EA009287B1 - Получение l-аскорбиновой кислоты в результате микробиологического процесса - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении раскрывается выделенная полинуклеотидная молекула, полученная из полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий L-сорбозондегидрогеназную активность, включающая в себя по крайней мере 20 последовательных нуклеотидов из частичной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу получения L-аскорбиновой кислоты с высоким выхода продукта, в частности способу с использованием покоящихся клеток микроорганизма, способного превращать источники углерода в витамин С. Таким образом полученный витамин С может быть дополнительно подвергнут стадиями очистки и/или разделения.

Description

Настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, полученным из полинуклеотидов, кодирующих фермент, который превращает Ь-сорбозон непосредственно в Ь-аскорбиновую кислоту. Фермент Ь-сорбозондегидрогеназа (далее 8ΝΩΗαί) непосредственно превращает Ь-сорбозон в Ь-аскорбиновую кислоту (витамин С). Ь-сорбозондегидрогеназа (δΝΏΗαί) была получена с использованием бактерий рода С1исопоЬас1сг и Лсс1оЬас1сг. Настоящее изобретение также относится к процессу получения Ьаскорбиновой кислоты с высоким выходом продукта. Ь-аскорбиновая кислота широко используется в фармацевтической, пищевой и косметической промышленности.

На протяжении последних 70 лет Ь-аскорбиновую кислоту (витамин С) промышленным способом получали из Ό-глюкозы, применяя хорошо известный метод Райштейна. Все стадии этого процесса являются химическими, кроме одной стадии (превращение Ό-сорбитола в Ь-сорбозу), которая протекает в результате микробной трансформации. Со времени первоначального внедрения для промышленного получения Ь-аскорбиновой кислоты применяли несколько химических и технологических модификаций для увеличения эффективности метода Райштейна. Суммированные данные о последних усовершенствованиях получения витамина С представлены в иПшапп'к Епсус1ореб1а ок Ιηάιϊδίπηί СйешШту, 5'¹' Εάίίίοη, νοί. А27 (1996), рр. 547ίί. Недавно различные стадии получения витамина С были выполнены с помощью микроорганизмов или ферментов, выделенных из микроорганизмов.

Современные способы получения витамина С имеют некоторые нежелательные характеристики, как, например, высокое потребление энергии и применение больших количеств органических и неорганических растворителей. В силу вышесказанного за последние десятилетия были изучены другие способы получения Ь-аскорбиновой кислоты с использованием микробной трансформации, которые могут быть не только более экономичными, но и не наносящими вред экологии. Непосредственное продуцирование Ь-аскорбиновой кислоты было описано для некоторых микроорганизмов.

Оказалось, что непосредственное превращение Ь-сорбозона в Ь-аскорбиновую кислоту может быть выполнено с использованием Ь-сорбозондегидрогеназы (далее называемая δΝΏΗαί), выделенной из О. охубапк N44-1 или ферментов, являющихся ее ортологами, происходящими из уксусно-кислых бактерий, принадлежащих к роду О1исопоЬас1ет и Асе1оЬас1ет. Был выделен ген, ответственный за эту реакцию, и определена его нуклеотидная последовательность. Фермент сорбозондегидрогеназа, кодируемый этим геном, превращает Ь-сорбозон в Ь-аскорбиновую кислоту. Этот фермент отличается от известных 8ΝΏΗ ферментов.

Ь-аскорбиновая кислота, или, как равнозначно употребляется здесь, витамин С, может быть в любой химической форме Ь-аскорбиновой кислоты, присутствующей в водных растворах, как, например, недиссоциированной, в форме свободной кислоты или диссоциированной как анион. Форма растворимой соли Ь-аскорбиновой кислоты может быть определена как анион в присутствии любого вида катионов, обычно обнаруживаемых в супернатантах после ферментации, как, например, калий, натрий, аммоний или кальций. Также могут быть включены выделенные кристаллы свободной Ь-аскорбиновой кислоты. С другой стороны, названия выделенных кристаллов соли Ь-аскорбиновой кислоты происходят от названия соответствующей соли, например аскорбат натрия, аскорбат калия, аскорбат кальция и т.п.

Превращение Ь-сорбозона в витамин С означает, что превращение субстрата, приводящее к образованию витамина С, осуществляется с помощью ΞΝΟΗηί. то есть субстрат может быть непосредственно превращен в витамин С.

Клонирующий вектор может представлять собой, например, любую плазмиду, или фаговую ДНК, или другую последовательность ДНК, которая способна автономно реплицировать в клетке хозяина и для которой характерно наличие одного или небольшого количества сайтов узнавания рестрикционными эндонуклеазами, в которых такие последовательности ДНК могут быть разрезаны на поддающиеся определению участки без потери основной биологической функции вектора и в которых фрагмент ДНК может быть сплайсирован для того, чтобы осуществить его репликацию. Клонирующий вектор также может содержать, например, маркер, пригодный для использования при идентификации клеток, трансформированных с клонирующим вектором. Такие маркеры могут обеспечить, например, устойчивость к антибиотикам, например к тетрациклину или ампицилину.

Вектором экспрессии может быть любой вектор, который способен усилить экспрессию гена, который был клонирован, например, после трансформации в клетку-хозяина. Клонируемый ген обычно включается под контролем (например, функционально связанных) определенных контрольных последовательностей, таких как, например, промоторные последовательности. Промоторные последовательности могут быть регулируемыми или индуцибельными.

Молекула нуклеиновой кислоты может включать в себя ДНК и РНК. В качестве молекулы нуклеиновой кислоты может быть использована любая форма, например двухцепочечная, одноцепочечная нуклеиновая кислота и нуклеотиды. Также могут быть включены гибриды, такие как, например, гибриды ДНК-РНК, гибриды ДНК-РНК-белок, гибриды РНК-белок и гибриды ДНК-белок. Полинуклеотиды могут состоять из нескольких оснований, обычно по крайней мере из 20 оснований.

Термин «гомологичный» определяет схожесть последовательностей двух полинуклеотидов. Для того, чтобы установить гомологию, последовательности полинуклеотидов располагают таким образом, чтобы можно было сравнить аналогичные области. При необходимости, нуклеотиды в определенных поло

- 1 009287 жениях могут быть заменены пропусками с целью достижения большей схожести. Сопоставление гомологии можно выполнить, например, вручную или с помощью коммерчески доступных компьютерных программ. Для того, чтобы достичь максимальной гомологии, предпочтительной является программа, которая работает при стандартных условиях. Степень гомологии или схожести между двумя последовательностями нуклеотидов приводится в «% гомологии».

Мутация может представлять собой, например, изменение одной пары нуклеотидов, вставку или делецию в интересующей нуклеотидной последовательности или генетическое событие, например вставку такого генетического элемента как, например, транспозон.

Накопление мутаций ДНК, то есть «мутагенез», может осуществляться различными путями, например случайно, то есть неспецифический мутагенез, где точный сайт мутации непредсказуем, встречается где угодно на хромосоме (хромосомах) микроорганизма или в эндогенной плазмиде (плазмидах). Мутация также может накапливаться, например, в результате физического повреждения, вызванного такими агентами, как, например, радиация, химическая обработка или вставка генетического элемента.

В качестве промотора может быть использована любая последовательность ДНК, которая расположена проксимально от старт-кодона соответствующего гена и которая инициирует транскрипцию одного или нескольких прилегающих генов (гена). В большинстве случаев промотор может быть расположен в 5'-области соответствующего гена. Промотор может быть индуцибельным или регулируемым. В случае индуцибельного промотора интенсивность транскрипции увеличивается в ответ на агент индукции. В случае регулируемого промотора интенсивность транскрипции не является регулируемой, например, агентом индукции.

Понятие «идентичность» и «% идентичности» относится к сравнению двух аминокислотных последовательностей с использованием такой программы для анализа последовательности, как представлена в качестве примера ниже. «% идентичности» относится к процентному содержанию аминокислот в исследуемой аминокислотной последовательности, которые совпадают с идентичными аминокислотами в сравниваемой аминокислотной последовательности. Если обе сравниваемые аминокислотные последовательности не имеют отличия ни по одной аминокислоте, они являются идентичными или имеют 100% идентичности.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному полинуклеотиду, происходящему из полинуклеотидной молекулы, кодирующей полипептид, имеющий Ь-сорбозондегидрогеназную активность, включающему в себя по крайней мере 20 последовательных нуклеотидов из частичной нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 1. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает выделенную полинуклеотидную молекулу, происходящую из полинуклеотида, кодирующего полипептид, имеющий Ь-сорбозондегидрогеназную активность, включающую в себя по крайней мере 20 последовательных нуклеотидов из частичной нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО N0: 1. Выделенный полинуклеотид включает предпочтительно по крайней мере 50 и более предпочтительно по крайней мере 100 последовательных нуклеотидов из частичной нуклеотидной последовательности 8Е0 ГО N0: 1. Самым предпочтительным является выделенный полинуклеотид, включающий в себя нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 1. Кроме того, наиболее предпочтительным вариантом осуществления является выделенный полинуклеотид, включающий в себя нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из 8Е0 ГО N0: 11, 13, 15, 17, 19, 21 и 26. Выделенный полинуклеотид может происходить из полинуклеотида, который кодирует полипептид, имеющий Ь-сорбозондегидрогеназную активность. 8Е0 ГО N0: 1 представляет собой полную нуклеотидную последовательность фермента 8ЫОНа1, который был выделен из микроорганизма С1исоиоЬас1ег охубаик N44-1. Части такой последовательности можно использовать в различных целях. Короткие полинуклеотиды, например, могут быть использованы в качестве праймеров, например, для амплификации соответствующих полинуклеотидов, выделенных из других организмов. Короткий полунуклеотид может иметь длину приблизительно от 10 приблизительно до 100 пар нуклеотидов (п.н.), обычно приблизительно от 14 до 50 и предпочтительно приблизительно от 17 приблизительно до 30 п.н. Примерами таких коротких полинуклеотидов являются последовательности 8Е0 ГО N0: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 23 или 24. Более длинные полинуклеотиды могут кодировать полипептиды, имеющие ферментативную активность. Например, 8МОНа1 имеет трансмембранный домен, который может не использоваться для ферментативной деятельности. Если части полинуклеотида, кодирующего ферментативно активные области белка, экспрессируются без трансмембранного домена, такой полипептид может иметь достаточную ферментативную активность.

Выделенная полинуклеотидная молекула обычно происходит из более длинной полинуклеотидной последовательности, которая также кодирует полипептид, имеющий Ь-сорбозондегидрогеназную активность. Такие полинуклеотиды могут быть выделены, например, из бактерий. Предпочтительно их изолируют из бактерий, принадлежащих к роду С1исоиойас1ег и Лсе1оЬас1ег, включая, но, не ограничиваясь, С. охубапк, С. 1га1еиш, С. сегшик и А. асей. Когда такие полинуклеотиды получают из более длинных полинуклеотидных последовательностей, представляется возможным определить гомологию между такой полинуклеотидной последовательностью и последовательностью 8Е0 ГО N0: 1. В таком случае предпочтительно выбирают область, имеющую по крайней мере 100 последовательных нуклеотидов, и сравнивают ее с соответствующим отрезком другого нуклеотида. В случае, когда полинуклеотидная последо

- 2 009287 вательность и соответствующий отрезок, происходящий из 8ЕО ΙΌ N0: 1, имеют, например, 60 нуклеотидов, которые являются идентичными при сравнении 100 последовательных нуклеотидов, гомология составляет 60%. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение направлено на выделенный полинуклеотид в соответствии с настоящим изобретением, где частичная нуклеотидная последовательность происходит из полинуклеотидной последовательности, имеющей по крайней мере 60% гомологию с последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 1, при сравнении по крайней мере 100 последовательных нуклеотидов. Частичные полинуклеотидные последовательности по настоящему изобретению имеют гомологию с последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 1 предпочтительно по крайней мере 80% и более предпочтительно по крайней мере 90%. Для определения гомологии могут быть использованы, например, отрезки по крайней мере из 100, предпочтительно отрезки по крайней мере из 300 и более предпочтительно отрезки по крайней мере из 500 последовательных нуклеотидов.

Настоящее изобретение обеспечивает новые полинуклеотидные последовательности, кодирующие Ь-сорбозондегидрогеназу микроорганизма, принадлежащего к уксусно-кислым бактериям, включая роды С1исопоЬас1ег и АесЮЬас1сг. для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона. Вышеуказанный полинуклеотид предпочтительно кодирует полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ N0: 2, или полипептид, полученный или получаемый из вышеуказанного полипептида, например, путем замены, делеции, вставки или добавления одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 2, который сохраняет Ь-сорбозондегидрогеназную активность для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона. Дополнительно включает в себя полинуклеотидные последовательности, кодирующие частичные полинуклеотидные последовательности полипептида, который сохраняет Ь-сорбозондегидрогеназную активность для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона, как, например, полипептиды, представленные последовательностями 8Е0 ΙΌ N0: 12, 14, 16, 18, 20, 22 и 27.

Полипептиды по настоящему изобретению включают в себя предпочтительно частичные аминокислотные последовательности из по крайней мере 25 последовательных аминокислот, выбранных из аминокислотных последовательностей полипептидов, раскрытых в настоящей заявке. Специалисту в уровне техники известен тот факт, что некоторые отрезки в полипептидах являются необходимыми для проявления биологической активности. Однако существуют другие области, где аминокислоты могут быть вставлены, делетированы или заменены на другие аминокислоты, предпочтительно на такие аминокислоты, которые являются схожими с заменяемыми аминокислотами.

Кроме того, данное изобретение направлено на молекулы рекомбинантных ДНК и/или векторы экспрессии, включающие в себя полинуклеотид по настоящему изобретению, особенно тот, который функционирует в соответствующей клетке-хозяине.

В качестве клетки-хозяина может быть использована любая клетка, которая выполняет функцию реципиента чужеродной молекулы (молекул) нуклеиновой кислоты, как, например, клетка, несущая воспроизводимый вектор экспрессии, или клонирующий вектор, или клетка, созданная с помощью известных методик генетической инженерии, содержащая желаемый ген (гены) на своей хромосоме (хромосомах) или в геноме. Клетка-хозяин может быть прокариотического или эукариотического происхождения, как, например, бактериальные клетки, клетки животных, включая в себя клетки человека, клетки грибов, включая в себя клетки дрожжей, и клетки растений. Предпочтительной является клетка-хозяин, принадлежащая к бактериям, которые ίη νίνο экспрессируют активную форму Ь-сорбозондегидрогеназы, более предпочтительны бактерии родов С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег, Ркеибошопак, например Р. ριιΐίώι или ЕксйепсЫа, например Е. сой.

Таким образом, аспектом настоящего изобретения является обеспечение клетки-хозяина, как описано выше, включающей в себя такой вектор экспрессии или включающей в себя такой нуклеотид, который имеет полинуклеотид, интегрированный в ее хромосомной ДНК. Такая клетка-хозяин далее называется рекомбинантной клеткой-хозяином или рекомбинантным организмом.

Дополнительно данное изобретение направлено на процесс получения рекомбинантного полипептида Ь-сорбозондегидрогеназы, кодируемого полинуклеотидом по данному изобретению. Такой процесс включает в себя, например, культивирование любых рекомбинантных организмов по данному изобретению, как, в частности, описано выше. Таким образом, частью данного изобретения является рекомбинантный полипептид Ь-сорбозондегидрогеназы, полученный в результате этого процесса. Такая рекомбинированная Ь-сорбозондегидрогеназа может быть использована, например, в качестве растворимого фермента в любой стандартной методике, используемой для ферментативных реакций и известных специалисту, переработанной с использованием таких устройств, как мембранные модули или мембранные реакторы, или иммобилизированной на твердом носителе для твердофазной ферментативной реакции.

Другим аспектом данного изобретения является процесс получения Ь-аскорбиновой кислоты, включающий в себя превращение субстрата в Ь-аскорбиновую кислоту, с помощью рекомбинантного полипептида Ь-сорбозондегидрогеназы, кодируемого полинуклеотидом по данному изобретению. Настоящее изобретение также включает в себя использование Ь-сорбозондегидрогеназы (8НВНа1), выделенной из микроорганизма, продуцирующего этот фермент по своей природе, то есть нерекомбинантный, где выделенная §НОНа1 кодируется полинуклеотидом по данному изобретению.

- 3 009287

В качестве субстрата может быть использован источник углерода, который может быть превращен в Ь-аскорбиновую кислоту с использованием 8ΝΌΗ;·ιί, кодируемой полинуклеотидом по настоящему изобретению. Предпочтительны субстраты. выбранные из Ь-сорбозы, Ό-сорбитола и Ь-сорбозона.

В одном варианте осуществления данного изобретения процесс получения Ь-аскорбиновой кислоты включает в себя превращение Ь-сорбозы или Ό-сорбитола в Ь-аскорбиновую кислоту в клетке-хозяине, способной превращать Ь-сорбозу в Ь-сорбозон или превращать Ό-сорбитол в Ь-сорбозон.

В другом варианте осуществления процесс получения Ь-аскорбиновой кислоты включает в себя превращение Ь-сорбозона в Ь-аскорбиновую кислоту с помощью рекомбинантной 8ΝΌΗ;·ιί, кодируемой полинуклеотидом по данному изобретению. Также в таком технологическом процессе может быть использована Ь-сорбозондегидрогеназа (8ΝΌΗηί), выделенная из микроорганизма, который продуцирует этот фермент в естественных условиях, то есть нерекомбинантного, где выделенная 8ΝΌΗηί кодируется полинуклеотидом по настоящему изобретению.

Данное изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие фермент (Ь-сорбозондегидрогеназа 8ΝΌΗ;·ιί или части его). Способы и технологии, разработанные для обработки выделенных молекул нуклеиновых кислот, хорошо известны в области применения изобретения. Специалисту известны способы изоляции, очистки и клонирования молекул нуклеиновых кислот, так же, как способы и технологии, описывающие использование эукариотических и прокариотических хозяев и нуклеиновых кислот и экспрессию в них белка.

Функциональные производные полипептидов по настоящему изобретению также могут быть частью настоящего изобретения и определены на основании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению путем добавления, вставки, делеции и/или замены одного или нескольких аминокислотных остатков таких последовательностей, где такие производные предпочтительно сохраняют Ьсорбозондегидрогеназную активность, измеренную способом, известным в области применения или, в частности, описанным здесь. Такие функциональные производные могут быть получены или путем известного в области применения химического синтеза белка, или с помощью рекомбинантных технологий на основании последовательностей ДНК, как раскрыто здесь с помощью способов, известных в существующем уровне техники. Известны аминокислотные замены в белках и пептидах, которые, в целом, не изменяют функцию таких молекул.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения встречаются следующие представляющие интерес консервативные замены: в качестве примера приемлемы замены А1а на Уа1/Ьеи/11е, Агд на Ьу8/С1п/А8и, Аки на 61и/Нщ/Ьу8/Агд, Акр на С1и, Сук на 8ег, С1и на Аки, С1у на Акр, С1у на Рго/А1а, Н1к на Аки^и/БукМ-гд, 11е на Ьеи/Уа1/Ме1/А1а/РЬе/иогЬеи, Ьук на Агд/С1и/Аки, Ме1 на Ьеи/РЬе/Пе, РЬе на Ьеи/Уа1/11е/А1а/Туг, Рго на А1а, 8ег на ТЬг, ТЬг на 8ег, Тгр на Туг/РЬе, Туг на Тгр/РЬе/ТЬг/8ег и Уа1 на 11е/Ьеи/Ме1/РЬе/А1а/иогЬеи. В качестве предпочтительных примеров приемлемыми являются замены А1а на Уа1, Агд на Ьук, Аки на С1и, Акр на С1и, Сук на 8ег, С1и на Аки, С1и на Акр, С1у на А1а, Н1к на Агд, 11е на Ьеи, Ьеи на 11е, Ьук на Агд, Ме1 на Ьеи, РЬе на Ьеи, Рго на А1а, 8ег на ТЬг, ТЬг на 8ег, Тгр на Туг, Туг на РЬе и Уа1 на Ьеи. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда вводятся более существенные замены, представленные в качестве примеров выше, и продукты подвергают скринингу.

Если не указано особо, все нуклеотидные последовательности были определены путем секвенирования молекулы ДНК с использованием автоматического ДНК-секвенатора (как, например, модель генетического анализатора Аррйеб Вюкук1ешк РЫ8М 310). Вследствие этого, как хорошо известно, в уровне техники для любой последовательности ДНК, определенной с помощью такого автоматизированного подхода, любая последовательность нуклеотидов, определенная здесь, может содержать некоторые ошибки. Последовательности нуклеотидов, определенные автоматически, являются обычно по крайней мере на 90% гомологичными, более типично по крайней мере приблизительно от 95%, по крайней мере приблизительно до 99,9% гомологичными фактической последовательности нуклеотидов секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность более точно может быть определена с помощью других подходов, в том числе с помощью способов ручного секвенирования ДНК, хорошо известных в уровне техники. Также в уровне техники хорошо известно, что единичная вставка или делеция в определяемой последовательности нуклеотидов по сравнению фактической последовательностью будет являться причиной сдвига рамки считывания в процессе трансляции нуклеотидной последовательности, так что предполагаемая аминокислотная последовательность, кодируемая определенной последовательностью нуклеотидов, будет полностью отличаться от фактической аминокислотной последовательности, кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начинающейся в точке такой вставки или делеции.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, имеющие Ь-сорбозондегидрогеназную активность, как раскрыто в списке последовательностей как 8ЕО ΙΌ N0: 2, так же, как комплементарные нити, или те, которые включают в себя эти последовательности, последовательности ДНК или их фрагменты, и последовательности ДНК, которые гибридизуются при стандартных условиях с таким последовательностями, но которые кодируют полипептиды, имеющие точно такую же аминокислотную последовательность.

Другим способом описания схожести последовательностей полинуклеотидов является определение

- 4 009287 того, гибридизуются такие последовательности или не гибридизуются. Это зависит от условий, выбранных для гибридизации.

Стандартные условия для гибридизации в данном контексте означают такие условия, которые обычно используются специалистом в уровне техники для определения специфичных сигналов гибридизации, или предпочтительно так называемые «строгие условия гибридизации», используемые специалистом в уровне техники. Таким образом, как используется здесь, термин «строгие условия гибридизации» означает, что гибридизация будет происходить, если имеется около 95%, а предпочтительно по крайней мере приблизительно 97% гомологии между последовательностями. Строгими условиями гибридизации являются, например, инкубация от 2 ч до 4 дней при температуре 42°С с использованием диоксигенин(ЭЮ)-меченой пробы ДНК (приготовленной с помощью системы мечения ЭЮ; Восйе ΟίαβηοκΙίοκ СтЬН, 68298 Маппйепп. Сегтапу) в растворе типа ЭщЕакуНуЬ раствор (Восйе ΟίαβηοκΙίοκ СтЬН) с или без 100 мкг/мл ДНК из молок лососевых, или растворе, содержащем 50% формамида, 5-кратного 88С (150 мМ №1СТ 15 мМ тринатриевого цитрата), 0,02% додецилсульфата натрия, 0,1% Ν-лаураилсаркозина и 2% блокирующего реагента (Восйе Эхадпокйск СтЬН), с последующей отмывкой фильтров дважды от 5 до 15 мин в 2-кратном 88С и 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре и затем отмывкой дважды в 0,5кратном 88С и 0,1% 8Ό8, или 0,1-кратном 88С и 0,1% 8Ό8 при температуре 65-68°С на протяжении 1530 мин.

В одном аспекте ген, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая названный ген, вектор экспрессии и рекомбинантный организм, используемый в настоящем изобретении, могут быть получены в результате следующих стадий:

(1) транспозонный мутагенез, как описано ниже для штаммов, относящихся к родам С1исопоЬас1ег или Лсе1оЬас1ег штаммам, которые производят аскорбиновую кислоту из Ь-сорбозона, для получения колоний, экспрессирующих устойчивость к антибиотикам, кодируемые применяемым транспозоном;

(2) отбор мутантов, не вырабатывающих Ь-аскорбиновую кислоту при скрининге Ь-сорбозона в качестве субстрата;

(3) выделение хромосомной ДНК из мутантов;

(4) клонирование фрагментов ДНК, содержащих транспозон из хромосомной ДНК, путем гибридизации колоний микроорганизмов, гибридизации бляшек или Саузерн-гибридизации, ПЦР (полимеразная цепная реакция) клонирования и т.п.;

(5) определение нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего вставку транспозона;

(6) клонирование фрагмента ДНК из родительского штамма, который вырабатывает Ь-аскорбиновую кислоту из Ь-сорбозона;

(7) конструирование вектора экспрессии, на котором ген, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу, может эффективно экспрессировать;

(8) конструирование рекомбинантных организмов, несущих ген, кодирующий Ь-сорбозондегидрогеназу с помощью соответствующего способа для введения ДНК в клетку-хозяина, например трансформацией, трансдукцией, конъюгационным переносом и/или электропорацией, в результате чего клеткахозяин превращается рекомбинантным организмом по данному изобретению.

Транспозонный мутагенз является эффективным методом генетического анализа (Р. Сегйагб! е! а1., Мебюбк £ог Сепега1 апб Мо1еси1аг Вас1егю1оду, Сйар1ег 17, Тгапкрокоп Мшадепейк Лтепсап 8ос1е1у £ог МюгоЬю1о§у).

Целый ряд транспозонов известны в уровне техники, как, например, Тп3, Тп5, Тп7, Тп9, Тп10, фаг Ми и т.п. Среди них Тп5, как известно, почти не имеет специфичности вставки, и его размер относительно невелик. Тп5 является предпочтительным при использовании в неспецифическом мутагенезе при практическом применении настоящего изобретения. Также в настоящем изобретении являются применимыми различные производные Тп5, обозначаемые М1ш-Тп5, которые состоят из 19 п.н. инвертированных повторов, необходимых для транспозиционного спаривания генов устойчивости к антибиотикам или других селектируемых маркеров. Такие М1ш-Тп5 включены в вектор-«самоубийцу», в добавление к Тп5 транспозазе (!пр), для конструирования эффективной «суицидной» системы мутагенеза Тп5.

Неспецифический мутагенез с транспозоном вовлекает введение транспозона в целевую бактериальную клетку посредством, например, трансформации, трансдукции, конъюгационного связывания или электропорации с использованием плазмиды-«самоубийцы» или фаговых векторов. Полученные мутанты могут быть отсортированы при помощи маркера, несущегося транспозоном. Перенос транспозона в геном бактерии-реципиента может быть выявлен после утраты используемого вектора в результате сегрегации.

Для введения транспозонов в микроорганизмы рода С1исопоЬас1ег или Лсе1оЬас1ег обычно используются так называемые векторы-«самоубийцы», включающие в себя, например, производное фага Р1 и узкий круг хозяев плазмид, как, например, производное рВВ325, содержащее начало репликации Со1Е1. Векторы фага Р1 и плазмидные векторы могут быть перенесены путем инфекции и трансформации, конъюгационного связывания или электропорацией, соответственно, в клетки-реципиенты, где эти векторы предпочтительно не содержат соответствующие источники реципиентов. Выбор используемого вектора-«самоубийцы» и транспозона зависит от критериев, включающих в себя, например, чувстви

- 5 009287 тельность к фагу, природную резистентность к антибиотикам клетки-реципиента, доступность системы передачи генов, включающей трансформацию, конъюгационное связывание, электропорацию или инфекцию, для введения в Е. сой вектора, несущего транспозон.

Одним из предпочтительных векторов для использования в настоящем изобретении, является, например, фаг Р1 (АТСС25404), который вводит свою ДНК в микроорганизм, принадлежащий роду О1исопоЬас!ег или Асе!оЬас!ег, однако, эта ДНК будет не способна к репликации и будет утеряна в результате сегрегации. Такой фаг Р1, несущий Тп5(Р1::Тп5), может быть использован в виде фаголизата, который можно получить в результате лизиса Е. сой, содержащей Р1::Тп5, в соответствии с известными процедурами (см., например, МеДобк £ог Оепега1 апб Мо1еси1аг Вас!егю1оду, Сйар!ег 17, Тгапкрокоп МШадепекщ; Атепсап 8ос1е!у £ог МюгоЬю1оду или патент США 5082785, 1992).

Для подтверждения того, что дефектный мутант в действительности содержит транспозон, такие процедуры, как, например, гибридизация колоний или Саузерн-гибридизация, могут быть проведены стандартными способами с меченными ДНК фрагментами, содержащими транспозон, используемыми в качестве зонда (Мо1еси1аг с1ошпд, а 1аЬога!огу тапиа1 кесопб ебйюп, Машайк Т., е! а1., 1989).

Такой мутант был выделен, как описано в примере 5 настоящего изобретения. Транспозонный мутант может быть использован для дополнительной идентификации гена-мишени, кодирующего Ь-сорбозондегидрогеназу, и определения нуклеотидной последовательности области, меченной транспозоном.

Фрагмент ДНК, содержащий вставку транспозона, может быть клонирован в любые клонирующие векторы Е. сой, предпочтительно рИС18, рИС19, рВШексйр! II К8+ (81га!адепе Еигоре) и их близкие формы, выбирая трансформанты, показывающие наличие обоих фенотипов маркеров селекции вектора и транспозона. Нуклеотидные последовательности, расположенные рядом с транспозоном, могут быть определены с помощью известных в уровне техники способов секвенирования.

В качестве альтернативы, когда вышеуказанный полипептид сорбозондегидрогеназы очищен от штамма, вырабатывающего Ь-аскорбиновую кислоту из Ь-сорбозоны, желаемый ген может быть клонирован или в плазмидные, или в фаговые векторы из целой хромосомной ДНК с помощью следующих пояснительных способов.

(ί) Частичные аминокислотные последовательности могут быть определены в очищенных белках или пептидных фрагментах с помощью таких способов, как, например, лазерная десорбция-ионизация в присутствии матрицы (МАЙШ). Такой цельный белок или пептидные фрагменты могут быть получены путем выделения такого цельного белка или путем обработки пептидазой геля после электрофореза в δΌδ-полиакриламидном геле (δΌδ-РАОЕ).

Полученный таким образом белок или его фрагменты также могут быть внесены в белковый секвенатор, например автоматический газофазный секвенатор 470А Аррйеб ВюкуЧетк. Аминокислотные последовательности могут быть применены для конструирования и получения олигинуклеотидных зондов и/или праймеров с помощью ДНК-синтезатора, такого как, например, автоматический ДНК-секвенатор 381А Аррйеб Вюкуйетк. Зонды могут быть использованы для выделения клонов, содержащих ген-мишень из библиотеки генов штамма, несущего ген-мишень, посредством, например, Саузерн-гибридизации, гибридизации колоний или гибридизации бляшек.

(й) Кроме того, альтернативно с целью отбора из библиотеки генов клонов, экспрессирующих белок-мишень, могут быть применены иммунологические способы, например, с полученным антителом против белка-мишени.

(ш) Фрагменты ДНК гена-мишени могут быть амплифицированы из общей хромосомной ДНК, например, с помощью ПЦР с набором праймеров, например двух олигонуклеотидов, синтезированных в соответствии с аминокислотными последовательностями, определенными, как описано выше. Затем клон, несущий весь ген, может быть выделен из сконструированной библиотеки генов, например Е. сой, с использованием, например, Саузерн-гибридизации, гибридизации колоний или гибридизации бляшек с полученным выше ПЦР-продуктом в качестве зонда.

Также объектами настоящего изобретения являются последовательности ДНК, которые могут быть получены с помощью ПЦР с использованием праймеров, сконструированных на основе раскрытых здесь последовательностей ДНК, с помощью способов, известных в уровне техники.

Вышеуказанное антитело может быть получено, например, для очищенных белков Ь-сорбозондегидрогеназы, очищенных белков рекомбинантной Ь-сорбозондегидрогеназы, как, например, Шк-меченой Ь-сорбозондегидрогеназы, экспрессирующейся в Е. сой, или ее пептидных фрагментов в качестве антигена. В качестве антигена для получения антитела может быть использована полипептидная последовательность, выведенная из нуклеотидной последовательности Ь-сорбозондегидрогеназы.

После того, как получен клон, несущий желаемый ген, нуклеотидная последовательность гена-мишени может быть определена общеизвестным способом.

Для эффективной экспрессии желаемого гена/нуклеотидной последовательности могут использоваться различные промоторы; например естественный промотор гена, промоторы генов устойчивости к антибиотикам, таких как, например, ген транспозона Тп5, устойчивый к канамицину, ген плазмиды рВК.322, устойчивый к ампициллину, и бета-галактозидазы Е. сой (1ас), 1гр-, !ас- !гс-промотор, промоторы фага лямбда и любые другие промоторы, которые могут функционировать в клетке-хозяине. Для этой

- 6 009287 цели клетка-хозяин может быть выбрана из группы, состоящей из бактериальных клеток, клеток животных, включая клетки человека, клеток грибов, включая дрожжевые клетки, и клеток растений. Предпочтительно клетка-хозяин принадлежит к бактериям, которые могут ίη νίνο экспрессировать активную форму Ь-сорбозондегидрогеназы, в частности бактериям рода С1исопоЬас1сг. ЛссЮЬасЮг. Рзеийотопаз и ЕхсйспсЫа.

Для экспрессии могут быть использованы с вышеописанными промоторами другие регуляторные элементы, как, например, последовательность Шайн-Дальгарно (8Ό) (например, АССАСС и т.п., включая природные и синтетические последовательности, функционирующие в клетке-хозяине) и терминатор транскрипции (структура инвертированных повторов, включая любую природную или синтетическую последовательность), которые функционируют в клетке-хозяине (в которую будет введена кодирующая последовательность для обеспечения рекомбинантной клетки по данному изобретению).

Большое разнообразие комбинаций хозяин/клонирующий вектор может быть использовано для клонирования двухцепочечной ДНК. Предпочтительные векторы экспрессии в Е. сой гена по настоящему изобретению, например гена δΝΏΗαί, могут быть выбраны из любых векторов, обычно используемых в Е. сой, как, например, векторы рОЕ, которые могут экспрессировать Ηίδ-меченые рекомбинантные белки (Р1АСЕЫ АС 8^Й2ег1апй), рВК.322 или его производные, включая, например, рИС18 и рВ1ие8спр1 II (81та1адепе С1ошпд 8у51ет5, Калифорния, США), рАСУС177 и рАСУС184 и их производные, и вектор, полученный из плазмиды с широким кругом хозяев, как, например, КК2 и Р8Е1010. Предпочтительный вектор экспрессии нуклеотидной последовательности по настоящему изобретению в бактериях, включая С1исопойас1ег, Асе1оЬас1ег и Рзеийотопаз, выбран из любых векторов, которые могут реплицировать как в С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег или Рзеийотопаз, так и в предпочтительном клонированном микроорганизме, например в Е. сой. Предпочтительным вектором является вектор с широким кругом хозяев, как, например космида типа рУК100 и ее производные и Р8Е1010. Для стабильной и эффективной экспрессии клонированного гена, а также для эффективного культивирования клетки-хозяина, несущей клонированный ген, необходимо тщательно изучить количество копий и стабильность вектора. Молекулы нуклеиновых кислот, содержащих, например, мобильные генетические элементы, такие как Тп5, также могут быть использованы в качестве вектора для введения желаемого гена в предпочтительного хозяина, главным образом на хромосому. Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие любые ДНК, выделенные из предпочтительных хозяев вместе с геном 8ΝΌΗηί по настоящему изобретению, могут быть также использованы для введения этого гена в предпочтительную клетку-хозяина, главным образом на хромосому. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть перенесены в предпочтительного хозяина с помощью любых удобных способов, например трансформацией, трансдукцией, конъюгационным связыванием или электропорацией, которые широко известны в уровне техники, принимая во внимание природу клеткихозяина и молекулы нуклеиновой кислоты.

Для получения вектора экспрессии ген/нуклеотидные последовательности Ь-сорбозондегидрогеназы, обеспеченные данным изобретением, могут быть лигированы с использованием широко известного в уровне техники способа в подходящий вектор, содержащий регуляторный участок, например промотор, сайт связывания рибосомы и терминатор транскрипции, функционирующие в вышеописанной клеткехозяине.

Для конструирования рекомбинантного микроорганизма, несущего вектор экспрессии, могут быть использованы различные способы переноса генов, включая в себя, например, трансформацию, трансдукцию, конъюгационное связывание и электропорацию. Способ конструирования рекомбинантной клетки может быть выбран из способов, хорошо известных в области молекулярной биологии. Например, стандартные трансформационные системы могут быть использованы для С1исопоЬас1ег, АсеЮЬасЮг, Рзеийотопаз или ЕзсйейсШа. Для Е. сой также может быть использована трансдукционная система. Система конъюгационного связывания может быть широко использована для грамположительных и грамотрицательных бактерий, например Е. сой, Р. риййа и С1исопоЬас1ег, включительно. Пример конъюгационного связывания раскрыт в международной публикации \7О 89/06688. Конъюгация может протекать, например, в жидкой среде или на твердой поверхности. Примеры реципиентов для производства 8ΝΌΗ;·ιί включают в себя, например, такие микроорганизмы, как С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег, Рзеийотопаз или ЕзсйейсЫа. К реципиенту для конъюгационного связывания может быть добавлен селективный маркер; например, обычно выбирают устойчивость к налидиксовой кислоте и рифамицину. Также может быть использована естественная устойчивость, например для многих бактерий, принадлежащих к С1исопоЬас1ег, применяется естественная устойчивость к полимиксину В.

Настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантную Ь-сорбозондегидрогеназу (8ΝΌΗ;·ιί). Можно увеличить выход продукции фермента Ь-сорбозондегиброгеназы путем введения гена Ь-сорбозондегидрогеназы, обеспеченного настоящим изобретением, в клетку-хозяина, описанные выше. В одном аспекте белки Ь-сорбозондегидрогеназы получают в клетке-хозяине, выбранной из группы, содержащей С1исопоЬас1ег, Асе1оЬас1ег, Рзеийотопаз или ЕзсйейсЫа с помощью гена Ь-сорбозондегидрогеназы по настоящему изобретению.

Микроорганизм, способный экспрессировать δΝΌΗηΓ кодируемую полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, может быть культивирован в анаэробных условиях в водной

- 7 009287 среде с добавками соответствующих питательных веществ. Культивирование можно проводить в фоновом режиме, в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. Период культивирования может изменяться, например, в зависимости от хозяина, используемого для экспрессии полипептида-мишени, рН, температуры и используемой питательной среды, и предпочтительно этот период длится от 1 приблизительно до 10 дней, при проведении в фоновом режиме или в культуре с подпиткой. Культивирование можно проводить, например, при значении рН приблизительно от 4,0 приблизительно до 9,0, предпочтительно приблизительно от 5,0 приблизительно до 8,0. Предпочтительный диапазон температуры для проведения культивирования лежит в пределах приблизительно от 13 приблизительно до 36°С, предпочтительно приблизительно от 18 приблизительно до 33°С. Обычно среда для культивирования может содержать такие питательные вещества, как источники усвояемого углерода, например глицерин, И-маннитол, И-сорбитол, Ь-сорбозу, эритрит, рибит, ксилит, арабит, инозит, дульцит, Όрибозу, И-фруктозу, Ό-глюкозу и сахарозу, предпочтительно И-сорбитол, И-маннитол и глицерин; и источники легкоусвояемого азота, например такие органические вещества, как, например, пептон, дрожжевой экстракт, пекарские дрожжи, мочевина, аминокислоты и кукурузный экстракт. Также в качестве источников азота можно использовать различные неорганические вещества, например нитраты и соли аммония. Кроме того, среда для культивирования обычно может содержать неорганические соли, например сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и карбонат кальция.

Было установлено, что процесс получения витамина С из субстрата с использованием организмахозяина, содержащего δΝΏΗαί, кодируемую полинуклеотидом по настоящему изобретению, осуществляется посредством развивающихся клеток, то есть удельная скорость роста клеток представляет собой по крайней мере 0,02 ч^-1.

Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой использование для получения витамина С выделенной δΝΏΗαί, кодируемой нуклеотидной последовательностью, раскрытой здесь. Для выделения и очистки δΝΌΗπί из микроорганизма после культивирования клетки микроорганизма могут быть собраны из питательной среды для культивирования посредством, например, центрифугирования или фильтрования. Собранные клетки могут быть отмыты, например, водой, физиологическим солевым раствором или буферным раствором, имеющим соответствующее значение рН. Отмытые клетки могут находиться в суспензии в соответствующем буферном растворе и разрушены с помощью, например, гомогенизатора, устройства для разрушения ультразвуком, устройства для разрушения клеток «френч-пресс» или обработкой лизоцимом и т.п. с получением раствора разрушенных клеток. Ь-сорбозондегидрогеназа может быть выделена и очищена из бесклеточного экстракта или разрушенных клеток, предпочтительно из мембранной фракции, с использованием стандартных способов, таких как, например, ультрацентрифугирование, дифференциальная солюбилизация с использованием соответствующих детергентов, преципитация солями или другими подходящими агентами, диализ, ионообменная хроматография, хроматография на колонке с гидроксиапатитом, гидрофобная хроматография, гель-хроматография, аффинная хроматография или кристаллизация. После получения Ь-сорбозондегидрогеназы в виде меченого полипептида, например Ηίκ-меченого, его можно очистить с помощью аффинных смол, таких как, например, аффинная смола №ске1. Очистка Ь-сорбозондегидрогеназы может быть мониторирована фотометрически с использованием, например, искусственных акцепторов электронов, как, например, нитросинийтетразолийхлорид (ΝΒΤ) и феназинметосульфат, 2,6-дихлорфенолиндофенол (ЭСЭР), феррицианид или цитохром С.

Настоящее изобретение обеспечивает получение Ь-аскорбиновой кислоты с помощью δΝΏΗαί, как описано здесь. Источник ΞΝΌΗαί не является определяющим. Этот процесс может быть проведен с использованием, например, микроорганизмов, по природе своей способных экспрессировать активную форму фермента δΝΌΗαί, δΝΏΗαί, кодируемой нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, которая выделена из вышеуказанных микроорганизмов, рекомбинантных организмов, несущих ген ΞΝΌΗαί по настоящему изобретению, как описано выше, или посредством использования естественных и/или рекомбинантных ΞΝΌΗαί в виде фермента мембранной фракции, растворимого или иммобилизированного фермента, действующего как биокатализатор при превращении Ь-сорбозона в Ьаскорбиновую кислоту, как описано ниже. Вышеописанный способ выделения и очистки ΞΝΌΗαί может быть использован и для естественных, и для рекомбинантных ΞΝΌΗαί.

Рекомбинантные микроорганизмы, используемые для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона, могут быть культивированы, как описано выше. Предпочтителен рекомбинантный микроорганизм, который выбран из группы, включающей в себя О1исопоЬас1ег, Лсе1оЬас1ет, Ркеиботопак и ЕксйепсШа, содержащие ген Ь-сорбозондегидрогеназы по настоящему изобретению. Рекомбинантный микроорганизм может быть культивирован при тех же условиях, как описано выше. В случае, если рекомбинантный организм, используемый для получения Ь-аскорбиновой кислоты, не способен конвертировать ни один из описанных выше источников углерода в Ь-сорбозон, Ь-сорбозон необходимо добавить в среду для культивирования, чтобы быть использованным в качестве предшественника для получения Ь-аскорбиновой кислоты. Продолжительность реакции может меняться в зависимости от значения рН, температуры и используемой реакционной смеси и предпочтительно длится от 1 приблизительно до 10 дней при проведении реакции в фоновом режиме или в культуре с подпиткой.

- 8 009287

В одном варианте осуществления δΝΌΗηί по настоящему изобретению, или рекомбинантная, или естественная, например выделенный нерекомбинантный фермент, очищена из среды для культивирования, как описано выше, и используется в форме растворимого или иммобилизированного фермента в качестве биокатализатора для превращения Ь-сорбозона в Ь-аскорбиновую кислоту с использованием любого способа, известного специалисту, например, в фоновом режиме, в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. Очищенную Ь-сорбозондегидрогеназу можно использовать также, например, в растворимой форме, удержанной в реакционном сосуде с помощью мембранных устройств, или в качестве иммобилизированного фермента на любой твердой фазе, как, например, пористой или полимерной матрице. Например, фермент может быть непосредственно связан с мембраной, гранулами или чем-либо подобным смолы, имеющей одну или более функциональных групп, или фермент может быть связан со смолой посредством сшивающих соединений, имеющих одну или более функциональных групп, например глутаральдегид. Реакция с использованием очищенного фермента в растворимой, удержанной или иммоболизированной форме может протекать, например, в водной среде, содержащей Ьсорбозон и другие подходящие питательные вещества, в анаэробных условиях. Реакционная среда может содержать, например, неорганические соли, такие как сульфат магния, фосфат калия или карбонат кальция. Реакция может быть проведена при значениях рН приблизительно от 4,0 приблизительно до 9,0, предпочтительно приблизительно от 5,0 приблизительно до 8,0. Предпочтительный температурный диапазон для проведения реакции находится в пределах приблизительно от 13 приблизительно до 36°С, предпочтительно приблизительно от 18 приблизительно до 33 °С.

Микроорганизмы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть общедоступны из различных источников, например ОеШксйе 8атт1иид νοη М1кгоогдашктеи ииб 2с11ки11игсп (Ό8ΜΖ), Максйегобег \Уед ΙΒ, Ό-38124 Вгаиикйете1д, Оегтаиу, Атейсаи Туре СиЙиге Сойесйои (АТСС), Р.О. Вох 1549, Маиаккак, УА 20108 И8А ои Мау 12,2003 или СиЙиге Со11есйои ОМкюи, ΝΙΤΕ Вю1одюа1 Векоигсе Сеи1ег, 2-5-8, Кахикаката1ап. Каката/и-кИк СЫЬа, 292-0818, .Гараи (ранее: 1и81йи1е Гог РегтейаЦои, Окака (ΙΕΟ), 17-85, Зико-йоитасЫ 2-сйоте, Уобода^а-ки, Окака 532-8686, .Гараи). Примерами предпочтительных бактерий, хранящихся в ΙΡΟ, являются, например, О1исоиоЬасГег охубаик (ранее известный как О. тек-шодегшк) ΙΡΟ 3293, О1исоиоЬасГег охубаик (ранее известный как С.тек-тодегшк) ΙΡΟ 3292, О1исоиоЬасГег охубаик (ранее известный как О.гиЫдтокик) ΙΡΟ 3244, О1исоиоЬасГег ГгаГеиш (ранее известный как О. шбикГпик) ΙΡΟ 3260, О1исоиоЬасГег сепиик ΙΡΟ 3266, О1исоиоЬасГег охубаик ΙΡΟ 3237 и АсеГоЬасГег асей киЬкр. или 1еаиик ΙΡΟ 3259, которые все были помещены на хранение 5 апреля 1954 года; АсеГоЬасГег асей киЬкр. хуйиит ΙΡΟ 13693, помещенный на хранение 22 октября 1975 года, и АсеГоЬасГег асей киЬкр. хуйиит ΙΡΟ 13773, помещенный на хранение 8 декабря 1977 года. Штамм АсеГоЬасГег кр. АТСС 15164, который также является примером предпочтительной бактерии, был помещен на хранение с АТСС. Штамм О1исоиоЬасГег охубаик (ранее известный как О. те1аиодеиик) N44-1, как еще один пример предпочтительной бактерии, является производным штамма ΙΡΟ 3293 и был описан §ид1ката е1 а1., Адйс. Вю1. Сйет. 54; 1201-1209, 1990.

Подразумевается, что вышеуказанные микроорганизмы также включают в себя ненаучные названия или ненаучные названия таких разновидностей, имеющих одинаковые физиологические свойства, как определено в международном коде номенклатуры прокариотов.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к новому способу получения Ь-аскорбиновой кислоты (витамин С) с большим выходом продукции в результате применения покоящихся клеток микроорганизма, способного превращать некоторые источники углерода в витамин С.

Прямое получение Ь-аскорбиновой кислоты с использованием различных способов культивирования было описано для нескольких микроорганизмов. Недостатком таких способов, тем не менее, является низкий выход полученного витамина С вследствие нестабильности продукта. При использовании, например, микроорганизмов, о которых известно, что они способны производить и 2-кето-Ь-гулоновую кислоту (2-КОА), и витамин С, выход микробиологически полученного витамина С дополнительно лимитируется относительно высокой продукцией 2-КОА, которая более быстро синтезируется вышеназванным микроорганизмом, что приводит, например, к соотношению между концентрацией витамина С и 2-КОА менее чем 0,1. Таким образом, целью настоящего изобретения является усовершенствование микробиологического получения витамина С с более высоким выходом продукта по сравнению со способами, описанными в предшествующем уровне техники.

Было обнаружено, что способ применения покоящихся клеток микроорганизмов, способных осуществлять непосредственное превращение субстрата в витамин С, приводит к увеличению уровня выхода витамина С.

В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ получения витамина С, включающий в себя превращение субстрата в витамин С в среде, содержащей покоящиеся клетки микроорганизма.

В вышеуказанном способе применения покоящихся клеток микроорганизма в качестве субстрата может быть использован источник углерода, который может быть превращен в Ь-аскорбиновую кислоту и который является легко получаемым в результате метаболизма Ό-глюкозы или Ό-сорбитола, как, например, Ό-глюкоза, Ό-сорбитол, Ь-сорбоза, Ь-сорбозон, 2-кето-Ь-гулонат, Ό-глюконат, 2-кето-Э-глюко

- 9 009287 нат или 2,5-дикетоглюконат. Еще одним возможным субстратом может быть галактоза.

Предпочтительно субстрат выбран, например, из Ό-глюкозы, Ό-сорбитола, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона, более предпочтительно из Ό-глюкозы, Ό-сорбитола или Ь-сорбозы и наиболее предпочтительно из Όсорбитола или Ь-сорбозы. Термины «субстрат» и «субстрат для получения продукта» в контексте вышеуказанного способа применения покоящихся клеток микроорганизма используются здесь как равнозначные.

Превращение субстрата в витамин С в контексте вышеуказанного способа применения покоящихся клеток микроорганизма означает, что превращение субстрата, приводящее к образованию витамина С, выполнено с помощью микроорганизма, то есть субстрат может быть непосредственно превращен в витамин С. Указанный микроорганизм культивирован в условиях, которые делают возможным такое превращение субстрата согласно вышеприведенному определению.

Средой, используемой здесь в вышеуказанном способе применения покоящихся клеток микроорганизма, может быть любая среда, подходящая для получения витамина С. В основном, среда представляет собой водную среду, содержащую, например, соли, субстрат(ы) и имеющую определенное значение рН. Среда, в которой происходит превращение субстрата в витамин С, также упоминается как среда получения продукта.

В контексте вышеуказанного способа применения покоящихся клеток микроорганизма может быть использован любой микроорганизм, способный выполнять превращение субстрата в витамин С, как, например, дрожжи, морские водоросли или бактерии, либо штаммы дикого типа, мутантные штаммы, полученные с помощью классических способов мутагенеза или селекции, либо рекомбинантные штаммы. Примерами таких дрожжей могут быть, например, Сапб1ба, 8ассйатотусез, 2удо8ассйагошусе8, 8сухозассйаготусез или К1иууеготусез. Примером таких морских водорослей может быть, например, СЫотеИа. Примерами таких бактерий могут быть, например, С1исопоЬас1ег. Асе1оЬас1ег. Ке1оди1ошс1дешит, РаШоеа. Сгур!ососсиз, Рзеиботопаз, например Рзеиботопаз рийба и ЕзсйебсЫа, например ЕзсйебсЫа сой. Предпочтительными являются С1исопоЬас1ег или Асе1оЬас1ег асеб, как, например, 6. охубапз, 6. себпиз, 6. 1га1ешп, А. асеб зиЬзр. хуйиит или А. асеб зиЬзр. ог1еапиз.

В контексте вышеуказанного способа применения покоящихся клеток микроорганизма микроорганизмы, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, могут быть общедоступными из разных источников, например ОеЫзсйе 8атш1ипд уоп М1кгоогдашзтеп ипб 2е11кийигеп (Ό8ΜΖ), Мазсйегобег \Уед ΙΒ, Ό-38124 Вгаипзсйтее1д, бегтапу, Атебсап Туре СиНиге Сойесбоп (АТСС), Р.О. Вох 1549, Мапаззаз, УА 20108 И8А оп Мау 12, 2003 или СиЙше Сойесбоп О1У1зюп, ΝΙΤΕ Вю1одюа1 Кезоигсе Сеп1ет, 2-5-8, КахизакатаБиГ Шзата/и-зЫ, СЫЬа, 292-0818, 1арап (ранее: 1пзб1и1е £от ЕеттеШабоп, Озака (ΙΕΟ), 17-85, 1изо-йоптасЫ 2-сйоте, Уободатеа-ки, Озака 532-8686, 1арап). Примерами предпочтительных бактерий, помещенных на хранение в ΙΕΟ, являются, например, 61исопоЬас1ет охубапз (ранее известный как 6. те1аподепиз) ΙΕΟ 3293, 61исопоЬас1ет охубапз (ранее известный как 6. те1аподепиз) ΙΕΟ 3292, 61исопоЬас1ет охубапз (ранее известный как 6.гиЫдшозиз) ΙΕΟ 3244, 61исопоЬас1ет £та1еигй (ранее известный как 6. шбизбшз) ΙΕΟ 3260, 61исопоЬас1ет себпиз ΙΕΟ 3266, 61исопоЬас1ет охубапз ΙΕΟ 3287 и Асе1оЬас1ет асеб зиЬзр. ог1еапиз ΙΕΟ 3259, которые были помещены на хранение 05 апреля 1954 года; Асе1оЬас1ет асеб зиЬзр. хуйпит ΙΕΟ 13693, помещенный на хранение 22 октября 1975 года, и Асе1оЬас1ет асеб зиЬзр. хуйпит ΙΕΟ 13773, помещенный на хранение 08 декабря 1977 года. Штамм Асе1оЬас1ет зр.АТСС 15164, который также является примером предпочтительной бактерии, был помещен на хранение с АТСС. Штамм 61исопоЬас1ет охубапз (ранее известный как 6. те1аподепиз) N44-1, другой пример предпочтительной бактерии, получен из штамма ΙΕΟ 3293 и описан 8ид1затеа е! а1., Адбс. Вю1. Сйет. 54: 1201-1209, 1990.

В контексте вышеуказанного способа применения покоящихся клеток микроорганизма подразумевается, что вышеуказанные микроорганизмы также включают в себя ненаучные названия или ненаучные названия таких разновидностей, имеющих одинаковые физиологические свойства, как определено в международном коде номенклатуры прокариотов. Номенклатура микроорганизмов, как используется здесь, является официально принятой (на момент подачи приоритетной заявки) Международным Комитетом по классификации прокариотов и Отделом микробиологии и прикладной микробиологии Международного Союза Микробиологических обществ и опубликованной в их официальном издании Iηΐетабоηа1 1оитпа1 о£ 8уз1етабс апб Еуо1ийопату МютоЬю1оду (Н8ЕМ). В частности, ссылка дана на статью игЬапсе е! а1. Н8ЕМ (2001) уо1. 51: 1059-1070 с измененной регистрацией таксономической реклассификации, описывающей 6. охубапз О8М 4025 как Ке1оди1ошс1депшт уи1дате в Н8ВМ (2001) уо1. 51: 1231-1233.

Как используется здесь, покоящиеся клетки относятся к клеткам микроорганизма, которые являются, например, жизнеспособными, но не активно развивающимися или развивающимися с низкими удельными скоростями роста (μ), например скоростями роста, которые ниже чем 0,02 ч^-1, предпочтительно ниже чем 0,01 ч^-1. Клетки, для которых характерны вышеуказанные скорости роста, как говорят, находятся в «состоянии покоящихся клеток».

По настоящему изобретению технологический процесс применения покоящихся клеток микроорганизма может быть осуществлен с помощью различных стадий или этапов: предпочтительно на первом этапе (также именуемом как этап (а) или фаза роста) микроорганизм культивируют при условиях, которые способствуют росту. Эта стадия прекращается в результате изменений условий таким образом, что скорость роста микроорганизма снижается, что приводит к образованию покоящихся клеток, что также

- 10 009287 называется этапом (Ь), с последующим получением витамина С из субстрата с использованием покоящихся клеток, полученных на этапе (Ь), что также называется фазой образования продукта.

Фаза роста и фаза образования продукта, представленные в вышеуказанном процессе применения покоящихся клеток микроорганизма, могут быть проведены в одном и том же сосуде, то есть только в одном сосуде, или в двух или нескольких различных сосудах, с дополнительным этапом сепарации клеток между двумя фазами. Полученный витамин С может быть восстановлен из погибших клеток с использованием любых соответствующих способов. Под восстановлением подразумевают, например, что полученный витамин С может быть отделен от среды получения продукта. При желании, полученный таким образом витамин С может быть дополнительно обработан.

В контексте настоящего изобретения, относящегося к вышеуказанному процессу применения покоящихся клеток микроорганизма, термины «фаза роста», «стадия выращивания», «стадия роста» и «период роста» используются здесь как равнозначные. То же самое относится к терминам «фаза получения продукта», «стадия получения продукта», «период получения продукта».

По настоящему изобретению одним способом выполнения вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма может быть процесс, при котором, как источник покоящихся клеток, микроорганизм выращивают в первом сосуде, так называемом ростовом сосуде, и по крайней мере часть этих клеток переносят во второй сосуд, так называемый сосуд получения продукта. Условия в сосуде получения продукта могут быть такими, что клетки, транспортированные из ростового сосуда, становятся покоящимися клетками согласно вышеприведенному описанию. Витамин С получают во втором сосуде и восстанавливают оттуда.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма в одном аспекте стадия выращивания может быть выполнена в водной среде, то есть среде для выращивания, обогащенной соответствующими питательными веществами для роста в аэробных условиях. Культивирование может быть проведено, например, в фоновом режиме, в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. Период культивирования может изменяться, например, в зависимости от типа клеток, рН, температуры и используемой питательной среды и может длиться, например, от 10 ч приблизительно до 10 дней, предпочтительно от 1 приблизительно до 10 дней, более предпочтительно этот период длится от 1 приблизительно до 5 дней, при проведении в фоновом режиме или в культуре с подпиткой, в зависимости от используемого микроорганизма. Если клетки выращивают в непрерывном режиме, время инкубирования, в зависимости от микроорганизма, может составлять, например, приблизительно от 2 приблизительно до 100 ч, предпочтительно приблизительно от 2 приблизительно до 50 ч. Если микроорганизм выбран из бактерий, культивирование может проводиться, например, при значениях рН приблизительно от 3,0 приблизительно до 9,0, предпочтительно приблизительно от 4,0 приблизительно до 9,0, более предпочтительно приблизительно от 4,0 приблизительно до 8,0 и еще более предпочтительно приблизительно от 5,0 приблизительно до 8,0. Если используют морские водоросли или дрожжи, культивирование может проводиться, например, при значениях рН ниже чем 7,0, предпочтительно ниже чем 6,0, более предпочтительно ниже чем 5,5 и наиболее предпочтительно ниже чем 5,0. Предпочтительный диапазон температуры для проведения культивирования с использованием бактерий, например, лежит в пределах приблизительно от 13 приблизительно до 40°С, предпочтительно приблизительно от 18 приблизительно до 37°С, более предпочтительно приблизительно от 13 приблизительно до 36°С и наиболее предпочтительно приблизительно от 18 приблизительно до 33°С. Если используют морские водоросли или дрожжи, предпочтительный диапазон температуры для проведения культивирования, например, лежит в пределах приблизительно от 15 приблизительно до 40°С, предпочтительно приблизительно от 20 приблизительно до 45°С, более предпочтительно приблизительно от 25 приблизительно до 40°С, еще более предпочтительно приблизительно от 25 приблизительно до 38°С и наиболее предпочтительно приблизительно от 30 приблизительно до 38°С. Обычно среда для культивирования в качестве источников усвояемого углерода может содержать такие питательные вещества, как, например, глицерин, Ό-маннитол, Ό-сорбитол, Ь-сорбоза, эритрит, рибит, ксилит, арабит, инозит, дульцит, Ό-рибоза, Ό-фруктоза, Ό-глюкоза и сахароза, предпочтительно Ь-сорбоза, Ό-глюкоза, Ό-сорбитол, Ό-маннитол и глицерин; и источники легкоусвояемого азота, например такие органические вещества, как, например, пептон, дрожжевой экстракт и аминокислоты. Среда может содержать или не содержать мочевину, и/или кукурузный экстракт, и/или пекарские дрожжи. Также в качестве источников азота можно использовать различные неорганические вещества, например нитраты и соли аммония. Кроме того, среда для культивирования обычно может содержать неорганические соли, например сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и карбонат кальция.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма в фазе роста удельные скорости роста представляют собой, например, по крайней мере 0,02 ч^-1. Для клеток, растущих в фоновом режиме, в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме, скорость роста зависит, например, от состава среды для выращивания, рН, температуры и т.п. В целом, скорости роста могут находиться, например, в пределах приблизительно от 0,05 приблизительно до 0,2 ч^-1, предпочтительно приблизительно от 0,06 приблизительно до 0,15 ч^-1 и наиболее предпочтительно приблизи

- 11 009287 тельно от 0,07 приблизительно до 0,13 ч^-1.

В другом аспекте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма покоящиеся клетки могут быть получены в результате культивирования соответствующего микроорганизма на чашках с агаровой средой, выполняющих функцию ростового сосуда, с использованием, по существу, аналогичных условий, например периода культивирования, температуры, питательной среды, как описано выше, с добавлением агар-агара.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма, если фаза выращивания и фаза получения продукта осуществляются в двух отдельных сосудах, клетки, полученные в результате фазы выращивания, могут быть собраны или концентрированы и перенесены во второй сосуд, так называемый сосуд получения продукта. Этот сосуд может содержать водную среду с добавлением любого пригодного субстрата для получения продукта, который может быть превращен в Ь-аскорбиновую кислоту с помощью клеток. Клетки, полученные в ростовом сосуде, могут быть собраны или концентрированы с помощью любых подходящих способов, например центрифугированием, использованием мембранной системы для ультрацентрифугирования в поперечном потоке или микрофильтрацией, фильтрацией, декантацией, флоккуляцией. Клетки, полученные таким образом, также могут быть перенесены в сосуд получения продукта в виде исходной питательной среды из ростового сосуда, не будучи собранными, концентрированными или отмытыми, то есть в виде клеточной суспензии. В предпочтительном варианте осуществления клетки переносят из ростового сосуда в сосуд получения продукта в виде клеточной суспензии без каких-либо промежуточных стадий отмывки или выделения.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма стадии (а) и (с) процесса настоящего изобретения, как описано выше, не разделяются никакими стадиями отмывки и/или сепарации.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма, если фаза выращивания и фаза получения продукта осуществляются в одном и том же сосуде, клетки могут быть выращены при соответствующих условиях до желаемой плотности клеток с последующей заменой среды для выращивания на среду получения продукта, содержащую субстрат для получения продукта. Такая замена может представлять собой подпитку среды получения продукта в сосуде и одновременное изъятие или сбор супернатанта из сосуда. Для того, чтобы сохранить покоящиеся клетки в сосуде, можно использовать способы для клеточного рециклинга или удержания, как, например, стадии клеточного рециклинга. Такие стадии клеточного рециклинга, например, включают в себя, но не ограничиваются, способы с использованием центрифуг, фильтров, мембранной системы для микрофильтрации в поперечном потоке стадии ультрацентрифугирования, мембранных реакторов, флоккуляции или иммобилизации клеток на соответствующих пористых, непористых или полимерных матриксах. После переходной стадии сосуд подвергается воздействию условий, при которых клетки находятся в состоянии покоя, как определено выше, и субстрат для получения продукта эффективно превращается в витамин С.

Водная среда в сосуде получения продукта, используемом на стадии получения продукта в контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма, называемая здесь далее средой получения продукта, может содержать только субстрат(ы) для получения продукта для превращения в Ь-аскорбиновую кислоту или может содержать, например, дополнительно неорганические соли, например хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия, фосфат кальция и карбонат кальция. Среда получения продукта также может содержать источники усвояемого азота, такие как, например, органические вещества, например пептон, дрожжевой экстракт, мочевина, аминокислоты, и кукурузный экстракт, и неорганические вещества, например аммиак, сульфат аммония, и нитрат натрия, в таких концентрациях, при которых клетки сохраняются в состоянии покоя, как определено выше. Среда может содержать или не содержать мочевину, и/или кукурузный экстракт, и/или пекарские дрожжи. Стадия получения продукта может проводиться, например, в фоновом режиме, в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. В случае проведения в культуре с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме и клетки из ростового сосуда, и среда получения продукта могут быть подпитаны непрерывно или периодически в сосуде получения продукта с соответствующей интенсивностью подпитки. В качестве варианта только среда получения продукта может быть подпитана непрерывно или периодически в сосуде получения продукта, в то время, как клетки, полученные в ростовом сосуде, без промедления перенесены в сосуд получения продукта. Клетки, полученные в ростовом сосуде, могут быть использованы в виде клеточной суспензии внутри сосуда получения продукта или могут быть использованы, например, как флоккулированные или иммобилизованные клетки на любом твердофазном компоненте, например пористом или полимерном матриксах. Период получения продукта, определяемый как период, протекающий между введением субстрата в сосуд получения продукта и сбором супернатанта, содержащего витамин С, так называемый поток клеток, выросших в культуре, может изменяться в зависимости, например от типа и концентрации клеток, рН, температуры и используемой питательной среды и предпочтительно протекает приблизительно от 2 приблизительно до 100 ч. Значение рН и температура могут отличаться от значения рН и температуры на стадии выращивания, но, по существу, являются такими же, как на стадии выращивания.

В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного процесса применения покоящихся

- 12 009287 клеток микроорганизма стадия получения продукта проводится в непрерывном режиме, что означает, что первый сырьевой поток, содержащий клетки из ростового сосуда, и второй сырьевой поток, содержащий субстрат, поступают в сосуд получения продукта непрерывно или периодически. Первый сырьевой поток может содержать либо только клетки, выделенные/отделенные из среды выращивания, либо клеточную суспензию, получаемую непосредственно на стадии выращивания, то есть клетки, суспендированные в среде выращивания, без какой-либо промежуточной стадии отделения, отмывки и/или выделения клеток. Второй сырьевой поток, как определено здесь, может включать в себя все другие сырьевые потоки, необходимые для проведения стадии получения продукта, например среду получения продукта, включающую в себя субстрат в виде одного или нескольких различных потоков, воду для разведения и акцептор протона для контроля рН.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма, когда оба потока подаются непрерывно, отношение интенсивности подачи первого потока к интенсивности подачи второго потока может изменяться в пределах от 0,01 до 10, предпочтительно между приблизительно 0,01 и приблизительно 5, наиболее предпочтительно между приблизительно 0,02 и 2. Это отношение зависит от концентрации клеток и субстрата в первом и втором потоках, соответственно.

Другим способом осуществления вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма по настоящему изобретению может быть процесс применения покоящихся клеток определенной клеточной плотности в сосуде получения продукта. Клеточная плотность измеряется в единицах абсорбции (оптическая плотность) при 600 нм с использованием способов, известных специалисту. В предпочтительном варианте осуществления клеточная плотность на стадии получения продукта составляет по крайней мере 10, более предпочтительно между приблизительно 10 и приблизительно 200, еще более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 200, еще более предпочтительно между приблизительно 15 и приблизительно 120 и наиболее предпочтительно между приблизительно 20 и приблизительно 120.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизме для того, чтобы сохранить клетки в сосуде получения продукта в необходимой клеточной плотности в течение фазы получения продукта, выполненной, например, в непрерывном или полунепрерывном режиме, могут быть использованы любые способы, известные в уровне техники, как, например, рециклинг клеток посредством центрифугирования, фильтрования, применения мембранной системы для ультрацентрифугирования в поперечном потоке или микрофильтрации, декантации, флоккуляции, удерживания клеток в сосуде с помощью мембранных устройств или клеточной иммобилизации. Кроме того, в случае, если стадия получения продукта проводится в непрерывном или полунепрерывном режиме и клетки подпитываются непрерывно или периодически из ростового сосуда, клеточная плотность в сосуде получения продукта может сохраняться на постоянном уровне посредством, например, отбора из сосуда получения продукта количества клеток, соответствующего количеству клеток, поступивших из ростового сосуда.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма полученный витамин С, содержащийся в так называемом потоке клеток, выросших в культуре, восстановлен или собран из флакона для получения продукта. Поток клеток, выросших в культуре, может включать в себя, например, бесклеточный или содержащий клетки водный раствор, полученный из сосуда получения продукта, который содержит витамин С, полученный в результате превращения субстрата для получения продукта с помощью покоящихся клеток в сосуде получения продукта. Клетки, все еще находящиеся в потоке клеток, выросших в культуре, могут быть отделены от витамина С с помощью любых способов, известных в области применения, например таких, как фильтрация, центрифугирование, декантация, применение мембранной системы для ультрацентрифугирования в поперечном потоке или микрофильтрация, проточная ультрафильтрация вдоль потока или ультрафильтрация или фильтрация с использованием концевого фильтра. После проведения такой технологической операции по отделению клеток поток клеток, выросших в культуре, является, по существу, свободным от клеток.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма в одном аспекте процесс по настоящему изобретению приводит к получению витамина С с выходом продукта, который по крайней мере составляет приблизительно 1,8 г/л, предпочтительно по крайней мере приблизительно 2,5 г/л, более предпочтительно по крайней мере приблизительно 4,0 г/л и наиболее предпочтительно по крайней мере 5,7 г/л. В одном варианте осуществления выход витамина С, полученного в результате процесса по настоящему изобретению, находится в диапазоне приблизительно от 1,8 г/л приблизительно до 600 г/л. Выход витамина С означает концентрацию витамина С в потоке клеток, выросших в культуре, полученном непосредственно из сосуда получения продукта, то есть бесклеточный супернатант, включающий в себя витамин С.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма в одном варианте осуществления настоящего изобретения витамин С получают в результате процесса применения покоящихся клеток рекомбинантных микроорганизмов, например таких, как рекомбинантные бактерии. Предпочтительно рекомбинантные бактерии выбраны из бактерий, которые могут экспрессировать ίη νίνο активную форму Ь-сорбозондегидрогеназы, в частности бактерии рода 61исоиоЬас!ег, Лсс1оЬас1сг. Ркеиботоиак и ЕксйепсЫа, наиболее предпочтительны бактерии из рода 61исоиоЬас!ег, Лсе!оЬас!ег или Е.

- 13 009287 со11. Еще более предпочтительны, например, бактерии С. охубапк и Е. со11, и наиболее предпочтительны бактерии, выбранные из группы, состоящей из С. охубапк N44-1, С. охубапк ΙΕ0 3293 и С. охубапк ΙΕ0 3244. Рекомбинантный микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, созданный методом генетической инженерии с использованием широко известных способов, содержащий один или несколько желаемых генов на своей хромосоме или на плазмиде, введенной в вышеуказанный микроорганизм, что приводит, например, к сверхпродукции вышеуказанного гена (генов). Желаемый ген(ы), введенный (введенные) в вышеуказанный микроорганизм, может (могут) кодировать, например, фермент, вовлеченный в процесс превращения субстрата в витамин С. В предпочтительном варианте осуществления желаемый ген кодирует Ь-сорбозондегидрогеназу, катализирующую процесс превращения Ь-сорбозона в витамин С. Предпочтительной Ь-сорбозондегидрогеназой, используемой в настоящем изобретении, является, например, Ь-сорбозондегидрогеназа (δΝΟΗπί) микроорганизма С. охубапк N44-1 (§идката с1 а1., Лдлс. Вю1. СНет. 54: 1201-1209,1990), как представлено в 8ЕД ΙΌ N0: 2, нуклеотидная последовательность, кодирующая вышеуказанную δΝΟΗπί, представлена в 8ЕД Ш N0: 1. Функциональные производные вышеуказанной 5>НЭНа1 также могут быть использованы в контексте настоящего изобретения. Подразумевается, что частью настоящего изобретения также являются нуклеотидные последовательности, имеющие гомологию по крайней мере 80%, предпочтительно по крайней мере 90% по сравнению с последовательностью 8ЕД ΙΌ N0: 1 и которые кодируют ферменты, способные катализировать превращение Ь-сорбозона в витамин С.

Рекомбинантный микроорганизм, такой, например, как С. охубапк N44-1, может включать в себя несколько копий §N0^1, клонированной на соответствующей плазмиде или интегрированной на хромосоме. Количество плазмидных копий, которые могут применяться в настоящем изобретении, находится в диапазоне приблизительно от 2 приблизительно до 15, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 5 приблизительно до 10 на преобразованный микроорганизм. Количество плазмидных копий может быть определено, например, с помощью сравнения интенсивности соответствующей полосы, видимой на полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.

В контексте вышеуказанного процесса применения покоящихся клеток микроорганизма при использовании в настоящем изобретении рекомбинантных микроорганизмов стадия роста и стадия получения продукта, по существу, могут быть такими же, как описано выше. Если используется рекомбинантный микроорганизм, содержащий §N0^1, например рекомбинантный С. охубапк N44-1 с увеличенной дозой 5>НЭНа1. среда для выращивания может содержать, например, Ό-сорбитол, Ь-сорбозу, глицерин или Ό-глюкозу как по отдельности, так и их смесь, один или несколько соответствующих источников азота и соли. Среда получения продукта может содержать, например, Ό-сорбитол и/или Ь-сорбозу и соли. Сбор витамина С, по существу, может быть выполнен, как описано в этом описании.

Еще в одном аспекте процесс по настоящему изобретению может быть объединен с дополнительными стадиями разделения и/или очистки полученного витамина С от других компонентов, содержащихся в потоке клеток, выросших в культуре, то есть так называемыми стадиями технологии производства и выделения целевого продукта. Эти стадии могут включать в себя любые способы, известные специалисту, например концентрирование, кристаллизацию, преципитацию, абсорбцию, ионный обмен, электродиализ, электродиализ с использованием биполярных мембран и/или обратный осмос. Витамин С может быть далее очищен как свободная кислота или любая известная его соль посредством таких способов, как, например, обработка активированным углем, ионный обмен, адсорбция и элюирование, концентрация, кристаллизация, нитрование и лиофилизация. В частности, первое отделение витамина С от других компонентов потока клеток, выросших в культуре, может быть выполнено с помощью любой подходящей комбинации или повторяемости, например, следующих способов: двух- или трехкамерный диализ, электродиализ с использованием биполярных мембран, обратный осмос или адсорбция, например, на ионообменных смолах или неионных смолах. Если в конечной форме витамин С представляет собой соль Ь-аскорбиновой кислоты, превращение солевой формы в форму свободной кислоты может быть выполнено, например, применением электродиализа с использованием биполярных мембран, ионного обмена, технологий хроматографии псевдодвижущихся слоев и т.п. Может быть использовано объединение упомянутых стадий, например электродиализ и электродиализ с использованием биполярных мембран, в одну стадию, так же, как и объединение упомянутых стадий, например нескольких стадий ионного обмена с использованием способов хроматографии псевдодвижущихся слоев. Любой из этих способов самостоятельно или в комбинации с другими формируют удобные способы выделения и очистки продукта, то есть витамина С. Полученный таким образом продукт далее может быть выделен такими способами, как, например, концентрация, кристаллизация, отмывка и лиофилизация кристаллов и/или дополнительная очистка с помощью, например, обработки активированным углем, ионного обмена и/или рекристаллизации.

В предпочтительном варианте осуществления витамин С является очищенным из потока клеток, выросших в культуре с помощью серии стадий технологии производства и выделения целевого продукта, как описано выше, без необходимости перемещения в неводный раствор во время этого процесса, то есть все стадии были выполнены в водной среде. Такая предпочтительная технология производства и выделения целевого продукта может включать в себя, например, концентрацию потока клеток, выросших в

- 14 009287 культуре, полученного из сосуда получения продукта посредством двух- или трехкамерного электродиализа, превращение витамина С, представленного в его солевой форме в концентрированном растворе, в его кислотную форму с помощью электродиализа с использованием биполярных мембран и/или ионного обмена, очистку с помощью таких способов, как, например, обработка активированным углем, с использованием ионообменных и неионных смол, с последующей стадией дополнительной концентрации и кристаллизации. Эти кристаллы могут быть отделены, отмыты и высушены. При необходимости, кристаллы могут быть снова растворены водой, обработаны активированным углем и/или ионообменными смолами и перекристаллизованы. Эти кристаллы затем могут быть отделены, отмыты и высушены.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают изобретение никоим образом.

Пример 1. Получение Ь-аскорбированной кислоты с применением очищенной δΝΩΗαί.

1. Очистка δΝΩΗαί.

Клетки микроорганизма, способного к продукции δΝΩΗαί. культивированные в режиме периодической ферментации с подпиткой (о режиме культивирования см. пример 3), были суспендированы в фосфатном буфере (20 мМ, рН 7,0), содержащем МдС1₂ 2 мМ, дитиотретиол (ΌΤΤ) 1 мМ и 2-3 таблетки ингибитора протеазы, не содержащего ЭДТА (Косйе П1адповйсв ОшЬН). Клеточная суспензия трижды была обработана с помощью устройства «френч-пресс». Затем добавили 25 мл фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0), содержащего 2 мМ МдС1₂ и 1М ЫаС1, и суспензию подвергли ультрацентрифугированию (30000 об./мин, 60 мин, 4°С). Осадок в пробирке после центрифугирования, содержащий мембранную фракцию, отмывали фосфатным буфером (20 мМ, рН 7,0), содержащим 2 мМ МдС1₂ и 500 мМ ЫаС1, а затем суспендировали в соответствующем объеме фосфатного буфера (20 мМ, рН 7,0), содержащего 2 мМ МдС1₂. Затем добавили Ν-октилглюкозид (Ийка) в конечной концентрации 2% (вес/объем) и инкубировали суспензию на льду 90 мин с легким перемешиванием. После центрифугирования (20000 об./мин, 60 мин, 4°С) собирали прозрачный красноватый супернатант и добавляли полиэтиленгликоль 6000 (Ийка) в конечной концентрации 15% (вес/объем). После инкубирования 60 мин при 4°С с легким перемешиванием с последующим центрифугированием (10000 об./мин, 30 мин, 4°С) осадок растворяли в Трис-НС1 буфере (20 мМ, рН 7,6), содержащем 2 мМ МдС1₂ и 0,5% (вес/объем) лаурилсульфабетаин (Ийка). После легкого перемешивания при температуре 4°С, продолжавшегося всю ночь, раствор был подвергнут центрифугированию (20000 об./мин, 30 мин, 4°С). Супернатант был собран и далее очищен, как изложено ниже.

Следующие стадии очистки были проведены при температуре 4°С на системе АКТА Ехр1огег 10 Б (Атегвйат Вювшепсев) с использованием программы υΝΚΌΚ,Ν 3.1. Стандартные скорости потока при ионообменной хроматографии находились в пределах 1-2 мл/мин. Элюирование белка контролировали при 280 нм, и БПОНаьактивные фракции были определены с использованием стандартного фотометрического анализа на всех стадиях очистки (см. далее) или анализа очищенных фракций продукта.

Прозрачный супернатант IV был обессолен в 2,5 мл порциях на гель-фильтрационной колонке Берйабех О 25 (свободный объем: 2,5 мл) с использованием 20 мМ Трис-НС1 буфера (рН 7,6), содержащего 2 мМ МдС1₂ и 0,5% (вес/объем) лаурилсульфобетаин.

БПОНаьположительные фракции объединяли вместе и аликвоты (приблизительно 10 мл) помещали на сильную аниообменную колонку (например, Моно-0 НК, Атегвйат Вюваепсев, объем колонки: 8 мл), которая перед использованием предварительно была уравновешена буфером А1 (10 мМ Τηβ, 10 мМ ΒίδΤπβ, 10 мМ МЕБ, 2 мМ МдС1₂, 0,5% лаурил сульфобетаин, рН 7,6). Несвязывающие белки элюировали 100% буфером А1, а затем вносили 4 объема колонки с линейным градиентом рН в 6 объемах колонки до образования 100% буфера Β1 (Τηβ, 10 мМ; ΒίδΤτίδ, 10 мМ; МЕБ, 10 мМ; МдС1₂, 2 мМ, и лаурилсульфобетаин, 0,5%, рН 4,7), а затем 8 объемами колонки 100% буфера В1. БПЭНа1 элюировали при значении рН приблизительно 6,5, что является очень близким к значению рН 6,52, рассчитанном на основании аминокислотной последовательности. Активные фракции объединяли вместе, разбавляли таким же объемом буфера НЕРЕБ (50 мМ, рН 8,0), содержащего 2 мМ МдС1₂ и 0,5 %> лаурилсульфобетаин (конечный объем: 15-20 мл), и наносили на другую сильную анионообменную колонку (например, Мопо-0 НК, Атегвйат Вюваепсев, объем колонки: 1 мл), которая была уравновешена буфером А2 (15 мМ НЕРЕБ, 2 мМ МдС1₂, 0,5% лаурилсульфобетаин, рН 7,6). Несвязывающие белки элюировали 100% буфером А2 и затем вносили 4 объема колонки с линейным солевым градиентом в 20 объемах колонки до 40% буфера В2 (НЕРЕБ 15 мМ; МдС1₂ 2 мМ, ИС1 1М и лаурилсульфобетаин 0,5%, рН 7,6) с последующим ступенчатым градиентом до 100% буфера В2. БПОНа1 элюировали приблизительно 150 мМ ЫС1. При электрофорезе в полиакриамидном геле в присутствии додецилсульфата натрия активные фракции имеют одну-единственную полосу приблизительно 85 кДа.

2. Фотометрический анализ БПЭНат

Реакционная смесь для фотометрического измерения активности БПОНа1 состоит из 0,196 мМ хлорида нитросинего тетразолия (ΝΈΤ), 0,137 мМ феназин метосульфата (РМБ), 20,4 мМ Ь-сорбозона и ферментных растворов в конечном объеме 1 мл 0,1М натриево-фосфатного буфера, рН 7,5. Реакцию начинали с добавления фермента и измеряли активность фермента в 1 см кювете при 570 нм (Т=25°С) как уровень первоначального восстановления ЫВТ Одна единица ферментативной активности была опреде

- 15 009287 лена как количество фермента, катализирующее восстановление 1 мкМ ΝΒΤ в минуту. Коэффициент экстинкции ΝΒΤ при рН 7,5 составляет 100 мМ^-1 см^-1. Для определения активности использовали два типа стандартных кювет: одна содержала вышеуказанные компоненты, за исключением Ь-сорбозона, а вторая содержала все компоненты, за исключением ферментативных растворов.

3. Анализ полученной ΞΝΟΗηί.

Очищенные фракции, содержащие 8ЫОНа1 (см. выше), анализировали непосредственно для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона при исследовании следующей композиции (конечный объем 0,5 мл): 0,14 мг/мл очищенной и обессоленной δΝΟΗπί, 50 мМ фосфатного буфера (рН 6,5), 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (В8А), 100 мМ Ь-сорбозона, 1 мМ РМ8, 5 мМ СаС1₂, 50 мкМ РЦЦ-К₂. Исследование проводили в соответствующих реакционных пробирках при температуре 25°С при адекватном перемешивании (900 об./мин на настольном шейкере) в темноте.

Образцы анализировали посредством способа высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС) с использованием системы Ад11еп( 1100 НРЬС (АдИеп( Тесйпо1од1е8, ^11тшд1оп, И8А) с колонкой Ь1Сйго8рйег-100-КР 18 (125x4,6 мм) (Мегск, ОагтЧабГ Сегтапу), соединенной с колонкой АттехНРХ-78Н (300x7,8 мм) (Вюгаб, Кетасй, 8\\'Цхег1апб). Подвижная фаза представляла собой 0,004М серную кислоту, и скорость потока составляла 0,6 мл/мин. Два сигнала были зарегистрированы с использованием УФ-детектора (длина волны 254 нм) в сочетании с детектором показателя преломления. Дополнительно была проведена идентификация Ь-аскорбиновой кислоты с использованием аминоколонки (УМС-Раск Ро1уатше-П, УМС, 1пс., Куо1о, 1арап) с УФ-детектированием при длине волны 254 нм. Подвижная фаза представляла собой 50 мМ ХН₄Н₂РО₄ и ацетонитрил (40:60). Стандартная первоначальная волюметрическая продуктивность Ь-аскорбиновой кислоты при этих условиях составляла 0,5-1,0 г/л/ч. Таким образом, после 1 ч реакционного времени концентрация Ь-аскорбиновой кислоты в супернатанте составляла 300-900 мг/л.

Пример 2. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозы и Ό-сорбитола в пробирке и колбах для ферментации.

Клетки микроорганизма С. охубапк Ν44-1 высевали в 4 мл жидкой питательной среды № 3ΒΌ и культивировали в пробирке (диаметр 18 мм) при температуре 30°С со встряхиванием при 220 об./мин на протяжении 3 дней. По окончании инкубационного периода было аккумулировано 20 мг/л Ь-аскорбиновой кислоты.

Клетки штамма Ν44-1 культивировали (в трех параллелях) в 50 мл жидкой питательной среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (ОтТсо), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃, в 500 мл отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С со встряхиванием при 200 об./мин. После 72 ч инкубирования количество Ь-аскорбиновой кислоты, определенное с помощью НРЬС, в трех колбах составляло 400, 500 и 680 мг/л.

Пример 3. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ό-сорбитола в результате ферментации с периодической подпиткой.

Клетки С. охубапк Ν44-1 выращивали в 200 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюСкет1ка, Вискз, 8^Й7ет1апб), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃, в 2-литровой отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С, со встряхиванием при 180 об./мин. После 48 ч инкубирования 150 мл этой культуры высеяли в 10-литровый биореактор (Β. Вгаип ΕΌ10, Мекипдеп, Сегтапу), оборудованный датчиками температуры, рН и растворенного кислорода и замкнутой системой автоматического управления, содержащий предварительно приготовленные 5,3 л среды, содержащей 20 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюСкет1ка, Вискк, 8\\'Цхег1апб) и 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О. Температуру поддерживали на 30°С, значение рН поддерживали на 6,0 путем добавления 28% раствора аммония, поток воздуха составлял 4,5 л/мин, и уровень растворенного кислорода поддерживался на 30% посредством ступенчатого перепада скорости перемешивания (минимум, 300 об./мин). После 6 ч продолжительности процесса 500 г/л раствор сорбитола был подпитан при скорости 25 г/ч на протяжении 44 ч. После 96 ч продолжительности процесса в супернатанте осталось приблизительно 1% субстрата, и было получено 950 г/л Ь-аскорбиновой кислоты.

Пример 4. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона и Ь-сорбозы с использованием фракции клеточной мембраны.

Клетки С. охубапк Ν44-1 культивировали в 100 мл жидкой питательной среды № 3ΒΌ в 500-миллилитровой отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С со встряхиванием при 220 об./мин на протяжении 3 дней. Полученную культуру центрифугировали при 500 об./мин с целью удаления СаСО₃. Супернатант, полученный на этой стадии, затем центрифугировали при 5000 об./мин для получения в пробирке осадка этих клеток. Собранные клетки суспендировали в 3 мл 50 мМ калиево-фосфатного буфера (рН 7,0), и клетки были разрушены посредством пропускания дважды через устройство для разрушения клеток «френч-пресс» (81М-АМШСО 8ре1гошс ИчЧгитепК И8А) при давлении 900 фунтов/кв.дюйм. Полученный гомогенат сначала центрифугировали при 5000 об./мин для того, чтобы удалить клеточный дебрис. Затем супернатант разводили до конечной концентрации белка 3 мг белка/мл. Этот разведенный образец обозначается как бесклеточный экстракт (СРЕ). СРЕ центрифугировали 60 мин при 100000хд. Супернатант удаляли и собирали осадок, содержащий мембранную фракцию.

- 16 009287

Реакцию (200 мкл) с мембранной фракцией (100 мкл) проводили в 50 мМ калиево-фосфатном буфере (рН 7,0) при температуре 30°С со встряхиванием при 220 об./мин на протяжении 15 ч. Тестированные субстраты представляли собой Ь-сорбозон (конечная концентрация 1%) и Ь-сорбозу (конечная концентрация 2%). Конечная концентрация белка, использованная в реакции, составляла 1,5 мг/мл. По окончании инкубационного периода было получено 680 и 10 мг/л Ь-аскорбиновой кислоты из 1% Ь-сорбозона и 2% Ь-сорбозы, соответственно.

Пример 5. Выделение гена 8ИВНа1 из С1исопоЬас1ег охубапк N44-1.

1. Мутагенез Тп5.

Плазмида р8ИР2021, представляющая собой вектор-«самоубийцу», содержащий Тп5 (81топ В. е1 а1. 1983. В10/ТЕС’НН0Ь0СУ 1: 784-791), была перенесена из Е. сой НВ101 в С. охубапк N44-1 посредством следующего способа конъюгационного переноса. С. охубапк N44-1 культивировали в экспериментальной пробирке, содержащей 5 мл жидкой питательной среды МВ при температуре 30°С на протяжении всей ночи. Е. сой НВ101, несущая хелперную плазмиду рВК2013 (И.Н. Р1диг8к1, Ргос. ИаИ. Асаб. 8ск И8А, 76, 1648-1652, 1979), и Е. сой НВ101, несущая плазмиду р8ИР2021, инкубировали в экспериментальных пробирках, содержащих 5 мл среды ЬВ с 50 мкг/мл канамицина, при температуре 37°С на протяжении всей ночи. Клетки С. охубапк N44-1, Е. сой НВ101 (рВК2013) и Е. сой НВ101 (р8ИР2021), полученные в результате ночного культивирования, были собраны отдельно друг от друга центрифугированием и суспендированы в первоначальном объеме среды МВ. Затем эти клеточные суспензии были смешаны в равных объемах, и эта смесь была распределена на 0,45 мкм нитроцеллюлозной мембране, наложенной на поверхность агаровой пластины МВ. После культивирования при 27°С на протяжении 1 дня клетки были соскоблены с мембраны, и были приготовлены разбавленные растворы в питательной среде МВ. Разведенные клетки затем были распределены на агаровой среде МВ, содержащей 10 мкг/мл полимиксина В и 50 мкг/мл канамицина (среда МРК). Полимиксин В селекционирует против донора Е. сой и вспомогательных штаммов, в то время, как канамицин селекционирует такие клетки С. охубапк, которые были трансформированы с плазмидой р8ИР2021 (то есть трансконъюганты). Было получено приблизительно 30000 трансконъюгантов.

2. Тестирование с целью выявления микроорганизмов, не являющихся продуцентами Ь-аскорбиновой кислоты.

В общей сложности, 3760 трансконъюгантов были перенесены с использованием стерильных зубочисток на сетчатые пластинки со средой МРК и выращивались при 27°С на протяжении 3 дней. Для тестирования получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона клетки каждого трансконъюганта были сняты с сетчатой пластины с помощью стерильной зубочистки и суспендированы в 50 мкл реакционной смеси покоящихся клеток, содержащей 0,5% Ь-сорбозона, 0,3% №1С1 и 1% СаСО₃, в 96-луночных микротитрационных планшетах. Микротитрационные планшеты инкубировали при 30°С без встряхивания на протяжении 1 дня. Анализировали по 1 мкл каждой полученной реакционной смеси на наличие образования Ь-аскорбиновой кислоты с использованием индикаторных полосок для определения аскорбиновой кислоты и прибора КОР1ех2 (Мегск КСаА, 64271 ЬапщйабГ Сегтапу). Штаммом положительного контроля был микроорганизм С. охубапк N44-1, выращенный при идентичных условиях. С помощью этого способа был выявлен мутант №4-1-6А9, не производящий Ь-аскорбиновую кислоту. Затем был выполнен Саузерн-блоттинг для подтверждения наличия Тп5 в хромосомной ДНК мутанта №4-1-6А9. 2 мкг хромосомной ДНК, выделенной из мутанта, были переварены рестриктазами либо Ара1, С1а1, ЕсоВ1, ЕсоВУ, Крп1, 8й.1Е ВатН1, 8а11, либо НшбШ и подвергнуты электрофорезу в агарозном геле (0,8% агароза). Затем гель был обработан 0,25н. НС1 в течение 15 мин с последующей обработкой 0,5н. №10Н в течение 30 мин. ДНК была перемещена на нейлоновую мембрану с помощью быстрой нисходящей системы переноса ТигЬоВ1ойег (8сй1екйег & 8сйие11 СтЬН, Сегтапу). Зонд был изготовлен с помощью набора для нанесения метки РСВ-Э1С 1аЬейпд кй (Восйе Ихадпокйск СтЬН, 68298 Маппйе1т, Сегтапу) с использованием праймеров Тп2419 (8ЕО ΙΌ N0: 3) и Тп3125В (8ЕО ΙΌ N0: 4) с плазмидой р8ИР2021 в качестве матрицы. Был получен ПЦР-продукт длиной 707 пар оснований.

Применяли следующие условия гибридизации: гибридизация была выполнена при строгих условиях гибридизации, например от 2 ч до 4 дней инкубирования при температуре 42°С, с использованием ДНК-зонда, меченного диоксигенином (И1С) (изготовленного с использованием системы для нанесения метки Э1С: Восйе Ихадпокйск СтЬН, 68298 Маппйе1т, Сегтапу) в растворе П1дЕакуНуЬ (Восйе Ихадпокйск) с 100 мкг/мл ДНК из молок лососевых, с последующей отмывкой фильтров в течение 15 мин (дважды) в двукратном 88С и 0,1% 8Ό8 при комнатной температуре и затем отмывкой в течение 15 мин (дважды) в 0,5-кратном 88С и 0,1% 8Ό8 или 0,1-кратном 88С и 0,1% 8Ό8 при температуре 65°С.

Следующая стадия гибридизации, детекция гибридизации, была выполнена с использованием антиИ1С-АР конъюгата (Восйе Ихадпокйск СтЬН, 68298 Маппйе1т, Сегтапу) и субстрата ЕСР (Атегкйат Вюкшепсек иррка1а, 8\гебеп) с применением прибора 8Т0ВМ (Атегкйат Вюкаепсек). Все манипуляции были выполнены в соответствии с инструкциями компаний-поставщиков.

Используя вышеуказанные способы, было подтверждено присутствие Тп5 в хромосомной ДНК мутанта №4-1-6А9.

- 17 009287

3. Клонирование фрагментов ДНК, разомкнутых посредством Тп5, и секвенирование смежных областей. На основании результатов, полученных после применения ферментов рестрикции, описанного выше в параграфе 2, в качестве ферментов, которые образуют фрагменты ДНК, имеющие фланкирующие области хромосомной ДНК длиной более 1 т.п.н. с обеих сторон от вставки Тп5, были выбраны Арак СЫ, ЕсоЫ и ЕсоВУ. Двойное переваривание ДНК мутанта Ш4-1-6А9 с использованием 8аП (который имеет сайт рестрикции приблизительно посередине Тп5) и ΑρηΙ приводит к образованию двух фрагментов (6,2 и 3,8 т.п.н.), которые образуют 707 п.н. зонд, описанный выше.

Хромосомная ДНК Тп5 мутанта С. охуйапк Ш4-3-6А9 была приготовлена и обработана с помощью Арак Фрагменты ДНК, имеющие размеры от 9 до 12 т.п.н., были выделены из агарозного геля и лигированы с клонирующим вектором рВ1иезсг1р1 ΙΙ КЗ+ (8йа1адепе, Змйхейапй), предварительно обработанным Арак Затем смесь для лигирования была использована для трансформации компетентных клеток Е. сой, селектированных на Ь-агаровых пластинках, содержащих 50 мкг/мл канамицина и 100 мкг/мл ампициллина. Была выделена плазмида из одного трансформанта, и клонированные области, фланкирующие вставку Тп5, были секвенированы. Нуклеотидная последовательность одиночной открытой рамки считывания (разомкнутая вставкой Тп5) была установлена после удаления дупликации 9 п.н., которая, как известно, возникает во время транспозиции Тп5. Нуклеотидная последовательность всей открытой рамки считывания, далее именуемая ген 8ХЭНа1 микроорганизма С1исопоЬас!ег охуйапк N44-2, состоит из 2367 п.н. и обозначена как 8ЕО ΙΌ N0: 1. Соответствующая аминокислотная последовательность, выведенная из полинуклеотидной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 1, обозначена здесь как 8Е0 ΙΌ N0: 2.

Полинуклеотидная последовательность гена 8ХЭНа1 депе (8Е0 ΙΌ N0: 1) была подвергнута исследованию с помощью В1ак! 2 (версия 2 программы ВЬА8Т, доступная в №йопа1 СеШет Гог В1о!есйпо1оду Ыогшайоп [ЛСВТ], описанная у Л115сйн1 е! а1. (ЖсЫс ЛаШ Век. 25: 3389-3402, 1997)) по базе данных РВ0 8\У-8\\тккРго1 (полная версия и дополнительные уточненные варианты).

Используемые условия представляли собой выравнивание разрывов и отбор искомой последовательности для обнаружения участка низкой сложности.

При использовании программы М0ТГЕ8 были без труда установлены бактериальные сигнатурные последовательности дегидрогеназ хинопротеинов, что свидетельствует о том, что 8ИВНа1 имеет характеристики РОО-зависимого фермента.

Пример 6. Саузерн-блоттинг бактерий, продуцирующих Ь-аскорбиновую кислоту из Ь-сорбозона.

Хромосомная ДНК была выделена из клеток микроорганизмов С1исопоЬас!ег охуйапк ΙΕ0 3293, ΙΕ0 3292, ΙΕ0 3244, ΙΕ0 3287, С1исопоЬас!ег Гга1еигн ΙΡ0 3260 и ΙΕ0 3265, С1исопоЬас!ег сегйшк ΙΕ0 3266 и ΙΕ0 3269, Асе!оЬас!ег асей киЬкр. ог1еапик ΙΕ0 3259, Асе!оЬас!ег асей киЬкр. хуйпит ΙΕ0 13693 и ΙΕ0 13773, Асе!оЬас!ег кр. АТСС 15164 и ЕксйепсШа сой К-12. Штаммы ΙΕ0 13693 и ΙΕ0 13773 выращивали при температуре 27°С в течение 3 дней в среде № 350, содержащей 5 г/л бактопептона (ЭГГсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ЭГГсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннитола, 1 г/л Мд80₄-7Н₂0, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все прочие штаммы Асе!оЬас!ег и все штаммы С1исопоЬас!ег выращивали при температуре 27°С в течение 3 дней на маннитоловой (МВ) агаровой среде, содержащей 25 г/л маннитола, 5 г/л дрожжевого экстракта (ЭГсо ЬаЬотаФпек, Пейой, М1сй., И8А), 3 г/л бактопептона (ИГГсо) и 18 г/л агара (ЭГсо). Е. сой К-12 выращивали на агаровой среде Луриа. Препараты хромосомной ДНК использовали при Саузернблоттинге при строгих условиях, как описано в примере 5. Препараты хромосомной ДНК были обработаны С1аГ (при исследовании области Х-домена) или ЕсοВI (при исследовании области С-домена), и по 1 мкг фрагментов ДНК были разделены с помощью электрофореза в агарозном геле (1% агароза). Гель был обработан 0,25н. НС1 в течение 15 мин, а затем 0,5н. №10Н в течение 30 мин, после чего был блоттирован на нейлоновую мембрану с помощью Уасиит В1ойет Мойе1 785 (ВЮ-ВАИ ЬаЬота!опек АС, 8\\т1хег1апй) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. Зонды были изготовлены с помощью набора для нанесения метки РСВ-ЭЮ 1аЬейпд кй (Восйе П1адпокйск) с использованием пар праймеров, указанных в табл. 1. ПЦР-продукт Р1 соответствует области 8ИВНа1, обозначаемой как Н-домен (предположительно трансмембранная область), в то время как ПЦР-продукт Р2 соответствует области ЗИИНа/ обозначаемой как С-домен (предположительно область первичной дегидрогеназы).

Таблица 1

Праймеры, использованные в ПЦР для получения меченых зондов для гибридизации по Саузерну

Пары праймеров	5Е0 Ιϋ N0: последовательностей праймеров	ПЦРпродукт	Расчетный размер ПЦР-продукта (п.н.)
3ΝΩΗ1Ρ и 3ΝΟΗ420Β	5 и 6	Р1	420
3ΝΟΗ501Ε и 3Ν0Η2364Β	7 и 8	Р2	1864
3ΝΌΗ501Γ и 3ΝϋΗ1530Β	7 и 9	РЗ	1030
8Ν0Η1391Γ и 5ΝΟΗ2364Ε	10 и 8	Р4	974

- 18 009287

В табл. 1 представлены результаты блоттинг-гибридизации по Саузерну. В результате гибридизации с зондом Р1 (Ν-домен) чистые положительные полосы наблюдались для С. охубаик ΙΡ0 3293, ΙΡ0 3292, ΙΡ0 3244, ΙΡ0 3287 и А.кр. АТСС 15164. В результате гибридизации с зондом Р2 (С-домен) чистые положительные полосы наблюдались для штаммов ΙΡ0 3293, ΙΡ0 3292, ΙΡ0 3244, ΙΡ0 3287 и А.кр. АТСС 15164, в то время как слабая полоса наблюдалась у штаммов ΙΡ0 3260, ΙΡ0 3265, ΙΡ0 3266, ΙΡ0 3269 и ΙΡ0 13773. Контрольный штамм, представляющий собой Е. со11 К-12, не демонстрировал определяемых сигналов ни для одного из доменов.

Таблица 2

Определение сигналов гибридизации, полученных в результате блоттинг-гибридизации по Саузерну с зондами для Ν- и С-доменов ΞΝΌΗηί (зонды Р1 и Р2) у различных штаммов

Штамм	Р1	Р2
С. охудапз ΙΓΟ 3293	+	+
С. охудапз ΙΕΟ 3292	+	+
С. охуёапз ΙΓΟ 3244	+	+
С. ЕгаЪеигИ ΙΓΟ 3260	не обнаружено	след
С. ГгаСеигбб ΙΕΟ 3265	не обнаружено	след
С. сег1пиз ΙΕΌ 3266	не обнаружена	след
С. охус!апз ΙΓΟ 3269	не обнаружено	след
С. охудапз ΙΓΟ 3287	+	+
А. асеШ зиЬзр. ог!еапиз ΙΓΟ 3259	не обнаружено	не обнаружено
А. асеИ зиЬзр, хуИпит ΙΕΟ 13693	не обнаружено	не обнаружено
А. асеСб зиЬзр. хуИпит ΙΓΟ 13773	не обнаружено	след
АсеСоЬасСег зр, АТСС 15164	+	+
Е. соИ К-12	не обнаружено	не обнаружено

1г - след.

иб - не обнаружено.

Зонды Р1 и Р2 были синтезированы (в качестве ΌΙΟ-меченных ПЦР-продуктов) с использованием пар праймеров, указанных в табл. 1.

Пример 7. ПЦР-амплификация и секвенирование ортологов гена ΞΝΌΗηί О1исоиоЬас1ег охубаик Ν44-1.

Препараты хромосомной ДНК (изготовленные, как описано в примере 6) были использованы в качестве матрицы в ПЦР с четырьмя парами праймеров, указанных в табл. 1. Использовали от 5 до 10 нг хромосомной ДНК на реакцию (общий объем 50 мкл). Если не указано иначе, использовали систему Ехраиб Н1дЬ Ыбе111у РСК (КосЬе О1адиокбск). Условия проведения ПЦР были следующие.

Инкубирование при 94°С 2 мин; 30 циклов: (1) стадия денатурации при 94°С в течение 15 с, (ίί) стадия отжига при 60°С в течение 30 с, (ίίί) стадия синтеза при 72°С в течение 45-120 с (время стадии синтеза для пар праймеров Р1, Р2, Р3 и Р4 было 45, 120, 90 и 90 с, соответственно); стадия удлинения при 72°С в течение 7 мин.

Образцы, полученные в результате ПЦР, были разделены электрофорезом в агарозном геле, и после окрашивания бромистым этидием полосы были визуализированы с использованием трансиллюминатора. Результаты ПЦР суммированы в табл. 3.

- 19 009287

Таблица 3

Определение у различных штаммов ПЦР-продуктов Р1, Р2, Р3 и Р4, полученных с парами праймеров, указанных в табл. 1 (продукты визуализированы посредством электрофореза в агарозном геле)

Штамм	Р1	Р2	РЗ	Р4
С. охус/апз ΙΓΟ 3293	+	+*	не определялось	+
С. охудапз ΙΓΟ 3292	+	не обнаружено	не обнаружено	+
С. оху0апз ΙΕΌ 3244	+	+	+	+
С. ЬгаСеигН ΙΓΟ 3260	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено
С, сег1пиз ΙΓΟ 3266	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено
С, охускзпз ΙΓΟ	+	+	не обнаружено	+
А. асе£1 зиЬзр. ог1еапиз ΙΓΟ 3259	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено
А. аоеС1 зиЬзр. хуИпит ΙΓΟ 13693	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено
А. асе£1 зиЬзр. ху11пит ΙΡΟ 13773	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено
АсеСоЬас&ег зр. АТСС 15164	+	+	не обнаружено	не обнаружено
Е. соИ К-12	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено	не обнаружено

+ - обнаружено.

пб - не обнаружено.

п! - не определялось.

* Эта ПЦР была выполнена при помощи СС-богатой ПЦР системы (Восйе П1адпокбск) с таким же реакционным циклом, какой использовали для системы Ехрапб Н1дй НбеШу РСВ.

После того, как чистые полосы ПЦР-продуктов были выявлены на агарозном геле (табл. 3), ПЦРпродукты использовали для непосредственного определения нуклеотидной последовательности, применяя стандартные способы. Нуклеотидные последовательности, полученные для различных ПЦР-продуктов, и соответствующие аминокислотные последовательности кодируемых пептидов сравнивали с полноразмерной последовательностью гена §N0^1 и непроцессированным белком микроорганизма С. охубапк N44-1.

Ортологи 8НЭНа1 С1исопаЬас!ег охубапк ΙΕΟ 3292

ПЦР-продукт (около 1 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами 8N^Н1391Ε (8Еф ΙΌ ΝΟ: 10) и 8ΝΩΜ2364Β (8Еф ΙΌ ΝΟ: 8) и хромосомной ДНК С. охубапк ΙΕΟ 3292 в качестве матрицы, был секвенирован с праймером 8ΝΟΜ1391Ε (8Еф ΙΌ ΝΟ: 10).

Для установленной нуклеотидной последовательности 771 п.н. (8Еф ΙΌ ΝΟ: 11) было выявлено 98,7% (761/771) гомологии с нуклеотидами 1431-2201 последовательности 8НЭН;н микроорганизма С. охубапк Ν44-1 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 1). Установленная аминокислотная последовательность 256 аминокислот (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 12) показывала 100% идентичность аминокислотам 478-733 из аминокислотной последовательности 8ΝΩΝ микроорганизма С. охубапк Ν44-1 (8Еф ΙΌ ΝΟ: 2).

Ортологи 8НЭНа1 С1исопоЬас!ег охубапк ΙΕΟ 3287

ПЦР-продукт (около 0,4 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами 8ΝΩΜ1Ε (8Еф ΙΌ ΝΟ: 5) и 8ΝΩΜ420Β (8Еф ΙΌ ΝΟ: 6) и хромосомной ДНК С. охубапк ΙΕΟ 3287 в качестве матрицы, был секвенирован с праймером 8НЭН420В (8Еф ΙΌ ΝΟ: 6). Для установленной нуклеотидной по

- 20 009287 следовательности 350 п.н. ($Е0 ΙΌ N0: 13) было выявлено 97,4% (341/350) гомологии с нуклеотидами 31-380 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 1. Установленная аминокислотная последовательность 116 остатков ($Е0 ΙΌ N0: 14) показывала 100% идентичность аминокислотам 11-126 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

ПЦР-продукт (около 1,9 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами $ХЬН501Е ($Е0 ΙΌ N0: 7) и $ЫПН2364В ($Е0 ΙΌ N0: 8), был секвенирован с праймером $ХЬН501Е ($Е0 ΙΌ N0: 7). Для установленной нуклеотидной последовательности 808 п.н. ($Е0 ΙΌ N0: 15) было выявлено 98,0% (745/808) гомологии с нуклеотидами 578-1385 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 1. Установленная аминокислотная последовательность 268 остатков ($Е0 ΙΌ N0: 16) показывала 100% идентичность аминокислотам 194-461 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

ПЦР-продукт (около 1 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами $ХЬН1391Е ($Е0 ΙΌ N0: 10) и $N042364^ ($Е0 ΙΌ N0: 8), был секвенирован с праймером §N041391Е ($Е0 ΙΌ N0: 10). Для установленной нуклеотидной последовательности 800 п.н. ($Е0 ΙΌ N0: 17) было выявлено 98,8% (790/800) гомологии с нуклеотидами 1469-2268 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 1. Установленная аминокислотная последовательность 266 остатков ($Е0 Ш N0: 18) показывала 100% идентичность аминокислотам 491-756 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

Ортологи $Х0Нщ Лсс1оЬас1сг кр. АТСС 15164

ПЦР-продукт (около 0,4 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами $ХЭН1Е ($Е0 ΙΌ N0: 5) и $АЭН420Е ($Е0 ΙΌ N0: 6) и хромосомной ДНК А.кр.АТСС 15164 в качестве матрицы, был секвенирован с праймером $ХЭН420К ($Е0 ΙΌ N0: 6). Для установленной нуклеотидной последовательности 360 п.н. ($Е0 ΙΌ N0: 19) было выявлено 97,8% (352/360) гомологии с нуклеотидами 31-390 последовательности $Е0 Ш N0: 1. Установленная аминокислотная последовательность 120 остатков ($Е0 ΙΌ N0: 20) показывала 100% идентичность аминокислотам 11-130 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

ПЦР-продукт (около 1,9 т.п.н.), полученный в результате амплификации с праймерами $ХЭН501Е ($Е0 ΙΌ N0: 7) и $1ХОН2364К ($Е0 ΙΌ N0: 8), был секвенирован с праймером $ХЬН501Е ($Е0 ΙΌ N0: 7). Для установленной нуклеотидной последовательности 760 п.н. ($Е0 ΙΌ N0: 21) было выявлено 98,0% (745/760) гомологии с нуклеотидами 563-1322 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 1. Установленная аминокислотная последовательность 252 остатков ($Е0 ΙΌ N0: 22) показывала 100% идентичность аминокислотам 189-440 последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

Ортологи $Х0Нщ О1исопоЬас!ег охубапк ΙΕ0 3244

Полная нуклеотидная последовательность ортолога гена $ХОНа1 микроорганизма О. охубапк ΙΕ0 3244 была определена путем использования ПЦР-продуктов, полученных в результате амплификации хромосомной ДНК О. охубапк ΙΕ0 3244 в качестве матрицы со следующими парами праймеров: $ХЬН1Е ($ЕО ΙΌ N0: 5) и $\Ι)11420Η ($ЕО ΙΌ N0: 6); $ЫВН501Е ($ЕО ΙΌ N0: 7) и $МБН1530К ($ЕО ΙΌ N0: 9); $ЫВН1391Е ($ЕО ΙΌ N0: 10) и $№Н2364К ($ЕС) ΙΌ N0: 8); $ЫВН382 ($ЕС) ΙΌ N0: 23) и $МБН1530К ($ЕО ΙΌ N0: 9); $ЫВН1Е ($ЕО ΙΌ N0: 5) и $ЫВН689В ($ЕО ΙΌ N0: 24). Хромосомную ДНК, обработанную рестриктазами ВдШ и ВатНб и лигированную, использовали для еще двух ПЦР с использованием следующих пар праймеров: $ХОН420В ($Е0 ΙΌ N0: 6) и $ХЭН501Е ($Е0 ΙΌ N0: 7) и $N041530^ ($Е0 ΙΌ N0: 9) и Ι$-50.3 ($Е0 ΙΌ N0: 25). Для полной нуклеотидной последовательности ($Е0 ΙΌ N0: 26) было выявлено 98,4% гомологии с нуклеотидной последовательностью $ХОНа1 микроорганизма О. охубапк N44-1 ($Е0 ΙΌ N0: 1). Установленная аминокислотная последовательность ($Е0 ΙΌ N0: 27) показывала 100% идентичность аминокислотной последовательности $Е0 ΙΌ N0: 2.

Пример 8. Увеличенное получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона в результате повышения дозы гена $ХЭНат

Ген $ХОНа1 с 3'-5' и 5'-3' фланкированными областями амплифицировали с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма N44-1 в качестве матрицы и пары праймеров N1 ($Е0 ΙΌ N0: 28) и N2 ($ЕО ΙΌ N0: 29).

ПЦР была выполнена при помощи ОС-богатой ПЦР системы (Восйе Пхадпокбск) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Амплифицированные фрагменты ДНК вводили в вектор рСК.2.1Т0Р0 ([пубгодеп. СаткЬаб, СА, и$А). Затем полученную плазмиду обрабатывали рестриктазами НшбШ и Х1юЕ Фрагмент НшбШ-ХМ, включающий ген $ХЭНа1, лигировали с вектором рУК100 (доступный из Ашепсаи Туре СиНите СоПесбоп, каталожный № АТСС 37156), предварительно обработанным рестриктазами НшбШ и Х1юЕ Смесь для лигирования использовали для трансформации Е. со11 ТО1. Необходимая плазмида, обозначенная как рУК-Р-$Х0На1-Т, была выделена из Е. сой и введена в штамм О. охубапк N44-1 посредством электропорации с использованием стандартных способов (Е1ес1госе11 ташри1а!от ЕСМ600, ВТХ Шс., $ап П1едо, СА, и$А).

Клетки штаммов О. охубапк N44-1 и N44-1, несущих плазмиду рУК-Р-$Х0На1-Т, культивировали в 50 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Ойсо), 2,5 г/л Мд$0₄-7Н₂0 и 15 г/л СаСО₃, в 500 мл отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С, со встряхиванием при 200 об./мин. После 48 ч культивирования количество Ь-аскорбиновой кислоты, определенное в супернатанте с помощью НРЬС, в двух колбах составляло 110 и 200 мг/л, соответственно.

- 21 009287

Пример 9. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона в результате применения покоящихся клеток, выращенных на агаровой среде, содержащей маннитол.

Для получения Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозоны использовали штаммы ΙΡΟ 3293, 3292, 3244, 3260, 3266, 3287, 3259, 13693 и 13773, а также Асе!оЬас!ег кр. АТСС 15164 и 61исопоЬас!ег охубапк N44-1, производное штамма ΙΡΘ 3293.

Штаммы ΙΡΘ 13693 и ΙΡΘ 13773 выращивали при 27°С в течение 3 дней в среде № 350, содержащей 5 г/л бактопептона (ИгГсо), 5 г/л дрожжевого экстракта (ИгГсо), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннитола, 1 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все прочие штаммы Асе!оЬас!ег и все штаммы 61исопоЬас!ег выращивали при температуре 27°С в течение 3 дней на маннитоловой (МВ) агаровой среде, содержащей 25 г/л маннитола, 5 г/л дрожжевого экстракта (ИГсо ЬаЬога!опек, Пе!гоП, М1сП., И8А), 3 г/л бактопептона (Ь|Гсо) и 18 г/л агара (ИНсо).

Клетки соскабливали с агаровых пластин, суспендировали в дистиллированной воде и использовали в реакциях покоящихся клеток, проводившихся в 5 мл пробирках при 30°С в течение 20 ч со встряхиванием при 230 об./мин. Реакционные смеси (0,5 мл) содержали 1% Ь-сорбозон, 0,3% №С1, 1% СаСО₃ и клетки в конечной концентрации 10 единиц абсорбции при 600 нанометрах (ΟΌ₆₀₀). По окончании инкубационного периода реакционные смеси анализировали с помощью способа высокоэффективной жидкостной хроматографии (НРЬС) с использованием системы АдПеп! 1100 НРЬС (АдПеп! ТесЬпо1од1ек, ^Пттд!оп, И8А) с колонкой Ь1СЬгокрйег-100-ВР18 (125x4,6 мм) (Мегск, Иагтк!аб!, Сегтапу), соединенной с колонкой Аттех-НРХ-78Н (300x7,8 мм) (Вюгаб, ВешасП, 8\\'Цхег1апб). Подвижная фаза представляла собой 0,004М серную кислоту, и скорость потока составляла 0,6 мл/мин. Два сигнала были зарегистрированы с использованием УФ-детектора (длина волны 254 нм) в сочетании с детектором показателя преломления. Дополнительно была проведена идентификация Ь-аскорбиновой кислоты с использованием аминоколонки (УМС-Раск Ро1уатше-П, УМС, 1пс., Куо!о, .Гараи) с УФ-детектированием при длине волны 254 нм. Подвижная фаза представляла собой 50 мМ NН₄Н₂РΟ₄ и ацетонитрил (40:60).

Система АдПеп! 8епек 1100 НРЬС-масс-спектрометрия (М8) была использована для идентификации Ь-аскорбиновой кислоты. М8 проводили в режиме положительных ионов с использованием контактной поверхности с электрораспылением. Разделение проводили с помощью колонки Ε·υΝΛ-ί.'8(2) (100x4,6 мм) (РПепотепех, Тоггапсе, И8А). Подвижная фаза представляла собой смесь 0,1% муравьиной кислоты и метанола (96:4). Ь-аскорбиновую кислоту элюировали со временем удержания, равным 3,1 мин. Идентичность Ь-аскорбиновой кислоты была подтверждена по времени удерживания и молекулярному весу соединения.

Для исключения наличия Ό-изоаскорбиновой кислоты идентификация Ь-аскорбиновой кислоты была дополнительно проведена по времени удержания с использованием аминоколонки (УМС-Раск Ро1уатше-П, УМС, 1пс., Куо!о, .Таран) с УФ-детекцией при 254 нм. Подвижная фаза представляла собой 50 мМ NН₄Н₂РΟ₄ и ацетонитрил (40:60).

Штаммы 61исопоЬас!ег и Асе!оЬас!ег, продуцирующие Ь-аскорбиновую кислоту из Ь-сорбозона, представлены в табл. 4.

Таблица 4

Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона

Штамм	Ъ-аскорбиновая кислота (мг*/л)
С.оху^апз ΙΓΟ 3293	1740
&.оху<1апз N4 4-1	570
С.охудапз ΙΓΟ 3292	410
СХохуйапз ΪΕΟ 3244	1280
С. ГгаСеигН ΙΓΟ 3260	50
С. сег!пиз ΙΓΟ 3266	140
(з.оху^апз ΙΓΟ 3287	60
А. асеСл зиЪзр. Ог1еапиз ΙΓΟ 3259	30
А. асеС! зикзр. ХуИпит ΙΓΟ 13693	40
А. асеС1 зиЬзр. ХуИпит ΙΓΟ 13693	120
АсеСоЬасСег зр. АТСС 15164	310
Контрольная проба	Не обнаружено

Контрольная проба; реакцию проводили в реакционной смеси, не содержащей клетки.

- 22 009287

Пример 10. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ό-сорбитола, Ь-сорбозы или Ь-сорбозона в результате применения покоящихся клеток, выращенных на агаровой среде 3ΒΌ.

Клетки 6. охубапк N44-1 выращивали при 27°С в течение 3 дней на агаровой среде № 3ВР, содержащей 70 г/л Ь-сорбозы, 0,5 г/л глицерина, 7,5 г/л дрожжевого экстракта (ЭГсо), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О, 10 г/л СаСО₃ и 18 г/л агара (Όίίοο). Реакции с покоящимися клетками (1 мл реакционной смеси в 10 мл пробирке) проводили с 2% Ό-сорбитолом, 2% Ь-сорбозой или 1% Ь-сорбозоном при 30°С в течение 24 ч, как описано в примере 9. Штамм N44-1 продуцировал 280, 400 и 1780 мг/л Ь-аскорбиновой кислоты из Όсорбитола, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, соответственно.

Другие реакции (0,5 мл реакционной смеси в 10 мл пробирке) проводили с клетками N44-1, выращенными на агаровой среде № 3ΒΌ, содержащей 2% Ό-сорбитол, 2% Ь-сорбозу или 2% Ь-сорбозон в течение 2 дней, как описано в примере 9. Штамм N44-1 продуцировал 1,8, 2,0 и 5,1 г/л Ь-аскорбиновой кислоты из Ό-сорбитола, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, соответственно.

Реакцию с использованием клеток С. охубапк 1РО 3293 проводили с 2% Ь-сорбозоном, как описано выше. Штамм 1РО 3293 продуцировал 5,7 г/л Ь-аскорбиновой кислоты через 2 дня.

Пример 11. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ό-сорбитола в результате применения покоящихся клеток, выращенных в жидкой среде.

Клетки 6. охубапк N44-1 выращивали в 200 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ΒίοΟιοιηί1<;·ι. Вискк, 8мт1жг1апб), 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃ в 2-литровой отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С со встряхиванием при 180 об./мин. Через 24 ч культуру подвергли центрифугированию при 3220хд (ЕррепбогГ 5810В, НатЬигд, бегтапу) и клетки ресуспендировали в 0,9% растворе ИаС1, центрифугировали снова при 3220хд и клеточный осадок использовали для засевания одной 500 мл отведенной встряхиваемой колбы, содержащей 50 мл полноценной среды для выращивания (100 г/л Э-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃), и другой 500 мл отведенной встряхиваемой колбы, содержащей 50 мл среды для получения продукта (100 г/л Э-сорбитола, 3 г/л №С1, 10 г/л СаСО₃). Изначальная клеточная плотность, измеренная как оптическая плотность при 600 нм (ОЭ₆₀₀), в обеих колбах составляла 10. Обе колбы инкубировали при 30°С со встряхиванием при 180 об./мин. Через 48 ч клеточные суспензии в среде для выращивания и в среде для получения продукта аккумулировали 1,06 и 1,18 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, соответственно. Не было отмечено дополнительного роста в полноценной среде для выращивания в течение инкубационного периода.

Пример 12. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона или Ό-сорбитола в результате применения покоящихся клеток рекомбинантного микроорганизма с увеличенной дозой гена ЗИОНак

Ген 8ЫПНа1 с 3'-5' и 5'-3' фланкированными областями амплифицировали с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма N44-1 в качестве матрицы и пары праймеров N1 (8ЕЦ ГО NО: 28) и N2 (8Ер ГО ЫО: 29).

ПЦР была выполнена при помощи 6С-богатой ПЦР системы (Воске Э|адпо511С5) в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Амплифицированные фрагменты ДНК вводили в вектор рСВ2.1ТОРО (1пубгодеп, СаШЬаб, СА, И8А). Затем полученную плазмиду обрабатывали рестриктазами НшбШ и ХМ. Фрагмент НшбШ-ХМ, включающий ген 8ЫЭНа1, лигировали с вектором рУК100 (доступный из Атепсап Туре СиНиге СоПесбоп, каталожный № АТСС 37156), предварительно обработанным рестриктазами НтбШ и Х1юЕ Смесь для лигирования использовали для трансформации Е. со11 ТС1. Необходимая плазмида, обозначенная как рУК-Р-8КОНа1-Т, была выделена из Е. со11 и была введена в штамм С. охубапк N44-1 посредством электропорации с использованием стандартных способов (Е1ес1госе11 ташриШог ЕСМ600, ВТХ 1пс., 8ап ^^едο, СА, Ц8А).

Три отдельных трансформанта, обозначаемых N44-1 (рУК-Р-8ХЭНа1-Т) клоны 1, 2 и 3, вместе с родительским штаммом С. охубапк N44-1, каждый выращивали на агаровой среде № 3ΒΌ и агаровой среде МВ. Клетки соскабливали с агаровых пластинок и использовали в реакциях покоящихся клеток (в качестве субстрата использовали 1% Ь-сорбозон), как описано в примере 9. При выращивании на агаровой среде № 3ΒΌ в результате анализа покоящихся клеток штамм N44-1 продуцировал 2,5 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, в то время как клоны 1, 2 и 3 штаммов N44-1 (рУК-Р-8КОНа1-Т) продуцировали 4,2, 4,1 и 4,2 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, соответственно. При выращивании на агаровой среде МΒ в результате анализа покоящихся клеток штамм N44-1 продуцировал 0,12 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, в то время, как клоны 1, 2 и 3 штаммов N44-1 (рУК-Р-8КЭНаЬТ) продуцировали 1,8, 2,5 и 0,94 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, соответственно.

Другая реакция была проведена с использованием клеток С. охубапк N44-1 и клона 2 (см. выше), культивированных в течение 3 дней в 50 мл среды № 5 (100 г/л Э-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта, 2,5 г/л Мд8О₄-7Н₂О и 15 г/л СаСО₃) в двух 500 мл отведенных встряхиваемых колбах при температуре 30°С, со встряхиванием при 220 об./мин. Из одного флакона для каждого штамма полученная питательная среда была подвергнута центрифугированию при 500 об./мин для удаления СаСО₃. Супернатант, полученный на этой стадии, затем был подвергнут центрифугированию при 5000 об./мин для получения клеточного осадка. Полученные клетки были ресуспендированы в воде и использованы

- 23 009287 для засевания 1 мл среды получения продукта (20 г/л Ό-сорбитола, 3 г/л №С1, 10 г/л СаСО₃) в 10 мл реакционной пробирке, в конечной плотности покоящихся клеток, соответствующей 5 единицам ΘΌ при 600 нм. Через 20 ч реакционного периода при 30°С и 220 об./мин супернатант, собранный из сосуда получения продукта, содержал 360 и 760 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, соответственно, для сверхпродуцирующих 8ΝΌΗηί штаммов Ν44-1 и Ν-44-1. В отличие от этого, через 72 ч супернатант, полученный из оставшейся среды для выращивания, содержал 0 и 440 мг/л Ь-аскорбиновой кислоты, соответственно.

Пример 13. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ь-сорбозона с помощью покоящихся клеток Е. сой.

Не содержащий стоп-кодон ген ^ΝΟΗοε называемый 8N^Ηа^-1, соответствующий нуклеотидам 12364 последовательности 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1, был амплифицирован из хромосомной ДНК штамма Ν44-1 посредством ПЦР (набор ЬосНе Ηί§1ι Е1йе1йу Κίΐ) с использованием пары праймеров 8ΝϋΗ;ιί-Ν(Γ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30) и 8ΝΟΗ3ΪΗ18-Χ (81Ь) ΙΌ ΝΟ: 31).

Амплифицированная ДНК была клонирована в рСВ2.1-ТОРО (1пуйгодеп, СагкЬай, СА, И8А) для получения ρ0Κ2.1-ΤΟΡΟ-8ΝΌΗΗί-1, чья последовательность 8ΝΌΗηί была подтверждена как правильная посредством секвенирования. Затем ген 8ΝΌΗηί-1 был обработан рестриктазами Ыйе1 и Х1ю1 и лигирован между сайтами Ыйе1 и Х1ю1 рЕТ-21Ь(+) (Ыоуадеп, Майкоп, ^1, И8А), для получения рЕТ21Ь8140^141^ 6χΗίκ был добавлен к С-концу 8ΝΌΗηί. Полученный ρЕΤ21Ь-8N^Ηа^Η^κ был введен в Е. сой ВЬ21 (ИЕ3).

мл культуры Е. сой ВЬ21 (^Е3)/ρЕΤ21Ь-8N^Ηа^Η^κ, полученной после инкубирования на протяжении всей ночи в среде ЬВ с 50 мкг/мл карбенициллина, были высеяны в 200 мл такой же среды. Клетки культивировали 2 ч при температуре 37°С со встряхиванием при 230 об./мин, затем индуцировали введением 1 мМ 1РТС и продолжали культивирование при 25°С при 230 об./мин в течение 3 ч. Полученную культуру центрифугировали и отмывали солевым раствором дважды, после чего клеточный осадок ресуспендировали в 2 мл воды. Клетки использовали в реакциях покоящихся клеток с реакционной смесью (500 мкл в 5 мл пробирке), содержащей клетки плотностью ΟΌ600=10, 1% моногидрат сорбозона, 5 мкМ РОО, 5 мМ МдС1₂, 0,3% ЫаС1, и 1% СаСО₃, проводимых при 30°С в течение 15 ч. После 15 ч инкубирования было получено 0,14 г/л Ь-аскорбиновой кислоты. Когда реакцию покоящихся клеток проводили с 1 мкМ РОО (остальные условия были такие же, как описано выше), было получено 0,05 г/л Ьаскорбиновой кислоты после 3 ч инкубирования.

Пример 14. Получение Ь-аскорбиновой кислоты из Ό-сорбитола при помощи покоящихся клеток рекомбинантных микроорганизмов с повышенной дозой гена 8ΝΌΗηί.

Клетки 6. охуйапк Ν44-1 сверхпродуцирующего 8ΝΌΗηί выращивали в 50 мл среды № 5, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,5 г/л глицерина, 15 г/л дрожжевого экстракта (Ийка ВюСйетчка, Висйк, 8\У1(хег1ап0.), 2,5 г/л Μ§8Ο₄·7Η₂Ο и 15 г/л СаСО₃, в 500 мл отведенной встряхиваемой колбе при температуре 30°С со встряхиванием при 180 об./мин в течение 48 ч. Полученную клеточную суспензию использовали для высевания в 2-литровый биореактор, называемый сосудом для выращивания (ВюйаСМО, В. Вгаип Мекипдеп, Мекипдеп, бегтапу), содержащий 1,25 л среды, состоящей из 100 г/л Ό-сорбитола, 15 г/л дрожжевого экстракта (Е1ика ВюСйет1ка, Висйк, 8^Й7ег1апй), 2,5 г/л Μд8Ο₄·7Η₂Ο, 0,3 г/л ΚΗ^Ο,ι и 0,12 г/л Са8Ο₄. Клетки культивировали при 30°С со скоростью аэрации 1 л/мин, значение рН поддерживали на уровне 5,7 с помощью 25% раствора Νη₂№₃, насыщение растворенным кислородом поддерживали на уровне 10% посредством изменения скорости перемешивания. Через 24 ч плотность клеток, измеренная при 600 нм, составляла 20 единиц абсорбции. На данном этапе подпитывающий раствор, содержащий 100 г/л Ό-сорбитола, 15 г/л дрожжевого экстракта (Е1ика ВюСйетчка, Висйк, 8^й/ег1апй), 2,5 г/л Μд8Ο₄·7Η₂Ο, 0,3 г/л ΚΗ^Ο,ι и 0,12 г/л Са8Ο₄, добавляли в сосуд для выращивания при скорости подпитывания 125 мл/ч и питательную среду непрерывно собирали со скоростью сбора 125 мл/ч. Таким образом, объем в сосуде для выращивания постоянно сохранялся равным 1,25 л. Другие параметры процесса контролировали, как указано выше.

Питательную среду непрерывно подпитывали со скоростью подпитывания 125 мл/ч во втором реакторе, называемом сосудом получения продукта, наполненном 5 л среды получения продукта, содержащей 100 г/л Ό-сорбитола, 0,3 г/л ЫаС1 и 0,12 г/л Са8Ο₄, температуру поддерживали 30°С, значение рН поддерживали на уровне 7,0 с помощью 20% раствора ΝηΟΗ. Скорость аэрации сохраняли постоянной 10 л/мин и насыщение растворенным кислородом поддерживали на уровне 20% посредством изменения скорости перемешивания. Среду получения продукта с таким же составом также непрерывно вводили в сосуд получения продукта со скоростью 375 мл/ч. Объем сосуда сохраняли постоянно равным 5 л посредством непрерывного сбора со скоростью 500 мл/ч супернатанта, полученного в результате фильтрации потока в модуле ультрафильтрации в поперечном потоке с размером пор 500 кДА (ИЕР-5Р0-Е-9А, Атегкйат Вюкшепсек), через который клеточная суспензия, собранная из сосуда получения продукта, перекачивалась со скоростью 50 л/ч с помощью насоса МаЧегПех. Поток ультраконцентрата перекачивали обратно в сосуд. Как только плотность клеток в сосуде получения продукта достигала уровня 100 единиц абсорбции при 600 нм, начинали отбор клеток из концентрированного клеточного потока, поступающего обратно в сосуд получения продукта, со скоростью 25 мл/ч, для того, чтобы поддерживать плотность клеток постоянной в сосуде получения продукта.

- 24 009287

Поток бесклеточного супернатанта содержит 4 г/л Ь-аскорбиновой кислоты и непрерывно подается в накопительный сосуд с двойной стенкой при 30°С (Есойие Ре112, Ьаиба, Ьаиба-КоешдкйоЕеи, Сегтаиу). Из этого сосуда супернатант непрерывно поступает в разбавительную камеру двухкамерного устройства для электродиализа (блок, содержащий 10 пар ячеек с катионобменными мембранами СМХ-8 и анионобменными мембранами А8М, общая площадь мембран 0,2 м², производится компанией ЕигоФа 1иби8йге8, У188ои8, Ргаисе) со скоростью 180 л/ч, и постоянный поток выкачивают из сосуда для того, чтобы поддерживать его постоянный объем 2 л. В другой сосуд с двойной стенкой, изначально содержащий деионизированную воду при 30°С, непрерывно поступает свежая деионизированная вода со скоростью 62,5 мл/мин, постоянно откачивают водный раствор в камеру для концентрирования устройства для электродиализа со скоростью 200 л/ч и постоянный поток клеток, выросших в культуре, откачивают из сосуда. Подпитывающие растворы, используя шланговые насосы (7518-00, Ма8!ег1ех, И8А), накачивают в электродиализный блок и проводят рециркуляцию растворов через каждую электродиализную камеру с помощью роторных насосоз (МИ-20, 1УАК, Токуо, .Гараи). На протяжении всего процесса к электродиализному блоку подают напряжение 14У (источник питания РиМАТесй Т8001/5, 8!.1идЬег1, Сегтаиу). Концентрация Ь-аскорбиновой кислоты в потоке клеток, выросших в культуре, составляет 16 г/л.

Пример 15. Очистка Ь-аскорбиновой кислоты, полученной с помощью покоящихся клеток в результате стадий технологии производства и выделения целевого продукта.

Поток клеток, выросших в культуре по примеру 14, содержащий 16 г/л Ь-аскорбиновой кислоты, нанесли на хелатообразующую смолу (АтЬег1йе 1РС 748, Ройт аиб Наак, РЫ1абе1рЫа, РА, И8А) для того, чтобы элиминировать двухвалентные катионы из потока продукции. Потом этот поток собирали в охлажденный сосуд (питающий сосуд), и после того, как было накоплено 10 л, их перерабатывали в фоновом режиме посредством устройства для электродиализа с использованием биполярных мембран (блок, содержащий мембраны 7 №о§ер!а ВР1/СМВ, общая площадь мембран составляет 0,14 м², производится компанией Еитоб1а 1иби8й1е8, У188ои8, Ргаисе). Этот раствор был перекачан со скоростью 200 л/ч через подпитывающую камеру устройства для электродиализа и возвращен в питающий сосуд. Другой охлажденный сосуд (сосуд для концентрирования), изначально содержащий 5 л раствора 2 г/л ИаОН, перекачивает со скоростью 100 л/ч через камеру для концентрирования устройства для электродиализа с использованием биполярных мембран. Посредством подачи максимального напряжения 25 V и максимального электрического тока 20 А катионы натрия из подпитывающей камеры были перенесены в камеру для концентрирования, и таким образом натриевая форма Ь-аскорбиновой кислоты, присутствующая в питающем потоке, превращается в соответствующую форму свободной кислоты. После достижения 90% конверсионного выхода процесс останавливают. В сосуде для концентрирования 6 л раствора, содержащего 7,5 г/л ИаОН, собирают в сосуд для разведения, 9 л раствора, содержащего приблизительно 16 г/л Ь-аскорбиновой кислоты в форме свободной кислоты и 1,6 г/л Ь-аскорбиновой кислоты в форме ее натриевой соли, дополнительно подвергли процессу обработки посредством катионобменной смолы (АтЬегШе РРС 21 Н, Ройт аиб Наак, РЫ1абе1рЫа, РА, И8А) для увеличения выхода конверсии натриевой соли в форму свободной кислоты до 99%. Поток Ь-аскорбиновой кислоты в форме свободной кислоты, полученный в результате применения любого способа, описанного выше, затем дополнительно подвергают следующим последовательным стадиям: анионный обмен, обработка активированным углем, концентрирование, кристаллизация, фильтрация кристаллов и высушивание. Конечная чистота полученных кристаллов составляет 98%, и выход продукта, полученный в результате комбинирования стадий технологии производства и выделения целевого продукта, составляет 80%.

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий Ь-сорбозондегидрогеназной активностью, выбранный из группы, состоящей из:

   (a) полинуклеотида, кодирующего полипептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с 8ЕО ГО N0: 2, 12, 14, 16, 18, 20, 22 или 27;

   (b) полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность в соответствии с 8ЕО N0: 1, 11, 13, 15, 17, 19, 21 или 26;

   (c) полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, которая может быть получена путем амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция, с использованием геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с 8Е0 ГО N0: 7 и 8ЕО ГО N0: 8;

   (б) полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом по любому из (а)-(с), где в указанном производном один или более аминокислотных остатков консервативно заменены по сравнению с указанным полипептидом и указанные фрагмент или производное обладают Ь-сорбозондегидрогеназной активностью;

   (е) полинуклеотида, комплементарная цепь которого гибридизуется в строгих условиях с полинуклеотидом, определенным по любому из (а)-(б); и

   - 25 009287 (ί) полинуклеотида, который по крайней мере на 60% гомологичен полинуклеотиду, определенному по любому из (а)-(ф, где сравниваются по крайней мере 100 последовательных нуклеотидов, или комплементарная цепь такого полинуклеотида.
2. 2. Фрагмент полинуклеотидной последовательности по п.1, содержащий по крайней мере 50 последовательных нуклеотидов из 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 1.
3. 3. Полипептид, кодируемый полинуклеотидом по п.1 или 2.
4. 4. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п.1.
5. 5. Рекомбинантный организм, который трансформирован полинуклеотидом по п.1 или 2 и/или вектором экспрессии по п.4, где указанный рекомбинантный организм выбран из группы, состоящей из клеток грибов, растений, животных и бактерий.
6. 6. Рекомбинантный организм по п.5, где организм представляет собой бактерию рода, выбранного из группы, состоящей из С1исопоЬасФг, АсеФЬасФг, Ркеиботопак и ЕксйепсЫа.
7. 7. Способ получения Ь-аскорбиновой кислоты из субстрата, выбранного из Ό-сорбита, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, предусматривающий:

   (a) размножение (ί) рекомбинантного организма по п.5 или 6, или (и) нерекомбинантного организма, кодирующего полипептид по п.3, или (ш) контактирование указанного субстрата с выделенным и очищенным полипептидом по п.9 в соответствующей среде для культивирования; и (b) извлечение и отделение Ь-аскорбиновой кислоты из указанной среды для культивирования.
8. 8. Способ получения Ь-аскорбиновой кислоты из субстрата, выбранного из Ό-сорбита, Ь-сорбозы и Ь-сорбозона, предусматривающий:

   (a) размножение рекомбинантного организма по п.5 или 6 или нерекомбинантного организма, кодирующего полипептид по п.3 в соответствующей среде для культивирования;

   (b) выделение и очистку Ь-сорбозондегидрогеназы;

   (c) инкубацию субстрата в присутствии Ь-сорбозондегидрогеназы согласно (Ь); и (ά) извлечение и отделение Ь-аскорбиновой кислоты из реакционной смеси.
9. 9. Способ получения Ь-сорбозондегидрогеназы, где рекомбинантный организм, содержащий полинуклеотид по п.1 или 2, или нерекомбинантный микроорганизм, кодирующий полинуклеотид по п.3, размножают в соответствующей среде для культивирования, клетки разрушают и выделяют Ьсорбозондегидрогеназу.
10. 10. Способ получения витамина С, предусматривающий превращение субстрата в витамин С в среде, содержащей покоящиеся клетки микроорганизма, где выход получаемого витамина С составляет по крайней мере 1,8 г/л.
11. 11. Способ получения витамина С, предусматривающий превращение субстрата в витамин С в среде, содержащей покоящиеся клетки микроорганизма, включающий стадии:

    a) культивирования микроорганизма в условиях, способствующих росту;

    b) изменения условий таким образом, чтобы скорость роста микроорганизма снижалась, что приводит к образованию покоящихся клеток; и

    c) получения витамина С из субстрата с помощью покоящихся клеток согласно (Ь), причем стадии (а) и (с) не разделены какой-либо стадией промывки и/или выделения.
12. 12. Способ по п.10 или 11, в котором микроорганизм является рекомбинантным или нерекомбинантным организмом, содержащим полинуклеотид по п.1 или 2.
13. 13. Способ по любому из пп.10-12, в котором плотность покоящейся культуры в среде, измеренная как оптическая плотность (ΟΌ) при 600 нм, составляет по крайней мере 10.
14. 14. Способ по любому из пп.10-13, в котором микроорганизм выбран из группы, состоящей из дрожжей, водорослей и бактерий.
15. 15. Способ по любому из пп.10-14, в котором микроорганизм выбран из группы, состоящей из СапФйа, Зассйаготусек, 2удо8ассйаготусе8, Зсу/окассйаготусек, К1иуνе^οтусе8, Сй1оге11а, С1исопоЬасФг, АсеФЬасЫ асей, РапФеа, СгурФсоссик, Ркеиботопак и ЕксйепсЫа или рекомбинантного организма по п.5 или 6.
16. 16. Способ по любому из пп.10-15, в котором субстрат выбирают из группы, состоящей из Όглюкозы, Ό-сорбита, Ь-сорбозы, Ь-сорбозона, 2-кето-Ь-гулоната, Ό-глюконата, 2-кето-Э-глюконата и 2,5-дикетоглюконата.
17. 17. Способ по любому из пп.10-16 с использованием микроорганизма, способного продуцировать как витамин С, так и 2-кето-Ь-гулоновую кислоту из субстрата, где отношение между концентрацией витамина С и 2-КСА составляет более 0,1.
18. 18. Способ по любому из пп.7, 8 или 10-16, дополнительно предусматривающий выделение витамина С из среды и, необязательно, одну или несколько стадий очистки.
19. 19. Способ по п.18, в котором все стадии очистки осуществляют в водной среде.
20. 20. Способ по любому из пп.7, 8 или 10-19, дополнительно предусматривающий отделение витамина С от компонентов в среде с использованием электродиализа.