EA008480B1 - Выделенный полинуклеотид (варианты), содержащий его вектор и клетка-хозяин, кодируемый им полипептид рецептора nogo, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов (варианты), выделенное антитело и фармацевтическая композиция на их основе - Google Patents

Abstract

Описаны белки рецептора NOGO и пептиды, которые блокируют опосредованное NOGO ингибирование удлинение аксонов, а также выделенные полинуклеотиды, их кодирующие. Композиции по изобретению могут применяться при лечении черепной или церебральной травмы, повреждения спинного мозга, инсульта или демиелинизирующего заболевания.

Description

Область изобретения

Изобретение относится к новым человеческим и мышиным генам, которые кодируют белок рецептора Иодо, причем данный рецептор способен регулировать рост аксонов. Данные гены рецептора Иодо избирательно экспрессируются в аксонах и дендритах нейронов в центральной нервной системе во время роста аксонов. Изобретение также относится к композициям, с помощью которых можно осуществлять избирательную блокаду опосредованного рецептором Иодо ингибирования роста аксонов путем блокирования взаимодействия Иодо с рецептором Иодо, вызывая последующее повышение роста аксонов.

Предпосылки изобретения

Аксоны и дендриты нейронов представляют длинные клеточные отростки нейронов. На дистальном конце растущего аксона или нейрита расположен специализированный регион, известный как конус роста. Конусы роста ответственны за чувствительность к местному окружению и движению в направлении клетки-мишени нейрона. Конусы роста имеют форму руки, с некоторым количеством тонких филоподий, которые по-разному прилипают к поверхностям эмбриона. Конусы роста могут быть чувствительны к некоторым направительным сигналам, например к поверхностной адгезивности, факторам роста, нейротрансмиттерам и электрическим полям. Направление роста конуса зависит от различных классов молекул адгезии, межклеточных сигналов, так же, как от факторов, которые стимулируют и ингибируют конусы роста. Конус роста, находящийся на конце растущего нейрита, продвигается с различными скоростями, но обычно со скоростью 1 или 2 мм в день. Конус состоит из широких и плоских отростков с многочисленными длинными микрошипиками или филоподиями, которые простираются как шипы. Данные филоподии постоянно активны. В то время, как некоторые филоподии возвращаются назад к конусу роста, другие продолжают удлиняться сквозь субстрат. Продолжения между несколькими филоподиями образуют ламеллиподий.

Конус роста может обследовать область, которая лежит впереди его и по каждую сторону от его ламеллиподий и филоподий. Когда отросток входит в контакт с поверхностью, которая неблагоприятна, он отклоняется. Когда отросток входит в контакт с благоприятной поверхностью, он продолжает расти и может регулировать движение конуса роста в данном направлении. Следовательно, конус роста может направляться малыми вариациями поверхностных свойств субстратов. Когда конус роста достигает подходящей клетки-мишени, возникает синаптическое соединение.

В центральной нервной системе (ЦНС) поврежденные нейроны не регенерируют после повреждения, вызванного травмой или заболеванием. Отсутствие регенерации аксонов после повреждения может объясняться наличием ингибиторов роста аксонов. Данные ингибиторы преимущественно ассоциированы с миелином и представляют важный барьер для регенерации. Ингибиторы роста аксонов присутствуют в миелине, выделенном из ЦНС, и плазматической мембране олигодендроцитов, которые синтезируют миелин в ЦНС (ЗсНхгаЬ е! а1., (1993) Апп. Веу. Иеитозсь 16, 565-595).

Миелин ЦНС представляет собой сложное продолжение клеточной мембраны олигодендроцитов. Один олигодендроцит миелинизирует целых тридцать аксонных сегментов ЦНС. Отростки мембраны олигодендроцита обвертываются вокруг аксонов концентрическим способом с образованием миелинового слоя. Плотно компактизованный зрелый миелин состоит из параллельных слоев бимолекулярных липидов, чередующихся слоями гидратированного белка. Активный синтез миелина начинается ίη и!его и продолжается в первые 2 года жизни человека. Медленный синтез продолжается в течение детства и подросткового возраста, и кругооборот зрелого миелина продолжается с более низкой скоростью в течение жизни взрослого. Как развивающиеся, так и зрелые формы миелина чувствительны к повреждению вследствие болезни или физической травмы, что приводит к деградации миелина, окружающего аксоны.

Оказывается, что миелинассоциированные ингибиторы вносят первичный вклад в невозможность регенерации аксонов ЦНС ίη у1уо после прерывания целостности аксона, в то время, как другие, не ассоциированные с миелином ингибиторы роста аксонов в ЦНС могут играть меньшую роль. Данные ингибиторы блокируют регенерацию аксонов после повреждения нейронов вследствие травмы, инсульта или вирусной инфекции.

Было охарактеризовано много происходящих из миелина ингибиторов роста аксонов (см. для обзора Όανίά е! а1., (1999) №0 995394547; Вапдшап е! а1., (1999) патент США 5858708; Зс11\\аЬ. (1996) Иеитосйеш. Вез. 21,755-761). Также описаны некоторые компоненты белого вещества ЦНС, И135, И1250 (Иодо) и миелинассоциированный гликопротеин (МАС), которые обладают ингибиторной активностью в отношении распространения аксонов (ЗсНхтаЬ е! а1., (1990) №0 9005191; 8с11хтаЬ е! а1., (1997) патент США 5684133). В частности, Иодо представляет 250 кДа миелинассоциированный ингибитор роста аксонов, который был клонирован и охарактеризован (Иадазе е! а1., (1998) ЭИА Вез. 5, 355-364; 8сйгаЬ, (1990) Ехр. Иеиго1. 109,2-5). кДНК Иодо вначале идентифицировали путем случайного анализа кДНК головного мозга и не придавали ему предполагаемой функции (Иадазе е! а1., (1998) ЭИА Вез. 5, 355-364).

Шваб с коллегами опубликовали последовательность шести пептидов, случайным образом выделенных из продукта протеолитического расщепления предполагаемого бычьего белка И1250 (Иодо) (8рй1шапп е! а1., (1998) ί. Вю1. СНет. 273, 19283-19293). Вероятная полноразмерная последовательность кДНК данного белка в настоящее время хранится в СепВапк. Данный клон кДНК человека размером 4,1 тыс. пар оснований, К1АА0886, был получен при попытке Кахиза ЭИА ВезеагсН 1пзй!и!е секвенировать выде- 1 008480 ленную из головного мозга кДНК большой молекулярной массы (Ыадаке с1 а1., (1998) ΌΝΆ Кек. 31, 355364). Данный новый клон кДНК кодирует 135 кДа белок, который включает все шесть пептидных последовательностей, происходящих из бычьего Νο§ο.

Последовательность человеческого Νο^ο-Ά проявляет высокую степень гомологии по отношению к карбоксиконцевой трети белков семейства ретикулона (К1и). К1и1 также был назван нейроэндокринным специфичным белком (Ν8Ρ), поскольку он экспрессируется исключительно в нейроэндокринных клетках (Уап бе Уе1бе е1 а1., (1994) 1. Се11. 8с1. 107, 2403-2416). Все белки К1и обладают регионом длиной 200 аминокислотных остатков со сходством последовательности с карбоксильным концом данного белка (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) 1. Се11. 8с1. 107, 2403-2416; КоеЬтоек е! а1., (1996) Сепотюк 32, 191-199; КоеЬтоек е! а1., (1998) Сепотюк 51, 98-106; Мотена е! а1., (1999) Сепотюк 58, 73-81; Мотк е! а1., (1991) ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 1450, 68-76). Родственные последовательности были обнаружены в геномах мухи и червя (Мотена е! а1., (1999) Сепотюк 58, 73-81). Данный регион обладает приблизительно 70% идентичностью по семейству К!п. Аминоконцевые регионы не являются родственными один другому и происходят вследствие различных событий альтернативного сплайсинга РНК.

В результате анализа последовательностей, хранящихся в СепВапк, и по гомологии с опубликованными изоформами К!п были предсказаны три формы белка №до (№до-А, №до-В, №до-С). №до-В массой 37 кДа, возможно, может соответствовать N135, и этим объясняется антигенное сходство ингибиторной активности в отношении разрастания аксонов N135 и N1250 (№до-А). №до-В-Мус при 8Ό8РАСЕ проявляет электрофоретическую подвижность, соответствующую 25 кДа, и был описан ранее как К!п4 или νρ2015. Способность белка №до-А ингибировать регенерацию аксонов выявлена лишь недавно (СгапбРге е! а1., (2000) №11иге 403, 439-444; Сйеп е! а1., (2000) №11иге 403, 434-439; Рпп)11а е! а1., (2000) №11иге 403, 483-484).

Отсутствие в ЦНС повторного роста аксонов через очаг повреждения после травмы считалось причиной стойких неблагоприятных эффектов, ассоциированных с травмой, инсультом и демиелинизирующими нарушениями. Модуляция N1250 описана как средство лечения путем регенерации нейронов, поврежденных травмой, инсультом или дегенеративными нарушениями ЦНС (8с11\таЬ е! а1., (1994) XVО 9417831; Та1ащЬа е! а1., (1997) №игокигдегу 40, 541-546), так же, как и злокачественными опухолями в ЦНС, такими как глиобластома (8с11\таЬ е! а1., (1993) патент США 5250414; 8сйтеаЬ е! а1., (2000) патент США 6025333).

Имеются сообщения о том, что антитела, которые распознают N1250, могут использоваться для диагностики и лечения повреждения нервов в результате травмы, инфекции и дегенеративных нарушений в ЦНС (8еЬпе11 & 8сйтеаЬ, (1990) Уинге 343, 269-272; 8сйтеаЬ е! а1., (1997) патент США 5684133). В аксонах, которые становятся миелинизированными, имеет место корреляция между развитием миелина и появлением №до. После того, как №до блокируется антителами, нейроны снова могут прорастать через очаги разрушения, вызванного повреждением нерва (Уагда е! а1., (1995) Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 92, 10959-10963).

Механизм действия, посредством которого №до ингибирует рост аксонов, еще не выяснен. Идентификация и характеристика данного механизма действия и биохимических путей, ассоциированных с эффектами №до. могли бы использоваться для лечения болезненных состояний, ассоциированных с повреждением аксонов и демиелинизацией аксонов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на открытии белков рецептора №до, уменьшающих опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, и относится к изолированным молекулам нуклеиновой кислоты, которые их кодируют.

Так, вариант изобретения относится к выделенному полинуклеотиду, кодирующему полипептид рецептора NОСО, по меньшей мере на 80, 90 и 95% идентичный полипептиду, содержащему аминокислоты 1-348 8ЕО Ш N0: 2 человека или 8ЕО Ш N0: 4 мыши, или кодирующему полипептид, содержащий аминокислоты 1-348 8ЕО Ш N0: 2 человека или 8ЕО Ш N0: 4 мыши.

Вариант изобретения относится также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует растворимый фрагмент полипептида рецептора №до, содержащий по меньшей мере 50, 60 или 70 смежных аминокислот 1-348 из 8ЕО Ш N0: 2 человека или 8ЕО Ш N0: 4 мыши.

Вариант изобретения относится также к изолированной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует фрагмент полипептида рецептора №до (^К), содержащий область ЬККЛТ ^К, области ЬКК ^К и область ЬККСТ ^К в пределах аминокислот 1-309 8ЕО Ш N0: 2 человека или 8Е0 Ш N0: 4 мыши.

Вариант представляет собой выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид рецептора NОСО, содержащий аминокислоты 1-348 8Е0 Ш N0: 2 человека или 8Е0 Ш N0: 4 мыши, слитый с гетерологичным полипептидом.

Настоящее изобретение далее относится к указанной выше выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид рецептора NОСО, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, функционально связанной с одним или несколькими элементами контроля экспрессии, включая векторы, в состав которых входят изолированные молекулы нуклеиновой кислоты.

- 2 008480

Изобретение далее относится к клеткам-хозяевам, трансформированным таким образом, что они содержат молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, и получаемым белкам по способам, включающим культивирование клетки-хозяина, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты по изобретению при условиях, в которых экспрессируется данный белок.

Настоящее изобретение включает изолированный полипептид, выбранный из группы, состоящей из изолированного полипептида, включающего фрагмент по меньшей мере из 50, 60 или 70 смежных аминокислот из последовательностей 1-348 8ЕО ΙΌ N0: 2 человека, 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши; изолированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность 1-348 8Е0 ΙΌ N0: 2 человека, 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши; включающую по меньшей мере 1, например, 5, 10, 15 или 20 консервативных аминокислотных замен; изолированного полипептида, включающего аминокислотную последовательность 1-348 8Е0 ΙΌ N0: 2 человека, 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши, включающую по меньшей мере 1, например, 5, 10, 15 или 20 встречающихся в природе аминокислотных замен, то есть изолированного полипептида с идентичностью аминокислотной последовательности, равной по меньшей мере 80, 90 или 95% по отношению к 1348 8Е0 ΙΌ N0: 2 человека, 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши.

Изобретение также относится к выделенному фрагменту полипептида рецептора N000 (ИдЯ), содержащему область ЬЯЯЫТ ЫдЯ, области ЬЯК N3^ и область ЬЯКСТ N3^ в пределах аминокислот 1309 8Е0 ΙΌ N0: 2 человека или 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши.

Изобретение также относится к химерным полипептидам, включающим аминокислотную последовательность 1-348 8Е0 ΙΌ N0: 2 человека, 8Е0 ΙΌ N0: 4 мыши.

Изобретение далее относится к антителам, которые связывают указанные выше белки рецептора N030. Антитела могут быть моноклональными и поликлональными антителами. В дополнение, антитела могут быть гуманизированными. Изобретение также относится к антителам, которые проявляют антигенсвязывающую активность.

Изобретение также относится к способу лечения нарушения центральной нервной системы млекопитающего, включающему стадию введения эффективного количества композиции, содержащей в качестве действующего начала указанный выше выделенный полинуклеотид, или указанную выше клеткухозяина, или указанный выше полипептид, или антитело, которые уменьшают опосредованное рецептором N030 ингибирование роста аксонов. В некоторых осуществлениях нарушение центральной нервной системы является результатом черепной или церебральной травмы, повреждения спинного мозга, инсульта или демиелинизирующего заболевания. Примерами демиелинизирующих заболеваний являются рассеянный склероз, монофазная демиелинизация, энцефаломиелит, мультифокальная лейкоэнцефалопатия, панэнцефалит, болезнь Маркьяфава-Биньями (МагсЫа1ауа-В1дпат1), миелинолизис моста, адренолейкодистрофия, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (РеН/аеик-Мег/Ьасйег), спонгиозная дегенерация, болезнь Александра (А1ехапбег), болезнь Канавана (Сапауап), метахроматическая лейкодистрофия и болезнь Краббе (КгаЬЬе).

Описание фигур

Фиг. 1 - сравнение доменов N030.

(а) представляет собой схематичную диаграмму, которая суммирует свойства белка N030, использованные в данном исследовании. (Ь) представляет фотографию фибробластов Ы1Н-3Т3, культивированных на поверхностях, покрытых Атш0-М0д0, О8Т-Ы0д0-66 или без белка, и окрашенных с выявлением актина филаментов (масштаб 40 мкм). (с) представляет фотографию куриных ганглиев дорзального корешка Е12, культивированных на поверхностях, покрытых Атт0-М0д0, О8Т-Ы0д0-66 или без белка (связанных с субстратом) или в присутствии 100 нМ белка N030 (растворимого) (масштаб 40 мкм). (ά) представляет фотографию геля и иммуноблота, где очищенный белок Л1шп0-№д0-Мус-Н15 подвергали δΌδ-РАОЕ- и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым (СВВ) или выявляли иммуноблоттингом посредством антител против Мус (Мус) (маркеры молекулярной массы 200, 116, 97, 65 и 45 кДа находятся слева). (е) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли процент фибробластов 3Т3 с площадью более 1200 мкм² (покрытие) в экспериментах, проведенных по (Ь) на поверхностях, покрытых N0^0 (черный цвет) или с растворимыми 100 нМ препаратами N030 (голубой цвет) (АМ, Л1шп0-№д0; АМ+Мус, Атш0-Н0д0, преинкубированный с антителом против Мус; АМ+Мус+Мо, АМ+Мус, преинкубированные с антителом против мышиных Ι§0; Мус+Мо, антитело против Мус плюс антитело против мышиных )дО). (!) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где определяли процент покрытия клетками С08-7 после культивирования на поверхностях, покрытых N0^0, или с растворимыми 100 нМ препаратами N030. (д) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где эффекты очищенных препаратов О8Т-Ы0д0-66 или Лтт0-'Ы0д0 на морфологию конуса роста оценивали на культурах ганглиев дорзального корешка Е12 в указанных концентрациях через 30 мин. В данном эксперименте было продемонстрировано, что при данном анализе О8Т-Ы0д0-66 действует в 2 раза более мощно по амплитуде, чем Атш0-Н0д0. (11) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где проводили количественную оценку разрастаний нейритов на клетку в культурах ганглиев дорзального корешка Е13 в экспериментах, проведенных по (с) на поверхностях, покрытых №д0 или с растворимыми 100 нМ препаратами Ы0д0. (ί) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли эффекты препаратов №д0 на разрастание нейритов в мозжечковых

- 3 008480 гранулярных нейронах.

Фиг. 2 - фрагменты Νο§ο являются антагонистами действия Νο§ο и миелина ЦНС.

(а) представляет собой фотографию отростков куриного ганглия дорзального корешка Е12, которые культивировали, после чего оценивали коллапс конуса роста, как описано на фиг. 4. Культуры подвергали действию следующих препаратов в течение 30 мин до фиксации и окрашивания родамин-фаллоидином: только буфер (контроль); 15 нМ Ο8Τ-Νο§ο (Νο§ο); Рер1, Рер2 и Рер3 (Рер); 15 нМ Ο8Τ-Νο§ο плюс Рер1, Рер2 и Рер3 по 1 мкМ каждого (Νο^ο + Рер). Заметьте, что коллапс конуса роста за счет Νο§ο блокировался добавлением пептидов. Рер1, остатки 1-25 внеклеточного домена; Рер2, 11-35; и Рер3, 21-45. (Ь) представляет график количественной оценки результатов анализа коллапса конуса роста по (а). Индивидуальные пептиды включали в концентрации 4 мкМ, а смесь пептидов 1-3 содержала по 1 мкМ каждого пептида. Миелин ЦНС получали, как описано, и указанные общие концентрации миелинового белка включали в культуры. Все результаты представляют собой средние ± станд.ош.средн. (к.е.ш.), рассчитанные на основе 4-7 измерений. Отмечены значения, значимо отличающиеся от соответствующих значений с теми же концентрациями Νο§ο или миелина, но без пептида (звездочка, р<0,05, двухсторонний 1-тест Стьюдента).

Фиг. 3 - антагонист Νο§ο Рер2-41.

(а) представляет график, показывающий результаты анализа коллапса конуса роста на куриных ганглиях дорзального корешка Е12. Данный анализ проводили и подвергали количественной оценке, как в ОгаибРге е1 а1., (2000) №1Шге 403,439-444. Анализ проводили без добавления (контроль), с 15 нМ Ο8ΤΝο§ο (Νο^ο) или 15 нМ ΟδΤ-Νο^ο плюс 1 мкМ Рер2-41 (Νο^ο-Рер). Значения представляют собой средние ± станд.ош.средн. (к.е.ш.), рассчитанные на основе четырех измерений. (Ь) представляет график, показывающий результаты по связыванию, где измеряли связывание 10 нМ АР-Νο^ο с нейронами куриных ганглиев дорзального корешка Е12, как описано на фиг. 4, с добавлением указанных концентраций Рер2-41.

Фиг. 4 - Νο§ο Рер2-41 предотвращает ингибирование разрастания нейритов Νο§ο и миелином ЦНС.

Данная фигура представляет собой график, на котором показаны результаты анализа разрастания, где нейроны культивировали в присутствии указанных концентраций Рер2-41, очищенного белка Ο8ΤΝο§ο (Ο8Τ-Νο§ο-66) и грубого белка миелина ЦНС. Нейроны куриных ганглиев дорзального корешка Е12 культивировали в стандартных условиях. Для анализа разрастания нейроны культивировали в присутствии указанных концентраций Рер2-41, очищенного белка Ο8Τ-Νο§ο (Ο8Τ-Νο§ο-66) и грубого белка миелина ЦНС. Данный эксперимент продемонстрировал, что Рер2-41 может обращать ингибирование разрастания нейритов за счет Ο8Τ-Νο§ο или общего миелина ЦНС.

Фиг. 5 - анализ связывания лиганда аксонными рецепторами Νο§ο.

(а) представляет собой фотографию геля и иммуноблота, где белок Η^8-АР-Nοдο (66 аминокислот) экспрессировали в клетках НЕК293Т и очищали от кондиционной среды на смоле, содержащей никель посредством гистидиновой метки. Очищенный белок подвергали 8Э8-РАСЕ и окрашивали общий белок СВВ или проводили иммуноблоттинг с использованием антител против Νο§ο (ημη-Νο^ο). Слева показаны маркеры молекулярной массы 200, 116, 97, 65 и 45 кДа, а справа находится миграция АР-Νοβο. (Ь) представляет собой фотографию диссоциированных нейронов куриного ганглия дорзального корешка Е12, которые инкубировали с 10 нМ АР-Νο^ο или 10 нМ АР-Νο^ο + 160 нМ Ο8Τ-Νο§ο в течение 60 мин при 23°С. Клетки отмывали, фиксировали и инкубировали при 60°С для инактивации эндогенного АР. Связанный Ар-Νο^ο выявляли путем инкубации с голубым нитротетразолием. Заметьте интенсивное окрашивание нейронов Ар-Νο^ο, которое отменяется введением немеченого лиганда. (с) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где оценивали эффективность АР-Νο^ο и Ο8Τ-Νο§ο путем анализа коллапса конуса роста на куриных ганглиях дорзального корешка Е12, как описано в разделе примеров. Определено, что ЕС₅₀ АР-Νο^ο составляет 1 нМ или меньше. Показаны средние значения ± станд.ош.средн., рассчитанные для 5-8 измерений. (ά) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где оценивали связывание АР-Νο^ο в концентрации 10 нМ с нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е12, или в присутствии 100 нМ Ο8Τ-Νο§ο. или в присутствии 4 мкМ Рер2, которое количественно анализировали по (Ь), способом, описанным в разделе примеров. Показаны средние значения ± станд.ош.средн., рассчитанные для 8 измерений. (е) представляет график, показывающий экспериментальные данные, где измеряли связывание АР-Νο^ο с нейронами ганглия дорзального корешка как функцию концентрации АР-Νο^ο. Приведен один из шести экспериментов со сходными результатами. (ί) представляет график, суммирующий данные из (е), преобразованные для анализа Скетчарда. Очевидная Κ_ά связывания Ар-Νο^ο с нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е12 составляет 3 нМ.

Фиг. 6 - связывание Νο§ο с СО8-7, экспрессирующими рецептор Νο§ο.

Данная фигура представляет собой фотографию клеток СО8-7, которые трансфицировали экспрессирующим вектором, кодирующим мышиный рецептор Νο§ο. Через 2 дня после трансфекции оценивали связывание Ар-Νο^ο или АР, как описано в разделе примеров для нейронов ганглия дорзального корешка. Отметьте избирательное связывание Νο§ο с клетками, экспрессирующими рецептор Νο§ο. Связывание сильно уменьшается в присутствии избытка пептида Νο^ο, не слитого с АР.

Фиг. 7 - структура рецептора Νο§ο.

Данная схематичная диаграмма иллюстрирует главные структурные черты рецептора Νο§ο.

- 4 008480

Фиг. 8 - распределение мРНК рецептора Νοβο.

Данная фигура представляет собой фотографию нозерн-блота мРНК рецептора Νοβο для образцов ро1уА+РНК из указанных тканей мыши слева и для образцов общей РНК из различных регионов головного мозга крысы справа. Слева показана миграция маркеров размера РНК.

Фиг. 9 - иммуногистология рецептора Νοβο-66.

(а) представляет собой фотографию иммуноблота, где анализировали мембранную фракцию (10 мкг белка) из указанных клеток или тканей цыпленка путем иммуноблоттинга против рецептора Νοβο-66 (маркеры молекулярной массы в кДа находятся справа). (Ь) представляет собой фотографию клеток СО8-7, экспрессирующих Мус-рецептор Νοβο-66, или отростков куриного спинного мозга Е5 (8 дней ίη νίίτο), окрашенных антителами против рецептора Νοβο-66, против Мус или олигодендроцитспецифическими антителами О4. На нижних трех панелях показана иммуногистохимия той же области (масштаб 40 мкм для трех верхних панелей и 80 мкм для трех нижних панелей). (с) представляет собой фотографию фиксированных параформальдегидом вибратомных секций головного мозга или спинного мозга взрослого, окрашенных препаратом антител против рецептора Νοβο-66. Данные результаты демонстрируют окрашивание профилей аксонов (стрелки) как в мосте, так и в спинном мозге. Окрашивание существенно снижается в присутствии 10 мкг/мл антигена-О8Т-рецептора Νοβο-66.

Фиг. 10 - рецептор Νοβο-66 опосредует коллапс конуса роста, происходящий за счет Νοβο-66.

(а) представляет собой фотографию куриных отростков ΌΚΟ Е12, подвергавшихся действию Νοβο-66 после предварительной обработки Р1-РЬС или буфером. Показано окрашивание Е-актина в аксонах (масштаб 40 мкм). (Ь) представляет график, суммирующий экспериментальные результаты связывания 3 нМ АР или АР-Νοβο с диссоциированными нейронами куриного ганглия дорзального корешка Е12. Там, где это отмечено, культуры предварительно обрабатывали Р1-РЬС или включали 150 нМ Ο8Τ-Νοβο-66 в инкубационную среду с Ар-Νοβο. (с) представляет график, суммирующий измерения коллапса конуса роста из экспериментов по (а). Культуры куриных ΌΚΟ Е12 обрабатывали Р1-РЬС или не делали этого перед воздействием 30 нМ ΟδΤ-Νοβο-66 или 100 пМ 8ета3А. (б) представляет фотографию отростков клеток ганглия сетчатки Е7, инфицированных контрольным вирусом (Н8У-Р1ехшА1) или Н8У-Мус-рецептором Νοβο-66 и затем инкубированных с Νοβο-66 или без него. Показано окрашивание фаллоидином конусов роста аксонов (масштаб 25 мкм). (е) представляет график с количественной оценкой коллапса конусов роста неинфицированных или инфицированных вирусом нейронов сетчатки Е17 по (б).

Фиг. 11 - структурно-функциональный анализ рецептора Νοβο-66.

(а) представляет схематичную диаграмму различных мутантов с делецией рецептора Νοβο-66. В данных мутантах оценивали уровень экспрессии путем иммуноблоттинга и связывание АР-Νοβο. Заметьте, что богатые лейцином повторы и богатый лейциновыми повторами С-конец требуются для связывания Νοβο, но оставшаяся часть белка не требуется. Второй белок тестировали после очистки и иммунизации. (Ь) представляет диаграмму с предсказанной трехмерной структурой первых семи богатых лейцином повторов рецептора Νοβο-66. Данный результат выведен при компьютерном моделировании, основанном на предсказанной структуре сходных богатых лейцином повторов рецептора лейтропина (Лапд еί а1., (1995) 81гисШге 3, 1341-1353). Моделирование проводили посредством 8\ν^55-Μοбе1 на \у\у\у.ехра5у.с11/5рбЬ\'. Также отмечены регионы с бета-листовой и альфа-спиральной вторичной структурой.

Фиг. 12 - растворимый рецептор Νοβο блокирует Νοβο-66.

Нейроны куриных ΌΚ.0 Е13 культивировали в стандартных условиях. При анализе коллапса конуса роста вместе с 100 нМ Νοβο-66 добавляли кондиционированную среду от клеток НЕК293Т, секретирующих фрагмент эктодомена мышиного рецептора Νοβο длиной 1-348 аминокислот или контрольную кондиционированную среду. На нижней левой панели данные графика показывают, что индуцируемый Νοβο коллапс блокируется растворимым фрагментом рецептора. Для анализа разрастания нейроны культивировали в присутствии контроля или кондиционированной среды с эктодоменом рецептора Νοβο вместе с Νοβο-66 (50 нМ) или миелином центральной нервной системы (13 мкг общего белка/мл). На четырех верхних панелях показаны фотографии, на которых продемонстрировано, что миелин центральной нервной системы ингибирует разрастание и что данный эффект блокируется присутствием белкаэктодомена рецептора Νοβο. На графике на нижней правой панели показана количественная оценка разрастания.

Подробное описание изобретения

I. Определения.

Кроме определенных по-другому, все используемые здесь технические и научные термины имеют те же значения, под которыми они обычно понимаются обычным специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя в осуществлении и тестировании настоящего изобретения могут использоваться любые способы и материалы, сходные или эквивалентные тем, что здесь описаны, описываются предпочтительные способы и материалы.

Используемый здесь термин «аксон» относится к длинному клеточному выпячиванию нейрона, по которому от тела клетки к клеткам-мишеням проводятся эфферентные (исходящие) потенциалы действия.

Используемый здесь термин «рост аксонов» относится к удлинению длинного отростка или аксона, начинающемуся от тела клетки и происходящему за счет конуса роста.

- 5 008480

Используемый здесь термин «нарушение центральной нервной системы» относится к любому патологическому состоянию, ассоциированному с ненормальной функцией центральной нервной системы (ЦНС). Термин включает в качестве неограничивающих примеров измененную функцию ЦНС, возникающую в результате физической травмы ткани головного мозга, вирусной инфекции, аутоиммунного механизма, генной мутации и нейродегенеративных заболеваний или нарушений.

Используемый здесь термин «химерный белок» относится к любому полипептиду, который не полностью гомологичен на аминокислотном уровне его последовательности «дикого типа» или кодируется нуклеиновой кислотой, возникающей из соединения нуклеиновых кислот из двух разных источников. Термин включает в качестве неограничивающих примеров белки слияния и белки, сконструированные таким образом, что они содержат одну или несколько аминокислотных замен, за счет которых их аминокислотная последовательность отличается от последовательностей дикого типа.

Используемый здесь термин «демиелинизирующее заболевание» относится к патологическому нарушению, характеризующемуся деградацией миелиновой оболочки клеточной мембраны олигодендроцитов.

Используемый здесь термин «конус роста» относится к специализированному региону на кончике растущего нейрита, который отвечает за чувствительность к местному окружению и движение аксона по направлению к соответствующей ему синаптической клетке-мишени.

Используемый здесь термин «движение конуса роста» относится к вытяжению или коллапсу конуса роста по направлению к клетке-мишени нейрона.

Используемый здесь термин «нейрит» относится к отростку, растущему от нейрона. Так как в культуре иногда трудно отличить аксон от дендрита, термин «нейрит» используется для них обоих.

Используемый здесь термин «олигодендроцит» относится к клетке нейроглии ЦНС, функцией которой является миелинизация аксонов ЦНС.

Используемый здесь термин «полипептид» относится к пептиду, который при гидролизе дает более двух аминокислот, называемому трипептидами, тетрапептидами и т.д., согласно числу аминокислот, содержащихся в полипептиде. Термин «полипептид» используется по ходу спецификации в качестве синонима термину «белок» или «пептид».

II. Конкретные осуществления.

А. Белок-рецептор Иодо и пептидные средства (агенты) для белка-рецептора Иодо.

Настоящее изобретение относится к изолированному белку, аллельным вариантам белка и консервативным аминокислотным заменам в белке. Используемые здесь термины «белок» или «полипептид» относятся к белку-рецептору Иодо, который имеет аминокислотную последовательность человека, описанную 8ЕЦ ГО N0: 2, или аминокислотную последовательность мыши, описанную 8ЕЦ ГО N0: 4. «Белок» или «полипептид» также относится к пептидам, идентифицированным как пептидные агенты рецептора Иодо, которые имеют аминокислотные последовательности, описанные 8ЕЦ ГО N0: 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20. Изобретение также включает встречающиеся в природе аллельные варианты и белки, которые имеют аминокислотную последовательность, слегка отличающую от тех, что специфично перечислены выше. Аллельные варианты, хотя обладают аминокислотной последовательностью, слегка отличающейся от тех, что специфично перечислены выше, тем не менее, имеют ту же или сходную биологическую функцию, ассоциированную с белками-рецепторами Иодо человека и мыши и пептидными агентами рецептора Иодо, описанными 8ЕЦ ГО И0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20.

Используемый здесь термин «семейство белков, родственных белкам-рецепторам Иодо», относится к белкам, которые выделены из организмов в дополнение к людям и мышам. Способы, используемые для идентификации и выделения других членов семейства белков, родственных белкам-рецепторам Иодо, описаны ниже.

Белки и пептидные агенты - рецепторы Иодо - по настоящему изобретению находятся предпочтительно в изолированной форме. При использовании здесь белок или лиганд называют изолированным, когда для отделения белка от клеточных составляющих, которые в норме ассоциированы с белком, привлекают физические, механические и химические способы. Специалист в данной области может легко применить стандартные способы очистки для получения изолированного белка или лиганда.

Белки по настоящему изобретению далее включают консервативные варианты белков и лигандов, описанных здесь. Используемый здесь термин «консервативный вариант» относится к изменениям в аминокислотной последовательности, которые не оказывают неблагоприятного влияния на биологические функции белка. Г оворят, что замена, вставка или делеция неблагоприятно влияют на белок, когда у измененной последовательности предотвращена или нарушена функция, ассоциированная с белком. Например, общий заряд, структура или гидрофобно-гидрофильные свойства белка могут изменяться без неблагоприятного влияния на биологическую активность. Соответственно, аминокислотная последовательность может быть изменена, например, для приведения пептида в более гидрофобное или гидрофильное состояние, без неблагоприятного влияния на типы биологической активности белка.

Обычно аллельные варианты, варианты с консервативными заменами и члены белкового семейства обладают аминокислотной последовательностью, имеющей по крайней мере 75%-ную идентичность последовательности с человеческими и мышиными последовательностями, заданными 8ЕЦ ГО И0: 2, 4, 8,

- 6 008480

10, 12, 14, 16, 18 или 20, более предпочтительно по крайней мере 80%-ную, даже более предпочтительно по крайней мере 90%-ную и наиболее предпочтительно 95%-ную идентичность. Идентичность или гомология в отношении таких последовательностей определяется здесь как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными таковым в известных пептидах после выравнивания последовательностей и, если необходимо, введения вставок для достижения максимальной процентной гомологии, и не считая любые консервативные замены частью идентичности последовательности. Ν-концевые, С-концевые или внутренние расширения, делеции или инсерции в пептидной последовательности считаются не влияющими на гомологию.

Таким образом, белки и пептиды по настоящему изобретению включают молекулы, включающие аминокислотные последовательности 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, их фрагменты, имеющие последовательность из следующих друг за другом по крайней мере 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или более аминокислотных остатков белков и пептидных агентов - рецепторов Νο^ο; варианты аминокислотной последовательности таких последовательностей, где по крайней мере один аминокислотный остаток вставлен с Ν- или С-конца, или внутри описанных последовательностей: варианты аминокислотной последовательности таких последовательностей или их фрагменты, как определено выше, которые замещены другим остатком. Рассмотренные варианты далее включают те, что содержат предварительно определенные мутации, полученные, например, путем гомологичной рекомбинации, сайт-специфического или ПЦР-мутагенеза, и соответствующие белки других видов животных, включая в качестве неограничивающих примеров кроличьи, крысиные, свиные, бычьи, овечьи, лошадиные белки и белки видов приматов, кроме человека, аллели или другие встречающиеся в природе варианты семейства белков; и производные, где белок был ковалентно модифицирован путем замещения химическими, ферментными или другими подходящими средствами группой, отличной от встречающихся в природе аминокислот (например, детектируемой группой, такой как фермент или радиоизотоп).

Как описано ниже, члены семейства белков могут использоваться: (1) для идентификации средств, которые модулируют по крайней мере один тип активности белков; (2) для способов идентификации связывающих партнеров белка; (3) в качестве антигена для получения поликлональных и моноклональных антител и (4) в качестве терапевтического средства.

В. Молекулы нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение далее относится к молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют белки и пептиды, включающие аминокислотные последовательности 8ΕΟ ΙΌ ΝΟ: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 или 20, и описанные здесь родственные белки, предпочтительно в изолированной форме. Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» включает геномную ДНК, кДНК, мРНК и антисмысловые молекулы, так же, как нуклеиновые кислоты, основанные на альтернативных скелетах или включающие альтернативные основания, выделенные из природных источников или синтезированные.

Гомологию или идентичность определяли посредством анализа ВЬА8Т (Ва§1с Ьоеа1 Айдитеи! 8еагсй Тоо1) с использованием алгоритма, задействованного программами Ыа§!р, Ыак'и, Ыа§!х, !Ыа§!и и !Ыак!х (Каг1ш е! а1., (1990) Ргос. Асаб. 8с1. И8А 87, 2264-2268 аиб А118сйи1, (1993) 1. Мо1. Ενοί. 36,

290-300, полностью включено в качестве ссылок), которые предназначены для поиска сходства последовательностей. Подход, использованный программой ВЬА8Т, представляет собой, во-первых, распознавание сходных сегментов между запрашиваемой последовательностью и последовательностью из базы данных, затем оценку статистической значимости всех совпадающих пар, которые были идентифицированы, и, наконец, суммирование только тех совпадающих пар, которые удовлетворяют предварительно выбранному уровню значимости. Для обсуждения основных вопросов поиска сходства в базах данных последовательностей см. А118сйи1 е! а1., (1994) №1Шге Оеиейск 6, 119-129, которое полностью включено в качестве ссылки. Параметры поиска «Ык'одгат», «бекспрйоик», «аНдитеи'к», «ехрес!» (т.е. уровень статистической значимости для сообщаемых совпадений по отношению к последовательностям базы данных), «си!о££», «та!пх» и «П11ег» совпадали с таковыми по умолчанию. Использованная по умолчанию матрица счета, использованная Ыа§!р, Ыа§!х, !Ыа8!и, и !Ыа§1х, представляла собой матрицу ВЕО8ИМ62 (Нешко££ е! а1., (1992) Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 89, 10915-10919, полностью включено в качестве ссылки). Четыре параметра ЫаЧи настраивали следующим образом: р=10 (штраф за создание вставки); В=10 (штраф за продолжение вставки); \νίπ1<=1 (генерирует словесные сноски в каждой позиции «мерцания» (λνίπΕ¹') по запросу); и дар^=16 (устанавливает ширину окна, внутри которого генерируются выравнивания со вставками). Эквивалентные установки параметров В1ак!р составляли 0=9; К=2; ^1ик=1; и дар^=32. Сравнение последовательностей посредством ВеЧПт доступной в пакете ССС, версия 10.0, использует параметры для ДНК, составляющие САР=50 (штраф за создание вставки) и ΕΕΝ=3 (штраф за продолжение вставки), и эквивалентные параметры для сравнения белков равны САР=8 и ΕΕΝ=2.

Используемый здесь термин «условия высокой жесткости» означает гибридизацию при 42°С в присутствии 50% формамида, с последующей первой отмывкой при 65°С 2х88С, содержащим 1% 8Ό8, с последующей второй промывкой при 65°С 0,1х88С.

При использовании здесь говорят, что молекула нуклеиновой кислоты является «изолированной», когда молекула нуклеиновой кислоты, по существу, отделена от контаминантной нуклеиновой кислоты, кодирующей другие полипептиды из источника нуклеиновой кислоты.

- 7 008480

Настоящее изобретение далее относится к фрагментам кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Используемый здесь термин «фрагмент кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты» относится к части целой последовательности, кодирующей белок. Размер фрагмента определяется предназначенным способом применения. Например, если фрагмент выбран таким образом, что он должен кодировать активную часть белка, необходимо, чтобы фрагмент был достаточно большим для кодирования функционального региона(-ов) белка. Если фрагмент подлежит использованию в качестве зонда нуклеиновой кислоты или праймера для ПЦР, тогда выбирают длину фрагмента так, чтобы получить относительно малое количество ложноположительных результатов во время зондирования/использования праймера.

Фрагменты кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению (т.е. синтетические олигонуклеотиды), которые используются в качестве зондов или специфических праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для синтеза генных последовательностей, кодирующих белки по изобретению, могут быть легко синтезированы посредством химических технологий, например фосфотриэфирным способом по Майеисс1 е! а1., (1981) 1. Ат. Сйет. 8ос. 103, 3185-3191, или с использованием способов автоматического синтеза. Кроме того, большие сегменты ДНК могут быть легко получены хорошо известными способами, такими как синтез группы олигонуклеотидов, которые определяют различные модульные сегменты гена, с последующим лигированием олигонуклеотидов для построения полного модифицированного гена.

Кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут далее быть модифицированы так, что они будут содержать детектируемую метку для целей диагностики и зондирования. Такие разнообразные метки известны в данной области и могут легко задействоваться с описанными здесь кодирующими молекулами. Подходящие метки включают в качестве неограничивающих примеров биотин, радиоактивно меченные нуклеотиды и т.п. Специалист в данной области может применить любую из известных в данной области меток для получения меченой кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты.

Модификации самой первичной структуры путем делеции, дополнения или изменения аминокислот, входящих в состав белковой последовательности во время трансляции, могут проводиться без нарушения активности белка. Такие замены или другие изменения приводят к появлению белков, обладающих аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеиновой кислотой, попадающих в предполагаемые рамки настоящего изобретения.

С. Выделение других родственных молекул нуклеиновой кислоты.

Как описано выше, идентификация молекулы нуклеиновой кислоты человека, обладающей 8ЕЦ ГО N0: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19, позволяет специалисту в данной области выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют другие члены семейства белков-рецепторов Νο§ο в дополнение к описанным здесь последовательностям. Далее, описанные в настоящее время молекулы нуклеиновой кислоты позволяют специалисту в данной области выделять молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют другие члены семейства белков-рецепторов Νο§ο и пептидные агенты.

По существу, специалист в данной области может легко использовать аминокислотные последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20 или их содержащие эпитопы фрагменты для получения зондов-антител для скрининга экспрессионных библиотек, полученных из подходящих клеток. Поликлональные антитела из таких млекопитающих, как кролики, иммунизированные очищенным белком (как описано ниже), или моноклональные антитела обычно могут применяться для зондирования кДНК млекопитающих или геномных экспрессионных библиотек, таких как библиотека лямбда д!.11, для получения подходящей кодирующей последовательности других членов семейства белков.

Клонированная последовательность кДНК может экспрессироваться в качестве белка слияния, экспрессироваться непосредственно с использованием его собственных последовательностей контроля или экспрессироваться посредством конструкций, использующих последовательности контроля конкретного хозяина, использованного для экспрессии фермента.

Альтернативно, часть описанной здесь кодирующей последовательности может синтезироваться и применяться в качестве зонда для обнаружения ДНК, кодирующей член белкового семейства, в любом организме млекопитающего. Олигомеры, содержащие, например, примерно 18-20 нуклеотидов (кодирующие отрезок примерно в 6-7 аминокислот), могут быть получены и использованы для скрининга геномной ДНК или библиотек кДНК с получением гибридизации в жестких условиях или условиях с жесткостью, достаточной для элиминации недолжного уровня ложноположительных результатов.

Кроме того, могут быть получены пары олигонуклеотидных праймеров для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с целью селективного клонирования кодирующей молекулы нуклеиновой кислоты. Цикл ПЦР «денатурация/отжиг/удлинение» для применения таких праймеров ПЦР хорошо известен в данной области и может быть легко адаптирован для применения с целью выделения других кодирующих молекул нуклеиновой кислоты.

Ό. Молекулы рекомбинантной ДНК, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение далее относится к молекулам рекомбинантной ДНК (рДНК), которые содержат кодирующую последовательность. Используемый здесь термин «рДНК» представляет молекулу ДНК, которая подвергалась молекулярным манипуляциям. Способы получения молекул рДНК хорошо

- 8 008480 известны в данной области, например см. ЗатЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬота1оту Мапиа1, Со16 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту Рге§8. В предпочтительных молекулах рДНК кодирующая последовательность ДНК функционально связана с последовательностями контроля экспрессии и векторными последовательностями.

Выбор векторных последовательностей и последовательностей контроля экспрессии, с которыми функционально связывается одна из последовательностей, кодирующих белок белкового семейства по настоящему изобретению, зависит, как хорошо известно в данной области, непосредственно от требуемых функциональных свойств (например, экспрессии белка и клетки-хозяина, подлежащей трансформации). Вектор по настоящему изобретению может быть, по крайней мере, способным направлять репликацию или вставку в хромосому хозяина структурного гена, входящего в состав молекулы рДНК, и предпочтительно также его экспрессию.

Элементы контроля экспрессии, которые используются для регуляции экспрессии функционально связанной последовательности, кодирующей белок, известны в данной области и включают в качестве неограничивающих примеров индуцируемые промоторы, конститутивные промоторы, секреторные сигналы и другие регуляторные элементы. Предпочтительно индуцируемый промотор легко контролируется, как отвечающий на наличие питательного вещества в среде для клетки-хозяина.

В одном из осуществлений вектор, содержащий кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты, включает прокариотический репликон, т.е. последовательность ДНК, обладающую способностью к направлению автономной репликации и поддержанию молекулы рекомбинантной ДНК внехромосомно в прокариотической клетке-хозяине, такой как прокариотическая клетка-хозяин, транформированной ею. Такие репликоны хорошо известны в данной области. Кроме того, векторы, которые включают прокариотический репликон, могут также включать ген, экспрессия которого предоставляет детектируемый маркер, такой как лекарственная устойчивость. Обычными генами бактериальной лекарственной устойчивости являются те, что предоставляют устойчивость к ампициллину или тетрациклину.

Векторы, которые включают прокариотический репликон, могут далее включать прокариотический промотор или промотор бактериофага, способный направлять экспрессию (транскрипцию и трансляцию) кодирующих генных последовательностей в бактериальной клетке-хозяине, такой как Е. со11. Промотор представляет собой элемент контроля экспрессии, образованный последовательностью ДНК, которая обеспечивает связывание РНК-полимеразы и то, что транскрипция происходит. Промоторные последовательности, совместимые с бактериальными хозяевами, обычно обеспечиваются в плазмидных векторах, содержащих удобные сайты рестрикции для вставки сегмента ДНК по настоящему изобретению. Примерами таких векторных плазмид являются рИС8, рИС9, рВК.322 и рВК.329 (Вютаб ЕаЬотаФпек), рРЬ и рКК223 (Рйаттас1а). Любой подходящий прокариотический хозяин может использоваться для экспрессии молекулы рекомбинантной ДНК, кодирующей белок по изобретению.

Экспрессирующие векторы, совместимые с эукариотическими клетками, предпочтительно те, что совместимы с клетками позвоночных, также могут использоваться для получения молекул рДНК, которые содержат кодирующие последовательности.

Экпрессирующие векторы эукариотических клеток хорошо известны в данной области и доступны из некоторых коммерческих источников. Обычно такие векторы предоставляются с содержанием удобных сайтов рестрикции для вставки требуемого сегмента ДНК. Примерами таких векторов являются р8УЪ и рК8У-10 (Рйаттас1а), рВРУ-1, рМЬ2б (1п1ета1юпа1 Вю1ес1то1още5). ρΤΏΤ1 (АТСС 31255) и подобные эукариотические экспрессирующие векторы.

Экспрессирующие векторы эукариотических клеток, использованные для конструирования молекул рДНК по настоящему изобретению, могут далее включать избирательный маркер, который эффективен в эукариотической клетке, предпочтительно селективный маркер лекарственной устойчивости. Предпочтительный маркер лекарственной устойчивости представляет собой ген, экспрессия которого приводит к устойчивости к неомицину, например ген неомицинфосфотрансферазы (пео) (8он1Негп е! а1., (1982) 1. Мо1. Апа1. СепеБ 1, 327-341). Альтернативно, селективный маркер может присутствовать в отдельной плазмиде, два вектора могут вводиться путем совместной трансфекции в клетку-хозяина, и трансфицированные клетки отбираются путем культивирования с подходящим лекарственным средством в качестве селективного маркера.

Е. Клетки-хозяева, содержащие введенную извне кодирующую молекулу нуклеиновой кислоты.

Настоящее изобретение далее относится к клеткам-хозяевам, трансформированным молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок по настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической.

Эукариотические клетки, которые могут использоваться для экспрессии белка по изобретению, не ограничиваются при условии того, что клеточная линия совместима со способами клеточной культуры и совместима с воспроизведением экспрессирующего вектора и экспрессией генного продукта. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в качестве неограничивающих примеров клетки дрожжей, насекомых и млекопитающих предпочтительно клетки позвоночных, такие как клеточные линии мыши, крысы, обезьяны или человека. Примеры применимых эукариотических клеток-хозяев включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), доступные от АТСС как ССБ61, клетки мышиного эм

- 9 008480 бриона ΝΙΗ 8^155 ΝΙΗ-3Τ3, доступные от АТСС как СКЬ1658, клетки почки новорожденного хомячка (ВНК) и подобные клеточные линии культур эукариотических тканей.

Трансформация подходящих клеток-хозяев молекулой рДНК по настоящему изобретению выполняется хорошо известными способами, которые обычно зависят от типа использованного вектора и задействованной системы хозяина. В отношении трансформации прокариотической клетки-хозяина могут применяться способы электропорации и солевой обработки (см., например, 8атЬтоок с1 а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, Со1й 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Ргезз; Сойеп с1 а1., (1972) Ргос. №11. Асай. 8с1. И8А 69, 2110-2114). В отношении трансформации клеток позвоночных векторами, содержащими рДНК, могут применяться способы электропорации, обработки катионными липидами и солевой обработки (см., например, Сгайат е1 а1., (1973) Уно1оду 52, 456-467; А1д1ег е1 а1., (1979) Ргос. №ΐ1. Асай. 8с1. И8А 76, 1373-1376).

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу рДНК по настоящему изобретению, могут быть идентифицированы хорошо известными способами, включающими отбор при помощи селективного маркера. Например, клетки, полученные в результате введения рДНК по настоящему изобретению, могут быть клонированы с получением единичных колоний. Клетки из данных колоний могут отбираться, лизироваться, и содержание их ДНК может проверяться на предмет наличия рДНК с использованием способа, такого как описанный 8ои111егп. (1975) 1. Мо1. Бю1. 98, 503-517, или белки, продуцированные клетками, могут анализироваться иммунологическим способом.

Р. Продукция рекомбинантных белков с использованием молекулы рДНК.

Настоящее изобретение далее относится к способам продукции белка по изобретению с использованием описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты. В общих терминах продукция рекомбинантной формы белка обычно включает следующие стадии.

Вначале получают молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок по изобретению, такой как молекула нуклеиновой кислоты, описанная 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1, 3, 7, 9, 11, 13, 15, 17 и 19 или нуклеотидами 166-1584 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 1 и нуклеотидами 178-1596 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 3. Если кодированная последовательность не прерывается интронами, то она непосредственно подходит для экспрессии в любом хозяине.

Тогда молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно помещается в функциональной связи с подходящими последовательностями контроля, как описано выше, для получения экспрессионной единицы, содержащей открытую рамку считывания белка. Экспрессионную единицу используют для трансформации подходящего хозяина, а трансформированный хозяин культивируют в условиях, обеспечивающих продукцию рекомбинантного белка. Необязательно, рекомбинантный белок выделяют из среды или из клеток; выделение или очистка белка может в некоторых случаях, когда примеси допустимы, не понадобиться.

Каждая из указанных выше стадий может быть осуществлена множеством способов. Например, желаемые кодирующие последовательности могут быть получены из фрагментов генома и непосредственно использованы в подходящих хозяевах.

Конструирование экспрессирующих векторов, функциональных во множестве хозяев, осуществляют, используя подходящие репликоны и контрольные последовательности, приведенные выше. Контрольные последовательности, экспрессирующие векторы и способы трансформации, зависят от типа клетки-хозяина, применяемой для экспрессии гена, и подробно обсуждались выше. Подходящие сайты рестрикции, если таковые отсутствуют исходно, могут быть добавлены на концы кодирующей последовательности для обеспечения встраивания вырезаемого гена в данные векторы. Квалифицированный специалист может с легкостью приспособить известные в данной области хозяин/экспрессирующую систему для использования с молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для продукции рекомбинантного белка.

С. Способы идентификации партнеров связывания.

Настоящее изобретение относится к способам использования белков по настоящему изобретению для выделения и идентификации партнеров связывания. В некоторых осуществлениях белок по настоящему изобретению смешивают с потенциальным партнером связывания или экстрактом или фракцией клетки в условиях, обеспечивающих связывание потенциальных партнеров связывания с белком по настоящему изобретению. После смешивания пептиды, полипептиды, белки и другие молекулы, связавшиеся с белком по настоящему изобретению, выделяют из смеси. Партнер связывания, связавшийся с белком по настоящему изобретению, может быть затем отделен и подвергнут дополнительному анализу. Для идентификации и выделения партнера связывания может быть применен полноразмерный белок, например полноразмерный белок рецептора №§о 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 2 или 4 либо полноразмерный белок №§о 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 6. Альтернативно, может быть использован фрагмент белка. Примером применимого фрагмента белка рецептора №§о является растворимый полипептид рецептора №до, не содержащий трансмембранного домена (фиг. 7).

Используемый здесь термин «клеточный экстракт» относится к препарату или фракции, которые получены из лизированных или разрушенных клеток. Предпочтительным источником клеточных экстрактов являются клетки, выделенные из ткани человеческого головного или спинного мозга, например ткани головного мозга человека. Альтернативно, клеточные экстракты могут быть получены из любого

- 10 008480 источника нервной ткани или доступных линий нервных клеток, в частности клеточных линий, происходящих от олигодендроцитов.

Для получения экстракта клетки могут использоваться разнообразные способы. Клетки могут быть разрушены с использованием физических или химических способов разрушения. Примеры физических способов разрушения включают в качестве неограниченных примеров обработку ультразвуком и механическим сдвигом. Примеры химических способов лизиса включают в качестве неограниченных примеров лизис детергентами и ферментативный лизис. Специалист в данной области может легко адаптировать способы подготовки клеточных экстрактов для получения экстрактов для применения по настоящим способам.

Как только получают экстракт клетки, экстракт смешивают с белком по изобретению при условиях, в которых может происходить ассоциация белка со связывающими партнерами. Могут использоваться разнообразные условия, причем наиболее предпочтительными являются условия, которые приближаются к условиям, обнаруженным в цитоплазме клетки человека. Такие свойства, как осмолярность, рН, температура и концентрация используемого клеточного экстракта, могут варьировать для оптимизации ассоциации белка со связывающим партнером.

После смешивания в подходящих условиях связанный комплекс отделяют от смеси. Для разделения смеси могут задействоваться различные способы. Например, для иммунопреципитации комплекса со связывающим партнером могут использоваться антитела, специфичные по отношению к белку по изобретению. Альтернативно, могут применяться стандартные способы химического разделения, такие как хроматография и седиментационное центрифугирование в градиенте плотности.

После удаления неассоциированных клеточных составляющих, находящихся в экстракте, связывающий партнер может диссоциироваться из комплекса с использованием общепринятых способов. Например, диссоциацию могут осуществлять путем изменения концентрации соли или рН смеси.

Для облегчения разделения ассоциированных пар связывающих партнеров в смешанном экстракте белок по изобретению может иммобилизироваться на твердой основе. Например, белок может привязываться к нитроцеллюлозному матриксу или акриловым гранулам. Идентифицированные связывающие партнеры могут представлять собой как отдельный белок, так и комплекс, состоящий из двух или более белков. Альтернативно, связывающие партнеры могут идентифицироваться с использованием анализа на основе слияния с щелочной фосфатазой согласно процедурам по Нападал & Уапбетйаедйеп, (1998) Аппи. Неу. №иго5С1. 21, 309-345 или ТакайазЫ е! а1., (1999) Се11 99, 59-69; путем «Дальневосточного» (РатХУеЧегп) анализа согласно процедурам по Такауата е! а1., (1997) Ме!йоб§ Мо1. Βίο1. 69, 171-184 или 8аибет е! а1., 1. Сеп. У1то1. (1996) 77, 991-996, или идентифицироваться путем применения меченных эпитопом белков или белков слияния с С8Т.

Альтернативно, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут использоваться в дрожжевой двухгибридной системе. Дрожжевая двухгибридная система была использована для идентификации других пар белковых партнеров и может быть легко адаптирована для привлечения описанных здесь молекул нуклеиновой кислоты (см. двухгибридную систему 81та1адепе НуЬпхар¹'').

Н. Способы идентификации средств, модулирующих экспрессию.

Настоящее изобретение относится к способам идентификации средств, модулирующих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор Иодо. Настоящее изобретение также относится к способам идентификации средств, модулирующих экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок Иодо. Такие способы анализа могут задействовать любые доступные средства мониторинга изменений уровня экспрессии нуклеиновых кислот по изобретению. При использовании здесь о средстве говорят как о модулирующем экспрессию нуклеиновой кислоты по изобретению, например нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий последовательностью 8ЕО ГО N0: 2, 4 или 6, если он способен регулировать повышение или снижение экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке.

В одном из форматов анализа могут быть получены клеточные линии, которые содержат слияния с геном-репортером открытой рамки считывания, заданной нуклеотидами 166-1584 из 8Е0 ГО N0: 1, или нуклеотидами 178-1596 из 8Е0 ΙΌ N0: 3, или нуклеотидами 135-3713 из 8Е0 ГО N0: 5, и любой анализируемый партнер для слияния. Многие анализируемые партнеры для слияния известны и легкодоступны, включая ген люциферазы светляка и ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу (А1ат е! а1., (1990) Апа1. Вюсйет. 188, 245-254). Клеточные линии, содержащие гены-репортеры, затем подвергаются действию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и в течение подходящего времени. Различие в уровне экспрессии гена-репортера между образцами, подвергшимися действию средства, и контрольными образцами приводит к идентификации средства, которое модулирует экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, обладающий последовательностью 8Е0 ГО N0: 2, 4 или 6.

Дополнительные форматы анализа могут использоваться для мониторинга способности средства модулировать экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор №до по изобретению, такой как белок, обладающий аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 2 или 4, или белок №до. обладающий аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 6. Например, экспрессия мРНК может отслеживаться непосредственно путем гибридизации с нуклеиновой кислотой по изобретению. Клеточные линии подвергают действию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и

- 11 008480 в течение подходящего времени и выделяют общую РНК или мРНК путем стандартных процедур, таких как те, что описаны 8атЬгоок с1 а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, СоИ 8ргтд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге§8.

Зонды для детекции различий в уровне экспрессии РНК между клетками, подвергшимися действию средства, и контрольными клетками могут быть получены из нуклеиновой кислоты по изобретению. Предпочтительным, но не необходимым, является конструирование зондов, которые гибридизуются только с целевой нуклеиновой кислотой в условиях высокой жесткости. Только высококомплементарные продукты гибридизации нуклеиновых кислот образуются в условиях высокой жесткости. Соответственно, жесткость условий анализа определяет степень комплементарности, которая должна существовать между двумя цепями нуклеиновой кислоты для образования гибридной молекулы. Жесткость должна выбираться так, чтобы максимизировать различие в стабильности продукта гибридизации «зонд - мишень» и потенциального продукта гибридизации «зонд - участок, не являющийся мишенью».

Зонды могут конструироваться из нуклеиновых кислот по изобретению способами, известными в данной области. Например, содержание С+С в зонде и длина зонда могут влиять на связывание зонда с его целевой последовательностью. Способы оптимизации специфичности зонда обычно доступны по 8атЬгоок е1 а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1Ь 8ргшд НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге§8, или по Аи8иЬе1 е1 а1., (1995) СиггеШ РгоЮсоЬ т Мо1еси1аг Вю1оду, Сгеепе РиЬЬкЫпд.

Условия гибридизации модифицируют с использованием известных способов, таких как те, что описаны 8атЬгоок е1 а1., (1989) или Аи8иЬе1 е1 а1., (1995), как это требуется для каждого зонда. Гибридизацию общей клеточной РНК или РНК с обогащенной фракцией ро1уА-РНК можно осуществлять в любом доступном формате. Например, общую клеточную РНК или РНК с обогащенной фракцией ро1уА+РНК можно зафиксировать на твердой основе и подвергать твердую основу воздействию по крайней мере одного зонда, включающего по крайней мере одну или часть одной из последовательностей по изобретению, при условиях, в которых будет происходить специфическая гибридизация зонда.

Альтернативно, фрагменты нуклеиновой кислоты, включающие по крайней мере одну или часть одной из последовательностей по изобретению, могут фиксироваться на твердой основе, такой как пластина на основе силикона или пластина пористого стекла. Пластина затем может подвергаться воздействию общей клеточной РНК или РНК с обогащенной фракцией ро1уА+РНК из образца в условиях, в которых будет происходить специфическая гибридизация зафиксированной последовательности. Такие пластины и способы гибридизации широко доступны, например те, что описаны ВеаШе. (1995) \У0 9511755. Средства, которые регулируют экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей белок-рецептор Иодо, обладающий последовательностью 8ЕЦ ΙΌ И0: 2 или 4, путем повышения или снижения экспрессии, идентифицируют путем оценки способности данного зонда к специфической гибридизации с образцом РНК из необработанной популяции клеток и из популяции клеток, подвергшихся воздействию средства.

Гибридизация с целью качественного или количественного анализа мРНК также может проводиться с использованием анализа защиты от РНКаз (т.е. ЯРА, см. Ма е1 а1., Ме11ю05 (1996) 10, 273-238). В кратком изложении экспрессионный носитель, содержащий кДНК, кодирующую генный продукт и промотор для фагоспецифической ДНК-зависимой РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы Т7, Т3 или 8Р6), линеаризуют с З'-конца молекулы кДНК, ниже фагового промотора, где такая линеаризованная молекула впоследствии используется в качестве шаблона для синтеза меченого антисмыслового транскрипта кДНК путем транскрипции ш νίΙΐΌ. Меченый транскрипт затем подвергают гибридизации со смесью изолированной РНК (т.е. общей или фракционированной мРНК) путем инкубации при 45°С в течение ночи в буфере, содержащем 80% формамид, 40 мМ Р1ре8, рН 6,4, 0,4М ИаС1 и 1 мМ ЭДТА. Полученные в результате продукты гибридизации затем расщепляли в буфере, содержащем 40 мкг/мл рибонуклеазы А и 2 мкг/мл рибонуклеазы. После дезактивации и экстракции избыточного белка образцы загружали в полиакриламидный гель с мочевиной для анализа.

В другом формате анализа средств, которые воздействуют на экспрессию конкретного генного продукта, вначале идентифицируют клетки или клеточные линии, которые экспрессируют указанные генные продукты физиологически. Ожидается, что клетки и клеточные линии, идентифицированные таким образом, должны включать необходимый клеточный аппарат, так что будет достигаться правильная модуляция транскрипционного аппарата при экзогенном контакте средства с подходящими механизмами трансдукции с поверхности и цитозольными каскадами. Далее, такие клетки или клеточные линии должны подвергаться трансдукции или трансфекции экспрессирующей несущей конструкцией (например, плазмидой или вирусным вектором), включающей дееспособный нетранслируемый 5'-промотор, содержащей конец структурного гена, кодирующего конкретный генный продукт, слитый с одним или несколькими антигенными фрагментами, являющимися специфическими для конкретных генных продуктов, где указанные фрагменты находятся под транскрипционным контролем указанного промотора и экспрессируются в качестве полипептидов, молекулярная масса которых может отличаться от встречающихся в природе полипептидов и может, кроме того, включать иммунологически отличную метку. Такой способ хорошо известен в данной области (см. 8атЬгоок е1 а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога1огу Мапиа1, СоИ 8рппд НагЬог ЬаЬога1огу Ргекк).

Клетки или клеточные линии, трансдуцированные или трансфицированные, как описано выше, за

- 12 008480 тем должны контактировать со средствами в подходящих условиях; например, средство включает фармацевтически приемлемый наполнитель и контактирует с клетками в водном физиологическом буфере, таком как фосфатно-солевой буфер (РВ8) при физиологическом значении рН, сбалансированный солевой раствор Игла (Еад1ез; В88) при физиологическом значении рН, РВ8 или В88, включающие сыворотку, или кондиционированные среды, включающие РВ8 или В88 и сыворотку, с инкубацией при 37°С. Солевые условия могут модулироваться так, как сочтет нужным специалист в данной области. После контакта клеток со средством указанные клетки разрушают и фракционируют полипептиды из продукта разрушения таким образом, что белковую фракцию объединяют и подвергают контакту с антителом, что далее подлежит иммунологическому анализу (например, ЕЬ18А, иммунопреципитация или вестерн-блот).

Совокупность белков, выделенных из образца, «контактировавшего со средством», сравнивают с контрольным образцом, где с клетками контактировал только наполнитель, и повышение или снижение иммунологически генерированного сигнала образца, «контактировавшего с средством», по сравнению с контрольным образцом используют для характеристики эффективности средства.

I. Способы идентификации средств, которые модулируют активность.

Настоящее изобретение относится к способам идентификации средств, которые модулируют по крайней мере один тип активности белка-рецептора Иодо. Изобретение также относится к способам идентификации средств, которые модулируют по крайней мере один тип активности белка Иодо. Такие способы анализа могут задействовать любые средства мониторинга или детекции требуемой активности.

В одном из форматов может анализироваться специфическая активность белка-рецептора Иодо или белка Иодо, нормализованная относительно стандартной единицы, в сравнении между клеточной популяцией, подвергшейся воздействию средства, подлежащего тестированию, и не подвергавшейся воздействию контрольной клеточной популяцией. Клеточные линии или популяции подвергаются воздействию средства, подлежащего тестированию, в подходящих условиях и в течение подходящего времени. Из подвергшейся воздействию клеточной линии или популяции и контрольной, не подвергавшейся воздействию клеточной линии или популяции могут быть получены клеточные лизаты. Затем клеточные лизаты анализируют посредством зонда.

Зонды на основе антител могут быть получены путем иммунизации подходящих хозяев-млекопитающих при задействовании подходящих протоколов иммунизации, с использованием белка-рецептора Иодо, белка Иодо, пептидных агентов рецептора Иодо или антигенсодержащих фрагментов любого из перечисленных. Для усиления иммуногенности данные белки или фрагменты могут конъюгироваться с подходящими носителями. Способы получения иммуногенных конъюгатов с такими носителями, как В8А, КЬН, или другими носителями хорошо известны в данной области. В некоторых обстоятельствах может быть эффективным прямое конъюгирование с использованием, например, карбодиимидных реагентов; в других случаях может быть желательным применение связывающих реагентов, таких как поставляемые Р1егсе СНет1са1 Со., для обеспечения доступности гаптена. Гаптенные пептиды могут быть продолжены с И- или С-конца цистеиновым остатком или иметь в промежутках цистеиновые остатки, например, для облегчения связывания носителя. Введение иммуногенов проводится, главным образом, путем инъекции через подходящий период времени и с использованием подходящих адъювантов, как, в основном, принято в данной области. Во время выполнения регламента иммунизации анализируют титры антител для определения адекватности образования антител.

Хотя поликлональные антитела, получаемые таким образом, могут быть удовлетворительными для некоторых применений, для фармацевтических композиций предпочтительным является использование моноклональных препаратов. Линии иммортализованных клеток, которые секретируют требуемые моноклональные антитела, могут быть получены с использованием стандартных способов, см., например, КоН1ег & М11з!ет, (1992) Вю!есйпо1оду 24, 524-526, или модификаций, которые действуют за счет иммортализации лимфоцитов или клеток селезенки, как широко известно. Линии иммортализованных клеток, секретирующие требуемые антитела, могут подвергаться скринингу путем иммунологического анализа, в котором антиген представляет собой пептидный гаптен, полипептид или белок. Когда идентифицируют подходящую культуру иммортализованных клеток, секретирующую требуемое антитело, клетки могут культивироваться ш νίΙΐΌ или путем продукции асцитной жидкости.

Требуемые моноклональные антитела могут извлекаться из культурального супернатанта или из асцитного супернатанта. Интактные антитела против Иодо или рецептора Иодо или их фрагментов, содержащих иммунологически значимую часть, могут применяться, например, в качестве антагонистов связывания Иодо (лиганда) с рецептором Иодо. Применение иммунологически реактивных фрагментов, таких как фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' из Е(аЬ')₂, часто является предпочтительным, особенно в контексте терапии, поскольку данные фрагменты обычно менее иммуногенны, чем целый иммуноглобулин.

Антитела или фрагменты могут также продуцироваться с использованием современной технологии рекомбинантными средствами. Регионы антитела, которые специфично связываются с требуемыми регионами белка, могут также продуцироваться в контексте химер с многовидовым происхождением.

Регионы антитела, которые специфично связываются с требуемыми регионами белка, могут также продуцироваться в контексте химер с многовидовым происхождением, например гуманизированные антитела. Поэтому антитело может быть гуманизированным антителом или человеческим антителом, как

- 13 008480 описано в патенте США 5585089 или Кгесйтапп еί а1., (1988) 332, 323-327.

Средства, которые анализируют вышеуказанным способом, могут быть выбраны случайным образом или выбраны или сконструированы рационально. При использовании здесь о средстве говорят как о случайным образом выбранном, когда средство выбирают случайно без рассмотрения специфических последовательностей, вовлеченных в ассоциацию одного белка по изобретению или с ассоциированными с ним субстратами, связывающими партнерами и т.д. Примером случайно выбранных средств является применение химической библиотеки, или пептидной комбинаторной библиотеки, или питательного бульона организма.

При использовании здесь о средстве говорят как о выбранном или сконструированном рационально, когда средство выбирают на неслучайной основе, беря в расчет последовательность сайта-мишени или его конформацию в связи с действием средства. Средства могут рационально выбираться или рационально конструироваться путем привлечения белковых последовательностей, которые составляют данные сайты. Например, рационально выбранное пептидное средство может представлять собой пептид, последовательность которого идентична связывающему домену (8Е0 ГО ΝΟ: 20) Νοβο, который взаимодействует с рецептором Νοβο. Альтернативно, это может быть фрагмент связывающего домена, например 8ЕО ГО ΝΟ: 8, 10, 12, 14, 16 или 18.

Средства по настоящему изобретению могут представлять собой, например, пептиды, антитела, фрагменты антител, малые молекулы, производные витаминов, а также углеводы. Пептидные средства по изобретению могут быть получены с использованием стандартных способов твердофазного (или в растворимой фазе) пептидного синтеза, как это известно в данной области. Кроме того, ДНК, кодирующая данные пептиды, может синтезироваться с использованием коммерчески доступного оборудования олигонуклеотидного синтеза и быть получена рекомбинантно с использованием стандартных систем рекомбинантной продукции. Продукция с использованием твердофазного пептидного синтеза является необходимой, если надлежит включить некодируемые генетически аминокислоты.

Другим классом средств по настоящему изобретению являются антитела или их фрагменты, которые связываются с белком Νοβο или белком-рецептором Νοβο. Средства на основе антител могут быть получены путем иммунизации подходящих субъектов-млекопитающих пептидами, содержащими антигенные регионы, причем данные части белка предназначены быть мишенями для антител.

1. Высокопроизводительные способы анализа.

Мощность высокопроизводительного скрининга используется для поиска новых соединений, которые способны взаимодействовать с белком-рецептором Νοβο. Для общей информации по высокопроизводительному скринингу (например, Ое\'1т. (1998) ΗίβΗ ΤΙιΐΌΐίβΙιριιΙ 8сгеешпд, Магсе1 Эеккег; патент США 5763263). Высокопроизводительные способы анализа включают один или несколько разных технологий анализа.

Иммунодиагностика и иммунологические способы анализа.

Иммунодиагностика и иммунологические способы анализа представляют собой группу способов, используемых для измерения специфичных биохимических веществ, обычно в низких концентрациях в сложных смесях, таких как биологические жидкости, которые зависят от специфичности и высокой аффинности, проявляемой подходящим образом полученными и выбранными антителами по отношению к комплементарным им антигенам. Вещество, подлежащее измерению, обязательно должно быть антигенным, или в виде иммуногенной макромолекулы, или гаптенной малой молекулы. К каждому образцу добавляют известное ограниченное количество специфичного антитела, и оценивается связавшаяся с ним доля антигена, часто выражаемая в виде отношения связанный: свободный, с использованием индикатора формы антигена, меченного радиоизотопом (радиоиммунный анализ), флуоресцентной молекулы (иммунофлуоресцентный анализ), стабильного свободного радикала (спиновый иммунологический анализ), фермента (иммуноферментный анализ) или другой легко различимой метки.

Антитела могут быть мечены различными способами, включая сорбционный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А); радиоиммунный анализ (К1А); иммунофлуоресцентный анализ (НА); иммунохемилюминесцентный анализ (СНА); и мечение антитела частицами коллоидного золота (^ттиηοβο1б).

Обычные форматы анализа включают сэндвич-анализ, конкурентный анализ или анализ конкуренции, анализ агглютинации латекса, гомогенный анализ, формат планшетов для микротирования и анализ, основанный на микрочастицах.

Сорбционный иммуноферментный анализ (ЕЬ18А).

ЕЬ18А представляет собой иммунохимический способ, который избегает опасности радиоактивных химикатов и дороговизны флуоресцентных систем детекции. Вместо этого, в анализе используются в качестве индикаторов ферменты. ЕЬ18А представляет собой форму количественного иммунологического анализа, основанного на применении антител (или антигенов), связанных с поверхностью нерастворимого носителя, который затем используется для «захвата» относящегося к делу антигена (или антитела) в растворе тестирования. Затем комплекс «антиген-антитело» детектируется путем измерения активности соответствующего фермента, который предварительно был ковалентно привязан к антигену (или антителу).

Для информации по способам ЕН8А см., например, СгоМйег, (1995) ЕЫ8А - ΤΙκοΐΎ апб Ргасйсе (Мебюбз 1п ΜοΕαιΕίΓ Вю^ду), Нитапа Ргезз; С^аТО^тЬе & Кетепу, (1998) ЕЫ8А апб ОШег 8ο1ί6 Рйазе

- 14 008480

1ттипоа88ау8 - Ткеоге!юа1 апб Ргасйса1 АкресГО Ιοίιη \УПеу; Кетепу, (1991) А Ргасйса1 Сшбе !о ЕЫ8А, Регдатоп Ргекк; ЪЫката, (1991) ийгакепкфуе апб Ρηρίά Епхуте 1ттипоа88ау (ЪаЬога!огу Тес11пк|ие5 ίη Вюскет^Ру апб Мо1еси1аг В1о1оду) Екеу1ег.

Колориметрические способы анализа ферментов.

Колориметрия является тем способом количественного химического анализа, в котором концентрация или количество соединения определяется путем сравнения окраски, продуцируемой реакцией реагента со стандартными и тестируемыми количествами соединения с использованием, например, колориметра или спектрофотометра.

Стандартные колориметрические способы анализа бета-галактозидазной ферментной активности хорошо известны специалистам в данной области (см., например, ΝογΙοπ е! а1., (1985) Мо1. Се11. Βίο1. 5, 281-290). Колориметрический анализ может проводиться на цельноклеточных лизатах с использованием О-нитрофенил-бета-Э-галактопиранозида (0кРС, 81дта) в качестве субстрата в стандартном колориметрическом бета-галактозидазном анализе (8атЬгоок е! а1., (1989) Мо1еси1аг С1ошпд - А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк). Также доступны способы автоматического колориметрического анализа для детекции бета-галактозидазной активности (см., например, патент США 5733720).

Иммунофлуоресцентные способы анализа.

Иммунофлуоресценция или иммунофлуоресцентная микроскопия является способом, в котором антиген или антитело делают флуоресцентным путем конъюгирования с флуоресцентной меткой и затем им позволяют прореагировать с комплементарным антителом или антигеном на срезе или мазке ткани. Локализация антигена или антитела затем может определяться наблюдением флуоресценции путем микроскопии в ультрафиолетовом свете.

Для общей информации по иммунофлуоресцентным способам см., например, Кпарр е! а1., (1978) [ттипоПиоге^сепсе апб Ре1а1еб 81ашшд Тес11пк|ие5. Екеу1ег; А11ап, (1999) Рго!еш БосаК/акоп Ьу Ииогексеп! Мюгоксору - А Ргасйса1 Арргоаск (Тке Ргас!юа1 Арргоаск 8ег1е§) 0хГогб Ишуегайу Ргекк; Саи1, (1993) [ттипоПиоге^сепсе Апйдеп Ое!есйоп Тескпк|ие5 ш О|адпо5Рс МюгоЬю1оду, СатЬпбде Ишуегайу Ргекк. Для детального объяснения иммунофлуоресцентных способов, которые могут применяться по настоящему изобретению, см. патент США 5912176; патент США 5869264; патент США 5866319; и патент США 5861259.

К. Применение средств, модулирующих активность.

Как описано в примерах, белки и нуклеиновые кислоты №до и рецептора №до, такие как белки, обладающие аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО N0: 2, 4 или 6, экспрессируются в миелине, происходящем из аксона и дендритов. Средства, которые модулируют или регулируют повышение или снижение экспрессии №до или белка-рецептора №до, или средства, такие как агонисты или антагонисты по крайней мере одного типа активности №до или белка-рецептора №до, могут использоваться для модулирования биологических и патологических процессов, ассоциированных с функцией и активностью белков. Изобретение, в частности, может использоваться для лечения людей.

Патологические процессы относятся к биологическим процессам, которые имеют вредоносный эффект. Например, экспрессия белка по изобретению может быть ассоциирована с ингибированием регенерации аксонов после черепной, церебральной или спинальной травмы, инсульта или демиелинизирующего заболевания. Такие демиелинизирующие заболевания включают в качестве неограниченных примеров рассеянный склероз, монофазную демиелинизацию, энцефаломиелит, мультифокальную лейкоэнцефалопатию, панэнцефалит, болезнь Маркьяфава-Биньями (МагсЫаГауа-В1дпат1), миелинолизис моста, адренолейкодистрофию, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (Рей/аеш-Мег/Ьасйег), спонгиозную дегенерацию, болезнь Александра (А1ехапбег), болезнь Канавана (Сапауап), метахроматическую лейкодистрофию и болезнь Краббе (КгаЬЬе). При использовании здесь о средстве говорят как о модулирующем патологический процесс, когда средство снижает степень или тяжесть процесса. Например, может предотвращаться демиелинизирующее заболевание или модулироваться прогрессирование заболевания путем введения средств, которые снижают, способствуют или модулируют некоторым образом экспрессию по крайней мере одного типа активности белка по изобретению.

В одном из примеров введение пептидных средств (агентов) на основе №до, показанных 8Е0 ГО N0: 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20, может применяться для лечения демиелинизирующего заболевания, ассоциированного с №до и белком-рецептором №до. В другом примере клетки, которые экспрессируют пептидные средства по изобретению, могут трансплантироваться в место повреждения спинного мозга для облегчения роста аксонов через поврежденный участок. Такие трансплантированные клетки представляют собой средство для восстановления функции спинного мозга после повреждения или травмы.

Еще в одном примере введение растворимого белка-рецептора №до, который связывается с №до, может использоваться для лечения демиелинизирующего заболевания, ассоциированного с №до или с белком-рецептором №до. Данное средство может использоваться для предотвращения связывания №до со связанным с клеткой рецептором №до и действует как антагонист №до. Растворимые рецепторы использовали для связывания цитокинов и других лигандов для регуляции их функции (Ткоткоп, (1998) Су!окше НапбЬоок, Асабетю Ргекк). Растворимый рецептор оказывается в растворе или вне мембраны. Растворимые рецепторы могут возникать в результате отсутствия сегмента молекулы, который пронизы

- 15 008480 вает или ассоциируется с мембраной. Данный сегмент обычно обозначается в данной области как трансмембранный домен гена или мембраносвязывающий сегмент белка. Таким образом, в некоторых осуществлениях изобретения растворимый фрагмент включает фрагмент или аналог мембраносвязанного рецептора. Предпочтительно фрагмент содержит по крайней мере 6, например 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 или 70 аминокислот, что обеспечивает поддержание его требуемой активности.

В других осуществлениях изобретения модифицируют структуру сегмента, который ассоциирован с мембраной (например, полиморфизм последовательности ДНК или мутация в гене), таким образом, что рецептор не вставляется в мембрану или рецептор вставляется, но не остается внутри мембраны. Таким образом, растворимый рецептор, по контрасту с соответствующей мембраносвязанной формой, отличается одним или несколькими сегментами гена белка-рецептора, которые важны для ассоциации с мембраной.

Средства по настоящему изобретению могут предоставляться по одному, или в комбинации, или в последовательной комбинации с другими средствами, которые модулируют конкретный патологический процесс. Например, средство по настоящему изобретению может вводиться в комбинации с противовоспалительными средствами после инсульта как средство для блокирования дальнейшего повреждения нейронов и ингибирования регенерации аксонов. При использовании здесь говорят, что два средства вводятся в комбинации, когда два средства вводятся одновременно или вводятся независимо таким образом, что средства будут действовать в одно и то же время.

Средства по настоящему изобретению могут вводиться парентеральным, подкожным, внутривенным, внутримышечным, внутрибрюшинным, чрескожным или буккальным путем. Например, средство может вводиться местно в участок повреждения путем микроинфузии. Обычно участки включают в качестве неограниченных примеров поврежденные области спинного мозга, возникшие в результате травмы, или поврежденные участки в головном мозге, возникшие в результате инсульта. Альтернативно или одновременно, введение может происходить пероральным путем.

Вводимая дозировка зависит от возраста, здоровья и массы реципиента, вида одновременного лечения, если таковое проводится, частоты лечения и природы требуемого действия.

Настоящее изобретение далее относится к композициям, содержащим одно или несколько средств, которые модулируют экспрессию по крайней мере одного типа активности белка по изобретению. Когда индивидуальные потребности варьируют, определение оптимальных пределов эффективных количеств каждого компонента зависит от специалиста в данной области. Обычные дозировки включают от 1 пг/кг до 100 мг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки для системного введения включают от 100 нг/кг до 100 мг/кг массы тела. Предпочтительные дозировки для непосредственного введения в участок путем микроинфузии включают от 1 нг/кг до 1 мкг/кг массы тела.

В дополнение к фармакологически активному средству композиции по настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые наполнители и добавки, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут применяться в фармацевтике для доставки к месту действия. Подходящие препараты для парентерального введения включают водные растворы активного соединения в водорастворимой форме, например в виде водорастворимых солей. Кроме того, могут вводиться суспензии активных соединений в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензий, включая, например, карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и декстран. Суспензии также могут необязательно содержать стабилизаторы. Для инкапсуляции средства при доставке в клетку также могут использоваться липосомы.

Фармацевтический препарат для системного введения по изобретению может составляться для внутреннего, парентерального или местного введения. В действительности, все три типа препаратов могут использоваться одновременно для достижения системного введения активного ингредиента. Подходящие препараты для перорального введения включают твердые или мягкие желатиновые капсулы, пилюли, таблетки, включая покрытые таблетки, эликсиры, суспензии, сиропы или жидкости для ингаляции и их формы с контролируемым высвобождением.

При осуществлении способов данного изобретения средства по данному изобретению могут использоваться по одному, или в комбинации, или в комбинации с другими терапевтическими или диагностическими средствами. В некоторых предпочтительных осуществлениях соединения по данному изобретению могут вводиться совместно с другими соединениями, обычно предписанными для данных состояний согласно общепринятой медицинской практике, такими как противовоспалительные средства, антикоагулянты, противотромботические средства, включая ингибиторы агрегации тромбоцитов, активаторы тканевого плазминогена, урокиназу, проурокиназу, стрептокиназу, аспирин и гепарин. Соединения по данному изобретению могут применяться ш νίνΌ, обычно на млекопитающих, таких как люди, овцы, лошади, крупный рогатый скот, свиньи, собаки, кошки и мыши, или ш νίΙΐΌ.

Ь. Пептидные миметики.

Данное изобретение также включает пептидные миметики, которые имитируют трехмерную структуру Чодо и блокируют связывание Чодо с рецептором Чодо. Такие пептидные миметики могут обла

- 16 008480 дать значительными преимуществами над встречающимися в природе пептидами, включая, например, более экономичное получение, большую химическую стабильность, улучшенные фармакологические свойства (период полужизни, всасывание, мощность, действенность и т.д.), измененную специфичность (например, более широкий спектр типов биологической активности), сниженную антигенность и др.

В одной из форм миметики представляют собой пептидсодержащие молекулы, которые имитируют элементы вторичной структуры белка (см., например, 10Ьик0и е1 а1., (1993) Рерббе Тит Маиебск, ш В101есЬп010ду апб РЬагтасу, Ре//иЮ е1 а1., (ебЙ0гк) СЬартап апб На11). Основным логическим обоснованием применению пептидных миметиков является то, что пептидный остов белков, главным образом, существует с ориентацией аминокислотных боковых групп, способствующей молекулярным взаимодействиям, таким как между антителом и антигеном. Ожидается, что пептидный миметик обеспечивает молекулярное взаимодействие, сходное с таковым природной молекулы.

В другой форме аналоги пептидов обычно используются в фармацевтической промышленности в виде непептидных лекарственных средств со свойствами, аналогичными таковым для эталонных пептидов. Данные типы непептидных соединений также относятся к «пептидным миметикам» или «пептидомиметикам» ((РаисЬеге, (1986) Αάν. Игид Кек. 15, 29-69; УеЬег & Рге1бтдег, (1985) Тгепбк Ыеигоксг 8, 392-396; Етапк е1 а1., (1987) 1. Меб. СЬет. 30, 1229-1239, которые включены сюда в качестве ссылки) и обычно разрабатываются с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования.

Пептидные миметики, которые являются структурно сходными с пептидами, применяемыми в терапии, могут использоваться для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, пептидные миметики структурно сходны с эталонным полипептидом (т.е. полипептидом, который обладает биохимическими свойствами или фармакологической активностью), таким как внеклеточный домен Ы0д0, но имеют одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из -СН₂ИН-, -СН₂8-, -СН₂-СН₂-, -СН=СН- (цис- и транс-), -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂- и -СН₂80-, способами, известными в данной области и описанными далее следующими ссылками: \етк1ет, (1983) СЬетШгу апб ВюсЬет1к1гу 0! Атт0 Ас1бк, Рерббек апб Рго1етк, Магсе1 Эеккег; М0г1еу, (1980) Тгепбк РЬагтас01. 8ск 1, 463-468 (общий обзор); Нибк0п е1 а1., (1979) Ιπΐ. 1. Рерк РЮеш Кек. 14, 177-185 (-СН₂ИН-, СН₂СН₂-); 8раЮ1а е! а1., (1986) Ь1ке 8с1. 38, 1243-1249 (-СН₂-8); Напп, (1982) 1. СЬет. 80с. Регкш Тгапк. 1, 307-314 (-СН=СН-, цис- и транс-); А1тдшк1 е1 а1., (1980) 1. Меб. СЬет. 23, 1392-1398 (-С0СН₂-); 1ептпдк-\Ьйе е! а1., (1982) ТейаЬебгоп Ьей. 23, 2533 (-С0СН2-); Н011абау е! а1., (1983) ТейаЬебгоп Ьей. 24, 4401-4404 (-С(0Н)СН2-); и НгиЬу, (1982) Ыке 8ск 31, 189-199 (-СН₂8-); каждая из которых включена сюда в качестве ссылки.

Мечение пептидных миметиков часто включает ковалентное пришивание одной или нескольких меток, непосредственно или через спейсер (например, амидную группу), к позиции(-ям) пептидного миметика, не мешающей связыванию, которая предсказывается посредством количественных данных по структуре-активности и молекулярного моделирования. Такие позиции на пептидном миметике, не мешающие связыванию, как правило, представляют собой позиции, которые не образуют прямых контактов с макромолекулой(-ами) (например, не являются точками контакта в комплексах Ы0д0-рецептор Ы0д0), с которой связывается пептидный миметик для получения терапевтического эффекта. Дериватизация (например, мечение) пептидных миметиков не должна существенно мешать требуемой биологической или фармакологической активности пептидного миметика.

Пептидные миметики N030 могут конструироваться посредством конструирования лекарственных средств, основанного на структуре, путем замен аминокислот органическими группами (см., например, НидЬек, (1980) РЫ10К. Тгапк. К. 80с. Ь0пб. 290, 387-394; Н0бдк0п, (1991) Вю1есЬп01. 9, 19-21; 8иск1шд, (1991) 8ск Ргод. 75,323-359).

Применение пептидных миметиков может быть улучшено путем использования комбинаторной химии с целью создания библиотек лекарственных средств. В конструировании пептидных миметиков может помочь идентификация аминокислотных мутаций, которые повышают или снижают связывание N0^0 с рецептором N0^0. Подходы, которые могут использоваться, включают дрожжевой двухгибридный метод (см. СЫеи е1 а1., (1991) Ргос. N311. Асаб. 8ск И8А 88, 9578-9582) и применение метода фагового дисплея. Посредством двухгибридного метода выявляют белок-белковые взаимодействия у дрожжей (Р1е1бк е1 а1., (1989) ЫаШге 340, 245-246). Посредством метода фагового дисплея выявляют взаимодействия между иммобилизированным белком и белком, который экспрессирован на поверхности фагов, таких как лямбда и М13 (АтЬегд е1 а1., (1993) 81га1ед1ек 6, 2-4; Н0дге!е е1 а1., (1993) Оепе 128, 119-126). Данные способы позволяют проводить позитивную и негативную селекцию белок-белковых взаимодействий и идентификацию последовательностей, которые определяют данные взаимодействия.

Для общей информации по пептидному синтезу и пептидным миметикам см., например, 10иек, (1992) Атт0 Ас1б апб Рерббе 8упШек1к, 0х&гб Ипгоегкйу Ргекк; 1ипд, (1997) С01пЫпа10па1 Рерббе апб Шпреркбе ЫЬгапек: А НапбЬ00к, Ют \11еу; В0бапкхку е1 а1., (1993) Рерббе СЬет1кйу - А Ргасбса1 ТехкЬ00к, 8ргтдег Уег1ад.

М. Трансгенные животные.

Используемый здесь термин «животное» включает всех позвоночных животных, кроме человека. Он также включает индивидуальное животное на всех стадиях развития, включая стадии эмбриона и

- 17 008480 плода. «Трансгенное животное» представляет собой животное, содержащее одну или несколько клеток, несущих генетическую информацию, полученную, непосредственно или непрямым путем, посредством преднамеренной генетической манипуляции на клеточном уровне, такой как микроинъекцня или инфекция рекомбинантным вирусом. Данная введенная молекула ДНК может интегрироваться в хромосому, илн она может быть внехромосомно реплицирующейся ДНК. Термин «трансгенное по клеткам зародышевой линии животное» относится к трансгенному животному, в котором генетическая информация введена в линию зародышевых клеток, таким образом оно приобретает способность передавать информацию потомству. Если такое потомство обладает некоторой частью такой информации, то оно тогда также является трансгенными животными. Трансгенные животные, содержащие мутантные гены, «нокаут»гены, модифицированные гены или генные конструкции для избыточной экспрессии или экспрессии в зависимости от условий гена, соответствующего последовательностям кДНК 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 1 или 3 или родственным последовательностям, относятся к настоящему изобретению.

Информация может быть чужеродной для вида животного, к которому относится реципиент, чужеродной только для конкретного индивидуального реципиента, или генетическая информация может всегда быть присуща реципиенту. В последнем случае введенный ген может быть по-другому экспрессирован по сравнению с нативным эндогенным геном. Гены могут быть получены путем выделения их из геномных источников, путем получения кДНК из выделенных шаблонных РНК, путем прямого синтеза или путем некоторых комбинаций перечисленного.

Для экспрессии ген должен быть функционально связан с регуляторным регионом. Регуляторные регионы, такие как промоторы, могут использоваться для повышения, снижения, регуляции или приурочивания к конкретным тканям или конкретным стадиям развития экспрессии гена. Промотор не обязательно должен быть встречающимся в природе промотором. «Трансгенные животные, не являющиеся человеком» по изобретению получают путем введения «трансгенов» в зародышевые клеточные линии животных, не являющихся человеком. Способы, позволяющие введение ДНК в клетки, как правило, доступны и хорошо известны в данной области. Могут использоваться различные способы введения трансгенов. Как правило, зигота является лучшей мишенью для микроинъекции. У мыши мужской пронуклеус достигает размеров приблизительно 20 мкм в диаметре, что позволяет проведение воспроизводимой инъекции 1 или 2 пл раствора ДНК. Применение зигот в качестве мишени для генного переноса имеет большое преимущество. В большинстве случаев инъецированная ДНК включается в ген хозяина до первого дробления (Вгтйег е! а1., (1985) Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 82, 4438-4442). Впоследствии примерно все клетки трансгенного животного, не являющегося человеком, будут нести включившийся трансген. Как правило, это также приводит к эффективной передаче трансгена потомству производителя, поскольку 50% зародышевых клеток несут трансген. Микроинъекцня зигот является предпочтительным способом введения трансгенов при осуществлении изобретения.

Также для введения трансгена в животное, отличное от человека, может использоваться ретровирусная инфекция. Развивающийся нечеловеческий эмбрион можно культивировать ίη νίίτο до стадии бластоцисты. В течение этого времени бластомеры могут являться мишенью для ретровирусной инфекции. Эффективное инфицирование бластомеров получают путем ферментной обработки с целью удаления ζοιιη ре11ис1ба. Система вирусных векторов, используемая для введения трансгена, обычно представляет собой дефектный в плане репликации ретровирус, несущий трансген (баНпет е! а1., (1985) Ргос. №111. Асаб. 8сЕ И8А 82, 6927-6931; Уап бег Рийеп е! а1., (1985) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сЕ И8А 82, 6148-6152). Трансфекцию легко и эффективно осуществляют путем культивирования бластомеров на монослое продуцирующих вирус клеток (Уап бег Рийеп е! а1., (1985) Ргос. №-И1. Асаб. 8сЕ И8А 82, 6148-6152; 81е\\'ай е! а1., (1987) ЕМВО ί. 6, 383-388). Альтернативно, инфицирование можно проводить на более поздней стадии. Вирус или продуцирующие вирус клетки можно инъецировать в бластоцеле (баНпет е! а1., (1982) №йиге 298, 623-628). Большинство животных-производителей являются мозаичными в плане наличия трансгена, поскольку включение происходит только в отдельные группы клеток, которые образуют трансгенное животное, отличное от человека. Более того, животное-производитель может содержать ретровирусные вставки трансгена в различных позициях генома; они, как правило, разделяются в потомстве. Кроме того, также возможно введение трансгенов в зародышевую линию, хотя с меньшей эффективностью, путем внутриматочного инфицирования эмбриона в середине гестации (1аЪпег е! а1., (1982) №Пиге 298, 623-628).

Третьим типом клетки-мишени для введения трансгена является эмбриональная стволовая клетка (Е8). Клетки Е8 получают из доимплантационных эмбрионов, культивируемых ш νίίτο (Ένηΐ'ΐδ е! а1., (1981) №Пиге 292, 154-156; Вгаб1еу е! а1., (1984) №Пиге 309, 255-256; Οο^Ετ е! а1., (1986) Ргос. Ыа!1. Асаб. 8сЕ И8А 83, 9065-9069). Трансгены могут эффективно вводиться в клетки Е8 путем трансфекции ДНК или путем ретровирусопосредованной трансдукции. Полученные в результате трансформированные клетки Е8 могут после этого комбинироваться с бластоцистой животного, не являющегося человеком. Клетки Е8 колонизируют эмбрион и вносят вклад в зародышевую линию полученного химерного жнвотного.

Способы оценки присутствия введенной ДНК, а также ее экспрессии легко доступны и хорошо известны в данной области. Такие способы включают в качестве неограниченных примеров (саузерн-)гиб

- 18 008480 ридизацию ДНК для выявления экзогенной ДНК, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), электрофорез в полиакриламидном геле (РАСЕ) и вестерн-блоттинг для выявления ДНК, РНК и белка. Способы включают иммунологические и гистохимические подходы для выявления экспресии гена рецептора Иодо.

Используемый здесь термин «трансген» представляет собой последовательность ДНК, введенную в зародышевую линию животного, не являющегося человеком, путем человеческого вмешательства, таким путем, как описано ниже в примерах. Последовательность нуклеиновой кислоты трансгена, в данном случае формы 8Е0 ΙΌ N0: 1 или 3, может интегрироваться в локус генома, где данная конкретная последовательность нуклеиновой кислоты не обнаружена в норме, или, наоборот, в нормальный локус для трансгена. Трансген может состоять из последовательностей нуклеиновых кислот, происходящих из генома того же вида или других видов по отношению к виду целевого животного. Например, регенерация аксонов у мыши, лишенной Иодо, может сравниваться с таковой у мыши, лишенной МАС или как МАС, так и Иодо. Для определения того, является ли действие антител против Иодо следствием блокады Иодо, эффекты антител могут исследоваться на животных, лишенных экспрессии Иодо.

Как обсуждалось выше, нуклеиновая кислота по изобретению может трансфицировать в клетку-хозяин с использованием вектора. Предпочтительными векторами являются плазмиды и вирусные векторы, такие как ретровирусы. Вирусные векторы могут использоваться для получения трансгенного животного по изобретению. Предпочтительно вирусные векторы являются дефектными в плане репликации, то есть они не могут автономно реплицироваться в клетке-мишени. Как правило, геном вирусных векторов, дефектных в плане репликации, которые используются в рамках настоящего изобретения, не содержит по крайней мере один регион, необходимый для репликации вируса в инфицированной клетке. Данные регионы или могут быть элиминированы (целиком или частично), или сделаны нефункциональными любым способом, известным специалисту в данной области. Данные способы включают полное удаление, замену (другими последовательностями, в частности вставленной нуклеиновой кислотой), частичную делецию или добавление одного или нескольких оснований в существенный (для репликации) регион. Данные способы могут осуществляться ш νίΙΐΌ (на выделенной ДНК) или ш δίΐιι с использованием способов генетической манипуляции или путем обработки мутагенными агентами.

Предпочтительно вирус, дефектный в плане репликации, сохраняет последовательности его генома, необходимые для упаковывания в капсид вирусных частиц. Ретровирусы являются интегрирующимися вирусами, которые инфицируют делящиеся клетки. Ретровирусный геном включает два ЬТК, последовательность включения в капсид и три кодирующих региона (дад, ро1 и епу). Описана конструкция рекомбинантных ретровирусных векторов (см., например, Ветрею е! а1., (1985) Сепе! Епд. 7, 235; МсСогтюк, (1985) Вю1есЬио1. 3, 689-691). В рекомбинантных ретровирусных векторах гены дад, ро1 и епу, как правило, подвергнуты делеции, полностью или частично, и замещены интересующей гетерологической последовательностью нуклеиновой кислоты. Данные векторы могут конструироваться из разных типов ретровирусов, таких как ВИЧ, МоМиЬУ (вирус мышиного лейкоза Молони (Мо1опеу)), МЗУ (вирус мышиной саркомы Молон), НаЗУ (вирус саркомы Харви (Нагуеу)); ЗИУ (вирус некроза селезенки); КЗУ (вирус саркомы Рауша (Коик)) вирус Френда (Епепб).

Как правило, для конструирования рекомбинантных ретровирусов, содержащих последовательность нуклеиновой кислоты, конструируют плазмиду, которая содержит ЬТК, последовательность включения в капсид и кодирующую последовательность. Данная конструкция используется для трансфицирования в упаковочную клеточную линию, причем клетки данной линии способны возмещать в транс-положении функции ретровируса, которых не хватает в плазмиде. Как правило, упаковочные клеточные линии способны, таким образом, экспрессировать гены дад, ро1 и епу. Такие упаковочные клеточные линии описаны в предшествующих исследованиях, в частности клеточная линия РА317 (патент США 4861719); клеточная линия РыСШР (\У0 9002806) и клеточная линия СР+епуАт-12 (\У0 8907150). Кроме того, рекомбинантные ретровирусные векторы могут содержать модификации внутри ЬТК для подавления транскрипционной активности, а также последовательности интенсивного включения в капсид, которые могут включать часть гена дад (Вепбег е! а1., (1987) 1. У1го1. 61, 1639-1646). Рекомбинантные ретровирусные векторы очищают посредством стандартных способов, известных рядовым специалистам в данной области.

В одном из аспектов нуклеиновая кислота кодирует антисмысловую молекулу РНК. В данном осуществлении нуклеиновую кислоту функционально связывают с подходящими регуляторными регионами (обсуждаемыми выше), делающими возможной экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, и вводят в клетку, задействуя, предпочтительно, рекомбинантные векторные конструкции, которые будут экспрессировать антисмысловую нуклеиновую кислоту, как только вектор будет введен в клетку. Примеры подходящих векторов включают плазмиды, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (см., например, патент США 4797368, патент США 5139941), ретровирусы (см. выше) и герпесвирусы. Для доставки терапевтического гена вектор предпочтительно является аденоассоциированным вирусом.

Аденовирусы представляют собой ДНК-вирусы эукариотов, которые могут модифицироваться для эффективной доставки нуклеиновой кислоты по изобретению в различные клеточные типы. Существуют различные серотипы аденовируса. Из этих серотипов предпочтение в рамках настоящего изобретения отдается применению аденовирусам человека второго типа или пятого типа (Аб 2 или Аб 5) или адено

- 19 008480 вирусам животного происхождения (см. АО 9426914). Данные аденовирусы животного происхождения, которые могут применяться в рамках настоящего изобретения, включают аденовирусы, происходящие из лошади, быка, мыши, овцы, свиньи и обезьян.

Рекомбинантные аденовирусы по изобретению, дефектные в плане репликации, могут быть получены любым способом, известным специалисту в данной области. В частности, они могут быть получены путем гомологичной рекомбинации между аденовирусом и плазмидой, которая, среди прочего, несет интересующую последовательность ДНК. Гомологичная рекомбинация происходит после совместной трансфекции указанными аденовирусом и плазмидой подходящей клеточной линии. Клеточная линия, которая задействуется, должна предпочтительно (ί) быть способной к трансформации указанными элементами и (ίί) содержать последовательности, способные восполнять часть генома дефектного в плане репликации аденовируса, предпочтительно в интегрированной форме во избежание риска рекомбинации. Рекомбинантные аденовирусы выделяют и очищают с использованием стандартных молекулярно-биологических способов, которые хорошо известны рядовому специалисту в данной области.

Было получено некоторое количество рекомбинантных или трансгенных мышей, включая тех, что экспрессировали последовательность активированного онкогена (патент США 4736866); экспрессировали обезьяний Т-антиген 8У 40 (патент США 5728915); были лишены экспрессии регуляторного фактора интерферона 1 (ΙΒΓ-1) (патент США 5731490); проявляли дофаминергическую дисфункцию (патент США 5723719); экспрессировали по крайней мере один ген человека, который участвовал в контроле кровяного давления (патент США 5731489); проявляли большое сходство с состояниями, существующими при встречающейся в природе болезни Альцгеймера (патент США 5720936); обладали сниженной способностью опосредовать клеточную адгезию (патент США 5602307); обладали геном бычьего гормона роста (С1и!!ег е! а1., (1996) Сепейск 143, 1753-1760); или были способны генерировать ответ полностью человеческих антител (Ζου е! а1., (1993) 8с1епсе 262, 1271-1274).

Хотя мыши и крысы остаются животными выбора во многих трансгенных экспериментах, в некоторых случаях предпочтительно или даже необходимо использовать альтернативные виды животных. Трансгенные процедуры успешно применяли на различных немышевидных животных, включая овец, коз, кур, хомяков, кроликов, коров и морских свинок (см. Лщпег е! а1., (1999) Вюсйеш. Вюрйук. Кек. Соттип. 257, 843-850; Сак!го е! а1., (1999) Сепе!. Апа1. 15, 179-187; Вппк е! а1., (2000) Тйег1одепо1о§у 53, 139-148; Со1тап, (1999) Сепе!. Апа1. 15, 167-173; Еуек!опе, (1999) Тйеподепо1о§у 51, 509-517; Вадшк1 е! а1., (1999) Ыа!. Вю!есйпо1. 17, 456-461; Рта!йег е! а1., (1999) Тйеподепо1о§у 51, 487-498; Раш е! а1., (1999) Се11к Т1ккиек Огдапк 165, 212-219; кегпапйех е! а1., (1999) 1пй1ап 1. Ехр. Вю1. 37, 1085-1092; патент США 5908969; патент США 5792902; патент США 5892070; патент США 6025540).

N. Диагностические способы.

Одно из средств для диагностики димиелинизирующих заболеваний с использованием молекул нуклеиновой кислоты включает получение образца ткани из живых субъектов. Получение образцов ткани из живых источников является проблематичным для таких тканей, как таковые центральной нервной системы. От пациентов, страдающих демиелинизирующим заболеванием, образцы ткани для диагностических способов могут быть получены путем менее инвазивных процедур. Например, образцы могут быть получены из цельной крови и сыворотки.

Применение молекулярно-биологических средств стало рутинным в судебной технологии. Например, для определения экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, включающей 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, в судебных патологических образцах могут использоваться зонды на основе нуклеиновой кислоты. Кроме того, способы анализа нуклеиновой кислоты могут осуществляться любыми средствами проведения анализа транскрипционного профиля. В дополнение к анализу нуклеиновой кислоты судебные способы по изобретению могут быть нацелены на белок, кодированный 8ЕЦ ΙΌ N0: 1, для определения регуляции, повышающей или снижающей экспрессию генов (81т^гепск е! а1., (1975) ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а 393, 124-133).

Способы по изобретению могут включать обработку тканей коллагеназами и другими протеазами для того, чтобы сделать ткань подверженной клеточному лизису (8етепоу е! а1., (1987) Вш11. Еккр. Вю1. Мей. 104, 113-116). Кроме того, возможно получение образцов биопсии из разных регионов головного мозга для анализа.

Способы анализа для детекции молекул нуклеиновой кислоты или белка по изобретению могут быть в любом доступном формате. Обычные способы анализа молекул нуклеиновой кислоты включают гибридизацию или форматы, основанные на ПЦР. Обычные способы анализа для детекции белков, полипептидов или пептидов по изобретению включают применение зондов-антител в любом доступном формате, таком как анализ связывания ш кйи, и т.д. См. Нат1оте & Ьапе, (1988) АпйЬоФек - А ЬаЬога!оту Мапиа1, Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬота!огу Ргекк. В предпочтительных осуществлениях анализы проводятся с соответствующими контролями.

Без дальнейшего описания предполагается, что рядовой специалист в данной области может, используя предшествующее описание и последующие иллюстративные примеры, получить и задействовать соединения по настоящему изобретению и осуществить входящие в формулу изобретения способы. Поэтому следующие рабочие примеры специально показывают предпочтительные осуществления настоящего изобретения и не истолковываются как любым образом ограничивающие оставшуюся часть описания.

- 20 008480

Примеры

Пример 1. Идентификация Иодо как члена ретикулонового семейства белков.

Регенерация аксонов взрослых млекопитающих, как правило, успешно проходит на периферии, но, к несчастью, слабо выражена в ЦНС. Однако многие классы аксонов ЦНС могут вытягиваться на большие расстояния при трансплантации на нервную периферию (ВепГу & Адиауо (1982) №11игс 296, 150152). При сравнении миелина ЦНС и периферической нервной системы (ПНС) выявлено, что белое вещество ЦНС является избирательным ингибитором разрастания аксонов (8с11\таЬ & Ткоепеп (1985) 1. №ито8С1. 5, 2415-2423). Описаны некоторые компоненты белого вещества ЦНС, N1135, N1250 (Иодо) и МАО с ингибиторной активностью по отношению к вытягиванию аксонов (Аапд е! а1., (1999) Ттапкбисйоп оГ 1пЬ1Ьйоту к1дпа1к Ьу 1Не ахопа1 дтоМй сопе, ίη №итоЬю1оду оГ 8рша1 Согб 1н)шу, Ка1Ь & 81г|Нта11ег (еПйогк) Нитапа Ргекк; Сагош & 8с11\\'аЬ. (1988) 1. Се11 Вю1. 106, 1281-1288; 8рШтапп е! а1., (1998) 1. Вю1. Скет. 73, 19283-19293; МсКеггаскег е! а1., (1994) Иеигоп 13, 805-811; Миккорабкуау е! а1., (1994) Иеигоп 13, 757-767). Антитело ΙΝ-1, полученное против N1135 и N1250 (Иодо), приводило, как сообщалось, к умеренной степени регенерации аксонов и восстановления функции после травмы спинного мозга (Вгедтап е! а1., (1995) №Ш.1ге 378, 498-501; ТкаЛтшг е! а1., (1998) №Ш1ге №итокс1. 1, 24-31). По настоящему изобретению №до идентифицирован как член белкового семейства ретикулона.

№до экспрессируется олигодендроцитами, но не Шванновскими клетками, и первоначально ассоциирован с эндоплазматическим ретикулумом. Люменально-внеклеточный домен №до, состоящий из 66 аминокислот (8ЕО ΙΌ N0: 20), ингибирует вытягивание аксонов и выводит из строя конусы роста ганглиев дорзальных корешков. Другие ретикулоновые белки не экспрессируются олигодендроцитами, и люменально-внеклеточный 66-аминокислотный домен других ретикулоновых белков не ингибирует регенерацию аксонов. Эти данные обеспечивают молекулярную основу причастности №до к отсутствию регенерации аксонов в ЦНС взрослых.

Для экспрессии и белковой очистки рекомбинантного №до-А полноразмерная последовательность (К1АА0886) была любезно предоставлена Кахика ^NА Шекеагск 1пкй!и!е. Полноразмерную кодирующую последовательность амплифицировали посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) и лигировали в вектор рС^NА3.1-МусН^к Дпуйтодеп) с получением плазмиды, кодирующей №до-А, слитый с С-концом эпитопа Мус (№до-А-Мус). Альтернативно, кодирующую последовательность амплифицировали с использованием праймеров, которые кодируют в рамке эпитоп Мус сразу с №конца от первого остатка и стоп-кодон с С-конца (Мус-№до-А). Экспрессирующие векторы №до-С-МусН|к и Шп1С-МусН1к были получены в той же манере, кроме того, что в качестве шаблона для реакции ПЦР использовали библиотеку кДНК головного мозга взрослой крысы, с праймерами, основанными на последовательностях №доС или Шп1С (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) ί. Се11. 8ст 107, 2403-2416). Данными плазмидами трансфицировали С08-7 или НЕК293Т посредством ЫроГесШтше (О1Ьсо-ВВЕ) или по способу Εи6ΕNΕ 6 (ВоетЫпдег Маппкенп).

Часть №до-А, кодирующую 66-аминокислотный люменально-внеклеточный фрагмент №до-А, амплифицировали посредством ПЦР и лигировали в плазмиду рОЕХ-2Т с получением прокариотического экспрессирующего вектора для белка слияния С8Т-№до. Сходные регионы П1п1, Шп2 и Шп3 амплифицировали путем вложенной ПЦР с использованием в качестве шаблона библиотеки кДНК головного мозга взрослой крысы и лигировали в рОЕХ-2Т. Е. сой, трансформированную данными плазмидами, индуцировали 1РТО. Растворимые, нативные белки слияния с О8Т очищали с использованием глутатионовой смолы, и они содержали приблизительно 75% О8Т и 25% полноразмерных белков С8Т-№до или О8ТШп. Большая часть белка С8Т-№до не подлежала экстракции при неденатурирующих условиях, но экстракт с 8М мочевиной, диализованный против РВ8, содержал свыше 98% чистого С8Т-№до.

Иммунореактивность Мус выявляли с продуктом очевидного размера в области 225 кДа в восстановительных условиях (данные не показаны). Таким образом, кДНК направляет экспрессию белка с подходящей электрофоретической подвижностью и аминокислотной последовательностью, относящейся к №до, который был назван человеческим №до-А (11№до-А).

Консервативный С-конец белков семейства Шп содержал два гидрофобных домена, разделенных гидрофильным сегментом длиной 66 аминокислотных остатков. Ни одна из этих последовательностей не содержит сигнального пептида. Предсказанная для данных белков топология такова, что N и С-конец должны находиться в цитозоле, а консервативный регион должен быть ассоциирован с липидным бислоем. Для Шп1А имеется экспериментальное доказательство, демонстрирующее, что полипептид ведет себя как интегральный мембранный белок и что гидрофобные сегменты консервативного домена ответственны за это проявление (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) ί. Се11. 8сЕ 107, 2403-2416). Меченный Мус №до также асссоциирован с конкретными фракциями и экстрагируется детергентом, но не посредством высокой ионной силы (данные не показаны).

При повышенной экспрессии в клетках почки белок Шп1 первоначально локализуется в эндоплазматическом ретикулуме (ЕШ) в мелкогранулированном виде, отсюда термин Вейси1оп (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) 1. Се11. 8сЕ 107, 2403-2416). На С-конце №до и большинства белков Шп имеется дилизиновый мотив задержки в ЕШ (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) 1. Се11. 8сь 107, 2403-2416; 1асккоп е! а1., (1991) ЕМВ0 1. 9, 3153-3162). В нейронах Шп1 экспрессируется на протяжении отростков и сконцентрирован в конусах

- 21 008480 роста (8епбеп е! а1., (1996) Еиг. 1. Се11. ΒίοΙ. 69, 197-213). Исследование его локализации в трансфицированных клетках почки привело к тому предположению, что В!п1 может регулировать сортировку белков или другие аспекты функции ЕВ (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) 1. Се11. δα. 107, 2403-2416). Формы сплайсинга Νο§ο А и С характеризуются распределением в ретикулуме при экспрессии в клетках СО8-7, сходным с таковым В!п1С.

Пример 2. Поликлональные антитела против Νο§ο.

Предсказанная внутримембранная топология двух гидрофобных доменов Νο§ο указывает, что 66 аминокислотных остатков между данными сегментами локализованы на люменальной/внеклеточной поверхности мембраны. Для дальнейшего выяснения этого получали антисыворотки, направленные против 66-аминоксилотного домена.

Для продукции антител и иммуногистологии получали иммуноблоты и иммуногистологию против Мус с антителом 9Е10, как описано ТакайакЫ е! а1., (1998) Иа1иге №иго8а., 1, 487-493 & ТакайакЫ е! а1., (1999) Се11, 99, 59-69. Белок слияния Ο8Τ-Νο§ο использовали в качестве иммуногена для получения кроличьей антисыворотки против Νο§ο. Антитело аффинно очищали и использовали в концентрации 3 мкг/мл для иммуногистологии и 1 мкг/мл для иммуноблотов. Для оценки специфичности антисыворотки проводили окрашивание в присутствии белка ΟδΤ-Νο^ο в концентрации 0,1 мг/мл. Для окрашивания живых клеток клетки инкубировали в разведениях первичного антитела при 4°С в течение 1 ч в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (Напкк) с 0,05% ΒδΑ и 20 мМ №1-Нере5 (рН 7,3). После фиксации связанное антитело выявляли путем инкубации с флуоресцентно меченными вторичными антителами.

Посредством антитела выявлен низкий уровень поверхностной экспрессии данного эпитопа, тогда как эпитоп Мус на С-конце экспрессированного Νο§ο не выявляли до тех пор, пока клетки не делали проницаемыми. Поверхностное окрашивание указывало на то, что с поверхностью ассоциирована меньшая часть белка Νο§ο по сравнению с мембраной ЕВ. Эти данные служат подтверждением топографической модели, на которой Ν- и С-концы белка находятся в цитоплазме и 66 аминокислот белка выступают на люменально-внеклеточную сторону ЕВ или плазматической мембраны.

Пример 3. Экспрессия Νο§ο в центральной нервной системе.

Если Νο§ο вносит основной вклад в ингибиторные характеристики разрастания аксонов (Сагою & δ№\\№, (1988) 1. Се11 Βίο1. 106, 1281-1288; 8рШтапп е! а1., (1998) 1. Βίο1. СНет. 73, 19283-19293; Вгедтап е! а1., (1995) №1иге 378, 498-501), то Νο§ο должен экспрессироваться в миелине ЦНС взрослых, но не в миелине ПНС. Анализ экспрессии Νο§ο посредством нозерн-блота проводили с использованием зондов, происходящих из 5'-концевого Nοдο-Α/Β-специфического региона и из 3'-концевого общего региона кДНК Νο§ο. Единственная полоса размером около 4,1 тыс. нуклеотидов была выявлена с 5'-концевым зондом в образцах общей РНК зрительного нерва взрослой крысы, но не в образцах из седалищного нерва. Результаты указывают на то, что клон Νο^ο-Α представляет полноразмерную кДНК, и согласуются с ролью Νο§ο как специфического для миелина ЦНС ингибитора разрастания аксонов. При помощи анализа нозерн-блота с 3'-концевым зондом выявлено, что зрительный нерв экспрессирует большие количества мРНК Νο^ο-Α и значительно меньшие количества Νο^ο-Β и Νο^ο-С. Целый головной мозг экспрессирует как Νο^ο-Α, так и Νο^ο-С, но некоторое количество периферических тканей (включая седалищный нерв) экспрессируют малое количество или не экспрессируют Νο§ο. Продемонстрировано, что экспрессия Νοβο-ίνΚΕΠί.' происходит в скелетной мышце и адипоцитах, так же, как в головном мозге (Μοιτίδ е! а1., (1991) ΒΐοοΗ™. Βίορίινδ. Лс1а 1450, 68-76). Из семейства В!п в зрительном нерве происходит селективная экспрессия Νο§ο в отсутствие выявляемой экспресии В!п1 или В!п3. В!п2 не определяли.

Посредством гибридизации ίπ δίΐιι мРНК Νο§ο выявлена в клетках с морфологией олигодендроцитов в зрительном нерве и пирамидном пути взрослой крысы. В некоторых популяциях нейронов в головном мозге также выявлена экспрессия Νο§ο. В отличие от Νο^ο, В!п1 или В!п3 не экспрессируются в зрительном нерве, но мРНК выявляют в некоторых популяциях нейронов. Локализацию белка Νο§ο анализировали в клеточных культурах спинного мозга, обработанных ΡΌΟΡ и разбавленной сывороткой для индукции дифференцировки олигодендроцитов, с использованием антител против Νο§ο и специфичных для олигодендроцитов моноклональных антител О4. В живых клетках на поверхности олигодендроцитов были обнаружены как люменально-внеклеточная 66-аминокислотная петля Νο^ο, так и антиген О4. Приблизительно половина О4-положительных клеток в данных культурах характеризовались поверхностным окрашиванием на Νο§ο.

Пример 4. Опосредованный Νο§ο коллапс конусов роста.

Для всех экспериментов с привлечением клеточных культур использовали следующие способы. Способы с использованием культур выростов и диссоциированных нейронов ганглиев эмбриональных куриных дорзальных корешков Е10 и Е12 описаны для культур ганглия дорзального корешка Е7 (ТакайакЫ е! а1., (1998) Ха!иге №иго8а. 1, 487-493; ТакайакЫ е! а1., (1999) Се11 99, 59-69; Οοδίιίιηη е! а1., (1995) Ха!иге 376, 509-514; Лп & 8!тй1та!1ег, (1997) 1. №иго8а. 7, 6256-6263). ΝΟΡ-дифференцированные клетки РС12 культивировали, как описано (81п!!та!!ет е! а1., (1994) 1. №иго8а. 14, 2327-2338). Выросты эмбрионального спинного мозга (Е10 крысы или Е5 цыпленка) культивировали в течение 7-14 дней в присутствии ΡΟΌΡ-ΑΑ для индукции дифференцировки некоторых клеток в зрелые олигодендроциты (Уат1ап1ап е! а1., (1999) Ргос. №111. Αсаб. δα. υδΑ 96, 731-735). Процедура анализа коллапса конусов роста идентична тако- 22 008480 вой для анализа 8ета3А-индуцированного коллапса конусов роста (Такайазй1 е! а1., (1998) №1Шге Неигозсг 1, 487-493; Такайазй1 е! а1., (1999) Се11 99, 59-69; СозНана е! а1., (1995) №1Шге 376, 509-514; Лп & 81пйтайег, (1997) 1. №игозсг 17, 6256-6263). Способ анализа общего разрастания нейритов также был описан (СозНана е! а1., (1995) №1Шге 376, 509-514; Лп & 8!гй1та!!ег, (1997) I. №агозсг 17, 6256-6263; 8!гй!та!!ег е! а1., (1994) I. №агозсг 14, 2327-2338). При анализе разрастания белки и пептиды добавляли через 1 ч после помещения на чашки для минимизации любого действия на общее количество прилипающих клеток. Для тестирования действия связанного с субстратом С8Т или С8Т-Ыодо белковые растворы высушивали на покрытом поли-Ь-лизином стекле, отмывали и затем покрывали ламинином. Для культур Е12 идентичность клеток нейронам проверяли путем окрашивания антителами против нейрофиламентов (2Н3, Оеуе1отеп1а1 81аЙ1ез НуЬпйота Вапк) и следы нейритов отмечали при наблюдении окрашивания родаминфаллоидином Р-актина в отростках.

Экспрессия рекомбинантного №§о в клетках НЕК293Т позволяет проводить точное тестирование того, оказывает ли данный белок ингибирующее действие на разрастание аксонов. Отмытые мембранные фракции из трансфицированных вектором или йЫодо-А-Мус клеток НЕК293Т добавляли к культурам выростов ганглиев куриных дорзальных корешков Е12. Морфологию конусов роста оценивали после 30минутной инкубации при 37°С путем фиксации и окрашивания родаминфаллоидином.

Контрольные мембраны НЕК не оказывали детектируемого действия на морфологию конусов роста. Мембраны, содержащие №до-А, индуцировали коллапс большей части конусов роста ганглия дорзальных корешков. Данный коллапс конусов роста является индикатором ингибирующей активности в отношении разрастания аксонов, и также показано ингибирование №§о вытягивания аксонов (см. ниже). Форма №до-С также проявляет активность в отношении коллапса, и это означает то, что общий С-конец белка, включающий гидрофобные сегменты и 66-аминокислотный люменально-внеклеточный домен, содержит функционально важные остатки. Наличие дополнительной ингибиторной активности Ν-концевого региона №до-А не исключается данными исследованиями. Чувствительность более незрелых культур выростов из куриных эмбрионов Е10 или из крысиных эмбрионов Е15 (данные не показаны) является существенно меньшей. Регуляция чувствительности по ходу развития согласуется с экспериментами, в которых используют частично очищенный №§о (Вапй!1оте е! а1., (1997) Еиг. 1. №агозсг 9, 2743-2752).

В приводящем к коллапсу конуса роста белка №до-С гидрофильный 66-аминокислотный люменально-внеклеточный домен кажется более вероятным кандидатом на взаимодействие с поверхностью нейронов ганглиев дорзального корешка, чем погруженные в мембрану гидрофобные домены. Для проверки данной гипотезы 66-аминокислотный регион йЫодо экспрессировали в Е. соЛ и очищали. Большая часть белка слияния С8Т-Ыодо скапливалась в тельцах включения, но может быть выделена путем экстракции мочевиной. Данный ограниченный регион №до проявляет сильную (ЕС₅₀=50 нМ) активность, приводящую к коллапсу конусов роста в нейронах ганглиев дорзального корешка Е12 (данные не показаны). Препарат экстрагированного мочевиной белка, вероятно, представляет только малую фракцию последовательности №§о в активной конформации. Поэтому 10% С8Т-Ыодо, который растворим в Е. соЛ, очищали посредством смолы глутатионсефарозы. Данный препарат является даже более сильным, чем экстрагированный мочевиной белок, фактором коллапса, резко изменяя морфологию конуса роста в таких низких концентрациях, как 1 нМ.

Действие в наномолярных концентрациях является стандартом для большинства известных физиологических регуляторов, управляющих аксонами. Разрастание аксонов нейронов ганглиев дорзального корешка и NСР-дифференцированных клеток РС12 также блокируется данным растворимым белком С8Т-Ыодо в нМ концентрациях (данные не показаны). Когда С8Т-Ыодо связан с поверхностями субстрата, разрастание аксонов нейронов ганглиев дорзального корешка или клеток РС12 снижается до недетектируемого уровня. Имеет место селективное действие на разрастание аксонов, но не на выживание клеток, поскольку С8Т-Ыодо не снижает число нейрофиламент-положительных прилипающих клеток (137 ± 24% для обработанных С8Т культур) и не изменяет значимо число апоптотических ядер, идентифицированных путем окрашивания ΩΛΡΙ (4,0 ± 1,7% в контрольных культурах и 5,2 ± 1,1% в образцах, обработанных С8Т-Ыодо).

Оказывается, что олигодендроциты избирательно экспрессируют №§о из белков Κίπ. Для выяснения избирательности роли №§о в регенерации аксонов рассматривали активность, ингибирующую разрастание аксонов, других белков Ш!п. Предсказанные люменально-внеклеточные 66-аминокислотные фрагменты Шп1, Шп2 и Р1п3 экспрессировали в виде белков слияния с С8Т и очищали в нативной форме. В концентрациях, в которых фрагмент №§о приводит к коллапсу большей части конусов роста ганглиев дорзальных корешков Е12, другие белки Ши не изменяли морфологии конусов роста (данные не показаны). Таким образом, активность, ингибирующая регенерацию аксонов, является в семействе Шп специфичной для №§о.

Пример 5. Пептидные агенты рецептора №§о.

Для дальнейшего определения активного домена №§о синтезировали пептиды длиной 25 аминокислотных остатков, соответствующие сегменту 6,6-аминокислотной последовательности. Пептид, соответствующий остаткам 31-55 внеклеточного фрагмента №до, вызывает коллапс конусов роста (фиг. 2) и проявляет виды активности, ингибирующие разрастание (данные не показаны), в концентрации, равной 4 мкМ.

- 23 008480

В то время, как данная последовательность может относиться к центральной части (соге) ингибиторного домена, 66-аминокислотный фрагмент явно требуется для полной силы действия. Интересно, что этот регион внутри 66-аминокислотного домена проявляет наименьшее сходство с другими белками Шп, и это согласуется с тем, что другие члены семейства не активны в качестве ингибиторов регенерации аксонов. Действительно, люменально-внеклеточный пептид из 31-55 аминокислот Н!п1 не проявляет активности, вызывающей коллапс конусов роста (данные не показаны).

Вышеуказанные экспериментальные данные определяют №до как олигодендроцитспецифический член семейства Н!п и демонстрируют, что дискретный домен №до может ингибировать разрастание аксонов. Другие белки Н!п не обладают данной активностью. Поэтому экспрессия №до в олигодендроцитах, но не в Шванновских клетках, способствует отсутствию регенерации аксонов в ЦНС взрослых млекопитающих по сравнению с ПНС взрослых. Относительный вклад №до по сравнению с другими компонентами в тормозящую природу белого вещества ЦНС может теперь быть охарактеризован на молекулярном уровне.

В то время, как настоящие экспериментальные данные согласуются с ролью №до в блокировании регенерации аксонов в ЦНС взрослых после патологического повреждения, это также может относиться к физиологической роли №до в непатологических состояниях. Основываясь на исследованиях локализации, полагают, что другие белки Шп играют роль в функционировании ЕН (Уап бе Уе1бе е! а1., (1994) 1. Се11. 8с1. 107, 2403-2416). Большая часть №до распределена в ретикулярной системе в клетках С08-7, и лишь меньшая часть представляется доступной на клеточной поверхности.

Пример 6. Ингибирование активности №до.

Предыдущие примеры показали, что 66-аминокислотный регион вблизи С-конца №до ингибирует разрастание аксонов и экспрессируется на клеточной поверхности. Более короткие сегменты данного домена длиной 25 аминокислот или являются инертными в качестве ингибиторов разрастания, или проявляют гораздо меньшую силу действия (СгапбРге е! а1., (2000) №11иге 403, 439-444). Область 31-55 из данного 66-аминокислотного сегмента обладает слабой активностью, вызывающей коллапс конусов роста и ингибирующей разрастание аксонов. Для блокирования действия №до ш у1уо мог бы очень потребоваться конкурентный антагонист №до, который связывается с тем же рецептором, но, в свою очередь, не оказывает биологического эффекта. Различные фрагменты 66-аминокислотной область тестировали в качестве блокаторов опосредованного №до ингибирования роста аксонов. Для этой цели применяли два способа анализа. Первый представлял собой анализ коллапса конусов роста, а второй представлял анализ связывания.

При анализе коллапса конусов роста измеряли реакцию на №до в присутствии различных пептидов-потенциальных антагонистов. Три из пептидов длиной 25 аминокислот (1-25, 11-35 и 21-45) из 66аминокислотного региона обладают блокирующей активностью в мкМ концентрациях (фиг. 2). Комбинация всех трех пептидов не изменяла морфологию конусов роста при базовых условиях, но полностью предотвращала коллапс за счет 15 нМ С8Т-Ыодо. Та же смесь пептидов также была способна блокировать коллапс конусов роста, индуцированный низкой дозой миелина ЦНС. Наличие данной блокады поддерживало гипотезу о том, что №до представляет первичный ингибиторный компонент миелина ЦНС. Более того, блокада обладала свойствами, ожидаемыми для конкурентного антагонизма, будучи неэффективной при больших дозах миелина ЦНС.

Для разработки антагониста с более высокой специфичностью и силой действия тестировали более длинный фрагмент №до. Предпочтительно, чтобы такой пептид сам по себе не обладал ингибирующей разрастание аксонов активностью, при этом конкурентно блокируя действие №до. Фрагмент 2-41 №до ацетилирован на С-конце, и амидирован на №конце, и является наиболее мощным блокатором №до, определенным к настоящему моменту. Рер2-41 препятствует С8Т-Ыодо-индуцированному коллапсу конусов роста и обладает при анализе связывания кажущейся Κι, равной 150 нМ (фиг. 3). Фрагмент 2-41 также блокирует способность очищенного белка №до-66 и грубого миелина ЦНС ингибировать разрастание нейритов в культивируемых нейронах (фиг. 4).

Пример 7. Идентификация рецептора №до.

Разработан анализ связывания №до, который задействует способ, широко используемый для определения функции управления аксонами семафорина и эфрина (Б1ападап & Уапбегйаедйеп, (1998) Аппи. Неу. №иго8С1. 21, 309-345; ТакайазЫ е! а1., (1999) Се11 99, 59-69). Он включает слияние части секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (АР) с лигандом для получения биологически активного средства, связывающего рецептор, который может детектироваться путем исключительно чувствительного колориметрического анализа. В случае №до создали экспрессирующий вектор, кодирующий сигнальный пептид, метку Ηίδ6 для очистки, АР и 66-аминокислотный активный домен №до. Белок слияния может очищаться из кондиционированной среды трансфицированных клеток в миллиграммовых количествах (фиг. 5). Данный белок является биологически активным в качестве средства, приводящего к коллапсу конусов роста с ЕС₅₀, равной 1 нМ. АР-Ыодо действует лишь ненамного сильнее, чем С8Т-Нодо, возможно, из-за того, что данный белок синтезируется в эукариотической, а не прокариотической клетке. Первоначальные исследования выявили на аксонах насыщаемые сайты с высокой аффинностью. Связывание блокируется С8Т-Ыодо и антагонистическими пептидами длиной 25 аминокислот, что соответст

- 24 008480 вует конкурентному связыванию с рецепторным сайтом нейрона. Поскольку кажущаяся Кб (3 нМ) для данных сайтов близка ЕС₅₀ АРУодо в анализе коллапса, сайты, вероятно, представляют собой необходимые физиологически рецепторы №до.

Данный анализ задействовали для экспрессионного клонирования рецептора №до. Порциями экспрессионной библиотеки кДНК головного мозга взрослой мыши, представляющей собой 250000 независимых клонов, трансфицировали клетки С08-7 ненейронного происхождения. Нетрансфицированные клетки С08-7 не связывали АРУодо, но трансфекция двумя порциями из 5000 клонов приводила к появлению небольшого числа клеток с сильным связыванием АΡ-Nοдο. Отдельные клоны кДНК, кодирующие сайт связывания №до, выделяли путем к1Ь-селекции из каждой из двух позитивных порций. Два независимо выделенных клона были идентичны один другому, кроме расширения длиной 100 п.осн. 5'концевого нетранслируемого региона в одном из клонов. Трансфекция клеток С08-7 приводила к образованию сайта связывания с аффинностью для АΡ-Nοдο, идентичной таковой, наблюдаемой в нейронах ганглиев спинного корешка Е13; Кб связывания составляет примерно 3 нМ (фиг. 6). Сама по себе АР не связывается с какой-либо детектируемой аффинностью с данными трансфицируемыми клетками, и это означает, что аффинность является следствием наличия 66 аминокислот, происходящих из №до. Более того, С8ТУодо вытесняет АΡ-Nοдο из данных сайтов.

Данная кДНК кодирует новый белок длиной 473 аминокислот. О кДНК со значительной гомологией не сообщалось в СепВапк. Предсказанный белок содержит сигнальный пептид, за которым следуют восемь регионов богатых лейцином повторов, уникальный домен и предсказанный сайт заякоривания СР1 (фиг. 7). Идентифицирован человеческий гомолог мышиной кДНК, характеризующийся 89% аминокислотной идентичностью. Существование данной кДНК предсказано на основе структуры мышиной кДНК и анализа последовательности генома человека, хранящейся в СепВапк как часть Нитап 8ес.|иепстд Рго_)ес!. Экзоны человеческой кДНК распространены на 35 тыс. нуклеотидов, и кДНК ранее не была распознана в геномной последовательности. Структура белка соответствовала белку клеточной поверхности, способной связывать №до. По связанной с СР1 природе белка предполагается, что может существовать вторая субъединица рецептора, которая пронизывает плазматическую мембрану и опосредует трансдукцию сигнала от №до.

Пример 8. Распределение рецептора №до в тканях.

Распределение мРНК для данного рецептора №до соответствует роли данного белка в регуляции регенерации и пластичности аксонов в ЦНС взрослых. Путем нозерн-анализа в головном мозге выявлена единственная полоса размером 2,3 тыс. оснований, что указывает на то, что выделенный клон рецептора №до является полноразмерным (фиг. 8). Малые количества данной мРНК наблюдаются в сердце и почке, но не в других периферийных тканях. В головном мозге экспрессия является широко распространенной, и области, наиболее богатые серым веществом, экспрессируют наибольшие количества мРНК.

Пример 9. Биологические эффекты разных доменов №до.

Способы анализа функции №до-А включали коллапс конусов роста, разрастание нейритов и распластывание фибробластов со связанными с субстратом и растворимыми препаратами белка (Сагош & 8сйтеаЬ, (1988) 1. Се11 Вю1. 106, 1281-1288; СгапбРге е! а1., (2000) №11иге 403, 439-444; Сйеп е! а1., (2000) Уинге 403, 434-439; Рпп)11а е! а1., (2000) Уинге 403, 483-484). При анализе морфологии фибробласт 3Т3, связанный с субстратом №до-66, не ингибировал распластывание (фиг. 1Ь, е). Поскольку препараты N1250 и полноразмерный №до-А являются тормозящими факторами в отношении распластывания 3Т3, необходимо рассмотреть, могут ли разные домены №до способствовать этому при активности ΐπ νίΙΐΌ. Для облегчения сравнения различных доменов №до-А кислый Уконцевой фрагмент длиной 1040 аминокислот (АттоУодо) экспрессировали в виде меченного Мус-Ык белка в клетках НЕК293Т (фиг. 1б). Белок №до присутствует в цитозольных фракциях. Поверхности, покрытые очищенным белком Атто№до, не поддерживали распластывание фибробласта 3Т3 (фиг. 1Ь, е). Сходные результаты наблюдали на происходящей из почки клеточной линии С08-7 (фиг. 1ί). Поэтому оказывается, что Уконцевой домен имеет значение для действия полноразмерного №до-А на фибробласты. Домен №до-66 является специфичным для нейронов; он не влияет на клетки ненейронного происхождения.

Культуры ганглиев дорзальных корешков также подвергали воздействию белка АттоУодо (фиг. 1с, д-ί). Как и 3Т3, фибробластоподобные клетки в культурах ганглиев дорзальных корешков не распластываются по данному субстрату. Более того, разрастание аксонов на покрытых АттоУодо поверхностях снижается до низкого уровня. Таким образом, в то время, как действие №до-66 является специфичным в отношении нейронов, ингибиторное действие домена АттоУодо является более генерализованным. При наличии в растворимой форме в концентрации 100 нМ полипептид №до-66 приводит к коллапсу конусов роста куриных ганглиев дорзальных корешков Е12 и почти отменяет вытяжение аксонов, как описано ранее (СгапбРге е! а1., (2000) Уинге 403, 439-444). По заметному контрасту с этим растворимый белок АттоУодо оказывается неактивным и значимо не модулирует морфологию конусов роста ганглиев дорзальных корешков, или вытяжение аксонов ганглиев дорзальных корешков, или распластывание ненейронных клеток (фиг. 1с, д-1).

В экспериментах νηΜι и коллег (РгшЩа е! а1., (2000) Уинге 403, 483-484) исследованы гранулярные нейроны мозжечка, и растворимый АттоУодо присутствовал в виде белка слияния Ес, возможно, в

- 25 008480 димерной форме. Поэтому необходимо уяснить, может ли данными различиями объясняться неактивность растворимого Ашшо-Иодо. Гранулярные нейроны мозжечка мыши Р4 реагируют на препараты Иодо в манере, неотличимой от реакции нейронов куриных ганглиев дорзальных корешков Е13 (фиг. 11). Ашшо-Иодо, димеризованный с антителом против Мус, ингибирует распластывание 3Т3 и С08-7 (фиг. 1е, ί) и имеет тенденцию к снижению разрастания аксонов мозжечка (фиг. 11). При дальнейшей агрегации путем добавления антитела против мышиных 1дС Ашшо-Иодо значимо снижает разрастание аксонов ганглиев дорзальных корешков и мозжечка (фиг. 1Н. ί). Хотя белок Ашшо-Иодо является довольно кислым, электростатический заряд сам по себе не имеет значения для его ингибиторного действия, поскольку поли-Азр не изменяет распластывание клеток или разрастание аксонов (фиг. 1е, ί, Н). Таким образом, домен Иодо-66 является сильным и специфичным для нейронов ингибитором, тогда как внутриклеточный домен Ашшо-Иодо ингибирует многие клеточные типы и оказывается функциональным только в агрегированном состоянии.

Пример 10. Локализация рецептора Иодо.

Для дальнейшей характеристики экспрессии белка-рецептора Иодо-66 получали антисыворотку к белку слияния С8Т-рецептор Иодо. Данной антисывороткой селективно выявляется 85 кДа белок в экспрессирующих рецептор Иодо-66 клетках НЕК293Т (фиг. 9а) и специфично окрашиваются клетки С087, экспрессирующие рецептор Иодо-66 (фиг. 9Ь). Иммуногистологическое окрашивание культур спинного мозга куриного эмбриона локализует белок в аксонах, что согласуется с опосредованием ингибирования разрастания аксонов, индуцированного Иодо-66. Экспрессия рецептора Иодо-66 не обнаружена в О4-положительных олигодендроцитах, которые экспрессируют Иодо-66. Иммунореактивный 85 кДа белок экспрессируется в препаратах нейронов из куриных ганглиев дорзальных корешков Е13, отвечающих на Иодо-66, но в гораздо меньшей степени в слабо отвечающей ткани куриных ганглиев дорзальных корешков Е7 и куриной сетчатке Е7 (фиг. 9а).

В общем, характер экспрессии рецептора Иодо-66 соответствует белку, опосредующему ингибирование аксонов за счет Иодо-66.

Данное антитело также является эффективным при локализации белка-рецептора Иодо-66 в секциях тканей (фиг. 9с). В то время, как из гибридизации ш з1!и ясно, что белок экспрессируется во многих классах нейронов, путем иммуногистологии белок выявляется в больших количествах в белом веществе ЦНС, в профилях, соответствующих аксонам. В небольших количествах белок выявляется в телах нейронов и нейропиле. Эти данные предоставляют дальнейшее подтверждение предполагаемого функционирования данного белка при опосредовании взаимодействий с олигодендроцитами.

Пример 11. Рецептор Иодо опосредует ответы на Иодо-66.

Белок-рецептор Иодо-66 необходим для действия Иодо-66 и не является просто участком связывания с функцией, не относящейся к ингибированию разрастания аксонов. Первым предсказанием этого является то, что обработка фосфоинозитолспецифичной фосфолипазой С (Р1-РЬС) для удаления с поверхности нейронов, связанных с гликофосфатидилинозитолом (СР1) белков, делает нейроны нечувствительными к Иодо. Данное предсказание остается в силе по отношению к нейронам куриных ганглиев дорзальных корешков Е13; обработка Р1-РЬС отменяет как связывание АР-Иодо, так и индуцированный С8Т-Иодо-66 коллапс конусов роста (фиг. 10а-с). В качестве контроля в параллельных культурах обработка Р1-РЬС не изменяла ответ на 8ета3А. Конечно, ожидается, что обработка Р1-РЬС удаляет некоторое количество белков с поверхности аксонов, так что данный результат оставляет возможность того, что другие связанные с СР1 белки опосредуют ответ на Иодо-66 в необработанных культурах.

Для демонстрации того, что рецептор Иодо-66 способен опосредовать ингибирование разрастания аксонов за счет Иодо-66, белок экспрессировали в нейронах, лишенных реакции на Иодо-66. Испытывали нейроны ганглиев дорзального корешка и сетчатки из куриных эмбрионов Е7. Реакции на Иодо в нейронах ганглиев дорзального корешка с данной стадии развития являются слабыми, но в некоторых культурах можно выявить незначительный ответ (данные не показаны). Конусы роста клеток ганглиев сетчатки Е7 одинаково нечувствительны к индуцированному Иодо-66 коллапсу конусов роста (фиг. 10е), не связывают АР-Иодо (данные не показаны), и в них не проявляется 85 кДа белок, иммунореактивный с антителами против рецептора Иодо-66 (фиг. 9а). Экспрессия в данных нейронах ИдВ путем инфекции рекомбинантными препаратами Н8У приводит к появлению у конусов роста клеток ганглиев сетчатки чувствительности к индуцированному Иодо-66 коллапсу. Инфекция контрольным препаратом Н8У, экспрессирующим плексин А1, не изменяет реакции на Иодо. Совместно эти данные означают, что идентифицированный здесь рецептор Иодо участвует в опосредованном Иодо-66 ингибировании реакции аксонов.

Пример 12. Структурный анализ рецептора Иодо-66.

Структуру рецептора Иодо-66 оценивали путем определения, какой регион опосредует связывание Иодо-66. Данный белок легко разделяется на регион повторов, богатых лейцином, и не содержащий их регион. Анализ делеций ясно показывает, что богатые лейцином повторы требуются для связывания Иодо-66, но оставшаяся часть белка не является необходимой для этого (фиг. 11). В домене богатых лейцином повторов отдельно подвергали делеции два домена. Предсказано, что должна поддерживаться вся структура домена богатых лейцином повторов, и сходный подход применяли для рецептора лейтропина. Очевидно, что связывание Иодо-66 требует наличия всех восьми богатых лейцином повторов, и предпо

- 26 008480 лагается, что значительный сегмент плоской поверхности формируется линейными бета-листами богатых лейцином повторов. Находящиеся с Ν- и С-конца от богатых лейцином повторов консервативные богатые цистеином регионы с каждого конца от богатых лейцином повторов также требуются для связывания №до-66, по-видимому, они необходимы для формирования подходящей конформации богатого лейцином повтора.

Пример 13. Блокада №до растворимым белком-эктодоменом рецептора Чодо.

Одним из способов блокирования каскада трансдукции сигнала, инициируемого связыванием №до66 с рецептором №до, является получение избытка растворимого эктодомена рецептора. Секретируемый фрагмент белка-рецептора №до продуцировали в клетках НЕК293Т. кДНК, кодирующую аминокислотные остатки 1-348 мышиного рецептора №до, лигировали в эукариотический экспрессионный вектор и данной ДНК трансфицировали клетки НЕК293Т. Кондиционированная среда от данных клеток содержит высокие концентрации данного фрагмента рецептора №до (ЫдК-экто), что продемонстрировано путем иммуноблотов с антителом против Ν§Κ.. Кондиционированная среда содержит примерно 1 мг/л белка ЧдК-экто. При анализе связывания АР-Ыодо добавление кондиционированной среды с ЧдК.-экто к клеткам СО8-7, экспрессирующим полноразмерный рецептор Чодо, или к нейронам ганглиев дорзального корешка снижает связывание 0,5 нМ АР-Ыодо-66 на 80%. Формирование комплексов между растворимым ЧдК-экто и Чодо-66 предотвращает связывание с рецепторами клеточной поверхности.

В некоторых рецепторных системах такие растворимые комплексы «лиганд-рецептор» могут блокировать сигнал путем образования неэффективных взаимодействий. Например, растворимый эктодомен Тгк служит для блокирования сигнала нейротрофина и широко используется с данной целью (8Бе1!ои е! а1., (1995) 1. №иго8с1. 15, 477-491). Альтернативно, растворимый комплекс №до-66/ЧдК-экто может связываться и стимулировать предполагаемую вторую трансмембранную субъединицу рецептора №до. Имеется предшествующий пример данного типа действия из исследований рецпторов семейства ΟΌΝΕ (Саса1аио е! а1., (1998) №игои 21, 53-62). Комплекс Nοдο-66/NдΚ-экто не вызывает коллапс конусов роста в тех нейронах (куриные клетки ганглиев сетчастки Е7), которые не имеют рецептора №до-66, но содержат другие компоненты сигнального пути №до. Это означает, что NдΚ-экто функционирует как блокатор сигнала №до-66.

В прямых тестах белок NдΚ-экто защищает аксоны от ингибиторных эффектов №до-66. NдΚ-экто предотвращает индуцированный №до-66 коллапс конусов роста и блокирует индуцированное №до-66 ингибирование разрастания нейритов в куриных нейронах ΌΚΟ Ε13 (фиг. 12). Более того, наличие белка NдΚ-экто блокирует способность миелина ЦНС ингибировать разрастание аксонов ш νίΙΐΌ (фиг. 12). Эти данные демонстрируют, что белок NдΚ-экто может опосредовать регенерацию аксонов 1и νί\Ό.

Хотя настоящее изобретение описано детально со ссылкой на вышеуказанные примеры, понятно, что могут быть выполнены различные модификации без отклонения от духа изобретения. Соответственно, изобретение ограничено только следующими пунктами. Все цитированные патенты и публикации, на которые ссылается данная заявка, включены сюда в качестве ссылки во всей их целостности. Результаты части описанных здесь экспериментов были опубликованы (СгаибРге е! а1., (2000) №11иге 403, 439-444) после даты подачи И.8. Р^ον^8^οиа1 АррБсаБои 60/175707, с которой данная заявка предъявляет право на приоритет, причем данная публикация включена сюда в качестве ссылки во всей целостности.

- 27 008480

Список последовательностей <110> 5Ы1ССтаССег, ЭСерЪеи М.

<120> Опосредованная рецептором N060 блокада роста аксонов <130> 44574-5073-И0 <140>

<141>

<150> и8 60/175,707 <131> 2000-01-12 <150> 175 50/207,366 <151> 2000-05-26 <15С> ПЭ 60/236,378 <151> 2000-09-29 <16С> 20 <170> РаСепСШ Уег. 2.1 <210> 1 <211> 1719 <212> ДНК <213э Нойю еархепв <220>

<221> СОЗ <222> (166)..(1584) <223 > Предсказанный ген человеческого рецептора Подо <400> 1 адсссадсса дадссдддсд садсддадсд сдссдадссС сдссссдсдд ссдддссддд 60 дседддссдС адсддсддсд ссСддасдсд дасссддссд сддддадасд ддсдсссдсс 120 ссдааасдас сСйсадСссс сдасдсдссс сдсссаассс сСасд асд аад адд дед 177

Мес Ьуе Агд А1а

ссс дсс Зег АД а 5

99» <Э1у

999 О1у

аде Зег

=99 Агд 10

сед Ьеи

сед дса Сдд дед ссд сдд сед сад дсс

225

Ьеи

АД а

Тгр

Уа1 Ьеи Тгр Ьеи (31п А 1а

15

20

ьдд

сад

дгд

дса

дсс

сса

Сдс

сса

ддс

дсс

Сдс

дса

сдс

Сас

ааС

дад

273

тгр

(31п

Уа1

А1а

АД а

Рго

Сув

Рго

(31у

А1а

Суя

Уа1

Суе

туг

Аян

(Э1и

25

30

35

ссс

аад

дйд

асд

аса

аде

сдс

ссс

сад

сад

ддс

ссд

сад

дсс

дед

ссс

321

Рго

Ьуз

Уа1

ТЬг

ТЬг

Зег

суя

Рго

<310

О1п

<31у

Ьеи

□1п

А1а

Уа1

Рго

40

45

50

дЬд

99е

аСс

ССС

дсс

дсс

аде

сад

сдс

аСс

ССс

ссд

сас

ддс

аас

сдс

369

-28008480

ν&1 О1у Не Рго А1а А1а Зег 81 η Агд Не РИе Ьеи Н1е С1у Аяп Агд

55

60

65

аре

: есд

1 сае

дед

[ сса

ι дсе

дсс

адс

еес

еде

дсс

Сдс

сдс

аае

сес

асе

417

Не

! Зег

ΗΪ8

Уа1

Ргс

> А1а

А1а

Зег

Рке

Агд

А1а

Суз

Агд

Азп

Ьеи

ТЫ

70

75

80

асе

сед

едд

сед

: сас

есд

аае

дед

сед

дсс

еда

аее

дас

дед

дсе

дсс

465

Не

Ьеи

Тгр

Ьеи

Н1в

Зег

Азп

Уа1

Ьеи

А1а

Агд

Не

Азр

А1а

А1а

А1а

85

90

95

100

еес

асе

ддс

сед

дсс

сес

сед

дад

сад

сед

дас

сес

адс

дае

аае

дса

513

РЬе

ТЫ

01у

Ьеи

А1а

Ьеи

Ьеи

81и

□1п

Ьеи

Аяр

Ьеи

Зег

Аяр

Аяп

А1а

105

110

115

сад

сес

едд

есе

дед

дас

ссе

дсс

аса

еес

сас

ддс

сед

ддс

сдс

сеа

561

С1п

Ьеи

Агд

Зег

Уа1

Аар

Рго

А1а

ТЬг

РЬе

И18

81у

Ьеи

О1у

Агд

Ьеи

120

125

130

сас

асд

сед

сас

сед

дас

сдс

еде

ддс

сед

сад

дад

сЬд

ддс

ссд

ддд

609

Идя

Ткг

Ьеи

ΗΪ8

Ьеи

Аар

Агд

Суя

С1у

Ьеи

αΐη

81и

Ьеи

С1у

Рго

С1у

135

140

145

сед

еес

сдс

ддс

сед

дсе

дсс

сед

сад

еас

сес

Сас

сСд

сад

дас

аае

657

Ьеи

РИе

Агд

01у

Ьеи

А1а

А1а

Ьеи

81»

Туг

Ьеи

Туг

Ьеи

£Э1п

Азр

Азп

150

155

160

дед

сед

сад

дса

сед

ссе

дае

дас

асе

еес

сдс

дас

сСд

ддс

аае

сес

705

А1а

Ьеи

<31п

А1а

Ьеи

Рго

Аяр

АВр

ТЬг

РЬе

Агд

Авр

Ьеи

81у

Азп

Ьеи

165

170

175

180

аса

сас

сес

еес

сед

сас

ддс

аас

сдс

аРс

есс

аде

дед

ссс

дад

сдс

753

Ткг

ΗΪ3

Ьеи

Рке

Ьеи

ΗΪ8

(31у

Авп

Агд

Не

Зег

Зег

Уа1

Рго

<31и

Агд

185

190

195

дсс

еес

еде

ддд

сед

сас

адс

сес

дас

еде

сес

сеа

сСд

сас

сад

аае

801

А1а

Рке

Агд

О1у

Ьеи

Н1в

Зег

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Я1в

βία

Азп

200

205

210

сдс

дед

дес

сае

дед

сас

ссд

сае

дсс

еее

еде

дас

еее

ддс

сдс

сес

849

Агд

νβΐ

А1а

Н1з

ναΙ

ΗΪ8

Рго

Ηίκ

А1а

РЬе

Агд

АЗр

ьеи

О1У

Агд

Ьеи

215

220

225

аед

аса

скс

еае

сед

еее

дсс

аае

аае

сеа

Сса

дед

сед

ссс

асе

дад

897

МеЬ

ТЫ

Ьеи

Туг

Ьеи

РЬе

А1а

Азл

Азп

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

Рго

ТЬг

81и

230

235

240

дсс

сед

дсс <

ссс

сед

еде

дсс

сед

сад

еас

сед

адд

сес

аае

дас

аае

945

А1а

Ьеи .

А1а

Рго

Ьеи

Агд

А1а

Ьеи

81п

туг

Ьеи

Агд

Ьеи

Аяп

Авр

Азп

245

250

255

260

ссс

едд

дед ι

еде .

дас

еде

едд

дса

сдс

сса

сес

едд

дсс

едд

сед

сад

993

Рго 1

Тгр '

Уа1 Суя Авр

Сув Агд ,

А1а .

Агд

Рго

Ьеи

Тгр

А1а

Тгр

Ьеи

αΐη

265

270

275

аад ι

еес сдс ддс ·

есс

есс 1

есс

дад <

дед

ссс

еде

адс

сес

ссд

саа

сдс

1041

-29008480

Ьуз РЬе Агд <31у Зег бет Зег Й1и Уа1

Рго

Суз Зег Ьеи Рго 290

Й1п Агд

280

285

сед

дсе

ддс

еде

дас

сес

ааа

сдс

сеа

дсе

дсс

аае

дас

сед

сад

99С

1089

Ьеи

А1а

С1у Агд

Аар

Ьеи

Ьув

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Авп

Авр

Ьеи

О1п

О1у

295

300

305

еде

дес

дед

дсс

асе

ддс

ссе

еас

сае

ССС

аес

едд

асе

ддс

адд

дсс

1137

Сув

А1а

Уа1

А1а

ТЬг

Й1у

Рго

Туг

Н18

РГО

Не

Тгр

ТЬг

Й1у

Агд

Айа

310

315

320

асе

дае

дад

дад

сед

сед

ддд

сее

ССС

аад

еде

еде

сад

сса

дас

дсс

1185

ТЬг

Авр

<31Ц

Й1и

Рго

Ьеи

О1у

Ьеи

Рго

Ьув

Сув

Сув

О1п

Рго

Азр

Айа

325

330

335

340

дсе

дас

аад

дсс

еса

де а

сед

дад

ссе

дда

ада

сса

дсе

есд

дса

ддс

1233

А1а

Авр

Ьуз

А1а

Зег

Уа1

Ьеи

Й1и

Рго

С1у

Агд

Рго

А1а

Зег

А1а

Сйу

345

350

355

аае

эсд

сед

аад

дда

сдс

дьд

ссд

ссс

дд£

дас

аде

ссд

ссд

ддс

аас

1281

Авп

А1а

Ьеи

Ьув

СИу

Агд

Уа1

Рго

Рго

<31у

Авр

Зег

Рго

Рго

<31у

Авп

360

365

370

ддс

есе

ддс

сса

едд

сас

аес

аае

дас

еса

ссс

еее

ддд

асе

сед

ссе

1329

Й1у

Зег

<31у

Рго

Агд

Н1в

Не

Авп

Авр

зег

Рго

РЬе

Й1у

ТЬг

Ьеи

Рго

375

380

385

ддс

есе

дсе

дад

ссс

ссд

сес

асе

дса

дед

едд

ссс

дад

ддс

есс

дад

1377

<Яу

Зег

А1а

С1и

Рго

Рго

Ьеи

ТЬг

А1а

Уа1

Агд

Рго

С1и

С1у

5ег

Й1и

390

395

400

сса

сса

ддд

еес

ССС

асе

есд

ддс

ссе

сдс

едд

адд

сса

ддс

еде

еса

1425

Рго

Рго

Й1у

РЬе

Рго

ТНг

Зег

С1у

Рго

Агд

Агд

Агд

Рго

<31у

Сув

Зег

405

410

415

420

сдс

аад

аас

сдс

асе

сдс

аде

сас

еде

еде

сед

ддс

сад

дса

ддс

аде

1473

Агд

Ьув

Авп

Агд

ТЬг

Агд

Зег

ΗΪ8

Суя

Агд

Ьеи

С1у

01п

А1а

Й1'У

2ег

425

430

435

999

ддь

ддс

999

асе

дде

дас

еса

даа

ддс

еса

дде

дсс

сеа

ссс

аде

1521

С1у

Й1у

<31у

Й1у

ТЬг

<31у

Авр

Зег

О1и

О1у

Зег

<31у

Айа

Ьеи

Рго

Зег

440

445

450

сес

асе

еде

аде

сес

асе

ссс

сед

ддс

сед

дед

сед

дед

сед

едд

аса

1569

Ьеи

ТЬг

Суз

Зег

Ьеи

ТЬГ

Рго

Ьеи

С1у

Ьеи

А1а

Ьеи

Уа1

Ьеи

Тгр

ТЬг

455

460

465

дЬд сее ддд ссс еде Сдасссссад сддаеасаад адсдедсеса дсадссадде 1624 Уа1 Ьеи Й1у Рго Сув

470 дСдСдеасае асддддесес есессасдсс дссаадссад ссдддсддсс дасссдСддд 1634 дсаддссадд ссаддессес ссйдаЪддас дссед

1719

-30008480 <210> 2 <211> 473 <212> Белок <213> Ното вархедэ <400> 2

Мес Ьуз Агд А1а Зег А1а 01 у 01 у Зег Агд Ьеи ьеи А1а Тгр Уа1

Ьеи

1

5

10

15

Тгр

Ьеи

С1п АХа 20

Тгр

□1п

Уа1

Айа

АХа 25

Рго

Сув

Рго

С1у

АХа 30

Сув

Уа1

Сув

Тут

Авп О1и 35

Рго

Ьув

Уа1

ТЬг 40

ТЬг

Зег

сув

Рго

£31 п 45

О1п

<31у

Ьеи

О1п

А1а 50

νβΐ Рго

Уа1

01у

Не 55

РГО

АХа

А1а

Зег

01п 60

Агд

Не

РЬе

Ьеи

Ηίδ 65

О1у

Авп Агд

Не

Зег 70

Н1в

Уа1

Рго

Айа

А1а 75

Зег

РЬе

Агд

АХа

Сув 80

Агд

Авп

Ьеи ТЬг

Не 85

Ьеи

Тгр

Ьеи

ΗΪ5

Зег 90

Авп

УаХ

Ьеи

Айа

Агд 95

Не

Аар

А1а

А1а А1а 100

РЬе

ТЬг

О1у

Ьеи

Айа 105

Ьеи

Ьеи

Сйи

Ойп

Ьеи 110

Авр

Ьеи

Зег

Авр

Авп А1а 115

О1п

Ьеи

Агд

Зег 120

Уа1

Авр

Рго

А1а

ТЙГ 125

РЬе

Нхв

<31у

Ьеи

Е1у 130

Агд Ьеи

Нхв

ТЬг

Ьеи 135

Н1в

Ьеи

Авр

Агд

Сув 140

О1у

Ьеи

О1п

01и

Ьеи 145

О1у

Рго 01у

Ьеи

РЬе 150

Агд

Ойу

Ьеи

АХа

А1а 155

Ьеи

01п

туг

Ьеи

Туг 160

Ьеи

О1п

Авр Авп

А1а 165

Ьеи

С1п

А1а

Ьеи

Рго 170

А8р

Авр

ТЬг

РЬе

Агд 175

Авр

Ьеи

С1у

Авп Ьеи 1В0

ТЬг

Н1а

Ьеи

РЬе

Ьеи 185

ΗΪ8

Е1у

Авп

Агд

Не 190

Зег

Зег

Уа1

Рго

01и Агд 195

А1а

РЬе

Агд

<Э1у 200

Ьеи

ΗΐΒ

Зег

Ьеи

Авр 205

Агд

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Н1в 210

О1п Авп

Агд

Уа1

Айа 215

Нхв

ν*1

ΗΪ8

РГО

Н1в 220

Айа

РЬе

Агд

Авр

Ьеи 225

О1у

Агд Ьеи

МеС

ТЬг 230

Ьеи

Туг

Ьеи

РЬе

А1а 235

Авп

Авп

Ьеи

Зег

А1а 240

Ьеи

Рго

ТЬг О1и

А1а 245

Ьеи

Айа

Рго

Ьеи

Агд 250

А1а

Ьеи

<31п

Туг

Ьеи 255

Агд

Ьеи .

АбП .

Авр Авп 260

Рго

Тгр

7а1

Сув

Азр 265

Сув

Агд

А1а

Агд

РГО 270

Ьеи

Тгр

-31 008480

А1а Тгр Ьеи СХп Ьув РЬе Агд СХу Зег Зег Зег <31и Уа1 Рго Сув

Зег

275

280

285

Ьеи

РГО

бХп

Агд

ьеи

А1а

ЗХу Агд

лар

Ьеи

Ьув

Агд

Ьеи

АХ а

А1а

Азп

250

255

300

Азр

Ьеи

бХп

С1у

Сув

А1а

УаХ

А1а

ТЬг

81у

Рго

Туг

Н1в

Рго

11е

Тгр

305

310

315

320

ТЬг

б1у

Агд

АХа

ТЬг

Авр

С1и

О1и

РГО

Ьеи

<31у

Ьеи

РГО

ьув

Сув

Сув

325

330

335

С1п

Рго

Авр

АХа

А1а

Авр

Ьув

А1а

зег

Уа1

Ьеи

О1и

Рго

01у

Агд

Рго

340

345

350

АХ а

Зег

АХа

бХу

Авп

А1а

Ьеи

Ьув

оху

Агд

УаХ

Рго

Рго

□Ху

Авр

Зег

355

360

365

Рго

РГО

бХу

Аэп

бХу

Зег

б1у

Рго

Агд

ΗΪ5

Не

Авп

Авр

Зег

Рго

РЬе

370

375

380

бХу

ТЫ

Ьеи

Рго

С1у

Зег

А1а

ОХи

Рго

Рго

Ьеи

ТЬГ

А1а

Уа1

Агд

Рго

385

390

395

400

<31и

С1у

Зег

ОХи

Рго

Рго

<51у

РЬе

рго

ТЫ

Зег

б!у

Рго

Агд

Агд

Агд

405

410

415

Рго

бХу

Сув

Зег

Агд

Ьув

Ав η

Агд

ТЪг

Агд

Зег

Ηίθ

Сув

Агд

Ьеи

б1у

420

425

430

□1п

А1а

О1у

Зег

б1у

б!у 01у 01 у

ТЫ

01у

Авр

зег

<31и

01у

Зег

<Э1у

435

440

445

А1а

Ьеи

Рго

Зег

Ьеи

ТЬг

Сув

Зег

Ьеи

ТЬг

Рго

Ьеи

(Ну

Ьеи

АХ а

Ьеи

450

455

460

УаХ

Ьеи

Тгр

ТЪг

УаХ

Ьеи С1у

Рго

Сув

465 470 <210> 3 <211> 1866 <212> ДНК <213 > Мив гаивсиХив <220>

<221> СЛ8 <222> (178)..(1556) < 2 2 3 > кДНК мышиного рецегггора Иодо <400> 3 адссдсадсс сдсдадссса дсссддсасд деададсдда дсдседдадс сесдссссдс 60 ддссдддссд ддассдддсс ддадсадсдд сдсседдаед сддасссддс сдсдсдсада 120

-32008480

сдддсдсссд ссссдаадсе дсесссадсд сссдасдсдс сссдсЕсдас сссдаад
а Ед аад адд дед Есе Еее дда	99*	аде	адд	сСд	сед	дса	ьдд	дед	сеа
МеЕ Ьув Агд А1а Зег Зег С1у 1 5	С1у	Зег	Агд 10	Ьеи	ьеи	А1а	Тгр	Уа1 15	Ьеи
Едд сЕа сад дсс Едд адд дЕа	дса	аса	сса	Еде	ссс	ддЕ	дсЕ	ьдг	дьд
Тгр Ьеи 03.11 А1а Тгр Агд УаХ 20	А1а	ТЬг 25	Рго	суа	Рго	(31у	А1а 30	Сув	ν&1
Еде Сас ааЕ дад ссс аад дЕа	аса	аса	аде	Еде	ссс	сад	сад	ддс	СЕд
сув Туг Авп О1и Рго Ьув Уа1 35	ТЬг 40	ТЬг	Зег	Суд	Рго	С1п 45	31п	С1у	Ьеи
сад дсЕ дед ссс асе ддс аЕс	сса	дсс	есе	аде	сад	еда	аЕс	ЕСс	сЕд
С31п А1а Уа1 Рго ТЬг 31 у Не 50 55	Рго	А1а	Зег	Зег	<31п 60	Агд	Не	РЬе	Ьеи
еаЕ ддс аас еда аЕс СеЕ сас	9*9	сса	дсс	9«9	аде	ЕС С	сад	Еса	Еде
ΗΪ8 С1у Авп Агд Х1е Зег НАв 65 70	νβΐ	Рго	А1а	А1а 75	Зег	РЬе	С1п	Зег	Сув 80
еда ааЕ ссс асЬ аЕс сЕд Едд	ССд	сас	ССС	ааЕ	дед	есд	дсс	едд	аЕс
Агд Авп Ьеи ТЬг Не Ьеи Тгр ВБ	Ьеи	Н1в	Зег 90	Азп	А1а	Ьеи	А1а	Агд 95	Не
дас дсС дсЕ дсс ССс асе ддс	сЕд	асе	ссс	сЕд	9*9	саа	сЕа	даЕ	СЕЕ
Авр А1а А1а А1а РЬе ТЬг <31у 100	Ьеи	ТЬг 105	Ьеи	Ьеи	(31и	С1п	Ьеи 110	Авр	Ьеи
адС даС ааС дса сад сЕЕ саС	дСс	дед	дас	ссС	асе	асд	ССс	сас	ддс
Зег Авр Авп А1а С1п Ьеи НАв 115	ν*1 120	Уа1	Авр	Рго	ТЬг	ТЬг 125	РЬе	НАв	<Э1у
сед ддс сас сед сас аса сед	сас	сеа	дас	еда	СдС	ддс	есд	едд	дад
Ьеи (31у Ηΐε Ьеи Нхя ТЬг Ьеи 130 135	НА в	Ьеи	Авр	Агд	Суа 140	(31у	Ьеи	Агд	С1и
есд 99ь ссс ддс сСа ССс сде	99*	аса	дса	дсС	СЕд	сад	Сас	СЕ с	Сас
Ьеи О1у Рго 31у Ьеи РЬе Агд 145 150	С1у	Ьеи	А1а	А1а 155	Ьеи	<31п	Туг	Ьеи	Туг 160
сСа саа дас аас ааС сСд сад	дса	ссс	ссС	дас	аас	асе	ЕСЕ	еда	дас
Ьеи С1п Аар Авп Авп Ьеи βΐη. 165	А1а	Ьеи	Рго 170	Авр	Авп	ТЬг	РЬе	Агд 175	Авр
сСд ддс аас сЬс асд саС ссс	ССС	сСд	саС	ддс	аас	сдС	аЕс	ссс	аде
Ьеи С1у Авп Ьеи ТЬг Н1я Ьеи 180	РЬе	Ьеи 185	НА в	□1у	Авп	Агд	11е 190	Рго	Зег
дед ссс дад сас дсС ССс сдС	ддс	есд	сас	аде	СЕЕ	9*с	сде	СЕС	еЕе
Уа1 Рго <31и Ηίβ А1а РЬе Агд 195	в!у 200	Ьеи	Н1в	Зег	Ьеи	Авр 205	Агд	Ьеи	Ьеи
ССд сас сад аас сас дСд дес	сде	дьд	сас	сса	саЕ	дсс	ЕЕС	едд	дас
Ьеи Ηΐв 31п Авп НАв Уа1 А1а .	Агд	ν«1 :	НАв	Рго	НАв	А1а	РЬе	Агд Авр

177

225

273

321

359

417

465

513

561

609

657

705

753

501

849

-33 008480

210

215

220

ссе дде сдс сЬс аСд Ьеи <31у Агд Ьеи МеС 225

асе ссс еас сед еее дсс аас аас сес есс аед

397

ТЬг Ьеи туг Ьеи 230

РЬе А1а Авп Азп Ьеи Бег МеС

235

240

сед

сей

дса

дад

де с

сса

асд

ссс

сед

адд

псе

сед

сад

пас

сед

еда

945

Ьеи

РГО

А1а

(31и

Уа1

Ьеи

Мес

Рго

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

С1п

Туг

Ьеи

Агд

245

250

255

сПс

аае

дас

аас

ссс

едд

дед

еде

дас

еде

едд

дса

еде

сса

сес

едд

993

Ьеи

Аал

Авр

Авп

Рго

тгр

Уа1

Суа

Авр

Сув

Агд

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Тгр

-

260

265

270

дсс

едд

сед

сад

аад

еес

еда

дде

Ссс

еса

Пса

дад

дед

ссс

Где

аас

1041

А1а

Тгр

Ьеи

□1л

Ьув

РЬе

Агд

61у

бег

Зег

Зег

01и

¥а1

Рго

Сув

Авп

275

280

235

сед

ссс

саа

сдс

сед

Эса

дас

еде

дае

сее

аад

сдс

сес

дсе

дсс

аде

1089

Ьеи

РГО

Агд

Ьеи

А1а

Аар

Агд

Авр

Ьеи

Ьув

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Бег

290

295

300

дас

сеа

дад

ддс

еде

дсе

дед

дсе

Сса

дда

ссс

есс

еде

ссс

аес

сад

1137

Авр

Ьеи

С1и

О1у

сув

АЗа

Уа1

А1а

Зет

О1у

РГО

₽Ье

Агд

Рго

Не

С1п

305

310

315

320

асе

аде

сад

сес

асе

дае

дад

дад

сед

сед

аде

сСс

ссс

аад

Сдс

еде

1135

ТЬг

£ег

<31л

Ьеи

ТИг

Азр

□1и

31и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

рго

Ьув

Сув

Сув

325

330

335

сад

сса

дае

дсе

дса

дас

ааа

дсс

сса

дГа

сПд

даа

ссс

ддд

адд

сса

1233

<31п

Рго

Авр

А1а

А1а

Авр

Ьув

А1а

Зег

Уа1

Ьеи

□1 и

Рго

01у

Агд

Рго

340

345

350

дсе

сое

дсс

дда

аас

дсс

сес

аад

дда

еде

дед

ссе

ссе

дде

дас

асе

1281

А1а

Бег

АЗ а

С1у

Авп

А1а

Ьеи

Ьув

<31у

Агд

ν&ι

Рго

Рго

(31у

Авр

ТЬг

355

зво

365

сса

сса

ддс

аае

ддс

еса

дде

ССС

едд

сас

асе

аас

дас

есе

сса

сее

1329

Рго

рго

в1у

АВП

61у

Зег

С1у

Рго

Агд

Н1в

Не

Авп

Авр

Зег

Рго

Рпе

370

375

380

дда

асе

еед

ссс

аде

есе

дса

дад

ссс

сса

сед

асе

дсс

сед

едд

ссе

1377

С1у

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

зег

А1а

О1и

Рго

Рго

Ьеи

ТЬг

А1а

Ьеи

Агд

Рго

385

390

395

400

999

дде

Ьсс

дад

сса

сса

дда

сес

ссс

асе

асе

дде

ссс

сдс

адд

адд

1425

О1у С1у

Зег

(31и

Рго

Рго

31у

Ьеи

Рго

ТЬг

ТЬг

О1у

Рго

Агд

Агд

Агд

405

410

415

сса ι

дде

еде

есс

едд

аад

аас

сдс

асе

сдс

аде

сас

Сдс

еде

сед

дде

1473

Рго ι

51у

Сун

Зег .

Агд

Ьуз

Авп

Агд

ТЬг

Агд

Зег

ΗΪ3

Суз

Агд

Ьеи

01у

420

425

430

сад ι

дед !

дда ;

аде <

ддд

дсс

аде

дда

аса

ддд

дас

дса

дад

дде

Пса

999

1521

βΐη А1а ι

31у ι

5ег 1

01у .

А1а

Зег

<31у

тЬг

<31у

Авр

Айа

С1и

31у

Зет

□ 1у

-34008480

1569

		435					440			445
дсЕ	сЕд	ссЕ	дсе	сед	дсс	Ьдс	аде	сее	дсе ссе СЕд	ддс сее дса	сед
А1а	Ьеи	Рго	А1а	Ьеи	А1а	Суе	Зег	Ьеи	АХа Рго Ьеи	<31у Ьеи АХа	Ьеи
	450					455			460
д(=а	сЕЕ	*99	аса	9^9	сее	999	сес	еде	Едассадсса ссадссасса
Уа1	ьеи	тгр	ТЬг	Уа1	Ьеи	СЯу	Рго	Сув
465					470

1616

ссаЕсаЕдЕЕ

аГааасадсЕ

саЕаЕддддЕ	сЕссееесас	дссдссадсс	ададссаддд	асаддеЕсЕ'д	1676
саддсссЕсе	сЕдасадаЕд	ссЕссссасс	адсссасссс	саесЕссасс	1736
ЕасадддЕЕс	едддддеддс	ддЕЕддЕЕса	саассссаас	ЕЕесасседд	1796
аеадасаеае	даааЕЕЕаЕЕ	ЕЕасЕЕдсдс	ааааЕассдд	аЕдасдЕдда	1856
					1866

<21С> 4 <211> 473 <212> Белок <213> Миа тивсиХиз <400> 4

мес 1

Ьув

Агд

АХа

Зег 5

Зег

31у ЗХу

Зег

Агд 10

Ьеи

Ьеи

АХа

Тгр

Уа1 15

Ьеи

Тгр

ьеи

С1П

АХ а 20

Тгр

Агд

Уа1

АХа

ТЬг 25

Рго

Сув

Рго

31у

А1а 30

Сув

УаХ

Сув

Туг

Авп 35

31и

Рго

Ьув

Уа1

ТЬг 40

ТЬг

Зег

Сув

Рго

31п 45

ЗХп

еху

Ьеи

31 η

АД а 50

ναΐ

Рго

ТЬг

31у

Не 55

Рго

А1а

Зег

Зег

ЗХп 60

Агд

Не

РЬе

Ьеи

Ηΐβ 65

О1у

Лап

Агд

Не

Зег 70

НХв

ν*ι

РГО

А1а

АХа 75

Зег

РЬе

ЗХп

Зег

Суз 80

Агд

Азп

Ьеи

ТЬг

Не 85

Ьеи

Тгр

Ьеи

НХв

Зег 90

Авп

А1а

Ьеи

АХа

Агд 95

11е

Аар

АХ а

АХа

АХ а 100

РЬе

ТЬг

31у

Ьеи

ТЬГ 105

Ьеи

Ьеи

□1и

в1п

Ьеи НО

Авр

Ьеи

Зег

Авр

Авп 115

А1а

31П

Ьеи

НХв

УаХ 120

Уа1

Авр

Рго

ТЬг

ТЬг 125

РЬе

Ηΐβ

ЗХу

Ьеи

О1у 130

НХе

Ьеи

НХз

ТЬг

Ьеи 135

Н13

Ьеи

Авр

Агд

Сув 140

ЗХу

Ьеи

Агд

ЗХи

Ьеи 145

<31у

рго

ЗХу

Ьеи

РЬе 150

Агд

ЗХу

Ьеи

АХа

АХа 155

Ьеи

<31п

Туг

Ьеи

Туг 160

-35 008480

Ьеи

31 η

. Авр

Авп

Авп

. Ьеи

. О1п А1а

Ьеи

Рго

Авр

Авп

ТЬг

РЬе

Агд

Авр

165

170

175

Ьеи

31у

АВП

Ьеи

ТЬг

Н1з

Ьеи

РЬе

Ьеи

Н1э

<31у

Авп

Агд

Не

Рго

Зег

180

165

190

7а1

Рго

01и

Ηίβ

А1а

РЬе

Агд

01у

Ьеи

Я15

зег

Ьеи

Авр

Агд

Ьеи

Ьеи

195

200

205

Ьеи

Н18

31п

Авп

ΗΪΒ

Уа1

А1а

Агд

νβΐ

Н13

Рго

Н1а

А1а

РЬе

Агд

Авр

210

215

220

Ьеи

31у

Агд

Ьеи

мее

ТЬг

Ьеи

Туг

Ьеи

РЬе

А1а

АВП

АВП

Ьеи

Зег

меи

225

2Э0

235

240

Ьеи

Рго

А1а

01и

Уа1

Ьеи

Мее

Рго

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

С1п

Туг

-Ьеи

Агд

245

250

255

Ьеи

Авп

Авр

АЗП

Рго

Тгр

νβΐ

Сув

Авр

Сув

Агд

А1а

Агд

Рго

Ьеи

Тгр

260

265

270

А1а

Тгр

Ьеи

<31п

Ьун

РЬе

Агд

(31у

Зег

Зег

Зег

С1и

Уа1

Рго

Сув

Авп

275

280

285

Ьеи

Рго

31п

Агд

Ьеи

А1а

Авр

Агд

Азр

Ьеи

Ьув

Агд

Ьеи

А1а

А1а

Зег

290

295

300

Аар

Ьеи

С1и

31у

сув

А1а

ν&ι

А1а

Зег

31у

Рго

РЬе

Агд

Рго

Не

□1п

305

310

315

320

ТЬг

Зег

С1п

Ьеи

ТЬг

Авр

С1и

31и

Ьеи

Ьеи

Зег

Ьеи

Рго

ьув

Суз

Сув

325

330

335

αΐη

Рго

Авр

А1а

А1а

Авр

Ьуа

А1а

Зег

Уа1

Ьеи

<31и

Рго

01у

Агд

Рго

340

345

350

А1а

Зег

А1а

31у

Авп

А1а

Ьеи

Ьуе

31у

Агд

Уа1

Рго

Рго

С1у

Авр

ТЬг

355

360

365

Рго

Рго

61у

Авп

01у

Зег

31у

Рго

Агд

Ηίε

Не

Авп

Авр

Зег

Рго

РЬе

370

375

380

31у

ТЬг

Ьеи

Рго

Зег

Зег

А1а

31и

Рго

Рго

Ьеи

ТЬГ

А1а

Ьеи

Агд

Рго

305

390

395

400

<31у ί

31 у

Зег 1

31и

Рго

РГО

<31у

Ьеи

Рго

ТЬг

ТЬГ

С1у

Рго

Агд

Агд

Агд

405

410

415

Рго <

31у

Суа ;

5ег Агд

Ьув

Авп

Агд

ТЬг

Агд

Зет

Ηϊε

Сув

Агд

Ьеи

31у

420

425

430

С1п А1а 1

Э1у Зег 31у А1а

Бег

З1у

ТЬг

о!у

Аар

А1а

С1и

01у

Вег

О1у

435

440

445

А1а Ьеи :

Рго А1а Ьеи А1а 1

Су В

Зег :

Ьеи ,

А1а

Рго

Ьеи

<31у

Ьеи

А1а

Ьеи

450

455

460

-36008480 νβΐ Ьеи Тгр ТЬг ν«1

465

Ьеи £5Ху Рго Суя

470 <210> 5 <211> 4053 <212> ДНК <213 > Нолю 8ар1еп8 <220>

<221 > 008 <222> (135)..(3710) <223> Человеческая мРЙК белка Коде (ΚΙΑΑ0886, (ЗепВапк

Ассезнхоп Νο. АВ020693) <400> 5 сассасадЪа ддесссНсдд сесадесддс ссадссссес есадессесс ссаассссса 60 саассдсссд сддсНседад асдсддсссс ддсддсддсд дсадсадскд садсаесаНс 120

ессасссесс

адсс

аСд даа МеС ЗХи 1

дас Авр

сед дас Ьеи Аяр 5

сад ОХп

нес Зег

ссе сед дес

есд Зег

есс зег

170

Рго

Ьеи

Уа1 10

есд

дас

аде

сса

ссс

едд

ссд

сад

ссс

дед

еес

аад

нас

сад

нес

дед

218

Зег

Азр

5ег

Рго

Рго

Агд

Рго

О1п

Рго

АХа

РЬе

Ьув

Туг

αΐη

РЬе

Уа1

15

20

25

адд

дад

ССС

дад

дас

дад

дад

даа

даа

дад

дад

дад

даа

дад

дад

дас

266

Агд

О1и

Рго

<31и

Авр

01и

□1и

01 и

С1и

01и

ахи

□Хи

О1и

аХи

СХи

Авр

30

35

40

дад

дас

даа

дас

ссд

дад

дад

сед

дад

дед

сед

дад

адд

аад

ссс

дсс

314

01ц

Авр

С1и

Авр

Ьеи

ОХи

01и

Ьеи

□Хи

Уа1

Ьеи

<31и

Агд

Ьуз

Рго

А1а

45

50

55

60

дес

ддд

сед

НСС

дед

дсс

сса

дьд

ссс

асе

дсс

ссе

дсс

дсс

ддс

дед

362

АХа

С1у

Ьеи

Зег

А1а

А1а

Рго

Уа1

Рго

ТЬг

АХа

Рго

А1а

А1а

сз1у

АХа

65

70

75

ссс

сед

асд

дао

еес

дда

аар

дас

еес

дьд

ссд

ссд

дед

ссс

едд

дда

410

Рго

Ьеи

мен

Аяр

РЬе

□1у

АЗП

Аяр

РЬе

Уа1

Рго

Рго

АХа

Рго

Агд

СХу

80

85

90

ссс

сед

ссд

дсс

дсс

ссс

ссс

дьс

дсс

ссд

дад

едд

сад

ссд

есе

ьдд

458

Рго

Ьеи

Рго

АХа

АХ а

Рго

Рго

УаХ

А1а

Рго

<Э1и

Агд

αΐη

Рго

Зег

Тгр

95

100

105

дас

ссд

аде

ссд

дед

Ссд

Ссд

асе

дед

ссс

дед

сса

Нее

ссд

сед

есе

506

Авр

Рго

Зег

Рго

УаХ

Зег

Зег

ТЬг

Уа1

Рго

А1а

РГО

Зег

Рго

Ьеи

Заг

110

115

120

дсе

дсс

дса

дсс

ссд

ссс

Ссс

аад

сес

ссс

дад

дас

дас

дад

ссе

ссд

554

АХа

А1а

А1а

ν*1

бег

Рго

Зег

Ьув

ьеи

Рго

СХи

Авр

Авр

(31 и

Рго

Рго

125

130

135

140

-37008480

дсс сдд ссЕ ссс ссс ссЕ ссс ссд А1а Агд Рго Рго Рго Рго Рго Рго 145

дсс аде дЕд аде ссс сад дса дад

602

А1а

Зег 150

Уа1 Бег Рго

О1п А1а <31и 155

ссс

дед

Едд

асе

сед

сса

дсс

ссд

дсЕ

ссс

дсс

дед

ссс

ссс

Есс

асе

650

Рго

Уа1

Тгр

ТЫ

Рго

Рго

А1а

Рго

А1а

Рго

А1а

А1а

Рго

Рго

Вег

ТЬг

160

165

170

сед

дсс

дед

ссс

аад

еде

адд

ддс

есс

Есд

ддс

Еса

дед

даЕ

дад

асе

699

Рго

А1а

А1а

Рго

Ьуз

Агд

Агд

аХу

Зег

Зег

□1у

Зег

УаХ

Авр

01и

ТЬг

175

180

185

СЕЕ

еее

дсЕ

сЕЕ

ССЕ

дсс

дса

ЕСЕ

дад

ССЕ

дед

аЕа

сдс

ЕСС

ЕСС

дса

746

Ьеи

РЬе

А1а

Ьеи

РГО

А1а

А1а

Зег

01 и

Рго

ν·ι

Не

Агд

Зег

Зег

А1а

190

195

200

даа

аас

а Ед

дас

«д

аад

дад

сад

сса

ддс

аас

асЕ

аЕЕ

ссд

дсс

ддс

794

С1и

Азп

МеС

Азр

Ьеи

Ьуз

С1и

<31п

Рго

(31у

Авп

ТЬг

Не

Зег

А1а

С1у

205

210

215

220

саа

дад

даЕ

ЕЕС

сса

ЕСЕ

дсе

сез

СЕЕ

даа

асЕ

дсс

дсс

ЕсЕ

сЕЕ

ССЕ

842

С1п

(31и

Азр

РЬе

Рго

Зег

Уа1

Ьеи

Ьеи

<з1и

ТЬг

А1а

А1а

Зег

Ьеи

Рго

225

230

235

есе

СЕд

ЕсЕ

ссЕ

сЕс

Еса

дсе

дсЕ

ЕСЕ

ЕЕС

ааа

даа

саЕ

даа

Пас

СЕЕ

890

Бег

Ьеи

Зег

РГО

Ьеи

Зег

А1а

А1а

Зег

РЬе

Ьуз

О1и

Н15

С1и

Туг

Ьеи

240

245

250

ддс

ааЬ

СЕд

Еса

аса

дЕа

ЕЕа

ссс

асЕ

даа

дда

аса

СЕЕ

саа

даа

ааЕ

938

Азп

Ьеи

Зег

ТЬг

ν»ι

Ьеи

Рго

ТЬг

(Ни

СЯу

ТЬг

Ьеи

(31п

С1и

Азп

255

260

265

дсе

адБ

даа

дсЕ

ЕСЕ

эза

дад

дсе

Еса

дад

аад

дса

ааа

асе

сЕа

ССС

986

Уа1

Зег

С1и

А1а

Зег

ьуз

О1и

Уа1

Зег

С1и

Ьуз

А1а

Ьуз

ТЫ

Ьеи

Ьеи

270

275

280

аса

дас

ада

даЕ

ЕЕа

аса

дад

ЕЕЕ

Еса

даа

ЕЕа

даа

Еас

Еса

даа

асд

1034

Не

Азр

Агд

Азр

Ьеи

ТЬг

С1и

РЬе

Зег

<31и

Ьеи

О1и

Тур

Зек

О1и

МеС

285

290 .

295

300

дда

сса

Есд

ЕЕС

аде

дес

ЕсЕ

сса

ааа

дса

даа

ЕСЕ

дсс

дПа

аЕа

дЕа

1082

В1у

Зег

Зег

РЬе

Зег

Уа1

Зег

Рго

Ьуз

А] а

В1и

Зег

А1а

Уа1

Не

Уа1

305

310

315

дса

аас

ССЕ

адд

даа <

даа

аСа

аЕС

дед

ааа

ааЕ

ааа

даЕ

даа

даа

дад

ИЗО

А1а .

Азп

Рго

Агд <

(Пи '

В1и

Не

Не

νΒ1

Ьув

Азп

Ьуз

АВр

(Ни

С31и

<31и

320

325

330

аад ι

ССа 1

дЕЕ .

адЕ ;

ааЕ .

аас

асе

СЕЕ

саЕ

ааЕ

саа

саа

дад

ЕЕа

ссЕ

аса

1178

Ьуз ]

Беи 1

7а1 ;

Зег Азп ;

Азп

Не

Ьеи

Ηίθ

Азп

С1п

□1п

С1и

Ьеи

Рго

ТЬг

335

340

345

дес ι

сЕЕ асЕ ааа 1

ЬЕд дЕЕ .

ааа '

дад -

даЕ

даа

дЕЕ

дед

ЕсЕ

Еса

даа

ааа

1226

А1а Ьеи ТЬг Ьуз Ьеи Уа1 :

Ьув 1

31и <

Азр

С1и

Уа1

Уа1

5ег

Зег

е1и

Ьуз

350 355 360

-38008480

дса ааа дас А1а Ьуз Азр 365

адр ррр аар Зег РЬе Азп 370

даа аад ада дРР дса дРд даа дер ссР

ард НеС 380

1274

С1и

Ьуя

Агд Уа1 А1а 375

Уа1 О1и А1а Рго

адд

дад

даа

РаР

дса

дас

РРС

ааа

сса

РРР

дад

еда

дра

едд

даа

дед

1322

Агд

О1и

С1и

Туг

А1а

Авр

РЬе

Ьув

Рго

РЬе

31и

Агд

Уа1

Тгр

О1и

Уа1

385

390

395

ааа

дар

адР

аад

даа

дар

адр

дар

аРд

ррд

дсс

дсе

дда

дде

ааа

асе

1370

Ьуз

Азр

Зег

Ьуз

61и

Авр

Зег

Авр

Мер

Ьеи

А1а

А1а

С1у О1у

Ьув

Не

400

405

410

дад

аде

аас

ррд

даа

адр

ааа

дед

даР

ааа

ааа

еде

ССР

дса

дас

аде

1418

С1и

Зег

Азп

Ьеи

С1и

Зег

Ьуз

Уа1

Азр

Ьуз

Ьув

Суз

РЬе

А1а

Адр

Зег

-

415

420

425

,т

ССР

дад

саа

асР

ааР

сас

даа

ааа

дар

аде

дад

адр

адр

аар

дас

дае

1466

Ьеи

С1и

О1п

ТЬг

Азп

Ηχε

61и

Ьуя

Авр

зег

О1и

Зег

Зег

Аян

Авр

Авр

430

435

440

аср

СсС

РРс

ссс

адр

асд

сса

даа

дде

аса

аад

дар

сдр

Сса

дда

дса

1514

ТЬг

Зег

РЬе

Рго

Зег

ТЬг

Рго

О1и

01у

Не

Ьув

Авр

'Агд

Зег

О1у

А1а

445

450

455

460

СаС

аРс

аса

рдр

дер

ссс

РРР

аас

сса

дса

дса

асе

дад

аде

аСС

дса

1562

туг

Не

ТЬг

Сув

А1а

Рго

РЬе

Аап

Рго

А1а

А1а

ТЬг

С1и

Зег

Не

А1а

465

470

475

аса

аас

аРР

РРР

ССР

ерд

РРа

дда

дар

ССР

асР

Сса

даа

аар

аад

асе

1610

таг

Азп

Не

РЬе

Рго

Ьеи

Ьеи

О1у

Азр

РГО

ТЬг

Зег

С1и

Авп

ьув

ТЬг

480

485

490

дас

даа

ааа

ааа

аРа

даа

даа

аад

аад

дсс

саа

аСа

дСа

аса

дад

аад

1658

Азр

<31и

Ьуз

Ьуз

Не

<51и

01 и

Ьув

Ьуз

А1а

О1п

Не

Уа1

ТЬг

С1и

Ьуя

495

500

5 05

ааР

аср

аде

асе

ааа

аса

рса

аас

ссР

РРР

сРС

дса

дса

дса

сад

дас

1706

Азп

ТНг

бег

таг

Ьуз

таг

Зег

Азп

Рго

РЬе

Ьеи

Уа1

А1а

А1а

С1п

Азр

510

515

520

СсР

дад

аса

дар

Рас

дСс

аса

аса

дар

ааР

РРа

аса

аад

дед

асС

дад

1754

Зег

С1и

ТЬг

Авр

Туг

Уа1

ТЬг

таг

Авр

Лап

Ьеи

ТЬг

Ьуя

Уа1

ТЬг

С1и

525

530

535

540

даа

дрс

дрд

дса

аас

ард

ССР

даа

ддс

сед

асР

сса

дар

сса

дра

сад

1802

С1и

Уа1

Уа1

А1а

Азп

Мер

Рго

01и

О1у

Ьеи

ТЬг

Рго

Авр

Ьеи

Уа1

О1п

545

550

555

даа

дса

рдр

даа

адр ι

даа

ррд

аас

даа

дее

аср

дде

аса

аад

аре

дсС

1850

С1и .

А. 1а

Суя 1

31 и ,

Зег <

31и

Ьеи

АЗП

01 и

ν»1

ТЬг

О1у

ТЬг

Ьуз

Не

А1а

560

565

570

РаС ι

даа

аса .

ааа :

ард ι

дас ’

ЬРд

дРР

саа

аса

Рса

даа

дсс

аСд

саа

дад

1898

Туг <

31и '

ТЬг )

□уз 1

Кее Авр :

Ьеи

Уа1

О1п

ТЬг

Зег

С1и

Уа1

Мер

О1п

<31и

575

580

585

-39008480

Сса Зег

сСс сас Ьеи Туг 590

ССС Рго

дса дса А1а А1а

сад О1п 595

ссе еде ьеи Суз

сса Рго

еса зег

ССС РЬе 600

даа О1и

дад О1и

Сса Зег

даа (Пи

1946

дсъ

асе

ссС

еса

сса

дее

сед

ссе

дас

аСС

дес

аСд

даа

дса

сса

сед

1994

А1а

ТНг

Рго

Зег

Рго

Уа1

Ьеи

Рго

Азр

Не

νβΐ

МеС

01и

А1а

Рго

Ьеи

605

610

615

620

ааС

есе

дса

ссе

аде

дсе

ддс

дсе

Ссс

дед

аеа

сад

ссс

аде

Сса

2042

Анп

Зег

А1а

Уа1

Рго

Зег

А1а

О1у

А1а

Зег

Уа1

Не

01п

Рго

Зег

Зег

625

630

635

Сса

сса

ССа

даа

д=ь

Ссе

еса

дее

аае

еае

даа

аде

аса

ааа

саС

дад

2090

Зег

Рго

Ьеи

О1и

А1а

Зег

Зег

ν«1

Аяв

Туг

01и

Зег

Не

Ьуз

Н13

О1и

640

645

650

ССС

даа

аас

ССС

сса

сса

СаС

даа

дад

дсс

асд

аде

дса

сса

сеа

ааа

2138

Рго

О1и

Азп

РГО

Рго

Рго

Туг

С1и

01и

А1а

Мес

зег

ν«1

Зег

Ьеи

Ьуз

655

660

665

ааа

дСа

Сса

дда

аеа

аад

даа

даа

асе

ааа

дад

ссе

даа

аае

аСС

аае

2186

Буе

V»!

Зег

<31у

Не

Ьуз

С1и

<Э1и

Не

Ьуз

01«

Рго

О1и

Азп

Не

Аяп

670

675

680

дса

дсс

сее

саа

даа

аса

даа

дсе

ссе

сас

аеа

ссе

аСС

дса

еде

дае

2234

А1а

А1а

Ьеи

С1п

О1и

ТЬг

С1и

А1а

Рго

Туг

11е

Зег

Не

А1а

Суз

Аяр

685

690

695

700

сса

аее

ааа

даа

аса

аад

сее

СсС

дсе

даа

сса

дсе

ссд

дас

ССс

Ссе

2282

Ьеи

Не

Ьуз

О1и

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Зег

А1а

<31и

Рго

А1а

Рго

Азр

РЬе

Зег

705

710

715

дас

еае

Сса

даа

асд

дса

ааа

дсс

даа

сад

сса

дед

ссе

дае

с ас

есе

2330

Дер

Туг

Зег

01и

мее

А1а

Ьуз

V»!

01 и

О1П

Рго

Уа1

Рго

Аяр

Ηί8

Зег

720

725

730

дад

сеа

дес

даа

дае

Ссс

еса

ссе

дае

Ссе

даа

сса

дее

дас

сеа

сее

2378

С1и

Ьеи

Уа1

01 и

Авр

Зег

Зег

Рго

Авр

Зег

О1и

Рго

ν*ι

Азр

Ьеи

РЬе

735

740

745

аде

дае

даС

еса

аса

ссе

дас

дее

сса

саа

звэ

саа

дас

даа

асе

дед

2426

Зег

Азр

Азр

Зег

Не

Рго

Авр

Уа1

Рго

О1п

Ьуз

<31 η

Авр

О1и

ТЬг

ν«1

750

755

760

аСд

сее

дед

ааа ;

даа

аде

сес

асе

дад

ас С

еса

сес

дад

Сса

аЬд

аса

2474

МеС

ьеи

Уа1 :

Ьуз <

31 и

Зег

Ьеи

ТЬг

О1и

ТЬг

Зег

₽Ье

О1и

Зег

Мес

Не

765

770

775

780

даа

СаС >

даа <

аае :

аад даа

ааа

сСс

аде

дсС

ссд

сса

ссе

дад

дда

дда

2522

(31и ’

Туг ί

31и Азп Ьуз С1и 1

Ьуз :

Ьеи

Зег

А1а

Ьеи

Рго

Рго

О1и

□1у 01у

785

790

795

аад <

сса '

Сас ССд даа СсС <

сее

аад

сес

аде

ССа

дае

аас

аса

ааа

дас

2570

Ьув :

Рго Туг Ьеи (Пи Зег ;

РЬе ьуз

Ьеи

Зег

Ьеи

Авр

Азп

ТЬг

Ьув

Аяр

800

805

810

-40008480

асе ейд ЕЕа ссЕ дай ТЬг Ъеи Ьеи Рго Авр 815

даа дЕЕ 01и Уа1

Еса аса ЕЕд аде ааа аад дад ааа аЕЕ

2618

Зег 820

ТЬг

Ъеи

Зег

Ьув

Ьув 01и Ьуз 825

Не

ссЕ

ЕЕд

сад

аЕд

дад

дад

сЕс

адЕ

асЕ

дса

д*Е

ЕаЕ

Еса

ааЕ

даЕ

дас

2666

Рго

Ьеи

О1п

мее

(Пи

С1и

Ьеи

Зег

ТЫ

А1а

ν»χ

Туг

Зег

Ав η

Азр

Азр

830

835

В40

Еса

ЕЕЕ

аЕЕ

ЕсЕ

аад

даа

дса

сад

аЕа

ада

даа

асЕ

даа

асд

ЕЕЕ

Еса

2714

Ьеи

РЬе

Не

Зег

Ьув

(31и

А1а

<31п

Не

Агд

О1и

ТЫ

31и

ТЫ

РЬе

Зег

845

850

855

860

даЕ

Еса

ЕсЕ

сса

аЕЕ

даа

аЕЕ

аЕа

даЕ

дад

ЕЕс

ССЕ

аса

ЕЕд

аЕе

адЕ

2762

' Авр

Зег

Зег

Рго

11е

С1и

Не

11е

Авр

С1и

РЬе

Рго

ТЬг

Ьеи

Не

Зег

865

870

875

ЕсЕ

ааа

асе

даЕ

Еса

ЕЕЕ

ЕСЕ

ааа

ЕЕа

дсс

адд

даа

езе

асЕ

дас

сЕа

2810

Зег

Ъуз

ТЬг

Аар

Зег

РЬе

Зег

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

<Э1и

Туг

ТЬг

Азр

Ьеи

880

885

вэо

даа

дЕа

Есе

сас

ааа

адЕ

даа

аЕЕ

дсЕ

ааЕ

дсс

сед

даЕ

дда

дсЕ

ддд

2858

(31и

Уа1

Зег

Н1в

Ьув

Зег

С1и

Не

А1а

Азп

А1а

Рго

Азр

(31у

А1а

О1У

895

900

905

Еса

ЕЕд

ССЕ

Еде

аса

даа

ЕЕд

ССС

саЕ

дас

СЕЕ

ЕсЕ

ЕЕд

аад

аас

аЕа

2906

Зег

Ьеи

Рго

Суя

ТЫ

01и

Ьеи

Рго

Нхя

Авр

Ьеи

Зег

Ьеи

Ьуз

Азп

Не

910

915

920

саа

ССС

ааа

д*Е

даа

дад

ааа

аЕе

адЕ

ЕЕС

Еса

даЕ

дас

ЕЕЕ

ЕсЕ

ааа

2954

С1п

Рго

Ъуа

Уа1

С1и

81и

Ьув

Не

Зег

РЬе

Бег

Азр

Азр

РЬе

Зег

Ьув

925

930

93 5

940

ааг

999

ЕсЕ

дсЕ

аса

Еса

аад

д*д

СЕС

ЕЕа

ЕЕд

ССЕ

сса

даЕ

9**

ЕсЕ

3002

Азп

91у

Зег

А1а

ТЫ

Зег

Ьув

ν*ι

Ьеи

Ъеи

Ьеи

Рго

Рго

Азр

ν»ι

Зег

945

950

955

дсЕ

ЕЕд

дсс

асЕ

саа

дса

дад

аЕа

дад

аде

аЕа

дЕЕ

ааа

ССС

ааа

дЕЕ

3050

А1а

Ьеи

А1а

ТЫ

21п

А1а

01и

Не

<31и

Зег

Не

Уа1

Ьув

Рго

Ьув

Уа1

960

965

970

сЕЕ

9*9

ааа

даа

дсь

дад

ааа

ааа

СЕЕ

ССЕ

ЕСС

даЕ

аса

даа

ааа

дад

3098

Ьеи

νβΐ

Ьув

<31и

А1а

01и

Ьув

Ьув

Ьеи

Рго

Зег

Авр

ТЬг

51и

Ъуз

Э1и

975

9В0

985

дас

ада

Еса

сса

ЕСЕ

дсЕ

аЕа

ЕЕЕ

Еса

дса

дад

сЕд

адЕ

ааа

асЕ

Еса

3146

Авр .

Агд

Зег

Рго

Зег

А1а

Не

РЬе

Зег

А1а

01и

Ьеи

Зег

Ьув

ТЬг

Зег

990

995

1000

дЕЕ ι

дЕЕ <

дас

сЕс

с*9

Еас

*дд

ада

дас

аЕЕ

аад

аад

асЕ

дда

дед

д*д

3194

Уа1 '

Уа1 „

Авр :

Ьеи :

Ьеи

Туг

Тгр

Агд

Авр

Не

Ьув

Ьув

ТЬг

<31у

Уа1

Уа1

1005

1010

1015

1020

ЕЕЕ ддс ι

дсс ι

аде -

СЕа

ЕЕс

сЕд

сЕд

СЕЕ

Еса

*сд

аса

дЕа

ЕЕс

аде

аре

3242

РЬе О1у А1а 1

Зег :

ьеи :

РЬе

Ьеи

Ъеи

Ъеи

Зег

Ьеи

ТЫ

Уа1

РЬе

Зег

Не

1025

1030

1035

-41 008480

3^9 Уай

аде дЕа аса дес Еас аЕЕ дес ЕЕд дес ссд

сСе Ьеи

Есс дЕд Зег Уай 1050

асе ТЬг

аЕс 11е

3250

вег ν»1 ТЬг 1040

Айа

Туг

11е

Айа Ьеи 1045

Айа

Ьеи

аде

ЕЕЕ

адд

аЕа

Еас

аад

ддь

дЕд

асе

саа

дес

асе

сад

ааа

сса

дас

3335

Зег

РЬе

Агд

Не

Туг

Ьуз

Зйу

V»!

1йе

Сйп

Айа

Не

айп

Ьуз

Зег

Азр

1055

1060

1065

даа

ддс

сас

сса

ЕЕС

адд

дса

ЕаЕ

сСд

даа

ЕСЕ

даа

дЕЕ

дсЕ

аЕа

ССС

3386

С1и

Сйу

Ηϊβ

РГО

РЬе

Агд

Айа

Туг

Ьеи

Сйи

Зег

С1и

Уай

Айа

Не

Зег

1070

1075

1080

дад

дад

ЕЕд

дсс

сад

аад

сас

адС

ааЕ

ЕсЕ

дсс

ССЕ

дд£

саЕ

д^д

аас

3434

<31 и

□йи

Ьеи

Уай

αΐη

Ьуз

Туг

Зег

Азп

Зег

Айа

Ьеи

Сйу

Нйе

Уай

АЗП

1085

1090

1095

1100

Еде

асд

аЕа

аад

даа

ссс

адд

сдс

сСс

ЕЕС

ЕСа

дсс

даС

дас

сса

дсс

3482

Суз

ТЫ

Не

Буе

(Зйи

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

РЬе

Ьеи

νβΐ

Азр

Аар

Ьеи

ν»ι

1105

1110

1115

даЕ

сас

ссд

аад

ССЕ

дса

ЗЕд

ЕЕд

асд

Едд

дса

ЕЕЕ

асе

ЕаЕ

деЕ

ддс

3530

Азр

Зег

Ьеи

Ьуз

РЬе

Айа

Уай

Ьеи

МеЕ

Тгр

УаХ

РЬе

ТЬг

туг

Уай

Сйу

1120

1125

ИЗО

дес

ЕЕд

ЕЕЕ

аас

ддс

сСд

аса

сЕа

сЕд

аЕС

ЕЕд

дсс

ССС

аСС

Сса

СЕе

3578

Айа

Ьеи

РЬе

Азп

С1у

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Не

Ьеи

Айа

Ьеи

Не

Зег

Ьеи

1135

1140

1145

ЕЕС

адЕ

дсс

ССС

дсс

асе

ЕаЕ

даа

едд

аас

сад

дса

сад

аЕа

дас

саЕ

3626

РЬе

Зег

Уай

Рго

Уай

Не

Туг

Зйи

Агд

Н13

Сйп

А1а

Сйп

Не

Азр

Нйз

1150

1155

1160

ЕаЕ

сЕа

дда

ССС

дса

аас

аад

аас

дЕс

ааа

даЕ

дсс

аЕд

дсЕ

ааа

аЕс

3674

Туг Ьеи

О1у

Ьеи

Айа

Азп

Ьуа

Азп

ν»ι

Ьуз

Аар

Айа

Мес

Айа

Ьуз

Не

1165

1170

1175

1180

саа

дса

ааа

аЕс

ССЕ

дда

еед

аад

еде

ааа

дсЕ

даа

Сдаааасдсс

3720

Сйп Айа

Ьуз

Не

Рго Ойу

Ьеи

Ьуа

Агд

Ьуз

Айа

Сйи

	1185	1150
сааааСааЕЕ	адЕаддадЕЕ	саЕсЕЕЕааа	ддддаСаЕЕс	аЕССдаССаЕ	аедддддадд	3780
дЕсадддаад	аасдаассЕС	дасдЕЕдеад	сдсадЕЕЕса	садаСсдСЕд	ЕЕадаЕсЕЕЕ	3840
аСЕСЕЕадсс	аЕдсасСдЕС	дЕдаддаааа	аЕЕассЕдЕс	ссдасЕдсса	ЕдЕдССсаСс	3900
аЕеЕЕаадЕа	ЕЕдСаадсЕд	сЕаЕдЕасдд	аЕЕЕааассд	ЕааЕсаЕаЕс	СССЕЕссЕаС	3960
ссдаддсасе	ддЕддааСаа	аааассСдеа	саЕСЕсасСЕ	СдЕЕдсадаЕ	адЕсЕЕдссд	4020
саСсЕЕддса	адссдсадад	аЕддеддадс	сад			4053

<210> б <211> 1192 <212> Белок

-42008480 <213> Ното аарДепз

<400> б

МеС 1

С1и Авр Ьеи Авр 5

О1п Зег

Рго Ьеи

УаД Зег 10

Зег

Зег Азр

Зег РГО 15

Рго

Агд Рго С1п 20

Рго

А1а

РЬе

Ьуз

Туг 25

ЗДп

РЬе

УаД

Агд

ОДи 30

Рго

ОДи

Авр

С1и 31и С1и 35

01 и

01и

01и

С1и 40

□1и

01и

01и

Авр

ОДи 45

АЗр

ОДи

Авр

Ьеи

01 и 01и Ьеи 50

О1и

Уа1

Ьеи 55

01и

Агд

Ьув

Рго

А1а 60

АДа

ОДу

Ьеи

Зег

А1а 65

А1а Рго Уа1

Рго

ТЬг 70

А1а

РГО

АДа

АДа

СДу 75

АДа

Рго

Ьеи

МеС

Авр 80

РЬе

<31у Азп Азр

РЬе 85

Уа1

Рго

Рго

АДа

Рго 90

Агд

ОДу

Рго

Ьеи

Рго 95

АД а

А1а

Рго рго УаД 100

АД а

Рго

01и

Агд

01п 105

Рго

Зег

Тгр

Авр

Рго но

Зег

Рго

Уа1

Зег Зег ТЬг 115

Уа1

Рго

А1а

Рго 120

Зег

Рго

Ьеи

Зег

АДа 125

АДа

АДа

УаД

Зег

Рго Зег Ьуз 130

Ьеи

Рго

С1и 135

Азр

Азр

О1и

Рго

Рго 140

А1а

Агд

Рго

Рго

Рго 145

Рго Рго Рго

АДа

Зег 150

Уа1

Зег

Рго

О1п

А1а 155

О1и

Рго

УаД

Тгр

ТЬг 160

Рго

Рго А1а Рго

АДа 165

Рго

А1а

А1а

Рго

Рго 170

Зег

ТЬг

Рго

АДа

АДа 175

Рго

Ьуз

Агд Агд 01у 180

Зег

Зег

(31у

Зег

Уа1 185

Авр

О1и

ТЬг

Ьеи

РЬе 190

А1а

Ьеи

Рго

А1а А1а Зег 195

СЦи

Рго

Уа1

Не 200

Агд

Зег

Зег

АДа

01и 205

Азп

Мек

Азр

Ьеи

Ьув 01и 01п 210

Рго

С1у

АЗП 215

ТЬг

11е

Зег

АДа

01у 220

<31п

ОДи

Авр

РЬе

Рго 225

Зег Уа1 Ьеи

ьеи

01и 230

ТЬг

А1а

АДа

Зег

Ьеи 235

Рго

Зег

Ьеи

Зег

РГО 240

Ьеи

Зег А1а А1а

5ег 245

РЬе

Ьуз

01и

ΗΪ8

О1и 250

Туг

Ьеи

О1у

Авп

Ьеи 255

Бег

ТЬг

Уа1 Ьеи Рго 260

ТЫ

О1и

С1у

ТЬг

Ьеи 235

01п

О1и

Азп

УаД

Зег 270

(Ни

АДа

Зег :

Ьуз 01и Уа1

Зег <

01и

Ьув

А1а

Ьуз

ТЬг

Ьеи

ьеи

Не

Азр

Агд

Авр

275 280 285

-43 008480

Ьеи ТЬг 290

01и РЬе Зег 01и Ьеи 01и Туг Зег 295

Сйи МеС 300

Ойу Бег Зег РЬе

Зег

Уай

Зег

Рго

1 Ьув

Айа

Ойи

Зег

Айа

Уай

Не

Уай

Айа

Азп

Рго

Агд

3 05

310

315

320

Сйи

Сйи

Не

Не

Уай

Ьув

Авп

Ьув

Авр

Ойи

Сйи

Сйи

Ьув

Ьеи

Уай

Зег

325

330

335

АВП

Авп

Не

Ьеи

Нйв

Авп

С1п

Ойп

О1и

Ьеи

Рго

ТЬг

Айа

Ьеи

ТЬг

Ьув

340

345

350

Ьеи

Уай

Ьув

Сйи

Авр

Ойи

Уай

Уай

Зег

Зег

Сйи

Ьув

Айа

Ьув

Авр

Зет

355

360

365

РЬе

Авп

Ойи

Ьув

Агд

Уай

Айа

Уай

ойи

Айа

Рго

МеС

Агд

сйи

Сйи

Тут

370

375

380

Айа

Авр

РЬе

Ьув

Рго

РЬе

Ойи

Агд

Уай

Тгр

Сйи

Уай

Ьуз

Азр

Зег

Ьув

385

390

395

400

Сйи

Авр

Зег

Авр

МеС

Ьеи

Айа

Айа

Ойу

С1у

Ьуз

Не

Сйи

Зег

Авп

ьеи

405

410

415

С1и

Зег

Ьув

Уай

Авр

Ьув

Ьув

Сув

РЬе

Айа

Авр

Зег

Ьеи

Сйи

сйп

ТЬг

420

425

430

Авп

Н1в

Сйи

Ьув

Авр

Зег

ойи

Зег

Зег

Азп

Авр

Азр

ТЬг

Зег

РЬе

Рго

435

440

445

Зег

ТЫ

Рго

Сйи

О1у

Не

Ьув

Авр

Агд

Зег

ойу

Айа

Тут

Не

ТЬг

Сув

450

455

460

Айа

Рго

РЬе

Авп

Рго

Айа

Айа

ТЬг

Сйи

Зег

Не

Айа

ТИг

Авп

Не

РЬе

465

470

475

480

Рго

Ьеи

Ьеи

01у

Авр

Рго

ТЬг

Зег

ойи

Авп

Ьув

ТЬг

Авр

Сйи

Ьуз

Ьув

485

490

495

Не

01 и

Сйи

Ьув

Ьув

Айа

Ойп

Не

Уай

ТЬг

Ойи

Ьув

Авп

ТЬг

Зет

ТЬг

500

505

510

Ьув

ТЬг

Зег

Авп

Рго

РЬе

ьеи

Уай

Айа

Айа

Сйп

Авр

Зег

Ойи

ТЬг

Авр

515

520

525

Туг

Уай

ТЬг

ТЫ

Авр

Авп

Ьеи

ТЫ

Ьуз

Уай

ТЫ

Сйи

Сйи

Уай

Уай

Айа

530

535

540

АВП

мес

Рго

Сйи

<3йу

Ьеи

ТЫ

Рго

Авр

Ьеи

Уай

Ойп

Сйи

Айа

Сув

С1и

545

550

555

560

Зег

Сйи

Ьеи

Авп <

01 и

Уай

ТЬг

О1у

ТЬг

Ьув

Не

Айа

Туг

Ойи

ТЬг

ьув

565

570

575

мес .

Авр :

Ьеи '

Уай <

01п ·

ТЬг

Зег ι

Ойи

Уай

МеС

сйп

Сйи

Зег

Ьеи

Туг

Рго

580 585 590

-44008480

А1а А1а αΐη Ьеи суа Рго Зег РЬе Ойи О1и Зег О1и А1а ТЬг Рго

Зег

595

600

605

Рго

Уа1

Ьеи

Рго

Авр

Не

Уай

Мее

С1и

А1а

Рго

Ьеи

Авп

Зег

Айа

Уа1

£10

615

620

Рго

Зег

А1а

Ойу

Айа

Зег

Уа1

Не

Ойл

Рго

Зег

Зег

Зег

Рго

Ьеи

Ойи

£25

630

635

64 0

А1а

Зег

Зег

Уа1

Абп

Туг

Ойи

Зег

Не

Ьув

Я1в

01и

РГО

Зйи

Аяп

Рго

645

650

655

РГО

Рго

Туг

О1и

С Хи

Айа

нее

Зег

Уай

Зег

Ьеи

Ьуз

Ьув

Уа1

Зег

О1у

660

565

670

Не

Ьув

О1и

(31и

Не

Ьув

С1и

Рго

Ойи

Азп

Не

Авп

АХа

Айа

Ьеи

Ойл

675

680

685

О1и

ТЫ

01и

Айа

Рго

Тут

Не

Зег

Не

Айа

Сув

Азр

Ьеи

11е

Ьуз

Й1и

690

695

700

ТЬг

Ьуз

Ьеи

Зег

Айа

<31и

Рго

Айа

Рго

Авр

РЬе

Зег

Авр

Туг

Зег

ОХи

705

710

715

720

Мее

А1а

Ьув

Уай

<31и

01п

Рго

Уай

Рго

Авр

Ηίβ

Зег

Ойи

Ьеи

Уай

Ойи

725

730

735

Авр

Зег

Зег

Рго

Авр

Зег

С1и

РГО

Уай

Авр

Ьеи

РЬе

Зег

Авр

Авр

Зег

740

745

750

Не

Рго

Абр

Уай

РГО

С1п

Ьув

01«

Авр

Ойи

ТЬг

Уай

Мее

Ьеи

Уай

Ьув

755

760

765

01«

Зег

Ьеи

ТЫ

□Хи

ты

Зег

РЬе

01«

зег

мее

11а

01«

Туг

С1и

Авп

770

775

780

Ьув

С1и

Ьув

Ьеи

Вег

Айа

Ьеи

РГО

Рго

Й1и

Ойу

О1у

Ьуа

Рго

Туг

Ьеи

785

790

795

еоо

01«

Зег

РНе

Ьув

Ьеи

Зег

Ьеи

Азр

АВП

ТЬг

Ьув

АВр

ТЬг

ьеи

Ьеи

Рго

805

810

815

Азр

<31 и

Уа1

Зег

ТЫ

Ьеи

Зег

Ьув

Ьув

01«

Ьув

Не

Рго

Ьеи

Ойп

Мее

820

В25

азо

<31«

Ойи

ьеи

Зег

ТЬг

А1а

УаХ

Туг

Зег

Азп

Азр

Аар

Ьеи

РЬе

116

баг

835

840

845

Ьув

Ойи

Айа

Сйп

Не

Агд

<31 и

ТЫ

01«

ТЫ

РЬе

Зет

Авр

Зег

Зег

Рго

850

855

860

Не

Ойи

Не

Не

Авр

ОХи

РЬе

Рго

ТЫ

Ьеи

Не

Зег

Зег

Ьув

ТЬг

Азр

865

870

875

880

Зег

РЬе

Зег

Ьув

Ьеи ,

Айа

Агд

Ойи

Туг

ТЫ

Авр

Ьеи

ойи

Уа1

зег

Нхв

885 890 895

-45 008480

Ьув зег ОХи

Не 900

АХа Азп АХа Рго Авр СХу АХа 0Ху Зег Ьеи Рго

Суз

905

910

ТЬГ

ОХи

Ьеи

Рго

ΗίΒ

Азр

Ьеи

Зег

Ьеи

ьуз

Азп

ХХе

01»

РГО

Ьув

Уа1

915

920

925

О1и

СХи

Ьув

Не

Зег

РЬе

Зег

Авр Авр

РЬе

зег

Ьуз

АЗП

01у

Зег

А1а

930

935

940

ТЬг

Зег

ьув

Уа1

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Рго

РГО

Авр

УаХ

Зег

АХа

Ьеи

АХа

ТЬг

945

950

955

960

О1п

А1а

(ЗХи

Не

(ЗХи

Зег

ХХе

Уа1

Ьув

Рго

ьув

УаХ

Ьеи

Уа1

Ьув

С1и

965

970

975

АХа

СХи

Ьув

Ьув

Ьеи

Рго

Зег

Авр

ТЬг

01и

Ьуз

О1и

Азр

Агд

Зег

Рго

980

985

990

зег

АХа

Не

.РЬе

Зет

АХа

□Хи

Ьеи

Зег

Ьуз

ТЬг

Зег

Уа1

Уа1

АВр

Ьеи

995

1000

1005

Ьеи

Туг

Тгр

Агд

Авр

Не

ьув

Ьув

ТЬг

01у

УаХ

Уа1

РЬе

01у

АХа

Зег

1010

1015

1020

Ьеи

РЬе

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Зет

Ьеи

ТЬг

УаХ

РЬе

зег

Не

УаХ

Зег

Уа1

ТЬг

1025

1030

1035

1040

А1а

Туг

Не

А1а

Ьеи

АХа

Ьеи

Ьеи

Зег

УаХ

ТЬг

Не

Зег

РЬе

Агд

Не

1045

1050

1055

Туг

Ьув

□Ху

УаХ

Не

□1п

АХа

ХХе

0ХП

Ьуз

Зег

Азр

□Хи

□Ху

Н1н

Рго

1060

1065

1070

РЬе

Агд

АХа

Туг

Ьеи

□1и

Зег

01 и

УаХ

АХа

Не

Зег

О1и

О1и

Ьеи

УаХ

1075

1080

1085

О1п

ьув

Туг

Зег

Азп

Зег

АХа

Ьеи

01у

Н1з

Уа1

Азп

Сув

ТЬг

Не

Ьуз

1090

1095

НОО

01и

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

РЬе

Ьеи

УаХ

АЗр

Азр

Ьеи

УаХ

Азр

Зег

Ьеи

Ьуз

1105

1110

1115

1120

РЬе

АХа

УаХ

Ьеи

Мег

Тгр

Уа1

РЬе

ТЬг

Туг

УаХ

□Ху

АХа

Ьеи

РЬе

Азп

1125

изо

1135

ОХу

Ьеи

ТЬг

Ьеи

ьеи

Не

Ьеи

А1а

Ьеи

Не

Зег

Ьеи

РЬе

Зег

УаХ

Рго

1140

1145

1150

Уа1

Не ‘

Туг

ЗХи .

Агд

Нхв

αΐη

АХа

О1п

Не

Авр

НХв

Туг

Ьеи

СХу

Ьеи

1155 1160 1165

А1а Авп Ьув Азл Уа1 Ьув Авр А1а МеЬ АХа Ьув Не С1п А1а Ьуа Не 1170 1175 ПВО

Рго О1у Ьеи Ьув Агд Ьув А1а 31и

1165 1190

-46008480 <210> 7 <211? 75 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связывания рецептора Рер1 <400> 7 рхеаддасае асаадддСдЬ даьссаадсь аессадааае садардаадд ссасссаыс бо адддсаеаес рддаа ⁷⁵ <210> 8 <211> 40 <212? Белок <213> Искусственная последовательность <220?

<223> Описание искусственной последовательности: Рер1 - ингибитор белка Иодо <400? 8

Агд II е Туг Ьув С1у Уа1 Не С31п А1а Не 01п Ьув 5ег Авр С1и О1у 15 Ю15

Н1в Рго РЬе Агд А1а Туг Ьеи О1и Зег С1и Уа1 А1а Не Зег С1и О1и 20 2530

Ьеи Уа1 С1п Ьув Туг Зег Авп Зег

3540 <210> 9 <211> 75 <212> ДНК < 213 > Искусственная последовательность <220?

<223 > Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связываний рецептора Рер2 <400? 9 айссадаааР садакдаадд ссасссасРс адддсаСайс сддааЕсЕда адРРдсРаса 60

ЬсЬдаддадЬ ЬддСЬ ⁷⁵ <210> 10 <211? 25 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

-47008480 <223? Описание искусственной последовательности: Рер2 - ингибитор белка N090 <400? 10

Не ОХп Ьув Зег Авр О1и (31у НХв Рго РЬе Агд А1а Туг Ьеи С1и Зег 15 10 15

О1и Уа1 А1а Х1е Зег О1и С1и Ьеи Уа1

25 <210? 11 <211? 75 <212> Белок <213 > Искусственная последовательность <220?

<223 > Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связывания рецептора РерЗ <400? Н

А1а О1у 31у С1у Сув А1а ТЬг А1а ТЬг Сув ТЬг О1у <31у А1а А1а ТЬг

1

5

10

15

Сув

ТЬг

С1у

АХа 20

А1а

О1у

ТЫ

ТЬг

С1у 25

Сув

ТЬг

АХа

ТЬг

А1а 30

ТЫ

Суз

ТЫ

<31у

АХа 35

□1у С1у

АХа

О1у

ТЫ 40

ТЫ

СХу СХу

ТЫ

ТЬг 45

Сув

АХа

31у

АХа

А1а 50

□Ху

ТЬг

АХа

Сув

А1а 55

<31у

ТЬг

АХ в.

АХа

ТЫ 60

ТЬг

Суз

ТЫ

<31у

Сув 65

ТЬг

Сув

ТЬг

ТЫ

О1у 70

О1у

ТЫ

Сув

АХа

ТЬг 75

<210? 12 <211? 25 <212? Белок <213? Искусственная последовательность <220?

<223? Описание искусственной последовательности: РерЗ · ингибитор белка Нодо <400? 12

Агд А1а Туг Ьеи (ЗХи Зег <31и Уа1 А1а Не Зег О1и О1и Ьеи Уа1 О1п

Ю 15

Ьув Туг Зег Авп

Зег АХа Ьеи О1у НХв <210? 13 <211? 75

-48008480 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>

<223 > Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связывания рецептора Рер4 <4О0> 13 исидаддадС ЬддЬссадаа дЪасадЬаай ьсидсЬсьид дЬсаЬдЬдаа сСдсасдаСа бо ааддаасиса ддсдс ⁷⁵ <210> 14 <211> 25 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: Рер4-ингибитор белка Подо <400> 14

Зег С31и <31и Ьеи νβΐ С1п Ьув Туг Зег Авп Зег А1а Ьеи О1у Ηΐ® νβΐ 15 Ю З·⁵

Авп Суз ТЬг Не Ьуз С1и Ьеи Агд Агд

25 <210> 15 <211> 75 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223 > Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связывания рецептора Рер5 <400> 15 дсЪскиддис аЬдйдаасЬд сасдаиавад даасисаддс дссисиисЬЕ адиЪдасдаЬ 60 еьад&ъдаии сисьд ⁷⁵ <210> 16 <211> 25 <212 > Белок <213> Искусственная последовательность <220>

< 2 2 3 > Описание искусственной последовательности: Рер5 - ингибитор белка Подо <400> 16

А1а Ьеи О1у Н1в νβΐ Азп Суз ТЬг Не Ьув Й1и Ьеи Агд Агд Ьеи РЬе 15 Ю 15

-49008480

Ьеи ν*1 Азр Азр Ьеи 7а1 Азр Еег Ьеи

25 <210> 17 <211> 120 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кДНК, кодирующая ингибитор связывания рецептора Рер2-41 <400» 17 аддаЕасаса адддЕдЕдаЕ ссаадсЕаЕС садаааЕсад аЕдааддсса сссаЕСсадд 60 дсаЕаЕсЕдд ааЕсЕдаадЕ ЕдсЕаЕаЕСЕ даддадЕЕдд ЕЕсадаадЕа еадеааЕЕсЕ 120 <210» 1В <211> 40 <212> Белок < 213 > Искусственная последовательность <220» <223 > Описание искусственной последовательности: Рер2-41 · ингибитор белка Подо

<400» 18

Агд 1

Не

Туг Ьув О1у 5

νβΐ

11е <31 η А1а

Не 10

(31п

Ьув

Зег

Авр

О1и 15

«У

НАв

Рго

РЬе

Агд

А1а

Туг

Ьеи

□1и

Зег

О1и

Уа1

А1а

Не

Зег

О1и

<31и

20

25

30

Ьеи

Уа1

<31П

Ьув

Туг

Зег

АЗП

Зег

35

40

<210»	13
<211>	198
<212»	ДНК
<213>	Нопто	варАепв
<220»
<221>	СОЗ
<222»	(1) ..	£198)

<223> Полный связывающий рецептор района гена Иодо <400> 13

ЕЕЕ РЬе 1

адд аса Еас аад ддЕ дЕд аЕс саа дсЕ аЕс сад ааа Еса даЕ

даа С1и

48

Агд Не Тух Ьуз С31у Уа1 5

Не О1п

А1а 10

Не

<31п ьув

Зег Азр 15

ддс

сас

сса

ЕЕС

адд

дса

ЕаЕ

сЕд

даа

ЕсЕ

даа

дЕЕ

дсЕ

аЕа

ЕСЕ

дад

96

О1у

НАв

Рго

РЬе

Агд

А1а

Туг

Ьеи

О1и

Зег

С1и

νβΐ

А1а

Не

Зег

□1и

20

25

30

-50008480

дад 01и

сед Ьеи

дес УаХ 35

сад аад Сас аде

аас ссе дсе

сес дде Ьеи ОХу

сае дед аас

Сдс Сув

144

<31л

Буе

Туг Зег

Аял Зег 40

АХа

Н18 45

Уа1

Ав η

асд

аса

аад

даа

сес

адд

сдс

сес

еес

сса

дсе

дас

дае

сса

дес

дас

192

ТЬг

Не

Ьув

<31 и

Ьеи

Агд

Агд

Ьеи

РЬе

ьеи

Уа1

Авр

Аар

Ьеи

Уа1

Авр

55 60 есе сед

Зег ьеи

198 <210> 20 <211> 66 <212> белок <223> Нолю варХеив <400> 20

РЬе 1

Агд

Не

Туг

Ьув 5

01у

УаХ

Не

αΐη

А1а 10

Не

С1п

Ьув

Зег

Авр 15

01и

С1у

Н18

Рго

РЬе 20

Агд

АХа

Туг

Ьеи

<31и 25

Зег

61и

УаХ

АХа

Не 30

Зег

в1и

ОХи

Ьеи

νβΐ 35

<31п

Ьув

Туг

Зег

Абп 40

Зег

АХа

Ьеи

С1у

НХз 45

Уа1

Азп

Сув

ТЬг

Не 50

Ьуа

<31и

Ьеи

Агд

Агд 55

Ьеи

РЬе

Ьеи

Уа1

Авр 60

Азр

Ьеи

V*!

Авр

Зег Ьеи

Claims (35)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид рецептора ΝΟΟΟ, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, по меньшей мере на 80% идентичный полипептиду, содержащему аминокислоты 1-348 §Εζ) ГО N0: 2 человека или ЗЕО ГО N0: 4 мыши.
2. 2. Полинуклеотид по п.1, который кодирует полипептид, по меньшей мере на 90% идентичный указанному полипептиду.
3. 3. Полинуклеотид по п.2, который кодирует полипептид, по меньшей мере на 95% идентичный указанному полипептиду.
4. 4. Полинуклеотид по п.З, который кодирует полипептид, содержащий аминокислоты 1-348 §Εζ) ГО N0: 2 человека или §Εζ) ГО N0: 4 мыши.
5. 5. Выделенный полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида рецептора ΝΟΘΟ (Ν§Κ), уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий область ЬШШТ Ν§Κ, области ЬКК Ν§Κ и область ЬККСТ Ν§Κ в пределах аминокислот 1-309 ЗЕО ГО N0: 2 человека или §Εζ) ГО N0: 4 мыши.
6. 6. Полинуклеотид по и. 5, который кодирует указанный фрагмент полипептида Ν§Κ человека.
7. 7. Полинуклеотид по и. 5, который кодирует указанный фрагмент полипептида Ν§Κ мыши.
8. 8. Выделенный полинуклеотид, кодирующий полипептид рецептора N000, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий аминокислоты 1-348 §Εζ) ГО N0: 2 человека или ЗЕО ГО N0: 4 мыши, слитый с гетерологичным полипептидом.
9. 9. Выделенный полинуклеотид, кодирующий растворимый фрагмент полипептида рецептора N000, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий по меньшей мере 50 смежных аминокислот из аминокислот 1-348 §Εζ) ГО N0: 2 человека или ЗЕО ГО N0: 4 мыши.
10. 10. Полинуклеотид по и.9, который кодирует полипептид, содержащий по меньшей мере 60 смежных аминокислот из аминокислот 1-348 §Εζ) ГО N0: 2 человека или §Εζ) ГО N0: 4 мыши.

    -51 008480
11. 11. Полинуклеотид по и. 10, который кодирует полипептид, содержащий по меньшей мере 70 смежных аминокислот из аминокислот 1 -348 §Εζ) Ш ΝΟ: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
12. 12. Полинуклеотид по пи.9, 10 или 11, который кодирует полипептид, содержащий области ЬКК Ν§Κ, область ЬШЮТ Ν§Κ и область ЬККСТ Ν§Κ.
13. 13. Полинуклеотид по любому из пи.1-12, который функционально присоединен к одному или нескольким контролирующим экспрессию элементам.
14. 14. Вектор, содержащий полинуклеотид по любому из пи. 1-13.
15. 15. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по любому из пи. 1-13 или вектор по и. 14.
16. 16. Клетка-хозяин по и. 15, которая представляет собой эукариотическую клетку.
17. 17. Полипептид рецептора ΝΟΘΟ, уменьшающий опосредованное рецептором ΝΟΘΟ ингибирование роста аксонов, экспрессируемый клеткой-хозяином по и. 15 или 16.
18. 18. Выделенный полипептид рецептора ΝΟΘΟ, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, по меньшей мере на 80% идентичный полипептиду, содержащему аминокислоты 1-348 §Εζ) Ш ΝΟ: 2 человека или §Εζ) Ш N0: 4 мыши.
19. 19. Полипептид по и. 18, который по меньшей мере на 90% идентичен аминокислотам 1-348 §Εζ) Ш N0: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
20. 20. Полипептид по и. 19, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 1-348 8 Ер Ш N0: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
21. 21. Полипептид по п.20, который содержит аминокислоты 1-348 8Ер Ш N0: 2 человека и 8Ер Ш N0: 4 мыши.
22. 22. Выделенный фрагмент полипептида рецептора N000 (Ν§Β), уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий область ЬШШТ Ν§Κ., области ЬКК. и область ЫШСТ в пределах аминокислот 1-309 §Ер Ш N0: 2 человека или §Ер Ш N0: 4 мыши.
23. 23. Фрагмент полипептида по п.22, который относится к человека.
24. 24. Фрагмент полипептида по и. 22, который относится к мыши.
25. 25. Выделенный полипептид рецептора N000, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий аминокислоты 1-348 8 Ер Ш N0: 2 человека или §Ер Ш N0: 4 мыши, слитый с гетерологичным полипептидом.
26. 26. Выделенный растворимый фрагмент полипептида рецептора N000, уменьшающий опосредованное этим рецептором ингибирование роста аксонов, содержащий по меньшей мере 50 смежных аминокислот из последовательностей 1-348 8 Ер Ш N0: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
27. 27. Полипептид по и.26, который содержит по меньшей мере 60 смежных аминокислот из аминокислот 1-348 8 Ер Ш N0: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
28. 28. Полипептид по п.27, который содержит по меньшей мере 70 смежных аминокислот из аминокислот 1-348 8 Ер Ш N0: 2 человека или 8 Ер Ш N0: 4 мыши.
29. 29. Полипептид по пп.26, 27 или 28, который содержит области ЬКК. Ν§Β, область ЬШШТ Ν§Β и область ЫШСТ Ν§Β.
30. 30. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфично связывающиеся с полипептидом или полипептидным фрагментом по любому из пи. 18-29.
31. 31. Антитело или его фрагмент по п.ЗО, которое представляет собой поликлональное антитело.
32. 32. Антитело или его фрагмент по п.ЗО, которое представляет собой моноклональное антитело.
33. 33. Антитело или его фрагмент по любому из пи.31-32, которое представляет собой гуманизированное антитело.
34. 34. Антитело или его фрагмент по любому из пи.31-32, которое представляет собой человеческое антитело.
35. 35. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала полинуклеотид по любому из пи. 1-13, или клетку-хозяина по любому из пи. 15 и 16, или полипептид по любому из пи. 17-29, или антитело по любому из пп.30-34 и подходящий носитель.