EA008766B1

EA008766B1 - Интерферон-бета при тяжелом остром респираторном синдроме (sars)

Info

Publication number: EA008766B1
Application number: EA200501625A
Authority: EA
Inventors: Джампьеро Де Лука
Original assignee: Арес Трейдинг С.А.
Priority date: 2003-04-17
Filing date: 2004-04-06
Publication date: 2007-08-31
Also published as: MXPA05011170A; WO2004091653A1; KR20050112127A; EA200501625A1; BRPI0409484A; AU2004229185A1; JP2006523655A; US20070026014A1; CA2521650A1; NO20055243L; EP1613342A1; CN1798572A; UA81481C2

Abstract

В настоящем изобретении раскрыто применение интерферона (IFN) для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (SARS).

Description

Настоящее изобретение относится к применению интерферона (ΙΓΝ) для производства лекарственного средства с целью лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (8АВ8).

Предшествующий уровень техники

Пневмония (пневмонит) при острой инфекции паренхимы легкого охватывает альвеолярное пространство и интерстициальную ткань. Она может поражать целую долю легкого (лобарная пневмония), сегмент доли (сегментарная или лобулярная пневмония), альвеолы, прилегающие к бронхам (бронхопневмония), или интерстициальную ткань (интерстициальная пневмония). Эти различия, в общем, основаны на данных рентгенографии.

Пневмонию у взрослых субъектов старше 30 лет обычно вызывают бактерии. Из них наиболее распространенной является 81гер1ососсик риеитошае. К другим патогенам относятся анаэробные бактерии 81арйу1ососсик аигеик, НаеторЫ1ик тПиепхае. СЫатуФа риеишошае, С. ркШасг С. 1гасйотаИк, Могахе11а (Вгаийате11а) са1аггйа11к, Ьедюие11а рпеиторЫ1а, К1еЬк1е11а риеишошае и другие грамотрицательные бациллы. Бактериеподобный организм Мусор1акта риеитошае наиболее часто поражает детей старшего возраста и молодежь, особенно весной. Главными легочными патогенами у младенцев и детей являются вирусы: респираторный синцитиальный вирус, вирус парагриппа, вирусы гриппа А и В. Эти агенты могут также вызывать пневмонию у взрослых, однако наиболее типичным вирусом, поражающим практически здоровых субъектов, является вирус гриппа А, реже - вирус гриппа В и редко - вирус ветряной оспы. К другим агентам относятся высшие бактерии, в том числе №сагФа и Асйиотусек кр; микобактерии МусоЬас1егМЕт 1иЬегси1ок1К и их атипичные штаммы (в основном М. каикакй и М. ауМЕт-т1гасе11и1аге); грибы, в том числе Н1к1ор1акта сарки1а!ит, СоссШойек ιηιιηίιικ, В1ак1отусек бегтаИИФк, С’гурЮсоссик иеоГогтаик, АкрегдШик ГитщаШк и РиеитосукДк сапий; риккетсии в основном Сох1е11а ЬигиеШ (лихорадка 0).

К типичным симптомам относятся кашель, лихорадочное состояние и отделение мокроты, обычно развивающиеся через несколько дней после заражения и иногда сопровождающиеся плевритом. Физикальное обследование может выявить тахипноэ и симптомы консолидации, такие, как крепитация в сочетании с шумом бронхиального дыхания. Этот синдром обычно вызывается бактериями, например 8. риеитошае и Н. шПиеихае.

Диагноз ставят на основе характеристических симптомов и при наличии инфильтрата, выявленного при рентгенографии грудной клетки.

У 30-50% больных не идентифицируется патоген, несмотря на клиническое проявление признаков бактериальной пневмонии. Хотя для выявления бактериальных патогенов при культивировании выделенной мокроты используют способ временных отличий, анализ этих образцов часто дает ошибочные результаты, так как нормальная флора ротовой части глотки может загрязняться патогенами в процессе их прохождения через верхние дыхательные пути. Наиболее надежны в этом отношении образцы, полученные из стерильных в норме областей, например крови больных с бактериемической пневмонией или плевральной жидкости больных эмпиемой. Для идентификации таких патогенов, как микобактерии, микоплазмы, анаэробые бактерии, хламидии, вирусы, грибы, легионеллы, риккетсии и паразиты, используют специальные методы культивирования, специальные штаммы, серологический анализ, биопсию легкого.

Лечение основано на вспомогательной искусственной вентиляции легких, в том числе О₂ по показаниям, и назначении антибиотиков, подобранных на основе данных анализа окрашивания по Граму. Если анализ окрашивания по Граму не осуществлен или не установлен диагноз, антибиотики подбирают с учетом возраста больного, эпидемиологии, факторов риска хозяина и тяжести заболевания.

Тяжелая атипичная пневмония, или тяжелый острый респираторный синдром (8АВ8), является состоянием неизвестной этиологии, недавно описанным у больных в Азии, Северной Америке и Европе.

Большинство больных в возрасте 25-70 лет, у которых диагностирован 8АВ8, ранее были практически здоровы. Имеются сообщения о нескольких случаях 8АВ8 у детей в возрасте менее 15 лет.

Инкубационный период 8АВ8 составляет обычно 2-7 дней, однако в отдельных сообщениях указывают инкубационный период до 10 дней. Заболевание обычно начинается с предвестника болезни в виде лихорадки (>100,4°Г [>38,0°С]). Лихорадка часто сопровождается высокой температурой, ознобом, дрожью, а также другими симптомами, например головной болью, недомоганием и миалгией. В начале болезни у некоторых больных наблюдают легкие респираторные симптомы. Обычно данные по спинальным, неврологическим или желудочно-кишечным изменениям отсутствуют, но у некоторых больных развивается диарея в процессе лихорадочной продромы.

Через 3-7 дней наступает фаза ухудшения дыхания с началом сухого, непродуктивного кашля или одышки, которые могут сопровождаться гипоксемией или после проявления которых развивается гипоксемия.

В 10-20% случаев респираторное заболевание является настолько тяжелым, что вызывает необходимость проведения интубации и искусственной вентиляции легких. Уровень летальности у больных с заболеванием, соответствующим определению, даваемому в настоящее время Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) для 8АК.8, составляет примерно 3%.

- 1 008766

Рентгенограмма грудной клетки может быть нормальной в период фебрильной продромы и в течение всего периода болезни. Однако у достаточно большой части больных респираторная фаза характеризуется появлением ранних фокальных интерстициальных инфильтратов. На более поздних стадиях БАРБ рентгенография грудной клетки выявляет области консолидации.

В начале заболевания абсолютное число лимфоцитов часто снижено. Общее число лейкоцитов обычно находится в норме или понижено. На пике респираторного заболевания у примерно 50% больных регистрируют лейкопению и тромбоцитопению или низкое-нормальное число тромбоцитов (50000150000/мкл). Установлено, что начало респираторной фазы сопровождается повышением уровня креатинфосфокиназы (до 3000 МЕ/л) и трансаминаз печени (в 2-6 раз выше нормального значения). У большинства больных функция почек остается в норме.

Тяжесть заболевания может варьировать в большом диапазоне - от легкой формы до летального исхода. Лишь у немногих субъектов, тесно контактировавших с больными БАРБ, обнаруживают сходное заболевание, большинство остается здоровыми. Согласно сообщениям некоторые тесные контакты приводят к развитию слабого фебрильного заболевания без респираторных признаков или симптомов. Это свидетельствует о том, что заболевание не всегда прогрессирует в респираторную фазу.

Первичным путем распространения БАРБ является путь от субъекта к субъекту через тесный контакт. В большинстве случаев БАРБ развивается у персонала, обслуживающего больных БАРБ, или у субъектов, совместно проживающих с больным БАРБ, или у тех, кто прямо контактирует с инфекционным материалом (например, респираторными выделениями), полученным от больных БАРБ. Потенциальными путями распространения БАРБ могут быть прикосновение к коже другого человека или объектов, загрязненных воздушно-капельной инфекцией, с последующим касанием своих глаза (глаз), носа или рта. Заражение может произойти при кашле или чихании больного БАРБ, когда капельки из носа и рта попадают на других субъектов или на соседние поверхности. Возможны также пути распространения БАРБ по воздуху или другие пути, которые в настоящее время не известны.

Согласно полученной на настоящий момент информации такие симптомы, как лихорадка и кашель, наиболее вероятно свидетельствуют об инфицировании людей. Однако данные о том, как долго до или после появления таких симптомов больной БАРБ может передавать заболевание другим субъектам, отсутствуют.

Ученые Центров профилактики и контроля заболеваний (СЭС) и других лабораторий обнаружили неизвестный ранее коронавирус у больных БАРБ.

В настоящее время получены только предварительные данные по причинному агенту этого состояния. Выдвинута гипотеза, согласно которой БАРБ вызывает новый коронавирус (Кйахек с сотр., Новый коронавирус, ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом. Т11е Νο\ν Епд1апб 1оигпа1 о£ Мебюте. \У\У\У.пе)т.огд 16 Лрп1. 2003). Однако в качестве потенциальных причинных агентов БАРБ также исследуют другие вирусы.

Коронавирусы представляют собой группу вирусов, которые при наблюдении в микроскоп имеют гало- или коронаподобный внешний вид. Эти вирусы вызывают у человека заболевание верхних дыхательных путей слабой или средней тяжести. Они ассоциированы с респираторными, желудочнокишечными, печеночными и неврологическими заболеваниями животных. Коронавирусы сохраняют жизнеспособность в окружающей среде не более 3 ч.

Ученые СЭС выделили вирус из тканей двух больных БАРБ и охарактеризовали его с помощью различных лабораторных методов. Исследование посредством электронного микроскопа показало, что вирус имеет форму и внешний вид, характерные для коронавирусов. С помощью генетического анализа установили, что этот новый вирус принадлежит к семейству коронавирусов, но отличается от ранее идентифицированных членов семейства. Тестирование образцов сыворотки больных БАРБ показало, что они недавно инфицированы этим вирусом. В других тестах установлено, что этот, ранее не изученный, коронавирус присутствует в различных клинических образцах (в том числе в образцах, полученных из носа и с помощью мазка со слизистой оболочки горла) других больных БАРБ, прямо или косвенно связанных со вспышкой заболевания. Эти результаты и другие данные, полученные из лабораторий, входящих в сеть Всемирной организации здравоохранения, свидетельствуют в пользу гипотезы, согласно которой этот новый коронавирус является причинным агентом БАРБ. В настоящее время проводится дополнительное изучение связи этого коронавируса с БАРБ.

Коронавирусы периодически вызывают пневмонию у человека, особенно у субъектов с ослабленной иммунной системой. Эти вирусы также служат причиной развития тяжелых заболеваний у животных, в том числе кошек, собак, свиней, мышей и птиц.

Исследователи из нескольких лабораторий сети ВОЗ сообщили об идентификации парамиксовируса в клинических образцах больных БАРБ. В этих лабораториях проводят изучение возможности развития БАРБ в результате воздействия парамиксовируса.

В настоящее время наиболее эффективная схема лечения, если она вообще имеется, не известна. В некоторых случаях терапия основана на применении антивирусных средств, таких, как оселтамивир или рибавирин. Больным назначают стероиды перорально или внутривенно в комбинации с рибавирином и другими антимикробными средствами. Однако в отсутствие клинического исследования в контролируе

- 2 008766 мых условиях эффективность этих схем лечения остается неизвестной. Ранние данные по лабораторному изучению одного изолята нового коронавируса показали, что рибавирин не ингибирует рост вируса или его распространение от клетки к клетке. Необходимо дополнительное лабораторное тестирование рибавирина и других противовирусных средств, чтобы убедиться в эффективности лечения с их помощью.

Интерфероны представляют собой цитокины, т.е. растворимые белки, которые передают сигналы между клетками и играют важную роль в иммунной системе, способствуя разрушению микроорганизмов, вызывающих инфекцию, и репарации полученных повреждений. Интерфероны естественным образом секретируются инфицированными клетками. Впервые они были идентифицированы в 1957 г. Их название обусловлено тем, что они препятствуют репликации и размножению вирусов.

Интерфероны проявляют как антивирусную, так и антипролиферативную активность. На основе биохимических и иммунологических свойств природные интерфероны человека сгруппированы в 3 больших класса: интерферон-альфа (лейкоцитарный), интерферон-бета (фибробластный) и интерферонгамма (иммунный). В настоящее время альфа-интерферон утвержден в США и других странах в качестве средства лечения волосатоклеточного лейкоза, остроконечных кондилом, саркомы Капоши (рак, обычно поражающий больных синдромом приобретенного иммунодефицита, СПИДа) и хронического гепатита типа ни-А, ни-В.

Интерфероны (ΙΡΝ) являются гликопротеинами, вырабатываемыми организмом в ответ на вирусную инфекцию. Они ингибируют размножение вирусов в защитных клетках. В соответствии с низкой молекулярной массой белка ΙΡΝ обладают удивительной неспецифичностью своего действия, например ΙΡΝ, индуцированный одним вирусом, эффективно противодействует широкому кругу других вирусов. Однако они являются видоспецифичными, т.е. ΙΡΝ, продуцируемый одним видом клеток, стимулирует антивирусную активность в клетках того же типа или близкородственных типов. ΙΡ№ представляют собой первую группу цитокинов, которые нашли применение благодаря их потенциальной противоопухолевой и антивирусной активности.

Три главных ΙΡΝ обозначены как ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ. Эти основные типы ΙΡΝ первоначально классифицировали в соответствии с природой клеток (лейкоцитарный, фибробластный или Т-клеточный). Однако стало ясно, что несколько типов ΙΡΝ могут продуцироваться одной клеткой. Поэтому лейкоцитарный ΙΡΝ сейчас называется ΙΡΝ-α, фибробластный ΙΡΝ - ΙΡΝ-β, Т-клеточный ΙΡΝ ΙΡΝ-γ. Существует также четвертый тип ΙΡΝ - лимфобластоидный ΙΡΝ, вырабатываемый клеточной линией Ν;·ιιη;·ι1\ν;·ι (производной от лимфомы Беркитта), которая продуцирует смесь лейкоцитарного и фибробластного ΙΡΝ.

Ранее сообщено о введении единицы интерферона или международной единицы интерферона (Ед или МЕ для международной единицы) в качестве меры активности ΙΡΝ, определенной как количество, необходимое для защиты 50% клеток от вирусного повреждения. Анализ, который можно использовать для измерения биоактивности, представляет собой анализ ингибирования цитопатического эффекта, как описано КиЫпйет с! а1., 1981; Ρат^11ей^, Р.С. с! а1., 1981. Согласно этому способу оценки антивирусной активности интерферона около 1 ед/мл интерферона необходимо для продуцирования цитопатического эффекта в 50% клеток. Единицы определяют по отношению к международному эталонному стандарту Ηιι-ΙΡΝ-бета. представленному Национальным институтом здоровья (Рсйка, 8. 1986).

Каждый класс ΙΡΝ содержит несколько различных типов. Каждый из ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ является продуктом отдельного гена.

Белки, классифицированные как ΙΡΝ-α, представляют собой наиболее разнородную группу, содержащую около 15 типов. Существует кластер генов ΙΡΝ-α, локализованных на хромосоме 9, содержащий не менее 23 последовательностей, из которых 15 проявляют активность и транскрибируются. Зрелые ΙΡΝ-α не гликозилированы.

ΙΡΝ-α и ΙΡΝ-β имеют одинаковую длину (165 или 166 аминокислот) и сходную биологическую активность. ΙΡΝ-γ содержат 146 аминокислот и проявляют меньшее сходство с классами α и β. Только ΙΡΝ-γ могут активировать макрофаги или индуцировать созревание киллерных Т-клеток. Эти новые типы терапевтических агентов иногда называют модификаторами биологического ответа (ВКМ), так как они влияют на ответ организма на опухоль путем воздействия на распознавание через иммуномодуляцию.

Фибробластный интерферон человека (ΙΡΝ-β) проявляет антивирусную активность и может также стимулировать природные киллерные клетки против неопластических клеток. Он представляет собой полипептид около 20000 Да, индуцируемый вирусами и двунитевыми РНК. Исходя из нуклеотидной последовательности гена фибробластного интерферона, клонированного с помощью технологии рекомбинантной ДНК (Эсгупк с! а1., 1980), выведена полная аминокислотная последовательность белка длиной 166 аминокислот.

811срагб с! а1., (1981) описал мутацию основания 842 (Сук^Туг в положении 141), которая отменяет антивирусную активность, и вариантный клон с делецией нуклеотидов 1119-1121.

Магк с! а1., (1984) ввел искусственную мутацию путем замещения основания 469 (Т) на (А), что привело к аминокислотному переключению Сук^Бсг в положении 17. В результате ΙΡΝ-β приобрел активность нативного ΙΡΝ-β и стабильность в процессе длительного хранения (-70°С).

- 3 008766

К.еЫГ® (рекомбинантный интерферон-β человека) - самая последняя разработка в интерфероновой терапии рассеянного склероза (МБ), представляет собой интерферон (ШЫ)-бета 1а, вырабатываемый клеточными линиями млекопитающих.

В литературе пока не сообщалось о лечении БАВБ интерферонами отдельно или в комбинации с другими антивирусными агентами.

Описание изобретения

Основным предметом настоящего изобретения является использование интерферона (ΙΡΝ), в отдельности или в комбинации с антивирусным агентом, для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (БАВБ).

Антивирусное действие интерферонов против двух клинических изолятов БАВБ-СоУ (коронавирус, ассоциированный с тяжелым острым респираторным синдромом) выявлено рядом ученых франкфуртского университета (см. 1. С1п1а1 е! а1., Тйе Ьапсе!, 362, 293-294, 2003). В этой работе ученые показали, что интерфероны ингибируют ίη νίίτο репликацию БАВБ-СоУ. В частности, они оценили антивирусный потенциал рекомбинантных интерферонов (ΙΡΝ-альфа, ΙΡΝ-бета и ΙΡΝ-гамма) против двух клинических изолятов: БАВБ-СоУ-РРМ-1, выделенного от больных из Франкфурта, и Нопд Копд, который реплицируется в клетках Уего и Сасо2.

После введения в оба изолята наибольший защитный и антивирусный потенциал показал интерферон-бета. Кроме того, ученые провели анализ значимости ингибирования вирусной репликации для подавления вирусиндуцированного цитопатогенного эффекта в культурах, обработанных интерферономбета за 24 ч до заражения вирусом и сразу после инфицирования. Показано, что интерферон-бета дозозависимым образом ингибирует продуцирование инфекционного вируса в культуре.

Термин «лечение» в контексте этого изобретения относится к любому благоприятному действию на развитие болезни, в том числе, аттенуацию, ослабление или уменьшение проявления патологических симптомов после начала заболевания.

Термин «интерферон» или ΙΡΝ, используемый здесь, представляет собой любую молекулу, определенную, как таковую, в литературе и содержащую любые типы ΙΡΝ, упомянутые в разделе «Уровень техники». В частности, в упомянутое определение входят ΙΡΝ-α, ΙΡΝ-β и ΙΡΝ-γ. В соответствии с настоящим изобретением ΙΡΝ-β представляет собой ΙΡΝ. В соответствии с настоящим изобретением ΙΡΝ-β представляет собой коммерчески пригодный препарат, такой, как ВеЫГ® (Бегопо), Аνοηеx® (Вюдеп) или Ве1аГегоп® (Бсйегшд). Использование интерферонов человека также предпочтительно в соответствии с настоящим изобретением. Термин «интерферон» или ΙΡΝ, используемый здесь, обозначает соли, функциональные производные, варианты, мутеины, слитые белки, аналоги и активные фрагменты.

Термин «интерферон-бета (ΙΡΝ-β)», используемый здесь, обозначает, в частности, фибробластный интерферон человека, полученный путем выделения из биологических жидкостей или с помощью технологии рекомбинантной ДНК из прокариотических и эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и активные фрагменты.

Термин «мутеины», использованный здесь, относится к аналогам ΙΡΝ, в которых один или большее число аминокислотных остатков природного ΙΡΝ заменены на другие аминокислотные остатки или делетированы, или добавлены к нативной последовательности ΙΡΝ без существенного изменения активности полученных продуктов по сравнению с ΙΡΝ дикого типа. Эти мутеины приготовлены с помощью известных методов синтеза и/или сайт-направленного мутагенеза, или других соответствующих методов. К представленным мутеинам относятся мутеины, описанные Бйерагб е! а1., (1981) или Магк а! а1., (1984).

Предпочтительно любой из мутеинов имеет аминокислотную последовательность, в достаточной степени дублирующую последовательность ΙΡΝ и проявляющую существенную гомологию или даже усиленную ΙΡΝ-активность. Биологическая функция интерферона хорошо изучена квалифицированными специалистами, биологические стандарты определены и представлены Национальным институтом биологических стандартов и контроля (Шр://1ттипо1о£у.Ог£/1тк8/№ВБС).

Описан биологический анализ определения активности ΙΡΝ. Анализ ΙΡΝ можно выполнять по методу ВиЫп8!ет е! а1., 1981, который позволяет определить с помощью средств рутинного эксперимента, действительно ли данный мутеин имеет существенную гомологию и проявляет активность, характерную для ΙΡΝ.

В соответствии с настоящим изобретением могут быть использованы мутеины ΙΡΝ и кодирующие их нуклеиновые кислоты, в том числе, ограниченный набор соответствующих последовательностей замещенных пептидов или полинуклеотидов, полученных с помощью обычных методов и обычными специалистами на основе представленных здесь протоколов и руководства.

В соответствии с настоящим изобретением представленные изменения мутеинов известны как «консервативные» замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов или белков изобретения представляют собой группу синонимических аминокислот, которые проявляют значимую гомологию физико-химических свойств, так что замещение между членами группы сохраняет биологическую функцию молекулы. Ясно, что в вышеупомянутые последовательности можно вводить инсерции и делеции аминокислот без изменения функции последовательностей, особенно, если в инсерции или делеции

- 4 008766 участвует несколько аминокислот, например, менее 30, предпочтительно менее 10, и не происходит удаления или замещения аминокислот, имеющих критическое значение для функциональной конформации, например, остатков цистеина. К области настоящего изобретения относятся белки и мутеины, полученные путем введения этих делеции и/или инсерций.

В табл. 1 представлены предпочтительные синонимические аминокислотные группы. Более предпочтительные синонимические аминокислотные группы представлены в табл. 2, а наиболее предпочтительные синонимические аминокислотные группы - в табл. 3.

Таблица 1

Предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег, ТНг, С1у, Азп
Агд	Агд, С1п, Ъуз, С1и, НЪз
Ъеи	11е, РНе, Туг, МеН, Уа1, Ъеи
Рго	С1у, А1а, ТНг, Рго
ТНг	Рго, Зег, А1а, 61у, ΗΪ3, С1п, ТНг
А1а	С1у, ТНг, Рго, А1а
Уа1	Мек, Туг, РНе, 11е, Ъеи, Уа1
61у	А1а, ТНг, Рго, Зег, С1у
Не	МеЪ, Туг, РНе, Уа1, Ъеи, 11е
РНе	Тгр, МеЪ, Туг, 11е, Уа1, Ъеи, РНе
Туг	Тгр, Мек, РНе, 11е, Уа1, Ъеи, Туг
Суз	Зег, ТНг, Суз
ΗΪ3	С1и, Ъуз, С1п, ТНг, Агд, Низ
С1п	С1и, Ъуз, Азп, ΗΪ3, ТНг, Агд, С1п
АЗП	С1п, Азр, Зег, Азп
Ъуз	С1и, С1п, ΗΪ3, Агд, Ъуз
Азр	С1и, Азп, Азр
61и	Азр, Ъуз, Азп, С1п, ΗΪ3, Агд, С1и
Мер	РНе, 11е, Уа1, Ъеи, МеН
Тгр	Тгр

Таблица 2

Более предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег
Агд	Ηί3, Ъуз, Агд
Ъеи	Ъеи, 11е, РНе, Мек
Рго	А1а, Рго
ТНг	ТНг
А1а	Рго, А1а
Уа1	Уа1, МеЪ, 11е
С1у	С1у

- 5 008766

Продолжение табл. 2

Не	11е, Мер, РЬе, Уа1, Ьеи
РЬе	МеЬ, Туг, 11е, Ьеи, РЬе
Туг	РЬе, Туг
Суз	Суз, 5ег
Нтз	ΗΪ3, С1п, Агд
С1п	С1и, С1п, ΗΪ3
Азп	Азр, Азп
Ьуз	Ьуз, Агд
Азр	Азр, Азп
С1и	С1и, С1п
МеЬ	МеЬ, РЬе, 11е, Уа1, Ьеи
Тгр	Тгр

Таблица 3 Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот

Аминокислота	Синонимическая группа
Зег	Зег
Агд	Агд
Ьеи	Ьеи, 11е, МеЕ
Рго	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	А1а
Уа1	Уа1
С1у	С1у
11е	11е, МеЬ, Ьеи
РЬе	РЬе
Туг	Туг
Суз	Суз, Зег
ΗΪ3	ΗΪ3
С1п	С1п
Азп	Азп
Ьуз	Ьуз
Азр	Азр
С1и	С1и
МеЬ	МеЕ, 11е, Ьеи
Тгр	МеЬ

Примеры получения аминокислотных замен в белках, которые могут быть использованы для продуцирования мутеинов ΙΤΝ, применяемых в настоящем изобретении, основаны на использовании любых общепринятых методических этапов, представленных в патентах США № 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е! а1.; 5116943, Ко!й§ е! а1.; 4965195, №теп е! а1.; 4879111, СКопц е! а1.; 5017691, Ьее е! а1.; белки с заменой лизина представлены в патенте США № 4904584 (81ιη\ν е! а1.). Специфические мутеины ΙΤΝ-бета описаны Магк е! а1., 1984.

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, содержащему ΙΤΝ или мутеин, слитый с другим белком, который, например, имеет увеличенное резидентное время в жидкостях организма. ΙΤΝ может быть слит с другим белком или полипептидом, например, с иммуноглобулином или его фрагментом.

Применяемый здесь термин «функциональные производные» относится к производным ΙΤΝ, их мутеинам и слитым белкам, которые получают с использованием функциональных групп боковых цепей остатков, а также Ν- или С-концевых групп посредством известных методов с учетом их фармацевтической пригодности. Так, функциональные производные не должны нарушать активность белка, проявляющего высокую гомологию с активностью ΙΤΝ, и проявлять токсическое действие на составы, содержащие такой белок. Эти производные могут содержать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут

- 6 008766 маскировать антигенные сайты и повышать резидентность ΙΡΝ в жидкостях организма. К другим производным относятся алифатические эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные путем реакции с аммонием или с первичными или вторичными аминами, Ν-ацилпроизводные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованных с частями ацила (например, группой алканоила или карбоциклической ароильной группой), или О-ацилпроизводные свободных гидроксильных групп (например, таковых серильного или треонильного остатков), образованных с частями ацила.

К «активным фракциям» ΙΡΝ, мутеинов или слитых белков настоящего изобретения относятся любые фрагменты или предшественники полипептидной цепи молекулы белка, одной или совместно с ассоциированными молекулами или остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами белковой молекулы, или самими сахарными остатками, которые обеспечивают получение фракции, активность которой не является существенно сниженной по сравнению с соответствующим ΙΡΝ.

Применяемый здесь термин «соли» относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислым, содержащим добавки, солям аминогрупп описанных выше белков или их аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть получены с помощью известных методов. К ним относятся неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, трехвалентного железа, цинка и т.п., а также соли с органическими основаниями, образованные, например, с аминами, такими, как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. К кислым, содержащим добавки, солям относятся, например, соли минеральных кислот, таких, как соляной и серной кислот, а также соли органических кислот, например уксусной и щавелевой кислот. Любая из этих солей не должна изменять биологическую активность белков (ΙΡΝ), относящихся к настоящему изобретению, например способность связываться с соответствующим рецептором и инициировать передачу сигнала рецептором.

В соответствии с настоящим изобретением антивирусное средство может использоваться в комбинации с интерфероном для усиления его положительного действия. В соответствии с настоящим изобретением наиболее предпочтительным в качестве антивирусного средства является применение рибавирина (1-в-О-рибофуранозил-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид).

В соответствии с настоящим изобретением особенно предпочтительным является применение рекомбинантного ΙΡΝ-бета человека и соединений по изобретению.

Недавно рассмотрен особый тип варианта интерферона - так называемые «консенсусные интерфероны», представляющие собой не встречающиеся в природе варианты ΙΡΝ (И8 6013253). В соответствии с примером осуществления изобретения соединения по изобретению используют в комбинации с консенсусным интерфероном.

Как используется здесь, термин «консенсусный интерферон человека (ΙΡΝ-еои)» означает неприродный полипептид, содержащий преимущественно те аминокислотные остатки, которые являются общими для подвида ΙΡΝ-альфа, характерного для большинства последовательностей подтипа природного лейкоцитарного интерферона человека, и которые содержат в одном или большем числе этих положений, где отсутствуют аминокислоты, общие для всех подтипов, аминокислоту, которая преимущественно встречается в этом положении, и не случайно содержит любой аминокислотной остаток, который отсутствует в этом положении у не менее чем одного природного подтипа. ΙΡΝ-соп включает в себя аминокислотные последовательности, обозначенные ШЫ-соп1, ШЫ-соп2 и ΙΡΝ-сопЗ, и не только, которые представлены в патентах США № 4695623, 4897471 и 5541293. Последовательности ДНК, кодирующие ΙΡΝ-соп, могут быть получены, как описано в вышеуказанных патентах или с помощью других стандартных методов.

В другом примере осуществления изобретения слитый белок содержит слияние с Ι§. Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид, длиной 1-3 аминокислотных остатка или больше, например, длиной 13 аминокислотных остатков. Этот линкер может быть трипептидом последовательности Ε-Ρ-Μ (С1и-Рйе-Ме1), или последовательностью из 13 аминокислот, содержащей С1и-Рйе-С1у-А1аС1у-Ееи-Уа1-Ееи-С1у-С1у-С1п-Рйе-Ме1, встроенные между последовательностью ΙΡΝ и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими, как повышенное резидентное время в жидкостях организма (период полувыведения), увеличенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии и более легкая очистка слитого белка.

В другом примере осуществления изобретения ΙΡΝ слит с константной областью молекулы Ι§, предпочтительно, с областями тяжелой цепи, например с областями, гомологичными, например, доменам СН2 и СН3 Ι§01 человека. В соответствии с настоящим изобретением для генерации слитых белков также пригодны другие изоформы молекул Ι§, такие, как изоформы Ι§0₂, Ι§0₃ или Ι§0₄, или другие классы Ι§, подобные, например, Ι§Μ или Ι§Α. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

В другом примере осуществления изобретения функциональные производные содержат не менее одной части, прикрепленной к одной или большему числу функциональных групп в виде одной или большего числа боковых цепей на аминокислотных остатках. Предпочтительно часть представляет собой часть полиэтилена (ПЭГ). ПЭГилирование проводят с помощью общепринятых методов, таких, как метод, описанный, например, в публикации νΟ 99/55377.

- 7 008766

Назначение доз в виде одной или нескольких доз, вводимых больному, варьирует в зависимости от различных факторов, в том числе, фармакокинетических свойств и способа применения лекарственного средства, состояния больного и его характерных признаков (пола, возраста, массы тела, состояния здоровья), уровня проявления симптомов, совместно проводимых курсов лечения, частоты приема лекарственных средств и проявления желательного эффекта.

Стандартные дозы ΙΕΝ-бета человека варьируют в пределах 80000-200000 МЕ/кг в день или 6-12 ММЕ (млн международных единиц) на человека в день, или 22-44 мкг на человека. В соответствии с настоящим изобретением ΙΕΝ предпочтительно назначать в дозе примерно 1-50, более предпочтительно 10-30 или 10-20 мкг на человека в день.

В соответствии с настоящим изобретением путь введения активных ингредиентов может быть внутривенным, внутримышечным или подкожным. Предпочтителен подкожный путь введения ΙΕΝ.

ΙΕΝ также могут назначать ежедневно, через день или реже. Предпочтительно ΙΕΝ применяют 1, 2 или 3 раза в неделю.

Предпочтительным способом применения является подкожное введение, например, 3 раза в неделю. В дальнейшем предпочтительно внутримышечное введение 1 раз в неделю.

Предпочтительно применение 22-44 мкг или 6-12 ММЕ ΙΕΝ-бета 3 раза в неделю путем подкожной инъекции.

ΙΕΝ-бета могут назначать подкожно в дозе 25-30 мкг или 8-9,6 ММЕ через день.

В дальнейшем могут применять 30 мкг или 9,6 ММЕ ΙΕΝ-бета внутримышечно 1 раз в неделю.

В примере осуществления изобретения рибавирин назначают в комбинации с ΙΕΝ-бета в дозе 100-2000, предпочтительно 400-1200, более предпочтительно 800-1000 или около 1000-1200 мг на человека в день. Для больных с массой тела меньше 65 кг общепринятой дозой является 800 мг/кг в день, больным с массой тела 65-85 кг обычно назначают 1000 мг/кг в день, больным с массой тела больше 85 кг - 1200 мг/кг в день. Действующая доза может варьировать в зависимости от потребностей больного и тяжести состояния до лечения. Определение необходимой схемы приема лекарственного средства в конкретной ситуации зависит от уровня квалификации врача. Для удобства общую ежедневную дозу можно разделить на части и вводить, при необходимости, больному в течение дня.

В примере осуществления изобретения рибавирин применяют перорально.

Рибавирин назначают в виде инъекции или, предпочтительно, перорально. В зависимости от способа применения соединение может быть растворено в соответствующих растворителях и носителях с образованием мазей, кремов, пены и растворов, содержащих 0,01-15, предпочтительно 1-10 мас.% соединения. Для инъекции рибавирин назначают в форме раствора или суспензии, которые готовят путем растворения или суспендирования в физиологически совместимом растворе в концентрации примерно от 10 до 1500 мг/мл. Инъекция может быть внутривенной, внутримышечной, интрацеребральной, подкожной или внутрибрюшинной.

Для перорального применения рибавирин может быть в форме капсулы, таблетки, пероральной суспензии или сиропа. Таблетка или капсула может содержать 10-500 мг рибавирина, предпочтительно, около 300 мг рибавирина. Капсулы обычно представляют собой желатиновые капсулы, которые могут содержать дополнительно к необходимому количеству рибавирина, указанному выше, небольшое количество, например, менее 5 мас.% стеарата магния или другого наполнителя. Таблетки могут содержать вышеприведенное количество соединения и связывающее вещество, например, раствор желатина, растворенную в воде крахмальную пасту, поливинилпирролидон и поливиниловый спирт в воде и обычное покрытие в виде сахара.

Соединения изобретения и ΙΕΝ могут быть приготовлены в виде фармацевтического состава.

Термин «фармацевтически пригодный» включает в себя любой носитель, который не влияет на эффективность проявления биологической активности активного ингредиента и не обладает токсическим действием в отношении хозяина, которому его вводят. Например, для парентерального применения активный белок (белки) может быть приготовлен в форме единичной дозы для инъекции в носителе, таком, как физиологический раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

В соответствии с изобретением активные ингредиенты фармацевтической композиции могут вводиться субъекту различными путями. К способам введения относятся внутрикожный, чрескожный (например, при медленном выделении лекарств), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и внутриназальный. Может быть использован любой другой терапевтически эффективный путь поступления лекарств, например, с помощью абсорбции через эпителиальные или эндотелиальные ткани или посредством генотерапии, когда молекула ДНК, кодирующая активный агент, вводится больному (например, с помощью вектора), который стимулирует экспрессию и секрецию ίη νίνο активного агента. Кроме того, в соответствии с изобретением белок (белки) применяют совместно с другими компонентами биологически активных агентов, такими, как фармацевтически приемлемые сурфактанты, наполнители, переносчики, растворители и носители.

В соответствии с настоящим изобретением предпочтителен подкожный способ введения.

Другой возможностью выполнения настоящего изобретения является активация эндогенных генов ΙΕΝ. В этом случае для терапии 8ЛК8 используют вектор с целью индукции и/или усиления эндогенной

- 8 008766 выработки ΙΕΝ в клетке, у которой в норме наблюдают подавление экспрессии ΙΕΝ, или которая экспрессирует недостаточное количество ΙΕΝ. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в желательных для экспрессии ΙΕΝ клетках, например, промоторы или энхансеры. Такие регуляторные последовательности затем вводят в локус генома с 5'-стороны с помощью гомологичной рекомбинации, связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Метод, обычно называемый «активация эндогенного гена» (ЕСА), описан в публикации \УО 91/09955.

Изобретение также относится к применению клетки, генетически модифицированной для продуцирования ΙΕΝ для производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики 8АК8.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) ΙΕΝ может быть приготовлен в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка, связанного с фармацевтически пригодным для парентерального введения носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, поддерживающими изотоничность (например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Лекарственное средство стерилизуют с помощью общепринятых методов.

В соответствии с изобретением соединения интерферона и ΙΕΝ могут применяться индивидуально профилактически или терапевтически до, одновременно или после применения других схем лечения или агентов (например, при сложной схеме лекарственного лечения), в терапевтически эффективном количестве. Активные агенты, которые применяют одновременно с другими терапевтическими средствами, можно вводить в том же или в других композициях.

Все процитированные здесь ссылки на журнальные статьи или рефераты, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США и иностранные патентные заявки, патенты, выданные в США, а также иностранные патенты, или любые другие ссылки, полностью представлены здесь посредством ссылки и включают в себя все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитированных ссылках. Кроме того, содержание документов, упомянутых в разделе «ссылки», включено в данное описание посредством ссылки.

Для представления, разработки или предложения на соответствующем уровне квалификации любого аспекта, описания или примера осуществления настоящего изобретения ссылка на общепринятые методические этапы, стандартные методические этапы, общепринятые методы или стандартные методы не является необходимой.

Предшествующее описание специфических примеров осуществления изобретения полностью раскрывает основную сущность изобретения и позволяет при наличии необходимых знаний и квалификации (с учетом содержания цитированных здесь ссылок) легко его модифицировать и/или адаптировать для различного применения, а также исключить ошибочные эксперименты и отклонения от общей концепции настоящего изобретения. Поэтому такие варианты и модификации, которые эквивалентны по смыслу рассмотренным примерам осуществления изобретения, основаны на предложенных здесь методах и протоколе. Следует понимать, что предложенная здесь терминология и фразеология используется не только для настоящего описания и должна быть доступна квалифицированному специалисту, овладевшему представленными здесь методами и протоколом и обладающему стандартными профессиональными навыками.

Примеры

Клинические испытания.

Клинические испытания проводили с использованием 2 различных доз ΙΕΝ-бета. Целью испытания являлось определение клинического исхода больных, инфицированных 8АК.8 СоУ.

Клинический исход определяли путем количественного измерения вирусных титров 8АК8-СоУ в носоглоточном материале, полученном путем аспирации, и РВМС больных, а также с помощью изучения иммунологических параметров, указывающих на исход заболевания.

Моделирование клинического исследования.

Первое клиническое исследование разработано для детей. Причиной проведения исследования детей является менее тяжелое течение заболевания у больных детей, среди которых до сих пор не зарегистрировано летального исхода, что минимизирует риск лечения больных, которые из-за тяжести заболевания не способны переносить первоначальные дозы лекарства. Кроме того, опыт, приобретенный при проведении педиатрического исследования, может быть успешно применен для взрослых больных.

Рандомизированное клиническое исследование в контролируемых условиях проведено в группе больных моложе 18 лет. Больные отобраны на основе их клинического состояния и данных рентгенографии легких по критериям, установленным ВОЗ. Больных разделили на 3 группы по 10 человек в каждой группе. Первой, контрольной группе не вводили ΙΕΝ-бета. Второй группе вводили ΙΕΝ-бета в низкой дозе (1 млн ед/м²/д). Третьей группе вводили ΙΕΝ-бета в средней дозе (3 млн ед/м²/д). Больным проводили лечение в течение 1-4 недель в зависимости от течения болезни, вирусной нагрузки и иммунного ответа.

- 9 008766

Определение клинического исхода инфицированных СоУ-8АК8 больных.

Для анализа течения болезни собирали следующие данные, характеризующие состояние больного: лихорадка*, озноб или дрожь, кашель*, одышка или дыхательная недостаточность*, миалгия, недомогание, вялость или раздражительность, подавленное настроение, ринорея, фарингит, анорексия, диарея или рвота, головокружение или неврологические жалобы и высыпания, где * - симптомы, характерные для больных 8АК8. Определение клинического исхода основано на данных курса лечения в стационаре, респираторном статусе больных (одышка или цианоз), анализе газов артериальной крови, необходимости вспомогательной искусственной вентиляции легких и изменения в рентгенограммах легких.

Определение вирусных титров 8АК8-СоУ в носоглоточных аспиратах и стуле больных.

Серию носоглоточных аспиратов и образцов стула больных собирали у инфицированных больных в

3-недельный период: до лечения и на 3, 6, 9, 12, 15 и 21 день лечения. Для выявления 8АК8-СоУ образцы культивировали в клетках линии ЕК.йК-4. Изучение инфицированных клеток проводили с помощью непрямого иммунофлуоресцентного анализа. Для выявления цитопатического эффекта и определения вирусного титра/мл среды клетки исследовали с помощью светового микроскопа. Кроме того, из образцов выделяли общую РНК и проводили обратную транскрипцию с последующим выполнением количественной полимеразной цепной реакции для идентификации 8АК8-СоУ с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров.

Для анализа 8АК8-СоУ антител выделяли образцы сыворотки.

Иммунологические показатели, предсказывающие исход лечения.

Измеряли уровень экспрессии стимулируемых ΙΡΝ генов, который указывает на влияние ίη у1уо экзогенного ΙΡΝ. К ΙΡΝ-стимулируемым генам относятся гены 2-5 синтетазы, РКК и Мх. Они являются надежными маркерами активности ΙΡΝ в клетках. Кроме того, проводили отбор типичных больных, реагирующих на лечение (на примере улучшения результатов лечения и снижения вирусной нагрузки после лечения) и не реагирующих на лечение больных (плохой клинический исход и отсутствие изменений в уровне вирусной нагрузки или незначительные изменения после лечения ΙΡΝ-бета).

Профиль экспрессии генов в моноядерных клетках периферической крови больных исследовали с помощью систем микрочипов (например, АГПте1п.х) и анализа протеомикса. Полученные данные использовали для идентификации маркеров терапевтического ответа.

Ссылки

1. 8!ибу Огоир. Тйе Рапсе! 1998; 352, 1498-1504.

2. 1. Сш1а1 е! а1., Тйе Ьапсе1, 2003, 362, 293-294.

3. С1едд апб Вгуап1, Ехр. Ορίη. Рагтасо1йег, 2001; 2(4): 623-639.

4. Эегупк К. е1 а1., №11иге 1980; 285, 542-547.

5. РатШеШ, Р.С., КиЬтйет, 8., апб Рейка, 8. А Сопуешеп! апб К.ар1б Су1ора1йк ЕГГес! [пЫЫОоп Аккау Гог ШегГегоп ш Ме!йобк ш Епхуто1оду. 1981, уо1. 78 (8. Рейка, еб.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, 387-394.

6. Нийдгеп С., МШсй Э.К., ХУебапб Ο., 8а11Ьегд М. Тйе апйу1га1 сотроипб пЬаушп тоби1а!ек !йе Т Не1рег (Тй) 1/ТН2 киЬке! Ьа1апсе ш йераййк В апб С У!гик-крес|Пс 1ттипе гекропкек. 1 Оеп У1го1., 1998; 79 :2381-2391.

7. МсСогткк 1.В., Ктд Ι.Ι., \УеЬЬ Р.А., 8спЬпег С.Ь., Сгауеп К.В., 1ойпкоп К.М., Е1йой Ь.Н., Ве1топ1-^1Шатк К. Ьакка Геуег. ЕГГесОуе 1йегару νίΐΗ пЬаушп. Ν Епд1. 1. Меб. 1986, 1ап. 2; 314(1):20-6.

8. Магк Ό.Ρ. е! а1., Ргос. №11. Асаб. 8сЕ И.8.А., 1984, 81 (18) 5662-5666.

9. Рейка, 8. йИегГегоп 81апбагбк апб Оепега1 АЬЬгеу1а1юпк, т Ме!йобк т Епхутокду (8. Рек1ка, еб.), Асабетк Ргекк, №\ν Уогк, 1986, 119, 14-23.

10. КиЬтйеш, 8., РатШеШ, Р.С., апб Рейка, 8. Сопуешеп! Аккау Гог ЕНегГегопк. 1. У1го1. 1981; 37, 755-758.

11. 8йерагб Н.М. е! а1., \а!пге 1981; 294, 563-565.

12. Тат К.С., Ра1 В., Вагб 1., Ет С., Ауегей Ό.Β., Рйап и.Т., Мбоуапоук Т. КгЬаушп ро1апхек йитап Т се11 гекропкек 1о\гагбк а Туре 1 суккше ргоГбе. 1. Нера1о1. 1999; 30(3):376-82.

13. Тодо Υ., МсСгаскеп Е.А. ЭоиЫе-Ьйпб с1шка1 аккекктеп! оГ пЬаушп (уйахо1е) ш 1йе ргеуепйоп оГ тбисеб тГесОоп \\йй 1уре В тПиепха упик. 1. Мес!. Э1к. 1976, 1ип; 133 8ирр1: А109-13.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Применение интерферона-бета (ΙΡΝ-β) или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного, активной фракции или соли для производства лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики тяжелого острого респираторного синдрома (8АК8).
2. Применение ΙΡΝ-β или его изоформы, мутеина, слитого белка, функционального производного, активной фракции или соли в комбинации с антивирусным агентом для производства лекарственного средства, предназначенного для одновременного, последовательного или раздельного использования при лечении и/или профилактике 8АК8.
3. Применение по п.2, где указанный антивирусный агент является рибавирином.

- 10 008766
4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β является рекомбинантным ΙΕΝ-β человека.
5. Применение по любому из пп.1-4, где указанный ΙΕΝ-β является консенсусным интерфероном.
6. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный слитый белок включает слияние с иммуноглобулином.
7. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β назначается в дозе приблизительно 1-50, или приблизительно 10-30, или приблизительно 10-20 мкг на человека в день.
8. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β назначается ежедневно или через день.
9. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β назначается два или три раза в неделю.
10. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β назначается подкожно.
11. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанный ΙΕΝ-β назначается внутримышечно.
12. Применение по любому из пп.2-11, где антивирусный агент назначается в дозе приблизительно 100-2000, или приблизительно 400-1200, или приблизительно 800-1000, или приблизительно 1000-1200 мг на человека в день.
13. Применение по любому из пп.2-11, где рибавирин назначается перорально.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6