EA005140B1 - Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого - Google Patents

Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого Download PDF

Info

Publication number
EA005140B1
EA005140B1 EA200101037A EA200101037A EA005140B1 EA 005140 B1 EA005140 B1 EA 005140B1 EA 200101037 A EA200101037 A EA 200101037A EA 200101037 A EA200101037 A EA 200101037A EA 005140 B1 EA005140 B1 EA 005140B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequence
cells
polynucleotide
patient
Prior art date
Application number
EA200101037A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200101037A1 (ru
Inventor
Тонгтонг Ванг
Ликвун Фэн
Original Assignee
Корикса Корпорейшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/285,479 external-priority patent/US6821518B1/en
Priority claimed from US09/466,396 external-priority patent/US6696247B2/en
Priority claimed from US09/476,496 external-priority patent/US6706262B1/en
Priority claimed from US09/480,884 external-priority patent/US6482597B1/en
Application filed by Корикса Корпорейшн filed Critical Корикса Корпорейшн
Publication of EA200101037A1 publication Critical patent/EA200101037A1/ru
Publication of EA005140B1 publication Critical patent/EA005140B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Представляются соединения и методы для лечения и диагностики рака легкого. Соединения данного изобретения включают полипептиды, содержащие, по крайней мере, сегмент белка легочной опухоли. Вместе с молекулами ДНК для получения полипептидов данного изобретения также предоставляются вакцины и фармакологические композиции для иммунотерапии рака легкого, включающие указанные полипептиды или молекулы ДНК, кодирующие указанные полипептиды.

Description

Настоящее изобретение в целом касается лечения и диагностики ракового заболевания, такого как рак легкого. Изобретение более конкретно касается полипептидов, включающих по крайней мере сегмент белка легочной опухоли, а также полинуклеотидов, кодирующих такие полипептиды. Указанные полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы в вакцинах и фармацевтических композициях для профилактики и лечения рака легкого и для диагностики и контроля таких форм рака.
Предпосылки изобретения
Рак легкого является основной причиной онкологической смертности и у мужчин, и у женщин в США при оценке в 172 тысячи новых случаев в 1994 году. Выживаемость в течение 5 лет у всех больных с диагнозом рака легкого, независимо от стадии болезни в момент диагностирования, составляет только 13%. Это контрастирует с 46%-ным уровнем 5-летней выживаемости в тех случаях, когда заболевание все еще локализовано. Однако только в 16% случаев рак легкого диагностируют до того момента, как болезнь распространяется.
Раннее выявление затруднительно, поскольку клинические симптомы часто не выявляются до того, как заболевание достигает прогрессирующей стадии. В настоящее время диагноз осуществляется с использованием рентгенографии грудной клетки, анализа типа клеток, содержащихся в мокротах, и фиброскопического анализа бронхиальных путей. Режимы лечения определяют исходя из типа и стадии раковой опухоли: они включают хирургическое вмешательство, радиотерапию и/или химиотерапию. Несмотря на существенные исследования в области лечения данного заболевания, рак легкого остается трудным для лечения.
Следовательно, в данной области техники сохраняется необходимость в улучшенных вакцинах, способах лечения и способах диагностики рака легкого.
Краткое содержание изобретения
В кратком изложении настоящее изобретении представляет композиции и способы для диагностики и лечения такого ракового заболевания, как рак легкого. В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает полипептиды, включающие по крайней мере участок белка легочной опухоли или его варианта. Некоторые участки и другие варианты являются иммуногенными в такой степени, что способность варианта взаимодействовать с антигенспецифичными антисыворотками в существенной степени не уменьшается. В некоторых вариантах полипептид включает последовательность, которая кодируется полинуклеотидной последовательностью, выбранной из группы, которая включает (а) последовательности, приведенные в любом из 8ЕО Ш N0: 1-3, 6-8, 1013, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59,
61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168,
171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253-337, 345, 347 и 349; (Ь) варианты последовательности, приведенной в любом из 8Е0 Ш N0: 1-3, 68, 10-13, 15-27, 29, 30, 32, 34-49, 51, 52, 54, 55, 57-59, 61-69, 71, 73, 74, 77, 78, 80-82, 84, 86-96, 107-109, 111, 113, 125, 127, 128, 129, 131-133, 142, 144, 148-151, 153, 154, 157, 158, 160, 167, 168, 171, 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220-224, 253337, 345, 347 и 349;
и (с) комплементы последовательностей (а) или (Ь). В конкретных вариантах полипептиды по настоящему изобретению включают по крайней мере участок опухолевого белка, который включает аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая включает последовательности, приведенные в любом из 8ЕО Ш N0: 152, 155, 156, 165, 166, 169, 170,
172, 174, 176, 226-252, 338-344 и 346, и их варианты.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает полинуклеотиды, которые кодируют полипептид в соответствии с описанным выше, или их участок (такой как участок, кодирующий по крайней мере 15 аминокислотных остатков белка легочной опухоли), экспрессирующие векторы, включающие такие полинуклеотиды, и клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные указанными экспрессирующими векторами.
В других аспектах настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие полипептид или полинуклеотид в соответствии с описанным выше и физиологически приемлемый носитель.
В близком аспекте настоящего изобретения предусматриваются вакцины для профилактического или терапевтического применения. Такие вакцины содержат полипептид или полинуклеотид, описанные выше, и иммуностимулирующее средство.
Далее настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, которые содержат: (а) антитело или его антиген-связывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком легочной опухоли; и (Ь) физиологически приемлемый носитель.
В других аспектах настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие: (а) антиген-презентирующую клетку, которая экспрессирует описанный выше полипептид; и (Ь) фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. Антигенпрезентирующими клетками являются дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-лимфоциты.
В близких аспектах предусматриваются вакцины, которые содержат: (а) антиген презентирующую клетку, которая экспрессирует описанный выше полипептид; и (Ь) иммуностимулирующее средство.
Далее в других аспектах настоящее изобретение представляет химерные белки, которые включают по крайней мере один полипептид в соответствии с описанным выше, а также полинуклеотиды, кодирующие такие химерные белки.
В близких аспектах представляются фармацевтические композиции, содержащие химерный белок или полинуклеотид, кодирующий химерный белок, в сочетании с физиологически приемлемым носителем.
Далее в следующих аспектах предусматриваются вакцины, которые содержат химерный белок или полинуклеотид, кодирующий химерный белок, в сочетании с иммуностимулирующим средством.
В следующих аспектах настоящее изобретение охватывает способы подавления развития рака у пациента, включающие введение пациенту фармацевтической композиции или вакцины, отмеченных выше.
Кроме того, в других аспектах настоящее изобретение представляет способы удаления опухолевых клеток из биологического образца, включающие контактирование биологического образца с Т-клетками, специфически взаимодействующими с белком легочной опухоли, причем стадию контактирования проводят в условиях и в течение времени, достаточных для удаления из образца клеток, экспрессирующих данный белок.
В близких аспектах предусматриваются способы подавления развития рака у пациента, включающие введение пациенту биологического образца, обработанного в соответствии с описанным выше.
Далее в следующих аспектах предусматриваются способы стимуляции и/или воспроизведения Т-клеток, специфичных для белка легочной опухоли, включающие контактирование Тклеток с одним или несколькими из: (1) описанным выше полипептидом; (и) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и/или (ΐϊϊ) с антиген-презентирующей клеткой, которая экспрессирует такой полипептид; в условиях и в течение времени, достаточных для обеспечения стимуляции и/или воспроизведения Т-клеток. Также представляются детерминированные Т-клеточные популяции, включающие Т-клетки, полученные в соответствии с описанным выше.
В последующих аспектах настоящее изобретение представляет способы подавления развития рака у пациента, включающие введение пациенту эффективного количества Т-клеточной популяции, описанной выше.
Далее настоящее изобретение представляет способы подавления развития рака у пациента, включающие следующие стадии: (а) инкуба цию СП4-позитивных и/или СЭЗ-позитивных Тклеток, взятых от пациента, с одним или несколькими из: (1) полипептидом, включающим по крайней мере иммуногенный участок белка легочной опухоли; (и) полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид; и (ш) антигенпрезентирующей клеткой, которая экспрессирует такой полипептид; и (Ь) введение пациенту эффективного количества пролиферировавших Т-клеток, что тем самым подавляет развитие рака у пациента. Пролиферировавшие клетки могут, что не является обязательным, быть клонированы до введения пациенту.
В других аспектах настоящее изобретение предусматривает способы определения наличия или отсутствия рака у пациента, включающие (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента, со связывающим агентом, который связывается с приведенным выше полипептидом; (Ь) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнение количества полипептида с заранее установленной величиной отсечки, что тем самым определяет наличие или отсутствие рака у пациента. В предпочтительных вариантах связывающим агентом является антитело, более предпочтительно - моноклональное антитело. Рак может быть раком легкого.
Также настоящее изобретение в других своих аспектах охватывает способы контроля за развитием рака у пациента. Такие способы включают стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента в первый момент времени, со связывающим агентом, который связывается с полипептидом, описанным выше; (Ь) определение в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; (с) повторение стадий (а) и (Ь) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (а) сравнение количества полипептида, выявленного на стадии (с), с количеством, выявленным на стадии (Ь), что тем самым позволяет контролировать развитие рака у пациента.
Далее настоящее изобретение в других аспектах представляет способы определения наличия или отсутствия ракового заболевания у пациента, включающие стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли; (Ь) определение в образце уровня полинуклеотида, предпочтительно мРНК, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и (с) сравнение уровня полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с заранее установленной величиной отсечки, тем самым определяя наличие или отсутствие у пациента ракового заболевания. В некоторых вариантах количество мРНК определяют с помощью полимеразной цепной реакции с использо ванием, например, по крайней мере одного олигонуклеотидного праймера, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или с комплементом такого полинуклеотида. В других вариантах количество мРНК определяют с использованием метода гибридизации, используя олигонуклеотидный зонд, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим полипептид, описанный выше, или с комплементом такого полинуклеотида.
В близких аспектах представляются способы контроля за развитием рака у пациента, включающие стадии: (а) контактирование биологического образца, взятого от пациента, с олигонуклеотидом, который гибридизуется с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли; (Ь) определение в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом; (с) повторение стадий (а) и (Ь) с использованием биологического образца, взятого от пациента в последующий момент времени; и (а) сравнение количества полинуклеотида, выявленного на стадии (с), с количеством, выявленным на стадии (Ь), что тем самым позволяет контролировать развитие ракового заболевания у пациента.
В следующих аспектах настоящее изобретение предусматривает антитела, такие как моноклональные антитела, которые связываются с полипептидом в соответствии с описанным выше, а также диагностические наборы, содержащие такие антитела. Также представляются диагностические наборы, содержащие один или несколько олигонуклеотидных зондов или праймеров в соответствии с описанным выше.
Указанные и другие аспекты настоящего изобретения станут ясны в результате ознакомления с нижеследующим подробным описанием и прилагающимися чертежами. Все приведенные в данном тексте библиографические ссылки включены здесь для сведения в полном своем объеме в той же степени, в какой они включены здесь по отдельности.
Идентификаторы последовательностей
БЕЦ ΙΌ N0 1 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-2.
БЕЦ ΙΌ N0 2 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-28.
БЕЦ ΙΌ N0 3 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-90.
БЕЦ ΙΌ N0 4 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-144.
БЕЦ ΙΌ N0 5 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-133.
БЕЦ ΙΌ N0 6 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б1-169.
БЕЦ ΙΌ N0 7 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-6.
БЕЦ ΙΌ N0 8 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-11.
БЕЦ ΙΌ N0 9 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-17.
БЕЦ ΙΌ N0 10 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-25.
БЕЦ ΙΌ N0 11 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-39.
БЕЦ ΙΌ N0 12 представляет первую установленную последовательность кДНК для ЬБТБ2-43.
БЕЦ ΙΌ N0 13 представляет вторую установленную последовательность кДНК для ЬБТБ2-43.
БЕЦ ΙΌ N0 14 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-65.
БЕЦ ΙΌ N0 15 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-68.
БЕЦ ΙΌ N0 16 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-72.
БЕЦ ΙΌ N0 17 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-74.
БЕЦ ΙΌ N0 18 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-103.
БЕЦ ΙΌ N0 19 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н11Т.
БЕЦ ΙΌ N0 20 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н12А.
БЕЦ ΙΌ N0 21 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н14Н.
БЕЦ ΙΌ N0 22 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н15А.
БЕЦ ΙΌ N0 23 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н16В.
БЕЦ ΙΌ N0 24 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н17В.
БЕЦ ΙΌ N0 25 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н17Н.
БЕЦ ΙΌ N0 26 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н18А.
БЕЦ ΙΌ N0 27 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н18Ό.
БЕЦ ΙΌ N0 28 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н19А.
БЕЦ ΙΌ N0 29 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н19Е.
БЕЦ ΙΌ N0 30 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н110А.
БЕЦ ΙΌ N0 31 представляет установленную последовательность кДНК для ЬБТ-Б2-Н1106.
Ί
8Е6 ΙΌ N0 32 представляет установленную последовательность кДНК для Ε8Τ-82-Ν111А.
8Е6 ΙΌ N0 33 представляет установленную последовательность кДНК для Ε8Τ-82-Ν112С.
8Е6 ΙΌ N0 34 представляет установленную последовательность кДНК для Е8Т-82-Ы112Е.
8Е6 ΙΌ N0 35 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В13Ό.
8Е6 ΙΌ N0 36 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В16С.
8Е6 ΙΌ N0 37 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В15Ό.
8Е6 ΙΌ N0 38 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В15Р.
8Е6 ΙΌ N0 39 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В166.
8Е6 ΙΌ N0 40 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В18А.
8Е6 ΙΌ N0 41 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В18Ό.
8Е6 ΙΌ N0 42 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В110А.
8Е6 ΙΌ N0 43 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В19В.
8Е6 ΙΌ N0 44 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В19Р.
8Е6 ΙΌ N0 45 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-В112Ό.
8Е6 ΙΌ N0 46 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82422В.
8Е6 ΙΌ N0 47 представляет установленную последовательность кДНК для Б8Т-82425Р.
8Е6 ΙΌ N0 48 представляет установленную последовательность кДНК для Б8Т-82426В.
8Е6 ΙΌ N0 49 представляет установленную последовательность кДНК для Б8Т-82427Р.
8Е6 ΙΌ N0 50 представляет установленную последовательность кДНК для Б8Т-824286.
8Е6 ΙΌ N0 51 представляет установленную последовательность кДНК для 68^82429Е.
8Е6 ΙΌ N0 52 представляет установленную последовательность кДНК для Б8Т-824212В.
8Е6 ΙΌ N0 53 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н22С.
8Е6 ΙΌ N0 54 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н216.
8Е6 ΙΌ N0 55 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н246.
8Е6 ΙΌ N0 56 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н23Н.
8Е6 ΙΌ N0 57 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н256.
8Е6 ΙΌ N0 58 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н29В.
8Е6 ΙΌ N0 59 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н210Н.
8Е6 ΙΌ N0 60 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-82-Н212Ό.
8Е6 ΙΌ N0 61 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-2.
8Е6 ΙΌ N0 62 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-4.
8Е6 ΙΌ N0 63 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-7.
8Е6 ΙΌ N0 64 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-8.
8Е6 ΙΌ N0 65 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-12.
8Е6 ΙΌ N0 66 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-13.
8Е6 ΙΌ N0 67 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-14.
8Е6 ΙΌ N0 68 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-16.
8Е6 ΙΌ N0 69 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-21.
8Е6 ΙΌ N0 70 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-83-22.
8Е6 ΙΌ N0 71 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-81-7.
8Е6 ΙΌ N0 72 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-81-А1Е.
8Е6 ΙΌ N0 73 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-81-А16.
8Е6 ΙΌ N0 74 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-81-А3Е.
8Е6 ΙΌ N0 75 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-81-А4Е.
ЗЕО ΙΌ N0 76 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А6Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 77 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-81-Л8Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 78 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-81-Л10А.
ЗЕО ΙΌ N0 79 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А10С.
ЗЕО ΙΌ N0 80 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А9Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 81 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А10Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 82 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А9Н.
ЗЕО ΙΌ N0 83 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А11Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 84 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А12Ό.
ЗЕО ΙΌ N0 85 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А11Е.
ЗЕО ΙΌ N0 86 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-§1-А12Е.
ЗЕО ΙΌ N0 87 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5138(Т3).
ЗЕО ΙΌ N0 88 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5138, контиг 1.
ЗЕО ΙΌ N0 89 представляет первую установленную последовательность кДНК для Ь5148.
ЗЕО ΙΌ N0 90 представляет вторую установленную последовательность кДНК для Ь5148.
ЗЕО ΙΌ N0 91 представляет первую установленную последовательность кДНК для Ь5168.
ЗЕО ΙΌ N0 92 представляет вторую установленную последовательность кДНК для Ь5168.
ЗЕО ΙΌ N0 93 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5178.
ЗЕО ΙΌ N0 94 представляет достроенную последовательность кДНК Ь8Т-§1-169 (также известной как Ь5198).
ЗЕО ΙΌ N0 95 представляет первую установленную последовательность кДНК для Ь5208.
ЗЕО ΙΌ N0 96 представляет вторую установленную последовательность кДНК для Ь5208.
ЗЕО ΙΌ N0 97 представляет первую установленную последовательность кДНК для Ь5218.
ЗЕО ΙΌ N0 98 представляет вторую установленную последовательность кДНК для Ь5218.
ЗЕО ΙΌ N0 99 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5228.
ЗЕО ΙΌ N0 100 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5238.
ЗЕО ΙΌ N0 101 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5248.
ЗЕО ΙΌ N0 102 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5258.
ЗЕО ΙΌ N0 103 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5268.
ЗЕО ΙΌ N0 104 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5278.
ЗЕО ΙΌ N0 105 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5288.
ЗЕО ΙΌ N0 106 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5298.
ЗЕО ΙΌ N0 107 представляет первую установленную последовательность кДНК для Ь5308.
ЗЕО ΙΌ N0 108 представляет вторую установленную последовательность кДНК для Ь5308.
ЗЕО ΙΌ N0 109 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для короткой формы Ь5318.
ЗЕО ΙΌ N0 110 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ΙΌ N0 109.
8Е0 ΙΌ N0 111 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для длинной формы Б5318.
ЗЕО ΙΌ N0 112 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ΙΌ N0 111.
ЗЕО ΙΌ N0 113 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для Ь5208.
ЗЕО ΙΌ N0 114 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ΙΌ N0 113.
ЗЕО ΙΌ N0 115 представляет установленную последовательность кДНК для контига 1.
ЗЕО ΙΌ N0 116 представляет установленную последовательность кДНК для контига 3.
ЗЕО ΙΌ N0 117 представляет установленную последовательность кДНК для контига 4.
ЗЕО ΙΌ N0 118 представляет установленную последовательность кДНК для контига 5.
ЗЕО ΙΌ N0 119 представляет установленную последовательность кДНК для контига 7.
ЗЕО ΙΌ N0 120 представляет установленную последовательность кДНК для контига 8.
ЗЕО ΙΌ N0 121 представляет установленную последовательность кДНК для контига 9.
ЗЕО ΙΌ N0 122 представляет установленную последовательность кДНК для контига 10.
8ЕО ΙΌ N0 123 представляет установленную последовательность кДНК для контига 12.
8Е0 ГО N0 124 представляет установленную последовательность кДНК для контига 11.
8Е0 ГО N0 125 представляет установленную последовательность кДНК для контига 13.
8Е0 ГО N0 126 представляет установленную последовательность кДНК для контига 15.
8Е0 ГО N0 127 представляет установленную последовательность кДНК для контига 16.
8Е0 ГО N0 128 представляет установленную последовательность кДНК для контига 17.
8Е0 ГО N0 129 представляет установленную последовательность кДНК для контига 19.
8Е0 ГО N0 130 представляет установленную последовательность кДНК для контига 20.
8Е0 ГО N0 131 представляет установленную последовательность кДНК для контига 22.
8Е0 ГО N0 132 представляет установленную последовательность кДНК для контига 24.
8Е0 ГО N0 133 представляет установленную последовательность кДНК для контига 29.
8Е0 ГО N0 134 представляет установленную последовательность кДНК для контига 31.
8Е0 ГО N0 135 представляет установленную последовательность кДНК для контига 33.
8Е0 ГО N0 136 представляет установленную последовательность кДНК для контига 38.
8Е0 ГО N0 137 представляет установленную последовательность кДНК для контига 39.
8Е0 ГО N0 138 представляет установленную последовательность кДНК для контига 41.
8Е0 ГО N0 139 представляет установленную последовательность кДНК для контига 43.
8Е0 ГО N0 140 представляет установленную последовательность кДНК для контига 44.
8Е0 ГО N0 141 представляет установленную последовательность кДНК для контига 45.
8Е0 ГО N0 142 представляет установленную последовательность кДНК для контига 47.
8Е0 ГО N0 143 представляет установленную последовательность кДНК для контига 48.
8Е0 ГО N0 144 представляет установленную последовательность кДНК для контига 49.
8Е0 ГО N0 145 представляет установленную последовательность кДНК для контига 50.
8Е0 ГО N0 146 представляет установленную последовательность кДНК для контига 53.
8Е0 ГО N0 147 представляет установленную последовательность кДНК для контига 54.
8Е0 ГО N0 148 представляет установленную последовательность кДНК для контига 56.
8Е0 ГО N0 149 представляет установленную последовательность кДНК для контига 57.
8Е0 ГО N0 150 представляет установленную последовательность кДНК для контига 58.
8Е0 ГО N0 151 представляет полноразмерную последовательность кДНК для Ь5308.
8Е0 ГО N0 152 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 151.
8Е0 ГО N0 153 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта Ь5148.
8Е0 ГО N0 154 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта Ь5148.
8Е0 ГО N0 155 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 153.
8Е0 ГО N0 156 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 154.
8Е0 ГО N0 157 представляет установленную последовательность кДНК для контига 59.
8Е0 ГО N0 158 представляет полноразмерную последовательность кДНК для Ь763Р (также обозначаемой как контиг 22).
8Е0 ГО N0 159 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 158.
8Е0 ГО N0 160 представляет полноразмерную последовательность кДНК для Ь762Р (также обозначаемой как контиг 17).
8Е0 ГО N0 161 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 160.
8Е0 ГО N0 162 представляет установленную последовательность кДНК для Ь5158.
8Е0 ГО N0 163 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта Ь5248.
8Е0 ГО N0 164 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта Ь5248.
8Е0 ГО N0 165 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 163.
8Е0 ГО N0 166 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 164.
8Е0 ГО N0 167 представляет полноразмерную последовательность кДНК первого варианта Ь762Р.
8Е0 ГО N0 168 представляет полноразмерную последовательность кДНК второго варианта Ь762Р.
8Е0 ГО N0 169 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 167.
8Е0 ГО N0 170 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 168.
8Е0 ГО N0 171 представляет полноразмерную последовательность кДНК Ь773Р (также обозначаемой как контиг 56).
8Е0 ГО N0 172 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ГО N0 171.
8Е0 ГО N0 173 представляет достроенную последовательность кДНК для Ь5198.
8ЕО ΙΌ N0 174 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е6 ΙΌ N0 173.
5>Е0 ΙΌ N0 175 представляет полноразмерную последовательность кДНК для Б5238.
5>Е0 ΙΌ N0 176 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е6 ΙΌ N0 175.
8Е0 ΙΌ N0 177 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ57А.
8Е0 ΙΌ N0 178 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ586.
8Е6 ΙΌ N0 179 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ58Н.
8Е6 ΙΌ N0 180 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ510В.
8Е6 ΙΌ N0 181 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ510Н.
8Е6 ΙΌ N0 182 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ512В.
8Е6 ΙΌ N0 183 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ511С.
8Е6 ΙΌ N0 184 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-1с.
8Е6 ΙΌ N0 185 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-2£.
8Е6 ΙΌ N0 186 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ626.
8Е6 ΙΌ N0 187 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ64й.
8Е6 ΙΌ N0 188 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-4е.
8Е6 ΙΌ N0 189 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-4£.
8Е6 ΙΌ N0 190 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ63Ь.
8Е6 ΙΌ N0 191 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ65й.
8Е6 ΙΌ N0 192 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ65Ь.
8Е6 ΙΌ N0 193 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ66Ь.
8Е6 ΙΌ N0 194 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-7а.
8Е6 ΙΌ N0 195 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-8а.
8Е6 ΙΌ N0 196 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-7а.
8Е6 ΙΌ N0 197 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-7е.
8Е6 ΙΌ N0 198 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-8е.
8Е6 ΙΌ N0 199 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ67ё.
8Е6 ΙΌ N0 200 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6-9£.
8Е6 ΙΌ N0 201 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ69Ь.
8Е6 ΙΌ N0 202 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6llb.
8Е6 ΙΌ N0 203 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6llc.
8Е6 ΙΌ N0 204 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ612с.
8Е6 ΙΌ N0 205 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ612е.
8Е6 ΙΌ N0 206 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ6121.
8Е6 ΙΌ N0 207 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ611ё8Е6 ΙΌ N0 208 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ612§.
8Е6 ΙΌ N0 209 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-5иЬ612Ь.
8Е6 ΙΌ N0 210 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-Пla.
8Е6 ΙΌ N0 211 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П2Ь.
8Е6 ΙΌ N0 212 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П2ё·
8Е6 ΙΌ N0 213 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-Пlb.
8Е6 ΙΌ N0 214 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П4а.
8Е6 ΙΌ N0 215 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П4Ь.
8Е6 ΙΌ N0 216 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П3е.
8Е6 ΙΌ N0 217 представляет установленную последовательность кДНК для Ь§Т-5иЬ6-П41.
8ЕО ΙΌ N0 218 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П4ё·
8Е0 ΙΌ N0 219 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П4Ь.
8Е0 ΙΌ N0 220 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П5с.
8Е0 ΙΌ N0 221 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П5е.
8Е0 ΙΌ N0 222 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П6£.
8Е0 ΙΌ N0 223 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П5ё.
8Е0 ΙΌ N0 224 представляет установленную последовательность кДНК для Ь8Т-8иЬ6-П6ё.
8Е0 ΙΌ N0 225 представляет аминокислотную последовательность для Б5288.
8Е0 ΙΌ N0 226-251 представляют синтетические пептиды, производные от Б762Р.
8Е0 ΙΌ N0 252 представляет экспрессированную аминокислотную последовательность Б5148.
8Е0 ΙΌ N0 253 представляет последовательность ДНК, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0 252.
8Е0 ΙΌ N0 254 представляет последовательность ДНК экспрессионной конструкции Б762Р.
8Е0 ΙΌ N0 255 представляет установленную последовательность для клона 23785.
8Е0 ΙΌ N0 256 представляет установленную последовательность для клона 23786.
8Е0 ΙΌ N0 257 представляет установленную последовательность для клона 23788.
8Е0 ΙΌ N0 258 представляет установленную последовательность для клона 23790.
8Е0 ΙΌ N0 259 представляет установленную последовательность для клона 23793.
8Е0 ΙΌ N0 260 представляет установленную последовательность для клона 23794.
8Е0 ΙΌ N0 261 представляет установленную последовательность для клона 23795.
8Е0 ΙΌ N0 262 представляет установленную последовательность для клона 23796.
8Е0 ΙΌ N0 263 представляет установленную последовательность для клона 23797.
8Е0 ΙΌ N0 264 представляет установленную последовательность для клона 23798.
8Е0 ΙΌ N0 265 представляет установленную последовательность для клона 23799.
8Е0 ΙΌ N0 266 представляет установленную последовательность для клона 23800.
8Е0 ΙΌ N0 267 представляет установленную последовательность для клона 23802.
8Е0 ΙΌ N0 268 представляет установленную последовательность для клона 23803.
8Е0 ΙΌ N0 269 представляет установленную последовательность для клона 23804.
8Е0 ΙΌ N0 270 представляет установленную последовательность для клона 23805.
8Е0 ΙΌ N0 271 представляет установленную последовательность для клона 23806.
8Е0 ΙΌ N0 272 представляет установленную последовательность для клона 23807.
8Е0 ΙΌ N0 273 представляет установленную последовательность для клона 23808.
8Е0 ΙΌ N0 274 представляет установленную последовательность для клона 23809.
8Е0 ΙΌ N0 275 представляет установленную последовательность для клона 23810.
8Е0 ΙΌ N0 276 представляет установленную последовательность для клона 23811.
8Е0 ΙΌ N0 277 представляет установленную последовательность для клона 23812.
8Е0 ΙΌ N0 278 представляет установленную последовательность для клона 23813.
8Е0 ΙΌ N0 279 представляет установленную последовательность для клона 23815.
8Е0 ΙΌ N0 280 представляет установленную последовательность для клона 25298.
8Е0 ΙΌ N0 281 представляет установленную последовательность для клона 25299.
8Е0 ΙΌ N0 282 представляет установленную последовательность для клона 25300.
8Е0 ΙΌ N0 283 представляет установленную последовательность для клона 25301.
8Е0 ΙΌ N0 284 представляет установленную последовательность для клона 25304.
8Е0 ΙΌ N0 285 представляет установленную последовательность для клона 25309.
8Е0 ΙΌ N0 286 представляет установленную последовательность для клона 25312.
8Е0 ΙΌ N0 287 представляет установленную последовательность для клона 25317.
8Е0 ΙΌ N0 288 представляет установленную последовательность для клона 25321.
8Е0 ΙΌ N0 289 представляет установленную последовательность для клона 25323.
8Е0 ΙΌ N0 290 представляет установленную последовательность для клона 25327.
8Е0 ΙΌ N0 291 представляет установленную последовательность для клона 25328.
8Е0 ΙΌ N0 292 представляет установленную последовательность для клона 25332.
8Е0 ΙΌ N0 293 представляет установленную последовательность для клона 25333.
8Е0 ΙΌ N0 294 представляет установленную последовательность для клона 25336.
8Е0 ΙΌ N0 295 представляет установленную последовательность для клона 25340.
8Е0 ΙΌ N0 296 представляет установленную последовательность для клона 25342.
8Е0 ΙΌ N0 297 представляет установленную последовательность для клона 25356.
8Е0 ΙΌ N0 298 представляет установленную последовательность для клона 25357.
8Е0 ΙΌ N0 299 представляет установленную последовательность для клона 25361.
8ЕО ΙΌ N0 300 представляет установленную последовательность для клона 25363.
8Е0 ΙΌ N0 301 представляет установленную последовательность для клона 25397.
8Е0 ΙΌ N0 302 представляет установленную последовательность для клона 25402.
8Е0 ΙΌ N0 303 представляет установленную последовательность для клона 25403.
8Е0 ΙΌ N0 304 представляет установленную последовательность для клона 25405.
8Е0 ΙΌ N0 305 представляет установленную последовательность для клона 25407.
8Е0 ΙΌ N0 306 представляет установленную последовательность для клона 25409.
8Е0 ΙΌ N0 307 представляет установленную последовательность для клона 25396.
8Е0 ΙΌ N0 308 представляет установленную последовательность для клона 25414.
8Е0 ΙΌ N0 309 представляет установленную последовательность для клона 25410.
8Е0 ΙΌ N0 310 представляет установленную последовательность для клона 25406.
8Е0 ΙΌ N0 311 представляет установленную последовательность для клона 25306.
8Е0 ΙΌ N0 312 представляет установленную последовательность для клона 25362.
8Е0 ΙΌ N0 313 представляет установленную последовательность для клона 25360.
8Е0 ΙΌ N0 314 представляет установленную последовательность для клона 25398.
8Е0 ΙΌ N0 315 представляет установленную последовательность для клона 25355.
8Е0 ΙΌ N0 316 представляет установленную последовательность для клона 25351.
8Е0 ΙΌ N0 317 представляет установленную последовательность для клона 25331.
8Е0 ΙΌ N0 318 представляет установленную последовательность для клона 25338.
8Е0 ΙΌ N0 319 представляет установленную последовательность для клона 25335.
8Е0 ΙΌ N0 320 представляет установленную последовательность для клона 25329.
8Е0 ΙΌ N0 321 представляет установленную последовательность для клона 25324.
8Е0 ΙΌ N0 322 представляет установленную последовательность для клона 25322.
8Е0 ΙΌ N0 323 представляет установленную последовательность для клона 25319.
8Е0 ΙΌ N0 324 представляет установленную последовательность для клона 25316.
8Е0 ΙΌ N0 325 представляет установленную последовательность для клона 25311.
8Е0 ΙΌ N0 326 представляет установленную последовательность для клона 25310.
8Е0 ΙΌ N0 327 представляет установленную последовательность для клона 25302.
8Е0 ΙΌ N0 328 представляет установленную последовательность для клона 25315.
8Е0 ΙΌ N0 329 представляет установленную последовательность для клона 25308.
8Е0 ΙΌ N0 330 представляет установленную последовательность для клона 25303.
8Е0 ΙΌ N0 331-337 представляют последовательности кДНК изоформ гомолога опухоль-супрессорного белка р53 - р63 (также обозначаемого как Б5308).
8Е0 ΙΌ N0 338-344 представляют аминокислотные последовательности, кодируемые 8Е0 ΙΌ N0 331-337, соответственно.
8Е0 ΙΌ N0 345 представляет вторую последовательность кДНК антигена Ь763Р.
8Е0 ΙΌ N0 346 представляет аминокислотную последовательность, кодируемую последовательностью 8Е0 ΙΌ N0 345.
8Е0 ΙΌ N0 347 представляет установленную полноразмерную последовательность кДНК для Б5238.
8Е0 ΙΌ N0 348 представляет расшифрованную аминокислотную последовательность, кодируемую 8Е0 ΙΌ N0 347.
8Е0 ΙΌ N0 349 представляет последовательность кДНК, кодирующую №концевую часть Ь773Р.
8Е0 ΙΌ N0 350 представляет аминокислотную последовательность №концевой части Б773Р.
Подробное описание изобретения
Как отмечалось выше, настоящее изобретение в целом направлено на композиции и способы для лечения и диагностики рака, такого как рак легкого. Описанные в данном тексте композиции могут содержать полипептиды легочной опухоли, полинуклеотиды, кодирующие такие полипептиды, связывающие агенты, такие как антитела, антиген-презентирующие клетки (АПК) и/или клетки иммунной системы (например, Т-клетки). Полипептиды по настоящему изобретению в принципе включают по крайней мере участок (такой как иммуногенный сегмент) белка легочной опухоли или его варианта. «Белок легочной опухоли» - это белок, который экспрессируется в клетках легочной опухоли на уровне по крайней мере в два раза и предпочтительно по крайней мере в пять раз выше уровня экспрессии в нормальной ткани, что определено с использованием репрезентативного анализа, описанного в данном тексте. Некоторые белки легочной опухоли являются опухолевыми белками, которые на выявляемом уровне (при использовании иммунологического анализа, такого как ТИФА или Вестерн-блоттинг) взаимодействуют с антисыворотками больного с диагнозом рака легкого. В целом, полинуклеотиды по настоящему изобретению включают последовательность ДНК или РНК, которая кодирует полностью или частично такой полипептид или которая комплементарна указанной последовательности. В целом, антитела являются белками иммунной системы или их антигенсвязывающими фрагментами, которые способны связываться с полипептидом в соответствии с описанным выше. Антиген-презентирующими клетками являются дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и В-лимфоциты, которые экспрессируют описанный выше полипептид. Т-клетки, которые могут быть использованы в составе указанных композиций, в целом, являются Т-клетками, которые специфичны для полипептида, описанного выше.
Настоящее изобретение основывается на открытии белков легочной опухоли человека. Последовательности полинуклеотидов, кодирующие конкретные опухолевые белки, представлены в 8Ер ГО N0 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 и 349.
Полинуклеотиды белков легочной опухоли
Любой полинуклеотид, который кодирует белок легочной опухоли или его участок, или другой его вариант в соответствии с описанным в данном тексте, охватывается настоящим изобретением. Предпочтительные полинуклеотиды включают по крайней мере 15 расположенных подряд нуклеотидов, предпочтительно по крайней мере 30 расположенных подряд нуклеотидов и более предпочтительно по крайней мере 45 расположенных подряд нуклеотидов, которые кодируют участок белка легочной опухоли. Более предпочтительно полинуклеотид кодирует иммуногенный сегмент белка легочной опухоли. Полинуклеотиды, комплементарные любой такой последовательности, также охватываются настоящим изобретением. Полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными, а также могут быть молекулами ДНК (геномной, кДНК или синтетической) или РНК. Молекулы РНК охватывают молекулы гяРНК, которые включают интроны и соответствуют молекуле ДНК по типу «один к одному», а также молекулы мРНК, в которых интроны отсутствуют. Дополнительные кодирующие или некодирующие последовательности могут, что необязательно, присутствовать в составе полинуклеотида по настоящему изобретению, а полинуклеотид может быть, а может не быть связан с другими молекулами и/или материалами подложки.
Полинуклеотиды могут включать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует белок легочной опухоли или его часть) или могут включать вариант такой последовательности. Полинуклеотидные варианты могут включать одну или большее число замен, добавлений, делеций и/или вставок таким образом, что иммуногенность кодируемого полипептида не снижается по отношению к нативному опухолевому белку. Уровень иммуногенности кодируемого полипептида в принципе можно оценить в соответствии с описанным в данном тексте. Предпочтительно варианты проявляют по крайней мере примерно 70% идентичности, более предпочтительно по крайней мере примерно 80% идентичности и наиболее предпочтительно по крайней мере примерно 90% идентичности по отно шению к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует нативный белок легочной опухоли или его часть. Термин «варианты» также охватывает гомологичные гены ксеногенного происхождения.
Две полинуклеотидные или полипептидные последовательности называют «идентичными», если последовательность нуклеотидов или аминокислот в двух последовательностях одинакова при сопоставлении их в соответствии с описанным далее по принципу максимального соответствия. Сравнения между двумя последовательностями обычно проводят путем сравнения последовательностей в окне сравнения с целью идентификации и сравнения локальных мотивов по сходству последовательности. По использованию в данном тексте термин «окно сравнения» обозначает участок по крайней мере из примерно 20 расположенных подряд положений, обычно от 30 до примерно 75, от 40 до примерно 50, внутри которого последовательность можно сравнивать с референсной последовательностью с тем же числом непрерывных положений после того, как две последовательности сопоставлены оптимальным образом.
Оптимальное сопоставление последовательностей для сравнения может быть осуществлено с использованием программы Медайдп из набора Ьакегдепе биоинформационного компьютерного пакета (ΌΝΆ8ΤΆΚ 1пс., Май1коп, XVI) с использованием установок по умолчанию. Данная программа включает ряд схем сопоставления, описанных в следующих источниках: М.ОГОауЬоГГ, 1978, А тойе1 о! егойШопагу сйапде ш рго1ешк: МаПтсек Гог йе!есйпд й1к1ап( геПИопкЫрк. 1п М.ОГОауйоЕГ (ей.), А11ак оГ Рго1еш Зесщепсе апй ЗПисГиге, №Шопа1 Вюшей1са1 Кекеагсй ЕоипйаДоп, Vа8Ыπдоπ, ΌΟ, Уо1. 5, кирр1. 3, рр. 345-358; ЕНеш, 1990, ИшПей Арргоасй 1о АНдпшеп! апй Рйу1одепе8, рр. 626-645, Ме1йойк ίπ Еп7уто1оду, Уо1. 183, Асайетк Ргекк 1пс., Зап П1едо, СА; О.С.Нщщпк & Р.М.Зйагр, 1989, САВ1ОЗ, 5, 151-153;
Е.^.Муегк & №.Мц11ег, 1988, САВ1ОЗ, 4, 11-17; ЕГО.КоЬшкоп, 1971, СотЬ, Тйеог., 11, 105; К8ап1ои & М.№к, 1987, Мо1. Вю1. Еуо1., 4, 406425; Р.Н.А.8пеа1й & К..К..8ока1, 1973, Штепса1 Тахопоту: Тйе Ргшс1р1ек апй РгасИсе оГ Штепса1 Тахопоту, Егеетап Ргекк, Зап Егапшксо, СА; \ν.1.\ν№ιΐΓ & ПЛ.Ыртап, 1983, Ргос. №И. Асай. Зс1. иЗА, 80, 726-730.
Предпочтительно «процент идентичности последовательностей» определяют путем сравнения двух оптимально сопоставленных последовательностей в окне сравнения по крайней мере 20 положений, причем часть полинуклеотидной или полипептидной последовательности в окне сравнения может включать вставки или делеции (т.е. пробелы) на уровне 20% или меньше, обычно 5-15% или 10-12%, по сравнению с референсными последовательностями (которые не содержат вставок или делеций), для оптимального сопоставления двух последовательностей. Процент подсчитывают путем определения числа позиций, по которым имеются идентичные основания нуклеиновой кислоты или остатки аминокислот в обеих последовательностях, устанавливая число совпадающих положений, после чего делят число совпавших положений на общее число положений в референсной последовательности (т.е. на размер окна) и умножают полученный результат на 100, получая процент идентичности последовательностей.
Также или в качестве альтернативы варианты могут быть по существу гомологичными нативному гену или его части, или его комплементу. Такие варианты полинуклеотидов способны гибридизоваться при условиях средней жесткости со встречающейся в естественных условиях последовательностью ДНК, кодирующей нативный белок легочной опухоли (или комплементарной последовательностью). Подходящими условиями средней жесткости являются предварительная промывка в растворе 5х88С, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН=8,0); гибридизация при 50-65°С в 5х88С в течение ночи; последующая промывка дважды при 65°С в течение 20 минут в каждом из 2х, 0,5х и 0,2х88С, содержащих 0,1% ДСН.
Специалисту в данной области техники должно быть понятно, что вследствие вырожденности генетического кода существует множество нуклеотидных последовательностей, кодирующих описываемый здесь полипептид. Некоторые из таких полинуклеотидов характеризуются минимальным уровнем гомологии с нуклеотидной последовательностью любого нативного гена. Тем не менее полинуклеотиды, которые варьируются из-за различий в библиотеках кодонов, в частности, предусматриваются настоящим изобретением. Кроме того, аллели генов, включающие представляемые здесь полинуклеотидные последовательности, попадают в объем настоящего изобретения. Аллелями являются эндогенные гены, которые изменены в результате одной или нескольких мутаций, таких как делеции, вставки и/или замены нуклеотидов. Образующиеся в результате мРНК и белок могут иметь измененные структуру и функции, хотя это и не обязательно. Аллели могут быть идентифицированы с использованием стандартных методов (таких как гибридизация, амплификация и/или скрининг баз данных по последовательностям).
Полинуклеотиды могут быть получены с использованием любого из различных методов. Например, полинуклеотид может быть идентифицирован в соответствии с тем, что подробно описано далее, в результате скрининга микроматрицы кДНК на связанную с опухолью экспрессию (т.е. экспрессию, которая по крайней мере в два раза интенсивнее в легочной опухоли, чем в нормальной ткани по данным репре зентативного анализа, описанного в данном тексте). Указанный скрининг может быть осуществлен с использованием микроматрицы 8уп!еш (Ра1о А11о, СА) в соответствии с инструкциями изготовителя (и по существу согласно описанному у 8сйепа е! а1., 1996, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8ск И8А, 93, 10614-10619 и Не11ег е! а1., 1997, Ргос. ЫаЙ. Асай. 8ά. И8А, 94, 2150-2155). Как альтернатива, полипептиды могут быть амплифицированы на материале кДНК, полученной из клеток, экспрессирующих описанные здесь белки, таких как клетки легочной опухоли. Такие полинуклеотиды могут быть амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого специфичные по последовательности праймеры могут быть сконструированы, исходя из представленных здесь последовательностей, или могут быть куплены или синтезированы.
Амплифицированный фрагмент может быть использован для выделения полноразмерного гена из подходящей библиотеки (например, библиотеки кДНК легочной опухоли) с использованием хорошо известных методов. В таких методах библиотеку (кДНК или геномную) подвергают скринингу с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов или праймеров, пригодных для амплификации. Предпочтительно библиотеку сортируют по размеру с включением более крупных молекул. Случайно праймированные библиотеки также могут быть предпочтительными для идентификации 5'-фланкирующих и вышележащих участков генов. Геномные библиотеки предпочтительны для получения интронов и протяженных 5'-последовательностей.
Для методов гибридизации частичная последовательность может быть помечена (например, с помощью ник-трансляции или концевого мечения 32Р) с использованием хорошо известных методов. Затем бактериальную или фаговую библиотеку подвергают скринингу путем гибридизации фильтров, содержащих денатурированные бактериальные колонии (или газоны, включающие фаговые бляшки), с меченным зондом (см. 8ашЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬога!опек, Со1й 8рппд НагЬог, ΝΥ). Гибридизовавшие колонии или бляшки отбирают и воспроизводят, а ДНК выделяют для дальнейшего анализа. Клоны кДНК можно анализировать с целью определения величины дополнительной последовательности с помощью, например, ПЦР с использованием праймера для частичной последовательности и праймера для вектора. Рестрикционные карты и частичные последовательности могут быть сформированы так, чтобы идентифицировать один или большее число перекрывающихся клонов. После этого полную последовательность можно определить с помощью стандартных методов, которые могут включать создание серии делеционных кло нов. Полученные в результате перекрывающиеся последовательности затем собирают в единую непрерывную последовательность. Полноразмерная молекула кДНК может быть сформирована путем лигирования подходящих фрагментов с применением хорошо известных методов.
Как альтернатива, имеется значительное число методов амплификации для получения полноразмерной кодирующей последовательности на материале частичной последовательности кДНК. В таких методах амплификацию обычно проводят с помощью ПЦР. Любой из множества имеющихся в продаже соответствующих наборов можно использовать для проведения амплификационной стадии. Праймеры могут быть сконструированы с использованием, например, известной в данной области техники компьютерной программы. Длина праймеров предпочтительно составляет 22-30 нуклеотидов, содержание пары ОС составляет по крайней мере 50%, а отжиг на последовательность-мишень проводят при температуре примерно 68-72°С. Амплифицированный фрагмент может быть секвенирован в соответствии с описанным выше, а перекрывающиеся последовательности собраны в непрерывную последовательность.
Одним из указанных методов амплификации является инверсионная ПЦР (см. Тпдйа е! а1., 1988, Ыис! Ас1бк Век., 16, 8186), в которой используют рестриктазы для создания фрагмента в известном участке гена. Затем фрагмент циркуляризуют путем внутримолекулярного лигирования и используют в качестве матрицы для ПЦР с отличающимся праймером, производным от известного участка. При альтернативном подходе последовательности, соседствующие с частичной последовательностью, могут быть выделены с помощью амплификации с праймером, специфичным для линкерной последовательности, и праймером, специфичным для известного участка. Обычно амплифицированные последовательности подвергают второму раунду амплификации с тем же линкерным праймером и вторым праймером, специфичным для известного участка. Вариант данной процедуры, в котором используют два праймера, инициирующие достройку в противоположных направлениях от известной последовательности, описан в международной патентной заявке АО 96/38591. Другой подобный метод известен как «быстрая амплификация концов кДНК» или ВАСЕ. Данный метод включает использование внутреннего праймера и внешнего праймера, который гибридизуется с полиадениловым участком или векторной последовательностью, с целью идентификации последовательностей, которые находятся с 5'- и З'-сторон от известной последовательности. Дополнительными методами являются «ПЦР-ловушка» (Ьадегк1гот е! а1., 1991, РСВ МеШобк Аррйс., 1, 111-119) и «прогулки с ПЦР» (Рагкег е! а1., 1991, Ыис1. Ас
1бк Век., 19, 3055-3060). Другие методы, использующие амплификацию, также могут быть применены для получения полноразмерной последовательности кДНК.
В некоторых примерах возможно получение полноразмерной последовательности кДНК с помощью анализа последовательностей, представленных в базе данных экспрессированных последовательностей-меток (Е8Т-маркеров), например, доступных через ОеиБаик. Поиск перекрывающихся Е8Т-маркеров, в целом, может быть осуществлен с использованием хорошо известных компьютерных программ (например, поисковиков ЫСВ1 ВЬА8Т), и такие Е8Т могут быть использованы для формирования ассоциированной полноразмерной последовательности. Полноразмерные последовательности ДНК также могут быть получены с помощью анализа геномных фрагментов.
Некоторые нуклеотидные последовательности молекул кДНК, кодирующие участки белков легочной опухоли, представлены в 8ЕО ΙΌ N0 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160, 162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255-337, 345, 347 и 349.
В целом, полинуклеотидные варианты могут быть получены с помощью любого известного в данной области техники метода, включая химический синтез, например, твердофазный фосфоамидитный химический синтез. Модификации в полинуклеотидной последовательности также могут быть внесены с использованием стандартных методов мутагенеза, таких как опосредованный олигонуклеотидами сайтспецифичный мутагенез (см. Абе1тап е! а1., 1983, ^NΑ, 2, 183). Как альтернатива, молекулы РНК могут быть получены в результате транскрипции ίη νίίτο или ίη νίνο последовательностей ДНК, кодирующих белок легочной опухоли или его часть, для чего ДНК встраивают в вектор с подходящим для РНК-полимеразы промотором (таким как Т7 или 8Р6). Определенные участки могут быть использованы для получения кодируемого полипептида в соответствии с описанным в данном тексте. Кроме того, или в качестве альтернативы, участок может быть введен больному так, чтобы кодируемый полипептид образовывался ίη νίνο (например, путем трансфекции антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки, кДНКконструкцией, кодирующей полипептид легочной опухоли, с последующим введением трансфицированных клеток больному).
Сегмент последовательности, комплементарный кодирующей последовательности (т.е. антисмысловой полинуклеотид), также может быть использован в качестве зонда или для модуляции генной экспрессии. Конструкции кДНК, которые могут быть транскрибированы в антисмысловую РНК, также могут быть внесены в клетки тканей для облегчения выработки антисмысловой РНК. В соответствии с описан ным здесь антисмысловой полинуклеотид можно использовать для подавления экспрессии опухолевого белка. «Антисмысловую технологию» можно применять для контроля за генной экспрессией за счет формирования триплетных спиралей, которые нарушают способность двойной спирали открываться в той степени, которая достаточна для связывания с ней полимераз, транскрипционных факторов или регуляторных молекул (см. Сее с1 а1., 1994, Ιη НиЬет & Сагг (ебк.) Мо1еси1аг апб 1тшипо1оДс Арртоасйек, Ри1ита РиЬ1. Со., Моип! Ко5со. ΝΥ). Как альтернатива, антисмысловая молекула может быть сконструирована так, чтобы гибридизоваться с регуляторным сегментом гена (например, промотором, энхансером или сайтом инициации транскрипции), тем самым блокируя транскрипцию гена, или так, чтобы блокировать трансляцию в результате подавления связывания транскрипта на рибосомах.
Сегмент кодирующей последовательности или комплементарной последовательности также может быть сконструирован в виде зонда или праймера для выявления генной экспрессии. Зонды могут быть помечены различными репортерными группами, такими как радионуклиды и ферменты, и предпочтительно они имеют длину по крайней мере 10 нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов и еще более предпочтительно длину по крайней мере 30 нуклеотидов. Как отмечалось выше, длина праймеров предпочтительно составляет 22-30 нуклеотидов.
Любой полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован с целью повышения его стабильности ίη νί\Ό. Возможные модификации включают, тем самым не ограничиваясь, добавление фланкирующих последовательностей с 5'- и/или З'-концов; использование фосфотиоата или 2'-О-метила вместо фосфодиэфирных связей в фосфатном скелете; и/или включение редких оснований, таких как инозин, квеуозин и вибутозин, равно как и ацетил-, метил-, тио- и иначе модифицированные формы аденина, цитидина, гуанина, тимина и уридина.
Нуклеотидные последовательности, описанные здесь, могут быть присоединены к различным другим нуклеотидным последовательностям с использованием разработанных технологий рекомбинантных ДНК. Например, полинуклеотид можно клонировать в состав любого из множества клонирующих векторов, включая плазмиды, фагмиды, производные λ-фага и космиды. Представляющими конкретный интерес векторами являются экспрессирующие векторы, репликационные векторы, зондообразующие векторы и секвенационные векторы. В целом, вектор должен включать сайт начала репликации, функциональный по крайней мере в одном организме, удобные рестрикционные сайты и один или несколько селективных маркеров. Присутствие других элементов будет зависеть от предполагаемого использования и будет ясно специалисту в данной области техники.
В некоторых вариантах полинуклеотиды могут быть сформированы так, чтобы обеспечить попадание в клетку млекопитающего и экспрессию в ней. Такие препараты, в частности, применимы для лечебных целей в соответствии с описанным далее. Для специалиста в данной области техники должно быть понятно, что существует много путей достижения экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени, и может быть использован любой подходящий метод. Например, полинуклеотид может быть встроен в вирусный вектор, такой как, тем самым не ограничиваясь, аденовирус, аденоассоциированный вирус, ретровирус или вирус коровьей оспы или иной оспяный вирус (например, вирус оспы птиц). Также полинуклеотиды могут быть введены в виде «голых» плазмидных векторов. Методы включения ДНК в такие векторы хорошо известны специалистам в данной области техники. Ретровирусный вектор может дополнительно переносить или включать ген селективного маркера (с целью идентификации или отбора трансдуцированных клеток) и/или направляющий компонент, такой как ген, который кодирует лиганд для рецептора на поверхности конкретной клетки-мишени, что делает вектор специфичным по такой мишени. Также направленность можно обеспечить с помощью антитела, применяя методы, хорошо известные специалистам в данной области техники.
Другие препараты для лечебных целей включают коллоидные дисперсные системы, такие как макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики и системы на основе липидов, включая масляно-водные эмульсии, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой для использования в качестве доставочного приспособления ίη νίΙΐΌ и у1уо является липосома (т.е. искусственный мембранный пузырек). Приготовление и использование таких систем хорошо известно в данной области техники.
Полипептиды легочной опухоли
В контексте настоящего изобретения полипептиды могут включать по крайней мере иммуногенный сегмент белка легочной опухоли или его варианта в соответствии с описанным здесь. Как отмечено выше, «белок легочной опухоли» - это белок, который экспрессируется клетками легочной опухоли. Белки, являющиеся белками легочной опухоли, также на выявляемом уровне взаимодействуют в иммунологическом анализе (таком как ТИФА) с антисыворотками больного с диагнозом рака легкого. Длина описываемых здесь полипептидов может быть любой. Могут присутствовать дополнительные последовательности, производные от нативного белка и/или гетерологичных последовательностей, и такие последовательности могут (хотя и не обязательно) проявлять дополнительные иммуногенные или антигенные свойства.
По использованию в данном тексте «иммуногенный сегмент» обозначает сегмент белка, который распознается (т.е. специфически связывается) В-клеточными и/или Т-клеточными поверхностными рецепторами антигена. Такие иммуногенные сегменты обычно включают по крайней мере 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно по крайней мере 10 и еще более предпочтительно по крайней мере 20 аминокислотных остатков из белка легочной опухоли или его варианта. Некоторые предпочтительные иммуногенные сегменты включают пептиды, в которых Ν-концевая сигнальная (лидерная) последовательность и/или трансмембранный домен делегированы. Другие предпочтительные иммуногенные сегменты могут включать небольшие Ν- и/или С-концевые делеции (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) по отношению к зрелому белку.
Иммуногенные сегменты обычно могут быть идентифицированы с использованием хорошо известных методов, таких как те, которые обобщены у Раи1, 1993, Риибатеи1а1 1ттиио1оду, 36 еб., 243-247, Кауеи Рге§8 и в цитирующихся там работах. Такие методы включают скрининг полипептидов по их способности взаимодействовать с антиген-специфичными антителами, антисыворотками и/или Тклеточными линиями или клонами. По использованию в данном тексте антисыворотки и антитела являются «антиген-специфичными», если они специфически связываются с антигеном (т.е. они взаимодействуют с белком в ТИФА или другом иммунологическом анализе и не взаимодействуют на выявляемом уровне с неродственными белками). Такие антисыворотки и антитела могут быть получены в соответствии с описанным здесь и с использованием хорошо известных методов. Иммуногенный сегмент нативного белка легочной опухоли - это сегмент, который взаимодействует с такими антисыворотками и/или Т-клетками на уровне, который в сколько-нибудь существенной степени не ниже реактивности полноразмерного полипептида (например, в ТИФА и/или анализе на реактивность Т-клеток). Такие иммуногенные сегменты могут взаимодействовать в названных анализах на уровне, который сходен или превышает реактивность полноразмерного полипептида. Такой скрининг обычно может быть проведен с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области техники, например, описанных у Наг1оте & Ьаие, 1988, ЛибЬоб1е8: А ЬаЬогаФгу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаФгу. Например, полипептид может быть иммобилизован на твердую подложку и проконтактирован с сывороткой больного для обеспечения связывания антител из сыворотки с иммобилизованным полипептидом.
Несвязанная сыворотка может быть затем удалена, а связанные антитела - выявлены с использованием, например, 1251-меченного белкаА.
Как отмечалось выше, композиция может содержать вариант нативного белка легочной опухоли. По использованию в данном тексте полипептидный «вариант» обозначает полипептид, который отличается от нативного белка легочной опухоли по одной или нескольким заменам, делециям, добавлениям и/или вставкам, в результате чего иммуногенность полипептида по существу не снижается. Другими словами, способность варианта взаимодействовать с антиген-специфичными антисыворотками может быть усилена или остаться неизменной по сравнению с нативным белком, или она может быть снижена менее чем на 50% и предпочтительно менее чем на 20% по сравнению с нативным белком. Такие варианты, в целом, могут быть идентифицированы путем модифицирования одной из вышеприведенных последовательностей полипептидов и оценки реактивности модифицированного полипептида в отношении антиген-специфичных антител или антисывороток в соответствии с описанным в данном тексте. Предпочтительные варианты включают такие варианты, в которых один или несколько сегментов, таких как Ν-концевая сигнальная последовательность или трансмембранный домен, были удалены. Другие предпочтительные варианты включают варианты, в которых небольшой сегмент (например, 1-30 аминокислот, предпочтительно 5-15 аминокислот) был удален из Ν- и/или С-концевой части зрелого белка.
Полипептидные варианты предпочтительно проявляют по крайней мере примерно 70%, более предпочтительно по крайней мере примерно 90% и наиболее предпочтительно по крайней мере примерно 95% идентичности (что определяется в соответствии с описанным выше) с идентифицированными полипептидами.
Предпочтительно вариант включает консервативные замены. «Консервативной заменой» является такая замена, при которой аминокислота заменяется на другую аминокислоту, обладающую сходными свойствами, в результате чего специалист в области химии пептидов сможет ожидать, что вторичная структура и параметры гидропатичности полипептида по существу окажутся неизменными. В целом, аминокислотные замены могут быть выполнены, исходя из сходства параметров полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатичности аминокислотных остатков. Например, отрицательно заряженными аминокислотами являются аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; положительно заряженными аминокислотами являются лизин и аргинин; аминокислотами с полярными незаряженными головными группами, обладающими сходными величинами гидро фильности, являются лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другими группами аминокислот, которые могут представлять консервативные замены, являются: (1) А1а, Рго, 61у, 61и, Акр, 61п, Акп, 8ег, ТЬг; (2) Сук, 8ег, Туг, ТЬг; (3) Уа1, 11е, Ьеи, Ме1. А1а, РЬе; (4) Ьук, Агд, Ηίκ; и (5) РЬе, Туг, Тгр, Ηίκ. Также, или в качестве альтернативы, вариант может включать неконсервативные замены. В предпочтительном варианте вариантные полипептиды отличаются от нативной последовательности в результате замены, делеции или вставки пяти аминокислот или меньше. Варианты также (или как альтернатива) могут быть модифицированы, например, в результате делеции или вставки аминокислот, которые обладают минимальным влиянием на иммуногенность, вторичную структуру и параметры гидропатичности полипептида.
Как отмечалось выше, полипептиды могут включать сигнальную (или лидерную) последовательность на Ν-концевой части белка, которая одновременно с трансляцией или после нее обеспечивает перенос белка. Также полипептид может быть соединен с линкером или другой последовательностью для облегчения синтеза, очистки или идентификации полипептида (например, с полигистидиновым «хвостом»), или для усиления связывания полипептида на твердой подложке. Например, полипептид может быть соединен с Ес-сегментом иммуноглобулина.
Полипептиды могут быть получены с использованием любого из различных хорошо известных методов. Рекомбинантные полипептиды, кодируемые описанными выше последовательностями ДНК, легко могут быть получены на материале последовательностей ДНК с использованием различных экспрессирующих векторов, известных специалистам в данной области техники. Экспрессию можно осуществить в любой подходящей клетке-хозяине, которая была трансформирована или трансфицирована экспрессирующим вектором, включающим молекулу ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящими клеткамихозяевами являются прокариоты, дрожжи, высшие эукариотические и растительные клетки. Предпочтительно используемыми клеткамихозяевами являются клетки Е.со11, дрожжей или клетки млекопитающих таких линий, как СО8 или СНО. Надосадочные фракции от подходящих систем «хозяин-вектор», которые секретируют рекомбинантный белок или полипептид в культуральную среду, сначала могут быть сконцентрированы с использованием имеющегося в продаже фильтра. После концентрирования концентрат может быть внесен на подходящий матрикс для очистки, такой как аффинный матрикс или ион-обменная смола. Наконец, одна или несколько стадий ВЭЖХ с обращенной фа зой могут быть использованы для дальнейшей очистки рекомбинантного полипептида.
Сегменты и другие варианты, состоящие менее чем из примерно 100 аминокислот и обычно менее чем из примерно 50 аминокислот, также могут быть сформированы синтетическим путем с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Например, такие полипептиды могут быть синтезированы с использованием любой имеющейся в продаже твердофазной технологии, такой как метод твердофазного синтеза по Мэррифилду, в котором аминокислоты последовательно добавляют к концу растущей аминокислотной цепочки: см. Меглйе1б, 1963, I. Атег. СЬет. 8ос., 85, 2149-2146. В продаже у таких поставщиков, как Регкш Е1тег, АррЬеб Вю8ук1етк Όίνίκίοη (Еок1ег Сйу, СА), имеется оборудование для автоматического синтеза полипептидов, на котором можно работать в соответствии с инструкциями изготовителя.
В некоторых конкретных вариантах полипептид может являться химерным белком, который включает несколько полипептидов, описанных здесь, или который включает по крайней мере один полипептид, описанный здесь, и неродственную последовательность, такую как известный опухолевый белок. Партнер по химеризации, например, может способствовать презентированию Т-хелперных эпитопов (иммунологический партнер по химеризации), предпочтительно эпитопов, распознаваемых Т-хелперами человека, или может способствовать экспрессии белка (усилитель экспрессии) на более высоком уровне по сравнению с нативным рекомбинантным белком. Некоторыми предпочтительными партнерами по химеризации являются партнеры по химеризации, одновременно выполняющие иммунологическую роль и роль усиления экспрессии. Другие партнеры по химеризации могут быть выбраны так, чтобы повысить растворимость белка или обеспечить белку попадание в желательные внутриклеточные компартменты. Другими партнерами по химеризации являются аффинные метки, которые облегчают очистку белка.
В целом, химерные белки могут быть получены с помощью стандартных методов, включая химическое присоединение. Предпочтительно химерный белок экспрессируют в виде рекомбинантного белка, обеспечивая в экспрессионной системе выработку на повышенном уровне по сравнению с нехимерным белком. Коротко говоря, последовательности ДНК, кодирующие полипептидные компоненты, могут быть собраны по отдельности и лигированы в состав подходящего экспрессирующего вектора. 3'-Конец последовательности ДНК, кодирующей один полипептидный компонент, лигируют через пептидный линкер или без него на 5'конец последовательности ДНК, кодирующей второй полипептидный компонент, таким обра зом, что рамки считывания последовательностей совпадают по фазе. Это обеспечивает трансляцию в единый химерный белок, который сохраняет биологическую активность обоих полипептидных компонентов.
Последовательность пептидного линкера может быть использована для разделения первого и второго пептидных компонентов расстоянием, достаточным до того, чтобы гарантировать каждому полипептиду укладку в его вторичную и четвертичную структуру. Такую последовательность пептидного линкера вносят в химерный белок с использованием стандартных методов, известных в данной области техники. Подходящие последовательности пептидных линкеров могут быть выбраны на основе следующих факторов: (1) их способности принимать гибкую протяженную конфигурацию; (2) их неспособности образовывать вторичную структуру, которая бы могла взаимодействовать с функциональными эпитопами первого и второго полипептидов; и (3) отсутствия гидрофобных или заряженных остатков, которые могли бы взаимодействовать с функциональными эпитопами полипептидов. Предпочтительные последовательности пептидных линкеров включат остатки С1у. Аки и 8сг. Также в линкерной последовательности можно использовать другие почти нейтральные аминокислоты, такие как Т11Г и А1а. Аминокислотные последовательности, которые можно эффективно использовать в качестве линкеров, включают последовательности, описанные у Мата!еа е! а1., 1985, Сепе, 40, 39-46; Митрйу е! а1., 1986, Ргос. Ыа!1. Асад. 8с1. И8А, 83, 8258-8262; в патенте США № 4935233 и в патенте США № 4751180. Обычно линкерная последовательность может иметь длину от 1 до примерно 50 аминокислот. Линкерные последовательности не нужны, если первый и второй полипептиды имеют не играющие важной роли Ν-концевые аминокислотные участки, которые могут быть использованы для разделения функциональных доменов и предотвращения стерической интерференции.
Лигированные последовательности ДНК функционально присоединяют к подходящим элементам, регулирующим транскрипцию или трансляцию. Регуляторные элементы, ответственные за экспрессию ДНК, расположены только с 5'-стороны от последовательности ДНК, кодирующей первые полипептиды. Сходным образом стоп-кодоны, необходимые для остановки трансляции, и сигналы терминации транскрипции присутствуют только с 3'-стороны от последовательности ДНК, кодирующей второй полипептид.
Также предусматриваются химерные белки, которые включают полипептид по настоящему изобретению вместе с неродственным иммуногенным белком. Предпочтительно иммуногенный белок способен вызывать вторичный иммунный ответ. Примерами таких белков яв ляются столбнячные, туберкулезные и гепатитные белки (см., например, 8Юи1е е! а1., 1997, \ем Епд1апд 1. Мед., 336, 86-91).
В предпочтительных вариантах иммунологический партнер по химеризации происходит от белка Ό - поверхностного белка грамотрицательной бактерии НаешорЫ1и8 шПиепха В (международная патентная заявка XV О 91/18926). Предпочтительно дериват белка Ό включает приблизительно первую треть белка (например, первые Ν-концевые 100-110 аминокислот), причем дериват белка Ό может быть липидирован. В некоторых предпочтительных вариантах первые 109 остатков липопротеинаΌ, как химерного партнера, присоединяют к Νконцу с получением полипептида с дополнительными экзогенными Т-клеточными эпитопами и с повышением уровня экспрессии в Е.соН (т. е. функционирующего также в качестве усилителя экспрессии). «Липидный хвост» обеспечивает оптимальное презентирование антигена на антиген-презентирующих клетках. Другим партнером по химеризации является неструктурный белок вируса гриппа - N81 (гемагглютинин). Обычно используют расположенные с Ν-конца 81 аминокислоту, хотя можно использовать и различные фрагменты, которые включают Т-хелперные эпитопы.
В другом варианте иммунологический партнер по химеризации является белком, известным как ЬУТА, или его сегментом (предпочтительно С-концевым сегментом). ЬУТА происходит от 8!тер!ососси8 рпеишошае, который синтезирует Ν-ацетил-Ь-аланинамидазу, известную под названием амидазы ЬУТА (кодируется геном Ьу1А: Сепе, 1986, 43, 265-292). ЬУТА является автолизином, который специфически разрушает определенные связи в пептидогликановом скелете. С-концевой домен в составе белка ЬУТА ответствен за аффинность к холину или некоторым аналогам холина, таким как ЭЕАЕ. Данное свойство было использовано для формирования плазмид Е.сой, экспрессирующих С-ЬУТА, применимых для экспрессии химерных белков. Ранее была описана очистка химерных белков, включающих фрагмент СЬУТА на Ν-конце (см. Вю!есйпо1оду, 10, 795798, 1992). В предпочтительном варианте в химерный белок может быть включен повторный сегмент ЬУТА. Повторный сегмент обнаруживается в С-концевом участке, начиная со 178-го остатка. Особенно предпочтительный повторный сегмент охватывает остатки 188-305.
Обычно полипептиды (включая химерные белки) и полинуклеотиды в соответствии с описанным здесь являются изолированными. «Изолированным» является такой полипептид или полинуклеотид, который выделен из исходной для него среды. Например, встречающийся в естественных условиях белок является изолированным, если он отделен от части или от всех сосуществующих с ним в природной системе материалов. Предпочтительно такие полипептиды могут быть чистыми по крайней мере примерно на 90%, более предпочтительно чистыми по крайней мере на 95% и наиболее предпочтительно чистыми по крайней мере примерно на 99%. Полинуклеотид рассматривается как изолированный, если он, например, клонирован в вектор, который не является частью естественной среды.
Связывающие агенты
Далее настоящее изобретение представляет агенты, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с белком легочной опухоли. По использованию в данном тексте про антитело или его антиген-связывающий фрагмент говорят, что они «специфически связываются» с белком легочной опухоли, если они взаимодействуют на выявляемом уровне (например, в тесте ТИФА) с белком легочной опухоли и не взаимодействуют на выявляемом уровне с неродственными белками при сходных условиях. По использованию в данном тексте «связывание» обозначает такую нековалентную связь между двумя раздельными молекулами, в результате которой образуется комплекс. Способность связываться можно оценить, например, с помощью установления константы связывания для образования комплекса. Константа связывания представляет собой величину, полученную в случае, когда концентрация комплекса разделена на произведение концентраций его компонентов. В целом, в контексте настоящего изобретения про два соединения говорят, что они «связываются», если константа связывания для образования комплекса превышает примерно 103 л/моль. Константу связывания можно определить с помощью методов, хорошо известных в данной области техники.
Связывающие агенты дополнительно могут обладать способностью разграничивать пациентов, у которых есть или нет ракового заболевания, такого как рак легкого, при использовании описанных здесь репрезентативных анализов. Другими словами, антитела или другие связывающие агенты, которые связываются с белком легочной опухоли, будут генерировать сигнал, указывающий на наличие рака по крайней мере у примерно 20% пациентов с заболеванием, и будут генерировать отрицательный сигнал, указывающий на отсутствие заболевания по крайней мере у примерно 90% субъектов без ракового заболевания. Для определения того, удовлетворяет ли связывающий агент указанному требованию, биологические образцы (например, кровь, сыворотка, мокроты, моча и/или биопсийные пробы опухолей) от пациентов с диагнозом рака или без него (в соответствии с определениями с помощью стандартных клинических анализов) могут быть проанализированы в соответствии с описанным в данном тексте на присутствие полипептидов, которые связываются со связывающимся агентом. Должно быть понятно, что необходимо проанализировать статистически значимое число образцов с диагнозом рака и без него. Каждый связывающий агент должен удовлетворять вышеуказанным критериям: однако, для специалистов в данной области техники будет ясно, что с целью повышения чувствительности связывающие агенты можно использовать в сочетании.
Любой агент, который удовлетворяет приведенным выше требованиям, может являться связывающим агентом. Например, связывающий агент может быть рибосомой, имеющей или не имеющей пептидного компонента, молекулой РНК или полипептидом. В предпочтительном варианте связывающий агент является антителом или его антиген-связывающим сегментом. Антитела могут быть получены с помощью любого из различных методов, известных специалистам в данной области техники: см., например, Наг1оте & Ьапе, 1988, АпйЬоФек: А ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б Брппд НагЬог ЬаЬогаЮгу. В целом, антитела могут быть получены с помощью методов культивирования клеток, включая получение моноклональных антител, описанное в данном тексте, или с помощью трансфекции генов антител в подходящие бактериальные клетки-хозяева или клетки-хозяева млекопитающих с целью обеспечения выработки рекомбинантных антител. В одном из методов полипептидсодержащий иммуноген сначала инъецируют любому из широкого круга млекопитающих (например, мыши, крысы, кролики, овцы или козы). На этой стадии полипептиды по настоящему изобретению могут выполнять роль иммуногена без модификаций. Как альтернатива, в частности, в случае относительно коротких полипептидов, более сильный иммунный ответ может быть вызван тогда, когда полипептид присоединен к белку-носителю, такому как бычий сывороточный альбумин или гемоцианин слизня. Иммуноген инъецируют животномуреципиенту, причем предпочтительно в соответствии с заранее составленной схемой, включающей одну или несколько бустерных иммунизаций, и у животных периодически берут пробы крови. Поликлональные антитела, специфичные для полипептида, могут быть затем очищены из таких антисывороток с помощью, например, аффинной хроматографии с использованием полипептида, присоединенного к подходящей твердой подложке.
Моноклональные антитела, специфичные для интересующего антигенного полипептида, могут быть получены, например, с использованием метода Келера-Мильштейна (КоЫег & Мййет, 1976, Еиг. 1. Iттиηо1., 6, 511-519) и его модификаций. Вкратце, такие методы включают формирование иммортализованной клеточной линии, способной вырабатывать антитела, обладающие желательной специфичностью (т.е. взаимодействующие с интересующим полипеп тидом). Такие клеточные линии могут быть получены, например, на материале клеток селезенки, взятых от животного, иммунизованного в соответствии с описанным выше. Затем клетки селезенки иммортализуют, например, путем слияния с миеломными клетками, являющимися партнерами по гибридизации, предпочтительно такими клетками, которые сингенны иммунизированному животному. Могут быть использованы различные методы слияния. Например, клетки селезенки и миеломные клетки могут быть объединены с неионогенным детергентом на несколько минут и затем высеяны при низкой плотности на селективную среду, которая поддерживает рост гибридных клеток, но не миеломных клеток. В предпочтительном методе отбора используют НАТ-отбор (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). По прошествии достаточного времени - обычно примерно 1-2 недели - выявляют колонии гибридов. Отбирают одиночные колонии, и их культуральные надосадочные фракции тестируют на связывающую активность по отношению к полипептиду. Предпочтительными являются гибридомы, характеризующиеся высокой реактивностью и специфичностью.
Моноклональные антитела могут быть выделены из надосадочных фракций растущих гибридомных колоний. Кроме того, для повышения выхода можно использовать различные методы, такие как инъекция гибридомных клеток в брюшную полость подходящего позвоночного животного-реципиента, такого как мышь. Затем моноклональные антитела могут быть собраны из асцитной жидкости или крови. Загрязнители могут быть удалены от антител с помощью стандартных методов, таких как хроматография, гель-фильтрация, преципитация и экстракция. Полипептиды по настоящему изобретению могут быть использованы в процессе очистки, например, на стадии аффинной хроматографии.
В некоторых вариантах предпочтительным является использование антиген-связывающих фрагментов антител. Такие фрагменты включают РаЬ-фрагменты, которые могут быть получены с помощью стандартных методов. Вкратце, иммуноглобулины могут быть очищены из кроличьей сыворотки с помощью аффинной хроматографии на гранулярных колонках с белком-А (Наг1оте & Ьаие, 1988, АибЬоб1е8: А ЬаЬогаГогу Маииа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬогаГогу) и расщеплены с помощью папаина с образованием фрагментов РаЬ и Рс. Фрагменты РаЬ и Рс можно разделить с помощью аффинной хроматографии на гранулярных колонках с белком-А.
Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут быть соединены с одним или несколькими терапевтическими агентами. Подходящими в этом отношении агентами являются радионуклиды, индукторы дифференцировки, лекарственные средства, токсины и их производные. Предпочтительными радионуклидами являются 90Υ, 1231, 1251, 1311, 186Ке, 188Ке, 211АГ и 212В1. Предпочтительными лекарственными средствами являются метотрексат и аналоги пуринов и пиримидинов. Предпочтительными индукторами дифференцировки являются форболовые эфиры и масляная кислота. Предпочтительными токсинами являются рицин, абрин, дифтерийный токсин, холерный токсин, гелонин, экзотоксин Ркеиботоиак, токсин 8Ыде11а и антивирусный белок фитолакки.
Терапевтический агент может быть соединен (например, путем ковалентного связывания) с подходящим моноклональным антителом либо напрямую, либо опосредованно (например, через линкерную группу). Прямая реакция между агентом и антителом возможна тогда, когда каждый из них имеет заместители, способные взаимодействовать друг с другом. Например, нуклеофильная группа, такая как аминогруппа или сульфгидрильная группа, на одном из них может взаимодействовать с карбонилсодержащей группой, такой как ангидрид или галогенангидрид, или с алкильной группой, включающей эффективную отщепляемую группу (например, галогенид), на другом.
Как альтернатива, желательным может быть соединение терапевтического агента и антитела через линкерную группу. Линкерная группа может функционировать в качестве спейсера, чтобы дистанцировать антитело от агента с целью исключения возможных помех их способности к связыванию. Также линкерная группа может служить для повышения химической реактивности заместителя в составе агента или антитела, тем самым повышая эффективность реакции сочетания. Повышение химической реактивности также может облегчать использование агентов или функциональных групп в составе агентов, что в другом случае оказалось бы невозможным.
Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные бифункциональные или полифункциональные реагенты, как гомо-, так и гетерофункциональные (такие как те, которые описаны в каталоге фирмы Р1егсе Сбет1са1 Со., Коек Го гб, 1Ь), могут быть использованы в качестве линкерной группы. Сочетание может быть осуществлено, например, через аминогруппы, карбоксильные группы, сульфгидрильные группы или окисленные углеводные остатки. Имеется много ссылок, описывающих такую методологию, например, патент США № 4671958, выданный Коб\\'е11 е1 а1.
Когда терапевтический агент обладает большей активностью, будучи свободным от антительного сегмента иммуноконъюгатов по настоящему изобретению, желательным может быть использование линкерной группы, которая способна отщепляться в процессе интернализации внутрь клетки или после этого.
Был описан ряд различных отщепляемых линкерных групп. Механизмы внутриклеточного высвобождения агента с таких линкерных групп включают отщепление в результате восстановления дисульфидной связи (например, патент США № 4489710, выданный 8рй1ег), с помощью облучения светочувствительной связи (например, патент США № 4625014, выданный 8еп!ег е! а1.), за счет гидролиза дериватизованных боковых цепей аминокислот (например, патент США № 4638045, выданный КоНп е! а1.), за счет гидролиза, опосредованного сывороточным комплементом (например, патент США № 4671958, выданный Вой\\'е11 е! а1.), и в результате катализируемого кислотами гидролиза (например, патент США № 4569789, выданный В1а!!1ег е! а1.).
Желательным может быть присоединение к антителу более одного агента. В одном варианте множественные молекулы агента могут быть присоединены к одной молекуле антитела. В другом варианте более одного типа агента можно присоединить к одному антителу. Независимо от конкретного варианта различными способами могут быть приготовлены иммуноконъюгаты с более чем одним агентом. Например, более чем один агент может быть присоединен непосредственно к молекуле антитела, или можно использовать линкеры, которые предоставляют множественные сайты для присоединения. Как альтернатива, можно использовать носитель.
Носитель может нести агенты различными способами, включая ковалентное связывание либо напрямую, либо через линкерную группу. Подходящими носителями являются белки, такие как альбумины (например, патент США № 4507234, выданный Ка!о е! а1.), пептиды и полисахариды, такие как аминодекстран (например, патент США № 4699784, выданный δΐιίΐι е! а1.). Также носитель может нести агент за счет нековалентного связывания или инкапсуляции, например, внутри липосомного пузырька (например, патенты США №№ 4429008 и 4873088). Носителями, специфичными для радионуклидных агентов, являются небольшие радиогалогенированные молекулы и хелатирующие соединения. Например, в патенте США № 4735792 описаны небольшие радиогалогенированные молекулы и их синтез. Хелат радионуклида может быть сформирован с помощью хелатирующих соединений, включая соединения, имеющие атомы азота и серы в качестве донорных атомов для связывания металла или оксида металла, являющегося радионуклидом. Например, в патенте США № 4673562, выданном ЭауАоп е! а1., описаны характерные хелатирующие соединения и их синтез.
Могут быть использованы различные пути введения антител и иммуноконъюгатов. Обычно введение должно быть внутривенным, внутримышечным, подкожным или в ложе удаленной опухоли. Должно быть понятно, что точная доза антитела-иммуноконъюгата будет варьироваться в зависимости от используемого антитела, содержания антигена в опухоли и скорости клиренса антитела.
Т-лимфоциты
Иммунотерапевтические композиции могут также, или в качестве альтернативы, содержать Т-клетки, специфичные для белка легочной опухоли. Такие клетки в принципе могут быть получены ш νίΙΐΌ или ех у1уо с применением стандартных процедур. Например, Т-клетки можно выделить из костного мозга, периферической крови или фракции костного мозга или периферической крови пациента с использованием имеющихся в продаже систем для разделения клеток, таких как система 1ко1ех™, доступная от №хе11 ТНегареиБск 1пс., 1гуше, СА (см. также патент США № 5240856; патент США № 5215926; международные патентные заявки νθ 89/06280, νθ 91/16116 и νθ 92/07243). Как альтернатива, Т-клетки могут происходить от родственных или неродственных людей, не являющихся человеком млекопитающих, клеточных линий или культур.
Т-клетки могут быть простимулированы полипептидом легочной опухоли, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или антиген-презентирующей клеткой (АПК), которая экспрессирует такой полипептид. Стимуляцию проводят в условиях и в течение такого времени, которые достаточны для обеспечения образования Т-клеток, специфичных в отношении полипептида. Предпочтительно полипептид или полинуклеотид легочной опухоли находится в составе доставочной системы, такой как микросфера, с целью облегчения образования специфичных Т-клеток.
Т-клетки рассматриваются как специфичные в отношении полипептида легочной опухоли, если Т-клетки специфически пролиферируют, секретируют цитокины или уничтожают клетки-мишени, покрытые полипептидом или экспрессирующие ген, кодирующий полипептид. Специфичность Т-клеток можно оценить с использованием любого из известных стандартных методов. Например, в анализе на высвобождение хрома или анализе на пролиферацию индекса стимуляции, соответствующий более чем двукратному увеличению лизиса и/или пролиферации по сравнению с негативными контролями, указывает на специфичность Т-клеток. Такие анализы могут быть осуществлены, например, в соответствии с описанным у СНеп е! а1., 1994, Сапсег Век., 54, 1065-1070. Как альтернатива, выявление пролиферации Т-клеток может быть осуществлено с помощью различных известных методов. Например, пролиферацию Т-клеток можно выявить с помощью измерения увеличенного уровня синтеза ДНК (например, в культурах Т-клеток с пульсирующей меткой с использованием меченного тритием тимидина и измерением количества меченного тимидина, внесенного в ДНК). Контактирование с полипептидом легочной опухоли (от 100 нг/мл до 100 мкг/мл, предпочтительно от 200 нг/мл до 25 мкг/мл) в течение 3-7 дней должно обусловливать по крайней мере 2-кратное усиление пролиферации Т-клеток. Контактирование в соответствии с описанным выше в течение 2-3 ч должно приводить к активации Т-клеток в соответствии с измерением в стандартном анализе на цитокины, по результатам которого 2кратное повышение уровня секреции цитокина (например, ΊΝΓ или γ-интерферона) указывает на активацию Т-клеток (см. Сойдап е! а1., 1998, Сиггеп! Рго!осо1к ίη 1ттипо1оду, Уо1. 1, А11еу йИегкаепсе. Сгеепе). Т-клетки, которые были активированы в ответ на полипептид легочной опухоли, полинуклеотид или экспрессирующие полипептид АПК, могут быть СЭ4позитивными и/или СО8-позитивными. Специфичные в отношении полипептида легочной опухоли Т-клетки могут быть воспроизведены с помощью стандартных методов. В предпочтительных вариантах Т-клетки происходят от больного или родственного или неродственного донора, и их вводят больному после стимуляции и воспроизведения.
Для терапевтических целей Т-клетки СЭ4' или ί.Ό8', которые пролиферируют в ответ на полипептид легочной опухоли, полинуклеотид и АПК, можно воспроизводить численно как ш νίΐΐΌ, так и ш νί\Ό. Пролиферацию таких Тклеток ш ν 11го можно осуществить различными способами. Например, Т-клетки можно повторно подвергнуть действию полипептида легочной опухоли или короткого пептида, соответствующего иммуногенному сегменту такого полипептида, с добавлением факторов Т-клеточного роста, таких как интерлейкин-2, или без этого и/или стимуляторных клеток, которые синтезируют полипептид легочной опухоли. Как альтернатива, одна или большее число Тклеток, которые пролиферируют в присутствие белка легочной опухоли, могут быть количественно воспроизведены с помощью клонирования. Методы клонирования клеток хорошо известны в данной области техники и включают ограничивающее разведение.
Фармацевтические композиции и вакцины
В некоторых аспектах полипептиды, полинуклеотиды, Т-клетки и/или связывающие агенты, заявленные здесь, могут быть внесены в состав фармацевтических композиций или иммуногенных композиций (т.е. вакцин). Фармацевтические композиции содержат одно или несколько таких соединений и физиологически приемлемый носитель. Вакцины могут содержать одно или несколько таких соединений и иммуностимулирующее средство. Иммуностимулирующим средством может быть любое вещество, которое усиливает или интенсифицирует иммунный ответ на внешний антиген. При мерами иммуностимулирующих средств являются адъюванты, биоразрушаемые микросферы (например, полимолочный галактид) и липосомы (в которые заключено соединение: см., например, патент США № 4235877, выданный Еи11епоп). В целом, вакцинный препарат описан, например, у М.Е.Ро^ей & М.1№\\'тап (ебк.), Уассше Эек1дп (!йе кийиш! апб абщуап! арргоасй). Р1епит Ргекк, ΝΥ, 1995. Фармацевтические композиции и вакцины в объеме настоящего изобретения также могут содержать другие соединения, которые могут быть биологически активными или неактивными. Например, один или большее число иммуногенных сегментов других опухолевых антигенов могут присутствовать как встроенными в состав химерного белка, так и в виде отдельного соединения в составе композиции или вакцины.
Фармацевтическая композиция или вакцина может содержать ДНК, кодирующую один или большее число полипептидов, описанных выше, таким образом, что полипептид образуется ш кйи. Как отмечалось выше, ДНК может находиться в составе одной из различных доставочных систем, известных специалистам в данной области техники, включая системы экспрессии нуклеиновых кислот, бактериальные и вирусные экспрессионные системы. Многочисленные методы доставки генов хорошо известны в данной области техники, например, в соответствии с описанным у Во11апб, 1998, Сг11. Веν. Тйегар. Эгид Сатег 8ук!етк, 15, 143-198 и в цитируемых там ссылках. Подходящие системы экспрессии нуклеиновых кислот включают последовательности ДНК, необходимые для экспрессии в организме пациента (такие как подходящие промотор и сигнал терминации). Бактериальные доставочные системы включают введение бактерии (такой как ВасШик-Са1те!!еСиетп), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на поверхности своих клеток или секретирует такой эпитоп. В предпочтительном варианте ДНК может быть внесена с использованием вирусной экспрессионной системы (например, вируса коровьей оспы или других типов оспы, ретровируса или аденовируса), которая может включать использование непатогенного (дефектного), но компетентного по репликации вируса. Подходящие системы описаны, например, у Е1кйег-Носй е! а1., 1989, Ргос. №И. Асаб. 8οΐ. И8А, 86, 317-321; Иехпег е! а1., 1989, Апп. ΝΥ Асаб. 8сг, 569, 86-103; Иехпег е! а1., 1990, Уассше, 8, 17-21; в патентах США №№ 4603112, 4769330 и 5017487; в международных патентных заявках АО 89/01973 и АО 91/02805; в патенте США № 4777127; в британском патенте 2200651; в европейской патентной заявке 0-345242; у Вегкпег, 1988, В|о1есйп1циек, 6, 616-627; ВокепРе1б е! а1., 1991, 8с1епсе, 252, 431-434; Ко11к е! а1., 1994, Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А, 91, 215-219; Какк-Е1к1ег е! а1., 1993, Ргос.
Асаб. 8οΐ. И8А, 90, 11498-11502; Сш/тап е!
а1., 1993, С1гси1айоп, 88, 2838-2848; и Сихшап е! а1., 1993, С1г. Век., 73, 1202-1207. Методы включения ДНК в такие экспрессионные системы хорошо известны специалистам в данной области техники. ДНК также может быть «голой», как это описано, например, у И1тег е! а1., 1993, 8с1епсе, 259, 1745-1749 и представлено в обзоре у Сокеп, 1993, 8с1епсе, 259, 1691-1692. Поглощение «голой» ДНК может быть усилено с помощью нанесения ДНК на биоразрушаемые шарики, которые эффективно переносятся внутрь клеток.
При том, что любой подходящий носитель, известный специалистам в данной области техники, может быть использован в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, тип носителя будет варьироваться в зависимости от пути введения. Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для любого подходящего пути введения, включая, например, топическое, пероральное, интраназальное, внутривенное, внутричерепное, внутрибрюшинное, подкожное или внутримышечное введение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель предпочтительно включает воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно использовать любой из перечисленных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Биологически разрушаемые микросферы (например, из сополимера молочной и гликолевой кислот) также могут быть использованы в качестве носителей для фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Подходящие биоразрушаемые микросферы описаны, например, в патентах США №№ 4897268 и 5075109.
Такие композиции также могут содержать буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или фосфатносолевой буфер), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или консерванты. Как альтернатива, композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в лиофилизованном виде. Соединения также могут быть заключены в липосомы с использованием хорошо известных технологий.
В вакцинах по настоящему изобретению могут быть использованы любые из различных иммуностимулирующих средств. Например, могут быть включены адъюванты. Большинство адъювантов содержат вещество, сформированное так, чтобы защищать антиген от быстрого разрушения, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, а также стимулятор иммун ных ответов, такой как липид-А и белки, производные от Вог1абе11а репиккк или МусоЬас!епит !иЬегси1ок1к. Подходящие адъюванты имеются в продаже, например, неполный адъювант Фрейнда и полный адъювант Фрейнда (Ойсо ЬаЬога!опек, Пе!гой, ΜΙ), адъювант 65 Мегск (Мегск & Со. 1пс., Вак\уау, N1), А8-2 (8шйкК1ше Веескат, РЫ1а6е1рЫа, РА); соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (квасцы) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионно или анионно дериватизованные полисахариды; полифосфазены; биологически разрушаемые микросферы; монофосфориллипид-А и Οιιίΐ-Λ. Цитокины, такие как СМ-С8Р или интерлейкины-2, -7 или -12, также могут быть использованы в качестве адъювантов.
В представляемых здесь вакцинах адъювантную композицию предпочтительно выстраивают таким образом, чтобы индуцировать иммунный ответ в основном ТЫ-типа. Высокие уровни цитокинов ТЫ-типа (например, γинтерферон, ΤΝΡα, 1Ь-2 и 1Ь-12) обусловливают тенденцию, благоприятствующую индукции опосредованных клетками иммунных ответов на введенный антиген. Напротив, высокие уровни цитокинов Тк2-типа (например, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-6 и 1Ь-10) связаны с тенденцией, благоприятствующей индукции гуморальных иммунных ответов. После применения вакцины в соответствии с описанным в данном тексте, у больного будет поддерживаться иммунный ответ, который включает ответы и Тк1-, и Тк2-типов. В предпочтительном варианте, в котором ответ в основном представлен Тк1-типом, уровни цитокинов Тк1-типа должны возрастать в более значительной степени, чем уровни цитокинов Тк2типа. Уровни указанных цитокинов могут быть легко оценены с использованием стандартных тестов. Как обзор по семействам цитокинов, см. Моктапп & СоГГтап, 1989, Апп. Веу. 1ттипо1., 7, 145-173.
Предпочтительными адъювантами для использования в стимуляции преобладающего ответа ТЫ-типа являются, например, сочетание монофосфориллипида-А, предпочтительно 3-деО-ацилированного монофосфориллипида-А (3П-МРЬ), с солью алюминия. Адъюванты МРЬ доступны от В1Ь1 1ттипоСкет Векеагск 1пс. (НатЫоп, МТ) (см. патенты США №№ 4436727, 4877611, 4866034 и 4912094). Содержащие мотив СрС олигонуклеотиды (в которых динуклеотид СрС неметилирован) также индуцируют по преимуществу ответ ТЫ-типа. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в международных патентных заявках АО 96/02555 и АО 99/33488. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описываются, например, у 8аЮ е! а1., 1996, 80епсе, 273, 352. Другим предпочтительным адъ ювантом является сапонин, предпочтительно 0821 (Лс|ш1а В1орЬагтасеибса1к 1пс., ЕгаттдЬат, МА), который может быть использован отдельно или в сочетании с другим адъювантами. Например, усиленная система включает сочетание монофосфориллипида-А и производного сапонина, например, объединение 0821 и 3Э-МРБ в соответствии с описанным в международной патентной заявке АО 94/00153, или менее активная композиция, в которой 0821 загашен холестерином, что описано в международной патентной заявке XVО 96/33739. Другие предпочтительные препараты содержат масляно-водные эмульсии и токоферол. Особенно, активный адъювантный препарат, содержащий 0821, 3П-МРЬ и токоферол в масляно-водной эмульсии, описан в международной патентной заявке АО 95/17210.
Другими предпочтительными адъювантами являются МогИашбе 18А 720 (8ерр1с, Франция), 8АЕ (СЫгоп, СА, США), 18СОМ8 (С8Ь), МЕ-59 (СЫгоп), серия адъювантов 8ВА8 (например, 8ВА8-2 или 8ВА8-4, доступные от 8шйЬК1те ВеесЬат, Я1хепкаг1, Бельгия), Эе1ох (Я1Ы 1ттипоСЬет ЯекеагсЬ 1пс., НатЫоп, МТ), ЯС-529 (Я1Ь1 1ттипоСЬет ЯекеагсЬ 1пс., НатЫоп, МТ) и аминоалкилглюкозаминид-4фосфаты (АОР).
Любая представленная здесь вакцина может быть приготовлена с использованием хорошо известных способов, сутью которых является объединение антигена, усилителя иммунных ответов и подходящего носителя или наполнителя. Описанные здесь композиции могут быть введены в составе препарата медленной секреции (т.е. такого препарата, как капсула, тампон или гель, составленного, например, полисахаридами, который обусловливает медленное выделение соединения после введения). Такие препараты в принципе могут быть приготовлены с использованием хорошо известной технологии (см., например, СоотЬек е1 а1., 1996, Уассше, 14, 1429-1438) и введены, например, путем пероральной, ректальной или подкожной имплантации или имплантации в желательный сайтмишень. Препараты медленной секреции могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированные в матриксе носителя и/или находящиеся в резервуаре, окруженном мембраной, которая обеспечивает контроль за скоростью выделения.
Носители для использования в таких препаратах биологически совместимы и также могут быть биоразрушаемыми: предпочтительно препарат обеспечивает относительно постоянный уровень выделения активного компонента. Такими носителями являются микрочастицы сополимера молочной и гликолевой кислоты, а также полиакрилат, латекс, крахмал, целлюлоза и декстран. Другими носителями для задержки секреции являются надмолекулярные биовекторы, которые содержат нежидкую гидрофильную сердцевину (например, перекрестно-сшитый полисахарид или олигосахарид) и, что необязательно, внешний слой, содержащий амфифильное соединение, такое как фосфолипид (см., например, патент США № 5151254 и международные патентные заявки АО 94/20078, АО 94/23701 и АО 96/06638). Количество активного соединения в составе препарата медленной секреции зависит от места имплантации, скорости и ожидаемой продолжительности секреции и природы состояния, лечение или профилактика которого проводится.
Любое из различных доставочных средств может быть использовано для фармацевтических композиций и вакцин для облегчения выработки антиген-специфичного иммунного ответа, которое направлено на опухолевые клетки. Поставочными средствами являются антигенпрезентирующие клетки (АПК), такие как дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, моноциты и другие клетки, которые можно преобразовать так, чтобы они были эффективными АПК. Такие клетки могут быть, хотя и не обязательно, генетически модифицированы с целью увеличения способности к презентированию антигена, улучшения активации и/или поддержания Т-клеточного ответа, придания противоопухолевой активности рег ке и/или обеспечения иммунологической совместимости с реципиентом (т.е. соответствия гаплотипов НЬА). АПК обычно могут быть выделены из любых биологических жидкостей и органов, включая опухолевые и ткани, расположенные около опухолевых, и могут быть аутологичными, аллогенными, сингенными или ксеногенными клетками.
В некоторых предпочтительных вариантах настоящего изобретения в качестве антигенпрезентирующих клеток используют дендритные клетки или их предшественники. Дендритные клетки являются очень эффективными АПК (ВапсЬегеаи & 81ештап, 1998, МЦиге, 392, 245251) и, как было показано, эффективны в качестве физиологического адъюванта для стимуляции профилактического или лечебного противоопухолевого иммунитета (см. Т1ттегтап & Бету, 1999, Апп. Яеν. Меб., 50, 507-529). В целом, дендритные клетки могут быть идентифицированы на основе их характерной формы (ш кйи звездчатый, а ш тбго с хорошо различимыми цитоплазматическими отростками (дендритами)), по их способности захватывать, процессировать и презентировать антигены с высокой эффективностью и по способности активировать к иммунному ответу «необученные» Т-клетки. Понятно, что дендритные клетки могут быть преобразованы таким образом, чтобы они экспрессировали конкретные поверхностноклеточные рецепторы или лиганды, которые обычно не обнаруживаются на поверхности дендритных клеток ш νί\Ό или ех т1то, и такие модифицированные дендритные клетки преду сматриваются настоящим изобретением. В качестве альтернативы дендритным клеткам в вакцинах могут быть использованы пузырьки, секретированные загруженными антигеном дендритными клетками (экзосомы)(см. Ζίΐνο^οΐ е1 а1., 1998, №Шге Меб., 4, 594-600).
Дендритные клетки и предшественники могут быть получены из периферической крови, костного мозга, инфильтрующих опухоль клеток, инфильтрующих околоопухолевые ткани клеток, лимфатических узлов, селезенки, кожи, крови пупочного тяжа или любой другой подходящей ткани или жидкости тела. Например, дендритные клетки могут быть дифференцированы ех νίνο путем добавления сочетания цитокинов, таких как СМ-С8Р, 1Ь-4, ГС-13 и/или ТИГа, к культурам моноцитов, взятых из периферической крови. Как альтернатива, СЭ34позитивные клетки, выделенные из периферической крови, крови пупочного тяжа или костного мозга, могут быть дифференцированы в дендритные клетки добавлением в культуральную среду сочетаний СМ-С8Р, 1Ь-3, ТНЕа, лиганда ί.Ό40. ЛПС, лиганда ί1ΐ3 и/или другого(их) соединения(й), которое индуцирует дифференцировку, созревание и пролиферацию дендритных клеток.
Дендритные клетки стандартным образом разделяют на «незрелые» и «зрелые» клетки, что представляет собой простой путь разграничения двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако данная номенклатура не должна быть призвана исключить все возможные промежуточные стадии дифференциации. Незрелые дендритные клетки характеризуют как АПК с высокой способностью к поглощению и процессированию антигена, что коррелирует с высоким уровнем экспрессии рецептора Рсу и рецептора маннозы. Зрелый фенотип обычно характеризуется низким уровнем экспрессии указанных маркеров, но интенсивной экспрессией поверхностно-клеточных молекул, отвечающих за активацию Т-клеток, таких как молекулы класса I и класса II МНС, адгезионные молекулы (например, СЭ54 и СО 11) и костимуляторные молекулы (например, СЭ40, СО80, СЭ86 и 4-1ВВ).
Обычно АПК можно трансфицировать полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли (или его сегмент или другой вариант) , таким образом, что полипептид легочной опухоли или его иммуногенный сегмент экспрессируется на поверхности клеток. Такая трансфекция может иметь место ех νίνο, и композиция или вакцина, содержащие такие трансфицированные клетки, могут быть затем использованы для терапевтических целей в соответствии с описанным в данном тексте. Как альтернатива, ген-доставочное средство, которое направлено на дендритную или иную антиген-презентирующую клетку, можно вводить больному, что приводит к трансфекции ίη νίνο. Например, трансфекция дендритных клеток ίη νίνο и ех νίνο, в целом, может быть осуществлена с помощью любых методов, известных в данной области техники, например, как описано в международной патентной заявке \¥0 97/24447, или с помощью метода «генного ружья», описанного у Μαίινί е1 а1., 1997, Ιιηιηιιηοίοβ}· апб Се11 Βίο1ο§ν, 75, 456-460. Загрузка антигена на дендритные клетки может быть осуществлена путем инкубации дендритных клеток или клетокпредшественников с полипептидом легочной опухоли, ДНК («голой» или в составе плазмидного вектора) или РНК; или с экспрессирующими антиген рекомбинантными бактерией или вирусом (например, векторами вирусов коровьей оспы, куриной оспы, аденовирусов или лентивирусов). Перед загрузкой полипептид можно ковалентно присоединить к иммунологическому партнеру, что выполнит роль хелпера Т-клеток (например, как молекула-носитель). Как альтернатива, дендритную клетку можно обработать не присоединяемым иммунологическим партнером, причем как отдельно, так и в присутствие полипептида.
Вакцины и фармацевтические композиции могут быть представлены в емкостях со стандартной дозой или несколькими дозами, таких как закрытые ампулы или флаконы. Такие емкости предпочтительно закрыты герметично, чтобы обеспечить стерильность препарата до момента использования. В целом, препараты могут храниться в виде суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных наполнителях. Как альтернатива, вакцина или фармацевтическая композиция может храниться в лиофилизованном состоянии, которое требует только добавления жидкого стерильного носителя непосредственно накануне использования.
Лечение рака
В следующих аспектах настоящего изобретения описываемые здесь композиции могут быть использованы для иммунотерапии рака, такого как рак легкого. В таких способах фармацевтические композиции и вакцины обычно вводят пациенту. По использованию в данном тексте «пациент» обозначает любое теплокровное животное, предпочтительно человека. У пациента может быть, а может и не быть ракового заболевания. Соответственно, указанные выше фармацевтические композиции и вакцины могут быть использованы для профилактики развития рака или для лечения пациента с диагнозом рака. Раковое заболевание может быть диагностировано на основании критериев, обычно, принятых в данной области техники, включая присутствие злокачественной опухоли. Фармацевтические композиции и вакцины могут быть введены как до, так и после хирургического удаления первичных опухолей и/или такого лечения, как применение радиотерапии или стандартных химиотерапевтических средств.
В некоторых вариантах иммунотерапия может быть активной иммунотерапией, при которой лечение нацелено на стимуляцию ίη νίνο эндогенной иммунной системы пациента, чтобы она действовала против опухолей, с помощью введения агентов-модификаторов иммунного ответа (таких как описанные здесь полипептиды и полинуклеотиды).
В других вариантах иммунотерапия может быть пассивной иммунотерапией, при которой лечение включает доставку агентов, обладающих устойчивой иммунной активностью в отношении опухоли (таких как эффекторные клетки или антитела), которые могут напрямую или опосредованно проявлять противоопухолевые действия и не нуждаются в обязательной зависимости от иммунной системы интактного реципиента. Примерами эффекторных клеток являются описанные выше Т-клетки, Тлимфоциты (такие как СО8-позитивные цитотоксичные Т-лимфоциты и СЭ4-позитивные Т-хелперные лимфоциты, инфильтрующие опухоль), клетки-киллеры (такие как нативные клетки-киллеры и активируемые лимфокинами клетки-киллеры), В-лимфоциты и антигенпрезентирующие клетки (такие как дендритные клетки и макрофаги), экспрессирующие заявляемый здесь полипептид. Т-клеточные рецепторы и рецепторы антител, специфичные для приведенных в данном тексте полипептидов, могут быть клонированы, экспрессированы и внесены в другие векторы или эффекторные клетки для целей адоптивной иммунотерапии. Представленные здесь полипептиды также можно использовать для формирования антител или антиидиотипических антител (в соответствии с описанным выше и в патенте США № 4918164) для целей пассивной иммунотерапии.
Эффекторные клетки, в целом, могут быть получены в достаточных количествах для целей адоптивной иммунотерапии за счет культивирования ίη νίίτο в соответствии с описанным здесь. Условия культивирования для воспроизведения от отдельной антиген-специфичной эффекторной клетки до нескольких миллиардов клеток с сохранением распознавания антигена ίη νίνο хорошо известны в данной области техники. При таких условиях культивирования ίη νίίτο обычно используют перемежающуюся стимуляцию антигеном, часто в присутствие цитокинов (таких как ГБ-2) и неделящихся клетоккормильцев. Как отмечалось выше, иммунореактивные полипептиды в соответствии с описанным здесь могут быть использованы для быстрого воспроизведения антиген-специфичных Т-клеточных культур с целью получения достаточного для иммунотерапии количества клеток. В частности, антиген-презентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги, моноциты, фибробласты и/или В-клетки, могут быть обработаны иммунореактивными полипептидами или трансфицированы одним или несколь кими полинуклеотидами с использованием стандартных методов, хорошо известных в данной области техники. Например, антигенпрезентирующие клетки могут быть трансфицированы полинуклеотидом, включающим промотор, подходящий для усиленной экспрессии в рекомбинантной вирусной или иной экспрессионной системе. Культивируемые эффекторные клетки для использования в терапии должны быть способны расти и широко распределяться, а также сохранять жизнеспособность в течение длительного времени ίη νίνο. Исследования показали, что культивируемые эффекторные клетки могут быть вызваны к росту ίη νίνο и долговременной выживаемости в достаточном количестве путем повторной стимуляции антигеном, дополненным ]Б-2 (см., например, СЕееуег еί а1., 1997, Iттиηο1οд^са1 Веу1е\\ъ. 157, 177).
Как альтернатива, вектор, экспрессирующий описанный здесь полипептид, может быть введен в антиген-презентирующие клетки, взятые от пациента, и клонально воспроизведены ех νίνο для последующей обратной трансплантации тому же самому пациенту. Трансфицированные клетки могут быть реинтродуцированы пациенту с использованием любых способов, известных в данной области техники, предпочтительно в стерильной форме путем внутривенного, внутриполостного, внутрибрюшинного или внутриопухолевого введения.
Пути и частота введения терапевтических композиций, описанных здесь, равно как и дозировки, будут варьироваться от субъекта к субъекту, и они могут быть легко определены с применением стандартных методов. В целом, фармацевтические композиции и вакцины могут быть введены путем инъекции (например, внутрикожной, внутримышечной, внутривенной или подкожной), внутринозально (например, путем вдыхания) или перорально. Предпочтительно от 1 до 10 доз могут быть введены за 52-недельный период. Предпочтительно вводят 6 доз с месячным интервалом, и после этого возможны периодические бустерные вакцинации. Для отдельных пациентов могут быть применены альтернативные протоколы. Подходящей дозой является такое количество соединения, чтобы оно, будучи введено в соответствии с описанным здесь, было способно вызывать противоопухолевый иммунный ответ, который на 1050% превышает фоновый уровень (т.е. без введения). Такой ответ можно проконтролировать путем измерения титра противоопухолевых антител у больного или установления определяемого вакцинами образования цитолитических эффекторных клеток, способных уничтожать опухолевые клетки пациента ίη νίίτο. Такие вакцины также должны быть способны обусловливать иммунный ответ, который ведет к улучшенному клиническому результату (например, к большей частоте ремиссий, полному или частичному, или пролонгированному выживанию без болезни) у вакцинированных пациентов по сравнению с невакцинированными пациентами. В целом, в случае фармацевтических композиций и вакцин, содержащих один или большее число полипептидов, количество каждого полипептида находится в диапазоне доз от примерно 25 мкг до 5 мг на 1 кг массы тела реципиента. Подходящие величины доз будут варьироваться в зависимости от размера тела пациента, но обычно будут находиться в диапазоне от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл.
В целом, соответствующие дозировки и режимы введения предоставляют активный(ые) компонент(ы) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического и/или профилактического преимущества. Такой ответ можно проконтролировать по получению лучшего клинического результата (например, большей частоты ремиссий, полного или частичного, или пролонгированного выживания без болезни) у пациентов, в отношении которых указанное лечение проводится, по сравнению с пациентами без лечения. Превышение уже существующих иммунных ответов на белок легочной опухоли, обычно, коррелирует с улучшенным клиническим результатом. Такие иммунные ответы обычно могут быть оценены с использованием стандартных анализов на пролиферацию, цитотоксичность или цитокины, которые могут быть осуществлены с использованием образцов, взятых от пациента до и после лечения.
Способы диагностики рака
В целом, раковое заболевание может быть выявлено у пациента на основе присутствия одного или большего числа белков легочной опухоли и/или полинуклеотидов, кодирующих такие белки, в биологическом образце (например, кровь, сыворотка, мокроты, моча и/или биопсии опухоли), взятом от пациента. Другими словами, такие белки могут быть использованы в качестве маркеров для выявления наличия или отсутствия рака, такого как рак легкого. Кроме того, такие белки могут быть использованы для выявления других форм рака. Предусматриваемые здесь связывающие агенты, в целом, позволяют определять в биологическом образце уровень антигена, который связывается с таким агентом. Полинуклеотидные праймеры и зонды могут быть использованы для определения уровня мРНК, кодирующей опухолевый белок, что также является индикатором наличия или отсутствия рака. В целом, последовательность легочной опухоли должна присутствовать на уровне, который по крайней мере втрое выше в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью.
Существует ряд тест-форматов, известных специалистам в данной области техники, предназначенных для использования связывающего агента для выявления полипептидных маркеров в образце: см., например, Нат1оте & Ьапе, 1988, АпйЬоФек: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1й 8рппд
НатЬот ЬаЬота1огу. В целом, наличие или отсутствие рака у пациента может быть определено путем: (а) контактирования биологического образца, взятого от пациента, со связывающим агентом; (Ь) определения в образце уровня полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (с) сравнения уровня полипептида с заранее определенной величиной отсечки.
В предпочтительном варианте тест включает использование связывающего агента, иммобилизованного на твердую подложку, для связывания с полипептидом и отделения его от остального образца. Затем связанный полипептид может быть выявлен с использованием детекционного реагента, который включает репортерную группу и специфически связывается с комплексом связывающего агента с полипептидом. Такие детекционные реагенты могут включать, например, связывающий агент, который специфически связывается с полипептидом или антителом, или с другим агентом, который специфически связывается со связывающим агентом, таким как антииммуноглобулин, белок6, белок-А или лектин. Как альтернатива, может быть использован конкурентный тест, в котором полипептид помечен репортерной группой и обеспечивают связывание иммобилизованного связывающего агента после инкубации связывающего агента с образцом. Та степень, с которой компоненты образца подавляют связывание меченного полипептида со связывающим агентом, служит индикатором реактивности образца с иммобилизованным связывающим агентом. Подходящими для использования в таких анализах полипептидами являются полноразмерные белки легочной опухоли и их сегменты, с которыми связывается связывающий агент в соответствии с описанным выше.
Твердой подложкой может быть любой материал, известный специалистам в данной области техники, к которому можно присоединить опухолевый белок. Например, твердой подложкой может быть тест-лунка микротитровального планшета или нитроцеллюлозная или иная подходящая мембрана. Как альтернатива, подложкой может быть шарик или диск, например, из стекла, фибергласса, латекса или пластмассы, такой как полистирен или поливинилхлорид. Подложкой также может быть намагниченная частица или оптиковолоконный датчик, такой, как, например, описанный в патенте США № 5359681. Связывающий агент может быть иммобилизован на твердую подложку с использованием различных методов, известных специалистам в данной области техники, которые подробно описаны в патентной и научной литературе. В контексте настоящего изобретения термин «иммобилизация» указывает и на нековалентную связь, такую как адсорбция, и на ковалентное связывание (которое может быть прямой связью между антигеном и функцио нальными группами на подложке или может быть связью через перекрестно-сшивающий агент). Связывание с помощью адсорбции на лунке микротитровального планшета или на мембране является предпочтительным. В таких случаях адсорбция может быть осуществлена путем контактирования связывающего агента в подходящем буфере с твердой подложкой в течение подходящего периода времени. Время контакта зависит от температуры, но обычно составляет примерно от 1 ч до 1 дня. В целом, контакт лунки пластмассового микротитровального планшета (такого как планшет из полистирена или поливинилхлорида) с количеством связывающего агента, варьирующимся в пределах от примерно 10 нг до примерно 10 мкг и предпочтительно составляющим от примерно 100 нг до примерно 1 мкг, достаточен для связывания адекватного количества связывающего агента.
Ковалентное присоединение связывающего агента к твердой подложке, в целом, может быть осуществлено сначала путем взаимодействия подложки с бифункциональным реагентом, который будет взаимодействовать и с подложкой, и с функциональной группой, такой как гидроксильная или аминогруппа, в составе связывающего агента. Например, связывающий агент может быть ковалентно соединен с подложками, имеющими подходящее полимерное покрытие с бензохиноном, или путем конденсации альдегидной группы на подложке с амином и активным водородом связывающего агента (см., например, Р1егсе 1ттипо!есйпо1о§у Са!а1од апд НапдЬоок, 1991, А12-А13).
В некоторых вариантах анализом является «сэндвич-тест» с двумя антителами. Данный анализ может быть осуществлен сначала путем контактирования антитела, которое было иммобилизовано на твердую подложку - обычно лунку микротитровального планшета, - с образцом таким образом, что полипептидам в образце обеспечивается связывание с иммобилизованным антителом. Несвязанный образец затем отделяют от иммобилизованных комплексов полипептида и антитела, и добавляют детекционный реагент (предпочтительно второе антитело, способное связываться с отличающимся сайтом полипептида), включающий репортерную группу. Количество детекционного реагента, которое остается связанным с твердой подложкой, затем определяют с использованием метода, соответствующего конкретной репортерной группе.
Более конкретно, после того как антитело иммобилизовано на подложку в соответствии с описанным выше, остающиеся белковые сайты связывания на подложке обычно блокируют. Можно использовать любой подходящий блокирующий агент, известный специалистам в данной области техники, такой как бычий сывороточный альбумин или Твин-20™ (81дта Сйетка1 Со., 8!.Ьош5, МО). Затем иммобилизо ванное антитело инкубируют с образцом, и полипептид может связываться с антителом. Перед инкубацией образец может быть разбавлен подходящим разбавителем, таким как фосфатносолевой буфер (ФСБ). В целом, подходящей продолжительностью контакта (т.е. временем инкубации) является такой период времени, которого достаточно для выявления присутствия полипептида в образце, взятом от пациента с диагнозом рака легкого. Предпочтительно продолжительность контакта достаточна для достижения уровня связывания, который составляет по крайней мере 95% от уровня, достигаемого в состоянии равновесия между связанным и несвязанным полипептидом. Для специалиста в данной области техники будет понятно, что время, необходимое для достижения равновесия, может быть легко определено с помощью анализа уровня связывания, которое происходит за некий период времени. В принципе достаточное при комнатной температуре время инкубации составляет примерно 30 мин.
Несвязанный образец может быть затем удален путем промывки твердой подложки подходящим буфером, таким как ФСБ, содержащий 0,1% Твин-20™. Второе антитело, которое включает репортерную группу, после этого может быть добавлено к твердой подложке. Предпочтительными репортерными группами являются группы, перечисленные выше.
После этого детекционный реагент инкубируют с иммобилизованным комплексом «антитело-полипептид» в течение времени, достаточного для выявления связанного полипептида. Подходящее количество времени обычно можно определить путем анализа уровня связывания, которое имеет место за определенный отрезок времени. Затем несвязанный детекционный реагент удаляют, а связанный детекционный реагент выявляют с использованием репортерной группы. Метод, используемый для выявления репортерной группы, зависит от природы репортерной группы. Для радиоактивных групп обычно подходящими являются подсчет сцинтилляций или авторадиографические методы. Методы спектроскопии могут быть использованы для выявления красителей, люминесцентных групп и флуоресцентных групп. Биотин можно выявить с помощью авидина, соединенного с иной репортерной группой (обычно радиоактивной или флуоресцентной группой или с ферментом). Обычно ферментные репортерные группы можно выявить путем добавления субстрата (обычно на определенное время) с последующим спектроскопическим или иным анализом продуктов реакции.
Для установления наличия или отсутствия рака, такого как рак легкого, сигнал, выявленный от репортерной группы, которая остается связанной с твердой подложкой, обычно сравнивают с сигналом, который соответствует заданному значению отсечки. В предпочтитель ном варианте значение отсечки для выявления рака представляет собой средний сигнал, полученный в случае, когда иммобилизованное антитело инкубируют с образцами, взятыми от пациентов без рака. В целом, образец, дающий сигнал, который превышает заданную величину отсечки на три сигмы, рассматривается как положительный по наличию рака. В альтернативном предпочтительном варианте величину отсечки определяют с использованием операционной калибровочной кривой, полученной в соответствии с методом 8аске11 с1 а1., С11шса1 Ер1беш1о1оду: А Ваис 8с1епсе Гог С11шса1 Меб1сше, Ьйбе Вго\уп & Со., 1985, рр. 106-107. Вкратце, в данном варианте величина отсечки может быть определена из графика пар истинно положительных значений (т.е. чувствительности) и ложно-положительных значений (100% специфичности), которые соответствуют каждой возможной величине отсечки по результатам диагностического анализа. Та величина отсечки, которая на графике расположена наиболее близко к его левому верхнему углу (т.е. величина, которая охватывает наибольшую площадь), представляет собой наиболее точную величину отсечки, и образец, дающий сигнал, который выше величины отсечки, определенной с помощью указанного метода, может рассматриваться как положительный. Как альтернатива, величина отсечки может быть сдвинута на графике влево с целью минимизации ложноположительных оценок или же вправо с целью минимизации ложно-отрицательных оценок. В целом, образец, дающий сигнал, который превышает величину отсечки, определенной с помощью данного метода, рассматривается как положительный по наличию рака.
В близком варианте тест проводят в формате проточного теста или теста на полосках носителя, в которых связывающий агент иммобилизуют на мембрану, такую как нитроцеллюлозная мембрана. В проточном тесте полипептиды в образце связываются с иммобилизованным связывающим агентом по мере прохождения образца через мембрану. Затем второй меченный связывающий агент связывается комплексом «связывающий агент-полипептид» по мере того, как раствор, содержащий второй связывающий агент, проходит через мембрану. Выявление связанного второго связывающего агента можно затем провести в соответствии с описанным выше. В формате «теста на полосках» один конец мембраны, на которой связан связывающий агент, погружают в раствор, содержащий образец. Образец движется вдоль мембраны через участок, содержащий второй связывающий агент, и через область с иммобилизованным связывающим агентом. Концентрирование второго связывающего агента в области иммобилизованного антитела указывает на наличие рака. Обычно концентрирование второго связывающего агента в данном месте формиру ет параметр, например, линию, который легко можно определить визуально. Отсутствие такого параметра указывает на отрицательный результат. В целом, количество связывающего агента, иммобилизованного на мембране, выбирают так, чтобы сформировать визуально различимый параметр тогда, когда биологический образец содержит уровень полипептида, который должен быть достаточен для генерирования положительного сигнала в «сэндвич-тесте» с двумя антителами в обсуждавшемся выше формате. Предпочтительными связывающими агентами для использования в таких тестах являются антитела и их антиген-связывающие фрагменты. Предпочтительно количество антитела, иммобилизованного на мембране, варьируется от примерно 25 нг до примерно 1 мкг, а более предпочтительно - от примерно 50 нг до примерно 500 нг. Такие тесты обычно могут быть проведены при очень небольшом количестве биологического образца.
Понятно, что существуют многочисленные другие прописи тестов, которые пригодны для использования в отношении опухолевых белков или связывающих агентов по настоящему изобретению. Приведенные выше описания призваны служить исключительно примерами. Например, специалисту в данной области техники должно быть понятно, что указанные выше прописи легко могут быть модифицированы для использования полипептидов легочной опухоли для выявления антител, которые связываются с такими полипептидами в биологическом образце. Выявление таких антител, специфичных в отношении белка легочной опухоли, может коррелировать с наличием рака.
Также, или как альтернатива, рак может быть выявлен на основе присутствия в биологическом образце Т-лимфоцитов, которые специфическим образом взаимодействуют с белком легочной опухоли. В некоторых методах биологический образец, содержащий СП4-позитивные и/или СО8-позитивные Т-клетки, выделенные от больного, инкубируют с полипептидом легочной опухоли, полинуклеотидом, кодирующим такой полипептид, и/или АПК, которые экспрессируют по крайней мере иммуногенный сегмент такого полипептида, с выявлением присутствия или отсутствия специфической активации Т-клеток. Подходящими биологическими образцами являются, тем самым не ограничиваясь, изолированные Т-клетки. Например, Тклетки могут быть выделены у больного с помощью стандартных методов (таких как центрифугирование в градиенте плотности Είсо11/Нурас.|ие лимфоцитов периферической крови). Т-клетки могут быть проинкубированы ίη νίίΐΌ в течение 2-9 дней (обычно 4 дней) при 37°С с полипептидом (например, 5-25 мкг/мл). Желательной может быть инкубация другой аликвоты Т-клеточного образца при отсутствии полипептида легочной опухоли, что будет слу жить контролем. Для Т-клеток СБ4' активацию предпочтительно выявляют, оценивая пролиферацию Т-клеток. В случае Т-клеток СБ8' активацию предпочтительно выявляют путем оценки цитолитической активности. Степень пролиферации, которая по крайней мере вдвое выше, и/или уровень цитолитической активности, который по крайней мере на 20% выше, чем у здоровых субъектов, указывают на наличие рака у больного.
Как отмечалось выше, рак также, или как альтернатива, может быть выявлен на основе уровня кодирующей белок легочной опухоли мРНК в биологическом образце. Например, по крайней мере два олигонуклеотидных праймера могут быть использованы в основанном на полимеразной цепной реакции (ПЦР) тесте для амплификации части кДНК легочной опухоли, происходящей от биологического образца, в котором по крайней мере один из олигонуклеотидных праймеров специфичен (т.е. гибридизуется с) по отношению к полинуклеотиду, кодирующему белок легочной опухоли. Затем амплифицированную кДНК разделяют и детектируют с использованием методов, хорошо известных в данной области техники, таких как гель-электрофорез. Сходным образом, олигонуклеотидные зонды, которые специфически гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли, могут быть использованы в тесте на гибридизацию для выявления в биологическом образце присутствия полинуклеотида, кодирующего опухолевый белок.
Для обеспечения гибридизации в условиях теста олигонуклеотидные праймеры и зонды должны включать олигонуклеотидную последовательность, которая характеризуется по крайней мере примерно 60%-ной, предпочтительно по крайней мере примерно 75%-ной и более предпочтительно по крайней мере примерно 90%-ной идентичностью по отношению к участку полинуклеотида, кодирующего белок легочной опухоли, длина которого составляет по крайней мере 10 нуклеотидов и предпочтительно по крайней мере 20 нуклеотидов. Предпочтительно олигонуклеотидные праймеры и/или зонды будут гибридизоваться с полинуклеотидом, кодирующим заявленный здесь полипептид, при условиях средней жесткости, что было определено выше. Олигонуклеотидные праймеры и/или зонды, которые могут быть эффективно использованы в способах диагностики, описанных в данном тексте, имеют длину предпочтительно по крайней мере 10-40 нуклеотидов. В предпочтительном варианте олигонуклеотидные праймеры включают по крайней мере 10 расположенных подряд нуклеотидов, более предпочтительно по крайней мере 15 расположенных подряд нуклеотидов из молекулы ДНК, последовательность которой приведена в БЕЦ ΙΌ N0 1-109, 111, 113, 115-151, 153, 154, 157, 158, 160,
162-164, 167, 168, 171, 173, 175, 177-224, 255337, 345, 347 и 349. Методики и для анализов на основе ПЦР, и гибридизационных анализов хорошо известны в данной области техники (см., например, МиШ§ е1 а1., 1987, Со1б Брппд НагЬог Бутр. ОиапТ Вю1., 51, 263; ЕгНсН (еб.), 1989, РСК ТесЬпо1о§у, БЮскЮп Рге§8, ИУ).
В одном из предпочтительных тестов используют ПЦР с ревертированием, где ПЦР применяют в сочетании с обратной транскрипцией. Обычно РНК экстрагируют из биологического образца, такого как биопсийная проба ткани, и подвергают обратной транскрипции с получением молекул кДНК. ПЦР-амплификация с использованием по крайней мере одного специфичного праймера дает молекулу кДНК, которую можно отделить и визуализовать с использованием, например, гель-электрофореза. Амплификацию можно осуществить на материале биологических образцов, взятых от обследуемого пациента и от субъекта, у которого нет ракового заболевания. Реакцию амплификации можно провести в серии разведений кДНК в масштабе двух порядков. Двукратное или более значительное усиление экспрессии в ряду разведений анализируемого образца от обследуемого пациента по сравнению с такими же разведениями от неракового образца обычно рассматривается как положительный результат.
В другом варианте заявленные композиции могут быть использованы в качестве маркеров развития рака. В данном варианте тесты в соответствии с описанным выше для диагностики рака могут быть проведены в течение некоторого времени с оценкой изменения уровня реактивных полипептида(ов) или полинуклеотида. Например, тесты можно проводить каждые 2472 часа в течение периода от 6 месяцев до 1 года и дольше, если это необходимо. В целом, рак считается прогрессирующим у тех пациентов, у которых выявленный уровень полипептида или полинуклеотида возрастает со временем. Напротив, рак не является прогрессирующим, если уровень реактивного полипептида или полинуклеотида либо остается постоянным, либо со временем снижается.
Некоторые диагностические тесты ίη у1уо могут быть проведены непосредственно на опухоли. Один такой тест включает контактирование клеток опухоли со связывающим агентом. Связанный связывающий агент затем можно выявить напрямую или косвенно через репортерную группу. Также такие связывающие агенты можно использовать в гистологическом анализе. Как альтернатива, полинуклеотидные зонды могут быть использованы для аналогичного применения.
Как отмечалось выше, для повышения чувствительности в данном образце можно протестировать множественные белки-маркеры легочной опухоли. Должно быть понятно, что связывающие агенты, специфичные для разных бел ков, описываемых в данном тексте, могут быть объединены в общем тесте. Кроме того, множественные праймеры или зонды могут быть использованы одновременно. Отбор опухолевых белковых маркеров может быть основан на стандартных экспериментах с целью определения сочетаний, которые обеспечивают оптимальную чувствительность. Кроме того, или в качестве альтернативы, тесты на опухолевые белки, описываемые здесь, могут быть объединены с тестами на другие известные опухолевые антигены.
Диагностические наборы
Далее настоящее изобретение представляет наборы для использования в любых описанных выше способах диагностики. Обычно такие наборы содержат два или большее число компонентов, необходимых для проведения диагностического теста. Компонентами могут быть соединения, реагенты, емкости и/или оборудование. Например, в одной емкости в составе набора может находиться моно-клональное антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с белком легочной опухоли. Такие антитела или фрагменты могут быть представлены присоединенными к твердой подложке в соответствии с описанным выше. Одна или несколько дополнительных емкостей могут содержать такие компоненты, как реагенты или буферы, с целью их использования в тесте. Также, или в качестве альтернативы, указанные наборы могут содержать детекционный реагент, описанный выше, который включает репортерную группу, подходящую для прямого или опосредованного выявления связывания антитела.
Как альтернатива, набор может быть сформирован так, чтобы выявлять уровень мРНК, кодирующей белок легочной опухоли в биологическом образце. Обычно такие наборы содержат по крайней мере один олигонуклеотидный зонд или праймер, описанные выше, которые гибридизуются с полинуклеотидом, кодирующим белок легочной опухоли. Такой олигонуклеотид можно использовать, например, в ПЦР или гибридизационном тесте. Дополнительными компонентами, которые могут находиться в составе таких наборов, являются второй олигонуклеотид и/или диагностический реагент или емкость для облегчения выявления полинуклеотида, кодирующего белок легочной опухоли.
Нижеследующие примеры подобраны в качестве иллюстративных и не являются в чемлибо ограничивающими.
Пример 1. Выделение и характеристика последовательностей кДНК, кодирующих полипептиды легочной опухоли.
Данный пример иллюстрирует выделение молекул кДНК, кодирующих специфичные для легочной опухоли полипептиды, на материале библиотек кДНК легочной опухоли.
А. Выделение последовательностей кДНК из библиотеки плоскоклеточной карциномы легких
Экспрессионную библиотеку кДНК плоскоклеточной легочной карциномы человека конструировали на материале полиаденилированных РНК из объединенных тканей двух больных с использованием плазмидной системы 8ирег5спр1 для синтеза кДНК и набора для плазмидного клонирования (ВКЕ Ьйе Тес11по1оЩС5. ОаййегаЬигд, ΜΌ) в соответствии с прописью изготовителя. В частности, ткани легочной карциномы гомогенизировали на политроне (Кшетайса, Швейцария), а тотальную РНК экстрагировали с использованием Тпхо1 (ВДЬ Ь1£е Тес1то1още5) в соответствии с указанным производителем. Затем (ПОЛИ-А+)-РНК очищали с использованием колонки из олиго-дТ-целлюлозы в соответствии с описанным у 8ашЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬота!оту Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬота!от1е8, Со1б 8рпп§ НагЬог, КУ. Первую цепь кДНК синтезировали с использованием праймера №И/01що-бТ18. Двухцепочечную кДНК синтезировали, лигировали с адаптерами ΒδίΧΙ/ЕсоШ (ЗпуЦгодеп, 8ап О|едо, СА) и расщепляли с помощью рестриктазы МоД. После фракционирования по размеру с помощью колонок для фракционирования кДНК по размеру (ВКЬ Ьйе Тес11по1още5) кДНК лигировали по ВйХЕНои-сайту в состав рсОНА3.1 (Зпуйгодеп), и полученным с помощью электропорации трансформировали клетки Е1ес!тоМах Е.со11 ΌΗ10Β (ВКЬ Ь1£е Тес11по1още5).
С использованием той же процедуры экспрессионную библиотеку кДНК нормальных легких человека формировали на материале тканей четырех объединенных образцов. Библиотеки кДНК характеризовали по числу независимых колоний, проценту клонов, несущих вставки, среднему размеру вставки и с помощью секвенационного анализа. Библиотека плоскоклеточной карциномы легких включала 2,7х106 независимых клонов при том, что 100% клонов включали вставку при среднем размере вставки 2100 пар нуклеотидов. Библиотека кДНК нормальных легких включала 1,4х106 независимых клонов, 90% клонов имели вставки, а средний размер вставки составил 1800 пар нуклеотидов. Секвенационный анализ обеих библиотек показал, что большинство клонов включают полноразмерную последовательность кДНК, и были синтезированы на матрице мРНК.
«Субтракция» («сокращение») библиотеки кДНК была осуществлена с использованием описанных выше библиотек кДНК плоскоклеточной карциномы легких и нормальных легких в соответствии с описанным у Нага е! а1. (В1ооб, 84, 189-199, 1994) с некоторыми модификациями. В частности, «субтракционная» библиотека кДНК, специфичная для плоскоклеточной карциномы легких, была сформирована следующим образом. Библиотеку кДНК нормальной ткани (80 мкг) расщепляли рестриктазами ВатН1 и Х1ю1 с последующим заполнением концов с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. После экстракции фенолом-хлороформом и этанольной преципитации ДНК растворяли в 133 мкл воды, денатурировали нагреванием и смешивали с 133 мкл (133 мкг) биотина РНо1оргоЬе (УесЮг ЬаЬога1ог1е8, Вигбидате, СА). В соответствии с рекомендациями изготовителя, полученную смесь облучали ультрафиолетовой лампой 270 А на льду в течение 20 минут. Дополнительно биотин Р1ю1оргоЬе (67 мкл) добавляли с повторением реакции биотинилирования. После пятикратной бутанольной экстракции ДНК преципи-тировали этанолом и растворяли в 23 мкл воды с получением драйверной («сокращающей») ДНК.
Для получения трейсерной («ведомой») ДНК 10 мкг библиотеки кДНК плоскоклеточной карциномы легких расщепляли рестриктазами №И и 8ре1, экстрагировали фенолом-хлороформом и пропускали через колонку для центрифугирования Сбгота δρίπ-400 (С1ойесб, Ра1о Або, СА). Обычно после рассева колонки выделяли 5 мкг кДНК. После преципитации этанолом трейсерную ДНК растворяли в 5 мкл воды. Трейсерную ДНК смешивали с 15 мкл драйверной ДНК и 20 мкл 2х гибридизационного буфера (1,5 М №С1, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ НЕРЕ8 рН=7,5, 0 ,2% додецилсульфата натрия), покрывали минеральным маслом и полностью денатурировали нагреванием. Незамедлительно образец переносили на водяную баню при 68°С и инкубировали в течение 20 ч («длинная гибридизация» [ДГ]). Затем реакционную смесь обрабатывали стрептавидином с последующей экстракцией фенолом-хлороформом. Данный процесс повторяли еще трижды. «Субтракционную» ДНК преципитировали, растворяли в 12 мкл воды, смешивали с 8 мкл драйверной ДНК и 20 мкл 2х гибридизационного буфера и гибридизовали при 68°С в течение 2 ч («короткая гибридизация» [КГ]). После удаления биотинилированной двухцепочечной ДНК «субтракционную» ДНК лигировали по №11/8ре1-сайту плазмиды рВС8К+ с признаком резистентности к хлорамфениколу (81га1адеие, Ьа 1о11а, СА), и полученным с помощью электропорации трансформировали клетки Е1ес1гоМах Е.соб ЭН10В с получением «субтракционной» библиотеки кДНК, специфичной для плоскоклеточной легочной карциномы (здесь и далее обозначена как «легочная субтракция I»).
Вторая «субтракционная» библиотека кДНК, специфичная для плоскоклеточной легочной карциномы (обозначена как «легочная субтракция II»), была сформирована так же, как и как «легочная субтракционная библиотека I», за исключением того, что в состав драйверной ДНК были включены восемь часто выделяемых генов из состава «легочной субтракции I», после чего выделили 24000 независимых клонов.
Для анализа «субтракционных» библиотек кДНК плазмидную ДНК приготавливали на материале 320 независимых клонов, случайным образом отобранных из «субтракционных» библиотек, специфичных для плоскоклеточной легочной карциномы. Далее репрезентативные клоны кДНК охарактеризовывали с помощью секвенирования ДНК с применением автоматического секвенатора модели 373А и/или модели 377 от Регкш Е1тег/Аррбеб Вюкуйетк П1у181ои (Ройег Сбу, СА). Последовательности кДНК для шестидесяти изолированных клонов представлены в 8ЕО ГО N0 1-60. Указанные последовательности сравнивали с известными последовательностями банков генов с использованием баз данных ЕМВЬ и СеиВаик (выпуск 96). Не было обнаружено существенной гомологии с последовательностями, показанными в 8ЕО ГО N0 2, 3, 19, 38 и 46. Было установлено, что последовательности АГ) ГО N0 1, 6-8, 10-13, 15, 17, 18, 20-27, 29, 30, 32, 34-37, 39-45, 47-49, 51, 52, 54, 55 и 57-59 проявляли некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными экспрессируемыми маркерными последовательностями (Е8Т-маркерами). Было показано, что последовательности 8Е0 ГО N0 9, 28, 31 и 33 проявляли некоторую степень гомологии с ранее идентифицированными генными последовательностями, не относящимися к человеку, а последовательности 8Е0 ГО N0 4, 5, 14, 50, 53, 56 и 60 показали некоторый уровень гомологии с генными последовательностями, ранее идентифицированными у человека.
Описанную выше процедуру «субтракции» повторяли с использованием описанной выше библиотеки кДНК плоскоклеточной легочной карциномы в качестве трейсерной ДНК, а в качестве драйверной ДНК использовали описанную выше библиотеку кДНК нормальной легочной ткани и библиотеку кДНК нормальных печени и сердца (сконструированы на материале пула одного образца каждой ткани в соответствии с описанным выше) плюс двадцать разных клонов кДНК, которые часто выделяют из «легочных субтракций I и II» («легочная субтракция III»). Библиотека кДНК нормальных печени и сердца включала 1,76х106 независимых колоний при том, что 100% клонов имели вставки, а средний размер вставки составил 1600 пар нуклеотидов. Выделили десять дополнительных клонов (8Е0 ГО N0 61-70). Сравнение указанных последовательностей кДНК с последовательностями из генного банка в соответствии с описанным выше показало отсутствие существенной гомологии с последовательностями, представленными в 8Е0 ГО N0 62 и 67. Было установлено, что последовательности 8Е0 ГО N0 61, 63-66, 68 и 69 проявили некоторый уровень гомологии с ранее изолированными Е8Тмаркерами, а последовательность 8Е0 ГО N0 70, как было показано, проявила некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированным геном крысы.
В дальнейших исследованиях процедуру «субтракции», описанную выше, повторяли с использованием описанной выше библиотеки кДНК плоскоклеточной легочной карциномы в качестве трейсерной ДНК, а в качестве драйверной ДНК использовали библиотеку ДНК пула, сформированного объединением тканей нормальных легких, почек, толстой кишки, поджелудочной железы, головного мозга, покоящихся РВМС, сердца, кожи и пищевода, причем ДНК пищевода составляла до 1/3 от всего драйверного материала. Поскольку пищевод обогащен нормальными эпителиальными клетками, включая дифференцированные клетки плоского эпителия, то указанная процедура, по-видимому, приведет к обогащению генами, которые специфичны для опухоли, а не специфичны для других тканей. Последовательности кДНК из 48 клонов, определенных в результате указанной «субтракции», представлены в БЕР ГО N0 177224. Последовательности БЕР ГО N0 177, 178, 180, 181, 183, 187, 192, 195-197, 208, 211, 212, 215, 216, 218 и 219 показали некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными генами. Последовательности БЕР ГО N0 179, 182, 184-186, 188-191, 193, 194, 198-207, 209, 210, 213, 214, 217, 220 и 224 показали некоторый уровень гомологии с ранее определенными ЕБТмаркерами. Последовательности БЕР ГО N0 221-223 не проявили гомологии ни с одной из ранее установленных последовательностей.
В. Выделение последовательностей кДНК из библиотеки аденокарциномы легкого.
Экспрессионную библиотеку кДНК легочной аденокарциномы человека конструировали в соответствии с описанным выше. Библиотека содержала 3,2х106 независимых колоний, 100% клонов включали вставки, а средний размер вставки составил 1500 пар нуклеотидов. Субтракцию библиотеки осуществляли в соответствии с описанным выше, используя описанные выше экспрессионные библиотеки кДНК нормальных легких и нормальных печени и сердца в качестве драйверной ДНК. Было выделено 2600 независимых клонов.
Исходный анализ последовательностей кДНК по 100 независимым клонам показал присутствие большого числа генов рибосомных белков. Последовательности кДНК для пятнадцати клонов, выделенные в ходе указанной субтракции, показаны в БЕР ГО N0 71-86. Сравнение этих последовательностей с последовательностями банка генов в соответствии с описанным выше показало отсутствие существенного уровня гомологии с последовательностью БЕР ГО N0 84. Было установлено, что последовательности БЕР ГО N0 71, 73, 74, 77, 78 и 80-82 проявляли некоторый уровень гомологии с ранее выделенными ЕБТ-маркерами, а последовательности БЕр ГО N0 72, 75, 76, 79, 83 и 85 проявили некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными генами человека.
В ходе дальнейшего анализа библиотека кДНК (обозначенная как те!к3616А) была сконструирована на материале метастазирующей аденокарциномы легкого. Установленные последовательности кДНК для 25 клонов, случайным образом выбранных для секвенирования из данной библиотеки, приведены в БЕР ГО N0 255-279. Библиотеку кДНК те!к3616А подвергали субтракции библиотекой кДНК, полученной объединением тканей нормальных легких, печени, поджелудочной железы, кожи, почек, головного мозга и покоящихся РВМС. Для повышения специфичности субтракции драйверную библиотеку снабжали генами, которые были определены как наиболее представленные в библиотеке кДНК те!к3616А, такими как гены фактора элонгации ЕЕ 1α. β-интегрина и антикоагулянтного белка РР4, а также такими кДНК, для которых ранее была установлена дифференцированная экспрессия в подвергнутых субтракции библиотеках кДНК легочной аденокарциномы. Установленные последовательности кДНК для 51 клона, выделенного из субтракционной библиотеки (обозначенной как те!к 3616А-Б1), показаны в БЕр ГО N0 280-330.
Сравнение последовательностей БЕр ГО N0 255-330 с последовательностями из открытых баз данных показало отсутствие существенной гомологии для последовательностей БЕр ГО N0 255-258, 260, 262-264, 270, 272, 275, 276, 279, 281, 287, 291, 296, 300 и 310. Последовательности БЕР ГО N0 259, 261, 265-269, 271, 273, 274, 277, 278, 282-285, 288-290, 292, 294, 297-299, 301, 303-309, 313, 314, 316, 320-324 и 326-330 показали некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными генными последовательностями, в то время как последовательности БЕР ГО N0 280, 286, 293, 302, 310, 312, 315, 317-319 и 325 показали некоторый уровень гомологии с ранее выделенными экспрессированными последовательностями-метками (ЕБТмаркерами).
Пример 2. Определение тканевой специфичности полипептидов легочной опухоли.
С использованием ген-специфичных праймеров уровни экспрессии мРНК для семи репрезентативных полипептидов легочной опухоли, описанных в примере 1, были проанализированы в различных нормальных и опухолевых тканях с помощью метода ПЦР с ревертированием.
Вкратце, тотальную РНК экстрагировали из различных нормальных и опухолевых тканей с использованием реагента ТпхоБ как это было описано выше. Синтез первой цепи проводили с 2 мкг общей РНК с помощью обратной транскриптазы Бирегкспр! II (ВВЬ ЫЕе ТесНпо1од1ек) при 42°С в течение одного часа. Затем кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с генспецифичными праймерами. Для обеспечения полуколичественной природы ПЦР с ревертированием β-актин использовали в качестве внутреннего контроля для каждой из исследованных тканей. По 1 мкл кДНК в разведении 1:30 использовали для достижения линейного режима амплификации матрицы β-актина: такого количества было достаточно для отражения различий в исходном числе копий. С использованием указанных условий уровни β-актина были определены для каждой реакции обратной транскрипции в каждой ткани. Загрязнение ДНК сводили к минимуму обработкой ДНКазой и по получению отрицательного результата при ПЦР с использованием первой цепи кДНК, полученной без добавления обратной транскриптазы.
Уровни экспрессии мРНК анализировали в пяти различных типах опухолевой ткани (легочная плоскоклеточная карцинома от 3 пациентов, легочная аденокарцинома, опухоль толстой кишки от 2 пациентов, опухоль молочной железы и опухоль предстательной железы) и в 13 разных нормальных тканях (легкие от 4 доноров, предстательная железа, головной мозг, почка, печень, яичник, скелетная мышца, кожа, тонкий кишечник, желудок, миокард, сетчатка и семенник). Как было установлено с использованием 10-кратного количества кДНК, антиген ЬЗТ-З1-90 (ЗЕО ΙΌ N0 3) экспрессировался на высоких уровнях в плоскоклеточной карциноме легких и опухоли молочной железы, а в остальных проанализированных тканях - на уровнях от низкого до невыявляемого.
Антиген ЬЗТ-З2-68 (ЗЕО ΙΌ N0 15), повидимому, специфичен для опухолей легкого и молочной железы, однако, экспрессия также была выявлена в нормальной почке. Антигены ЬЗТ-З1-169 (ЗЕО ΙΌ N0 6) и ЬЗТ-З1-133 (ЗЕО ΙΌ N0 5), по-видимому, исключительно многочисленны в легочных тканях (как нормальных, так и опухолевых), причем экспрессия этих двух генов снижена в большинстве протестированных нормальных тканей. Также и ЬЗТ-З1-169, и ЬЗТ-З1-133 экспрессированы в опухолях молочной железы и толстой кишки. Антигены ЬЗТ-З1-6 (ЗЕО ΙΌ N0 7) и ЬЗТ-З2-12-5Е (ЗЕО ΙΌ N0 47) не проявили опухолеспецифичной или тканеспецифичной экспрессии, при том, что экспрессия ЬЗТ-З1-28 редка и выявляется лишь в небольшом числе тканей. Антиген ЬЗТ-З3-7 (ЗЕО ΙΌ N0 63) показал экспрессию, специфичную для опухолей легкого и молочной железы, хотя его мРНК выявляется только в нормальных семенниках при применении ПЦР на протяжении 30 циклов. Экспрессия низкого уровня была выявлена в некоторых нормальных тканях, когда число циклов было увеличено до 35. Антиген ЕЗТ-З3-13 (ЗЕО ΙΌ N0 66) был обнаружен по экспрессии в 3 из 4 легочных опухолей, одной опухоли молочной железы и в обоих образцах опухоли толстой кишки. Его экспрессия в нормальных тканях была ниже, чем в опухолях, и была выявлена только в 1 из 4 образцов нормальных легких и в нормальных тканях почек, яичников и сетчатки глаза. Экспрессия антигенов ЬЗТ-З3-4 (ЗЕО ΙΌ N0 62) и ЬЗТ-З3-14 (ЗЕО ΙΌ N0 67) была редкой и не проявила какойлибо опухолевой или тканевой специфичности. Согласуясь с данными Нозерн-блоттинга, результаты ПЦР с ревертированием по антигену ЬАТ-З1-А-10А (ЗЕО ΙΌ N0 78) подтвердили, что его экспрессия интенсивна в тканях легких, толстой кишки, желудка и тонкого кишечника, включая опухоли легкого и толстой кишки, в то время как в других тканях его экспрессия была низкой или не выявлялась вовсе.
Всего 2002 фрагмента кДНК, выделенные из «легочных субтракций Ι, ΙΙ и ΙΙΙ», описанных выше, были амплифицированы методом ПЦР колоний, и уровни экспрессии их мРНК в опухоли легкого, нормальных легких и различных других нормальных и опухолевых тканях определяли с использованием микроматричной технологии (Зуп1еш, Ра1о Айо, СА). Вкратце, продукты ПЦР-амплификации наносили каплями на предметные стекла в формате размеченной матрицы, причем каждый продукт занимал на этой матрице конкретное положение. мРНК экстрагировали из тканевого образца, который предстояло проанализировать, подвергали обратной транскрипции и формировали флуоресцентно меченные кДНК-зонды. Микроматрицы зондировали меченными кДНК-зондами, предметные стекла сканировали и определяли уровни флуоресценции. Выявленная интенсивность коррелирует с интенсивностью гибридизации. Семнадцать неизбыточных клонов кДНК проявили сверхэкспрессию в плоскоклеточных легочных опухолях, хотя экспрессия в исследованных нормальных тканях (легкие, кожа, лимфатический узел, толстая кишка, печень, поджелудочная железа, молочная железа, сердце, костный мозг, толстый кишечник, почка, желудок, головной мозг, тонкий кишечник, мочевой пузырь и слюнная железа) либо не выявлялась, либо была в 10 раз меньше по сравнению с плоскоклеточными легочными опухолями. Установленные частичные последовательности кДНК для клона Ь513З представлена в ЗЕО ΙΌ N0 87 и 88; то же для клона Ь514З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 89 и 90; то же для клона Ь516З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 91 и 92; то же для клона Ь517З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 93; то же для клона Ь519З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 94; то же для клона Ь520З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 95 и 96; то же для клона Ь521З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 97 и 98; то же для клона Ь522З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 99; то же для клона Ь523З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 100; то же для клона Ь524З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 101; то же для клона Ь525З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 102; то же для клона Ь526З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 103; то же для клона Ь527З представлено в ЗЕО ΙΌ N0 104; то же для клона Ь528З пред ставлено в 8ЕО ΙΌ N0 105; то же для клона Б5298 представлено в 8Е0 ΙΌ N0 106; и то же для клона Б5308 представлено в 8Е0 ΙΌ N0 107 и 108. Кроме того, полноразмерная последовательность кДНК Б5308 показана в 8Е0 ΙΌ N0 151, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 152. Б5308 проявляет гомологию со сплайсинговым вариантом гомолога опу-хольсупрессорного гена р53 - р63. Последовательности кДНК 7 известных изоформ р63 представлены в 8Е0 ΙΌ N0 331-337, а соответствующие расшифрованные аминокислотные последовательности приведены в 8Е0 ΙΌ N0 338-344, соответственно.
Вследствие полиморфизма клон Б5318, повидимому, существует в двух формах. Первая установленная полноразмерная последовательность кДНК для Б5318 показана в 8Е0 ΙΌ N0 109, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 110. Вторая установленная полноразмерная последовательность кДНК для Б5318 показана в 8Е0 ΙΌ N0 111, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 112. Последовательность 8Е0 ΙΌ N0 111 идентична 8Е0 ΙΌ N0 109, за исключением того, что имеет 27нуклеотидную вставку. Сходным образом Б5148 также имеет две формы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга: первый вариант кДНК приведен в 8Е0 ΙΌ N0 153, соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ΙΌ N0 155. Второй вариант полноразмерной кДНК Б5148 приведен в 8Е0 ΙΌ N0 154, соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ΙΌ N0 156.
При клонировании полноразмерного клона Б5248 (8Е0 ΙΌ N0 101) выявили два варианта (8Е0 ΙΌ N0 163 и 164) при соответствующих расшифрованных аминокислотных последовательностях 8Е0 ΙΌ N0 165 и 166, соответственно. Было показано, что оба варианта кодируют пептид, родственный паратироидному гормону.
Попытки выделить полноразмерную кДНК для Б5198 привели к выделению удлиненной последовательности кДНК, показанной в 8Е0 ΙΌ N0 173, которая включает потенциальную открытую рамку считывания. Расшифрованная аминокислотная последовательность, кодируемая последовательностью 8Е0 ΙΌ N0 173, приведена в 8Е0 ΙΌ N0 174. Кроме того, полноразмерная последовательность кДНК для клона 8Е0 ΙΌ N0 100 (определен как Б5238), являющегося известным геном, представлена в 8Е0 ΙΌ N0 175, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 176. При дальнейших исследованиях полноразмерная последовательность кДНК для Б5238 была выделена из ^5238-пοзитивнοй опухолевой библиотеки кДНК с помощью ПЦР амплификации с использованием ген-специфичных праймеров, сконструированных по параметрам последовательности 8Е0 ΙΌ N0 175. Установленная последовательность кДНК приведена в 8Е0 ΙΌ N0 347. Аминокислотная последовательность, кодируемая указанной последовательностью, представлена в 8Е0 ΙΌ N0 348. Данная белковая последовательность отличается от ранее опубликованной белковой последовательности по двум аминокислотным положениям, а именно положениям остатков 158 и 410.
Сравнение последовательностей Б5148 и Б5318 (8ЕО ΙΌ N0 87 и 88, 89 и 90, и 109, соответственно) с таковыми из генного банка, как это было описано выше, показало отсутствие сколько-нибудь существенной гомологии с известными последовательностями. Было установлено, что последовательности Б5138, Б5168, Б5178, Б5198, Б5208 и Б5308 (8Ер ΙΌ N0 87 и 88, 91 и 92, 93, 94, 95 и 96, 107 и 108, соответственно) проявляют некоторый уровень гомологии с ранее идентифицированными Е8Тмаркерами. Показано, что последовательности Б5218, Б5228, Б5238, Б5248, Б5258, Б5268, Б5278, Б5288 и Б5298 (8ЕО ΙΌ N0 97 и 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 и 106, соответственно) представляют известные гены. Установленные полноразмерные последовательности кДНК для Б5208 представлены в 8Е0 ΙΌ N0 113, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 114. Последующий микроматричный анализ показал, что Б5208 сверхэкспрессирован в опухолях молочной железы в дополнение к плоскоклеточным опухолям легкого.
Дальнейший анализ показал, что Б5298 (8ЕО ΙΌ N0 106 и 115), Б5258 (8ЕО ΙΌ N0 102 и 120) и Б5278 (8Е0 ΙΌ N0 104) являются цитоскелетными компонентами и потенциально белками, специфичными для клеток плоского эпителия. Б5298 соответствует коннексину-26 белку закрытия пробелов. Он интенсивно экспрессирован в плоскоклеточной легочной опухоли 9688Т и сверхэкспрессирован в средней степени в двух других ее образцах. Однако экспрессия коннексина-26 на низком уровне также выявляется в нормальных коже, толстой кишке, печени и желудке. Была установлена сверхэкспрессия коннексина-26 в некоторых опухолях молочной железы, а мутантная форма Б5298 может приводить к сверхэкспрессии в легочных опухолях. Б5258 является плакофилином-1 белком десмосом, обнаруживаемым в кожных бляшконесущих межклеточных связках. Уровни экспрессии мРНК Б5258 значительно усилены в трех из четырех исследованных плоскоклеточных легочных опухолях и в нормальной коже. Б5278 определен как изоформа кератина-6, кератина ΙΙ типа 58-кД и цитокератина-13: он характеризуется сверхэкспрессией в плоскоклеточных опухолях и низкой экспрессией в нор мальных тканях кожи, молочной железы и толстой кишки. Следует заметить, что гены кератина и родственных белков часто регистрировались в качестве потенциальных маркеров легочной опухоли, включая ген СУЕКА2.1 (А.Райог е! а1., 1997, Еиг. Яеврп·. 1., 10, 603-609). Ь5138 (8ЕО ΙΌ ΝΟ 87 и 88) проявляет умеренную сверхэкспрессию в некоторых исследованных опухолевых тканях и кодирует белок, который был впервые выделен в качестве антигена обыкновенной пузырчатки.
Ь5208 (8ЕО ГО ΝΟ 95 и 96) и Ь5218 (8ЕО ГО ΝΟ 97 и 98) интенсивно экспрессированы в плоско клеточных легочных опухолях, причем Ь5208 позитивно регулируется в слюнных железах, а Ь5218 сверхэкспрессирован в нормальной коже. Оба клона относятся к семейству небольших богатых пролином белков и представляют собой маркеры полностью дифференцировавшихся клеток плоского эпителия. Ь5218 был описан как специфический маркер плоскоклеточной опухоли легкого (Я.Ни е! а1., 1998, Ьипд Сапсег, 20, 25-30). Ь5158 (8 ЕС) ГО ΝΟ 162) кодирует Ι0Ε-β2, а Ь5168 является гомологом альдозоредуктазы, и оба они в средней степени экспрессированы в плоскоклеточных легочных опухолях и в нормальной толстой кишке. Следует отметить, что Ь5168 (8ЕО ГО ΝΟ 91 и 92) позитивно регулируется в метастазирующих опухолях, но не в первичной аденокарциноме легкого: это может указывать на его возможное значение для метастазирования и как потенциального прогностического маркера. Ь5228 (8ЕО ГО ΝΟ 99) в средней степени сверхэкспрессирован в плоскоклеточных легочных опухолях при минимальном уровне экспрессии в нормальных тканях. Ь5228, как было показано, относится к алкогольдегидрогеназе IV типа - АОН7, - а параметры его экспрессии подтверждают, что он является антигеном, специфичным для клеток плоского эпителия. Ь5238 (8ЕО ГО ΝΟ 100) умеренно сверхэкспрессирован в плоскоклеточной опухоли легкого, линиях клеток рака поджелудочной железы и тканях рака поджелудочной железы человека: это подтверждает, что данный ген может кодировать общий антиген для раковых клеток поджелудочной железы и плоскоклеточного эпителия легких.
Ь5248 (8ЕО ГО ΝΟ 101) сверхэкспрессирован в большинстве проанализированных плоскоклеточных опухолей и гомологичен пептиду, родственному паратироидному гормону (РТНгР), который, как хорошо известно, вызывает гуморальную гиперкальцимию, ассоциированную со злокачественными опухолями, такими как лейкозы, рак предстательной железы и молочной железы. Также считается, что РТНгР наиболее часто ассоциирован с плоскоклеточной карциномой легкого и редко с аденокарциномой легкого (Ь.АГОау1д8оп е! а1., 1996, 1. РаШо1., 178, 398-401). Ь5288 (8 ЕС) ГО ΝΟ 105) интенсивно экспрессирован в двух плоскокле точных легочных опухолях при среднем уровне экспрессии в двух других плоскоклеточных опухолях, одной легочной аденокарциноме и некоторых нормальных тканях, включая кожу, лимфатические узлы, сердце, желудок и легкие. Он кодирует ген ΝΜΒ, который сходен с предшественником специфичного для меланоцитов гена Рте117, для которого сообщалось о преобладающей экспрессии в меланомных линиях клеток, характеризующихся низким потенциалом метастазирования. Сказанное предполагает, что Ь5288 может быть антигеном, общим для меланомы и плоскоклеточной легочной карциномы. Ь5268 (8ЕО ГО ΝΟ 103) сверхэкспрессирован во всех проанализированных плоскоклеточных легочных опухолях: было показано, что он проявляет гомологию с геном (АТМ), мутации в котором приводят к атаксиителангиэктазии - наследственному заболеванию человека, обусловливающему, помимо прочих симптомов, предрасположенность к раку. АТМ кодирует белок, который активирует р53опосредуемую ключевую точку клеточного цикла за счет прямого связывания и фосфорилирования молекулы р53. Приблизительно 40% случаев рака легкого связаны с мутациями в р53, в связи с чем предполагается, что сверхэкспрессия АТМ является результатом компенсации утраты функций р53, однако пока неизвестно, приводит ли такая сверхэкспрессия к плоскоклеточной легочной карциноме. Кроме того, экспрессия Ь5268 (АТМ) также выявляется в метастатической, но не первичной легочной аденокарциноме: это подтверждает его роль в образовании метастазов.
Экспрессия Ь5238 (8ЕО ГО ΝΟ 175) также была проанализирована с помощью описанного выше метода ПЦР с ревертированием в масштабе реального времени. В первом анализе с использованием панели плоскоклеточных легочных опухолей экспрессия Ь5238 была обнаружена в 4 из 7 плоскоклеточных легочных опухолей, в 2 из 3 плоскоклеточных опухолей головы и шеи и в обеих легочных аденокарциномах при низком уровне экспрессии, выявленном в скелетных мышцах, мягком небе и миндалинах. Во втором анализе с использованием панели легочных аденокарцином экспрессию Ь5238 выявили в 4 из 9 первичных аденокарцином, обоих легочных плевральных выпотах, в единственной легочной аденокарциноме с метастазами и в обеих плоскоклеточных легочных опухолях при слабой экспрессии, выявленной в нормальных тканях.
Экспрессия Ь5238 в легочных опухолях и различных нормальных тканях также была исследована с применением Нозерн-блоттинга в его стандартной форме. В первом анализе экспрессия Ь5238 была выявлена в ряде легочных аденокарцином и плоскоклеточных карцином, а также в нормальной ткани миндалин. Не было выявлено экспрессии в нормальных легких. Во
Ί0 втором анализе с использованием нормального тканевого блота от С1оп1ес11 (НВ-12) не было обнаружено экспрессии в головном мозге, скелетных мышцах, толстой кишке, вилочковой железе, селезенке, почке, печени, тонком кишечнике, легких или РВМС, хотя имелась интенсивная экспрессия в плаценте.
Пример 3. Выделение и охарактеризование полипептидов легочной опухоли с помощью основанной на ПЦР субтракции.
Восемьсот пятьдесят семь клонов из субтракционной библиотеки кДНК, содержащей кДНК из пула двух плоскоклеточных легочных опухолей человека, подвергнутой субтракции восемью библиотеками кДНК нормальных тканей человека, включая легкие, РВМС, головной мозг, сердце, почку, печень, поджелудочную железу и кожу (С1оп1ес11, Ра1о А11о. СА), были выделены и подвергнуты первому раунду ПЦРамплификации. Указанную библиотеку подвергали второму раунду ПЦР-амплификации в соответствии с прописью изготовителя. Полученные в результате фрагменты кДНК субклонировали в вектор Р7- Айу (С1оп1еск, Ра1о А11о, СА), которым трансформировали клетки Е.соН штамма ЭН5а (61Ьсо ВКЬ). ДНК выделяли из независимых клонов и секвенировали на автомагическом секвенаторе модели 373А от Регкш Е1тег/Арркей Вюкуйетк ОАыоп.
Сто шестьдесят два клона были секвенированы. Сравнение последовательностей ДНК указанных клонов с последовательностями из баз данных ЕМВЬ и бепВапк, как это было описано выше, показало отсутствие существенной гомологии с 13 из указанных клонов, здесь и далее обозначаемых как контиги 13, 16, 17, 19, 22, 24, 29, 47, 49, 56-59. Установленные последовательности кДНК для указанных клонов показаны в 8ЕО ΙΌ N0 125, 127-129, 131-133, 142, 144, 148-150 и 157, соответственно. Контиги 1, 3-5, 7-10, 11, 12, 15, 20, 31, 33, 38, 39, 41, 43, 44, 45, 48, 50, 53, 54 (8ЕЕ) ΙΌ N0 115-124, 126, 130, 134-141, 143, 145-147, соответственно) проявили некоторую степень гомологии с ранее идентифицированными последовательностями ДНК. Контиг 57 (8Е0 ΙΌ N0 149), как было установлено, представляет клон Ь5198 (8Е0 ΙΌ N0 94), заявленный в патентной заявке США № 09/123912, поданной 27 июля 1998 г. Насколько известно авторам настоящего изобретения, ни для одной из указанных последовательностей ранее не была отмечена различающаяся сверхэкспрессия в легочных опухолях.
Уровни экспрессии мРНК репрезентативных клонов в тканях легочных опухолей, тканях нормальных легких (п=4), покоящихся РВМС, слюнной железы, сердца, желудка, лимфатических узлов, скелетных мышц, мягкого неба, тонкого кишечника, толстого кишечника, бронхов, мочевого пузыря, миндалин, почки, пищевода, костного мозга, толстой кишки, надпочечников, поджелудочной железы и кожи (все про исходят от человека) были определены с помощью ПЦР с ревертированием, как это было описано выше. Уровни экспрессии с использованием микроматричной технологии, как это описано выше, анализировали в одном образце каждого типа ткани, если это специально не оговаривается.
Контиг 3 (8Е0 ΙΌ N0 116), как было обнаружено, интенсивно экспрессирован во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (17 из 17) и экспрессирован в большинстве (8 из 12) плоскоклеточных легочных опухолей (интенсивно экспрессирован в 7 из 12, на среднем уровне в 2 из 12 и на низком уровне в 2 из 12), в то время как экспрессия отсутствовала в 2 из 4 образцов нормальной легочной ткани при низкой экспрессии в остальных двух образцах. Контиг 3 проявил средний уровень экспрессии в коже и мягком небе, а также пониженные уровни экспрессии в покоящихся РВМС, толстом кишечнике, слюнной железе, миндалинах, поджелудочной железе, пищеводе и толстой кишке. Контиг 11 (8Е0 ΙΌ N0 124), как было показано, экспрессирован во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (17 из 17): интенсивно экспрессирован в 14 из 17 и экспрессирован в средней степени в 3 случаях из 17. Кроме того, экспрессия в плоскоклеточных легочных опухолях была определена высокой в 3 случаях из 12 и на среднем уровне - в 4 из 12. Контиг 11 отсутствовал в 3 из 4 образцов нормальных легких, а в оставшемся образце характеризовался только слабой экспрессией. Контиг 11 проявил от низкой до средней реактивность в слюнной железе, мягком небе, мочевом пузыре, миндалинах, коже, пищеводе и толстом кишечнике. Контиг 13 (8Е0 ΙΌ N0 125), как было выявлено, экспрессирован во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (17 из 17): интенсивно экспрессирован в 12 из 17 и экспрессирован в средней степени в 5 случаях из 17. Контиг 13 был экспрессирован в 7 из 12 плоскоклеточных легочных опухолях, причем интенсивно в 4 из 12 и на среднем уровне в трех образцах. Анализ образцов нормальных легких показал отсутствие экспрессии в 2 из 4 образцов и экспрессию от слабой до средней в двух оставшихся образцах. Контиг 13 проявил реактивность от низкого до среднего уровня в покоящихся РВМС, слюнной железе, мочевом пузыре, поджелудочной железе, миндалинах, коже, пищеводе и толстом кишечнике, а также интенсивную экспрессию в мягком небе. Установлено, что контиг 16 (8Е0 ΙΌ N0 127) на среднем уровне экспресирован в некоторых случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (6 из 17) и в одной плоскоклеточной легочной опухоли, причем не проявляет экспрессии ни в одном из протестированных образцов нормальных легких. Контиг 16 проявил низкий уровень реактивности в покоящихся РВМС, толстом кишечнике, коже, слюнной железе и мягком небе. Контиг 17 (8ЕО ГО NО 128), как было показано, экспрессирован во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (17 из 17): интенсивно экспрессирован в 5 из 17 и экспрессирован в средней степени в 12 случаях из 17. Уровни экспрессии в плоскоклеточных легочных опухолях были высокими в одном образце и были средними в 3 случаях из 12. Контиг 17 не проявил активности в 2 из 4 образцах нормальных легких, а в остальных образцах имелась только слабая экспрессия. Кроме того, низкий уровень экспрессии был найден в пищеводе и мягком небе. Было показано, что контиг 19 (8ЕО ГО NО 129) экспрессирован в большинстве протестированных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи (11 из 17): интенсивно экспрессирован в двух образцах, экспрессирован в средней степени в 6 случаях из 17 и слабо экспрессирован в 3 из 17. Анализ плоскоклеточных легочных опухолей показал только средний уровень экспрессии в 3 из 12 образцов. Уровни экспрессии в 2 из 4 образцов нормальных легких были нулевыми, а в двух оставшихся образцах экспрессия была слабой. Контиг 19 проявил низкие уровни экспрессии в пищеводе, покоящихся РВМС, слюнной железе, мочевом пузыре, мягком небе и поджелудочной железе.
Было установлено, что контиг 22 (8ЕО ГО NО 131) экспрессирован в большинстве протестированных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи (13 из 17): интенсивно экспрессирован в четырех образцах, экспрессирован в средней степени в 6 случаях из 17 и слабо экспрессирован в 3 из 17. Уровни экспрессии в плоскоклеточных легочных опухолях были выявлены на уровнях от среднего до высокого в 3 из 12 проанализированных тканей при отсутствии экспрессии с двух образцах нормальных легких и низкой экспрессии в двух других образцах (п=4). Контиг 22 проявил низкий уровень экспрессии в коже, слюнной железе и мягком небе. Похожим образом контиг 24 (8ЕО ГО NО 132) как было выявлено экспрессирован в большинстве протестированных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи (13 из 17): интенсивно экспрессирован в трех образцах, экспрессирован в средней степени в 6 случаях из 17 и слабо экспрессирован в 4 из 17. Уровни экспрессии в плоскоклеточных легочных опухолях были выявлены на уровнях от среднего до высокого в 3 из 12 проанализированных тканей при отсутствии экспрессии с трех образцах нормальных легких и низкой экспрессии в одном образце (п=4). Контиг 24 проявил низкий уровень экспрессии в коже, слюнной железе и мягком небе. Контиг 29 (8ЕО ГО NО 133) экспрессирован почти во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (16 из 17): интенсивно экспрессирован в четырех образцах из 17, экспрессирован в сред ней степени в 11 случаях из 17 и слабо экспрессирован в одном образце. Также он в средней степени экспрессирован в 3 из 12 плоскоклеточных легочных опухолей и не экспрессирован в двух образцах нормальных легких из 4. Контиг 29 проявил экспрессию от низкого до умеренного уровня в толстом кишечнике, коже, слюнной железе, поджелудочной железе, миндалинах, сердце и мягком небе. Контиг 47 (8ЕО ГО NО 142) был экспрессирован в большинстве протестированных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи (12 из 17): в средней степени в 10 случаях из 17 и слабо экспрессирован в двух образцах. В плоскоклеточных легочных опухолях он был интенсивно экспрессирован в одном образце и умеренно экспрессирован в двух других случаях (п=13). Контиг 47 не был экспрессирован в 2 образцах нормальных легких из 4, а в двух других - экспресирован на среднем уровне. Также контиг 47 проявил средний уровень экспрессии в толстом кишечнике и поджелудочной железе, а низкий уровень экспрессии - в коже, слюнной железе, мягком небе, желудке, мочевом пузыре, покоящихся РВМС и миндалинах.
Контиг 48 (8ЕО ГО NО 143) был экспрессирован во всех протестированных случаях плоскоклеточной опухоли головы и шеи (17 из 17): интенсивно экспрессирован в 8 из 17, в средней степени в 7 случаях из 17 и слабо экспрессирован в двух образцах. Уровни экспрессии в плоскоклеточных легочных опухолях были от высоких до умеренных в трех образцах (п=13) . Контиг 48 не был экспрессирован в одном из четырех образцов нормальных легких, а остальные образцы проявили слабую умеренную экспрессию. Контиг 48 проявил средний уровень экспрессии в мягком небе, толстом кишечнике, поджелудочной железе и мочевом пузыре и низкий уровень экспрессии в пищеводе, слюнной железе, покоящихся РВМС и сердце. Контиг 49 (8ЕО ГО NО 144) был экспрессирован на низком-среднем уровнях в 6 из 17 исследованных плоскоклеточных опухолей головы и шеи. Уровни экспрессии в плоскоклеточных легочных опухолях были умеренными в трех образцах (п=13). Контиг 49 отсутствовал в 2 из 4 образцов нормальных легких, а в двух других экспрессия была слабой. Средние уровни экспрессии были выявлены в коже, слюнной железе, толстом кишечнике, поджелудочной железе, мочевом пузыре и покоящихся РВМС, а низкий уровень экспрессии - в мягком небе, лимфатических узлах и миндалинах. Контиг 56 (8ЕО ГО NО 148) был экспрессирован от низкой до умеренной степени в 3 из 17 проанализированных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи, а также в плоскоклеточных легочных опухолях, проявляя низкие-умеренные уровни экспрессии в трех из 13 образцов. Следует отметить, что низкие уровни экспрессии выявлены в одном образце легочной аденокарциномы из двух. Контиг 56 отсутствовал в 3 из 4 образцов нормальных легких, и средний уровень экспрессии имелся только в толстом кишечнике, а слабая экспрессия - в слюнной железе, мягком небе, поджелудочной железе, мочевом пузыре и покоящихся РВМС. Контиг 58, также известный как Б769Р (8Е0 ΙΌ N0 150), был экспрессирован при средних уровнях в 11 из 17 исследованных случаев плоскоклеточной опухоли головы и шеи и на низком уровне еще в одном образце. Экспрессия в плоскоклеточных легочных опухолях характеризовалась низкими-средними уровнями в трех образцах из 13. Контиг 58 не был экспрессирован в 3 образцах нормальных легких из 4, а в одном образце экспрессия была слабой. Умеренные уровни экспрессии были найдены в коже, толстом кишечнике и покоящихся РВМС, а низкий уровень экспрессии - в слюнной железе, мягком небе, поджелудочной железе и мочевом пузыре. Контиг 59 (8Е0 ΙΌ N0 157) был экспрессирован в некоторых плоскоклеточных опухолях головы и шеи, а также легких. Низкий уровень экспрессии контига 59 также был выявлен в слюнной железе и толстом кишечнике.
Полноразмерная последовательность кДНК для контига 22, также обозначаемого как Б763Р, представлена в 8Е0 ΙΌ N0 158, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 159. Анализ Б763Р с помощью ПЦР с ревертированием в реальном времени показал, что он интенсивно экспрессирован в 3 из 4 плоскоклеточных легочных опухолей и во всех 4 плоскоклеточных опухолях головы и шеи при низком уровне экспрессии, выявленном в нормальных головном мозге, коже, мягком небе и трахее. Последующий скрининг баз данных показал, что последовательность 8Е0 ΙΌ N0 158 включает мутацию, приводящую к сдвигу рамки в соответствующей белковой последовательности. Вторая последовательность для кДНК Б763Р показана в 8Е0 ΙΌ N0 345, соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 346. Последовательности 8Е0 ΙΌ N0 159 и 346 идентичны, за исключением С-концевых 33 аминокислот, имеющихся в 8Е0 ΙΌ N0 159.
Полноразмерная последовательность кДНК, охватывающая контиги 17, 19 и 24, обозначенная как Б762Р, представлена в 8Е0 ΙΌ N0 160, а соответствующая расшифрованная аминокислотная последовательность приведена в 8Е0 ΙΌ N0 161. Дальнейший анализ Б762Р показал, что он соответствует мембранному белку Ι типа, а также были секвенированы два дополнительных варианта. Первый вариант (8Е0 ΙΌ N0 167 с соответствующей аминокислотной последовательностью в 8Е0 ΙΌ N0 169) является формой 8Е0 ΙΌ N0 160, образованной в результате альтернативного сплайсинга с утратой 503 нуклеотидов, а также делецией корот кого сегмента в экспрессированном белке. Второй вариант (8Е0 ΙΌ N0 168 с соответствующей аминокислотной последовательностью в 8Е0 ΙΌ N0 170) характеризуется 2нуклеотидной делецией с 3'-конца кодирующего участка по сравнению с 8Е0 ΙΌ N0 160, в результате чего образуется секретируемая форма экспрессированного белка. Анализ Б762Р методом ПЦР с ревертированием в реальном времени показал, что он сверхэкспрессирован в 3 плоскоклеточных легочных опухолях из 4 и во всех 4 опухолях головы и шеи при низком уровне экспрессии, выявленном в нормальных коже, мягком небе и трахее.
Полноразмерная последовательность кДНК для контига 56 (8Е0 ΙΌ N0 148), также обозначенного как Б773Р, представлена в 8Е0 ΙΌ N0 171, а расшифрованная аминокислотная последовательность - в 8Е0 ΙΌ N0 172. Было установлено, что Б773Р идентичен 3'-части гена дигидроксилдегидрогеназы, отличаясь по 5'части гена. В результате 69 N-концевых аминокислот уникальны. Последовательность кДНК, кодирующая 69 N-концевых аминокислот, приведена в 8Е0 ΙΌ N0 349, а ^концевая аминокислотная последовательность показана в 8Е0 ΙΌ N0 350. Анализ Б773Р методом ПЦР в реальном времени показал, что он экспрессирован на высоком уровне в плоскоклеточных легочных опухолях и аденокарциноме легкого при отсутствии выявляемой экспрессии в нормальных тканях. Последующий анализ Б773Р методом Нозерн-блоттинга продемонстрировал, что данный транскрипт по-разному сверхэкспрессирован в плоскоклеточных опухолях и выявляется в виде транскрипта длиной приблизительно 1,6 тысяч нуклеотидов в ткани первичной опухоли легкого, а в ткани первичной опухоли головы и шеи - длиной примерно 1,3 тысячи нуклеотидов.
Последующий микроматричный анализ показал, что контиг 58, также обозначаемый как Б7698 (8Е0 ΙΌ N0 150), сверхэкспрессирован в опухолях молочной железы в дополнение к плоскоклеточным опухолям легкого.
Пример 4. Синтез полипептидов.
Полипептиды могут быть синтезированы на пептидном синтезаторе модели 430А от Регк1п Е1тег/Лрр11еб Вюкуйетк Όίνίκίοη с использованием химии ГМ0С с активацией НРТи - 0бензотриазол-N,N,N', N'-тетраметилуронийгексафторфосфатом. Последовательность С1уСук-С1у может быть присоединена к Оконцу пептида для обеспечения способа присоединения, связывания с иммобилизационной поверхностью или мечения пептида. Отщепление пептидов от твердой подложки можно осуществить с использованием следующей отщепляющей смеси: трифторуксусная кислота/этандитиол/ тиоанизол/вода/фенол (40:1:2:2:3). После отщепления в течение 2 ч пептиды могут быть преципитированы холодным метил-трет-бутиловым эфиром. Пептидные осадки затем могут быть растворены в воде, содержащей 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК), и лиофилизованы перед очисткой методом ВЭЖХ с обращенной фазой на колонках С18. Для элюции пептидов можно использовать градиент 0-60% ацетонитрила (содержащий 0,1% ТФК) в воде (содержащей 0,1% ТФК). После лиофилизации очищенных фракций пептиды можно охарактеризовать путем электрораспылительной или иного типа масс-спектрометрии и аминокислотного анализа.
Пример 5. Приготовление антител, специфичных в отношении антигенов рака легкого.
Поликлональные антитела, специфичные в отношении антигенов легочной опухоли Ь5148, Ь5288 и Ь5318 (8Ер ГО N0 155, 225 и 112, соответственно), были получены следующим образом.
Кроликов иммунизовали рекомбинантным белком, который в соответствии с описанным выше был экспрессирован в клетках Е.соН и очищен из них. Для исходной иммунизации 400 мкг антигена, объединенного с мурамиловым дипептидом (МДП), инъецировали подкожно (п/к). Через 4 недели животных бустировали инъекциями п/к по 200 мкг антигена, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ). При последующих бустерных инъекциях п/к вводили 100 мкг антигена, смешанного с НАФ, что было необходимо для индукции высоких титров антител. Пробы сыворотки от иммунизованных кроликов тестировали на антигенспецифичную реактивность с применением тестов ТИФА с очищенным белком. Поликлональные антитела к Ь5148, Ь5288 и Ь5318 очищали аффинным образом из поликлональных сывороток с высоким титром антител с использованием очищенного белка, присоединенного к твердой подложке.
Иммуногистохимический анализ с использованием поликлональных антител, специфичных в отношении Ь5148, проводили на панели 5 образцов легочных опухолей, 5 образцов нормальной легочной ткани и нормальных толстой кишки, почки, печени, головного мозга и костного мозга. В частности, тканевые образцы фиксировали в растворе формалина в течение 24 часов и заделывали в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 10 мкм. Срезы тканей пропитывали и инкубировали в течение 1 ч с антителом. Для визуализации иммунореактивности Ь5148 использовали мышиное антитело, меченное пероксидазой хрена, с последующей инкубацией с хромогеном ЬАВ. Было установлено, что Ь5148 интенсивно экспрессирован в ткани легочной опухоли, в то время как экспрессия в нормальном легком, головном мозге или костном мозге не выявлялась или была слабой. Слабое окрашивание было отмечено в толстой кишке и почке. Окрашивание выявлялось в нормальной печени, однако, в этой ткани не удалось обнаружить мРНК, что делает данный результат сомнительным.
Пример 6. Пептидное праймирование мышей и воспроизведение линий СТЬ.
Иммуногенные пептиды на материале антигена рака легкого Ь762Р (8Е0 ГО N0 161) для НЬА-А2/КЬ-ограниченных СО8-позитивных Тклеток идентифицировали следующим образом.
Локализация связывающих НЬА-А2 пептидов в пределах антигена рака легкого Ь762Р (8Е0 ГО N0 161) была предсказана с использованием компьютерной программы, используемой для предсказывания пептидных последовательностей, связывающихся с НЬА-А*0201, с помощью приближения к известному пептидному мотиву связывания с НЬА-А*0201 (Кирей е! а1., 1993, Се11, 74, 929; Каттепкее е! а1., 1995, [тишподепеНсх. 41, 178-228). Серия из 19 синтетических пептидов, соответствующих отобранному ряду предсказанных связывающихся с НЬА-А*0201 пептидов, была получена в соответствии с описанным выше.
Мышей, экспрессирующих трансген НЬАА2/КЬ человека (предоставлены д-ром Шерманом: Ь.8Ьегтап, 8спрр§ КекеагсЬ кщНЫе, Ьа Чо11а, СА), иммунизовали синтетическими пептидами в соответствии с описанным у ТНеоЬа1б е! а1., 1995, Ргос. ЫаЙ. Асаб. 8οΐ. И8А, 92, 1199311997 при следующих модификациях. Мышей иммунизовали 50 мкг пептида Ь762Р и 120 мкг связывающего пептида Ι-А5, происходящего от белка вируса гепатита-В, эмульгированных в неполном адъюванте Фрейнда. Спустя три недели мышей умерщвляли и приготавливали моноклеточные суспензии. Затем клетки ресуспендировали в полной среде (КРМЫ640: 61Ьсо ВКЬ, баййегкЬигд, ΜΌ) при 7х106 клеток на 1 мл, содержащей 10% ПТС, 2 мМ глутамина (61Ьсо ВКЬ), пируват натрия (61Ьсо ВКЬ), заменимые аминокислоты (61Ьсо ВКЬ), 2х10-5 М 2меркаптоэтанола, 50 ед./мл пенициллина и стрептомицина, и культивировали в присутствие облученных (3000 рад) Ь762Р-пептид- (5 мкг/мл) и 10 мг/мл в2-микроглобулин- (3 мкг/мл) -ЛПС бластов (А2-трансгенные спленоциты, культивируемые в присутствие 7 мкг/мл декстрансульфата и 25 мкг/мл ЛПС в течение 3 дней). Через 6 дней клетки (5х105 на 1 мл) повторно стимулировали действием 2,5х106 на 1 мл обрабатанных пептидом облученных (20000 рад) клеток ЕЬ4А2КЬ (8Ьегтап е! а1., 1992, 8с1епсе, 258, 815-818) и 5х106 на 1 мл облученных (3000 рад) А2/КЬ-трансгенных селезеночных клеток-кормильцев. Клетки культивировали в присутствие 10 ед./мл ГЬ-2. В ходе приготовления к клонированию в линию клетки повторно стимулировали раз в неделю в соответствии с описанным.
Специфичные для пептида клеточные линии были клонированы с помощью метода ограничивающего разведения с облученными (20000 рад) обработанными пептидом Ь762Р опухолевыми клетками ЕЬ4-А2КЬ (1х104 клеток на лунку) в качестве стимуляторов, а также облученными (3000 рад) А2/КЬ-трансгенными спленоцитами в качестве кормильцев (5х105 клеток на лунку), выращенными в присутствие 10 ед./мл ΙΕ-2. На 7-й день клетки повторно стимулировали так же, как описано выше. На 14-й день клоны, которые росли, выделяли и поддерживали в культуре.
Клеточные линии, специфичные для Б762Р-87 (8ЕО ΙΌ N0 226; соответствует аминокислотам 87-95 из 8Е0 ΙΌ N0 161), Б726Р145 (8Е0 ΙΌ N0 227: соответствует аминокислотам 145-153 из 8ЕО ΙΌ N0 161); Б726Р-585 (8Е0 ΙΌ N0 228: соответствует аминокислотам 585-593 из 8ЕО ΙΌ N0 161); Б762Р-425 (8ЕО ΙΌ N0 229: соответствует аминокислотам 425-433 из 8ЕО ΙΌ N0 161); Б762Р (10)-424 (8ЕО ΙΌ N0 230: соответствует аминокислотам 424-433 из 8ЕО ΙΌ N0 161) и Ь762Р(10)-458 (8ЕО ΙΌ N0 231: соответствует аминокислотам 458-467 из 8Е0 ΙΌ N0 161), проявили существенно более высокий уровень реактивности (в соответствии с определением доли специфичного лизиса) в отношении обработанных пептидом Б762Р опухолевых клеток-мишеней ЕЬ4-А2/КЬ по сравнению с опухолевыми клетками-мишенями ЕЬ4А2/КЬ, обработанных контрольным пептидом.
Пример 7. Идентификация иммуногенныхСИ4-Т-клеточных эпитопов, производных от антигена легочной опухоли Б762Р.
Т-клеточные линии СЭ4. специфичные для антигена Б762Р (8Е0 ΙΌ N0 161), были сформированы следующим образом.
Была синтезирована серия из 28 перекрывающихся пептидов, которая покрывала приблизительно 50% последовательности Б762Р. Для праймирования пептиды объединяли в пулы по 4-5 пептидов, и обрабатывали ими дозой 20 мкг/мл дендритные клетки в течение 24 ч. Затем дендритные клетки промывали и смешивали с позитивно отобранными Т-клетками СИ4+ в 96-луночных планшетов с И-образным дном. Для каждого пептидного пула было сформировано по сорок культур. Культуры повторно стимулировали еженедельно свежими дендритными клетками, загруженными пептидными пулами. После всего трех циклов стимуляции клетки оставляли отдыхать в течение еще одной недели и тестировали на специфичность в отношении антиген-презентирующих клеток (АПК), обработанных пептидными пулами, с использованием тестов ТИФА с γ-интерфероном и на пролиферацию. Для данных тестов адгезивные моноциты, загруженные пулом анализируемых пептидов или посторонним пептидом, использовали в качестве АПК. В каждом пуле были идентифицированы Т-клеточные линии, которые проявляли специфическое распознавание пептидных пулов Б762Р и по секреции цитокинов, и по пролиферации. Внимание было сосредоточено на идентификации Т-клеток, проявляющих пролиферативные ответы. Тклеточные линии, которые проявляли либо и Ь762Р-специфичную секрецию цитокинов, и пролиферацию, либо только мощную пролиферацию, дополнительно воспроизводили так, чтобы протестировать на распознавание отдельных пептидов из состава пулов, а также на распознавание рекомбинантного Б762Р. Источником рекомбинантного Б762Р были клетки Е.сой, и материал был частично очищен и позитивен по эндотоксину. В данных исследованиях использовали 10 мкг отдельных пептидов, 10 или 2 мкг постороннего пептида и 2 или 0,5 мкг либо белка Б762Р, либо постороннего, в равной степени неочищенного рекомбинантного белка, полученного в Е.сой. Существенная выработка γ-интерферона и пролиферация Т-клеток СИ4 были индуцированы рядом Ь762Р-производных пептидов из каждого пула. Аминокислотные последовательности таких пептидов показаны в 8Е0 ΙΌ N0 232-251. Указанные пептиды соответствуют аминокислотам 661-680, 676-696,
526-545, 874-893, 811-830, 871-891, 856-875,
826-845, 795-815, 736-755, 706-725, 691-710,
601-620, 571-590, 556-575, 616-635, 646-665,
631-650, 541-560 и 586-605, соответственно, из последовательности 8Е0 ΙΌ N0 161.
Линии Т-клеток СИ4, которые проявляли специфичность в отношении отдельных производных от Б762Р пептидов, дополнительно воспроизводили путем стимуляции анализируемым пептидом при дозе 10 мкг/мл. Через 2 недели после стимуляции линии Т-клеток тестировали с использованием пролиферационного теста и теста ТИФА с γ-интерфероном на распознавание специфичного пептида. Некоторые ранее идентифицированные Т-клетки продолжали проявлять активность, специфичную в отношении пептида Б762Р. Каждую из таких линий дополнительно воспроизводили на анализируемом пептиде и через 2 недели после этого тестировали на специфичность распознавания пептида Б762Р в экспериментах по титрованию, а также на распознавание рекомбинантного белка Б762Р из Е.сой. Для указанных экспериментов аутологичные адгезивные моноциты обрабатывали либо анализируемым пептидом, производным от Б762Р, либо посторонним пептидом, производным от маммаглобулина, либо рекомбинантным белком Б762Р из Е.сой (чистота примерно 50%), либо посторонним белком, происходящим от Е.сой. Было установлено, что большинство Т-клеточных линий проявляли низкую аффинность в отношении анализируемого пептида, поскольку специфичная пролиферация и доля γ-интерферона резко снижались по мере разбавления пептида Б762Р. Однако, были идентифицированы четыре линии, которые проявили значительную активность даже при концентрации пептида 0,1 мкг/мл. Каждая из таких линий (обозначенных А/И5, Ό/Ε5, Е/А7 и Е/В6) также специфически пролиферировала в ответ на препарат пептида Ь762Р, происходящего от Е.со11, но не в ответ на препараты постороннего белка. Аминокислотные последовательности производных от Ь762Р пептидов, распознаваемых указанными линиями, показаны в БЕр ΙΌ N0 234, 249, 236 и 245, соответственно. Ни в одной из этих линий не было выявлено специфического γ-интерферона. Линии А/Б5. Е/А7 и Е/В6 были клонированы на материале аутологичных адгезивных моноцитов, обработанных анализируемым пептидом в концентрации 0,1 (А/Б5 и Е/А7) или 1 (Ό/Ε5) мкг/мл. После культивирования клоны тестировали на специфичность в отношении тест-пептида. Многочисленные клоны, специфичные в отношении тест-пептида, были идентифицированы для линий А/Б5 и Е/А7.
Пример 8. Экспрессия специфичных для легочной опухоли белковых антигенов.
(a) Экспрессия Ь514Б в Е.со11.
Антиген легочной опухоли Ь514Б (БЕР ΙΌ N0 89) субклониро-вали в состав экспрессирующего вектора рЕ32Ь по сайтам NсоI и КоИ, которым трансформировали клетки Е.соН с применением стандартных методов. Белок экспрессировался с остатков 3-153 БЕР ΙΌ N0 89. Экспрессированная аминокислотная последовательность и соответствующая последовательность ДНК приведены в БЕр ΙΌ N0 252 и 253, соответственно.
(b) Экспрессия Б762Р.
Аминокислоты 32-944 антигена легочной опухоли Б762Р (БЕр ΙΌ N0 161), плюс гексагистидиновая метка, были субклонированы в состав модифицированного экспрессирующего вектора рЕТ28, несущего ген резистентности к канамицину, которым трансформировали ВЬ21 СобопР1н5 с применением стандартных методов. Была выявлена экспрессия на низком-среднем уровне. Установленная последовательность ДНК экспрессионной конструкции для Б762Р показана в БЕр ΙΌ N0 254.
На основании вышеизложенного должно быть понятно, что, хотя в данном тексте конкретные варианты были описаны с иллюстративной целью, различные модификации могут быть сделаны без отклонения от сути и объема настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение не ограничивается ни чем иным, как только прилагающейся формулой изобретения.

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированный полинуклеотид, включающий последовательность, выбранную из группы, которая состоит из (a) последовательности, представленной в БЕР ΙΌ N0:347;
    (b) комплементов последовательности, представленной в БЕр ΙΌ N0:347;
    (с) полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность БЕр ΙΌ N0:347 или ее часть; и (б) дегенеративных вариантов последовательности, представленной в БЕр ΙΌ N0:347.
  2. 2. Изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из (a) аминокислотной последовательности, кодируемой полинуклеотидом по п.1;
    (b) аминокислотной последовательности, представленной в БЕр ΙΌ N0:348;
    (c) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 70% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в БЕр ΙΌ N0:348; и (б) аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичность с аминокислотной последовательностью, представленной в БЕр ΙΌ N0:348;
    где указанный полипептид может использоваться для детектирования рака легких.
  3. 3. Экспрессирующий вектор, включающий полинуклеотид по п.1, оперативно связанный с экспрессирующей контрольной последовательностью.
  4. 4. Клетка-хозяин, трансформированная или трансфицированная экспрессирующим вектором по п.3.
  5. 5. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с полипептидом по п.2.
  6. 6. Способ определения наличия рака у пациента, включающий стадии (a) получения биологического образца от пациента;
    (b) контактирования биологического образца со связывающим агентом, который связывается с полипептидом, выбранным из группы, которая состоит из (ί) полипептида по п.2;
    (ίί) полипептида, представленного в БЕр ΙΌ N0:176;
    (ΐΐΐ) полипептида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность с полипептидом, представленным в БЕр ΙΌ N0: 176; и (ίν) полипептида, имеющего по меньшей мере 90% идентичность с полипептидом, представленным в БЕр ΙΌ N0: 176;
    (c) определения в образце количества полипептида, который связывается со связывающим агентом; и (б) сравнения количества полипептида с заранее установленной величиной отсечки и определения, таким образом, наличия рака у пациента.
  7. 7. Химерный белок, включающий по меньшей мере один полипептид по п.2 и неродственную последовательность, где указанный химерный белок может использоваться для детектирования рака легких.
  8. 8. Олигонуклеотид, который гибридизуется с последовательностью, представленной в 8 ЕД ΙΌ N0:175 и 347, в условиях высокой степени жесткости.
  9. 9. Способ стимуляции и/или воспроизведения Т-клеток, специфичных в отношении белка опухоли, включающий контактирование Тклеток по меньшей мере с одним компонентом, выбранным из группы, которая состоит из (a) полипептидов по п.2;
    (b) полипептида, представленного в 8 ЕД ΙΌ N0:176;
    (c) полипептида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность с полипептидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:176; и (6) полипептида, имеющего по меньшей мере 90% идентичность с полипептидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:176;
    (е) полинуклеотидов по п.1;
    (Г) полинуклеотида, представленного в 8ЕО ΙΌ N0:175;
    (д) полинуклеотида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность с полинуклеотидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:175; и (к) полинуклеотида, имеющего по меньшей мере 90% идентичность с полинуклеотидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:175;
    (ί) антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют полинуклеотид по п.1 или полинуклеотид, определенный в (Г), (д) или (к);
    в таких условиях и в течение такого времени, которые обеспечивают стимуляцию и/или воспроизведение Т-клеток.
  10. 10. Изолированная популяция Т-клеток, включающая Т-клетки, приготовленные в соответствии со способом по п.9.
  11. 11. Композиция, содержащая первый компонент, выбранный из группы, состоящей из физиологически приемлемых носителей и иммуностимуляторов, и второй компонент, выбранный из группы, состоящей из (a) полипептидов по п.2;
    (b) полинуклеотидов по п.1;
    (c) антител по п.5;
    (б) химерных белков по п.7;
    (е) популяций Т-клеток по п.10; и (Г) антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептида по п.2, по липептида, представленного в 8 ЕД ΙΌ N0:176; полипептида, имеющего по меньшей мере 70% идентичность с полипептидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:176; и полипептида, имеющего по меньшей мере 90% идентичность с полипептидом, представленным в 8ЕД ΙΌ N0:176.
  12. 12. Композиция по п.11 для применения в индуцировании иммуного ответа у пациента.
  13. 13. Композиция по п.11 для применения в лечении рака легких у пациента.
  14. 14. Способ определения наличия рака у пациента, включающий стадии (a) получения биологического образца от пациента;
    (b) контактирования биологического образца с олигонуклеотидом по п.8;
    (c) определения в образце количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом; и (б) сравнения количества полинуклеотида, который гибридизуется с олигонуклеотидом, с заранее установленной величиной отсечки и определения, таким образом, наличия рака у пациента.
  15. 15. Диагностический набор, содержащий по меньшей мере один олигонуклеотид по п.8.
  16. 16. Диагностический набор, содержащий по меньшей мере одно антитело по п.5 и реагент для детектирования, где реагент для детектирования включает репортерную группу.
  17. 17. Способ подавления развития рака легких у пациента, включающий стадии (a) инкубации СО4-позитивных и/или СО8-позитивных Т-клеток, выделенных от пациента по меньшей мере с одним компонентом, выбранным из группы, которая состоит из (ί) полипептидов по п.2;
    (ίί) полинуклеотидов по п.1;
    (ίίί) полипептида, представленного в 8 ЕД ΙΌ N0:176;
    (ίν) полинуклеотида, представленного в 8ЕО ΙΌ N0:175;
    (ν) антиген-презентирующих клеток, которые экспрессируют полипептид по п.2 или полипептид, представленный в 8ЕД ΙΌ N0:176;
    так, что Т-клетки пролиферируют;
    (b) введения пациенту эффективного количества пролиферировавших Т-клеток и подавления, таким образом, развития рака у пациента.
EA200101037A 1999-04-02 2000-04-03 Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого EA005140B1 (ru)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/285,479 US6821518B1 (en) 1998-03-18 1999-04-02 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/466,396 US6696247B2 (en) 1998-03-18 1999-12-17 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/476,496 US6706262B1 (en) 1998-03-18 1999-12-30 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US09/480,884 US6482597B1 (en) 1999-12-17 2000-01-10 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US51037600A 2000-02-22 2000-02-22
PCT/US2000/008896 WO2000061612A2 (en) 1999-04-02 2000-04-03 Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200101037A1 EA200101037A1 (ru) 2002-06-27
EA005140B1 true EA005140B1 (ru) 2004-12-30

Family

ID=27540689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200101037A EA005140B1 (ru) 1999-04-02 2000-04-03 Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого

Country Status (20)

Country Link
EP (2) EP1169347B1 (ru)
JP (1) JP2002543769A (ru)
KR (1) KR20020007354A (ru)
CN (1) CN1370182A (ru)
AT (1) ATE399793T1 (ru)
AU (1) AU4069200A (ru)
BR (1) BR0009505A (ru)
CA (1) CA2369578A1 (ru)
CZ (1) CZ20013527A3 (ru)
DE (1) DE60039353D1 (ru)
EA (1) EA005140B1 (ru)
ES (1) ES2308976T3 (ru)
HK (1) HK1049848A1 (ru)
HU (1) HUP0200760A2 (ru)
IL (1) IL145731A0 (ru)
MX (1) MXPA01009962A (ru)
NZ (1) NZ514818A (ru)
PL (1) PL354348A1 (ru)
WO (1) WO2000061612A2 (ru)
YU (1) YU72901A (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2481398C2 (ru) * 2006-12-28 2013-05-10 Интернешнл Инститьют Оф Кэнсер Иммунолоджи, Инк. Hla-a*1101-ограниченный пептид wt1 и содержащая его фармацевтическая композиция
US10240209B2 (en) 2015-02-10 2019-03-26 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US10633713B2 (en) 2017-01-25 2020-04-28 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7338937B2 (en) * 1997-11-17 2008-03-04 Cornell Research Foundation, Inc. Calcium-activated chloride channel proteins and their use in anti-metastatic therapy
US6706262B1 (en) 1998-03-18 2004-03-16 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US6696247B2 (en) 1998-03-18 2004-02-24 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US6737514B1 (en) 1998-12-22 2004-05-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US6960570B2 (en) 1998-03-18 2005-11-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20040235072A1 (en) * 1998-03-18 2004-11-25 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US20020147143A1 (en) * 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7258860B2 (en) 1998-03-18 2007-08-21 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7579160B2 (en) 1998-03-18 2009-08-25 Corixa Corporation Methods for the detection of cervical cancer
US20030236209A1 (en) * 1998-03-18 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
US7049063B2 (en) 1998-03-18 2006-05-23 Corixa Corporation Methods for diagnosis of lung cancer
WO2001016324A2 (en) * 1999-08-31 2001-03-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions of a novel serine protease inhibitor
DK1234031T3 (en) 1999-11-30 2017-07-03 Mayo Foundation B7-H1, AN UNKNOWN IMMUNE REGULATORY MOLECULE
US7030219B2 (en) 2000-04-28 2006-04-18 Johns Hopkins University B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules
AU2001260309A1 (en) * 2000-05-19 2001-12-03 F.Hoffmann-La Roche Ag A process for determining the tumoricidal potential of a sample by the use of a nucleic acid which is downregulated in human tumor cells
AU6531101A (en) 2000-06-02 2001-12-17 Genentech Inc Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6965018B2 (en) 2000-06-06 2005-11-15 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies directed to B7-related polypeptide, BSL-2
US20030031675A1 (en) 2000-06-06 2003-02-13 Mikesell Glen E. B7-related nucleic acids and polypeptides useful for immunomodulation
DE60134158D1 (de) * 2000-06-28 2008-07-03 Corixa Corp Zusammensetzungen und verfahren für therapie und diagnose von lungenkrebs
CA2413857C (en) * 2000-06-28 2010-04-27 Genetics Institute, Llc. Pd-l2 molecules: pd-1 ligands and uses therefor
US6635750B1 (en) 2000-07-20 2003-10-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. B7-H2 nucleic acids, members of the B7 family
AU2001280987A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of head and neck cancer
JP4584536B2 (ja) 2000-09-20 2010-11-24 アムジェン インコーポレイテッド Ｂ７様分子およびその使用
AU2006202524B2 (en) * 2000-09-20 2009-12-03 Amgen, Inc. B7-Like Molecules and Uses Thereof
AU2002226079A1 (en) 2000-12-08 2002-06-18 Curagen Corporation Method of detecting and treating tuberous sclerosis complex associated disorders
WO2002097434A1 (en) * 2001-05-29 2002-12-05 Syddansk Universitet Proteins in diabetes proteome analysis
JP4098236B2 (ja) 2001-08-24 2008-06-11 久光製薬株式会社 肝芽腫と正常肝で発現差がある核酸
AU2003246086A1 (en) * 2002-06-28 2004-01-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Diagnostics/preventives/re medies for respiratory diseases
JP2006508644A (ja) * 2002-08-14 2006-03-16 エルジー・ライフ・サイエンシーズ・リミテッド 胃癌関連遺伝子ファミリー
US7378495B2 (en) 2002-10-21 2008-05-27 Pevion Biotech, Ltd. PTH-rP related peptide cancer therapeutics
EP1469064A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-20 DRK-Blutspendedienst Baden-Württemberg-Hessen gGmbH Expression of proteins in endothelial cells derived from precursor cells from cord blood
MX2007004176A (es) 2004-10-06 2007-06-15 Mayo Foundation B7-h1 y metodos de diagnosis, prognosis, y tratamiento de cancer.
WO2006105642A1 (en) * 2005-04-05 2006-10-12 British Columbia Cancer Agency Biomarkers for the detection of lung cancer and uses thereof
KR101600225B1 (ko) 2005-06-08 2016-03-04 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 예정 세포사 1(ｐｄ-1) 경로를 억제함으로써 지속 감염 및 암을 치료하기 위한 방법 및 조성물
KR100873629B1 (ko) * 2007-01-05 2008-12-12 경북대학교 산학협력단 신규한 폐암 진단용 마커
CN102282265B (zh) 2008-11-28 2020-07-24 埃默里大学 用于治疗传染病和肿瘤的方法
US9302005B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer
EP3052131B1 (en) 2013-10-01 2018-12-05 Mayo Foundation for Medical Education and Research Methods for treating cancer in patients with elevated levels of bim
AU2014375224A1 (en) * 2014-01-05 2016-07-28 Biomirna Holdings Ltd Lung cancer determinations using miRNA ratios
WO2015179654A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Mayo Foundation For Medical Education And Research Distinguishing antagonistic and agonistic anti b7-h1 antibodies
EP3171896A4 (en) 2014-07-23 2018-03-21 Mayo Foundation for Medical Education and Research Targeting dna-pkcs and b7-h1 to treat cancer
KR20180031742A (ko) 2015-07-23 2018-03-28 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 무세포 dna의 단편화 패턴 분석
WO2017075045A2 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Antibodies to b7-h1

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235877A (en) 1979-06-27 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Liposome particle containing viral or bacterial antigenic subunit
US4489710A (en) 1981-06-23 1984-12-25 Xoma Corporation Composition and method for transplantation therapy
US4429008B1 (en) 1981-12-10 1995-05-16 Univ California Thiol reactive liposomes
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
JPS59116229A (ja) 1982-12-24 1984-07-05 Teijin Ltd 細胞毒性複合体を活性成分とする癌治療用剤およびその製造法
US4673562A (en) 1983-08-19 1987-06-16 The Children's Medical Center Corporation Bisamide bisthiol compounds useful for making technetium radiodiagnostic renal agents
US4873088A (en) 1983-09-06 1989-10-10 Liposome Technology, Inc. Liposome drug delivery method and composition
US4625014A (en) 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4918164A (en) 1987-09-10 1990-04-17 Oncogen Tumor immunotherapy using anti-idiotypic antibodies
US4638045A (en) 1985-02-19 1987-01-20 Massachusetts Institute Of Technology Non-peptide polyamino acid bioerodible polymers
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US4735792A (en) 1987-04-28 1988-04-05 The United States Of America As Represented By The United States Department Of Energy Radioiodinated maleimides and use as agents for radiolabeling antibodies
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
JPH04505547A (ja) 1988-01-04 1992-10-01 イー・アイ・デユポン・ド・ネモアース・アンド・コンパニー 細胞混合物から特定の細胞を単離するための多段アフィニティー法
US5215926A (en) 1988-06-03 1993-06-01 Cellpro, Inc. Procedure for designing efficient affinity cell separation processes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
EP0487587A1 (en) 1989-08-18 1992-06-03 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
WO1991016116A1 (en) 1990-04-23 1991-10-31 Cellpro Incorporated Immunoselection device and method
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
DE69126620T2 (de) 1990-10-18 1997-10-02 Cellpro Inc Vorrichtung und verfahren zur trennung von partikeln mittels eines biegsamen gefässes
US5240856A (en) 1991-10-23 1993-08-31 Cellpro Incorporated Apparatus for cell separation
PT761231E (pt) 1992-06-25 2000-06-30 Smithkline Beecham Biolog Composicao de vacina contendo adjuvantes
EP0662147B1 (en) * 1992-09-17 1996-12-18 MERCK PATENT GmbH Small cell lung carcinoma specific antibody and antigen
US5359681A (en) 1993-01-11 1994-10-25 University Of Washington Fiber optic sensor and methods and apparatus relating thereto
FR2702160B1 (fr) 1993-03-02 1995-06-02 Biovecteurs As Vecteurs particulaires synthétiques et procédé de préparation.
FR2704145B1 (fr) 1993-04-21 1995-07-21 Pasteur Institut Vecteur particulaire et composition pharmaceutique le contenant.
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5550214A (en) * 1994-02-10 1996-08-27 Brigham And Women's Hospital Isolated antigenic oncogene peptide fragments and uses
US6194388B1 (en) 1994-07-15 2001-02-27 The University Of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US5589579A (en) * 1994-07-19 1996-12-31 Cytoclonal Pharmaceutics, Inc. Gene sequence and probe for a marker of non-small cell lung carinoma
EP0695760A1 (en) * 1994-08-05 1996-02-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tumor marker for lung cancer
FR2723849B1 (fr) 1994-08-31 1997-04-11 Biovector Therapeutics Sa Procede pour augmenter l'immunogenicite, produit obtenu et composition pharmaceutique
US5744585A (en) * 1995-03-16 1998-04-28 Medenica; Rajko D. Human monoclonal antibody against lung carcinoma
US5633161A (en) * 1995-03-29 1997-05-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Murine gene fomy030 coding for tumor progression inhibitor
UA56132C2 (ru) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиция вакцины (варианты), способ стабилизации qs21 по отношению к гидролизу (варианты), способ приготовления вакцины
WO1996038591A1 (en) 1995-06-02 1996-12-05 Incyte Pharmaceuticals, Inc. IMPROVED METHOD FOR OBTAINING FULL-LENGTH cDNA SEQUENCES
WO1997007244A1 (en) * 1995-08-11 1997-02-27 The United States Of America, Represented By The ISOLATION OF AMPLIFIED GENES VIA cDNA SUBTRACTIVE HYBRIDIZATION
EP0871747A1 (en) 1996-01-02 1998-10-21 Chiron Viagene, Inc. Immunostimulation mediated by gene-modified dendritic cells
US20020192228A1 (en) * 1997-02-12 2002-12-19 Samir M. Hanash Protein markers for lung cancer and use thereof
CA2285688A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 Peter Kufer Novel primers and methods for the detection of disseminated tumor cells
CA2292788A1 (en) * 1997-06-11 1998-12-17 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the lung
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
ID27813A (id) * 1998-01-28 2001-04-26 Corixa Corp Senyawa-senyawa untuk terapi dan diagnosa kanker paru-paru dan metoda untuk penggunaannya
US6312695B1 (en) 1998-03-18 2001-11-06 Corixa Corporation Compounds and methods for therapy of lung cancer
NZ506699A (en) * 1998-03-18 2003-12-19 Corixa Corp Polynucleotide sequences and polypeptides used in vaccines and pharmaceutical compositions for the treatment and diagnosis of lung cancer
US6297364B1 (en) * 1998-04-17 2001-10-02 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecule encoding cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2481398C2 (ru) * 2006-12-28 2013-05-10 Интернешнл Инститьют Оф Кэнсер Иммунолоджи, Инк. Hla-a*1101-ограниченный пептид wt1 и содержащая его фармацевтическая композиция
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10240209B2 (en) 2015-02-10 2019-03-26 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US11168370B2 (en) 2015-02-10 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Detecting mutations for cancer screening
US10633713B2 (en) 2017-01-25 2020-04-28 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US11479825B2 (en) 2017-01-25 2022-10-25 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments

Also Published As

Publication number Publication date
EP1169347A2 (en) 2002-01-09
YU72901A (sh) 2004-07-15
ATE399793T1 (de) 2008-07-15
IL145731A0 (en) 2002-07-25
WO2000061612A3 (en) 2001-04-26
DE60039353D1 (de) 2008-08-14
PL354348A1 (en) 2004-01-12
EA200101037A1 (ru) 2002-06-27
HUP0200760A2 (en) 2002-06-29
KR20020007354A (ko) 2002-01-26
NZ514818A (en) 2004-04-30
ES2308976T3 (es) 2008-12-16
BR0009505A (pt) 2002-06-11
CN1370182A (zh) 2002-09-18
CA2369578A1 (en) 2000-10-19
EP1169347B1 (en) 2008-07-02
MXPA01009962A (es) 2002-08-20
HK1049848A1 (zh) 2003-05-30
CZ20013527A3 (cs) 2002-10-16
JP2002543769A (ja) 2002-12-24
AU4069200A (en) 2000-11-14
WO2000061612A2 (en) 2000-10-19
EP2028190A1 (en) 2009-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA005140B1 (ru) Соединения и способы для лечения и диагностики рака легкого
ES2277432T3 (es) Compuestos y metodos para terapia y diagnosis de cancer de pulmon.
US6887660B2 (en) Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
EP1992640A1 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use
KR20020007348A (ko) 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 이의 사용 방법
KR20010083111A (ko) 전립선암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법
CA2742641A1 (en) Compounds for immunotherapy of prostate cancer and methods for their use
JP2010239970A (ja) 乳癌の処置および診断のための組成物ならびにそれらの使用方法
US6410507B1 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of breast cancer and methods for their use
US6387697B1 (en) Compositions for treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
JP2002540789A5 (ru)
US6933363B1 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US6284241B1 (en) Compounds for immunotherapy and diagnosis of colon cancer and methods for their use
JP2009195236A (ja) 乳癌の免疫療法および診断のための化合物ならびにそれらの使用のための方法
US7008772B1 (en) Compounds for immunodiagnosis of prostate cancer and methods for their use
JP4942906B2 (ja) 卵巣癌の治療および診断のための組成物および方法
EP2003201A2 (en) Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
CA2613125A1 (en) Compositions and methods for therapy and diagnosis of prostate cancer

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU