EA009782B1 - Пептид, происходящий из вируса гепатита с - Google Patents
Пептид, происходящий из вируса гепатита с Download PDFInfo
- Publication number
- EA009782B1 EA009782B1 EA200600639A EA200600639A EA009782B1 EA 009782 B1 EA009782 B1 EA 009782B1 EA 200600639 A EA200600639 A EA 200600639A EA 200600639 A EA200600639 A EA 200600639A EA 009782 B1 EA009782 B1 EA 009782B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- peptide
- hepatitis
- virus
- antibody
- patients
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 315
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 title claims abstract description 46
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 50
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 20
- 208000010710 hepatitis C virus infection Diseases 0.000 claims description 18
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 12
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 10
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 7
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 4
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 79
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 30
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 29
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 21
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 20
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 18
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 18
- 208000000143 urethritis Diseases 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 17
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- -1 or an antibody Substances 0.000 description 9
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 9
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 5
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 3
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 3
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000011806 microball Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108010013476 HLA-A24 Antigen Proteins 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000011805 ball Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical class C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006154 Chronic hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124872 Hepatitis B virus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010048685 Oral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000544632 Suberites Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000000006 cell growth inhibition assay Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N disuccinimidyl suberate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ZWIBGKZDAWNIFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000007902 hard capsule Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229940102223 injectable solution Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000020280 negative regulation of antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000017066 negative regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940023041 peptide vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L phosphoramidate Chemical compound NP([O-])([O-])=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007901 soft capsule Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 201000000596 systemic lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/162—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
- G01N33/5767—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis non-A, non-B hepatitis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
- C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Описывается пептид, происходящий из вируса гепатита С, содержащий HLA-связывающий мотив в своей последовательности и распознаваемый антителом, обнаруживаемым у пациента с инфекцией вируса гепатита С. Пептид настоящего изобретения полезен при диагностике вируса гепатита С, лечении гепатита С и предсказании прогноза гепатита С.
Description
Настоящее изобретение относится к пептиду вируса гепатита С (НСУ), который полезен для диагностики инфекции вируса гепатита С и лечения гепатита С.
Более конкретно, изобретение относится к НСУ пептиду, полипептиду, содержащему НСУ пептид, нуклеотиду, кодирующему НСУ пептид или полипептид, антителу или веществу с антитело-подобной активностью, которое распознает пептид или полипептид, вектору, включающему в себя нуклеотид, способу индуцирования цитотоксических Т-клеток НСУ пептидом или полипептидом, способу обнаружения вируса гепатита С и к способу диагностики, профилактики или лечения гепатита С, способу предсказания прогноза гепатита С с использованием НСУ пептида, полипептида, нуклеотида, или антитела или вещества с антитело-подобной активностью, а также к фармацевтической композиции для лечения гепатита С, содержащей НСУ пептид, полипептид, нуклеотид, или антитело или вещество с антителоподобной активностью.
Предшествующий уровень техники
Гепатит, вызываемый вирусами, включает гепатит А, вызываемый, главным образом, оральным заражением вирусом, гепатит В, вызываемый заражением через кровь, и гепатит С, вызываемый главным образом заражением при переливании крови. Гепатит С является одним из заболеваний, которые могут развиваться в хроническое заболевание, приводящее в результате к циррозу печени или раку печени при крайне высоком риске.
Вирус гепатита С (НСУ) является вирусом с одноцепочечной РНК, который принадлежит к семейству флавивирусов, и говорят, что вирусом гепатита С заражены 2 млн или более в Японии и 170 млн по всему миру.
Для лечения гепатита С была разработана комбинационная терапия интерфероном и рибавирином, однако, она является эффективной только у 30-40% пациентов, и для большинства пациентов эффективная терапия не доступна. Соответственно, все еще существует сильная социальная потребность в немедленной разработке диагностических и терапевтических средств, которые являются безопасными, эффективными и простыми в использовании при низкой стоимости.
Имеется доказательство, показывающее, что и клеточные, и гуморальные иммунные ответные реакции играют первостепенную роль в ингибировании НСУ инфекции (\УО 89/04669). На протяжении прошедших 10 лет был проведен ряд исследований по поиску НСУ пептида с высокой иммуногенностью, и было обнаружено много НСУ пептидов, которые могут вызывать клеточную или гуморальную ответную реакцию (Нип/|ксг е! а1., Мо1 1ттипо1. 2001 Эес: 38 (6): 475-84). Однако ни один из данных пептидов не является клинически эффективным. Даже в настоящее время нет никаких эффективных средств для профилактики и лечения гепатита С, что, как считают, является, прежде всего, следствием плохой иммуногенности данных пептидов.
В дополнение к сказанному настоящие изобретатели уже сообщали, что антигенный пептид, распознаваемый некоторыми цитотоксическими Т-лимфоцитами (СТЬ), обладает способностью вызывать как клеточную, так и гуморальную иммунную реакции как ίη νίΐΓΟ, так и ίη νίνο (Сойага е! а1., 1 1ттипо1йег. 2002 Сентябрь-Октябрь; 25 (5): 439-44, Мше е! а1., С1ш Сапсег Век. 2001 Декабрь; 7(12): 3950-62, Тапака е! а1., 1 1ттипо!йег. 2003 Июль-Август; 26 (4): 357-66, Мше е! а1., Сапсег Зск 2003 Июнь; 94 (6): 548-56).
Ожидается, что НСУ пептид, распознаваемый как клеточными, так и гуморальными иммунными ответными реакциями, имеет более высокую иммуногенность, чем пептид, распознаваемый только клеточным иммунным ответом.
Новым подходом в удовлетворении такой социальной потребности является идентификация НСУ пептида, который может индуцировать и клеточный, и гуморальный иммунитет, поскольку накопленные знания продемонстрировали, что такой пептид обнаружил бы гораздо более высокую иммуногенность, чем пептид, индуцирующий только гуморальный иммунитет.
Таким образом, благоприятным является идентификация или определение такого пептида и проверка, является ли такой пептид кандидатом в новые терапевтические и диагностические средства для НСУ инфекции.
Соответственно, настоящие изобретатели проверили, может ли 1§С реакционноспособный по отношению к пептиду, распознаваемому НБА-А2- и НЬА-А24-специфичными цитотоксическими Тлимфоцитами (СТЬ), детектироваться в сыворотке пациента, инфицированного НСУ, и обнаружили, что 1§С. специфичный к некоторым СТЬ эпитопам, детектируется у большинства пациентов, зараженных НСУ, независимо от их НЬА класса типа I или НСУ генотипа. Благодаря данному результату они нашли, что такой пептид может привести к новым профилактическим и терапевтическим средствам, использующим данный пептид.
Соответственно, целью изобретения является предоставление НСУ пептида, который распознается клеточным и гуморальным иммунитетом и является высокоиммуногенным.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предоставляет пептид, происходящий или получаемый из вируса гепатита С, содержащий НЬА-связывающий мотив в своей последовательности, и распознается антителом, присутствующим в крови пациента, инфицированного вирусом гепатита С.
- 1 009782
Согласно предпочтительному воплощению пептид, происходящий из вируса гепатита С, имеет аминокислотную последовательность, представленную любой из последовательностей 8ЕО ΙΌ N08:1-8, 16, 20 и 38 перечня последовательностей, или имеет аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере на 70% гомологию с аминокислотной последовательностью пептида НСУ-происхождения, и обладает свойством распознавания НЬЛ-Л2- и НЬЛ-Л24-специфичными цитотоксическими Тклетками.
Еще один аспект изобретения предоставляет полипептид, включающий в себя пептид, происходящий из вируса гепатита С. Согласно предпочтительному воплощению изобретение предоставляет также полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую по крайней мере на 70% гомологию с аминокислотной последовательностью данного полипептида, и полипептид, дополнительно обладающий свойством быть распознаваемым НЬЛ-Л2- или НЕЛ-Л24-специфичными цитотоксическими Тклетками.
Еще один аспект изобретения предоставляет нуклеотид, кодирующий пептид, происходящий из вируса гепатита С, или полипептид.
Еще один аспект изобретения предоставляет антитело или вещество с антитело-подобной активностью, способное иммунологически распознавать пептид, происходящий из вируса гепатита С или полипептида.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет вектор, включающий вышеупомянутый нуклеотид.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ индуцирования цитотоксических Т-клеток путем использования нуклеотида, кодирующего пептид, происходящий из вируса гепатита С, или полипептида.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ детекции или обнаружения вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ диагностики заболевания, связанного с заражением НСУ, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ лечения заболевания, связанного с заражением НСУ, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет фармацевтическую композицию, включающую в качестве активного ингредиента пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид, нуклеотид, или антитело, или вещество с антитело-подобной активностью. Согласно предпочтительному воплощению фармацевтической композицией является вакцина вируса гепатита С.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет способ предсказания прогноза заболевания, связанного с заражением НСУ, такого как гепатит С, с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С, полипептида, нуклеотида, или антитела, или вещества с антитело-подобной активностью.
Согласно еще одному аспекту изобретение предоставляет набор для диагностики гепатита С или предсказания прогноза гепатита С, содержащий пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид, нуклеотид, или антитело, или вещество с антитело-подобной активностью.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет график, показывающий результаты измерения уровня 1дО в крови пациента, инфицированного НСУ, по методу ЕБ18Л, в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 2 представляет график, показывающий результаты измерения уровня 1дО в крови пациентов, инфицированных НСУ, по методу ЕБ18Л, в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 3 представляет график, показывающий экспериментальные результаты абсорбции и элюирования характерного примера антитела, реакционноспособного к С-35 пептиду, присутствующему в сыворотке пациента, показанного на фиг. 1, согласно настоящему изобретению.
Фиг. 4 представляет график, показывающий результаты СТЬ индуцирования 6 типами НЬЛ-Л24 связывающих пептидов (№ 3, 12, 13, 25, 32 и 38), происходящих из НСУ, согласно настоящему изобретению.
Фиг. 5 представляет график, показывающий результаты СТЬ индуцирования НЬЛ-Л2 связывающими пептидами (№ 40-57), происходящими из НСУ, согласно настоящему изобретению.
Фиг. 6 представляет график, показывающий характерные результаты цитотоксической активности стимулируемого пептидом РВМС в анализе высвобождения 51Сг согласно настоящему изобретению.
Фиг. 7 представляет график, показывающий характерные результаты цитотоксической активности стимулируемого пептидом РВМС в анализе высвобождения 51Сг согласно настоящему изобретению.
Фиг. 8 представляет график, показывающий НЬЛ класс I рестрикции цитотоксичности, стимулируемого пептидом РВМС в анализе ингибирования анти-СЭ8 моноклональным антителом согласно настоящему изобретению.
- 2 009782
Фиг. 9 представляет график, показывающий обнаружение антипептида 1дС в сыворотках пациентов, инфицированных НСУ.
Фиг. 10 представляет график, показывающий обнаружение антипептида 1дС в сыворотках пациентов, инфицированных НСУ.
Фиг. 11 представляет график, показывающий результаты анализа в опыте по абсорбции специфичности антипептида 1дС, присутствующего в сыворотках пациентов, инфицированных НСУ.
Фиг. 12 представляет график, показывающий результаты анализа в опыте по элюированию специфичности антипептида 1дС в сыворотках пациентов, инфицированных НСУ.
Фиг. 13 представляет график, показывающий ΙΡΝ-γ продуцирование стимулируемым пептидом РВМС.
Фиг. 14 представляет график, показывающий ΙΡΝ-γ продуцирование стимулируемым пептидом РВМС.
СТЬ
СТЬ
СТЬ активность активность активность стимулируемого стимулируемого стимулируемого пептидом пептидом пептидом
РВМС
РВМС
РВМС
Фиг. 15 представляет график, показывающий цитотоксичность стимулируемого пептидом РВМС.
Фиг. 16 представляет график, показывающий цитотоксичность стимулируемого пептидом РВМС.
Фиг. 17 представляет график, показывающий против №5Л-экспрессирующих клеток.
Фиг. 18 представляет график, показывающий против №5Л-экспрессирующих клеток.
Фиг. 19 представляет график, показывающий против №5Л-экспрессирующих клеток.
Фиг. 20 представляет график, показывающий специфичность активности анти-№5Л-2132 1дС.
Фиг. 21 представляет график, показывающий результаты анализа по ингибированию роста клеток с использованием анти-Ж5Л-2132 1дС.
Фиг. 22 представляет график, показывающий результаты анализа ЛЭСС активности анти-№5Л2132 1дС.
Фиг. 23 представляет график, показывающий обнаружение анти-С-35 антитела и анти-№5Л-2132 антитела у пациентов с различными заболеваниями.
Фиг. 24 представляет график, показывающий НЬЛ или НСУ генотипную рестрикцию пептидных антител.
Фиг. 25 представляет график, показывающий НЬЛ или НСУ генотипную рестрикцию пептидных антител.
Фиг. 26 представляет график, показывающий результаты измерения уровня анти-№5Л-2132 антиантиантитела в сыворотках пациентов.
Фиг. 27 представляет график, показывающий результаты измерения уровня анти-№5Л-2132 1дС в сыворотках пациентов.
Фиг. 28 представляет график, показывающий уровни анти-№5Л антител и НСУ РНК в сыворотках пациентов.
Фиг. 29 представляет график, показывающий обнаружение анти-С-35 антител и анти-№5Л-2132 антитела в групповом исследовании.
Фиг. 30 представляет график, показывающий обнаружение анти-№5Л-2132 антитела в групповом исследовании.
Фиг. 31 представляет график, показывающий результаты измерения уровня 1дС в крови пациентов, зараженных НСУ, с помощью анализа Ьитшех согласно настоящему изобретению.
Фиг. 32 представляет график, показывающий результаты измерения уровня 1дС в крови пациентов, зараженных НСУ, с помощью анализа Ьитшех согласно настоящему изобретению.
Фиг. 33 показывает курс лечения гепатита С с использованием пептидов настоящего изобретения.
Фиг. 34 показывает курс лечения гепатита С с использованием пептидов настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Пептид, происходящий из вируса гепатита С, изобретения представляет НСУ пептид, который содержит НЬЛ-связывающий мотив в своей последовательности и распознается антителами, присутствующими в крови пациентов, инфицированных вирусом гепатита С.
Кроме того, НСУ пептид согласно изобретению содержит НЬЛ-связывающий мотив, т.е. НЬЛ-Л2или НЬЛ-Л-24-связывающий мотив в своей последовательности. Данный НСУ пептид характеризуется также тем, что имеет высокую иммуногенность, а также распознается клеточным и гуморальным имму нитетом.
Примеры НСУ пептида включают пептиды, перечисленные в табл. 1 и 3. Одним из особенно предпочтительных НСУ пептидов изобретения является пептид, имеющий НЬЛ-Л2-связывающий мотив со следующей аминокислотной последовательностью:
С-35: УЬЬРККСРКЬ (8Ер ГО N0:1).
У пациента 1дС антитело, реакционноспособное с данным пептидом, обнаруживается в значительном количественном соотношении у пациентов, инфицированных НСУ со степенью детекции 93% и
- 3 009782 специфичностью к НСУ заражению 100%. Далее, особенно предпочтительными НСУ пептидами изобретения являются пептиды, имеющие НЬЛ-Л24-связывающий мотив с любой из следующих аминокислотных последовательностей:
Ν85Ά-2132: ЯУЛРЛСКРЬ (8ЕО ΙΌ N0:2);
Е2-488: Н¥ЛРЯРСО1 (8ЕО ΙΌ N0:3);
Е1-213: νΥΕΑΑΌΜΙΜ (8ЕО ΙΌ N0:4);
N83-1081: νΥΉ6Α68ΚΤΕ (8ЕО ΙΌ N0:5);
С-176: ПТЕ/УЛАСЕ (8ЕО ΙΌ N0:6);
С-173: 8Ε8ΙΕΕΕΑΌΕ (8ЕО ΙΌ N0:7);
ΗΥνΕΕΕΕΕΕ (8ЕО ΙΌ N0:8);
РУШЦСМЦЬ (8ЕО ΙΌ N0:16);
ΙΕΤΙΤΚΙΕΌ (8ЕО ΙΌ N0:20); и
8ΕΛΙΚ\\ΈΥνΕ (8ЕО ΙΌ N0:38).
В частности, №5Α-2132 способен индуцировать как клеточный, так и гуморальный иммунитет у многих НЕЛ-Л24-положительных пациентов.
НСV пептидом согласно изобретению может быть пептид, имеющий по крайней мере на 70%, предпочтительно на 80% или более, более предпочтительно на 90% или более гомологию с аминокислотной последовательностью любого из пептидов, перечисленных выше.
НСV пептид согласно изобретению может дополнительно содержать пептид, обладающий свойством быть распознаваемым ΒΕΑ-ΑΣ- или Н^Α-Α24-специфичными цитотоксическими Τ-клетками (СТЬ). Данный тип антигенного пептида, способного связываться с ΒΕΑ. генерируется под действием внутриклеточного разрушения антигенного белка, продуцируемого в клетке, и имеет мотив последовательности для каждого Β^Л типа. Цитотоксическая Т-клетка (СТЬ) распознает комплекс антигенного пептида и НЕг и вызывает повреждение НСV-инфицированной клетки.
Полипептид согласно изобретению содержит в своей последовательности аминокислотную последовательность пептида изобретения, описанного выше, но общее число аминокислот особо не ограничивается. Кроме того, в полипептиде изобретения аминокислотная последовательность, иная, чем последовательность данного пептида, располагается по Юконцевой стороне и/или С-концевой стороне, или по обеим сторонам аминокислот пептида. Поэтому такой полипептид имеет, по существу, ту же функцию и эффект, что и вышеупомянутый пептид. Когда здесь используется термин пептид, следует понимать, что в данный термин включен также полипептид, если не указывается иное.
Пептид, имеющий аминокислотную последовательность, описанную выше, может быть получен с помощью стандартного химического синтеза, путем ферментативного расщепления белковой молекулы, или с помощью методики рекомбинантной ДНК с использованием хозяина, трансформируемого таким образом, чтобы экспрессировать нуклеотидную последовательность, кодирующую требуемую аминокислотную последовательность.
В том случае, когда желаемый пептид получается с помощью химического синтетического метода, он может быть получен с помощью метода, который сам по себе хорошо известен и обычно используется в стандартной химии пептидов. Например, пептид может синтезироваться с помощью твердофазного метода синтеза с пептидным синтезатором. Сырой или неочищенный пептид, получаемый таким образом, может очищаться с помощью любого метода очистки, обычно используемого в химии белков, такого как высаливание, ультрафильтрация, хроматография с обращенной фазой, ионообменная хроматография и афинная хроматография.
В случае, когда желаемый пептид получают с использованием метода рекомбинантной ДНК, желаемый пептид может быть получен, например, путем интегрирования ДНК фрагмента, кодирующего желаемую аминокислотную последовательность, описанного выше, в соответствующий экспрессионный вектор, трансформирования микроорганизма или животной клетки с использованием данного экспрессионного вектора и затем культивирования полученного таким образом трансформанта. Экспрессионный вектор, который может использоваться в изобретении, включает плазмиду, вирусный вектор и др., которые хорошо известны в данной области.
Для трансформирования клетки-хозяина экспрессионным вектором по методу получения пептида, описанному выше, может соответствующим образом выбираться и использоваться любой из хорошо известных методов, таких как метод с хлоридом кальция, метод кальцийфосфатного соосаждения, ^ЕΑЕдекстрановый метод, липофектиновый метод или электропорационный метод. Пептид может очищаться с помощью любого из упомянутых выше способов очистки от клеточного экстракта или культурального супернатанта, собранного из культуральной среды.
Нуклеотид, который представляет один из других аспектов изобретения, включает олигонуклеотид или полинуклеотид, кодирующий вышеупомянутый пептид, происходящий из вируса гепатита С или упомянутый выше полипептид. Нуклеотид может включать в себя рибонуклеотид и дезоксинуклеотид. Нуклеотид может быть модифицированным хорошо известным в технике методом. Примеры модификации нуклеотида включают мечение, метилирование, сарк, замещение одного или более природных нуклеотидов аналогом и внутринуклеотидную модификацию, известные в данной области техники. Приме
- 4 009782 ры внутринуклеотидной модификации включают неионную модификацию (например, с использованием метилфосфоната, сложного фосфотриэфира, фосфорамидата и др.), ионную модификацию (например, с фосфортиоатом, форфордитиоатом и др.), модификацию с включением фрагмента боковой цепи, такой как белок (например, нуклеазы, токсина, антитела, сигнального пептида и др.), модификация хелатирующим агентом (например, металла, бора и др.).
Упомянутая выше нуклеотидная последовательность дает возможность предоставления пептидной или полипептидной последовательности НСУ антигена, кодируемого геномом НСУ, также как и пептида, полезного для диагностического испытания или в качестве компонента вакцины.
После того как получен нуклеотид изобретения, становится возможным конструировать нуклеотидный зонд и пептид, полезный для диагностики заболевания, связанного НСУ инфекцией, или скрининга НСУ инфекции в крови или препарате крови. На основе данной нуклеотидной последовательности можно синтезировать ДНК олигомер, имеющий, например, 24-30 нуклеотидов или даже более. Нуклеотид может также использоваться в качестве зонда для обнаружения НСУ РНК в сыворотке субъекта, или для скрининга присутствия НСУ в крови или продуктах крови.
Более того, нуклеотидная последовательность дает возможность моделирования и получения НСУспецифического пептида, полезного в качестве реагента для испытания на присутствие антител против НСУ. Антитело, направленное против очищенного пептида, имеющего данную последовательность, может использоваться для обнаружения НСУ антигена у субъекта, зараженного НСУ, и в продуктах крови, которые могли бы быть получены из крови лица, зараженного НСУ.
Согласно другим аспектам изобретения антитело включает в себя химерное антитело, модифицированное антитело, моновалентное антитело, БаЬ, Р(аЬ')2, РаЬ', белок с одной цепью Ρν (ксРУ) и антитело с одним доменом, которые являются реакционноспособными по отношению к пептиду, происходящему из вируса гепатита С, или к полипептиду. Данные антитела могут иммунологически распознавать пептид или полипептид.
Согласно дополнительным аспектам изобретения вектор представляет конструкцию, содержащую нуклеотид, и может трансформировать выбранную клетку-хозяина для экспрессии в хозяине гетерологичных кодирующих последовательностей.
Экспрессионным вектором может быть или клонирующий вектор, или вектор интеграционного типа.
Клонирующий вектор может включать, например, плазмиду и вирус (такой как аденовирусный вектор). Клонирующий вектор представляет репликон, который может трансформировать хозяйскую клетку и обладает способностью реплицироваться в клетке (например, плазмиде, хромосоме, вирусе, космиде и аналогичных).
Интеграционный вектор представляет вектор, который не служит как репликон в клетке-хозяина, но обладает способностью интегрировать ее содержимое в репликон (обычно хромосому) у хозяина, стабильно трансформируя хозяина.
Еще один аспект изобретения обеспечивает способ индуцирования цитотоксических Т-клеток, нацеленных на НСУ-зараженные клетки, с использованием пептида. Способ индукции изобретения может предусматривать, например, контактирование пептида с клеткой, экспрессирующей НБА-А2, для представления пептида в НБА-А2 молекуле, стимуляцию Т-клетки с клеткой, представляющей пептид, с помощью НБА-А2, и индуцирование Т-клетки в СТЬ. НЬА-А2-экспрессирующая клетка, используемая в данном способе, может собираться из крови НСУ пациента, однако, она может также получаться путем введения гена, кодирующего НБА-А2, в клетку, которая не экспрессирует НБА-А2. Таким образом, пептид согласно изобретению полезен для обнаружения и диагностики НСУ инфекции, а также полезен в виде фармацевтической композиции, такой как вакцина, для лечения заболеваний, связанных с вирусом гепатита С.
СТЬ, индуцируемый данным образом, попадает в цель и поражает клетку, инфицированную НСУ, поскольку СТЬ может быть также в качестве фармацевтической композиции для клеточной терапии.
Согласно еще одному аспекту изобретения пептид, происходящий из вируса гепатита С, полипептид, нуклеотид и/или антитело или вещество с антитело-подобной активностью полезны для обнаружения или диагностики НСУ инфекции.
Обнаружение или детекция НСУ и диагностика заболевания, связанного с НСУ, может осуществляться, например, путем детекции присутствия пептида, детекции присутствия или количества соответствующей нуклеотидной последовательности, определения биологического распространения пептида у индивидуума и/или определения количества пептида, присутствующего в пробе, взятой у индивидуума. В таком способе можно использовать взаимодействие и/или реакционноспособность с нуклеотидной последовательностью, кодирующей пептид. Другими словами, обнаружение НСУ и диагностика заболеваний, связанных с НСУ, может выполняться путем анализа пептида в качестве маркера. Анализ может осуществляться хорошо известным способом, например, с помощью реакционной системы антигенантитело, ферментной реакционной системы и РСК реакционной системы.
Мониторинг эффекта лечения и предсказание прогноза заболевания, связанного с НСУ, может осуществляться с помощью контролирования концентрации антитела реакционноспособного по отношению
- 5 009782 к пептиду, в крови субъекта с заболеванием, связанным с НСУ. Особенно предпочтительным является измерение уровня анти-С-35 1дО или анти-Ы§5Л-2132 1дО в крови субъекта.
Согласно еще одному аспекту изобретения фармацевтическая композиция включает вакцину. Вакцина содержит пептид, получаемый из вируса гепатита С, полипептид и/или нуклеотид, и может необязательно содержать фармацевтически приемлемый адъювант и/или носитель. Адъювант может усиливать иммунную ответную реакцию, и он может включать неполный адъювант Фрейда или алюминийгидроксидный гель. Носитель может, например, включать разбавитель, такой как РВ8 или дистиллированная вода, физиологический раствор.
Фармацевтическая композиция изобретения может вводиться орально, парентерально или трансдермально в зависимости от формы введения, например, с помощью внутривенного или подкожного введения. Примеры лекарственных форм включают таблетки, гранулы, мягкие капсулы, твердые капсулы, жидкости, масла и эмульсии. Доза такой фармацевтической композиции может подходящим образом выбираться в зависимости от симптомов у пациента, подвергаемого лечению. Обычно количество пептида может варьировать в пределах от 0,1 до 10 мг в день для взрослого, и композиция может вводиться один раз каждые несколько дней или несколько месяцев.
Все содержание всех патентов и ссылочных документов, приведенных в настоящем описании, включено в описание в виде ссылки на них. Кроме того, все содержание, описанное в описании и чертежах японской патентной заявки № 2003-330258, на основании которой, по данной заявке заявляется приоритет, также включено в настоящее описание путем ссылки на нее.
Примеры
Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры ниже. Данные примеры представлены для более подробной иллюстрации изобретения, но оно не ограничивается ими. Представлены следующие сокращения для аминокислот, используемых в следующих примерах.
А обозначает аланин, С - цистеин; Ό - аспарагиновая кислота; Е - глутаминовая кислота; Е - фенилаланин; О - глицин; Н - гистидин; I - изолейцин; К - лизин; Ь - лейцин; М - метионин; Р - пролин; В аргинин; 8 - серин; Т - треонин; V - валин; Υ - тирозин.
Пример 1.
Обнаружение 1дО, реакционноспособного к НСV пептиду, в сыворотках пациентов, инфицированных НСV.
Пептид.
В данном исследовании использовались синтетические пептиды, имеющие НЬА-А2-связывающий мотив или НЬА-А24-связывающий мотив из консервативной области 1Ь белка НСV генотипа (табл. 1). В качестве отрицательного контроля использовался пептид, происходящий от ВИЧ, имеющий НЬА-А2связывающий мотив. Все эти пептиды закупались у коммерческих поставщиков. Чистота анализировалась с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой, и было найдено, что она составляет 90% или выше.
- 6 009782
Таблица 1
| № | Название пептида | Условные обозначения | Область η | Последовательность | 5Ε0 Ю ΝΟ | НСУ пациенты (η=12) | Здоровые пациенты (η = 10) | ||
| положительные | положительные | ||||||||
| η* | % | η | % | ||||||
| 3 | 1ЬА24-2132 | Ν55Α-2132 | Ν55Α | НУАРАСКРЬ | 2 | 12 | 100 | 1 | 10 |
| 4 | 15А24-717 | Е2-717 | Е2 | ЕУУИХЕИ. | 8 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 5 | 1ЬА24-1100 | N53-1100 | N53 | ΜΥΤΝνοαϋΐ. | 9 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 15А24-1773 | Ν54Α-1773 | Ν54Α | ΟΥΙ ΑΟΙ 5ΤΙ. | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 1ЬА24-790 | Е2-790 | Е2 | ΙΥΟνννΡΕίί | 11 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 8 | 1ЬА24-1031 | N53-1031 | N53 | ΑΥδΟΟΤΑΘΙ | 12 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 9 | 1ЬА24-834 | N52-834 | N52 | ΗΥΚΙ ΡΙ ΑΑΙ. | 13 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 10 | 1ЬА24-1292 | N53-1292 | N53 | ΤΥΑΤΥΟΚΡΙ | 14 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 11 | 1ЬА24-1266 | N53-1266 | N53 | ΑΥΜ5ΚΑΗΟΙ | 15 | 6 | 50 | 0 | 0 |
| 12 | 1ЬА24-488 | Е2-488 | Е2 | ΗΥΑΡΑΡΰθΙ | 3 | 9 | 75 | 0 | 0 |
| 13 | 1ЬА24-213 | Е1-213 | Е1 | νΥΕΑΑϋΜΙΜ | 4 | 6 | 50 | 0 | 0 |
| 14 | 1ЬА24-1716 | Ν54Β-1716 | Ν54Β | ΡΥΙΕΟΟΜΟί | 16 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 15 | 1ЬА24-1767 | Ν54Β-1767 | Ν54Β | ΝΡΙδΘΙΟΥΙ. | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 16 | 1ЬА24-910 | N52-910 | N52 | ΡΥΡνΑΑΗΟί | 18 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 17 | 1ЬА24-1727 | Ν54Α-1727 | Ν54Α | ΟΡΚΟΚΑΙΟΙ. | 19 | 3 | 25 | 0 | 0 |
| 18 | 1ЬА24-885 | N52-885 | N52 | ΙΕΤΙΤΚΙΙΛ | 20 | 5 | 42 | 0 | 0 |
| 19 | 1ЬА24-135 | С-135 | С | ΟΥΙΡίνΟΑΡΙ. | 21 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 20 | 1ЬА24-631 | Е2-631 | Е2 | ΜΥνΟΟνΕΗ ΑΙ. | 22 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 21 | 1ЬА24-932 | N52-932 | N52 | ΗΥνθΜΑΙ.ΜΚΙ | 23 | 5 | 42 | 0 | 0 |
| 22 | 15А24-947 | N52-947 | N52 | ΤΥνΥΟΗΙ ΤΡΙ | 24 | 7 | 58 | 0 | 0 |
| 23 | 1ЬА24-1854 | Ν54Β-1854 | Ν54Β | ΟΥΟΛΟνΑΟΑί | 25 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 24 | 1ЬА24-1243 | N53-1243 | N53 | ΑΥΑΑΟΘΥΚνί | 26 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 25 | 1ЬА24-1081 | N53-1081 | N53 | νΥΗΘΑΘδΚΤΙ. | 5 | 6 | 50 | 0 | 0 |
| 26 | 1ЬА24-787 | Е2-787 | Е2 | ΑΥΑΙ-ΥΟνννΡΙ- | 27 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 27 | 1ЬА24-617 | Е2-617 | Е2 | ΗΥΡΟΤνΝΡΤΙ | 28 | 4 | 33 | 0 | 0 |
| 28 | 1ЬА24-1417 | N53-1417 | N53 | ΥΥΑΘΙϋνδνΐ | 29 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 29 | 16А24-2146 | Ν55Α-2146 | Ν55Α | ΤΕΙΛ/ΘΙ-ΝΟΥΙ. | 30 | 2 | 17 | 0 | 0 |
| 30 | 16А24-822 | N52-822 | N52 | урусишп- | 31 | 4 | 33 | 0 | 0 |
| 31 | 1ЬА24-1556 | N53-1556 | N53 | ΕΕννΕδνρταΐ- | 32 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 32 | 16А24-176 | С-176 | С | 1РЫ А1 1 5С1 | 6 | 7 | 58 | 0 | 0 |
| 33 | 1ЬА24-837 | N52-837 | N52 | Ι Ρ1 ΑΑυννννΐ. | 33 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 34 | 1ЬА24-848 | N52-848 | N52 | ΥΡΙΤΑΑΕΑΗί | 34 | 1 | 8 | 1 | 10 |
| 35 | 1ЬА24-1792 | Ν54Β-1792 | Ν54Β | ΑΡΤΑ5ΙΤ5ΡΙ. | 35 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 36 | 15А24-1990 | Ν55Α-1990 | Ν55Α | ϋρκτννί-αδκΐ- | 36 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 37 | 1ЬА24-2121 | Ν55Α-2121 | Ν55Α | ΕΡΤΕνϋΟνΑΙ. | 37 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 38 | 1ЬА24-173 | С-173 | С | 8Ρ8ΙΕΙΧΑΙ.Ι. | 7 | 7 | 58 | 0 | 0 |
| 39 | 1ЬА24-711 | Е2-711 | Е2 | δΡΑίκννεγνί | 38 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 40 | 1ЬА2-35 | С-35 | С | ΥΙίΡΑΑΘΡΑί | 1 | 12 | 100 | 0 | 0 |
| 41 | 1ЬА2-132 | С-132 | С | ϋίΜΘΥΙΡίν | 39 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 42 | 1ЬА2-178 | С-178 | С | ίίΑίΐδϋίτν | 40 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 43 | 1ЬА2-220 | Е1-220 | Е1 | Н-НТРССУ | 41 | 3 | 25 | 0 | 0 |
| 44 | 1ЬА2-363 | Е2-363 | Е2 | δΜνΟΝΜΑΚν | 42 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 45 | 1ЬА2-401 | Е2-401 | (Ηνη) | δΙΛΑΡΟΑΚΟΝν | 43 | 0 | 0 | 3 | 30 |
| 46 | 16А2-1073 | N53-1073 | N53 | ΟΙΝΟνΟΆ/Τν | 44 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 47 | 1ЬА2-1169 | N53-1169 | N53 | ΙΑΟΡΑΘΗΑν | 45 | 1 | 8 | 2 | 20 |
| 48 | 1ЬА2-1287 | N53-1287 | N53 | ΚΙ νΑΙ ΟΙΝΑν | 46 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 49 | 1ЬА2-1406 | N53-1406 | N53 | ΤΟΑΡνΤΥδΤΥ | 47 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 50 | 1ЬА2-1789 | Ν54Β-1789 | Ν54Β | 5Ι ΜΑΕΤΑΑν | 48 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 51 | 1ЬА2-1807 | Ν54Β-1807 | Ν54Β | ιχρΝίιααννν | 49 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 52 | 1ЬА2-1851 | Ν54Β-1851 | Ν54Β | ιυκοΥΟΛον | 50 | 0 | 0 | 1 | 10 |
| 53 | 1ЬА2-2252 | Ν55Α-2252 | Ν55Α | ΐίΟδΡΟΡίν | 51 | 0 | 0 | 0 | |
| 54 | 16А2-2692 | Ν55Β-2692 | Ν55Β | ΑίΐνΕΡΟΙΟν | 52 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 55 | 1ЬА2-2727 | Ν55Β-2727 | Ν55Β | αι οοοτΜΐ.ν | 53 | 2 | 17 | 1 | 10 |
| 56 | 1ЬА2-150 | С-150 | С | ΑΙΑΗΘνΑΑί | 54 | 0 | Ο | 1 | 10 |
| 57 | 1ЬА2-168 | С-168 | С | ΝΙ Ρ(3ϋ5Ρ5Ι | 55 | 0 | 0 | 1 | 10 |
| 60 | 1ЬА24-2422 | Ν55Β-2422 | Ν55Β | δΥΤννΤΟΑίΙ | 56 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 61 | 1ЬА24-2482 | Ν55Β-2482 | Ν55Β | ΗΥΑϋνΐ-ΚΕΜ | 57 | 3 | 25 | 1 | 10 |
| 62 | 1ЬА24-2990 | Ν55Β-2990 | Ν55Β | У/ЕМУУС1 Ш | 58 | 7 | 58 | 0 | 0 |
| 63 | 1ЬА24-789 | Е2-789 | Е2 | ΑΡΥΘνννΡΙ-Ι- | 59 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 64 | 1ЬА24-1727 | Ν54Β-1727 | Ν54Β | ΟΡΚΟΚΑίΘί | 60 | 1 | 8 | 0 | 0 |
| 65 | 1ЬА24-2613 | Ν55Β-2613 | Ν55Β | ΟΥδΡΟΟΑνΕΕ | 61 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 66 | 1ЬА24-1727 | Ν54Β-1727 | Ν54Β | ΟΡΚΟΚΑΙ.ΘΙ-1- | 62 | 3 | 25 | 0 | 0 |
*η - число.
Величина отсечки составляет 1,83.
- 7 009782
Таблица 2
Степень детекции вычислялась на основе количества положительных пациентов с вышеуказанной величиной отсечки (среднее ± 3 8Ό).
Степени детекции Ν8-5Ά-2132 и С-35 составляют 0,202 и 0,13 соответственно.
Статистический анализ осуществлялся с использованием '//-испытания.
ЕЫ8Л.
Уровень пептид-специфического ЕС) в сыворотке измеряли с помощью метода ЕЫ8А.
Сначала каждый пептид растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при -80°С. Пептид разбавляли 0,1М раствором смеси карбоната натрия/бикарбоната натрия, содержащим дисукцинимидилсуберат (Ό88) в качестве сшивающего агента. Планшету ЕЫ8Л покрывали 20 мкг/лунку пептида при 4°С в течение ночи. Лунки промывали три раза смесью 0,05% Твина 20/РВ8 (РВ8Т), и планшету блокировали с помощью В1оск Асе (зарегистрированная торговая марка) и оставляли на ночь при 4°С. Образцы плазмы или сыворотки разбавляли в соотношении 1:100, 1:200 и 1:400 смесью 0,05% Твин 20/В1оск Асе, и 100 мкл каждого образца добавляли в каждую лунку. После того как образцы инкубировали при 37°С в течение 2 ч, планшету промывали 9 раз РВ8Т, в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:1000 кроличьего античеловеческого 1дС (γ-цепь специфического), и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. Планшету промывали 9 раз РВ8Т, и в каждую лунку добавляли 100 мкл разбавленного 1:100 мышиного антикроличьего 1дС, конъюгированного с пероксидаза хрена-декстрановым полимером, и затем планшету инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. После промывания планшеты в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора тетраметилбензидинового субстрата. Реакцию останавливали добавлением 2,0М фосфорной кислоты. Величину отсечки вычисляли в виде средней ± 3 8Ό от величин оптической плотности контроля, полученных от здоровых доноров.
Абсорбция и элюирование пептид-специфического 1дС 100 мкл образца плазмы или сыворотки разбавленных 0,05% Твин 20/В1оск Асе (зарегистрированная торговая марка) добавляли в каждую лунку и оставляли абсорбироваться пептидом (20 мкг/лунку), нанесенным на лунку планшеты при 37°С в течение 2 ч. После того как данную процедуру повторяли 3 раза, уровень пептид-специфического ЕС) в супернатанте измеряли с помощью метода ЕЫ8А. Антитело, связанное с пептидом, нанесенным на планшету на первоначальной стадии адсорбции, элюировали 30 мкл/лунку 5М №С1/50 мкм цитратным буфером (рН 3,0) (нейтрализована 0,05% Твин 20/В1оск Асе, содержащей 1,0М Тпз-НСЬ (рН 7,5)) и уровень пептид-специфического ЕС) в элюированной фракции измеряли с помощью ЕЫ8А.
Анализ на пептид-специфический СТЕ
Пептид-специфический СТР детектировали с помощью метода, обычно используемого в данной области техники. РВМС добавляли в каждую лунку круглодонной 96-луночной планшеты для микрокультуры в количестве 1х105 клеток на лунку, и клетки инкубировали в 200 мкл среды с 10 мкм пептида. Состав данной среды является следующим: 45% КРМ1-1640, 45% А1М-У (зарегистрированная торговая марка), 10% плодная сыворотка теленка (РС8), 100 Ед/мл интерлейкина 2 (1Ь-2), и 1 ммоль МЕМ раствора несущественной аминокислоты. На 3, 6 и 9 день культивирования половину каждого раствора культу
- 8 009782 ры удаляли и заменяли свежей средой, содержащей соответствующий пептид (20 мкг/мл). На 12 день культивирования, культивируемые клетки собирали и анализировали на продуцирование гамма интерферона (ΙΡΝ-γ) в ответ на СШ-А2402 клетку или Т2 предварительно пульсируемую соответствующим пептидом или пептидом ВИЧ в качестве отрицательного контроля. Для каждого пептида использовали четыре лунки и анализ проводили дважды. Фон продуцирования ΙΡΝ-γ в ответ на ВИЧ пептид вычитали из значения полученных данных. Для анализа ингибирования пептид-реакционноспособный СТЬ очищали с использованием изолирующего набора СЭ8 и анализировали на продуцирование пептид-специфического ΙΡΝ-γ в присутствии 20 мкг/мл любого из моноклонального антитела анти-НЬЛ класс I (ХУ6/32, 1дС2а), моноклонального антитела анти-СЭ8 (Νιι-Τδ/ο, 1дС2а) и моноклонального антитела анти-НЬЛ класс II (Η-ΌΒ-1, 1дС2а).
Фоновое ΙΡΝ-γ продуцирование вычитали из значения полученных данных.
Статистика.
Величины выражены в виде среднего ± 8Ό. Статистический анализ проводили с использованием Мапп-\У1Шпеу и-теста и критерия хи-квадрата, а величину Р меньше чем 0,05 считали статистически значимой.
Обнаружение антитела против НСУ пептида.
Уровень 1дО, который реагирует с каждым из 62 типов пептидов, измеряли в сыворотках от 12 пациентов, инфицированных НСУ и 10 здоровых доноров (ΗΌδ) (табл. 1). Распространенность антител против каждого пептида показана в табл. 1. Было обнаружено множество пептидов, которые в высшей степени реагируют с 1дС в крови от пациентов, инфицированных НСУ, и изредка реагируют с сыворотками от здоровых доноров.
Пептиды включают № 3: Ν85Ά-2132 (соответствующий пептиду в положении 2132-2140 НСУ Ν85Ά протеина, ниже приведен в сокращении аналогичным образом), № 11: Ν83-1266, № 12: Е2-488, № 13: Е1-213, № 22: Ν82947, № 25: Ν83-1081, № 32: С-176, № 38 С-173, № 40: С-35 и № 62 Ν85Β-2990.
Характерные результаты измерения уровня 1дО в крови от пациентов, инфицированных НСУ, с помощью метода ЕЬ18Л представлены на фиг. 1 и 2.
В сыворотке пациента, показанной на фиг. 1, определяли антитело 1дС против С-35.
В сыворотке 4 пациентов, показанных на фиг. 2 (Ά)-(Ό), детектировали 1дО антитела, реакционноспособные к Ν85Ά-2132 (Α), Ν83-1081 (В), Е2-488 и Е1-213 (С) и С-176 и С-173 (Ό) соответственно. Специфичность пептидов данных пептид-реакционноспособных антител проверяли с помощью тестов абсорбции и элюирования.
Фиг. 3 показывает характерный пример экспериментальных результатов абсорбции и элюирования антитела реакционноспособного к С-35 пептиду в сыворотке пациента, показанной на фиг. 1. Данное антитело абсорбировали С-35, но не нерелевантным (не относящимся к делу) пептидом Ν85Α-2252 (верхний график на фиг. 3). Более того, антитело элюировали из С-35 адсорбируемой фракции (нижний график на фиг. 3).
Среди антител, перечисленных в табл. 1, антитело, реакционноспособное к пептиду С-35, обнаруживали на 100% у пациентов, инфицированных НСУ и на 0% у здоровых доноров, что указывает на то, что оно имеет высокую специфичность к НСУ. Последовательность С-35 пептида НСУ имеет частичную гомологию с пептидами различных вирусов, таких как 1е1 белок (аминокислотная последовательность в положениях 54-58) или епу белок (аминокислотные последовательности в положениях 5-9, 158-162 и 717-727) ВИЧ-1. Это так же показывает гомологию с различными белками НТЬУ-Ι (такими как ро1 724755, гех 5-9, гех 310-313 и 1ах 70-74). Таким образом, антитело, реакционноспособное к С-35 пептиду, в дальнейшем исследовали в двойном слепом анализе (экспериментальные и контрольные образцы смешаны в группе) 156 случаев в целом, включая 60 случаев заболеваний, связанных с НСУ инфекцией (22 случая хронического гепатита С, 20 случаев цирроза печени и 18 случаев рака печени), 24 случая субъектов, инфицированных вирусом гепатита В, 10 случаев реципиентов с вакциной от вируса гепатита В, 27 случаев здоровых доноров, 22 случая пациентов с аутоиммунным заболеванием, 10 случаев субъектов, инфицированных НТЬУ-Ι и 3 случая субъектов, инфицированных ВИЧ. Результаты показаны в табл. 2. НСУ специфичность и степень детекции антитела, реакционноспособного к С-35 пептиду, составляли 88,5% и 93,3% соответственно.
Индуцирование пептид-специфической СТЬ активности.
Шесть типов НЬА-А24 связывающих пептидов (№ 3, 12, 13, 25, 32 и 38) и 18 типов НЬА-А2 связывающих пептидов (№ 40-57) инкубировали с моноядерными клетками периферийной крови (РВМСк), полученными от НЬА-А24+ или НЬА-А2+ НСУ-инфицированных пациентов (5 пациентов в каждой группе). В качестве контроля РВМС инкубировали с пептидом ВИЧ. Затем инкубированные РВМС испытывали на их способность продуцировать ΙΡΝ-γ в ответ на СШ-А2402 клетку или Т2-клетку, пульсируемую соответствующим пептидом. Шесть типов НБА-А24 связывающих пептидов (№ 3, 12, 13, 25, 32 и 38) могли индуцировать СТЬ из РВМС полученной от 10 НЬА-А24+ НСУ пациентов (фиг. 4). Более того, СТЬ мог индуцироваться НЬА-А2 связывающими пептидами, происходящими из НСУ (№ 40-57) в
- 9 009782
РВМС, полученной от 5 НЬЛ-Л2+ НСУ пациентов (фиг. 5).
Цитотоксическую активность стимулируемых пептидом РВМС измеряли с помощью анализа высвобождения 51Сг. Характерные результаты показаны на фиг. 6 и 7.
Фиг. 6 показывает цитотоксическую активность СТЬ индуцируемого в РВМС полученном от НЬАА24+ НСУ пациентов НЬА-А24 связующими пептидами (№ 3, 12, 13, 25, 32 и 38), происходящими из НСУ. Цитотоксическая активность против С1К-А2402 клеток, загруженных соответствующим пептидом (представлен С1КА2402 на чертеже), была значительно выше, чем активность против контрольных клеток С1К-А2402, загруженных пептидом ВИЧ (представлен С1КА2402 ВИЧ на чертеже).
Фиг. 7 показывает цитотоксическую активность СТЬ, индуцируемого в РВМС периферической крови, полученном от НЬА-А2+ НСУ пациентов НЬА-А2 связующими пептидами (№ 40 и 41), происходящими из НСУ. Цитотоксическая активность против Т2-клеток, загруженных соответствующим пептидом (представлен Т2 на чертеже), была значительно выше, чем активность против контрольных клеток Т2 по отношению к загруженным пептидом ВИЧ (представлен Т2ВИЧ на чертеже).
Данные РВМС показали значительно более высокий уровень цитотоксической активности против С1К-А2420 клетки и Т2-клетки, предварительно загруженной соответствующим пептидом (за исключением ВИЧ пептида в качестве отрицательного контроля).
Рестрикцию цитотоксичности НЬА класса I испытывали с помощью анализа ингибирования с использованием анти-СЭ8 моноклонального антитела (фиг. 8). Фиг. 8 показывает типичный пример ингибирования СТЬ активности анти-СЭ8 антителом. Цитотоксичность СТЬ, индуцируемого в РВМС, полученном от НЬА-А2+ НСУ пациента, НЬА-А2 связующим пептидом (№ 40), происходящим из НСУ, ингибировали антителом анти-СЭ8, но не антителом анти-СЭ4 или контрольным антителом анти-СЭ14.
Пример 2.
Детекция ЦС. реакционноспособного к НСУ пептиду, в сыворотках НЬА-А2 4+ НСУинфицированных пациентов.
Объект.
Детекцию 1дС, реакционноспособного к НСУ пептиду, осуществляли более широко на НЬА-А24+ НСУ-инфицированных пациентах. По данным иммуноаналитического теста второго поколения или третьего поколения было обнаружено, что шестьдесят НСУ-1Ь+ пациентов являются сероположительными в отношении анти-НСУ антитела (АЬ). Генотип НСУ, содержащегося в сыворотках пациентов, определяли с помощью КТ-РСК. Пациентов диагностировали во время отбора проб сыворотки с помощью биохимического анализа, эхографии, компьютерной томографии и гистологического исследования. Результаты диагностики являются следующими: хронический гепатит (СН, п=24), цирроз печени (ЬС, п=18) и гепатоцеллюлярная карцинома (карцинома клеток печени) (НСС, п=18). Отрицательным контролем были образцы сыворотки от 20 здоровых доноров (НЭк), у которых были нормальные функции печени и не было вирусного гепатита.
Анализ пептида и пептид-реакционноспособного антитела.
Использовали сорок четыре типа синтетических пептидов, которые получали из высококонсервативной области НСУ-1Ь белка и выбирали на основе оценки высокого связывания с НЬА-А24 молекулой (ВюшРоттабск апб Мо1еси1аг Апа1ук18 8ес1юп, И1Н, ВеШекба, МИ). Пептид, получаемый из ВИЧ, который имеет НЬА-А24 связующий мотив (КУЬРВЦЦЬЬС1 (8ЕЦ ΙΌ N0:63)) служил в качестве отрицательного контроля. Оценки связывания и последовательности пептидов показаны в табл. 3. Для скрининга реакционноспособности пептидов по отношению к сыворотке 1дС, пептиды в обессоленной степени (>70%) закупали у фирмы Вюкуп1йе818 (ЬеМ8уШе, ТХ) или 8упРер (ИиЫт, СА). В последующих экспериментах использовали очищенный пептид (>90%). Уровень пептид-специфического 1дС в плазме измеряли с помощью энзим-связанного иммуносорбентного анализа (ЕЬ18А).
Специфичность антипептида 1дС в образце плазмы испытывали с помощью абсорбции и элюирования пептид-реакционноспособного 1дС.
Анализ пептид-специфического СТЬ.
Клетки пептид-специфического СТЬ предшественника обнаруживали с помощью метода, описанного в Н1ба е! а1. (Сапсег 1ттипо1 1ттипо1Нег 2002; 51:219-228). Для анализа ингибирования использовали моноклональные антитела 20 мкг/мл анти-НЬА класса I (^6/32, 1дС2а), анти-СЭ8 (Νη-Тк/с, 1дС2а), анти-СО4 (Ш-ТН/Е 1дС1Ь) и анти-НЬА класса II (Н-ЭК-1, ЦС).
СТЬ активность пептид-стимулируемого РВМС против клетки трансфицируемой №5А геном.
кДНК №5А, НЬА-А2402 и НЬА-А2601 получали с помощью КТ-РСК из НиЬ7 (ΝΝυ-50-1) клетки, С1К-А2402 клетки и КЕ4-СТЬ клетки, соответственно, и клонировали в экспрессионный вектор рСК3.1 Дпуйтодеп, 8ап П1едо, СА). Клеточная линия НиЬ7 (ΝΝυ50-1) является клеточным репликоном, получаемым из клеточной линии, инфицированной НСУ-1Ь, и экспрессирует белки от N83 к Ν85Ε (К1кЫпе е! а1., ВюсЬет ВюрЬук Кек Соттип 2002; 293:993-999). Затем, 100 нг №5А, НЬА-А2402 или N85;·! и НЬАА2601 кДНК (в качестве отрицательного контроля) смешивали в 100 мкл Орб-МЕМ Дпуфодеп), содержащим 0,6 мкл Ендепе6 (КосЬе Мо1еси1аг Вюсйетюа18, Шбхапаробк, ΕΝ) и инкубировали в течение 30 мин. Затем, 100 мкл смеси добавляли к СО8-7 клеткам (1х104 клеток) и инкубировали в течение 6 ч. 100 мкл КРМЫ640 среды, содержащей 20% ЕС8 добавляли к смеси и СО8-7 клетки культивировали в
- 10 009782 течение 2 дней, с последующим добавлением Ν85Ά 2132-2140-стимулируемых РВМС (2х105 клеток/лунку). После инкубирования в течение 18 ч 100 мкл супернатанта (всплывающий слой) удаляли и с помощью анализа ЕЬ18А троекратно анализировали концентрацию ΙΕΝ-γ. Для того чтобы приготовить стабильную клеточную линию трансфектанта, или рСК3.1-№5А. или рСК3.1-НЬА-А3101 (отрицательный контроль) трансфицировали в С1К-А2402 клетку с помощью электропорации с использованием Сепе Рикет (ΒίοΡΛΩ. Ктсйтопб. СА). Данные клетки культивировали в течение 30-40 дней в присутствии генетицина (С418) и затем собирали клетки. устойчивые к генетицину. Экспрессию №5А белка в трансфектанте анализировали с помощью Вестерн-блотт анализа с использованием анти-№5 поликлонального антитела (АЬсат Ытйеб. СатЬпбде. ИК).
Ингибирование роста и антителозависимая клеточная цитотоксичность (АИСС).
Клеточную линию Ни17 инкубировали в лунке плоскодонной 96-луночной планшеты для микрокультур в присутствии различных сывороток в течение 24. 48 и 72 ч. После инкубирования Ни17 клетки подсчитывали с помощью набора-8 для подсчета клеток (10 мкл/лунку) (Όο)ίηάο. Иран). Для АП88 анализа. РВМС. заново выделенные из НЬА-А24+ НИ предварительно инкубировали в течение 1.5 ч в 10% ЕС8 и ΡΡΜΙ-1640 среде. содержащей инактивированную сыворотку (56°С. 30 мин) от любого из разных пациентов и НИ (в качестве отрицательного контроля). С1К-А2402 клетки или С1К клетки (в качестве отрицательного контроля) инкубировали в течение 2 ч с №5А 2132-2140 пептидом (10 мкМ) радиометили №251СтО4 в течение 1.5 ч. промывали и использовали в качестве клеток-мишеней. Пептидстимулируемые РВМС инкубировали в лунке круглодонной 96-луночной планшеты для микрокультур с клетками мишени при соотношении эффектора к клетке мишени (Е/Т) 40. 20 или 10:1. После инкубирования при 37°С в течение 6 ч. супернатант. свободный от клеток. собирали и анализировали активность АИСС (81отига. е1 а1.. Вг I Сапсег 2004; 90:1563-1571).
Статистика.
Статистический анализ осуществляли с использованием ΐ-теста Стьюдента и И-теста Мапп-\У1Шпеу. Величины Р<0.05 считали статистически значимыми.
Детекция гуморального ответа на НСУ-пептид.
Для скрининга гуморального ответа на пептиды анализировали уровень 1дС реакционноспособного к каждому из 44 типов пептидов в плазме 12 пациентов. инфицированных НСУ-1Ь. Плазму 10 здоровых доноров использовали в качестве отрицательного контроля. Уровень пептид-реакционноспособного 1дС измеряли с помощью анализа ЕЫ8А для серийно разбавленных образцов плазмы и выражали величинами абсорбции (ΟΌ) каждого образца. Величину отсечки данных пептидов при разбавлении плазмы 1:100 устанавливали при 0.18 ΟΌ (значит (0.08)+28Ό (0.05x2) от 10 здоровых доноров). Значительный уровень (>0.18 ΟΌ при разбавлении плазмы 1:100) 1дС реакционноспособного к №5А-2132. С-176. Е2-488. Е1213. С-173 и N83-1081 пептидам были детектируемыми в плазме 12. 11. 10. 9. 8 и 5 пациентов среди 12 пациентов соответственно (фиг. 9). Как и ожидалось. ни один из этих пептидов не был реакционноспособным к плазме от 10 здоровых доноров (НИ к). Реакционноспособность пептидов к пептидспецифическому 1дС приводится в табл. 3.
- 11 009782
Таблица 3
НСУ рестрицируемые пептиды и реакционноспособность к пептид-специфическому 1дО
| № | Область | Пептид | ЗЕЦ ΌΝΟ | Реакционноспособность к пептидспецифическому 1д6 | ||
| Показатель связывания11 | Пациенты (п=12) | НО (п=10) | ||||
| 1 | С 135-144 | СУСАСУАСАЕ | 25 | 504 | 1 | 0 |
| 2 | С 173-182 | 8Р81РЬЬАЬЬ | 7 | 24 | 8 | 0 |
| 3 | С 176-185 | 1РЬЬАЬЬ8СЬ | 6 | 36 | 11 | 0 |
| 4 | Е1 213-221 | νΥΕΑΑϋΜΙΜ | 4 | 37,5 | 9 | 0 |
| 5 | Е2 488-496 | НУАРКРС61 | 3 | 60 | 10 | 0 |
| б | Е2 617-626 | ΗΥΡστνΝΡΤι | 28 | 75 | 2 | 0 |
| 7 | Е2 631-640 | МУУССУЕННЬ | 22 | 420 | 0 | 0 |
| 8 | Е2 711-720 | ЗРАИСНЕУУЬ | 38 | 20 | 1 | 0 |
| 9 | Е2 717-725 | ЕУУЬЬЬРЬЬ | 8 | 432 | 2 | 0 |
| 10 | Е2 787-796 | АУАЬУСУНРЬ | 27 | 200 | 2 | 0 |
| 11 | Е2 789-797 | АРУСУНРЫ. | 59 | 20 | 0 | 0 |
| 12 | Е2 790-798 | ЬУСУНРЬЬЬ | 11 | 200 | 0 | 0 |
| 13 | N82 822-831 | УРУСЫЬЬТЬ | 31 | 30 | 2 | 0 |
| 14 | N82 834-842 | НУКЬРЬАКЦ | 13 | 60 | 0 | 0 |
| 15 | N82 837-846 | ЬРЬАКЫЮП. | 33 | 36 | 0 | 0 |
| 16 | N82 848-856 | ΥΡΙΤΗΕΑΗΙ. | 34 | 30 | 1 | 1 |
| 17 | N82 885-893 | 1РТ1ТК1Ы. | 20 | 20 | 3 | 0 |
| 18 | N82 910-918 | РУРУКАНСЬ | 18 | 24 | 0 | 0 |
| 19 | N82 932-941 | НУУОМАЬМКЬ | 23 | 396 | 3 | 0 |
| 20 | N82 947-956 | ТУУУЭНЬТРЬ | 24 | 300 | 2 | 0 |
| 21 | N33 1031-1039 | АУЗООТКСЬ | 12 | 200 | 0 | 0 |
| 22 | N83 1081-1090 | УУНСАСЗКТЬ | 5 | 200 | 5 | 0 |
| 23 | N83 1100-1108 | ΜΥΤΝνϋΟϋΙ. | 9 | 336 | 0 | 0 |
| 24 | N83 1243-1252 | АУААОСУКУЬ | 26 | 200 | 2 | 0 |
| 25 | N83 1266-1274 | ΑΥΜ8ΚΑΗ6Ι | 15 | 75 | 2 | 0 |
| 26 | N83 1292-1300 | ТУЗТУСКРЬ | 14 | 200 | 1 | 0 |
| 27 | N83 1417-1426 | УУК6ЬОУ8У1 | 29 | 50 | 2 | 0 |
| 28 | N83 1556-1565 | ЕРКЕЗУРТСЬ | 32 | 40,32 | 0 | 0 |
| 29 | Ν84Β 1716-1724 | РУ1Е06М0Б | 16 | 36 | 1 | 0 |
| 30 | Ν84Β 1727-1735 | 0ΡΚ0ΚΑΙ6Ε | 19 | 20 | 3 | 0 |
| 31 | Ν84Β 1727-1735 | ОРКОКАЬСЬ | 60 | 20 | 1 | 0 |
| 32 | Ν84Β 1727-1736 | ОРКОКАЬСЬЬ | 62 | 20 | 1 | 0 |
| 33 | Ν84Β 1767-1775 | ЫР18С10УЬ | 17 | 36 | 0 | 0 |
| 34 | Ν84Β 1773-1781 | 0УЬАСЬ8ТЬ | 10 | 300 | 0 | 0 |
| 35 | Ν84Β 1792-1801 | ΑΡΤΑ8ΙΤ3ΡΙ1 | 35 | 28 | 0 | 0 |
| 36 | Ν34Β 1854-1863 | СУСАСУАСАЬ | 25 | 280 | 2 | 0 |
| 37 | Ν85Α 1990-1999 | ОРКТР/ЬОЗКЬ | 36 | 2 6,4 | 1 | 0 |
| 38 | Ν85Α 2121-2130 | ГРТЕУОСУВЬ | 37 | 24 | 1 | 0 |
| 39 | Ν85Α 2132-2140 | НУАРАСКРЬ | 2 | 480 | 12 | 1 |
| 40 | Ν85Α 2146-2156 | ТРЬУСЫОУЬ | 30 | 43,2 | 2 | 0 |
| 41 | Ν85Β 2442-2451 | зутеттсАы | 56 | 50 | 0 | 0 |
| 42 | Ν85Β 2482-2491 | НУКОУЬКЕМ | 57 | 46,2 | 3 | 1 |
| 43 | Ν85Β 2613-2622 | ОУЗРСОКУЕГ | 61 | 132 | 0 | 0 |
| 44 | Ν85Β 2990-2998 | ИРМНСЬЬЬЬ | 58 | 30 | 3 | 0 |
a) Уровень пептид-специфического 1дО в сыворотках 12 НСУ-1Ь+ пациентов измеряли с помощью метода ЕБ18А.
Было определено, что величина отсечки составляет 0,18.
b) Показатель связывания пептида с НБЛ-Л24 молекулой определяли с использованием ΒίοίπίοΓ- та11С8 и Мо1еси1аг Лпа1у818 8ес1юп, ΝΙΗ, Ве1Ьез4а, МП) (Ьйр://Ыта8. с1ег1. тП. доу/то1Ью/Ыа__Ьтб/).
Каждый из 6 типов вышеупомянутых пептидов, имеющих чистоту 90% или более и отрицательный контрольный пептид испытывали на реакционноспособность к каждому из образцов сыворотки от 60 НСУ-1Ь+ пациентов (СН, п=24; БС, п=18 и НСС, п=18) и 20 ΗΌδ (фиг. 10).
Значения для каждого из этих образцов при разбавлении 100:1 наносили на график. Среднее ± 8Ό 1дО (ΘΌ величина) было следующим: Ν85Ά-2132 (0,48±0,36), Е2-488 (0,18±0,19), Е1-213 (0,10+0,21), N83-1081 (0,036±0,14), С-176 (0,09±0,14) и С-173 (0,04+0,13). Звездочки указывают Р<0,05 в Ц-тесте М1апп-\МП11пет. Средний уровень 1дО, реакционноспособного к Ν85Α-2132, Е2-488, Е1-213 или С-173 был статистически значительно выше, чем уровень у здоровых доноров, однако, этого не было в случае с
- 12 009782
N33-1081 или С-176. 1дС, показывающий значительный уровень реакционноспособности (>0,101 ΟΌ при разбавлении сыворотки 1:100) к №5А-2132, Е2-488, Е1-213, С-173, N33-1081 и С-176 пептидам обнаруживали в плазме у 57 пациентов (95%), у 44 (73%), 28 (47%), 23 (38%), 21 (35%) и 17 (28%) пациентов из 60 испытуемых пациентов соответственно. Наоборот, в любой из сывороток от 20 здоровых доноров не мог быть обнаружен значительный уровень 1§С (фиг. 10).
Пептид-специфичность 1§С реакционноспособного к каждому из этих пептидов проверяли с помощью тестов абсорбции и элюирования. Каждый образец сыворотки абсорбировали или соответствующим пептидом или нерелевантным пептидом (ВИЧ; использовали в качестве отрицательного контроля) при 37°С 3 раза, и уровень пептид-специфического 1дС измеряли с помощью метода ЕЫ3А (фиг. 11). В тесте элюирования молекулы 1дС, связанные с пептид-иммобилизированной планшетой, элюировали или соответствующим пептидом или нерелевантным пептидом после первой абсорбции, и затем уровень пептид-специфического 1дС в элюированной фракции измеряли с помощью метода ЕЫ3А. Характерные результаты среднего ± 3Ό величин ΟΌ от трех измерений показаны на чертеже (фиг. 12). Звездочки обозначают р<0,05 в двухстороннем !-испытании Стьюдента.
Как ожидалось, каждый 1§С в отношении 6 типов пептидов абсорбировали соответствующим пептидом, но не абсорбировали нерелевантным пептидом (ВИЧ пептид). Более того, данный 1§С элюировали из связывающей фракции соответствующим пептидом, но не элюировали нерелевантным пептидом. Взятые вместе, данные результаты говорят о том, что 1дС реакционноспособный к каждому пептиду, является специфичным к пептиду, получаемому из НСУ-1Ь.
Индуцирование пептид-специфического клеточного ответа.
РВМС от НЬА-А24+ пациентов инфицированных НСУ-1Ь (п=12, 6 СН пациентов, 3 ЬС пациента и 3 НСС пациента) и НЬА-А24+ НЬк (п=5) без НСУ инфекции культивировали с каждым из 6 типов пептидов (чистота >90%) или контрольным ВИЧ пептидом в течение 13 дней, и проверяли на ΙΕΝ продуцирование в ответ на С1В-А2402 клетку, пульсируемую соответствующим пептидом. РВМС от НЬА-А2 4+ НСУ-1Ь+ пациентов (п=12) и НЬк (п=5) стимулировали любым из 6 типов пептидов в 4 лунках (15х104/лунку). На 14-й день культивирования пептид-стимулируемые РВМС (80-120х104/лунку) отдельно отбирали из каждой лунки и делили на четверти. Из них две порции отдельно тестировали на способность к продуцированию ΙΕΝ-γ в ответ на С1В-А2402 клетки, пульсируемые соответствующим пептидом. Остающиеся две порции испытывали с клетками с использованием в качестве отрицательного контрольного пептида (ВИЧ). Уровень ΙΕΝ-γ, продуцируемый в ответ на ВИЧ пептид (<50 пг/мл), вычитали как фон. Звездочки указывают р<0,05 в двухстороннем !-испытании Стьюдента.
НСУ пептиды С-173, С-176, Е1-213, Е2-488, N33-1081 и Д35А-2132 вызывали продуцирование ΙΕΝγ при значительном уровне (р<0,05) у 1, 3, 4, 6, 2 и 7 из 12 пациентов (фиг. 13 и 14) и у 0, 0, 1, 1, 1 и 1 из 5 НЬк (данные не показаны) соответственно. Среди этих 6 типов пептидов, Д35А-2132 пептид распознавался клеточным иммунитетом и гуморальным иммунитетом в РВМС от 7 из 12 пациентов и в сыворотках 57 из 60 НСУ-1Ь+ пациентов, подвергнутых тестированию.
Цитотоксичность данных, стимулируемых пептидом РВМС, проверяли с помощью 6-часового анализа высвобождения 51Сг (фиг. 15). Пептид-стимулируемый РВМС, показывающий положительную ответную реакцию в анализе ΙΕΝ-γ продуцирования (описанном выше), культивировали и выращивали ш νί!ΐΌ только с ΙΕ-2. Затем испытывали цитотоксичность против С1В-А2402 клеток, пульсируемых соответствующим пептидом или ШУ (ВИЧ) пептидом (отрицательный контроль), с помощью стандартного 6-часового анализа высвобождения 51Сг при трех различных соотношениях Е/Т клеток. Характерные результаты показаны на чертеже. Величины или показатели выражаются как среднее ± 3Ό процента специфичного лизиса. Звездочки указывают на р<0,05 в двухстороннем !-тесте 3!ибеп!'к (Стьюдента). РВМС, стимулируемый Ν35Ά-2132, Е2-488, или Е1-213 пептидом, показал значительный уровень цитотоксичности против С1В-А2402 клеток, предварительно нагруженных соответствующим пептидом, но не ВИЧ пептидом (фиг. 15).
Стимулируемый пептидом РВМС, используемый в эксперименте, показанном на фиг. 15, испытывали на цитотоксичность против С1В-А2402 клеток, пульсируемых соответствующим пептидом в присутствии 20 мкг/мл анти-НЬА-класс Ι (^6/32, [дСЗа), анти-НЬА-класс ΙΙ (Н-ОВ-1, [дСЗа), анти-СЬ8 (Νυ Тк/с, Iд62а) или анти-СЬ4 (Хи-ТН/к Ι§61) моноклонального антитела (тАЬ). Анти-СЬ14 (1МЬ-Н14, ^ОЗа) тАЬ использовали в качестве отрицательного контроля. 6-Часовой анализ высвобождения 51Сг осуществляли при трех различных соотношениях Е/Т. Показатели выражаются как среднее ± 3Ό процента специфичной фитотоксичности (фиг. 16). Звездочки указывают на р<0,05 в двухстороннем !-тесте Стьюдента.
Цитотоксичность против С1В-А2402 клеток, пульсируемых каждым из 3 типов пептидов, ингибировалась анти-НЬА-класс Ι (ХУ6/32) или СЭ8 моноклональным антителом (тАЬ), но не любым из других испытываемых тАЬ, указывая на то, что пептид-специфичная цитотоксичность опосредуется, главным образом, СЬ8'Т клетками НЬА-класс Ι рестрикцируемым образом (фиг. 16). Напротив, такая цитотоксичность не способна обнаруживаться в случае РВМС, стимулируемых остальными 3 типами пептидов (С-173, С-176 и Ν33-1081) (данные не показаны).
- 13 009782
Затем проверяли, распознают ли стимулируемые Ν85Λ-2132 пептидом РВМС природно перерабатываемый пептид, с использованием СО8-7 клетки, которую скоротечно совместно трансфицировали №5А и НЬА-А2401 генами в качестве клетки мишени. В качестве отрицательного контроля использовали СО8-7 клетку, которую совместно трансфицировали скоротечно №5А и НЬА-А2601 генами. Стимулируемые №5А-2132 пептидом РВМС от пациентов № 1 и № 2 испытывали на их способность распознавать СО8-7 клетки, совместно трансфицированной скоротечно №5А и НЬА-А2401 генами, в качестве клетки мишени для получения ΙΕΝ-γ. В качестве отрицательного контроля использовали СО8-7 клетку, которую совместно трансфицировали скоротечно №5А и НЬА-А2601 генами. Показатели выражаются как среднее значение ± 8Ό процента ΙΕΝ-γ продуцирования в троекратно повторяемых анализах при Е/Т соотношении 20:1 (фиг. 17). Звездочки указывают на р<0,05 в двухстороннем ΐ-тесте Стьюдента.
Как ожидалось, стимулируемым пептидом РВМС от пациентов № 1 и № 2, показывающие СТЬ активность (фиг. 13), распознавали СО8-7 клетку, которая совместно трансфицировалась №5А и НЬАА2401 генами и продуцировали значительное количество ΙΕΝ-γ (фиг. 17). Напротив, данные РВМС не взаимодействовали с СО8-7 клеткой, имеющей №5А и НЬА-А2601 гены в качестве отрицательного контроля. Кроме того, стимулируемые пептидом РВМС от двух других пациентов (№ 3 и № 4), которые не показывали СТЬ активность, не давали значительных количеств ΙΕΝ-γ путем распознавания СО8-7 клетки, совместно трансфицированной №5А и НЬА-А2401 генами (данные не показаны).
Далее испытывали цитотоксичность против С1В-2402 клетки, которую стабильно трансфицировали №5А геном и использовалась в качестве клетки мишени. Экспрессию НЬА-А24 молекулы в С1В-А2402 клетке, которую стабильно трансфицировали №5А геном, и экспрессия НЬА-А31 молекулы в С1ВА2402 клетке, которую стабильно трансфицировали НЬА-А31 геном (отрицательный контроль) анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием ЕАС8сап (фиг. 18).
Затем испытывали цитотоксичность с помощью 6-часового анализа высвобождения 51Сг с использованием С1В-А2402 клетки, которую стабильно трансфицировали №5А геном в качестве клетки мишени. С1В-А2402 клетку, которую стабильно трансфицировали отрицательным контрольным геном (НЬАА3101), использовали в качестве отрицательного контроля, а С1В-А2402 клетка, которую пульсировали №5А-2132 пептидом, использовали в качестве положительного контроля. 6-Часовой анализ высвобождения 51 Сг осуществляли при трех различных Е/Т соотношениях. Величины выражали как среднее ± 8Ό процента специфичного лизиса. Звездочки указывают на р<0,05 в двухстороннем ΐ-тесте Стьюдента. РВМС, стимулируемый №5А-2132 пептидом, показал более высокий уровень цитотоксичности, как против С1В-А2402 клетки, которую трансфицировали №5А геном, так и нетрансфицированной С1ВА2402 клетки, которую предварительно пульсировали соответствующим пептидом, по сравнению с цитотоксичностью против С1В-А2402 клетки, которую трансфицировали отрицательным контрольным геном (фиг. 19). Данные результаты говорят о том, что стимулируемый №5А-2132 пептидом РВМС успешно распознает пептид, перерабатываемый и получаемый природно в НЬА-А2402 молекуле НСV-1Ь+ клетки.
Дополнительная проверка анти-№5А-2132 1дС.
Для того чтобы больше понять возможность биологической роли антипептида 1дО, проверяли, распознает ли анти-№5А-2132 1дС весь №5А белок, в анализе абсорбции и элюции. №5А-2132 и ВИЧ пептид использовали в качестве положительного контроля и отрицательного контроля соответственно (см. описание выше в отношении подробностей испытаний абсорбции и элюции). Антипептид 1§С ни абсорбировали, ни элюировали целым N85 белком (фиг. 20), что говорит о том, что данный пептид 1§С не реагировал с целым Ν85 белком.
Затем, Ни117 клетки инкубировались до трех дней в присутствии сывороток от пациентов (сыворотки от 2 НСV-1Ь+ пациентов, сыворотки которых показывали высокий уровень анти-№5А-2132 активности). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки от 2 НЭк и ЕС8. Число Ни117 (ΝΝυ50-1) клеток, которые могут выжить, подсчитывали с помощью Се11 Соип1 1<ίΐ-8 (набор-8 для подсчета клеток) (10 мкл/лунку), и показаны средние значения от трех анализов. Ни одна из испытуемых сывороток не ингибировала рост Ни117 (ΝΝυ50-1) клеток в данных условиях культивирования (фиг. 21). Проверяли также, обладает ли анти-№5А-2132 1§С способностью опосредовать АЭСС активность. РВМС, вновь изолированный от НЬА-А24+ НЭ, испытывали на цитотоксичность против С1В-2402 клетки, предварительно пульсируемой данным пептидом, в присутствии упомянутых выше 4 типов инактивированных сывороток. Однако ни одна из испытуемых сывороток не показала АЭСС активность в данных условиях (фиг. 22).
Пример 3.
Предсказание прогноза пациентов, инфицированных НСV.
Объекты.
Сыворотки получали от 33 пациентов с заболеванием, связанным с НСV, в групповом исследовании, проводимом в период между 1995 и 2002 г. Результаты последующего обследования 33 пациентов показаны в табл. 4. В анализе использовали также сыворотки, полученные от пациентов с хроническим гепатитом (СН, п=68), циррозом печени (ЬС, п=43) и карциномой клеток печени (НСС, п=52). Данных
- 14 009782 пациентов диагностировали во время взятия первой пробы сыворотки с помощью биохимических и гистологических исследований, эхографии и компьютерной томографии. Анти-НСУ антитело анализировали с использованием набора для ферментного иммуноанализа хемилюминисценции (СЬЕ1Л) (Ьиш1ри1§е II НСУ, РиргеЬю 1пс., Токио, Япония) или ферментного иммуноанализа второго или третьего поколения (8КЬ, Токио, Япония). НСУ-РНК в сыворотках обнаруживали с использованием КТ-РСК (8КЬ, Токио, Япония). НСУ генотип определяли с помощью непосредственного секвенирования НСУ в сыворотках пациентов с помощью КТ-РСК (8КЬ, Токио, Япония). Сыворотки получали также от субъектов, которые не были заражены НСУ, и которые включали 24 пациента с аутоиммунным заболеванием (6 пациентов с системной красной волчанкой, один с болезнью ВеЬсеГз и 17 с атипическим дерматитом), 17 случаев заражения вирусом гепатита В (НВУ) (положительные для НВУ поверхностного антигена), 3 пациентов с вирусом иммунодефицита человека (Н1У или ВИЧ) и 10 случаев заражения вирусом Т-клеточной лейкемии человека типа I (НТЬУ-1). В качестве отрицательного контроля испытывали сыворотки, полученные от 37 пациентов, у которых не было вирусного гепатита или вакцинирования НВУ и которые имели нормальную функцию печени.
Таблица 4
СН: хронический гепатит; ЬС: цирроз печени;
НСС: карцинома клеток печени;
А8С: носитель асимптоматического здоровья.
Пептид.
Два пептида с чистотой 90% или более закупали у фирмы ВЮ8ΥNТНЕ8I8 (ЬеА18У111е, ТХ): НСУ-1Ь сердцевинный белок 35-44 (УЬЬРККОРКЬ (8ЕР ГО N0:1) способный индуцировать НЬ8-А2рестрицированную СТЬ активность) и НСУ-1Ь Ν85Α белок 2132-2140 (КУАРАСКРЬ (8ЕР ГО N0:2), способный индуцировать НЬА-А24-рестрицированную СТЬ активность). В качестве отрицательного контроля использовали пептиды, происходящие из ВИЧ с НЬА-А2-связующим мотивом (8РУКГУАТР (8Ер ГО N0:64)) и НЬА-А24-связующим мотивом (КΥ^К^^^^^ОI (8Ер ГО N0:63)).
Анализ антитела, реакционноспособного к пептиду.
Уровень пептид-специфического ^О измеряли с помощью фермент-связываемого иммуносорбентного анализа (ЕЫ8А).
Вкратце, каждый пептид растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и хранили при -20°С. Пептид (20 мкг/лунку), разбавленный 0,1М карбонатным буфером, содержащим дисукцинимидилсуберат (Ό88) (РГЕКСЕ, КоскГогб, IК) в качестве химического сшивателя, связывали с ЕЕ18А планшетой. Лунки промывали 3 раза смесью 0,05% Твин 20/РВ8 (РВ8Т). Затем планшету блокировали на протяжении ночи при 4°С с помощью В1оск Асе (Уику1ги§Ы, Токио, Япония). Образец сыворотки разбавляли 1:100, 1:200 или 1:400 смесью 0,05% Твин 20/В1оск Асе, и в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку образца. После того как образец инкубировали при 37°С в течение 2 ч, планшету промывали 9 раз РВ8Т, и дополнительно инкубировали при 37°С в течение 2 ч с 100 мкл/лунку 1:1000 разбавленного античеловечьего ГО'! кролика (γ-цепь специфического) (ИАК0 О1о§1гир, Дания). После того как планшету промывали 9 раз, в каждую лунку добавляли 100 мкл/лунку 1:100 разбавленного сопряженного или конъюгированного с антикроличьим ГО'! пероксидаза хрена-декстранового полимера (Еп УЫоп, ИАК0), а затем планшету инкубировали при комнатной температуре в течение 40 мин. После того как планшету промывали, добавляли 100 мкл/лунку тетраметилбензидинсубстратного раствора (КРЬ, Ош1бГогб. ИК), и реакцию прекращали добавлением 1,0М фосфорной кислоты.
- 15 009782
Статистика.
Статистический анализ осуществляли с использованием /2-теста. Значения Р<0,05 считались статистически значимыми.
Перекрестная реакционноспособность, рестрикция НЬА и рестрикция генотипа.
Проверяли перекрестную реакционноспособность двух антител, реакционноспособным к пептидам, происходящим из НСУ-1Ь. Сыворотки, полученные от 60 НСУ пациентов и пациентов, которые не включаются в групповое исследование (СН, п=22, ЬС, п=21 и НСС, п=17), проверяли на реакционноспособность к пептидам сердцевины 35-44 (С-35) и Ν85Λ 2132-2140 (Ν85Ά-2132). Сыворотки также получали от 24 субъектов с аутоиммунным заболеванием, 17 случаев инфекции НВУ и 10 случаев инфекции НТЬУ-1. Сыворотки, полученные от 37 НЭк, использовали в качестве отрицательного контроля. Уровень пептид-реакционноспособного ЦС, содержащегося в серийно разбавленных образцах сыворотки, измеряли с помощью ЕЫ8А. Результаты приводили по абсорбции (ΟΌ) каждого образца. Показаны характерные результаты ΘΌ при разведении сыворотки 100:1. Величину отсечки устанавливали на 0,093 (среднее ± 2 8Ό ΘΌ от НЭк). Статистический анализ осуществляли с использованием /2-теста. Значения Р<0,05 считали статистически значимыми.
В результате, значительный уровень анти-С-35 1дС обнаруживался у 56 из 60 НСУ-положительных пациентов (93,3%), и не было значительной разницы в уровне 1дС среди 3 групп (СН, ЬС и НСС пациентов) (фиг. 23). За исключением НТЬУ-1 пациентов, сыворотки от различных групп не были положительными для анти-С-35 антитела. В сыворотках 8 из 10 случаев НТЬУ-1+ субъектов обнаружился низкий, но существенный уровень анти-С-35 1дС. Значительный уровень анти-№5Л-2132 1дС был обнаружен у 45 из 60 пациентов (75%). Уровень 1дС был высоким у СН пациентов, промежуточным у ЬС пациентов и низким у НСС пациентов в 3 группах (р<0,05 против СН) (фиг. 23). Сыворотки от других групп были положительными, что касается анти-№5Л-2132 1дС, в большинстве испытанных случаев. Далее, сыворотки 3 из 37 НЭк, что касается анти-№5А-2132 1дС, были положительными.
Затем у 29 пациентов с заболеванием, связанным с НСУ, проверяли корреляцией между НЬА-класс 1А фенотипом и уровнем анти-С-35 1дС или анти-№5А-2132 1дС. НЬА-класс 1А фенотип определяли стандартным серологическим методом. 9 пациентов были НЬА-А2+, 13 пациентов были А24+, и остальные 7 пациентов были А2-А24-. Уровни анти-С-35 и анти-№5А-2132 измеряли стандартным методом ЕЫ8А, и на чертеже показано значение ΘΌ каждого пациента при разведении сыворотки 100:1. Независимо от разницы в НЬА-класс 1А фенотипе, оба антитела обнаруживали у большинства пациентов, инфицированных НСУ (фиг. 24).
Проверяли также корреляцию между НСУ генотипом и уровнем анти-С-35 1дС или анти-№5А2132 1дС в двойном слепом исследовании у пациентов, инфицированных НСУ-1Ь (п=29), НСУ-2а (п=16) и НСУ-2Ь (п=3). Генотип НСУ определяли с помощью непосредственного секвенирования НСУ в сыворотке пациента. Результаты всех субъектов при разведении 100:1 показаны на фиг. 25. Уровни анти-С-35 и анти-№5А-2132 измеряли стандартным методом ЕЬ18А, и показано значение ΘΌ каждого пациента при разведении сыворотки 100:1. Величину отсечки устанавливали на 0,093 (среднее ± 2 8Ό ΘΌ от НЭк).
Анти-С-35 антитело обнаруживалось у 26 из 30 пациентов, инфицированных НСУ-1Ь, 15 из 15 пациентов, инфицированных НСУ-2а, и 3 из 3 пациентов, инфицированных НСУ-2Ь, соответственно. Аналогично, анти-№5А-2132 антитело обнаруживали в сыворотке 23 из 30 пациентов, инфицированных НСУ-1Ь, 10 из 16 пациентов, инфицированных НСУ-2а, и 3 из 3 пациентов, инфицированных НСУ-2Ь, соответственно (фиг. 25). Данные результаты указывают на то, что и анти-С-35 антитела, и анти-№5А2132 антитела обнаруживали у НСУ-положительных пациентов независимо от разницы в НЬА-класс 1А подтипе и в НСУ-генотипе.
Указанные выше результаты говорят о том, что уровень анти-№5А-2132 антитела коррелирует с прогнозом индивидуума, инфицированного НСУ, но не в случае с анти-С-35 антителом.
Затем заново приготавливали сыворотки СН (п=24), ЬС (п=22), НСС (п=26) и НЬк (п=9), и измеряли уровень анти-№5А-2132 1дС (фиг. 26). Значения среднее ± 8Ό для СН, ЬС, НСС и НО групп были 0,51±0,24, 0,27±0,20, 0,26±0,23 и 0,08±0,07 соответственно. Уровни анти-№5А-2132 антитела у ЬС и НСС пациентов были значительно ниже, чем уровень у СН пациентов (р<0,05), но все же выше, чем у НЭк. Для того чтобы сравнить данные результаты с результатами, измеренными с помощью стандартного анализа третьего поколения, для всех сывороток измеряли уровень анти-НСУ антитела с использованием промышленно доступного набора (анализ третьего поколения, 8КЪ). Уровень представлен экспонентой (левая колонка). Корреляция между анти-НСУ уровнем и анти-№5А-2132 уровнем, представленным экспонентой, показана в правой колонке. Уровни анти-НСУ антитела, измеренные с использованием анализа третьего поколения, незначительно различали среди 3 групп (СН: 10±2,7, ЬС: 11±1,4, НСС: 11±1,1) (фиг. 27). Далее, измеряли НСУ РНК уровень для всех сывороток с использованием промышленно доступного набора (8ВЬ, Япония). Уровень НСУ РНК НСС пациентов (360±269,6) был ниже, чем уровень СН пациентов (610±347,3) или ЬС пациентов (610±246,4) (р<0,05) (фиг. 28). Однако не было никакой видимой корреляции между уровнем анти-№5А антитела и уровнем НСУ РНК (фиг. 28).
- 16 009782
Результаты группового исследования.
Для того чтобы дополнительно исследовать корреляцию между анти-Ы85А-2132 антителом и прогнозом НСУ-положительного пациента при индивидуальном уровне, проверяли сывороточные уровни двух антител в образце от группового исследования, при котором ежегодно с 1990 до 2002 г. подвергались скринингу обитатели, инфицированные НСУ. Данное исследование проводили в целом с 66 образцами сыворотки, которые получали от 33 пациентов и собирали от одних и тех же индивидуумов дважды в 1995 и 2002 г. Диагнозами данных 33 пациентов были СН (п=17), ЬС (п=1), асимптоматический носитель (А8С) (п=4), с прошлой историей НСУ заражения (индивидуум, самопроизвольно выздоровевший) (п=11) в 1995 г., и СН (п=13), ЬС (п=4), НСС (п=2), асимптоматический носитель (А8С) (п=1), и прошлая история НСУ заражения (п=13) в 2002 г. Другими словами, за период семи лет прогрессирование заболевания не наблюдалось у 26 пациентов, в то время как у остальных 7 пациентов прогресс наблюдался (табл. 4). На фиг. 29 показаны значения ΘΌ анти-С-35 антитела и анти-Ы85А-2132 1§С у каждого пациента, измеренные при разведении сыворотки 100:1 в 1995 и 2002 г. Как и ожидалось, у большинства из 33 случаев уровни анти-С-35 антитела, измеренные в 1995 и 2002 г. были почти равными, несмотря на условия болезни. В противоположность этому уровень анти-Ы85А антитела, измеренный в 1995 г., снижался по данным измерения в 2002 г. у всех 7 пациентов, заболевания которых прогрессировали, тогда как данные значения были почти равными значениям, измеренным в 2002 г., у большинства из 25 случаев, у которых болезнь не прогрессировала. Среднее значение ± 8Ό анти-Ы85А-2132 антитела в сыворотке 7 пациентов, болезнь которых прогрессировала, измеренное в 1995 г. (0,67±0,13), было значительно выше, чем данное значение (0,27±0,11), измеренное в 2002 г. (р<0,05).
Затем 33 субъекта подразделяли на 5 групп (СН, ЬС, НСС, пациент в прошлом с медицинской историей заражения НСУ (выздоровевший индивидуум), и А8С) и наносили на график (фиг. 30) уровни двух антител при разбавлении сыворотки 100:1 в 2002 г. Статистический анализ осуществляли с использованием '//-испытания. Считали, что величины р<0,05 являются статистически значимыми. Уровень антитела анти-С-35 был высоким у любого из СН, ЬС и НСС пациентов, но он становился очень низким или недетектируемым у выздоровевших индивидуумов. С другой стороны, уровень антитела анти-Ы85А2132 был высоким у пациентов СН, выздоровевшего индивидуума и А8С, промежуточным у ЬС и наиболее низким у пациентов НСС (р<0,05 против СН).
Пример 4.
Обнаружение 1дО реакционноспособного к пептиду НСУ в сыворотках НЬА-А24+ НСУинфицированных пациентов с использованием анализа Ьиттех.
Уровень 1дО реакционноспособного к пептиду НСУ в сыворотках НЬА-А24+ НСУинфицированных пациентов измеряли таким же образом, как в примере 1, с использованием анализа Ьиттех, который считается более чувствительным, чем метод ЕЫ8А.
Соединение пептида с микрошариками.
Каждый пептид соединяли с микрошариками (производимыми фирмой Ьиттех Согрогайоп, хМАР Ми11и-Апа1у1е СООН шарики), которые кодировались с помощью классификационного кода на содержание каждого флуоресцентного красителя (называемые ниже кодированными цветом) согласно инструкции производителя. 100 мкл в неподготовленных кодированных цветом микрошариков помещали в каждую лунку фильтровальной планшеты и аспирировали, а затем промывали дважды промывочным буфером (забуференный фосфатом солевой раствор (РВ8) (рН 7,4±0,1), Твином (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о)), и каждую лунку аспирировали в то же самое время. Затем добавляли 50 мкл 0,1М МЕ8 (2-морфолиноэтансульфоновая кислота) буфера (рН 7,0), и в каждую лунку добавляли 10 мкл гидрохлорида ЕИС (Н-этил-Ы'-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) (1 мг/мл/0,1М МЕ8 буфера (рН 7,0)). Несколько сот микролитров пептида (1 мг/мл, 0,1М МЕ8 буфер, рН 7,0) смешивали с промытыми микрошариками в каждой лунке. После того как пептид и смешанные микрошарики подвергали реакции в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре, в каждую лунку добавляли 10 мкл ЕИС (1 мг/мл/0,1М МЕ8 буфер (рН 7,0)), и смесь оставляли реагировать в темноте в течение 20 мин при комнатной температуре. Данный процесс повторяли дважды. После того как избыточный раствор аспирировали, в каждую лунку добавляли 100 мкл 1М ТП5-НС1 буфера (рН 7,0), и смесь оставляли реагировать в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем шарики в каждой лунке промывали 3 раза промывочным буфером, как описано выше, и собирали в растворе для хранения, содержащем 0,05% азида натрия в В1оск Асе (зарегистрированная торговая марка).
Получение смеси микрошариков.
Микрошарики для каждой лунки приготавливаются путем помещения раствора шариков, полученного путем связывания пептида с кодированными цветом микрошариками, таким образом, чтобы в каждой лунке фильтровальной планшеты содержалось около 5000 микрошариков (каждая лунка содержит около 1 мкл шариков одного типа). Смесь шариков приготавливали путем смешения равного количества десяти типов микрошариков, полученных таким же образом, и разбавления смеси с упомянутым выше промывочным буфером (РВ8, ТВИН (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о)) так, чтобы дать общее количество около 25 мкл.
- 17 009782
Получение образца.
В данном исследовании использовали сыворотку. Получали 100 мкл сыворотки каждого разведения путем разбавления сыворотки при соотношении 1:100 до 1:1000 реакционным буфером РВ8 (рН 7,4±0/1), Твином (зарегистрированная торговая марка) 20 (0,05% о/о), и бычьим сывороточным альбумином (В8А) 10 мг/мл.
Анализ антипептидного антитела.
В качестве вторичного антитела использовали биотинилированный козий античеловеческий 1дО (γцепь специфический), разбавленный реакционным буфером. Стрептавидин (1 мг/мл), меченный РЕ (фикоэритрином) (8КРЕ) разводили до 20 мкл (1/50 разведение) упомянутым выше реакционным буфером и использовали в качестве флуоресцентного меченного красителем стрептавидина.
В каждую лунку фильтровальной планшеты помещали 100 мкл промывочного буфера, а затем удаляли аспирированием. Данную стадию промывки осуществляли два раза. Затем, 96-луночную фильтровальную планшету, содержащую 25 мкл вышеупомянутой смеси шариков в каждой лунке, промывали дважды промывочным буфером. После промывки во все лунки добавляли 100 мкл образца. Фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 2 ч при комнатной температуре и аспирировали. Затем в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза.
Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл биотинилированного вторичного антитела, т.е. биотинилированного козьего античеловеческого 1дО (γ-цепь специфического), и фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре. После аспирации в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза.
Впоследствии в каждую лунку добавляли 100 мкл 8КРЕ, и фильтровальную пластину накрывали и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре. После аспирации в каждую лунку помещали 100 мкл промывочного буфера и удаляли с помощью аспирации. Данную стадию промывки осуществляли три раза. После этого в каждую лунку добавляли 100 мкл промывочного буфера и встряхивали с помощью пластинчатого шейкера (300 об/мин) в течение 2-3 мин, а затем 50 мкл образца, полученного таким образом, анализировали с помощью реометрической системы флуоресценции. Результаты показаны на фиг. 31 и 32 и в табл. 5.
Таблица 5
| № | Наименование пептида | Условные обозначения | Область | Последовательность | 5ЕО Ю N0 | НСУ пациенты (п=10) | Здоровые доноры (п=10) | ||
| Положительные | Положительные | ||||||||
| п | % | η | % | ||||||
| 4 | 1ЬА24-717 | Е2-717 | Е2 | ЕУУЬЬЬРЫ. | 8 | 6 | 60 | 2 | 20 |
| 14 | 1ЬА24-1716 | Ν34Β-1716 | Ν54Β | ΡΥΙΕΟΟΜβΕ | 16 | 6 | 60 | 1 | 10 |
| 18 | 1ЬА24-885 | N32-885 | N52 | 1РТ1ТК1ЬЬ | 20 | 9 | 90 | 2 | 20 |
| 39 | 1ЬА24-711 | Е2-711 | Е2 | ΒΡΑΙΚΝΕΥΥΕ | 38 | 6 | 60 | 2 | 20 |
Пример 5.
Лечение НСУ инфекции с использованием пептидной вакцины, происходящей из вируса гепатита С.
Антивирусный эффект вакцины, включающей пептид, происходящий из вируса гепатита С, настоящего изобретения проверяли на НСУ-инфицированных НБА-А2 или НБА-А24 субъектах. Всех субъектов инфицировали вирусом НСУ-1Ь и они не показывали никакой ответной реакции на лечение интерфероном и рибавирином. Пептиды, получаемые из вируса гепатита С, С-35, Н85А-2132, Е2-488, Е1-213 и N83-1081, синтезировали, очищали и хранили в виде лиофилизированного порошка согласно ОМР. Пептиды С-35, Ν85Ά-2132, Е2-488 и N83-1081 растворяли в небольшом количестве ДМСО (1 мг/10-25 мкл), а Е1-213 растворяли в 7% растворе бикарбоната натрия для инъекций (Меу1оп) (1 мг/15 мкл). Каждый раствор разбавляли физиологическим солевым раствором для инъекций (1-2 мг/мл) и стерилизовали с помощью фильтрации через 0,22 мкм фильтр. Каждый из получающихся растворов смешивали с равным количеством адъюванта (Моп1ашбе 18А-51), давая эмульгируемые инъекционные растворы. Инъекционный раствор С-35 вводили 3 субъектам из НБА-А2+, а инъекционный раствор N85А-2132 вводили 5 субъектам из группы НБА-А24+. Пептид вводили каждые две недели путем инъецирования эмульсии, содержащей 0,3 мг пептида на дозу, в латеральную область. Уровень НСУ РНК и величины ООТ, ОРТ, γ-ОТР и АРР контролировали непрерывно.
Результаты показаны на фиг. 33 и фиг. 34. Как видно из этих чертежей, уровень НСУ РНК заметно снижался после введения вакцины, инициируемого у большинства анализируемых субъектов, демонстрируя, что пептиды настоящего изобретения являются эффективными в качестве анти-НСУ вакцины.
- 18 009782
Промышленная применимость
Пептид, получаемый из вируса гепатита С, согласно изобретению содержит в своей последовательности НЬА-связывающий мотив. Он распознается антителом, реакционноспособным к вирусу гепатита С, а также имеет свойство быть распознаваемым НЬЛ-Л2-или НЬА-А24-специфичными цитотоксическими Т-клетками.
Соответственно, пептид, получаемый из вируса гепатита С, согласно изобретению мог бы быть эффективной вакциной от заболеваний, относимых за счет НСУ инфекции.
Claims (25)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Пептид, происходящий из вируса гепатита С, содержащий НЬА-связывающий мотив в своей последовательности и распознаваемый антителом, обнаруживаемым у пациента с инфекцией вируса гепатита С, где пептид состоит из аминокислотной последовательности, представленной любой из последовательностей БЕО 1И N08: 2, 3, 4, 5, 16, 20 и 38.
- 2. Пептид, происходящий из вируса гепатита С по п.1, отличающийся тем, что пептид дополнительно обладает свойством быть распознаваемым НБА-А2- или НЬА-А24-специфичными цитотоксическими Т-клетками.
- 3. Нуклеотид, кодирующий пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2, или нуклеотид, имеющий последовательность, комплементарную с ним.
- 4. Антитело или вещество с антитело-подобной активностью, которое распознает пептид, происходящий из вируса гепатита С, заявленный в п.1 или 2.
- 5. Вектор, включающий вышеупомянутый нуклеотид по п.3.
- 6. Способ индуцирования цитотоксических Т-клеток путем применения пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.
- 7. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.
- 8. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием нуклеотида по п.3.
- 9. Способ обнаружения вируса гепатита с использованием антитела или вещества с антителоподобной активностью по п.4.
- 10. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.
- 11. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.
- 12. Способ диагностики инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.
- 13. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.
- 14. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.
- 15. Способ профилактики или лечения инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.
- 16. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2.
- 17. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента нуклеотид по п.3.
- 18. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4.
- 19. Фармацевтическая композиция по пп.16, 17 или 18, отличающаяся тем, что она представляет вакцину вируса гепатита С.
- 20. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием пептида, происходящего из вируса гепатита С и заявленного в п.1 или 2.
- 21. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием нуклеотида по п.3.
- 22. Способ предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С с использованием антитела или вещества с антитело-подобной активностью по п.4.
- 23. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя пептид, происходящий из вируса гепатита С и заявленный в п.1 или 2.
- 24. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя нуклеотид по п.3.
- 25. Набор для диагностики инфекции вируса гепатита С или предсказания прогноза инфекции вируса гепатита С, включающий в себя антитело или вещество с антитело-подобной активностью по п.4.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003330258 | 2003-09-22 | ||
| PCT/JP2004/014312 WO2005028503A1 (ja) | 2003-09-22 | 2004-09-22 | Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200600639A1 EA200600639A1 (ru) | 2006-08-25 |
| EA009782B1 true EA009782B1 (ru) | 2008-04-28 |
Family
ID=34372985
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200600639A EA009782B1 (ru) | 2003-09-22 | 2004-09-22 | Пептид, происходящий из вируса гепатита с |
| EA200701870A EA200701870A1 (ru) | 2003-09-22 | 2004-09-22 | Пептид, происходящий из вируса гепатита с |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200701870A EA200701870A1 (ru) | 2003-09-22 | 2004-09-22 | Пептид, происходящий из вируса гепатита с |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20080063643A1 (ru) |
| EP (3) | EP2062590A1 (ru) |
| JP (2) | JP4342519B2 (ru) |
| KR (2) | KR20060087574A (ru) |
| CN (3) | CN102659922B (ru) |
| CA (1) | CA2539789A1 (ru) |
| EA (2) | EA009782B1 (ru) |
| TW (1) | TW200513260A (ru) |
| WO (1) | WO2005028503A1 (ru) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1757687A4 (en) * | 2004-04-30 | 2008-01-16 | Nec Corp | HLA BINDING PEPTIDE, PRE-STEP, DNA DOMAGING AND RECOMBINANT VECTOR |
| JPWO2006080340A1 (ja) * | 2005-01-28 | 2008-06-19 | 株式会社グリーンペプタイド | Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドとインターフェロンとの併用療法 |
| JP4615567B2 (ja) * | 2005-04-19 | 2011-01-19 | 株式会社グリーンペプタイド | Ｃ型肝炎ウイルス感染に関連する肝疾患の予後の予測 |
| JP2009091249A (ja) * | 2006-01-23 | 2009-04-30 | Univ Kurume | Ｃ型肝炎ウイルス２ａ由来ＨＬＡ−Ａ２拘束性抗原ペプチド |
| EP1982728A4 (en) * | 2006-01-23 | 2009-11-11 | Greenpeptide Co Ltd | HEPATITIS C-VIRUS DERIVED PEPTIDE |
| WO2007094137A1 (ja) * | 2006-02-17 | 2007-08-23 | Nec Corporation | 細胞傷害性ｔ細胞の誘導方法、細胞傷害性ｔ細胞の誘導剤、およびそれを用いた医薬組成物およびワクチン |
| WO2007137456A1 (fr) * | 2006-06-01 | 2007-12-06 | Yun Cheng | Peptide pour la prévention ou le traitement d'atteinte hépatique et son dérivé ainsi que son utilisation |
| WO2010050181A1 (ja) * | 2008-10-27 | 2010-05-06 | 株式会社グリーンペプタイド | Ｃ型肝炎ウイルスによる肝癌の発症および再発予防ワクチン |
| CN101696974B (zh) * | 2009-09-29 | 2013-03-06 | 才新 | Hla抗体特异性检测方法及细胞盘与试剂盒 |
| FR2980362B1 (fr) | 2011-09-27 | 2013-10-04 | Sederma Sa | Nouvelle utilisation cosmetique d'un extrait d'albizia julibrissin et composition topique correspondante |
| FR3007289B1 (fr) | 2013-06-24 | 2015-06-19 | Caster | Compositions cosmetiques comprenant des extraits de plantes pour lutter contre le vieillissement cutane |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03228681A (ja) * | 1990-01-31 | 1991-10-09 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドをコードする核酸断片およびその利用法 |
| WO1993011158A2 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-10 | Akzo Nobel N.V. | Non-a, non-b peptides |
| JPH08500106A (ja) * | 1992-08-07 | 1996-01-09 | サイテル コーポレイション | Ｈｌａ結合性ペプチド及びその用途 |
| JPH0873497A (ja) * | 1994-08-31 | 1996-03-19 | Tonen Corp | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
| JPH08507525A (ja) * | 1993-03-05 | 1996-08-13 | サイテル コーポレイション | Ｈｌａ−ａ２．１結合ペプチドおよびそれらの使用 |
| WO2001070772A2 (fr) * | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Pierre Fabre Medicament | Molecule d'interet pharmaceutique comportant en son extremite n-terminale un acide glutamique ou une glutamine sous forme de sel d'addition d'acide |
| JP2001522599A (ja) * | 1997-11-06 | 2001-11-20 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 診断用及びワクチン用、ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質由来マルチマーペプチド |
| WO2002004484A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Medmira Inc. | Hcv mosaic antigen composition |
| JP2002507397A (ja) * | 1998-03-13 | 2002-03-12 | エピミューン，インコーポレイティド | Ｈｌａ結合ペプチド及びその使用 |
| JP2002510038A (ja) * | 1998-03-27 | 2002-04-02 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | ウイルスエンベロープ蛋白中のエピトープおよびこれらのエピトープに対して指向された特異的抗体：宿主組織中のｈｃｖウイルス抗原の検出のための使用 |
| JP2002520000A (ja) * | 1998-05-13 | 2002-07-09 | エピミューン， インコーポレイテッド | 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法 |
| WO2002055548A2 (en) * | 2001-01-11 | 2002-07-18 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis c virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| US20020119127A1 (en) * | 1999-12-28 | 2002-08-29 | Alessandro Sette | Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby |
| JP2003509465A (ja) * | 1999-07-19 | 2003-03-11 | エピミューン， インコーポレイテッド | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 |
| WO2003084988A2 (de) * | 2002-04-10 | 2003-10-16 | Immusystems Gmbh | Cd4+ t-lymphozyten spezifische hepatitis c virus-epitope |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3886363T3 (de) | 1987-11-18 | 2004-09-09 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | NANBV-Diagnostika |
| US5747339A (en) * | 1990-06-25 | 1998-05-05 | Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka | Non-A, non-B hepatitis virus genomic CDNA and antigen polypeptide |
| BR9206131A (pt) * | 1991-06-10 | 1995-05-02 | Lucky Ltd | Hepatite C: diagnóstico e vacinas |
| ATE525384T1 (de) * | 2000-05-23 | 2011-10-15 | Univ Washington | Varianten des hepatitisvirus |
| EP1195381A1 (de) * | 2000-09-28 | 2002-04-10 | Immusystems GmbH | CD4+ T-Lymphozyten spezifische Hepatitis C Virus-Epitope |
| WO2002083124A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-10-24 | Probiochem, Llc | A composition and method of sustaining chemotherapeutic effect while reducing dose of chemotherapeutic agent using cox-2 inhibitor and statin |
| US7101561B2 (en) * | 2000-12-01 | 2006-09-05 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis C virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| JP2003330258A (ja) | 2002-05-13 | 2003-11-19 | Sharp Corp | 画像形成装置 |
| WO2005118626A2 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | Innogenetics N.V. | Peptides for inducing a ctl and/or htl response to hepatitis c virus |
| EP1982728A4 (en) * | 2006-01-23 | 2009-11-11 | Greenpeptide Co Ltd | HEPATITIS C-VIRUS DERIVED PEPTIDE |
-
2004
- 2004-09-22 EP EP08021733A patent/EP2062590A1/en not_active Withdrawn
- 2004-09-22 JP JP2005514147A patent/JP4342519B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2004-09-22 TW TW093128767A patent/TW200513260A/zh unknown
- 2004-09-22 WO PCT/JP2004/014312 patent/WO2005028503A1/ja active Application Filing
- 2004-09-22 KR KR1020067005679A patent/KR20060087574A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-09-22 CA CA002539789A patent/CA2539789A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-22 US US10/573,032 patent/US20080063643A1/en not_active Abandoned
- 2004-09-22 KR KR1020077009198A patent/KR100818578B1/ko active IP Right Grant
- 2004-09-22 CN CN2012101446788A patent/CN102659922B/zh active Active
- 2004-09-22 EA EA200600639A patent/EA009782B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-09-22 EP EP04773486A patent/EP1676856A4/en not_active Withdrawn
- 2004-09-22 EP EP10009742A patent/EP2267004A3/en not_active Withdrawn
- 2004-09-22 CN CN2008100809383A patent/CN101230096B/zh active Active
- 2004-09-22 EA EA200701870A patent/EA200701870A1/ru unknown
- 2004-09-22 CN CNA2004800274434A patent/CN1856503A/zh active Pending
-
2008
- 2008-07-07 JP JP2008177165A patent/JP4342597B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03228681A (ja) * | 1990-01-31 | 1991-10-09 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 非ａ非ｂ型肝炎ウイルス抗原ペプチドをコードする核酸断片およびその利用法 |
| WO1993011158A2 (en) * | 1991-12-06 | 1993-06-10 | Akzo Nobel N.V. | Non-a, non-b peptides |
| JPH08500106A (ja) * | 1992-08-07 | 1996-01-09 | サイテル コーポレイション | Ｈｌａ結合性ペプチド及びその用途 |
| JPH08507525A (ja) * | 1993-03-05 | 1996-08-13 | サイテル コーポレイション | Ｈｌａ−ａ２．１結合ペプチドおよびそれらの使用 |
| JPH0873497A (ja) * | 1994-08-31 | 1996-03-19 | Tonen Corp | Ｃ型肝炎ウイルス感染又はグループ判定のためのエピトープキメラ抗原ペプチド、その製法、及びそれを使用する感染又はグループ判定法 |
| JP2001522599A (ja) * | 1997-11-06 | 2001-11-20 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | 診断用及びワクチン用、ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質由来マルチマーペプチド |
| JP2002507397A (ja) * | 1998-03-13 | 2002-03-12 | エピミューン，インコーポレイティド | Ｈｌａ結合ペプチド及びその使用 |
| JP2002510038A (ja) * | 1998-03-27 | 2002-04-02 | イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ | ウイルスエンベロープ蛋白中のエピトープおよびこれらのエピトープに対して指向された特異的抗体：宿主組織中のｈｃｖウイルス抗原の検出のための使用 |
| JP2002520000A (ja) * | 1998-05-13 | 2002-07-09 | エピミューン， インコーポレイテッド | 免疫応答を刺激するための発現ベクターおよびそのベクターの使用方法 |
| JP2003509465A (ja) * | 1999-07-19 | 2003-03-11 | エピミューン， インコーポレイテッド | ペプチドおよび核酸組成物を使用する、ｃ型肝炎ウイルスに対する細胞性免疫応答の誘導 |
| US20020119127A1 (en) * | 1999-12-28 | 2002-08-29 | Alessandro Sette | Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby |
| WO2001070772A2 (fr) * | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Pierre Fabre Medicament | Molecule d'interet pharmaceutique comportant en son extremite n-terminale un acide glutamique ou une glutamine sous forme de sel d'addition d'acide |
| WO2002004484A2 (en) * | 2000-07-07 | 2002-01-17 | Medmira Inc. | Hcv mosaic antigen composition |
| WO2002055548A2 (en) * | 2001-01-11 | 2002-07-18 | Innogenetics N.V. | Purified hepatitis c virus envelope proteins for diagnostic and therapeutic use |
| WO2003084988A2 (de) * | 2002-04-10 | 2003-10-16 | Immusystems Gmbh | Cd4+ t-lymphozyten spezifische hepatitis c virus-epitope |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Takao, Y. et al.: Antibody reactive to a hepatitis C virus (HCV)-derived peptide capable of inducing HLA-A2 restricted cytotoxic T lymphocytes is detectable in a majority of HCV-infected individuals without HLA-A2 restriction. Microbiol. Immunol., Vol. 48(7), pages 507 to 517 (2004 July) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20070050993A (ko) | 2007-05-16 |
| JP2009034102A (ja) | 2009-02-19 |
| KR100818578B1 (ko) | 2008-04-02 |
| CA2539789A1 (en) | 2005-03-31 |
| CN101230096B (zh) | 2012-07-04 |
| EP2267004A3 (en) | 2011-04-27 |
| CN101230096A (zh) | 2008-07-30 |
| KR20060087574A (ko) | 2006-08-02 |
| CN102659922B (zh) | 2013-11-06 |
| WO2005028503A1 (ja) | 2005-03-31 |
| EP2062590A1 (en) | 2009-05-27 |
| EP2267004A2 (en) | 2010-12-29 |
| EP1676856A4 (en) | 2008-03-05 |
| US20080063643A1 (en) | 2008-03-13 |
| JP4342519B2 (ja) | 2009-10-14 |
| TW200513260A (en) | 2005-04-16 |
| EA200600639A1 (ru) | 2006-08-25 |
| EA200701870A1 (ru) | 2008-02-28 |
| EP1676856A1 (en) | 2006-07-05 |
| CN1856503A (zh) | 2006-11-01 |
| JPWO2005028503A1 (ja) | 2007-11-15 |
| CN102659922A (zh) | 2012-09-12 |
| JP4342597B2 (ja) | 2009-10-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Mengist et al. | Mutations of SARS-CoV-2 spike protein: Implications on immune evasion and vaccine-induced immunity | |
| Taya et al. | Fas‐mediated apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in patients with hepatitis C | |
| JP4342597B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド | |
| Gladue et al. | Effects of the interactions of classical swine fever virus Core protein with proteins of the SUMOylation pathway on virulence in swine | |
| EP1625402B1 (en) | Detection, characterization and treatment of viral infection and methods thereof | |
| EP3063298B1 (en) | Hcbi sequences as an early marker for the future development of cancer and diseases of the cns and as a target for cancer treatment and prevention | |
| Xiang et al. | Characterization of a peptide domain within the GB virus C NS5A phosphoprotein that inhibits HIV replication | |
| Kann et al. | Molecular subtyping of feline immunodeficiency virus from domestic cats in Australia | |
| CA2187299A1 (en) | Hepatitis c virus core peptide for stimulation of cytotoxic t lymphocytes and diagnosis of hcv exposure | |
| Tu et al. | An HTLV-1 envelope mRNA vaccine is immunogenic and protective in New Zealand rabbits | |
| Chiang et al. | Induction of high affinity monoclonal antibodies against SARS-CoV-2 variant infection using a DNA prime-protein boost strategy | |
| US9624511B2 (en) | Specific TT virus sequences and chimeric TT virus host cell DNA molecules for use in diagnosis, prevention and treatment of cancer and autoimmunity | |
| WO2000066621A1 (en) | Peptides from the tt virus sequence and monospecific antibodies binding to the tt virus | |
| US20140128447A1 (en) | Novel non-primate hepacivirus | |
| WO2022199526A1 (en) | Hepatitis e virus-like particles and uses thereof | |
| US20240229066A1 (en) | Infectious recombinant vesicular stomatitis virus (rvsv) bearing the spike glycoprotein s of sars-cov-2 and uses thereof | |
| Cheng | Counteraction of APOBEC3 Proteins by Herpesvirus Ribonucleotide Reductases | |
| Sidarovich et al. | Host Cell Entry and Neutralization Sensitivity of SARS-CoV-2 Lineages B. 1.620 and R. 1. Viruses 2022, 14, 2475 | |
| AU776955B2 (en) | Preparation for the prevention and/or treatment of a tissue change of mesenchymal origin | |
| Rosenkranz et al. | Hepatitis B and Hepatitis D Viruses | |
| Gunalan | Virus host interactions in SARS coronavirus infection | |
| Zagrodney | Investigation into the function of two small nonstructural proteins of the parvovirus V19 | |
| Mohr | Gb virus C: Cellular interactions, HIV inhibition and natural history | |
| DeWire | Rhesus monkey rhadinovirus as a model system for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus | |
| Cockerell et al. | A deletion in the proximal untranslated pX region of human T-cell |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |