EA004789B1 - Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование - Google Patents

Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование Download PDF

Info

Publication number
EA004789B1
EA004789B1 EA200100446A EA200100446A EA004789B1 EA 004789 B1 EA004789 B1 EA 004789B1 EA 200100446 A EA200100446 A EA 200100446A EA 200100446 A EA200100446 A EA 200100446A EA 004789 B1 EA004789 B1 EA 004789B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
interferon
beta
polymer
bie
composition
Prior art date
Application number
EA200100446A
Other languages
English (en)
Other versions
EA004789B9 (ru
EA200100446A1 (ru
Inventor
Блэйк Пепински
Лаура Ранкель
Маргот Брикельмэйер
Эдриан Витти
Паула Хочман
Original Assignee
Байоджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26801696&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA004789(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Байоджен, Инк. filed Critical Байоджен, Инк.
Publication of EA200100446A1 publication Critical patent/EA200100446A1/ru
Publication of EA004789B1 publication Critical patent/EA004789B1/ru
Publication of EA004789B9 publication Critical patent/EA004789B9/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/14—Lymphokine; related peptides
    • Y10S930/142—Interferon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Полипептид бета-интерферона, содержащий бета-1а-интерферон, соединенный с полиалкиленгликолевым фрагментом, где бета-интерферон и полиалкиленгликолевый фрагмент собраны таким образом, что бета-интерферон обладает повышенной активностью относительно других терапевтических форм бета-интерферона (бета-1b-интерферона) и не показывает снижения активности при сравнении с неконъюгированным бета-1а-интерфероном. Конъюгаты данного изобретения удобно применимы как для терапевтического использования, так и для нетерапевтического, например диагностического.

Description

Применение полипептидов и белков для системного лечения конкретных заболеваний в настоящее время широко используется в медицинской практике. Роль, которую эти вещества играют в терапии, так важна, что многочисленные усилия исследователей направлены на их синтез в больших количествах с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Многие из этих полипептидов являются эндогенными молекулами, биологическое действие которых осуществляется очень эффективно и специфично.
Основной фактор, ограничивающий применимость этих белковых веществ для их намеченного применения, состоит в том, что при парентеральном введении они выводятся из организма в течение короткого времени. Это может происходить в результате протеазного метаболизма или при клиренсе с вовлечением обычных механизмов удаления белков, таких как фильтрация в почках. Пероральный путь введения этих веществ является еще более проблематичным, так как кроме протеолиза в желудке, высокая кислотность желудка разрушает их до того, как они достигнут желаемых тканеймишеней. Проблемы, связанные с этими путями введения белков, хорошо известны в фармацевтической промышленности, и в попытках решить их используются различные стратегии.
Опубликовано огромное количество работ, связанных со стабилизацией белков. Известны различные пути конъюгирования белков с полимерными материалами, включая использование декстранов, поливинилпирролидонов, гликопептидов, полиэтилен-гликоля и полиаминокислот. Имеются сообщения, что полученные в результате конъюгированные полипептиды сохраняют свою биологическую активность и растворимость в воде для парентеральных путей введения.
Интерфероны представляют собой семейство пептидов, на котором были сфокусированы многочисленные клинические исследования и усилия, предпринятые для усовершенствования способов их введения и биологического усвоения. Наличие интерферона было определено при различных клинических болезненных состояниях. Применимость бета-интерферона человека, одного из членов этого семейства, лучше всего установлена для лечения рассеянного склероза. Для лечения этого заболевания в Европе и США недавно были лицензированы две формы рекомбинантного бета-интерферона. Одна форма представляет собой бета-1аинтерферон (торговые марка и название ΑνΟΝΕΧ®, тГд. Вюдсп. 1пс., СашЬпбдс. МА), и здесь далее называемая бета-1а-интерферон или 1Р№бета-1а, или ΙΡΝ-β-1α или интерферон-в-1а, используя взаимозаменяемо. Другая форма представляет собой бета-1Ьинтерферон (торговые марка и название
ΒΑΤΑ3ΕΒΟΝ®, Ьег1ех, Вюйтопб, СА), здесь далее называемый бета-1Ь-интерферон. Бета1 а-интерферон продуцируется в клетках млекопитающих с использованием нативной последовательности гена человека и гликозилируется, тогда как бета-1Ь-интерферон продуцируется бактериями Е. со11 с использованием модифицированной последовательности гена человека, которая содержит генетически введенную замену цестеина на серин в аминокислотном положении 17 и не гликозилируется.
Ранее некоторые из авторов непосредственно сравнили относительную эффективность ίη νίίτο бета-1а-интерферона и бета-1Ьинтерферона в функциональных исследованиях и показали, что удельная активность бета-1аинтерферона приблизительно в 10 раз выше, чем удельная активность бета-1Ь-интерферона (Випке1 еί а1., 1998, Рйатш. Вез. 15: 641-649). В результате исследований, призванных идентифицировать структурную основу этих различий в активности, авторы идентифицировали гликозилирование как единственное из известных структурных отличий между продуктами, которое влияет на удельную активность. Эффект углевода был более очевидным благодаря своему стабилизирующему воздействию на структуру. Стабилизирующий эффект углевода наблюдали в экспериментах по термической денатурации и ЗЕС анализе. Отсутствие гликозилирования также коррелирует с усилением агрегации и повышенной чувствительностью к термической денатурации. Ферментативное удаление углевода из бета-1а-интерферона с помощью ΡΝΟα’ϊΒΐ Р вызывает интенсивное осаждение дегликозилированного продукта.
Эти исследования показывают, что, несмотря на сохранение одинаковой последовательности у бета-1а-интерферона и бета-1Ьинтерферона, они различны биохимически и, таким образом, многое из того, что известно о бета-1Ь-интерфероне, не может быть применено к бета-1а-интерферону, и наоборот.
Сущность изобретения
Авторы использовали преимущества гликозилированного бета-интерферона по сравнению с его негликозилированными формами. В частности, авторы разработали композицию бета-1а-интерферона с повышенной активностью по сравнению с бета-1Ь-интерфероном, которая также имеет салюторные свойства конъюгированных с ПЭГ белков, как правило, без существенной потери активности по сравнению с неконъюгированными формами бета-1аинтерферона. Так, если модификации произведены таким образом, что продукты (конъюгаты полимер-бета-1а-интерферон) сохраняют всю или большую часть своей биологической активности, в результате, могут быть получены следующие свойства: изменение фармакокинетики и фармакодинамики, что приводит к увеличению периода полужизни и изменению распре3 деления в тканях (например, способность оставаться в сосудистом русле в течение длительного периода времени), повышенная стабильность в растворе, сниженная иммуногенность, защищенность от протеолитического расщепления и последующей потери активности. Такая готовая препаративная форма является существенным достижением в фармацевтической и медицинской областях и может внести значительный вклад в лечение различных заболеваний, в которых применяется интерферон, таких как рассеянный склероз, фиброз и другие воспалительные или аутоиммунные заболевания, злокачественные опухоли, гепатит и другие вирусные заболевания. В частности, способность сохраняться в течение длительного времени в сосудистом русле позволяет использовать бета-1Ьинтерферон для подавления ангиогенеза и для проникновения через гематоэнцефалический барьер. Коме того, улучшение термической стабильности путем создания конъюгатов полимербета-1а-интерферон является преимуществом в том случае, когда в готовой препаративной форме бета-1а-интерферон используется в виде порошка для последующего применения посредством ингаляции.
Авторы использовали знание кристаллографической структуры бета-1а-интерферона и разработали конъюгат полимер-бета-1а-интерферон, в котором полимер связан с бета-1аинтерфероном в таком(их) участке(ах), которые позволяют конъюгату сохранять полную активность бета-1а-интерферона по сравнению с неконъюгированным бета-1а-интерфероном.
Один аспект настоящего изобретения представляет собой конъюгированный комплекс бета-1а-интерферона, где бета-1а-интерферон ковалентно связан с полимером, включенным как интегрированный в него участок полиалкиленгликоля.
В одном конкретном аспекте настоящее изобретение относится к физиологически активной композиции бета-1а-интерферона, содержащей физиологически активный бета-1аинтерферон, соединенный с полимером, содержащим полиалкиленгликолевый фрагмент, где бета-1а-интерферон и полиалкиленгликолевый фрагмент собраны таким образом, что физиологически активный бета-1а-интерферон в этой композиции имеет увеличенный период полужизни по сравнению с бета-1а-интерфероном самим по себе (то есть в неконъюгированной форме, без соединенного с ним полимера).
Другой аспект данного изобретения представляет собой композицию бета-1аинтерферона, содержащую физиологически активный бета-1а-интерферон, соединенный с полимером, в которой интерферон является гибридным белком, предпочтительно гибридным иммуноглобулином. В таких комплексах тесная близость с Ν-окончанием (место конъюгирования с полимером) и С-окончанием (участок слияния с 1д фрагментом) предполагает, что конъюгирование с полимером может снизить иммуногенность гибридного белка.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к физиологически активному бета-1аинтерферону, соединенному с полимером, содержащему полиалкиленгликолевый фрагмент, где бета-1а-интерферон и полиалкиленгликолевый фрагмент собраны таким образом, что физиологическая активность бета-1а-интерферона в композиции имеет повышенную активность по отношению к бета-1а-интерферону самому по себе (то есть к его неконъюгированной форме, без соединения с полимером).
Другое воплощение изобретения представляет собой конъюгированный белок бета-1аинтерферон, в котором бета-1а-интерфероновый фрагмент мутирован для получения мутеинов с избирательно повышенной антивирусной и/или антипролиферативной активностью по сравнению с немутированными формами бета-1аинтерферона.
Это изобретение относится еще к одному аспекту, а именно к стабильному, водорастворимому комплексу конъюгированного бета-1аинтерферона, содержащему физиологически активный бета-1а-интерферон, ковалентно связанный с физиологически совместимым полиэтиленгликолевым фрагментом. В таком комплексе бета-1а-интерферон может быть ковалентно связан с физиологически совместимым полиэтиленгликолевым фрагментом лабильной ковалентной связью по свободным аминокислотным группам бета-1а-интерферона, где лабильная ковалентная связь разрывается ίη νίνο биохимическим гидролизом и/или протеолизом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к дозированной форме, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и стабильный водорастворимый комплекс бета-1аинтерферона, соединенного с физиологически совместимым полиэтиленгликолем.
В другом аспекте композиции ковалентно связанного бета-1а-интерферона, такие как описанный выше, могут использовать названный бета-1а-интерферон для диагностических или ίη νίΐτο применений, где бета-1а-интерферон представляет, например, диагностический реагент для иммуноанализа или другого диагностического применения или применения не ίη νίνο. При подобном нетерапевтическом применении комплексы настоящего изобретения могут полезно использоваться в качестве стабилизирующих композиций, которые могут, например, представлять препарат в соответствующих растворителях или входить в другую готовую препаративную форму, основанную на растворе, для обеспечения стабильной композиционной формы, обладающей повышенной устойчивостью к разрушению.
Модификация бета-1а-интерферона с нетоксичным полимером может обеспечить опре5 деленные преимущества. Если модификация проводится способом, в котором продукты (конъюгаты полимер-бета-1а-интерферон) сохраняют большую часть своей биологической активности, в результате, могут быть получены следующие свойства: измененная фармакокинетика и фармакодинамика, приводящая к повышению периода полужизни и к изменению распределения в тканях (например, к способности находиться в сосудистом русле в течение длительного периода времени), повышенная стабильность в растворе, сниженная иммуногенность, защита модифицированного бета-1аинтерферона от протеолитического переваривания и последующей потери активности; повышенная термическая стабильность, приводящая к более эффективной готовой препаративной форме порошкообразного бета-1а-интерферона для перорального применения или для ингаляции.
Описанный выше бета-1а-интерферон с улучшенными свойствами может быть эффективен в терапии при пероральном, аэрозольном или парентеральном применении. При использовании модифицированного бета-1аинтерферона также возможны другие пути введения, такие как назальный или чрескожный.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ подавления ангиогенеза и неоваскуляризации, включающий применение эффективного количества композиции по данному изобретению. В результате повышения содержания и длительности нахождения интерферона в сосудистом русле, конъюгированный с ПЭГ продукт изобретения должен быть особенно эффективным в качестве ингибитора ангиогенеза.
При нетерапевтическом (например, диагностическом) применении также предполагается конъюгирование диагностического и/или реакционноспособного видов бета-1а-интерферона. Полученный в результате конъюгированный агент является устойчивым к разрушающим факторам окружающей среды, включая опосредованный растворителем или раствором процесс разложения. Как результат такой повышенной устойчивости и повышенной стабильности бета-1а-интерферона, стабильность активного ингредиента способна к значительному увеличению, с сопутствующей способностью композиции, содержащей бета-1аинтерферон, к конкретному конечному использованию, для которого она предназначена.
Другие аспекты, черты и модификации данного изобретения будут более очевидны из последующего описания и формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Связывание аланинзамещенных мутантов бета-1а-интерферона с димерным гибридным белком, содержащим внеклеточный домен рецепторной цепи интерферона I,
ΙΓΝΑΒ2/Ι§ (ΙΓΝΑΚ.2 эктодомен, гибридный с константным доменом 1дО1 человека).
Сродство к связыванию аланинзамещенных мутантов ΙΓΝ (А1-Е) для ΙΓΝΑΚ2 рецепторной цепи было определено, как описано в примере 1 (подраздел Ό). Гистограмма представляет их связывающие свойства в этом исследовании относительно дикого типа Ык-ШЫ-бета (% д.т.). Значения % д.т. были рассчитаны как (сродство дикого типа Ы8-ШЫ-бета)/сродство мутанта ΙΓΝ-бета х 100. Показан % д.т. (О) для единичных экспериментов (п=3) и среднее значение % д. т. (х) для множества экспериментов. Мутанты А2, АВ1, АВ2, и Е не связывали ΙΓΝΑΒ2/Γο в 500-кратно более высоких концентрациях, чем д.т. Ηίκ-ΙΓΝ-бета ЕС 50 (*).
Фиг. 2. Связывание аланинзамещенных мутантов бета-1а-интерферона с рецепторным комплексом поверхности клетки интерферона Ι (ΙΕΝΑΚ.1/2 комплекс), экспрессирующим на клетках лимфомы Дауди-Беркитта.
Рецепторсвязывающие свойства аланинзамещенных мутантов (А1-Е) были определены при использовании основанного на ГАС8 анализа связывания с рецепторами поверхности клетки, как описано в примере 1 (подраздел Ό). Гистограмма представляет их сродство к связыванию рецептора относительно дикого типа ЫкΙΓΝ-бета (% д.т.). % д.т. для каждого мутанта был рассчитан как (сродство дикого типа ЫкΙΓΝ-бетаУсродство мутанта ΙΓΝ-бета х 100. Показаны значения % д. т. (О) для единичного эксперимента и среднее значение % д. т. для множества экспериментов (х).
Фиг. 3. Антивирусная активность аланинзамещенных мутантов бета-1а-интерферона.
Антивирусная активность аланинзамещенных мутантов (А1-Е) была определена на человеческих А549 клетках, обработанных ЕМС вирусом, как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом исследовании относительно дикого типа Ηίκ-ΙΓΝ-бета (% д.т.). % д.т. был рассчитан как концентрация д.т. Ιιίκ-ΙΡΝ-бета [50% сре]/концентрация мутанта ΙΓΝ-бета [50% сре]х100. Показаны % д. т. (О) для множества анализов и среднее значение экспериментальных данных (х).
Фиг. 4. Антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантов бета-1аинтерферона.
Антипролиферативная активность аланинзамещенных мутантов (А1-Е) была определена на клетках лимфомы Дауди-Беркитта, как описано в примере 1 (подраздел Е). Гистограмма представляет их активность в этом исследовании относительно дикого типа Ιιίκ-ΙΡΝ-бета (% д.т). % д.т. был рассчитан как концентрация д.т. Ιιίκ-ΙΡΝ-бета [ингибирование 50% роста]/концентрация мутанта ΙΓΝ-бета [ингибирование 50% роста]х100. Показаны % д.т. (О) для
Ί множества анализов и среднее значение экспериментальных данных (х).
Фиг. 5. Относительные антивирусная и антипролиферативная виды активности аланинзамещенных мутантов бета-1а-интерферона.
Сравнивалась относительная активность аланинзамещенных мутантов (А1-Е) в противовирусном (х ось) и антипролиферативном (у ось) исследовании. Средний процент дикого типа Ык-ШЫ-бета (% д.т., х), представленный на фиг. 3 и 4, использовался для сравнения. Те мутанты, которые показывают изменение координат по обеим активностям, опускаются на вертикальную линию. Мутанты, которые показывают изменение в антивирусной активности, которая является не пропорциональной изменению пролиферативной активности, значительно отходят вниз от диагональной линии (ΌΕ1. Ό, С1). Значение было определено из рассмотрения допустимых отклонений, свойственных среднему % д.т. использованных значений.
Фиг. 6. Локализация участка конъюгации с ПЭГ через пептидное картирование.
Конъюгированный с ПЭГ и не модифицированный в-1а-интерфероны были подвергнуты анализу пептидного картирования. Образцы переваривались эндопротеиназой Ьук-С и подвергались ВЭЖХ с обратной фазой на С4 колонке. Колонка промывалась градиентом 0-70% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте. Эфлюент из колонки контролировался при 214 нм. Набор а, не модифицированный интерферон-в-1а. Набор Ь, конъюгированный с ПЭГ в-1а-интерферон. Стрелки отмечают положение элюирования Ν-терминального эндопротеиназного Ьук пептида в-1а-интерферона, содержащего аминокислотные остатки 1-19.
Фиг. 7. Антивирусная активность конъюгированного с ПЭГ и неконъюгированного бета- а-интерферона.
Активность бета-1а-интерферона или конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона в концентрациях, обозначенных на Х оси, была оценена в антивирусных исследованиях, использующих клетки карциномы легкого человека (А549), обработанные вирусом энцефаломиокардита. После инкубации с вирусом в течение дней жизнеспособные клетки были окрашены МТТ, чашки читались при 450 нм, и поглощение, отражающее жизнеспособность клетки, показано на Υ оси. Допустимые отклонения показываются как отрезок погрешности. Концентрация бета-1а-интерферона или конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона, которая обеспечивает 50% гибель вируса (50% цитопатический эффект) (50% максимум ΘΌ450) составляла приблизительно 11 пг/мл, и 50% цитопатический эффект для конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона составил приблизительно 11 пг/мл.
Фиг. 8. Оценка стабилизации конъюгатов с использованием термической денатурации.
Конъюгированный с ПЭГ бета-1аинтерферон и необработанный контроль бета1а-интерферона в 20 мМ НЕРЕ8 рН=7,5, 20 мМ ЫаС1 нагревали с установленной скоростью 1°/мин. За денатурацией следовал контроль изменения поглощения при 280 нм. (а) Не модифицированный бета-1а-интерферон; (Ь) конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон.
Фиг. 9. Измерения антивирусной активности бета-1а-интерферона в плазме мышей, обработанных бета-1а-интерфероном или конъюгированным с ПЭГ бета-1а-интерфероном.
Мышам было введено внутривенно или 50000 единиц бета-1а-интерферона, или 50000 единиц конъюгированного с ПЭГ бета-1аинтерферона (содержащего 20К ПЭГ). Кровь от этих мышей получена ретро-орбитально в различное время после инъекции интерферона, как обозначено на Х оси. Имеются по крайней мере 3 мыши, обескровленные в каждый указанный момент времени, и плазму получали и замораживали до момента оценки активности бета-1аинтерферона в антивирусных исследованиях, использующих клетки карциномы легкого человека (А549), обработанные вирусом энцефаломиелокардита. Жизнеспособные клетки были окрашены раствором МТТ, чашки читались при 450 нм для определения поглощения, отражающего жизнеспособность клетки и активность бета-1а-интерферона. Для каждой чашки были построены калибровочные кривые с использованием бета-1а-интерферона, которые использовались для определения величины активности бета-1а-интерферона в каждом образце. Представлены данные от отдельных животных.
Фиг. 10. Полная последовательность ДНК гистидин-меченного гена бета-интерферона и его белкового продукта.
Показаны полные последовательности ДНК (8ЕО ГО ΝΟ: 1) и белка (8ЕО ГО ΝΟ: 2) гистидин-меченного 1ЕЫ-бета-1а. Отщепленная сигнальная последовательность УСАМ-1 оставляет 3 остатка аминоокончаний (8етО1уО1у) выше гистидиновой метки (Н186, положения 49). Последовательность линкера энтерокиназы (АкрАкрАкрАкрЬук) отделена от метки гистидина спейсером (положения 10-12, 8ет8етО1у). Исходная последовательность белка 1ЕЫ-бета-1а перекрывает положения (Ме118-А§п183).
Подробное описание изобретения
Определения
При использовании здесь термин ковалентно связанный означает, что определенные фрагменты являются или непосредственно ковалентно связанными друг с другом, или связаны не непосредственно, а через промежуточный фрагмент или фрагменты, такие как мостик, спейсер, или линкерный фрагмент или фрагменты.
Интерферон - интерферон (также называемый ΙΡΝ) представляет собой небольшой видоспецифичный одноцепочечный полипептид, продуцирующийся клетками млекопитающих в ответ на воздействие ряда индукторов, таких как вирусы, полипептиды, митогены и т.п. Наиболее предпочтительным интерфероном, использующимся в данном изобретении, является гликозилированный человеческий бетаинтерферон, который гликозилирован по 80 остатку (Аки 80) и который предпочтительно получают посредством технологии рекомбинантных ДНК. Этот предпочтительный гликозилированный бета-интерферон имеет названия бета-1а-интерферон, или ΙΡΝ-бета-Ха, или ΙΡΝβ-1α, или интерферон-бета-1а, или интерферон-в-1а, используемые взаимозаменяемо. Предполагается, что термин бета-1аинтерферон включает в себя его мутанты (например, пример 1), при условии, что эти мутанты также гликозилированы по 80 остатку (Акп 80). Известны методики рекомбинантных ДНК для синтеза белков, включая интерфероны. Смотри, например, патент США 4399216, 5149636, 5179017 (Αχ^ е! а1.) и 4470461 (КаиГтап).
Предпочтительные полинуклеотиды бета1 а-интерферона, которые могут использоваться в способах настоящего изобретения, получены из последовательностей гена бета-интерферона дикого типа различных позвоночных животных, предпочтительно млекопитающих, при использовании способов, известных специалистам в этой области, таких как способы, описанные в следующих патентах США: патент США 5641656 (выданный 24 июня 1997: ΌΝΑ епсобшд асаап 1уре I йИегГегоп рторго!еш апб та!ите асаап 1уре I ш1егГетоп), патент США 5605688 (25 февраля 1997 - тесотЬшап!: бод апб йогке 1уре I ш1етГегопк); патент США 5231176 (27 июля 1993, ΌΝΑ то1еси1е епсобшд а йитап 1еикосу!е ш1егГегоп); патент США 5071761 (10 декабря 1991, ΌΝΑ кесщепсе собшд Гот киЬ-кесщепсек о£ йитап 1утрйоЬ1ак!о1б ЫегГегопк Ру1РН-а1рРа-2 апб ЬуШН-а1рйа-3); патент США 4970161 (13 ноября 1990, ΌΝΑ кесщепсе собшд Гот йитап т1етГетоп-датта); патент США 4738931 (19 апреля 1988, ΌΝΑ согИашшд а йитап т1етГетоп Ье1а депе); патент США 4695543 (22 сентября 1987, йитап а1рйа-ш1егГетоп Сх-1 депе) и патент США 4456748 (26 июня 1984, ΌΝΑ епсобшд кпЬ-кесщепсек о£ бШетеп!, па!ига11у, оссштшд 1еикосу!е йИегГегопк).
Мутанты бета-1а-интерферона могут использоваться в соответствии с данным изобретением. Мутации получают, используя общеизвестные способы направленного мутагенеза, известные специалистам в области техники. Кроме того, данное изобретение предоставляет функционально эквивалентные полинуклеотиды бета-1а-интерферона, которые кодируют функционально эквивалентные полипептиды бета-1аинтерферона.
Первый полинуклеотид, кодирующий бета-1а-интерферон, является функционально эквивалентным по отношению ко второму полинуклеотиду, кодирующему бета-1аинтерферон, если он удовлетворяет по крайней мере одному из следующих условий:
(a) : функциональный эквивалент является первым полинуклеотидом, который гибридизируется со вторым полинуклеотидом при стандартных условиях гибридизации и/или является вырожденным по отношению к последовательности первого полинуклеотида. Наиболее предпочтительно, он кодирует мутантный интерферон, имеющий активность бета-1а-интерферона;
(b) функциональный эквивалент является первым полинуклеотидом, который кодирует экспрессию аминокислотной последовательности, кодируемой вторым полинуклеотидом.
В изложении сущности изобретения термин интерферон включает, не ограничиваясь этим, перечисленные выше агенты, а также их функциональные эквиваленты. Таким образом, при использовании здесь термин функциональный эквивалент относится к белку бета-1аинтерферона или полинуклеотиду, кодирующему белок бета-1а-интерферона, который имеет такое же или улучшенное полезное воздействие на млекопитающего-реципиента, как и интерферон, который считают его функциональным эквивалентом. Среднему специалисту в данной области понятно, что функционально эквивалентный белок может быть получен с помощью рекомбинантных технологий, например путем экспрессии функционально эквивалентной ДНК. Соответственно, настоящее изобретение охватывает белки бета-1а-интерферона, которые кодируются встречающимися в природе ДНК, а также искусственными ДНК, которые кодируют тот же самый белок, который кодируется встречающейся в природе ДНК. Благодаря вырожденности кодирующих нуклеотидных последовательностей для кодирования бета-1аинтерферона могут использоваться другие полинуклеотиды. Они включают целые последовательности или их части, которые заменены на отличные кодоны, которые кодируют тот же самый аминокислотный остаток последовательности, таким образом вызывая молчащую замену. Такие измененные последовательности рассматриваются как эквиваленты данных последовательностей. Например, Рйе (Ρ) кодируется двумя кодонами, ТТС или ТТТ, Туг (Υ) кодируется ТАС или ТАТ и Н1к (Н) кодируется САС или ΟΑΤ. С другой стороны, Тгр (V) кодируется единственным кодоном, ТОО. Соответственно, понятно, что для данной последовательности ДНК, кодирующей конкретный интерферон, будет много вырожденных последовательностей ДНК, которые будут его кодировать. Эти выро жденные последовательности ДНК рассматриваются в объеме данного изобретения.
Гибрид - относится к колинеарной связи двух или большего количества белков или их фрагментов через их индивидуальные пептидные каркасы посредством генетической экспрессии полинуклеотидной молекулы, кодирующей эти белки. Предпочтительно, чтобы белки или их фрагменты происходили из различных источников. Так, предпочтительные гибридные белки включают белки бета-1аинтерферона или фрагмент, ковалентно связанный со вторым фрагментом, который не является интерфероном. Конкретно, бета-1аинтерферон/1д гибрид является белком, включающим молекулу бета-1а-интерферона данного изобретения, или его фрагмент, связанный с Ν’концом цепи иммуноглобулина, причем Νконцевая часть иммуноглобулина заменена на бета-1а-интерферон.
Термин рекомбинант при использовании здесь означает, что белок получен из рекомбинантных, экспрессирующих систем млекопитающего. Белок, экспрессирующийся в большинстве культур бактерий, например Е. сой, не будет гликозилирован, так что эти экспрессирующие системы не являются предпочтительными. Белок, экспрессирующийся в дрожжах, может содержать олигосахаридные структуры, которые отличаются от экспрессированных в клетках млекопитающих.
Термин биологически активный при использовании в данном описании для характеристики бета-1а-интерферона означает, что конкретная молекула гомологична по аминокислотным последовательностям с воплощениями настоящего, раскрытого здесь изобретения в достаточной степени, чтобы быть способной к антивирусной активности, что измеряется в таком ίη νίΐτο антивирусном исследовании, какой показан в примере 1 (смотри ниже).
Термин терапевтическая композиция при использовании здесь определяется как композиция, включающая белки изобретения и другие физиологически совместимые ингредиенты. Терапевтическая композиция может содержать наполнители, такие как вода, минералы и носители, такие как белок.
Термин эффективное количество агента изобретения означает то количество, которое дает результат или оказывает влияние на конкретное состояние, подвергающееся лечению.
Аминокислота - мономерная единица пептида, полипептида или белка. Существует 20 аминокислот, обнаруженных в природных пептидах, полипептидах и белках, все из которых являются Ь-изомерами. Термин также включает аналоги аминокислот и Ό-изомеры аминокислот белков и их аналоги.
Модифицированная аминокислота представляет собой природную или неприродную аминокислоту, в которой обычно существую щая боковая цепь или концевая группа изменена в результате химической реакции. Такие модификации включают, например, гаммакарбоксилирование, бета-карбоксилирование, сульфатирование, сульфонирование, фосфорилирование, амидизацию, этерификацию, Νацетилирование, карбобензилирование, тозилирование и другие модификации, известные в области техники. Производный полипептид представляет собой полипептид, содержащий одну или большее количество производных аминокислот.
Термин белок означает любой полимер, состоящий по существу из любых из этих 20 аминокислот. Хотя полипептид часто используется по отношению к большим полипептидам, а пептид часто используется по отношению к небольшим полипептидам, использование этих терминов в технике различно. Термин белок при использовании здесь относится к пептидам, белкам и полипептидам, если не указано другое.
Мутантная форма обозначает любое изменение в генетическом материале организма, в особенности любое изменение (то есть делеция, замещение, добавление или альтерация) в полинуклеотидной последовательности дикого типа или любое изменение в белке дикого типа. Термин мутеин является взаимозаменяемым с термином мутантная форма.
Дикий тип - встречающаяся в природе полинуклеотидная последовательность экзона белка, или ее фрагмент, или последовательность белка, или ее фрагмент, соответственно, как они обычно существуют ίη νίνο.
Стандартные условия гибридизации означают условия солевого состава и температурные условия, в основном, эквивалентные 0,5 х 88С до около 5 х 88С и 65°С и для гибридизации и промывки. Термин стандартные условия гибридизации при использовании здесь соответственно означает прикладное определение и охватывает диапазон условий гибридизации. Более строгие условия могут, например, включать гибридизацию с буфером для скрининга бляшек (0,2% поливинилпирролидона, 0,2% Е1со11 400; 0,2% бычьего сывороточного альбумина, 50 мМ Трис-НС1 (рН 7,5); 1 М №С1; 0,1% пирофосфата натрия; 1% 8Ό8); 10% сульфата декстрана, и 100 мкг/мл денатурированной, разрушенной ультразвуком ДНК спермы лосося при 65°С в течение 12-20 ч, и промывку 75 мм №С1/7,5 мМ цитрата натрия (0,5х88С)/1% 8Ό8 при 65°С. Более мягкие условия могут, например, включать гибридизацию с буфером для скрининга бляшек, 10% сульфата декстрана и 110 мкг/мл денатурированной, разрушенной ультразвуком ДНК спермы лосося при 55°С в течение 12-20 ч, и промывку 300 мМ №С1/30 мМ цитрата натрия (2,0х88С)/1% 8Ό8 в 55°С. Смотри также СштеШ РгоЮсоЕ ίη Мо1еси1аг Βίо1оду, Ло11п АПеу & 8опз, 1пс. №\ν Уогк, 8есБопз 6.3.1-6.3.6 (1989).
Последовательность, контролирующая экспрессию - полинуклеотидная последовательность, которая контролирует и регулирует экспрессию генов, будучи оперативно связана с этими генами.
Оперативно связанный - полинуклеотидная последовательность (ДНК, РНК) является оперативно связанной с последовательностью, управляющей экспрессией, если управляющая экспрессией последовательность контролирует и регулирует транскрипцию и трансляцию этой полинуклеотидной последовательности. Термин оперативно связанный включает наличие соответствующего стартового сигнала (например, АТС) в начале полинуклеотидной последовательности, которая должна экспрессироваться, и сохранение правильной рамки считывания для обеспечения экспрессии полинуклеотидной последовательности под контролем последовательности, контролирующей экспрессию, и продукцию целевого полипептида, кодируемого этой полинуклеотидной последовательностью.
Экспрессирующий вектор - полинуклеотид, такой как ДНК-плазмида или фаг (наряду с другими обычными примерами), который допускает экспрессию по крайней мере одного гена, когда вектор экспрессии введен в клеткухозяина. Вектор может быть способным или не способным к репликации в клетке.
Термин выделенный (использованный наряду с существенно чистый) - когда применяется в отношении нуклеиновой кислоты, то есть полинуклеотидных последовательностей, которые кодируют полипептиды, означают РНК- или ДНК-полинуклеотид, часть геномного полинуклеотида, кДНК или синтетического полинуклеотида, который благодаря своему происхождению или получению (ί) не связан со всем полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, присутствует в клеткехозяине как вектор экспрессии, или его части); или (ίί) связан с нуклеиновой кислотой или другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Под термином выделенный, кроме того, понимают полинуклеотидную последовательность, которая (ί) амплифицируется ίη νίΐτο, например, полимеразной цепной реакцией (РСВ); (ίί) является химически синтезируемой; (ίίί) рекомбинантно продуцируется клонированием; или (ίν) очищена как расщеплением, так и разделением в геле.
Таким образом, существенно чистая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту, которая не соседствует непосредственно с одной или обеими кодирующими последовательностями, с которыми она обычно соседствует в природном геноме организма, из которого нуклеиновая кислота получена. Существенно чистая ДНК также включает рекомбинантную ДНК, которая является частью гибрид ного гена, кодирующего дополнительные последовательности.
Термин выделенный (используемый наряду с существенно чистый), когда он применен по отношению к полипептидам, означает полипептид или его фрагмент, который благодаря своему происхождению или манипуляции (ί) присутствует в клетке-хозяине как продукт экспрессии фрагмента вектора экспрессии; или (ίί) связан с белком или другим химическим фрагментом, отличным от того, с которым он связан в природе; или (ίίί) не встречается в природе. Под выделенный, кроме того, понимается белок, который (ί) химически синтезирован; или (ίί) экспрессирован в клетке-хозяине и очищен от примесных белков. Термин обычно означает полипептид, который был отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он встречается в природе. Предпочтительно полипептид также отделен от веществ типа антител или гелеобразной матрицы (полиакриламид), которые используются для его очистки.
Термин гетерологичный промотер при использовании здесь представляет собой промотер, который в природных условиях не связан с геном или очищенной нуклеиновой кислотой.
Гомологичный при использовании здесь является синонимом термину идентичный и относится к подобию последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же основной или аминокислотной мономерной субъединицей (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином или положение в каждом из двух полипептидов занято лизином), то соответствующие молекулы являются гомологичными по этому положению. Процент гомологии двух последовательностей определяют как число парных или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленное на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях являются равносильными или гомологичными, то две последовательности являются гомологичными на 60%. Например, последовательности ДНК СТСАСТ и САССТТ гомологичны на 50% (3 из 6 общих положений являются равносильными). Обычно сравнение проводят при выравнивании двух последовательностей, вытянутых в линию, с получением максимальной гомологии. Такое совмещение может обеспечиваться при использовании, например, метода №еб1етап е1 а1., 1. Μο1. Βίο1. 48:443-453 (1970), удобно осуществляемого такими компьютерными программами, как Айдп ргодгат (ΌΝΑδΙαΓ. 1пс). Гомологичные последовательности имеют идентичные или подобные аминокислотные остатки, где подобные остатки представляют собой консервативные замены на соответствующие аминокислот ные остатки в выровненной последовательности отнесения, или разрешенные точковые мутации. В этом отношении, консервативные замены остатков в упомянутой последовательности представляют собой те замены, которые являются физически или функционально подобными упомянутым остаткам, например, которые имеют сходные размер, форму, электрический заряд, химические свойства, включая способность формировать ковалентные или водородные связи, или им подобные. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются такие, которые соответствуют критериям, определенным для принятой точковой мутации в ЭауйоГГ е! а1., 5: Лбаз оГ Рто!ет 8ес|испсс аиб 81гис1игс. 5: 8ирр1. 3, сйар!ет 22: 354352, Ναι. Вютеб. Вез. Еоиибабои, ^азЫид!ои, Ό.Ο (1978).
Термин полинуклеотидная последовательность и нуклеотидная последовательность здесь также используются взаимозаменяемо.
Ангиогенез и неоваскуляризация означают в самом широком смысле образование новых кровеносных сосудов. В частности, ангиогенез также относится к образованию новых сосудов в области опухоли.
'ΊΕΝΑΒ2, 'ΊΕΝΑΒ1, 'ΊΕΝΑΒ1/2 относится к белкам, которые, как известно, составляют рецептор поверхности клетки интерферона I. Внеклеточный фрагмент (эктодомен) цепи ΙΕΝΑΚ2 может один связывать интерферон альфа или бета.
Технология настоящего изобретения использует, если не указано иное, общепринятые методики биологии клетки, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, белковой химии и иммунологии, которые входят в уровень техники. Такие методики описаны в литературе. Смотри, например, Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬогаЮгу Маииа1, 2иб ебйюи (8атЬгоок, Етбзсй аиб Машабз, ебз.), Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз, 1989; ΌΝΑ С1ошид, Уо1итез I аиб II (Ό.Ν. С1оует, еб.), 1985; О1щогшс1еойбе 8уи1йез1з, (М.1. Саб, еб.), 1984; патент США № 4683195 (МиШз е! а1.,); ШсШс Лаб НуЬпб|/а1юг1 (Β.Ό. Натез аиб 8.1. Шддтз, ебз.), 1984; ТтаизсбрИои аиб Ттаиз1абои (Β.Ό. Натез аиб 8.1. Шддшз, ебз.), 1984; Сибиге оГ Αη^та1 Се11з (ВТ. Егезйиеу, еб.), ΑΡπι В. Ызз, йс., 1987; !ттоЬ|1|/еб Се11з аиб Еи/утез, [ВЬ Ргезз, 1986; Α Ргасбса1 Сшбе !о Мо1еси1аг С1ошид (Β. РегЬа1), 1984; Мебюбз ш Еи7уто1оду, Уо1итез 154 аиб 155 (\Уи е! а1., ебз), Αсабет^с Ргезз, Νονν Уогк; Сеие ТгаизГег Уес!огз Гог Маттабаи Се11з (ЕН. Мб1ег аиб М.Р. Са1оз, ебз.), 1987, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу; Iттииосйет^са1 Ме1йобз т Се11 аиб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег аиб ^а1кет, ебз.), Αсабет^с Ргезз, Ьоибои, 1987; НаибЬоок оГ Ехрептеи! ^тиио^^у, Уо1итез НУ (Э.М. \Уеб аиб С.С. В1аскте11, ебз.), 1986; Машри1абид 111е Моизе
ЕтЬгуо, Со1б 8ргтд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз,
1986.
Бета-интерферон
Бета-1а-интерферон пригоден в качестве агента для лечения, вызова ремиссии, или ослабления болезненного состояния, физиологического состояния, симптомов или этиологических факторов, или для их оценки или диагностики. Термин также относится к бета-1аинтерферону, который сам по себе является частью гибридного белка, такого как гибридный белок иммуноглобулин-бета-1а-интерферон, как описано в совместно поданных заявках, серийный номер 60/104572 и 60/120161. Получение гибридных белков обычно хорошо известно квалифицированным специалистам в этой области техники.
Авторы обнаружили уникальный(е) участок(ки) для присоединения полимера, которое не уничтожало бы функцию бета-1аинтерферона. Кроме того, авторы также использовали способы сайт-направленного мутагенеза для независимого исследования участка(ов) для присоединения полимера (смотри пример 1). Вкратце, авторы предприняли мутационный анализ человеческого бета-1а-интерферона с целью картирования остатков, необходимых для активности и рецепторного связывания. Доступность 3-Ό кристаллической структуры бета1а-интерферона человека (смотри выше и пример 1) позволяет нам идентифицировать, для замещения аланина (или серина), подвергнутые растворению остатки, доступные для рецепторного связывания интерферона бета и сохранить аминокислоты, включенные в межмолекулярные связи. Набор 15 изученных аланиновых мутаций был разработан для замещения между вторым и восьмым остатками по отдельным областям каждой из спиралей (А, В, С, Ό, Е) и петель (АВ1, АВ2, АВ3, СЭ1, СЭ2, ΌΕ1, ΌΕ2) бета-1а-интерферона. Смотри пример 1.
Амино-терминальная метка гистидина (Ыз метка) была включена для аффинной очистки мутантов, экспрессирующих клетки млекопитающего, (фиг. 10 и 8ЕО Ш ΝΟ: 1 и 2 для кДНК и выведенных последовательностей аминокислоты, соответственно). Функциональные последствия этих мутаций оценены в антивирусном и антипролиферативном исследовании. Анализ нерадиоактивного связывания был разработан для анализа этих мутантов на их связывание с рецептором интерферона бета клеточной поверхности (ΣΕΝΑΒ1/2 рецептор поверхности клетки). Кроме того, ΕΕΚΑ анализ, использующий гибридный белок !ΕΝΑΒ2эктодоменДд для связывания интерферона, применялся для картирования взаимодействия поверхностей между бета-1а-интерфероном и !ΕΝΑΒ2 (смотри пример 1). Эти мутационные анализы продемонстрировали, что Ν- и Сокончания находятся в части молекулы бета интерферона, не существенные для связывания рецептора или биологической функции.
Мутанты, кроме того, представляют различные фрагменты бета-1а-интерферона данного изобретения, которые могут быть особенно полезны, поскольку они проявляют новые свойства, не обнаруживаемые в диком типе бета-1аинтерферона (смотри пример 1). Авторы идентифицировали три типа эффектов, вызванные целенаправленным мутагенезом. Эти эффекты могут быть полезны в некоторых случаях для разработки лекарственного средства интерферона. Три типа эффектов представляют собой следующие: (а) мутанты с более высокой антивирусной активностью, чем у дикого типа бета1а-интерферона (например мутант С1); (Ь) мутанты, которые проявляют активность как в антивирусном, так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой относительно антивирусной активности, при сравнении с диким типом бета-1а-интерферона (например, мутанты С1, Ό и ΌΕ1); и (с) функциональные антагонисты (например, А1, В2, СЭ2 и ΌΕ1), которые проявляют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими относительно рецепторного связывания при сравнении с диким типом бета-1а-интерферона.
Фрагмент полимера
В широких пределах области действия настоящего изобретения, отдельная молекула полимера может использоваться для конъюгирования с бета-1а-интерфероном, хотя также предполагается, что также может присоединяться более чем одна молекула полимера. Композиции конъюгированного бета-1а-интерферона данного изобретения могут находить применение как при использовании ίη νίνο, так и не ίη νίνο. Кроме того, известно, что конъюгированный полимер может использовать любые другие группы, фрагменты или другие конъюгированные виды как соответствующие конечному применению. Например, это может быть полезно в некоторых применениях для ковалентного связывания с полимером функционального фрагмента, передающего полимеру устойчивость к УФ-разложению, или антиоксидантные свойства, или другие свойства или характеристики. Еще одним примером может быть выгодная при некоторых применениях функционализация полимера, что делает его реактивноспособным или способным в особенности к перекрестному связыванию для увеличения различных свойств или характеристик полностью конъюгированного материала. Соответственно, полимер может обладать любыми функциональными возможностями, повторяющимися группами, связями или другими составными частями структуры, которые не препятствуют эффективности композиции конъюгированного бета-1а-интерферона в его назначении. Другие цели и преимущества существующего изобретения будут более очевидны из последующего раскрытия и формулы изобретения.
Иллюстративные полимеры, которые могут полезно использоваться для достижения этих желательных характеристик, описаны здесь ниже в схемах реакции примеров. В применениях ковалентно связанного пептида полимер может быть функционализирован и затем соединен со свободной(ыми) аминокислотой(ами) пептида(ов) с образованием лабильных связей.
Бета-1а-интерферон наиболее предпочтительно конъюгирован через терминальную реактивную группу на полимере, хотя конъюгаты могут также быть разветвленными от нетерминальных реактивных групп. Полимер с реактивной(ыми) группой(ами) называется здесь как активированный полимер. Реактивная группа выборочно реагирует со свободными аминоили другими реактивными группами белка. Активированный(е) полимер(ы) взаимодействует(ют) таким образом, что соединение может происходить в любой доступной аминогруппе бета-1а-интерферона, такой как альфааминогруппы или эпсилон-аминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, соответственно активированные карбонильные группы, гидроксильные, гуанидильные, окисленные углеводные фрагменты и меркаптогруппы бета-1а-интерферона (если они доступны) могут также использоваться как место присоединения.
Хотя полимер может быть присоединен в любом участке молекулы бета-1а-интерферона, наиболее предпочтительным участком для связи полимера является Ν-конец бета-1аинтерферона. Второй участок находится в или около С-конца и через фрагменты сахара. Таким образом, изобретение рассматривает в качестве своего наиболее предпочтительного воплощения (ί) Ν-концевые связанные полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона; (ίί) Сконцевые связанные полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона; (ш) соединенные с сахаром конъюгаты полимерных конъюгатов; (ίν) а также Ν-, С- и соединенные с сахаром полимерные конъюгаты гибридных белков бета-1аинтерферона.
Обычно используют от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 молей активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество представляет баланс между максимальным увеличением степени реакции при минимизации неспецифичных модификаций продукта, в то же самое время определяя химическую структуру, которая позволяет сохранить оптимальную активность, одновременно оптимизируя, если возможно, период полужизни белка. Предпочтительно сохранение по крайней мере прибли зительно 50% биологической активности белка, и наиболее предпочтительно 100% сохранение.
Реакции могут проводиться любым соответствующим способом, используемым для взаимодействия биологически активных веществ с инертными полимерами, предпочтительно при рН около 5-7, если реактивные группы находятся на альфа-аминогруппе Ν-конца. Обычно процесс включает подготовку активированного полимера (который может иметь по крайней мере одну концевую гидроксильную группу) и последующую реакцию белка с активированным полимером для получения растворенного белка, пригодного для получения готовой препаративной формы. Вышеупомянутая реакция модификации может проводиться несколькими способами, которые могут включать один или большее количество этапов.
Как упомянуто выше, наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения используют Ν-конец бета-1а-интерферона для связи с полимером. Соответствующие способы доступны для выборочного получения Νконцевого модифицированного бета-1аинтерферона. Примером одного способа является восстановительное гидроалкилирование, в котором используется дифференциальная реактивная способность различных типов первичных аминогрупп (эпсилон-аминогруппы на лизине против аминогрупп на Ν-концевом метионине), доступных для получения производных на бета-1а-интерфероне. При соответствующих условиях отбора может быть достигнуто, в основном, селективное получение производных бета-1а-интерферона на его Ν-конце с карбонильной группой, содержащей полимер. Реакция проводится при таком рН, который позволяет пользоваться преимуществом рКа различий между эпсилон-аминогруппами остатков лизина и таковых альфа-аминогруппы Ν-концевого остатка бета-1а-интерферона. Этот тип химического строения известен специалистам в уровне техники.
Авторы использовали схему реакции, в которой эта избирательность поддерживается проведением реакции при низком рН (обычно 5-6) при условиях, где ПЭГ-альдегидный полимер взаимодействует с бета-1а-интерфероном в присутствии цианоборгидрида натрия. Это следует после очистки ПЭГ-бета-1а-интерферона и анализа с 8Ό8-ΡΑΟΕ, ΜΑΕΌΙ масс-спектрометрией и секвенирования/картирования пептида, давая в результате бета-1а-интерферон, Ν-конец которого специфично направляется фрагментом ПЭГ.
Кристаллическая структура бета-1аинтерферона такова, что Ν- и С-концы расположены близко к друг другу (смотри Кагрикак с1 а1., 1997, Ргос. №б. Асаб. 8сР 94: 11813-11818). Таким образом, модификации С-конца бета-1аинтерферона должны также иметь минимальное влияние на его активность. В то время как не имеется никакой простой химической стратегии для нацеливания полиалкиленгликолевого полимера типа ПЭГ на С-конец, легко генетически сконструировать участок, который может использоваться как мишень для полимерного фрагмента. Например, введение Сук в участок, который находится в или около С-конца, привело бы к специфической модификации с использованием малеимида, винил-сульфона или галогенацетат-активированного полиалкиленгликоля (например, ПЭГ). Эти производные могут использоваться конкретно для модификации проектируемых цистеинов благодаря высокой избирательности этих реактивов для Сук. Другие стратегии, такие как введение метки гистидина, которая может являться мишенью (Раису е1 а1., (1996) СИет. & Βΐο1. 3: 551), или дополнительный гликозилированный участок, представляют другие альтернативы для модификации Сконца бета-1а-интерферона.
Гликан на бета-1а-интерфероне также находится в положении, которое допускало бы дальнейшую модификацию без изменения активности. Также известны способы для создания сахаров-мишеней как участков для химической модификации, и поэтому вероятно, что полимер полиалкиленгликоля может быть добавлен непосредственно и специфично к сахарам на бета-1а-интерфероне, полученным через окисление. Например, может быть получен полиэтиленгликоль-гидразид, который образует относительно устойчивые связи гидразина путем конденсации с альдегидами и кетонами. Это свойство использовалось для модификации белков через окисление олигосахаридных связей. Смотри Апбгекх, Н. е1 а1., (1978), Макгото1. СИет. 179: 301. В частности, обработка ПЭГкарбоксиметилгидразида с нитритом дает ПЭГкарбоксиметилазид, который является электрофильно активной группой, реактивной по отношению к аминогруппам. Эта реакция может использоваться также для получения полиалкиленгликоль-модифицированных белков. Смотри патенты США 4101380 и 4179337.
Авторы ранее обнаружили, что тиол линкер-медиированная химическая структура может, кроме того, облегчать перекрестное сшивание белков. В частности, авторы получили гомотипичные мультимеры ЬРА-3 и СЭ4. используя такой способ, как генерирование реакционноспособных альдегидов на углеводных фрагментах с периодатом натрия, образуя конъюгаты цистамина через альдегиды и вызывая перекрестную сшивку через группы тиола на цистаминах. Смотри Рершкку, В. е1 а1., (1991), 1. Βίο1. СИет., 266: 18244-18249 и СИеп, Ь.Ь. е1 а1, (1991) 1. Βΐο1. СИет., 266: 18237-18243. Поэтому авторы предполагают, что этот тип химического строения также был бы пригоден для модификации с полимерами полиалкиленгликоля, когда линкер встраивается в сахар и полимер полиалкиленгликоля связывается с линкером. В то время как аминотиол или гидразинсодержащий линкер допускает добавление одной группы полимера, структура линкера может быть изменена таким образом, чтобы добавлялись множественные полимеры и/или чтобы изменялась пространственная ориентация полимера относительно бета-1а-интерферона.
В технологии настоящего изобретения остатки полиалкиленгликоля С1-С4 алкильных полиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), или остатки поли(окси)алкиленгликоля таких гликолей полезно встраиваются в интересующие авторов полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединен белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) или представляет собой полиоксиэтилированный полиол, при условии, что во всех случаях полимер растворим в воде при комнатной температуре. Неограниченные примеры таких полимеров включает гомополимеры оксида полиалкилена, такие как ПЭГ или полипропиленгликоли, полиоксиэтилированные гликоли, их сополимеры и блоксополимеры, при условии, что сохраняется водорастворимость блок-сополимера. Примеры полиоксиэтилированных полиолов включают, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу или им подобные. Глицериновый каркас полиоксиэтилированного глицерина является тем же самым каркасом, который встречается в природе, например, у животных и человека в моно-, ди- и триглицеридах. Таким образом, это разветвление не обязательно было бы замечено как инородный организму агент.
Как альтернатива к оксидам полиалкилена могут использоваться декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, углевод-основные полимеры и им подобные. Квалифицированным специалистам ясно, что предшествующий список приведен для иллюстрации и что рассматриваются все полимерные материалы, имеющие описанные здесь качества.
Полимер не требует какого-то определенного молекулярного веса, но предпочтительно, чтобы молекулярный вес составлял приблизительно от 300 до 100000, более предпочтительно от 10000 до 40000. В частности, размеры 20000 или больше являются лучшими при предотвращении потери белков из-за фильтрации в почках.
Дериватизация полиалкиленгликоля имеет ряд выгодных свойств для готовой препаративной формы конъюгатов полимер-бета-1аинтерферона в технологии настоящего изобретения, так как связана со следующими свойствами производных полиалкиленгликоля: улучшение водорастворимости при отсутствии в то же самое время проявлений какой-либо антигенной или иммуногенной реакции; высокие степени биосовместимости; отсутствие ίη νίνο биоразложения производных полиалкиленгликоля; и простота выведения из живых организмов.
Кроме того, в другом аспекте настоящего изобретения можно использовать бета-1аинтерферон, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором природа конъюгации включает легко разрывающиеся ковалентные химические связи. Это позволяет осуществлять контроль в период времени, в течение которого полимер может отщепляться от бета-1аинтерферона. Эта ковалентная связь между лекарственным средством в виде бета-1аинтерферона и полимером может расщепляться при химических или ферментативных реакциях. Продукт полимер-бета-1а-интерферона сохраняет приемлемую степень активности. Одновременно части полиэтиленгликоля присутствуют в конъюгированном полимере, чтобы обеспечить конъюгированный полимер-бета-1аинтерферона с высокой водорастворимостью и способностью к пролонгированному циркулированию в крови. В результате этих улучшенных характеристик, изобретение рассматривает парентеральное, назальное и пероральное введение как активного полимер-бета-1аинтерферона, так и после гидролитического расщепления и биодоступность бета-1аинтерферона рег 5С при применении ίη νίνο.
Следует понимать, что описанные здесь схемы реакции предлагаются только для иллюстрации, а не для ограничения реакций и структур, которые могут использоваться для модификации бета-1а-интерферона, например для достижения растворимости, стабилизации и сродства к мембране клетки для парентерального и перорального введения. Реакцию полимера с бета-1а-интерфероном для получения наиболее предпочтительных Ν-концевых конъюгированных продуктов легко проводят с использованием большого многообразия схем реакции. Активность и стабильность конъюгатов бета-1аинтерферона могут быть изменены несколькими способами при использовании полимеров с различным размером молекулы. Растворимость конъюгатов может быть изменена путем изменения соотношения и размера фрагмента полиэтиленгликоля, встроенного в полимерную композицию.
Применение
Уникальное свойство полиалкиленгликоль-производных полимеров настоящего изобретения, ценное для терапевтических применений, состоит в их общей биосовместимости. Полимеры имеют различные свойства водорастворимости и не являются токсичными. Их считают неиммуногенными и неантигенными, и они не противоречат биологической активности фрагмента бета-1а-интерферона, когда конъюгированы с ним при описанных здесь условиях. Они длительно циркулируют в крови и легко выводятся из живого организма.
Обнаружено, что продукты настоящего изобретения полезны в поддерживании периода полужизни терапевтического бета-1аинтерферона и могут, например, быть приготовлены для терапевтического применения путем растворения в воде или приемлемой жидкой среде. Введение можно осуществить парентеральным путем, в аэрозолях или перорально. Тонкие коллоидные суспензии могут быть получены для парентерального введения для получения эффекта депо или для перорального введения, тогда как аэрозольная готовая препаративная форма может быть жидкой или в виде сухого порошка в природном виде. В сухом, лиофилизированном состоянии или в растворах конъюгаты полимер-бета-1а-интерферона настоящего изобретения должны иметь хорошую устойчивость при хранении. Термоустойчивость конъюгированного бета-1а-интерферона (пример 3) выгодна при получении порошкообразных готовых препаративных форм, при котором имеется этап дегидрирования. Смотри, например, РСТ/США/95/06008 (Ме11юб5 аиб Сотро81йои8 Гог Огу Ро\гбсг оГ 1п1сгГсгоп5).
Терапевтические полимерные конъюгаты настоящего изобретения могут использоваться для профилактики или лечения любого состояния или заболевания, для которого эффективным компонентом является бета-1а-интерферон. Кроме того, полимер-основные конъюгаты настоящего изобретения могут использоваться в диагностике состояний или заболеваний в биологических системах или видах, так же, как для диагностических целей в нефизиологических системах.
В терапевтическом использовании настоящее изобретение рассматривает способ лечения животного объекта или латентно восприимчивых к такому(им) состоянию(ям) или заболеванию и нуждающегося в подобном лечении, включая применение таким животным эффективного количества полимерного конъюгата настоящего изобретения, которое является терапевтически эффективным для названного состояния или заболевания. Объект, подвергаемый лечению полимерным конъюгатом настоящего изобретения, включает млекопитающих и наиболее предпочтительно человека. В зависимости от конкретного состояния или заболевания, которое нужно излечить, животным могут назначаться полимерные конъюгаты данного изобретения в любой соответствующей терапевтически эффективной и безопасной дозировке, которая легко может быть определена специалистом и без излишнего экспериментирования. Из-за видовых различий интерферонов I может быть необходимо получить конъюгаты интерферон-полимер, как описано здесь, с интерферонами соответствующего вида.
Антиклеточная пролиферативная активность бета-1а-интерферона хорошо известна. В частности, некоторые из описанных здесь по лимерных конъюгатов бета-1а-интерферона полезны для лечения опухолей, в том числе злокачественных, таких как остеогенная саркома, лимфома, острый лимфолейкоз, рак груди, меланома и назофарингеальная карцинома, так же, как аутоиммунных состояний, таких как фиброз, волчанка и рассеянный склероз. Кроме того, ожидается, что противовирусная активность, проявляемая конъюгированными белками, в частности некоторыми описанными здесь мутантными конъюгатами бета-1а-интерферона, может использоваться для лечения вирусных заболеваний, таких как инфекции ЕСМ, грипп и другие инфекции дыхательных путей, бешенство и гепатит. Также ожидается, что описанная здесь иммуномодуляторная активность бета-1аинтерферона может использоваться при лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний, таких как фиброз, рассеянный склероз. Способность интерферонов ингибировать образование новых сосудов (то есть игибирование ангиогенеза и неоваскуляризации) делает возможным для конъюгатов данного изобретения лечить ангиогенные заболевания, такие как диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, дегенерация желтого пятна, отторжение роговичного трансплантата, неоваскулярная глаукома, ретролентальная фиброплазия, покраснение радужки и синдром Ослер-Вебера.
Кроме того, антиэндотелиальная активность интерферона была известна в течение некоторого времени, и один потенциальный механизм воздействия интерферона может состоять в том, чтобы вмешиваться в эндотелиальную активность клетки, ингибируя продукцию или эффективность ангиогенных факторов, продуцируемых опухолевыми клетками. Некоторые сосудистые опухоли, такие как гемангиома, являются особенно чувствительными к лечению интерфероном. Лечение альфа-интерфероном является единственным зарегистрированным способом лечения этого заболевания. Ожидается, что лечение конъюгатом бета-1аинтерферона данного изобретения предложит существенные фармацевтические выгоды в смысле фармакокинетики и фармакодинамики, так как ожидается, что конъюгаты будут оставаться в сосудистом русле в течение более длительного времени, чем неконъюгированные интерфероны, таким образом приводя к более действенной и эффективной терапии для использования в качестве антиангиогенного агента. Смотри пример 8.
Конъюгаты полимер-бета-1а-интерферона данного изобретения могут применяться рег 5С как в форме фармацевтически приемлемых сложных эфиров, солей, так и других физиологически функциональных производных. В таких фармацевтических и медикаментозных готовых препаративных формах бета-1а-интерферон предпочтительно используется вместе с одним или большим количеством фармацевтически приемлемых носителей и необязательно любых других терапевтических ингредиентов. Носитель^) должен быть фармацевтически приемлем в смысле совместимости с другими ингредиентами препарата и не должен приносить вреда его реципиенту. Бета-1а-интерферон обеспечивается в количестве, эффективном для достижения желательного фармакологического эффекта, как описано выше, и в количестве, соответствующем достижению желательной суточной дозы.
Готовые препаративные формы включают те, которые подходят как для парентерального, так и для непарентерального введения, и специфические способы введения включают пероральный, ректальный, буккальный, местный, назальный, глазной, подкожный, внутримышечный, внутривенный, чрескожный, интратекальный, интраартикулярный, внутриартериальный, субарахноидальный, бронхиальный, в лимфатические сосуды, вагинальный и внутриматочный. Предпочтительными являются готовые препаративные формы, пригодные для перорального, назального и парентерального введения.
Когда бета-1а-интерферон используется в готовой препаративной форме, включающей жидкий раствор, готовая форма может быть введена преимущественно перорально или парентерально. Когда бета-1а-интерферон используется в жидкой готовой препаративной форме в виде жидкой суспензии или порошка в биологически совместимом носителе, готовая форма может полезно вводиться перорально, ректально или бронхиально.
Когда бета-1а-интерферон применяется непосредственно в виде порошкообразного твердого вещества, бета-1а-интерферон может быть введен преимущественно перорально. Альтернативно, его можно вводить через нос или бронхиально, через распыление порошка в газе-носителе, формировать газообразную дисперсию порошка, которая аспирируется пациентом из дыхательной цепи, включающей соответствующее устройство для распыления.
Готовые препаративные формы, включающие полимерные конъюгаты настоящего изобретения, могут быть удобно представлены в виде единичных дозированных форм и могут быть получены любыми способами, известными в уровне фармацевтической техники. Такие способы обычно включают стадию введения активного(ых) ингредиента(ов) в связь с носителем, который состоит из одного или большего количества добавочных компонентов. Как правило, готовые препаративные формы получают при равномерном и тесном внесении активного(ых) ингредиента(ов) в соединение с жидким носителем, или тонкоизмельченным твердым носителем, или обоими, и затем, если необходимо, осуществляют получение из продукта дозированных форм желательной готовой препаративной формы.
Готовые препаративные формы настоящего изобретения, пригодные для перорального введения, могут быть представлены в виде дискретных единиц, таких как капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых содержит предварительно определенное количество активного ингредиента в виде порошка или гранулы; или в виде суспензии в водной жидкости или неводной жидкости, такой как сироп, эликсир, эмульсия или дозированная форма жидкого лекарственного средства.
Таблетка может быть приготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или несколькими добавочными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем устройстве, причем активное соединение имеет легкосыпучую форму, такую как порошок или гранулы, которые необязательно смешивают со связывающим агентом, дезинтегратором, смягчающим агентом, инертным разбавителем, поверхностно-активным веществом или разряжающим агентом. Формованные таблетки, включающие смесь порошкообразных полимерных конъюгатов с подходящим носителем, могут быть изготовлены путем формования в подходящем устройстве.
Сироп может быть получен добавлением активного соединения к концентрированному водному раствору сахара, например сахарозы, к которой может также быть добавлен любой добавочный ингредиент(ы). Такой(ие) добавочный(е) ингредиент(ы) может(гут) включать ароматизатор, подходящий консервант, агенты для замедления кристаллизации сахара и агенты для увеличения растворимости любого другого ингредиента, такого как полигидроксильный спирт, например глицерин или сорбит.
Готовые препаративные формы, пригодные для парентерального введения, соответственно включают стерильный водный препарат активного конъюгата, который предпочтительно является изотоническим для крови реципиента (например, физиологический солевой раствор). Такие готовые препаративные формы могут включать суспендирующие агенты и загущающие агенты или другие системы микрочастиц, которые предназначены для нацеливания соединения на компоненты крови или один или большее количество органов. Готовые препаративные формы могут быть представлены в форме единичной или многоразовой дозы.
Назальные готовые препаративные формы в виде спреев включают очищенные водные растворы активного конъюгата и консервирующие агенты и изотонические агенты. Такие готовые препаративные формы предпочтительно доведены до рН и изотонического состояния, совместимого с назальнымислизистыми мембранами.
Готовые препаративные формы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозиториев с соответствующим носи27 телем, таким как масло какао, гидрогенизированные жиры или гидрогенизированная жирная карбоновая кислота.
Глазные готовые препаративные формы, такие как глазные капли, получают способом, подобным способу получения назальных спреев, за исключением того, что рН и изотонические факторы предпочтительно доведены для соответствующих для глаз.
Местные готовые препаративные формы включают конъюгаты настоящего изобретения, растворенные или суспендированные в одной среде или более, такой как минеральное масло, нефть, полигидроксиспирты или другие основы, используемые для местных фармацевтических готовых препаративных форм.
В дополнение к вышеупомянутым ингредиентам готовые препаративные формы данного изобретения могут, кроме того, включать один или большее количество добавочных ингредиентов и выбранных из разбавителей, буферов, вкусовых добавок, дезинтеграторов, поверхностно-активных агентов, загустителей, смягчающих компонентов, консервантов (включая антиоксиданты) и им подобных.
Соответственно, существующее изобретение рассматривает предоставление подходящих полимеров для стабилизации ίη νίνο бета-1аинтерферона в растворе, как предпочтительное иллюстративное нетерапевтическое применение. Полимеры могут использоваться, например, для повышения термоустойчивости и устойчивости к ферментативному разложению бета-1а-интерферона. Усиление характеристики термоустойчивости бета-1а-интерферона посредством конъюгирования способом настоящего изобретения представляет способ увеличения срока годности, стабильности при комнатной температуре и устойчивости к исследовательским реагентам и наборам.
Следующие примеры предоставлены для иллюстрации настоящего изобретения и не должны быть рассмотрены в качестве ограничения. В частности, понятно, что описанные здесь эксперименты ίη νίνο с животными могут быть изменены так, чтобы были возможны другие модификации и вариации основной методологии. Например, в примере 5 специалисты могут использовать другие исследования с неопирином или могут изменять количество и вид использованных приматов. Эти модификации и вариации к примерам должны расцениваться как соответствующие духу и области действия настоящего изобретения.
Пример 1. Исследования структура/активность человеческого бета-1а-интерферона с использованием мутаций в виде аланин/сериновых замещений: анализ сайтов рецепторного связывания и функциональных доменов.
А. Обзор.
Пространственный мутационный анализ человеческого бета-1а-интерферона (ΙΕΝ-бета
1а) был предпринят с целью картирования остатков, требующихся для осуществления активности и рецепторного связывания. Наличие 3-Ό кристаллической структуры человеческого бета1а-интерферона (см. Кагрикак е1 а1., 1997, Ргас. Ναίί. Асаб. 8с1. 94:11813-11818) позволило заявителям идентифицировать для аланиновых (или сериновых) замещений остатки, находящиеся в контакте с растворителем, доступные для взаимодействия с рецептором бетаинтерферона, и сохранить аминокислоты, включенные в образование межмолекулярных связей. Панель из 15 аланиновых последовательных мутаций была создана, чтобы заменить от 2 до 8 остатков вдоль различных областей каждой из спиралей (А, В, С, Ό, Е) и петель (АВ1, АВ2, АВ3, СИ1, СИ2, ΌΕ1, ΌΕ2) бета-1аинтерферона. Для аффинной очистки включили аминоконцевой маркер, состоящий из 6 гистидиновых остатков, а также участок энтерокиназной линкерной последовательности для удаления аминоконцевого удлинения. Полученные интерфероны равнозначно обозначают как Помеченный интерферон (ШЫ)-бета или Ήίκ6бета-интерферон и т.п.
Экспрессионные плазмиды с различными мутантными формами меченного ΙΕΝ-бета конструировали с использованием генной конструкции ΙΕΝ-бета дикого типа в качестве матрицы для мутагенеза. Стратегия мутагенеза включает вначале введение уникальных сайтов расщепления рестрикционными ферментами на всем протяжении гена Ык-меченного ΙΕΝ бета дикого типа, затем замену различных последовательностей ДНК между выбранными сайтами рестрикции на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые кодируют мутации с аланиновыми (или сериновыми) замещениями. Наконец, мутантные гены ΙΕΝ субклонировали в плазмиде, которая направляет экспрессию в клетках млекопитающих, в клеточной линии 293 почек человека.
Функциональные результаты этих мутаций оценивали в антивирусном и антипролиферативном тестах. Нерадиоактивный анализ связывания ΙΕΝ разработали для анализа данных мутантных форм на связывание с поверхностным рецептором (комплекс ΙΕΝΑΒ1/2) клеток человеческой лимфомы Дауди-Беркитта. Кроме того, разработали анализ для картирования поверхностей взаимодействия между мутантными формами Ιιίκ-ΙΕΝ-бета и ΙΕΝΑΚ.2. в котором использовали гибридный белок ШЫАК2/Ес, включающий внеклеточный домен ΙΕΝΑΚ2, рецепторного белка ΙΕΝ, соединенный с шарнирным участком, СН2 и СН3 доменами человеческого Ι§61.
1. Создание гена бета-интерферона как матрицы для мутагенеза.
Стратегия заявителей, направленная на получение аланин- (или серин-) замещенных мутантных форм ΙΕΝ-бета, состояла в создании вначале модифицированного гена ΙΕΝ-бета, ко29 торый кодировал белок дикого типа, но который нес уникальные сайты расщепления рестрикционными ферментами, рассеянные на всем протяжении гена. Уникальные сайты использовали для замены последовательностей дикого типа на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые кодируют мутантные кодоны. Для получения экспрессионной кассеты ШЫ-бета-1а, подходящей для создания мутантных генов, кДНК ΙΡΝ-бета (СепВапк, каталожный номер #Е00029) амплифицировали с помощью ПЦР (РСВ). Начальное клонирование гена ΙΡΝ-бета в плазмиде рМГВ 107, полученной из рАСУС184 (см. Возе, ей а1., 1988, М1с1е1с Ас1бз Вез. 16(1) 355), было необходимо для проведения сайт-направленного мутагенеза данного гена в плазмиде, утратившей специфические сайты рестрикции, которые образуются в процессе мутагенеза.
ПЦР праймеры, использующиеся для субклонирования кодирующей последовательности гена человеческого ΙΡΝ-бета, также позволили заявителям ввести линкерную последовательность энтерокиназы выше по ходу транскрипции и в рамке считывания с геном ΙΡΝ-бета (5' ПЦР праймер 5' ТТСТСС66А6АС6АТ6АТ6АСАА6АТ6А6СТАСААСТТ6СТТ66АТТС СТАСААА6АА6С-3' (ЗЕЕ) ΙΌ Ыо: 3: ВЕТ021), и 3' ПЦР праймер 5'-6СС6СТС6А 6ТТАТСА6ТТТС66А66ТААССТ6ТАА6ТС3' (ЗЕЕ) ΙΌ №: 4: ВЕТ-022)) и фланкирующими сайтами ферментативной рестрикции (Β3ρΕΙ и Хйо Ι), использующимися для клонирования в сайтах плазмиды рМДВ107. Полученную ДНК обозначают ПЦР фрагмент А.
Эффективную сигнальную последовательность из сигнальной последовательности адгезионной молекулы-1 клеток кровеносных сосудов человека (νθ'ΛΜ-1) и 6 гистидиновых остатков в качестве маркера ввели в конечную конструкцию из второго фрагмента ДНК, созданную из ρΌ8^247 (фрагмент В). Плазмиду ρΌ8^247 получали из рСЕР4 (ΙπνίΙ годен, Саг1зЬаб, СА), из которой удален ген ΕΒNΑ-1 и которая несет сигнальную последовательность VСΑМ-1 ^САМзз), находящуюся в рамке считывания с 6 гистидиновыми остатками в качестве маркера и присоединенную выше их по ходу транскрипции. ПЦР праймеры, которые использовали для создания кассетного фрагмента VСΑМзз-1/гистидиновый маркер, представляли собой ΚΙΌ-369 (5' ПЦР праймер 5'-А6СТТ СС66666ССАТСАТСАТСАТСАТСАТА6СТ3': ЗЕЕ) ΙΌ ΝΟ: 5) и ΚΙΌ-421 (3' ПЦР праймер 5'СС66А6СТАТ6АТ6АТ6АТ6АТ6АТ66ССС СС66А-3': ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 6), включающие фланкирующие сайты расщепления рестрикционными ферментами апб ВзрЕр, которые позволяют вырезать фрагмент В ДНК.
Для создания плазмидного вектора, несущего сигнальную последовательность VСΑМ-1, й1з-маркер и ген бета-интерферона, заявители провели трехфрагментное лигирование, исполь зуя очищенные в геле фрагменты ДНК из плазмидного вектора рМ!В107 (полученные в результате расщепления №б и Хйор, ПЦР фрагмент А (полученный в результате расщепления ВзрЕ1 и Хйо1) и фрагмент В (полученный в результате расщепления №б и ВзрЕ1). Лигированную плазмиду использовали для трансформации клеток Е. сой, или 1А221, или ХЕ1-В1ие, и устойчивые к ампициллину колонии собирали и тестировали на наличие вставок путем анализа рестрикционной карты. Проводили препаративное получение ДНК, и последовательность вставки подтверждали путем секвенирования ДНК. Полученную конструкцию назвали рСМ6260.
2. Создание аланинзамещенных мутантных форм человеческого бета-интерферона в рСМ6260.
Плазмиду рСМС260 использовали в качестве матрицы для множественных раундов мутагенеза (и.З.Е. набор для направленного мутагенеза (Воейппдег-Маппйеш)), в результате которого были введены уникальные сайты рестрикционного расщепления в положения вдоль последовательности, кодирующей белок ΙΡΝбета, но полученная в результате последовательность белка не была изменена. Мутантные плазмиды использовали для трансформации штаммов Е. сой 1А221 или ХЕ1-В1ие, и рекомбинантные колонии отбирали по устойчивости к хлорамфениколу. Хлорамфеникол-устойчивые колонии затем тестировали на присутствие требуемого уникального сайта ферментативной рестрикции с помощью анализа рестрикционного картирования ДНК. Были подтверждены структуры полученной плазмиды ΙΡΝ-бета, рСМ6275.8, содержащей полный набор уникальных сайтов рестрикционного ферментативного расщепления, и последовательности ДНК данного гена. Полная последовательность ДНК (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1) модифицированного гена й1змеченного интерферона-бета, вместе с кодирующей белок последовательностью (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 2), приведена на фиг. 10.
Полный набор аланинзамещенных мутаций приведен в табл. 1 (ниже). Названия мутантов определяют структурные области (спирали и петли), в которые введены данные мутации. Полная панель аланиновых (сериновых) замещений дает в результате 65 мутаций на 165 аминокислот человеческого ΙΡΝ-бета.
Панель мутантных форм создана из рСМ6275.8 путем замещения сегментов ДНК, находящихся между уникальными свитами рестрикции, на синтетические олигонуклеотидные дуплексы, которые несут информацию генетического кодирования, как изображено в табл. 2 (см. ниже). Для создания различных аланинзамещенных мутантных форм плазмид вектор рСМ6275.8 (полученный в результате расщепления соответствующим рестрикционным ферментом, как определено в списке, приведенном ниже для каждой структурной области ΙΕΝбета), очищенный в геле, и олигонуклеотидные дуплексы (кодирующие последовательности цепей, как показано в табл. 2) сшивали вместе. Лигированные смеси использовали для трансформации штамма Е. οοΐί 1Λ221. и рекомбинантные колонии выбирали по устойчивости к ампициллину. Устойчивые к ампициллину колонии тестировали на присутствие вставок мутаций путем скрининга соответствующих сайтов ферментативной рестрикции. Для двух мутантных форм (А2 и СЭ2) стратегия клонироваА1
А2
АЕ1
АВ2 νϋ’
ЗЕС Ю
N0:7 ЭЕТ-С53
5Е0 10
МС : 9
ВЕТ-04:
£ЕС ΙΟ
N0; 1С
ЗЕТ-080
ЗЕС 10
МС : 11
ЗЕТ-082
ЗЕС Ю
N0:12 ЗЕТ-084 оатстассаатсстссстстсстссссто:
ДААТАСТ
ЗССТСААЗСАСАОг «аастттсд/
ААТТСААТСЮСАССОСТОСАССТТСС стсассасаттаассаостсса
ААТТСААТСОСАЗССТТСААТАСТССТ
ТССАСАСАТТАА2САССТССА
Таблица 2 ттсаатс :А;
ГАТТСС ния заключается в использовании двух дуплексов синтетических нуклеотидов (как показано в табл. 2), которые несут комплементарные липкие концы, что позволяет лигировать один с другим и с каркасом вектора ΙΕΝ-бета при трехстадийном лигировании. Следующий список иллюстрирует сайты, которые использовали для
ЗЕС
N0; :
5ЕТГС ,36
ТСССТСАССАСАТТОСТССАССТССАСС' в:
:□ •5
ТОСССССТТОАССАТСТАТЗАСАТТ гАТТСАТСТАССАСТОССТСОДА
N0: ЗЕТ
112 зес :с
МО : 16
ХСОАТТСАССАТСТАТаАОАТС ГСАТСТАССАСТЗССТСОЛА
ЗОААТГСТТС ДАТТО ттзстосаст: ГСААСАСАСТТСТАС 'ТТТ1 .с;
клонирования мутантных олигонуклеотидов из табл. 2. Схема клонирования (подраздел В) показывает позиции данных уникальных сайтов гена бета-интерферона.
Таблица1 •ЕС 10
N0: I1
ЗЕТ-09:
г-.т:
:В1
СО2
ЕС ГО
N0: 13
ВЕТ-094
5Е0 10
N0:19
ВЕТ-096
СТАССТОСААААСТСССТССДаСТЗАТТГ :азсссааааст
СТАСААОАААААСТОСАОАААаААССАССТАССССТООААААвСААТСА
ССОСаСТОСАССТСААААОА
Положения мутаций замещения аланина ΗυΙΕΝ-β
Линия, обозначающая ΙΕΝ-β, показывает
ЗЕС Ю
N0:20
ВЕТ-106
ТАТТАТСб<ЗА&ЗАТТСТаСАТТАССТСААСОССААбаАСТАСТСАСАСТСТ
0Е2
Е1 зео ίο
N0:21
ВЕТ-108
ЗЕС 10 ΝΟ: 22 ВЕТ-116
ЕС 10
ΝΟ: 2 3
ВЕТ-118
5Е0 ГО N0:24 ВЕТ-104
САТСАОСАСТСТССАССТЗААААСАТА-ТТАТСССаСААТТОСТЗСАТАССТа ССАСССААССАСТАСТСАСАСТСТ
САТОАССАСТСТОСАССТСААДАОАТАТТАТаССАССАТТСТаСАТТАССТС ААСвССОСТССАТАСТСАСАСТСТСССТОСАССАТ сатсассастстссасстоаааасататтатсссассаттстссаттасстса
АСССАААОСАСТАСССТОСАТОТСССТСОАССАТ
СбТСАСАОСТСАААТССТАОСАААСТТТССАТТСАТТОСААСАСТТАСАС
В. Конструкция экспрессирующих плазмид ΕΒΝΑ 293.
последовательность человеческого ΙΕΝ-β дикого типа. Аланиновые или сериновые замены остатков ΙΕΝ-β показаны для каждой мутантной формы, и черточки, расположенные ниже соответствующих областей, обозначают последовательности дикого типа. Структуры спиралей и петель обозначены сплошными линиями ниже
Гены мутантных форм и дикого типа ΙΕΝбета, соединенные с сигнальной последовательностью УСАМ-1, 1115-маркером и энтерокиназной линкерной последовательностью, очищали в геле в виде ферментов величиной в 761 пар оснований, полученных в результате действия рестрикционных ферментов ΝοΐΙ и ВатНГ Очищенные гены субклонировали в расщепленном под действием ΝοΐΙ и ВатШ плазмидном мутантных форм. Петля ΌΕ охватывает промежуток между спиралями Ό и Е. Две дополнительные аланинзамещенные мутантные фомы (Н93А, Н97А и Н121А) получали и анализировали в антивирусных анализах для того, чтобы оценить влияние мутации соответствующих гистидинов, которые образуют хелатные комплексы с цинком в корковом структурном димере. Обе вышеуказанные мутантные формы полностью сохраняют активность дикого типа в антивирусных анализах, что позволяет предположить, что цинк-опосредованное образование димера не является существенным для проявления активности ΙΕΝ-β.
векторе ρΌ8^247, как изображено на схеме. Плазмида рЭ8\У247 представляет собой экспрессирующий вектор для белка клеток почки человека ΕΒΝΑ 293 (ΙηνίΐΓο^η, СагНЬаб, СА). Она содержит промотор гена цитомегаловируса и регуляторные элементы ЕВУ, которые необходимы для обеспечения высокого уровня экспрессии гена в этой системе, а также как селектируемые маркеры для Е. οοΐί (устойчивого к ампициллину) и ΕΒΝΑ 293 клетки (устойчивые к гигромицину), как видно на схеме стратегии клонирования (ниже). Лигированные плазмиды использовались для трансформации или ΪΑ221, или ХЬ1-В1ие клеток Е. οοΐί, и ампициллинустойчивые колонии были отобраны и тестиро33 ваны на вставку анализом рестрикционной карты. Получили препаративное количество ДНК, и последовательность вставок подтверждали путем секвенирования ДНК. Положительные клоны, обнаруживающее наличие желательных мутировавших последовательностей, использовались для трансфекции клеток почек человека ΕΒΝΑ 293, как описано ниже. Полная стратегия клонирования представлена ниже.
Схематическое изображение стратегии клонирования и ΙΓΝ-β экспрессирующих плазмид
С. Экспрессия и количественное определение аланинзамещенных форм 1ЕЫ-бета-1а.
Человеческие клетки ΕΒΝΑ 293 (Ιηνίΐτοден, СагНЬаб, СА, СЫйепбеп, Т. (1989) 1. νίτοί. 63: 3016-3025) хранили в виде субконфлюентных культур в модифицированной по способу Дальбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 250 нг/мл генетицина (ЫГе Τесйηο1οд^е5. СаййегкЬигд, ΜΌ). Экспрессионные плазмиды ρΌδ^247 для обеспечения временной экспрессии трансфицировали в клетки ΕΒΝΑ 293 с помощью метода с использованием липофектамина (ΌΦοο/ΒΡΕ ЫГе Тесйш^дтек). Кондиционированную среду собирали через 3-4 дня после трансфекции, обломки клеток удаляли путем центрифугирования, и концентрацию Ιιίδ-ΙΕΝбета определяли с помощью ЕЙ18А.
Анализ ЕЙ18А проводили с использованием поликлональных кроличьих антител (1дС, очищенные на белке А, образование антител вызывали против очищенного человеческого 1Е№бета-1а) для покрытия 96-луночных планшетов ЕЫ8А, и биотинилированную форму таких же поликлональных кроличьих 1дС использовали в качестве второго реагента для обеспечения возможности определения интерферона с помощью стрептавидин-связанной пероксидазы хрена (НКР: ΡιοΚδοη IттиηοКекеагсй, Сгосе. РА). Серии разведений бета1а-интерферона использовали для получения стандартных концентрационных кривых. Кондиционированную среду от трансфицированных клеток ΕΒNΑ, содержащую Ык-ШЫ-бета, разбавляли до получения образцов с концентрациями, варьирующими от 10 до 0,3 нг/мл в тесте
ЕЙ18А. Для подтверждения концентраций ΙΕΝбета в среде, определенных с помощью ЕЫ8А, проводили вестерн-блоттинг. Восстановленные супернатанты культуры и стандарты ΙΕΝ-бета1а подвергали анализу методом δΌδ-РАСЕ на гелях с градиентом полиакриламида 10-20% (Nονеx, δаη ^^едο, СА) и помещали на мембраны ΡΌνΓ. Иммуноактивные полосы определяли с помощью кроличьей поликлональной антисыворотки против ШЫ-бета-1а (#447, Вюдещ 1пс., вторая антисыворотка, которая была получена против ШЫ-бета-1а), с последующей обработкой НКР-связанными антикроличьими 1дС осла (ΕκΕδοη IттиηοКе8еа^сй).
Ό. Анализ мутантных форм бетаинтерферона на связывание с рецептором.
Рецептор-связывающие свойства мутантных форм бета-интерферона, описанных в разделе С, оценивали с помощью двух различных анализов связывания. В одном анализе измеряли связывание мутантных форм бета-интерферона с гибридным белком, ШЫАК2/1д, включающим внеклеточный домен цепи человеческого рецептора ΙΕΝΛΚ2, соединенного с частью константной области человеческого 1дС. ШЫАК2-Ес экспрессировали в клетках яичников китайского хомяка (СНО) и очищали с помощью аффинной хроматографии на сефарозе с иммобилизованным белком А в соответствии с инструкциями производителя (Р1егсе Сйет. КοскГο^ά, 1Ь, № по каталогу #20334). Связывание мутантных форм бета-интерферона с ШЫАК2-Ес измеряли с помощью анализа формата ЕЙ18А. Планшеты для ЕЙ18А получали путем покрытия плоскодонных 96-луночных планшетов 50 мкл/лунку мышиных моноклональных антител против человеческого 1дС1 (СПС5-АА9, Вюден, 1пс.) в течение ночи при 4°С, при концентрации 10 мкг/мл в буфере для покрытия (50 мМ NаНСОз, 0,2 мМ МдС12, 0,2 мМ СаС12, рН 9,6). Планшеты дважды промывали РВ8, содержащим 0,05% Τ\\^η-20, и блокировали 0,5% обезжиренным сухим молоком в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. После двух дополнительных промывок к каждой лунке добавляли 50 мкл 1 мкг/мл ШЫАК2-Ес в 0,5% молоке в РВ8, содержащем 0,05% Τ\\^η-20, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре, после чего планшеты промывали еще 2 раза. Связывание мутантных форм бета-интерферона с ШЫАК2Ес измеряли путем добавления 50 мкл/лунку мутантных форм бета-интерферона в кондиционированной среде, серийно разведенных в модифицированной по Дальбекко среде Игла (ЭМЕМ), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, и инкубировали 2 ч при 4°С. Разведения мутантных форм бета-интерферона οбычно варьировали приблизительно от 1 мкМ до 10 пМ. После промывания концентрацию бета-интерферона, связанного с планшетом, определяли путем добавления 50 мкл/лунку смеси, состоящей из разбавленных 1:1000 кро35 личьих поликлональных антител против интерферона (#447) и меченных пероксидазой хрена (НКР) антикроличьих 1дС осла (1аск§оп 1ттипоРс5сагс11). и инкубации в течение 15 мин при 4°С. После двух промывок добавляли субстрат НКР и планшет инкубировали при 4°С, после чего считывали поглощение при 450 нм на аппарате для прочтения планшет ЕЬ1§Л. Строили график зависимости поглощения от концентрации мутантной формы бета-интерферона, и сродство связывания мутантной формы бетаинтерферона с 1РЫЛК2-Рс определяли путем приведения данных к простому гиперболическому уравнению связывания. Результаты этих анализов приведены на фиг. 1, в которой связывающее сродство для каждого мутанта, определенное по крайней мере в трех независимых экспериментах, выражали в виде процента от величины, измеренной для Н186-бета-1аинтерферона дикого типа.
Во втором анализе использовали измерение сродства, с которым мутантные формы бета-интерферона связываются с клетками Дауди, экспрессирующими обе рецепторные цепи, ΙΡΝΑΚ1 и ΙΡΝΑΚ2, которые вместе составляют рецептор бета-интерферона. В этом анализе, который проводят с использованием РАС8, использовали блокирование моноклональных антител, направленных против внеклеточного домена ΙΡΝΑΚ1, ЕА12 (Вюдеп, 1пс.), для того, чтобы различить незанятый (свободный) рецептор от рецептора, с которым связан бетаинтерферон. Клетки Дауди (20 мкл с концентрацией 2,5х107 клеток/мл) помещали в 96луночные планшеты ЕЬ18А с У-образным дном и инкубировали в течение 1 ч при 4°С с различными концентрациями мутантных форм бетаинтерферона (20 мкл в РАС8-буфере; 5% РВ8, 0,1% Ν;·ιΝ3 в РВ8). Желательные серийные разведения мутантных форм бета-интерферона варьировали от 0,5 мкМ до 0,5 пМ. К каждой лунке добавляли 100 нг биотинилированных мышиных моноклональных антител ЕА12 (10 мкл) против ΙΡΝΑΚ1, и планшеты инкубировали еще 2 мин при комнатной температуре, после чего их дважды промывали ΡΑС8-буффером (4°С). Затем клетки инкубировали 30 мин при 4°С с 50 мкл/лунку разбавленного 1:200 Κфикоэритрин-конъюгированного стрептавидина (1аск§оп 1ттипоКе8еатсй), промывали дважды ΡΑС8-буфером, ресуспендировали в 300 мкл ΡΑС8-буфера, содержащего 0,5% параформальдегида, и переносили в полистироловые пробирки 12х75 мм (Ра1соп 2052). Затем образцы анализировали с помощью проточной цитометрии на ΡΑС8саη (ВесЮп Оюкпъоп). Строили график зависимости среднего значения интенсивности канальной флюоресценции (МРС1) от концентрации мутантной формы бетаинтерферона: связывающее сродство определяли как концентрацию мутантной формы бетаинтерферона, соответствующую 50% ингибиро ванию окрашивания антител. Каждую мутантную форму тестировали много раз. На фиг. 2 показано связывающее сродство к рецептору для каждой мутантной формы бетаинтерферона, определенное с помощью этого метода, выраженное как процент от сродства, измеренного для Н186-бета-1а-интерферона дикого типа в каждом эксперименте.
Е. Анализ функции мутантных форм бетаинтерферона.
Мутантные формы бета-интерферона также тестировали на функциональную активность, используя ίη νίΙΐΌ анализы на антивирусную активность и способность бета-интерферона ингибировать пролиферацию клеток. Минимум три антивирусных анализа, каждый с тройными повторами точек данных, проводили для каждой мутантной формы. Н186-бета-1а-интерферон дикого типа был включен в каждый эксперимент в качестве образца отнесения. Антивирусный анализ проводили путем обработки клеток карциномы легкого человека А549 (АТСС ССЬ 185) в течение ночи 2-кратными серийными разведениями мутантной формы бетаинтерферона в концентрациях, охватывающих интервал от полной защиты против вируса до отсутствия защиты от гибели клеток в результате действия вируса. На следующий день клетки заражали в течение 2 дней вирусом энцефаломиокардита (ВЭМК (ЕСМУ)) при разбавлении, которое приводит к полной гибели клеток в отсутствие интерферона. Содержимое планшетов затем окрашивали метаболическим красителем МТТ (2,3 -бис [2-метокси-4-нитро-5 -сульфофенил] 2Н-тетразолин-5-карбоксианалид) (М-5655, 8щта, 8ΐ. Ьошк, МО). Получали базовый раствор МТТ с концентрацией 5 мг/мл в РВ8, подвергали стерильной фильтрации, и 50 мкл этого раствора разбавляли в клеточных культуральных средах (100 мкл на лунку). После инкубации при комнатной температуре в течение 30-60 мин раствор МТТ/среда отбрасывали, клетки промывали 100 мкл РВ8, и, наконец, метаболизированный краситель солюбилизировали в 100 мкл 1,2 Ν растворе соляной кислоты в 90% изопропаноле. Количество живых клеток (как видно по присутствию красителя) определяли по поглощению при 450 нм. Данные анализировали путем нанесения на график величины поглощения против концентрации мутантной формы бетаинтерферона, и активность каждой мутантной формы определяли как концентрацию, при которой наступала гибель 50% клеток. На фиг. 3 показана активность каждой мутантной формы, выраженная в виде процента от активности, измеренной в каждом эксперименте для Ιιίδмеченного бета-1а-интерферона дикого типа.
Мутантные формы бета-интерферона также оценивали на активность в антипролиферативном анализе. Клетки человеческой лимфомы
Дауди-Беркитта (АТСС # ССЬ 213) высевали в концентрации 2х105 клеток/мл в КРМ1 1620, дополненной 10% определенной фетальной телячьей сывороткой (Нус1опе, Ьодап υΐαΐι) и 2 мМ Ь-глутамином. Каждая лунка также содержит заданную концентрацию мутантной формы бета-интерферона в конечном общем объеме 100 мкл среды на лунку; использующиеся концентрации бета-интерферона были выбраны так, чтобы охватывать интервал от максимального ингибирования пролиферации клеток Дауди до отсутствия ингибирования (т.е. полная пролиферация). Повторы экспериментальных точек использовали для каждой концентрации тестируемой мутантной формы бета-интерферона, и во всех экспериментах был включен параллельный набор необработанных клеток. Клетки инкубировали в течение 2 дней при 37°С в инкубаторах с 5% СО2, после чего к каждой лунке добавляли 1 мкКи на лунку меченного тритием тимидина ((метил-3Н)тимидин, Атеткйат ТКК758) в 50 мкл среды и инкубировали в течение еще 4 ч. Клетки собирали, используя харвестер планшет ЬКВ, и включение меченного тритием тимидина измеряли, используя планшет-ридер ЬКВ бета. Получали средние значения повторов экспериментальных данных, и определяли стандартные отклонения. Данные наносили на график как среднее количество импульсов в минуту против концентрации мутантной формы бета-интерферона, и активность каждого мутанта определяли как концентрацию, требующуюся для получения 50% ингибирования максимального наблюдающегося роста. Для каждой мутантной формы проводили многочисленные анализы. На фиг. 4 показаны результаты, выраженные в виде процента от активности, обнаруженной для Ык-меченного бета-1а-интерферона дикого типа в каждом эксперименте.
Р. Свойства мутантных форм бетаинтерферона.
Было обнаружено, что активность гистидин-меченного бета-1а-интерферона дикого типа в антивирусном и антипролиферативном анализах была в каждом приблизительно в 3 раза ниже, чем соответствующая активность, обнаруженная для немеченого бета-1аинтерферона дикого типа. Из-за того, что все мутантные формы бета-интерферона А1-Е содержат идентичную Ык-меченную последовательность в их Ν-концевых областях, влияние мутаций на свойства молекулы определяли путем сравнения активностей данных мутантных форм в антивирусном, антипролиферативном анализах и анализе связывания с активностью, наблюдаемой для Ык-меченного бета-1аинтерферона дикого типа. Исходя из этого, заявители допускали, что вариации активностей мутантных форм А1-Е, сравниваемые с Ыкмеченным бета-1а-интерфероном дикого типа, качественно и количественно приблизительно соответствуют эффектам, которые те же мутации будут оказывать в отсутствие Ν-концевого 1118-маркера. Эквивалентное допущение для ме ченных или гибридных конструкций других растворимых цитокинов обычно считается верным практикующими специалистами, использующими мутагенез с последовательными аланиновыми замещениями, особенно если ш νίΐτο функциональная активность меченной или гибридной конструкции близка к активности цитокина дикого типа, как в случае, описанном в данном документе. См., например, Реагсе К.Н. ΐτ., е1 а1., .1. Вю! С1ет. 272:20595-20602 (1997) и .Ьпек ЕТ., е1 а1., 1. Вю1. С1ет. 213:11667-11674 (1998).
Данные, приведенные на фиг. 1-4, позволяют предположить наличие трех типов эффектов, которые вызваны направленным мутагенезом. Эти эффекты в некоторых условиях могут быть благоприятными для разработки лекарственного препарата на основе интерферона. К данным трем типам эффектов относятся следующие: (а) мутантные формы с более высокой антивирусной активностью, чем активность бета-1а-интерферона дикого типа (например, мутантная форма С1); (Ь) мутантные формы, которые проявляют активность как в антивирусном, так и в антипролиферативном анализе, но для которых антипролиферативная активность является непропорционально низкой по отношению к антивирусной активности, по сравнению с диким типом бета-1а-интерферона (например, мутантные формы С1, Ό и ΌΕ1); и (с) функциональные антагонисты (например, А1, В2, СИ2 и ΌΕ1), которые демонстрируют антивирусную и антипролиферативную активность, которые являются непропорционально низкими по отношению к связыванию рецептора, по сравнению с диким типом бета-1а-интерферона. Можно видеть, что некоторые мутантные формы относятся более чем к одному классу. Обзор этих классов приведен ниже. Хотя заявители характеризуют данные классы мутантных форм относительно перечисленных примеров, должно быть понятно, что другие мутации в данных областях могут приводить к подобным или даже увеличенным влияниям на активность.
(а) Мутантная форма С1 обладает антивирусной активностью, которая приблизительно в 6 раз выше, чем активность Ык-меченного бета1 а-интерферона дикого типа. Ожидается, что эта и другие мутантные формы данного типа будут полезными для уменьшения количества бета-интерферона, которое должно быть введено для достижения заданного уровня антивирусного эффекта. Полагают, что уменьшение количества вводимого белка приведет к уменьшению иммуногенности данного белка и может также уменьшить побочные эффекты, касающиеся токсичности, не основанной на механизме действия белка. Ожидается, что мутации в данном классе являются благоприятными в ситуациях, когда терапевтическое улучшение, наступившее в результате введения бетаинтерферона, является следствием его антивирусного действия и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами.
(Ь) Относительные активности (% от дикого типа) аланинзамещенных мутантных форм в антивирусном и антипролиферативном анализах сравнивают на фиг. 5. Согласованно измененные активности (т.е. антивирусная и антипролиферативная активности, которые отличаются на один и тот же коэффициент от активностей Ык-меченного бета-1а-интерферона дикого типа) обнаруживали в большинстве мутантных форм (которые лежат на диагональной линии). Однако некоторые мутантные формы имеют более сильные изменения в активности в одном анализе относительно другого, по сравнению с Ык-меченным бета-1а-интерфероном дикого типа, как видно по смещению от диагонали. Три такие мутантные формы показаны в табл. 3, приведенной ниже. Мутантная форма С1 обнаруживает антивирусную активность, которая в ~6 раз выше, чем активность Ык-меченного бета-1а-интерферона дикого типа, но ее активность в антипролиферативном анализе является подобной активности дикого типа. Таким образом, мутантная форма С1 обладает антивирусной активностью, превышающей в 5,2 раза ее антипролиферативную активность, по сравнению с Ык-меченным бета-1а-интерфероном дикого типа. Подобным образом, мутантная форма Ό проявляет 65% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 20% активности дикого типа в антипролиферативном анализе, и, таким образом, обладает антивирусной активностью, которая в 3,4 превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с диким типом. Мутантная форма ΌΕ1 проявляет 26% активности дикого типа в антивирусном анализе, но только 8,5% в антипролиферативном анализе, и, таким образом, обладает антивирусной активностью, которая в 3,0 раза превышает ее антипролиферативную активность по сравнению с Ык-меченным бета-1а-интерфероном дикого типа. При введении в концентрации, достаточной для достижения желаемого уровня антивирусной активности, эти мутантные белки будут обнаруживать существенно более низкие уровни антипролиферативной активности, чем белок дикого типа. Ожидается, что мутации в этом классе, так же, как и в классе (а), являются благоприятными в ситуациях, когда терапевтическое улучшение, наступившее в результате введения бета-интерферона, является следствием его антивирусного действия и когда антипролиферативная активность сопровождается токсичностью или нежелательными побочными эффектами.
Таблица 3
Мутантная форма Антивирусная активность (АВ), % от дикого типа Антипролиферативная активность (АП), % от дикого типа АВ/АП
С1 571 109 5,2
э 65 19 3,4
ΏΕ1 26 8,5 3,0
(с) Мутантные формы с антивирусной и антипролиферативной активностями, которые являются низкими относительно рецепторного связывания, по сравнению с Ык-меченным бета1 а-интерфероном дикого типа (см. табл. 4, приведенную ниже). Мутантная форма А1 проявляет антивирусную и антипролиферативную активности, которые являются в 2,0 раза и в 1,8 раза выше, чем активности, наблюдающиеся для Ык-меченного бета-1а-интерферона дикого типа, но связывает родственный рецептор на клетках Дауди со сродством, которое в 29 раз превышает сродство дикого типа. Связывание данной мутантной формы с рецептором ΙΕΝ-бета, таким образом, увеличено приблизительно в 15 раз по сравнению с антивирусной и антипролиферативной активностями данного белка. Подобным образом, мутантные формы В2, ΟΌ2 и ΌΕ1 показывают увеличение связывания по отношению к антивирусной активности в 4,6, 4,6 и 18 раз соответственно и по отношению к антипролиферативной активности в 3,5, 15 и 54 раза. Ожидается, что эти белки будут полезными в качестве функциональных антагонистов активности эндогенного ΙΕΝ-бета и, возможно, других эндогенных интерферонов типа Ι, так как они обладают способностью связывать и занимать рецептору и, кроме того, генерируют только небольшую часть функционального ответа в клетках-мишенях, который можно наблюдать в случае ΙΕΝ-бета дикого типа.
Таблица 4
Мутантная форма Антивирусная активность (АВ), % от д.т. Антипролиферативная активность (АП), % от д.т. Клеточная связывающая активность, % от д. т. Связывание/АВ Связывание/АП
А1 200 180 2900 15 16
В2 7,1 9,2 33 4,6 3,5
СП2 150 46 690 4,6 15
ΏΕ1 26 8,5 460 18 54
О. Зависимость мутеина от трехмерной структуры интерферона.
В то время как опубликованные кристаллические структуры негликозилированной формы мышиного бета-интерферона (Т. 8епба, 8. 8айой апб Υ. Мйкш. Вейпеб СгукЫ1 81гис1иге оГ ВесотЫпаЫ Миппе 1п1егГегоп-Р а! 2.15 А Веко1ийоп. 1. Мо1. Вю1. 253: 187-207 (1995)) и человеческого альфа-2Ь-интерферона (В. ВабНакпкНпап, ЕЕ Аа11ег, А. Нгиха, Р. Векйей, Р.Р Тгойа, Т.Ь. ШдаЫшкНап апб М.В. Аайег. 2Ыс Меб1а1еб Оппег оГ Нитап 1п1егГегоп-а2Ь Веνеа1еб Ьу Х-гау Сгук1а11одгарйу. 81гис1иге. 4: 1453-1463 (1996)) предоставили модели полипептидного каркаса человеческого бетаинтерферона, заявители недавно установили структуру гликозилированной формы бета-1аинтерферона (М. Кагрикак, М. №11е, С.В. ВеЫоп, А. Ме1ег, Α.Ν. ЫрксотЬ, апб 8.Ε. Сое1х. ТНе СгукЫ1 81гис1иге оГ Нитап 1п1егГегоп41 β а! 2.2 А геко1икоп. Ргос. №11. Асаб. 8с1. И8А 94:11813-11818 (1997)).
Результаты наших мутационных анализов могут быть суммированы относительно 3Όструктуры бета-1а-интерферона (не представлено в данном документе). Некоторые мутации остатков приводят к уменьшению активности (от 2- до >5-кратное уменьшение). Мутировавшие участки соответствуют замещениям, приведенным в табл. 1 и 2. Остатки, существенные для антивирусной и антипролиферативной активности, локализованы к нижней половине ΙΓΝ-бетаЛа молекулы (набор а и Ь). Мутации в верхней половине молекулы, где расположены амино- и карбоксиконцы, не оказывали никакого влияния на биологическую активность или рецепторное связывание.
Мутации в А2 спирали, АВ2 петле и Е спирали являются наиболее значительными по их воздействию на функцию и приводят к значительному снижению как активности, так и рецепторного связывания поверхности клетки. Эта область (А2 спираль, АВ и АВ2 петля и Е спираль) соответствует участку связывания ΙΓΝΑΚ2, так как в нашем исследовании ни одна из этих мутантных форм не связывала ΙΓΝΑΚ/Рс.
Хотя мутации, которые являются важными для связывания ΙΓΝΑΚ2, также влияют на клеточное связывание. На связывающие свойства клеточной поверхности также влияют остатки в других участках молекулы (спираль В1, спираль С2). Как можно видеть на 3Ό моделях (не показано), изображающих эффекты аланинзамещенных мутантных форм, что Ν-концевые, Сконцевые участки и участки гликозилированной спирали С молекулы ΙΓΝ-бетаДа не принадлежат участку, связывающему рецептор. Мутации в этих участках не уменьшают биологической активности или уменьшают связывание рецептора клеточной поверхности.
Пример 2. Получение и исследование конъюгированного бета-1а-интерферона.
А. Получение конъюгированного с ПЭГ интерферона.
Не оформленную в готовую препаративную форму массу промежуточного вещества бета-1а-интерферона (продается как ΑνΟΝΕΧ®) при 250 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия рН 7,2, 200 мМ №С1 разбавляют равным объемом 100 мМ МЕ8, и рН доводят НС1 до 5,0. Образец наносят на колонку ΓΓ 8Р-сефарозы® (Рйагтас1а, Ρίκса1а\\'ау, ΝΙ) при 6 мг бета-1а-интерферона/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 75 мМ №01, и продукт элюируют 30 мМ фосфатом натрия рН 6,0, 600 мМ №01. Элюированные фракции анализируют по поглощению при 280 нм, и концентрацию интерферона в образцах оценивают, исходя из поглощения, используя коэффициент экстинкции 1,51 для 1 мг/мл раствора.
К 1 мг/мл раствора бета-1а-интерферона из 8Р элюата добавляют 0,5 М фосфата натрия рН
6,0 до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (А1бпс11, Мб^анкее, ΑΙ) добавляют до 5 мМ, и 20К альдегида ПЭГ (811еаг\\'а1ег Ро1утегк, Нип1куШе, АЬ) добавляют до 5 мг/мл. Образцы инкубируют при комнатной температуре в течение 20 ч. Конъюгированный с ПЭГ интерферон очищают от продуктов реакции последовательной ступенчатой хроматографией на 8ирегоке® 6 РРЬС калиброванной колонке (Рйагтааа) с 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 150 мМ №С1 в качестве подвижной фазы и 8Р-8ерйагоке® ΓΓ. Калиброванная колонка дает разделение исходного материала модифицированного и не модифицированного бета-1а-интерферона (хроматография не представлена здесь). ПЭГ-бета-1аинтерферонсодержащий элюционный пул после гель-фильтрации разбавляют 1:1 водой и наносят на колонку 8Р-8ерйагоке® при 2 мг бетаинтерферона/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 75 мМ №01, и затем конъюгированный с ПЭГ бета-1аинтерферон элюируют из колонки 5 мМ фосфатом натрия рН 5,5, 800 мМ №С1. Элюированные фракции анализируют на содержание белка поглощением при 289 нм. Концентрация конъюгированного с ПЭГ интерферона дается в эквивалентах интерферона, поскольку половина ПЭГ не участвует в поглощении при 280 нм.
В. Биохимическое исследование конъюгированного с ПЭГ интерферона.
Образцы анализируют на степень модификации с помощью 8Э8-РАСЕ (гель, не представленный здесь). Добавление единственного ПЭГ приводит к сдвигу в очевидной массе интерферона с 20 до 55 кДа, который легко выявляют при анализе. В конъюгированном с ПЭГ образце не обнаружено ни очевидного немодифицированного бета-1а-интерферона, ни более высоких массовых форм, полученных в результате присутствия дополнительных групп ПЭГ. Присутствие отдельного ПЭГ проверяют МАЙШ масс-спектрометрией. Специфичность реакции конъюгирования с ПЭГ оценивают по пептидной карте. 20 мкг аликвоты конъюгированного с ПЭГ и немодифицированного бета-1аинтерферона в качестве контроля в 240 мкл 200 мМ Трис НС1 рН 9,0, 1 мМ ΕΌΤΑ подвергают перевариванию с 1,5 мкг лизилэндопротеиназы от АсйготоЬасЫ (Аако ВюргобисЬ, Шсктопб, νΑ) в течение 3-4 ч при 27°С. 200 мг гуанидина НС1 добавляют к каждому образцу, и расщепленные продукты фракционируют на колонке Vубас С4 (0,46 х 25 см), используя 30-минутный градиент от 0 до 70% ацетонитрила в 0,1% ΤΓΑ при скорости потока 1,4 мл/мин. Эфлюент из колонки проверяют по поглощению при 214 нм.
Результаты исследования показаны на фиг.
6. Все предсказанные пептиды от переваривания бета-1а-интерферона эндопротеиназой Ьук-С были идентифицированы по последовательности их Ν-конца и с помощью массспектрометрии, и из них только пептид, кото43 рый содержал Ν-конец интерферона (АР8), был изменен при модификации, что стало очевидно по его исчезновению с карты. Таким образом, данные картирования показывают, что модификация ПЭГ направлена на Ν-конец белка, так как только модификация Ν-конца приводит к определенной потере этого пептида.
Дополнительное свидетельство для подобного заключения было получено при выделении конъюгированного с ПЭГ Ν-концевого пептида после переваривания эндопротеиназой Ьук-С и дальнейшего расщепления пептида бромцианом (ΟΝΒγ), после чего образец подвергали анализу последовательности лазерной десорбционной ионизацией с помощью матрицы после изменения источника (ΜΑΕΌΙ Ρ8Ό). ΟΝΒγ переваривание Ν-концевого пептида далее расщепляет этот пептид на два фрагмента, причем концевой метионин (Μ1) содержит фрагмент ПЭГ и ЗУЖЕ-СЕБОВ (остатки 2-11 в полученной последовательности бета-интерферона). Анализ последовательности идентифицировал немодифицированный пептид 8ΥΝΕΕΟΡΕΡΒ, который был предсказан, как результат такой обработки.
Антивирусная активность образцов бета1а-интерферона была тестирована на клетках карциномы легкого человека (А549 клетки), которые были подвергнуты воздействию вируса энцефаломиокардита (ЕМС) с использованием способов, включающих МТТ окрашивание, упомянутое выше. Кратко, А549 клетки были предварительно обработаны в течение 24 ч бета1а-интерфероном или ПЭГ-модифицированным бета-1а-интерфероном (4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 75, 62,5, 31,25, 50, 33,3, 22,2, 14,8, 9,9, 6,6, 4,39 пг/мл) до встречи с вирусом. Исследование проводилось с дублированием данных для каждой концентрации бета-1а-интерферона. Допустимые отклонения показаны, как полоски погрешности на фиг. 7. Концентрация бета-1аинтерферона (в препарате или массе), которая предлагает лизис 50% вирусов (50% цитопатический эффект) (50% максимум ΘΌ450), составила около 11 пг/мл, и 50% цитопатический эффект для ПЭГ-модифицированного бета-1аинтерферона составил около 11 пг/мл. Таким образом, конъюгирование с ПЭГ не изменило антивирусную активность бета-1а-интерферона. В этом исследовании авторы обычно находят, что специфическая активность бета-1аинтерферона приблизительно в 10 раз выше, чем специфическая активность бета-1Ьинтерферона, и, таким образом, конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон является значительно более активным, чем любой продукт бета-1Ь-интерферона.
Бета-1а-интерферон был также конъюгирован с ПЭГ 5К ПЭГ-альдегидным фрагментом, который был приобретен у Р1ика, 1пс. (Са1. Νο. 75936, Вопкопкота, ΝΥ), при следовании той же схеме, которая описана для модификации с 20К ПЭГ-альдегидом, за исключением того, что в реакцию входило 2 мг/мл 5К ПЭГ. Модификация с 5К ПЭГ была также высоко специфична для Ν-конца и не изменяла антивирусную активность бета-1а-интерферона. Подобно аддукту 20К, 5К ПЭГ-бета-1а-интерферон был неотличим от немодифицированного бета-1аинтерферона в антивирусном исследовании.
Пример 3. Защита бета-1а-интерферона от стресс-индуцированной агрегации, конъюгированной с ПЭГ.
Агрегация бета-интерферона оказывает вредное воздействие на активность. Предварительно авторы показали, что гликозилирование оказывает неблагоприятное воздействие на стабильность бета-1а-интерферона при сравнении с негликозилированными формами бетаинтерферона, и сделали заключение, что гликозилирование вносит вклад в более высокую специфическую активность бета-1а-интерферона (Випке1 Ь. е! а1., РИагт. Век. 15: 641-649). Для выяснения, может ли конъюгирование с полимером полиалкиленгликоля далее стабилизировать бета-интерферон, авторы подвергли конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон тепловому стрессу, используя следующий протокол.
Проводили термическую денатурацию, используя ΟΑΒΥ 3 УФ-спектрофотометр, снабженный компьютерным контролем, с термоэлектрически нагреваемым держателем кюветы. Растворы бета-1а-интерферона в 20 мм ΗΕΡΕδ рН 7,5, 20 мМ ΝηΟΊ уравновешивали при 25°С в 1 мл кювете. Температура держателя кюветы затем поднималась с 25 до 80°С со скоростью 2°С/мин, и денатурация белка проводилась под непрерывным контролем поглощения при 280 нм. Средняя точка согласованно протекающего процесса, Тт, была получена по кривым плавления путем определения температуры, при которой измеренное поглощение было средним между значениями, определенными линиями, экстраполируемыми от линейных областей с каждой стороны согласованно протекающих перемещений.
Результаты этого исследования показаны на фиг. 8. Тогда как не конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон подвергается денатурации и агрегированию с 50% перемещением при 60°С, у конъюгированного с ПЭГ интерферона нет заметной агрегации даже при 80°С. В отдельном исследовании авторы расширяли стресс термической обработкой до 95°С, и даже при такой высокой температуре авторы не наблюдали никакой заметной агрегации. Таким образом, соединение с этим полимером полиэтиленгликоля имеет полное и благоприятное воздействие на стабильность белка. Подобная стабилизация наблюдалась с модифицированным бета-1аинтерфероном, содержащим 20К и 5К ПЭГ.
Пример 4. Измерение антивирусной активности бета-1а-интерферона в плазме мышей, обработанных бета-1а-интерфероном и конъюгированным с ПЭГ бета-1а-интерфероном.
Мышам (С57В1/6) вводят внутривенно через хвостовую вену или 50000 единиц бета-1аинтерферона, или 50000 единиц конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона, содержащего 20К ПЭГ или равный объем буфера, в качестве контроля. Кровь от этих мышей получают ретроорбитально, в различные моменты времени после инъекции (немедленно, через 0,25, 1, 4, 24 и 48 ч). Для каждого момента времени используют по крайней мере 3 мыши. Цельную кровь собирают в пробирки, содержащие антикоагулянт, клетки удаляют, и полученную плазму замораживают до момента испытания. Затем эти образцы и плазмы тестируют в антивирусных исследованиях.
Образцы плазмы разбавляют 1:10 в свободной от сыворотке среде и пропускают через 0,2 мкм фильтр. Разбавленные образцы тестируют в антивирусных исследованиях. Образцы титруют в обозначенных лунках 96-луночного планшета с культурой, содержащей А549 клетки. На каждом планшете анализируют разведения стандартного бета-1а-интерферона (10; 6,7; 4,4; 2,9; 1,3; 0,9 и 0,6 ед./мл) и четыре образца плазмы. А549 клетки предварительно обрабатывают разведенными образцами плазмы в течение 24 ч до обработки ЕМС вирусом. После двухдневной инкубации с вирусом жизнеспособные клетки окрашивают раствором МТТ (в 5 мг/мл в фосфатном буфере) в течение 1 ч, промывают фосфатным буфером и растворяют 1,2 N НС1 в изопропаноле. Лунки читают при 450 нм. Для каждого планшета строят калибровочные кривые и используют для определения величины активности бета-1а-интерферона в каждом тестируемом образце. Активности в образцах от различных мышей наносят на график против моментов времени (фиг. 9).
Более медленное выведение конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона из кровообращения как функция времени показывает, что период полужизни в конъюгированных с ПЭГ образцах намного длиннее, чем таковой у необработанного контроля бета-1а-интерферона. Тогда как контроль был в значительной степени выведен через 4 ч, значительная фракция конъюгированного с ПЭГ продукта определялась через 48 ч. Беря за основу начальные уровни активности в сыворотке и активность, сохраняющуюся через 48 ч, авторы делают вывод, что период полужизни конъюгированного с ПЭГ интерферона увеличен по сравнению с периодом полужизни немодифицированного бета1 а-интерферона. Второе значительное открытие этого исследования состоит в том, что очень небольшое количество конъюгированной с ПЭГ формы было потеряно в течение фазы распределения, что доказывается одинаково высокими уровнями активности в 0 момент времени и через 60 мин. Данные указывают, что, в отличие от контрольного бета-1а-интерферона, распределение конъюгированного с ПЭГ продукта в значительной степени ограничено сосудистым руслом.
Пример 5. Сравнительная фармакокинетика и фармакодинамика у приматов (общие схемы).
Сравнительные исследования проводятся с конъюгатами полимер-бета-1а-интерферон и нативным бета-1а-интерфероном (в виде не оформленной в готовую препаративную форму массы промежуточного вещества бета-1аинтерферона в фосфате натрия, и №С1, рН 7,2) для определения их относительной стабильности и активности у приматов. В этих исследованиях фармакокинетику и фармакодинамику конъюгата полимер-бета-1а-интерферон у приматов сравнивали с таковыми нативного бета1 а-интерферона, и приемлемые выводы могут быть распространены на людей.
Животные и способы Способ исследования
Способ представляет собой исследование в параллельных группах с повторяющимися дозами для оценки сравнительной фармакокинетики и фармакодинамики конъюгированного и неконъюгированного бета-1а-интерферона.
Для этого исследования использовали здоровых приматов (предпочтительно обезьяны резус). До введения дозы оценивали состояние здоровья всех животных по видимым признакам заболевания в Ветеринарной Лаборатории 2 раза в течение 14 дней до применения препарата; одна оценка должна проводиться не раньше, чем за 24 ч до первого применения препарата. Препарат получают только здоровые животные. Оценка включает общее физическое исследование и предшествующую введению дозы картину крови для определения исходной клинической патологии и исходного уровня антител к бета1 а-интерферону. В пределах 24 ч до испытательного введения препарата все животные взвешиваются, и регистрируется температура тела.
параметров регистрируются и назначаются группам для получения 1 Μϋ/кг бета-1аинтерферона в виде конъюгата ПЭГ-бета-1аинтерферона или в неконъюгированном виде. Введение осуществляется или подкожно (8С), или внутривенно (IV). Все животные не должны ранее получать бета-1а-интерферон. Каждое животное получает дозу препарата по 2 раза; дозы делятся на 4 недели. Объем дозы составляет 1,0 мл/кг.
Проводят забор крови для фармакокинетического тестирования в различные интервалы времени, следующие за каждой инъекцией. После каждого введения изучаемого лекарственного средства также берут пробы крови для измерения интерферон-индуцируемого маркера биологического ответа, сывороточного неоптерина.
Оценки в процессе исследования включают клинические наблюдения за признаками токсичности, проводимые через 30 мин и 1 ч после получения дозы. Регистрируются ежедневный осмотр клетки и общего вида, наблюдение за признаками интоксикации, дискомфорта и изме47 нения в поведении. В течение следующего после приема дозы 21 дня через регулярные интервалы регистрируются вес и температура тела.
Способы исследования
Уровни бета-интерферона в сыворотке количественно выражены с помощью биоанализа цитопатического эффекта (СРЕ). СРЕ измеряет уровни интерферон-медиированной антивирусной активности. Уровень антивирусной активности в образце отражает число молекул активного интерферона, содержащихся в этом образце в момент забора крови. Подобный подход представляет собой стандартный способ оценки фармакокинетики бета-интерферона. СРЕ анализ, использованный в настоящем исследовании, и обнаруживает способность бетаинтерферона предохранять клетки карциномы легкого человека (А549, #ССБ-185, АТСС, КоскуШе, МО) от цитотоксичности, связанной с вирусом энцефаломиелокардита (ЕМС). Клетки предварительно инкубируют в течение 15-20 ч с образцами сыворотки, чтобы произошло индуцирование и синтез интерферон-индуцируемых белков, которые затем обеспечивают противовирусный ответ. После этого добавляют ЕМС вирус и инкубируют еще в течение 30 ч, а затем проводят оценку цитотоксичности, используя краситель кристаллический фиолетовый. Внутренний стандарт бета-интерферона, а также внутренний стандарт конъюгата ПЭГ тестируют одновременно с образцами на каждом испытательном планшете. Этот стандарт калиброван против стандарта естественного интерферона фибробласта человека (№НС Второй международный стандарт интерферона фибробласта человека СЬ-23-902-53). Каждый испытательный планшет имеет также лунки контроля клеточного роста, не содержащие ни какого-либо интерферона, ни ЕМС, и вирусные контрольные лунки, содержащие клетки и ЕМС, но не содержащие бета-интерферон. Также готовятся контрольные планшеты, содержащие стандарт и образцы для определения эффекта, если таковой имеется, образцов на рост клетки. Эти планшеты красятся без добавления вируса.
Каждый образец и стандарт тестируют в двойном экземпляре на каждом из двух исследовательских планшетов, получая четыре варианта данных на образец. Представляется среднее геометрическое значение этих четырех копий. Разрешающая способность этого исследовании - 10 ед./мл.
Концентрации неоптерина в сыворотке определены в клинических фармакологических единицах с использованием коммерчески доступных анализов.
Фармакокинетика и статистические методы
Используется компьютерная программа КйпрТМ (МкгоМаШ, 1пс., 8а11 Баке Сйу, ИТ) для адаптации данных к фармакокинетическим моделям. Среднее геометрическое значение концентраций для каждой группы наносится на график по отношению ко времени. Так как результаты исследований выражены в растворениях, среднегеометрические значения считаются более подходящими, чем среднеарифметические значения. Уровни интерферона в сыворотке приведены в соответствие с начальными значениями, и необнаруживаемые сывороточные концентрации установлены, как 5 ед./мл, что составляет половину нижнего предела обнаружения.
Для 1У данных, две отдельные 1У инфузионные модели приспособлены для определяемых сывороточных концентраций для каждого субъекта, и 8С данные приспособлены для двух отдельных инъекционных моделей.
Рассчитывались следующие фармакокинетические параметры:
(ί) наблюдаемые пиковые концентрации, Смакс. (ед./мл); (ίί) области под кривой от 0 до 48 ч, АИС, используя правило трапеции;
(ΐϊϊ) период полужизни при выведении;
и от 1У инфузионных данных (если использовали IV):
(ίν) распределение периода полужизни (ч);
(ν) клиренс (мл/ч) (νί) очевидный объем распределения, Уб (л).
Для вычисления полужизни при выведении после 8С и 1М инъекций используется компьютерная программа №ίηΝοη1ίη (Научная Консультационная компания, Арех, ЫС). Для неоптерина средние арифметические значения в зависимости от времени представлены для каждой группы. Рассчитано Емакс., максимальное отклонение от исходного значения. Смакс., АИС и Емакс. подвергают одноступенчатому анализу, чтобы сравнить группы дозирования. Смакс. и АИС до анализа подвергают логарифмическому преобразованию; представлены средние геометрические значения.
Пример 6. Сравнительная оценка фармакокикетики конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона и бета-1а-интерферона у обезьян резус. Материалы и методы
Бета-1а-интерферон и конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон вводили обезьянам резус в 1-ый день 1 раз и еще раз на 29 день внутривенным (1У) или подкожным путем (8С), как описано в общей схеме примера 5. В 1 день 6 обезьян получили ΙΕΝ бета-1а (3 обезьяны на 1 путь введения), и другие 6 обезьян получили конъюгированный с ПЭГ ΙΕΝ бета-1а (3 на путь введения). На 29 день дозы повторили. Доза 1У вводилась как медленная болюсная инъекция в краниальную или ножную подкожную вену.
Доза 8С вводилась под кожу на спине после выбривания места инъекции. Забор крови производили через бедренную вену в точно установленные моменты времени и давали ей свернуться для получения сыворотки. Сыворотку исследовали на определение уровней функциональных веществ лекарственного средства, используя утвержденный антивирусный СРЕ способ и для уровней сывороточного неоптерина и бета-2-микроглобулина, как фармакодинамической меры активности. Фармакологические параметры были рассчитаны с использованием компьютерной программы νίηΝοηΙίη, версия 2.0 (Научная Консультационная компания, Арех, ΝΟ).
Данные концентрации анализировали стандартными, не зависимыми от модели способами (ненезависимый анализ) для получения фармакокинетических параметров. Область под кривой (АИС) была рассчитана с использованием правила трапеции. Статистические исследования, включая среднеарифметическое значение и допустимое отклонение, проводили с использованием компьютерной программы Мюгокой Ехе1, версия 5.0 (Мкгокой Сс, Вебтоиб VΑ). Значения концентрации, представленные ниже как предельные значения количества (ВЬф), не использовались в фармакокинетическом анализе. Из-за того, что различные компьютеры и компьютерные программы различным образом округляют или сокращают числа, значения в некоторых таблицах (например, средние значения, допустимые отклонения или индивидуальные значения) могут слегка отличиться от таковых в других таблицах, от индивидуальных расчетных данных или от данных статистического анализа. Эти различия не влияют ни на целостность, ни на интерпретацию этих данных.
Выводы и обсуждение
В каждом пути введения конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон показывал более высокую биодоступность (что измерено по области под кривой сывороточной концентрации от времени). Кроме того, конъюгированный с ПЭГ бета-1а-интерферон имел более высокую абсолютную биодоступность по сравнению с бета-1а-интерфероном при введении 8С путем. Фармакокинетические параметры суммированы в табл. 5. Применение конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона как Ιν, так и 8 С путями приводит к увеличению периода полужизни так же, как АИС ΙΕΝ бета-1а.
Таблица 5 Среднее значение (±допустимое отклонение) ВС9418 фармакокинетические параметры после Ιν или 8С введения (доза 1) 1 Μϋ/кг ΙΕΝ Ь-1а или конъюгированного с ПЭГ ΙΕΝ В-1а обезьянам резуса
Готовая препаративная форма (путь введения) С '-хмакс. Тмакс. АиС и* ч/мл СЬ, мл/кг νκκ, мл/кг Т1/2
ΙΕΝ В-1а 6400 0,083 4453 229 543 3,2
(Ιν) (±0) (±0) (±799) (±38) (±147) (±1,4)
Конъюгированный с ПЭГ ΙΕΝ-Ыа (Ιν) 10800 0,083 34373 29 250 9,5
(±3811) (±0) (±3601) (±3) (±30) (±2,1)
ΙΕΝ В-1а 277 5,3 4753 Ν/А Ν/А 10,0
(8С) (±75) (±1,2) (±3170) (±2,9)
Конъюгированный с ПЭГ ΙΕΝ В-1а (8С) 1080 3,3 42283 Ν/А Ν/А 22,0
(±381) (±1,2) (±5934) (±3,4)
После Ιν введения первой дозы среднее значение (±допустимое отклонение) пиковой сывороточной концентрации (Смакс.) ΙΕΝ бета-1а и конъюгированного с ПЭГ ΙΕΝ бета-1а составило 6400 (±0) и 10800 (±3,5) ед./мл соответственно. Среднее (±стандартное отклонение) АИС значений составило 4453 (±799) и 34373 (±3601) ед.* ч/мл соответственно. После первого 8С введения среднее значение (±стандартное отклонение) Смакс. ΙΕΝ бета-1а и конъюгированного с ПЭГ ΙΕΝ бета-1а составило 277 (±75) и 1080 (±381) ед./мл соответственно. Среднее ^стандартное отклонение) АИС значения составило 4753 (±3170) и 44952 (±1443) ед.* ч/мл соответственно.
Уровни как сывороточного неоптерина, так и сывороточного бета-2-микроглобулина обработки ΙΕΝ-бета и регистрированным ΙΕΝбета были выше, показывая фармакологическую активность продуктов. При высоких дозах используемых тестируемых соединений не имелось никаких отличий в фармакологической активности ΙΕΝ бета-1а и конъюгированного с ПЭГ ΙΕΝ бета-1а при введении любым путем (данные представлены).
Пример 7. Сравнительная оценка фармакокинетики конъюгированного с ПЭГ бета-1аинтерферона и бета-1а-интерферона у крыс после введения различными способами.
Цель этого исследования состоит в определении сравнительной биодоступности бета1 а-интерферона и конъюгированного с ПЭГ бета1 а-интерферона при нескольких путях введения.
Материалы и способы
Авторы использовали самок крыс Ье^к (по 190 г каждая) для фармакокинетического исследования с 2 крысами на путь введения/состав. Крысам устанавливали катетер в яремную вену и вводили или человеческий бета1а-интерферон, или 5К конъюгированного с ПЭГ человеческого бета-1а-интерферона, или 20К человеческого бета-1а-интерферона (в носителе, состоящем из 14 мг/мл Н8А в 50 мМ фосфата натрия, 100 мМ №1С1 рН 7,2) внутривенно, интраперитонеально, перорально, подкожно, интратрахеально. Кровь обрабатывали несколько раз в течение 72 ч через 0,5 мин, 15 мин, 30 мин, 75 мин, 3 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч. Схема представлена в табл. 6. Анализ цитопатического эффекта (СРЕ) проводился на образцах сыворотки для определения бета-1а-интерферона. Результаты, полученные с немодифицированным бета-1а-интерфероном и бета-1аинтерфероном, конъюгированным с ПЭГ 20К ПЭГ, представлены в табл. 7. Во всех случаях конъюгирование с ПЭГ приводило к значительным увеличениям в Т1/2 и АИС.
*η=3
Таблица 6
Таблица 7
Фармакокинетические параметры после IV, 8С, ΙΡ или ГТ введения бета-1а-интерферона (ΊΡΝ) и конъюгированного с ПЭГ 1РН-бета-1а (ΙΡΝ-ПЭГ) у крыс
Готовая препаративная форма (путь введения) С '-'макс., ед./мл Т макс. ч ΑυС/доза, ед./ч, мл-мкг Т1/2, ч
ИЛ (IV, доза 20 мкг) 64000 0,25 3035 1,25
ПЛ-РЕОг (IV, доза 3 мкг) 23970 0,08 47728 8,44
№Ν (8С, доза 20 мкг) 2400 1,00 464,4 0,96
Щ’-РЕО (8С, доза 3 мкг) 2400 7,00 14688 11,9
ПЛ (ПР, доза 20 мкг) 26000 1,25 4159 1,53
Щ’-РЕО ЦР, доза 3 мкг) 9700 1,25 52148 16,2
ПЛ (РТ, доза 15 мкг) 240 1,5 70,7 1,29
Щ’-РЕО ЦТ, доза 15 мкг) 270 7,0 233,5 6,21
Пример 8. Антиангиогенный эффект полимер-конъюгированного бета-1а-интерферона: оценка способности конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона ингибировать пролиферацию эндотелиальных клеток ш νίΙΐΌ
Венозные эндотелиальные клетки человека (Се11 8ук1ет, Са!. #2νθ-Ρ75) и микроваскулярные эндотелиальные клетки кожи человека (Се11 8ук!ет, Са!. #2М1-С25) поддерживаются в культуре с набором сред С8-С (Се11 8ук!ет, Са!. #4Ζ0-500). За 24 ч до эксперимента клетки обрабатывают трипсином и ресуспендируют в аналитической среде, 90% М199 и 10% фетальной бычьей сыворотке, и доводят до желательной плотности клеток. Затем клетками покрывают 24- и 96-луночные планшеты, покрытые желатином, или при 12500 клетках/лунку, или 2000 клетках/лунку, соответственно.
После инкубации в течение ночи аналитическую среду заменяли свежей средой, содержащей 20 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (Вес!оп Оюкшкоп, Са!. #40060) и различные концентрации конъюгированного и неконъюгированного белка бета-1а-интерферона или положительный контроль (эндостатин может использоваться как положительный контроль, и как антитело к ЬГСГ). Конечный объем доводится до 0,5 мл в 24-луночном планшете или 0,2 мл в 96луночном планшете.
Через 72 ч клетки обрабатывают трипсином для Сои1!ег подсчета, замораживают для СуОиагИ флуоресцентного считывания или метят [3Н]тримидином. Сравнивают ингибирование пролиферации эндотелиальных клеток ш уйго конъюгированным и неконъюгированным бета-1а-интерфероном, показывая, что конъюгирование с ПЭГ не связано со способностью интерферона проявлять данную функцию в этом исследовании.
Это исследование ш уйго тестирует молекулы бета-1а-интерферона данного изобретения на воздействие на пролиферацию эндотелиальных клеток, которое может быть показательно для антиангиогенного эффекта ш у1уо. Смотри 0'йеШу, М.8., Т. Воейт, Υ. 8Ыпд, Ν. Ρика1, О. Vак^ок. V. Йапе, Е. Ρ1уππ, Г. Вйкйеаб, В. 01кеп и Г. Ρо1ктап (1997). Епбок!а!1п: Αп Епбодепоик Iπй^Ь^!о^ оГ Αпд^одепк^д апб Титог СгоМй. Се11 88, 277-285.
Пример 9. Ш у1уо модель для тестирования антиангиогенного эффекта и эффекта неоваскуляризации конъюгированного бета-1а-интерферона.
Многообразные модели были разработаны для тестирования антиангиогенного эффекта и эффекта антинеоваскуляризации описанных здесь молекул. Некоторые из этих моделей были описаны в патентах США 5733876 (31 марта 1998: Способ ингибирования ангиогенеза) и 5135919 (4 августа, 1992: Способ и фармацевтическая композиция для ингибирования ангиогенеза). Другие исследования - анализ беспанцирных хориолантойных мембран (САМ) 8. Тау1ог и Г. Ρо1ктаπ; №11иге, 297, 307 (1982) и В.Стит., 8.8/аЬо и Г. Ρо1ктаπ; 8аепсе. 230. 1375 (1985); модель Ρо1ктаπ, Г. е! а1. -ангиогенез способом мышиного спинного воздушного мешка; Г Ехр. Меб., 133, 275 (1971) и анализ роговичного ткгороске! крыс, ОтЬтопе, Μ.Α. Гт. е! а1., Г. №!1. Сапсег й1кГ 52, 413 (1974), в котором васкуляризация роговицы вызвана у взрослых самцов крыс линии 8ртадие-ОаМеу (Сйаг1ек КГует, Гарап) имплантацией в каждую роговицу шариков 500 нг основного ΡΟΡ (бычий, й и Ό 8ук!етк Шс.), импрегнированных в ΕνΕ (этиленвинилацетатный сополимер).
Другие способы тестирования конъюгированного с ПЭГ бета-1а-интерферона мыши на антиангиогенные эффекты на животной модели включают (не ограничиваясь ими) схемы скринирования новых возможных противораковых агентов, как описано в опд1па1 Сапсег Сйето!йегару йеройк, Раг! 3, νθ1. 3, ’о 2, 8ер!етЬег 1972 апб !йе кирр1етеп! Ш νί\Ό Сапсег Мобе1, 1976-1982, МН РиЬйсайоп ’о 84-2635, ГеЬгиагу 1984.
Из-за межвидового барьера интерферона I для оценки антиангиогенной активности полимер-конъюгированного бета-1а-интерферона на моделях грызунов получали полимерконъюгированные препараты бета-интерферона грызунов. Такие скринирующие способы иллюстрируются схемой для тестирования антиангиогенных эффектов конъюгированного с ПЭГ бета-интерферона мыши на имплантированной подкожно карциноме легкого Левиса Лунга.
Происхождение опухолевой линии: возникла спонтанно в 1951 как карцинома легкого у С57ВЬ/6 мыши.
Обобщение способов тестирования: фрагмент опухоли внедрен подкожно в подмышечную область Β6Ό2Ρ1 мыши. Тестируемый агент (т.е. конъюгированный с ПЭГ интерферон данного изобретения) вводится в различных дозах, подкожно (8 С) или внутрибрюшинно (ΙΡ) в течение большого количества дней после имплантации опухоли. Измеренный параметр представляет среднюю продолжительность жизни. Результаты выражены как процент от продолжительности жизни контроля.
Животные:
Распространение: С57ВЬ/6 мыши.
Тестирование: Β6Ό2Ρ1 мыши.
Вес: Мыши должны иметь вес в пределах 3 г при минимальном весе 18 г для самцов и 17 г для самок.
Пол: в одном эксперименте использовался один пол для теста и контроля.
Источник: в одном эксперименте при возможности использовали один источник для всех животных.
Величина экспериментальной группы: 10 животных на испытательную группу.
Передача опухоли:
Разведение:
Фрагмент: Готовят фрагмент 2-4 мм из подкожной донорской опухоли.
Время: 13-15 дней.
Место: фрагмент имплантируют подкожно в подмышечную область с пункцией в паховую область.
Тестирование:
Фрагмент: Готовят фрагмент 2-4 мм из подкожной донорской опухоли.
Время: 13-15 дней.
Место: Имплантируют фрагмент подкожно в подмышечную область пункцией в паховую область.
График тестирования:
день: Имплантирование опухоли. Получение бактериальных культур. Тестовое соединение положительного контроля для каждого нечетного эксперимента. Подготовка материалов. Ежедневная регистрация случаев смерти.
день: Проверка культуры. Отбраковка эксперимента при загрязнении. Яапбош1/е животных. Обработка по инструкции (в 1 день и в последующие дни).
день: Проверка культуры. Отбраковка эксперимента при загрязнении.
день: Оценка токсичности агента по весу 2 дня и дня начала тестирования.
день: Контроль дня ранней гибели. 48 день Контроль поЧаке дня.
день: Конец и оценка эксперимента. Исследование легких на рост опухоли.
Контроль качества: План соединения для положительного контроля (N80 26271 (Су1охап в дозе 100 мг/кг/введение)) в каждом нечетном эксперименте, режим которого является внутрибрюшинным только в 1 день. Более низкое тест/контроль ограничение для положительного контроля составляет 140%. Средняя продолжительность жизни необработанного контроля 19-35,6 дней.
Оценка: Измеренный параметр представляет среднюю продолжительность жизни. Вычисляют средний вес тела животного в течение 1 дня и 5 дня, вычисляют соотношение тест/контроль для всех тестируемых групп. Вычисляют средний вес тела животного дня начала эксперимента и последнего дня. Вычисляют соотношение тест/контроль для всех тестовых групп с >65% выживания на 5 день. Соотношение тест/контроль критерий <86% указывает на токсичность. Чрезмерное изменение веса тела (тест с отрицательным контролем) может также использоваться в оценке токсичности.
Критерии активности: Начальное соотношение тест/контроль, большее чем или равное 140%, рассматривается необходимым для проявления умеренной активности. Воспроизводимое значение соотношения тест/контроль, большее чем или равное 150%, рассматривается как значительная активность.
Список последовательностей <110> ΒΙΟΟΕΝ, 1пс, еС. а1.
<120> Полимерные конъюгаты Р1а-интерферона и их использование <130> 00689-514-112/2403-124398/233 <140> 200100446 <141> 1999-10-15 <150> РСТ/и399/24201 <151> 1999-10-15 <150> 60/104,572 <151> 1998-10-16 <150> 60/120,161 <151> 1999-02-16 <160> 40 <170> РазСЗЕф £ог Ηίηάονδ Уегзьоп 4.0 <210> 1 <211> 549 <212> ДНК <213> мышь <400> 1
Сссдддддсс ассассасса СсаСсаСадс Сссддадасд аСдаСдасаа даСдадсСас 60 аасссдссСд даССссСаса аадаадсадс ааСЬСХсадС дСсадаадсС ссСдсддсаа 120 седаасддда ддсССдааСа сСдссСсаад дасаддасда асСССдасаС ссссдаддад 180 аСсаадсадс сдсадсадСС ссадааддад дасдссдсаС ЬдассаСсСа СдадаСдсСс 240 садаасассс ссдссасссс садасаадаС СсаСсСадса сЬддседдаа сдадассасс. 300 дССдадаасс СссСддсСаа СдЬсСаСсаС садакааасс аЬсЬдаадас адСссСддаа 360 даааааседд адааадаада ссссассадд ддаааасСса ЬдадсадСсс дсассСдааа 420 адасассасд ддаддассес дсаССассСд ааддссаадд адСасадсса ссдСдссСдд 480 ассаСадсса дадсддааас ссСааддаас СЬССасССса ьсаасадасс Сасаддссас 540 сСссдааас 549 <210> 2 <211> 183
<212>
<2ΐ: !> мышь
<400> 2
Зег С1у С1у Η13 Н1з Н1з Н1з ΗΪ3 Н1з Зег Зег С1у Азр Азр Азр Азр
1 5 10 15
Ьуз Мес Зег Туг Азп Ьеи Ьеи С1у РЬе Ьеи С1п Агд Зег Зег Азп РЬе
20 25 30
С1п Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр <31п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз
35 40 45
Ьеи Ьуз Азр Агд Мес Азп РЬе Азр 11е Рго С1и С1и 11е Ьуз С1п Ьеи
50 55 60
С1п С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЪг Не Туг С1и Мес Ьеи
65 70 75 80
С1п Азг. Не РЬе А1а 11е РЬе Агд С1п Азр Зег Зег Зег ТЬг С1у Тгр
85 90 95
Азп С1и ТЬг 11е Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг ΗΪ3 С1п 11с
Ηί:
ТЬг
Агд
145
ТЬг
130
Не
Ьеи
115
СЬу юо
Ьуз
Ьу:
НЬз
ТЬ:
Туг
Не
УаЬ
Агд
ТЬ:
СЬу
Туг
180
УаЬ
165
Ьеи
Уа1
Мер
Агд
Зег
135
Ьуз
Не
Азп
СЬи
120
Зег
АЬа
Ьеи
105
СЬи
Ьуз
Агд
Ьуз
ΗΪ3
СЬи
Азп
170
Ьеи
Ьеи
Туг
155
РЬе
СЬи
Ьуз
140
Зег
Туг
Ьуз
125 Агд
ΗΪ5
РЬе но
СЬи
Рп <210> 16
Ту:
Ту:
С1у <211> 72 <212> ДНК <213> человек
Суз
А1а
11<
Тгр
160
Агд <210> 3 <211> 60 <212> ДНК <213> человек :400> 3 .РсРссддад асдаРдаРда саадакдадс РасаасРРдс
СЬддаРРссР асааадаадс <210> <211>
<212>
<213>
ДНК человек сддаддраас сРдРаадР<
<210> <211 >
<212>
<213>
ДНК человек адсРРссддд ддссаРсаРс :400:
аРсаРсаРса РадсР <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК человек б
ссддадсРаР даРдаРдаЪд :400:
<210:
<211:
<212:
<213:
ДНК человек <4ОО>
ссддадасда рдардасаад аРРРРсадРд РсадаадсРс аРддсРРасд ссдсРсРРдд адсссРасаа дсРРсРадса сРдРддс <210> 8 <211> 60 <212> ДНК <213> человек даРсРадсаа РдсРдссРдР 9
ДНК человек <210>
<211>
<212>
<213>
рддсРдссЬР дааРдддадд сРРдааРасР <4 00>
дссРсаадда саддардаа:
рррдасаРсс сРдаддадаР РаадсадсРд са <210>
<211 >
<212>
<213>
ДНК человек <400:
ааРРдааРдд дадддсрдса адаРРаадса дсРдса дсРРдсдсРд садасаддаР даасРРРдас аРсссРдадд <210> <211> <212>
<213>
ДНК человек <400> 16 ддааРдсРРс ааррдррдср дсасРссРда дсааРдРсРа РсаРсадаРа аассаРсРда адасадррср ад <210> 17 <212> ДНК <213> человек <400> 17 ддааРдадас саррдррдад аассрссРдд сРааРдРсдс СсаРсадаРа дсасарсрдд срдсадррср ад <210> 18 <211> 44 <212> ДНК <2ЬЗ> человек <400> 18 сРадсРдсаа аасРддсРдс адсРдаРРРс ассаддддаа аасС <210> 19 <211> 69 <212> ДНК <213> человек <400> 19 сРадаадааа аасРддадаа адаадсадсР ассдсРддаа аадсааРдад сдсдсРдсас сРдаааада <210> 20 <2Н> 51 <212> ДНК <213> человек <400> 20
РаРРарддда ддаРРсрдса РРассРдаад дссааддадр асРсасасрд р <210> 21 <211> 76 <212> ДНК <213> человек <400> 21 сардадсадр сРдсассРда ааадаРаРРа РддддсааРР дсРдсаРасс рддсадссаа ддадРасРса сасрдр <210> 22 <211> 87 <212> ДНК <213> человек <400> 22 сардадсадр сРдсассРда ааадаРаРРа РдддаддаРР сРдсаРРасс Ъдааддссдс рдсаРасРса сасРдРдсср ддасдаР <210> 23 <2И> 87 <212> ДНК <213> человек <40О> 23 сардадсадр сРдсассРда ааадаРаРРа РдддаддаРР сРдсаРРасс Рдааддсааа ддадрасдсР дсаРдРдссР ддасдаР <210> 24 <211> 50 <212> ДНК <213> человек <400> 24 сдРсададсР даааРссРад сааасРРРдс аРРсаРРдса адасРРасад <210> 25 <2Н> 166 <212> белок <213> человек <400>
ааРРдааРдд даддсррдаа адаРРаадса дсРдса
РасРдссРса аддасадддс РдсаРРРдсР аРсссРдсад <210> <211> <212> <213>
ДНК человек <400> ааРРдааРдд даддсРРда;
РасРдссРса :ддасаддаР даасРРРдас <210>
<211>
<212>
<213>
ДНК человек <400>
РсссРдадда даРРдсРдса дсРдсадсРР РсдсРдсадс рда <2 10>
<211>
<212 >
<213>
<400> 25
Мер 1 Зег Туг Аэп 5 С1у РЬе Ьеи СЬп 10 Агд Зег Зег Азп РЬе 15 СЬп
Суз СЬп Ьуз Ьеи Ьеи Тгр СЬп Ьеи Азп СЬу Агд Ьеи СЬи Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Мер Азп РЬе Азр 11е Рго СЬи СЬи 1Ье Ьуз СЬп Ьеи СЬп
35 40 45
СЬп РЬе СЬп Ьуз СЬи Азр АЬа АЬа Ьеи ТЬг 11е Туг СЬи Мер Ьеи СЬп
50 55 60
Азп Не РЬе АЬа Не РЬе Агд СЬп Азр Зег Зег Зег ТЬг СЬу Тгр Азп
65 70 75 80
СЬи ТЬг Не УаЬ СЬи Азп Ьеи Ьеи А1а Азп УаЬ Туг Н13 СЬп Не Азп
85 90 95
Н13 Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи СЬи С1и Ьуз Ьеи СЬи Ьуз СЬи Азр РЬе ТЬг
100 105 но
Агд СЬу АЬа Ьеи Мер Зег Зег Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг СЬу Агд
Ь Ь 5 120 125
Не Ьеи Н13 Туг Ьеи Ьуз АЬа Ьуз СЬи Туг Зег НЬз Суз АЬа Тгр ТЬг
130 135 140
Не УаЬ Агд Уа1 СЬи 11е Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд 11е Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг СЬу Туг Ьеи Агд Азп
165 <400:
сдссдсдРРд ассаРсРаРд аРсРадсасР ддсрддаа адаРдсРсдс РаасаРсдсР адсаРРРРса дасаадаРРс < 2 10 > 26 <211> 166 <212> белок <213> человек днк человек <400>
сдссдсаррд ассаРсРаРд аРсРадсасР ддсрддаа адаРдсРсса даасаРсРРР дсРаРРРРсд срдсадсРРс <400> 26
Мер АЬа Туг АЬа АЬа Ьеи СЬу АЬа Ьеи СЬп АЬа Зег Зег Азп РЬе СЬп
1 5 10 15
Суз СЬп Ьуз Ьеи Ьеи Тгр СЬп Ьеи Азп СЬу Агд Ьеи СЬи Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Мер Азп РЬе Азр 1Ье Рго СЬи СЬи Не Ьуз СЬп Ьеи СЬп
35 40 45
СЬп РЬе СЬп Ьуз С1и Азр АЬа АЬа Ьеи ТЬг Не Туг СЬи Мер Ьеи СЬп
50 55 60
Азп Не РЬе АЬа Не РЬе Агд СЬп Азр Зег Зег Зег ТЬг СЬу Тгр Азп
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи ΗΪ5 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у
115 120 125
Не Ьеи ΗΪ3 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Зег Н15 Суз А1а Тгр
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи Н1з Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Н1з Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз О1и Туг Бег Ηίε Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи Ηίδ Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у
115 120 125
Не Ьеи Н13 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Бег ΗΪ5 Суз А1а Тгр
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи С1п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд С1п Азр Бег Бег Бег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг ΗΪ3 С1п Не Азп
85 90 £уз 95
Н13 Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи 61и С1и Ьуз Ьеи С1и С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 110
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Бег Ьеи Низ Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Н15 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Зег ΒΪ8 Суз А1а Тгр ТЫ
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и 11е Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
Не Ьеи ΗΪ3 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз Б1и Туг Бег Й1з Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не νβΐ Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг С1у Туг Ьеи Агд Азп
165
<210> 31 <211> 166 <212> белок <213> человек <400> 31
Меб 1 Зег Туг Азп Ьеи Ьеи 5 61у РЬе Ьеи С1п 10 Агд Бег Зег Азп РЬе 15 С1п
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе Азр Не Рго С1и С1и Не Ьуз С1п Ьеи С1п
35 40 45
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг 11е Туг С1и Меб Ьеи А1а
50 55 60
Азп Не А1а Зег Не РЬе Агд С1п Азр Бег Бег Бег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЫ Не Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг ΗΪ3 С1п Не Азп
85 90 95
Н1з Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз 21и Азр РЬе ТЫ
100 105 110
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Бег Ьеи Н1з Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Η15 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Бег ΗΪ3 Суз А1а Тгр ТНг
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг С1у Туг Ьеи Агд Азп
165 <210> 32 <211> 166 <212> белок <213> человек <400> 32
Меб Зег 1 Туг Азп Ьеи 5 Ьеи
Суз С1п Ьуз Ьеи 20 Ьеи Тгр
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе
С1п РЬе С1п Ьуз О1и Авр
Азп Не РЬе А1а Не РЬе
65 С1и ТЬг Не Уа1 С1и 70 Азп
Н15 Ьеи Ьуз ТЬг 85 Уа1 Ьеи
Агд С1у А1а 100 Ьеи Меб Бег
Не Ьеи 115 ΗΪ3 Туг Ьеи Ьуз
Не 130 Уа1 Агд Уа1 С1и Не
С1у РЬе Ьеи С1п Агд Бег Бег Азп РЬе 15 Θ1Π
10
С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
25 30
Азр Не Рго С1и С1и Не Ьуз С1п Ьеи С1п
40 45
А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи С1п
55 60
А1а А1а А1а Бег Бег Зег ТЬг С1у Тгр Азп
75 80
Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг ΗΪ3 С1п Не Азп
90 95
С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз С1и Азр РЬе ТЬг
105 но
Бег Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
120 125
А1а Ьуз С1и Туг Бег Ηί3 Суз А1а Тгр ТЬг
135 140
Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
160
145 150 155
ТЬг С1у Туг Ьеи Агд Азп
165 <210> 33 <211> 166 <212> белок <213> человек <400> 33
Меб 1 Бег Туг Азп Ьеи 5 Ьеи С1у РЬе Ьеи С1п 10 Агд Бег Бег Азп РЬе 15 С1п
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе Азр Не Рго С1и С1и 11е Ьуз С1п Ьеи С1п
35 40 45
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг 11е Туг С1и Меб Ьеи С1п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд С1п Азр Бег Зег Бег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
А1а Бег Не ба1 А1а А1а Ьеи Ьеи Бег Азп Уа1 Туг Нгз С1п Не Азп
85 90 95
Ηίδ Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 110
Агд С1у А1а Ьеи Меб Бег Бег Ьеи ΗΪ5 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Ηίδ Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Бег Н1з Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЫ С1у Туг Ьеи Агд Азп
165 <210> 34 <211> 166 <212> белок <213> человек <400> 34
Меб 1 Бег Туг Азп Ьеи Ьеи 5 С1у РЬе Ьеи С1п Агд 10 Бег Бег Азп РЬе 15 С1п
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе Азр Не Рго С1и С1и Не Ьуз С1п Ьеи С1п
35 40 45
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи С1п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд С1п Азр Бег Бег Зег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 А1а ΗΪ3 С1п Не А1а
85 90 95
ΗΪ3 Ьеи А1а А1а Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьу5 С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 но
Агд С1у А1а Ьеи Меб Бег Бег Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Н13 Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Бег ΗΪ3 Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЫ С1у Туг Ьеи Агд Азп
165
Мей 5ег Туг 1 Азп Ьеи 5 Ьеи С1у РЬе Ьеи С1п 10 Агд Зег Зег Азп РЬе 15 С1п
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе Азр 11е Рго С1и С1и 11е Ьуз С1п Ьеи С1п
35 40 45
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи С1п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд С1п Азр Зег Зег Зег ТЬг С1у Тгр Азп
С1п РЬе 50 С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг 11е Туг С1и Меб Ьеи С1п
55 60
Азп Не РЬе А1а 11е РЬе Агд С1п Азр Зег Зег Зег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг Нхз С1п Не Азп
85 90 95
ΗΪ5 Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 но
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
11е Ьеи Н1з Туг Ьеи Ьуз А1а А1а А1а Туг Зег Н15 Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не Уа1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
<400> 39
Меб Зег Туг Азп Ьеи Ьеи <31у РЬе Ьеи С1п Агд Зег Зег Азп РЬе С1п
1 5 10 15
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп 61у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз А5р Агд Меб Азп РЬе Азр Не Рго С1и С1и Не Ьуз 31п Ьеи С1п
35 40 45
31п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи 61п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд О1п Азр 2ег Зег Бег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не Уа1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг Н1з С1п Не Азп
85 90 95
Н1з Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 НО
Агд С1у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи Нхз Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 1 125
11е Ьеи Н1з Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг А1а А1а Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не \7а 1 Агд Уа1 С1и Не Ьеи Агд Азп РЬе Туг Агд Не Азп Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг С1у Туг Ьеи Агд Азп
165 <210> 40 <211> 166 <212> белок <213> человек < 4 0 0 > 40
Меб Зег Туг Азп Ьеи Ьеи С1у РЬе Ьеи 61п Агд бег Зег Азп РЬе С1п
1 5 10 15
Суз С1п Ьуз Ьеи Ьеи Тгр С1п Ьеи Азп С1у Агд Ьеи С1и Туг Суз Ьеи
20 25 30
Ьуз Азр Агд Меб Азп РЬе Азр Не Рго С1и С1и Не Ьуз С1п Ьеи С1п
35 40 45
С1п РЬе С1п Ьуз С1и Азр А1а А1а Ьеи ТЬг Не Туг С1и Меб Ьеи С1п
50 55 60
Азп Не РЬе А1а Не РЬе Агд 31п Азр Зег Зег Бег ТЬг С1у Тгр Азп
65 70 75 80
С1и ТЬг Не \7а1 С1и Азп Ьеи Ьеи А1а Азп Уа1 Туг Нхз С1п Не Азп
85 90 95
Н1з Ьеи Ьуз ТЬг Уа1 Ьеи С1и С1и Ьуз Ьеи С1и Ьуз С1и Азр РЬе ТЬг
100 105 но
Агд <31у А1а Ьеи Меб Зег Зег Ьеи ΗΪ3 Ьеи Ьуз Агд Туг Туг С1у Агд
115 120 125
Не Ьеи Н1з Туг Ьеи Ьуз А1а Ьуз С1и Туг Зег ΗΪ5 Суз А1а Тгр ТЬг
130 135 140
Не Уа1 Агд А1а С1и Не Ьеи А1а Азп РЬе А1а Агд Не А1а Агд Ьеи
145 150 155 160
ТЬг С1у Туг Ьеи Агд Азп
165

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Композиция, содержащая гликозилированный β 1а-интерферон с аминокислотной последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:25, связанный с неприродным полимером по Ν-концу указанного гликозилированного в1а-интерферона, причем указанный полимер содержит полиалкиленгликолевый радикал.
  2. 2. Композиция по п.1, в которой полиалкиленгликолевый фрагмент связан с β 1аинтерфероном посредством группы, выбранной из альдегидной группы, малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы, множества гистидиновых остатков, гидразиновой группы и аминотиоловой группы.
  3. 3. Композиция по п.1, в которой гликозилированный β 1а-интерферон является более активным, чем β 1Ь-интерферон при измерении в анализе противовирусной активности.
  4. 4. Композиция по п.3, в которой β 1аинтерферон сохраняет 50-100% эффективности β1а-интерферона без указанного полимера при измерении в анализе противовирусной активности.
  5. 5. Композиция β1а-интерферона по п.1, в которой полимер имеет молекулярную массу приблизительно от 5 приблизительно до 40 кДа.
  6. 6. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию β1а-интерферона по п.5.
  7. 7. Композиция, содержащая мутантный βинтерферон, связанный с неприродным полиме61 ром по Ν-концу указанного мутантного βинтерферона, причем указанный полимер содержит полиалкиленгликолевый радикал, где указанный мутантный β-интерферон представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей ЗЕО ΙΌ ΝΟ:26-40.
  8. 8. Физиологически активная композиция β-интерферона, содержащая физиологически активный β 1а-интерферон с аминокислотной последовательностью ЗЕО ΙΌ ΝΟ:25, связанный с полимером, содержащим полиалкиленгликолевый радикал, где физиологически активный β1а-интерферон и полиалкиленгликолевый фрагмент взаимно расположены таким образом, что физиологически активный β1а-интерферон в физиологически активной композиции βинтерферона обладает повышенной активностью относительно физиологически активного β1Ь-интерферона при измерении в анализе противовирусной активности.
  9. 9. Композиция по п.8, в которой
    а) β1а-интерферон связан с полимером на Ν-концевом участке;
    б) β1а-интерферон связан с полимером на С-концевом участке или вблизи С-концевого участка; или
    в) β1а-интерферон связан с полимером посредством гликанового радикала.
  10. 10. Устойчивый водорастворимый комплекс конъюгированного β1а-интерферона, содержащий β1а-интерферон, связанный с полиэтиленгликолевым радикалом, где β 1аинтерферон имеет аминокислотную последовательность ЗЕО ΙΌ ΝΟ:25 и связан с полиэтиленгликолевым фрагментом лабильной связью по Ν-концу, причем указанная лабильная связь расщепляется биохимическим гидролизом и/или протеолизом.
  11. 11. Применение β1а-интерферона с амино- кислотной последовательностью ЗЕО ΙΌ ΝΟ:25 для получения фармацевтической композиции для профилактического или терапевтического лечения воспалительных, аутоиммунных, ангиогенных, опухолевых или вирусных заболеваний, поддающихся лечению β 1аинтерфероном, у млекопитающего, где указанный β1а-интерферон с аминокислотной последовательностью ЗЕО ΙΌ ΝΟ:25 связан с полиэтиленгликолевым радикалом.
  12. 12. Применение по п.11, согласно которому
    а) β1а-интерферон связан с полимером на Ν-концевом участке;
    б) β1а-интерферон связан с полимером на С-концевом участке или вблизи С-концевого участка; или
    в) β1а-интерферон связан с полимером посредством гликанового радикала.
  13. 13. Способ продления активности |Иаинтерферона с аминокислотной последовательностью ЗЕО ΙΌ ΝΟ:25 в системе ш νί\Ό или ш νίίΐΌ, предусматривающий соединение указанного β1а-интерферона с радикалом неприродного полимера с получением конъюгата полимерβ1а-интерферон и введение указанного конъюгата в систему т νί\Ό или т νίΙΐΌ.
  14. 14. Способ по п.13, согласно которому
    а) β1а-интерферон связывают с полимером на Ν-концевом участке;
    б) β1а-интерферон связывают с полимером на С-концевом участке или вблизи С-концевого участка; или
    в) β1а-интерферон связывают с полимером посредством гликанового радикала.
  15. 15. Способ по п.13, согласно которому указанный полимер содержит полиалкиленгликолевый радикал.
EA200100446A 1998-10-16 1999-10-15 Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование EA004789B9 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10457298P 1998-10-16 1998-10-16
US12016199P 1999-02-16 1999-02-16
PCT/US1999/024201 WO2000023114A2 (en) 1998-10-16 1999-10-15 Polymer conjugates of interferon beta- 1a and their uses

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200100446A1 EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
EA004789B1 true EA004789B1 (ru) 2004-08-26
EA004789B9 EA004789B9 (ru) 2017-05-31

Family

ID=26801696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200100446A EA004789B9 (ru) 1998-10-16 1999-10-15 Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование

Country Status (30)

Country Link
US (5) US6962978B2 (ru)
EP (4) EP1656952B1 (ru)
JP (5) JP4616478B2 (ru)
KR (1) KR100630849B1 (ru)
CN (2) CN1329082C (ru)
AT (1) ATE318149T1 (ru)
AU (1) AU762616B2 (ru)
BR (1) BRPI9915542C1 (ru)
CA (1) CA2345138C (ru)
CY (2) CY1105022T1 (ru)
CZ (1) CZ299164B6 (ru)
DE (1) DE69930015T2 (ru)
DK (2) DK1656952T3 (ru)
EA (1) EA004789B9 (ru)
EE (2) EE04967B1 (ru)
ES (4) ES2653589T3 (ru)
HK (2) HK1042434B (ru)
HU (1) HU229888B1 (ru)
IL (2) IL142282A0 (ru)
IS (1) IS2926B (ru)
LT (2) LT2599503T (ru)
NO (1) NO20011860L (ru)
NZ (1) NZ510689A (ru)
PL (1) PL206536B1 (ru)
PT (2) PT1656952E (ru)
SG (2) SG2008070138A (ru)
SI (2) SI1656952T1 (ru)
SK (1) SK287918B6 (ru)
TR (1) TR200101086T2 (ru)
WO (1) WO2000023114A2 (ru)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL200586B1 (pl) * 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
EP1656952B1 (en) * 1998-10-16 2013-12-18 Biogen Idec MA Inc. Polyalkylene glycol conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7431921B2 (en) 2000-04-14 2008-10-07 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
CZ2002521A3 (cs) * 1999-08-27 2002-05-15 Maxygen Aps Nové molekuly podobné interferonu beta
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
US20030211094A1 (en) 2001-06-26 2003-11-13 Nelsestuen Gary L. High molecular weight derivatives of vitamin k-dependent polypeptides
AU2002212107A1 (en) * 2000-11-02 2002-05-15 Maxygen Aps New multimeric interferon beta polypeptides
BR0207576A (pt) 2001-02-27 2004-04-27 Maxygen Aps Variante glicosilada de um polipeptìdeo de interferon beta precursor (ifnb), processos de aumentar a glicosilação in vivo de uma molécula de ifnb precursora, de produzir uma molécula de ifnb glicosilada, para preparar uma variante conjugada e de tratar um mamìfero com esclerose múltiplam composição farmacêutica, molécula de ifnb variante, sequência de nucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira de glicosilação conjugado, e, uso de um conjugado
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
US7214660B2 (en) 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
DK1578771T3 (da) * 2001-10-10 2013-06-10 Novo Nordisk As Remodellering og glycokonjugering af peptider
US7173003B2 (en) 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7696163B2 (en) 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
EP1476181B1 (en) 2002-01-18 2016-03-23 Biogen MA Inc. Polyalkylene polymer compounds and uses thereof
AU2003254641A1 (en) * 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
EP1539960B1 (en) * 2002-09-09 2010-04-28 Hanall Pharmaceutical Co., Ltd. Protease-resistant modified interferon alpha polypeptides
UA86749C2 (en) * 2002-09-27 2009-05-25 Байоджен Айдек Ма Инк. THERAPIES FOR CHRONIC INFLAMMATORY DEMYELINATING POLYNEUROPATHY USING INTERFERON-в
US20040062748A1 (en) * 2002-09-30 2004-04-01 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
US8129330B2 (en) 2002-09-30 2012-03-06 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates with decreased antigenicity, methods of preparation and uses thereof
AU2003303635B2 (en) * 2002-12-26 2009-07-23 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
TWI364295B (en) * 2002-12-26 2012-05-21 Mountain View Pharmaceuticals Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof with preserved receptor-binding activity
JP2006523211A (ja) 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
WO2004084949A2 (en) * 2003-03-20 2004-10-07 Xencor Generating protein pro-drugs using reversible ppg linkages
BRPI0408946A (pt) * 2003-03-28 2006-04-04 Biopolymed Inc material biologicamente ativo conjugado com polìmero biocompatìvel com complexo 1:1, seu processo de preparação e composição farmacêutica compreendendo o mesmo
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
EP1613261A4 (en) 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As INTRA-CELLULAR FORMATION OF PEPTIDE CONJUGATES
EP2338333B1 (en) 2003-04-09 2017-09-06 ratiopharm GmbH Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
ATE384735T1 (de) * 2003-05-21 2008-02-15 Ares Trading Sa Verfahren zur chromatographischen analyse einer proteinlösung
WO2005012484A2 (en) 2003-07-25 2005-02-10 Neose Technologies, Inc. Antibody-toxin conjugates
AU2004266969B2 (en) 2003-08-25 2010-02-25 Taniguchi, Tadatsugu Interferon-beta composite
US20080305992A1 (en) 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
ES2560657T3 (es) 2004-01-08 2016-02-22 Ratiopharm Gmbh Glicosilación con unión en O de péptidos G-CSF
JP2007519422A (ja) 2004-02-02 2007-07-19 アンブレツクス・インコーポレイテツド 修飾されたヒト四螺旋バンドルポリペプチド及びそれらの使用
WO2005084303A2 (en) * 2004-03-01 2005-09-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Interferon-beta polymer conjugates
WO2005112911A2 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating myelin deficiency disorders
US20060029573A1 (en) * 2004-06-30 2006-02-09 Chun Shen Pegylated interferon alpha-1b
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
EP1799249A2 (en) 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated interferon alpha
SI2586456T1 (sl) 2004-10-29 2016-05-31 Ratiopharm Gmbh Preoblikovanje in glikopegliacija fibroblastnega rastnega faktorja (FGF)
EP1858543B1 (en) 2005-01-10 2013-11-27 BioGeneriX AG Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
WO2006121569A2 (en) 2005-04-08 2006-11-16 Neose Technologies, Inc. Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants
EP2975135A1 (en) 2005-05-25 2016-01-20 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
US20070105755A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
US20070092486A1 (en) * 2005-10-21 2007-04-26 Avigenics, Inc. Glycolated and glycosylated poultry derived therapeutic proteins
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
EP1951285A2 (en) * 2005-11-18 2008-08-06 Ares Trading S.A. Interferon in influenza
CA2634034A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Duke University Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties
CN100475270C (zh) * 2006-01-20 2009-04-08 清华大学 一种***的药物及其应用
WO2007110231A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Nautilus Biotech, S.A. MODIFIED INTERFERON-β (IFN-β) POLYPEPTIDES
US7982010B2 (en) 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
CA2647314A1 (en) 2006-03-31 2007-11-08 Baxter International Inc. Pegylated factor viii
US8637325B2 (en) * 2009-02-16 2014-01-28 University Of Wyoming Method and apparatus for pyrolysis-induced cleavage in peptides and proteins
CN101516388B (zh) 2006-07-21 2012-10-31 诺和诺德公司 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化
WO2008025856A2 (en) 2006-09-01 2008-03-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified glycoproteins
WO2008031612A1 (en) * 2006-09-15 2008-03-20 Creabilis Therapeutics S.P.A. Polymer conjugates of box-a of hmgb1 and box-a variants of hmgb1
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES
DK2101821T3 (da) 2006-12-15 2014-10-06 Baxter Healthcare Sa Faktor VIIA-(poly)sialinsyre-konjugat med forlænget halveringstid in vivo
CN101743018A (zh) * 2006-12-19 2010-06-16 梅里麦克药品公司 甲胎蛋白和免疫调谐剂的共同施用以治疗多发性硬化
ES2406267T3 (es) 2007-04-03 2013-06-06 Biogenerix Ag Métodos de tratamiento usando G-CSF glicopegilado
CA2685596A1 (en) 2007-05-02 2008-11-13 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
WO2008154639A2 (en) 2007-06-12 2008-12-18 Neose Technologies, Inc. Improved process for the production of nucleotide sugars
WO2009047500A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Polytherics Limited Novel conjugated proteins and peptides
EP2234645B1 (en) * 2007-12-20 2012-05-02 Merck Serono S.A. Peg-interferon-beta formulations
SG188143A1 (en) 2008-02-08 2013-03-28 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
PL2257311T3 (pl) 2008-02-27 2014-09-30 Novo Nordisk As Koniugaty cząsteczek czynnika VIII
CA2721093A1 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
AU2009240738B2 (en) 2008-04-21 2014-09-11 Tissue Regeneration Therapeutics, Inc. Genetically modified human umbilical cord perivascular cells for prophylaxis against or treatment of biological or chemical agents
NZ591235A (en) 2008-07-23 2012-07-27 Ambrx Inc Modified bovine g-csf polypeptides comprising non natural amino acid and their uses treating infections such as mastitis
US8927694B2 (en) 2008-11-18 2015-01-06 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin linkers and conjugates thereof
GB0912485D0 (en) * 2009-07-17 2009-08-26 Polytherics Ltd Improved conjugation method
CN102711814A (zh) * 2009-04-30 2012-10-03 奥克兰儿童医院及研究中心 一种嵌合h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法
CA2764759A1 (en) 2009-06-09 2010-12-16 Defyrus, Inc. Administration of interferon for prophylaxis against or treatment of pathogenic infection
JP5908401B2 (ja) 2009-07-27 2016-04-26 バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッドＢａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃｏｒｐ０Ｒａｔｅｄ 血液凝固タンパク質複合体
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
HUE028056T2 (en) 2009-07-27 2016-11-28 Baxalta GmbH Blood coagulation protein conjugates
WO2011012850A2 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
NZ600361A (en) 2009-12-21 2014-06-27 Ambrx Inc Modified bovine somatotropin polypeptides and their uses
CN104017063A (zh) 2009-12-21 2014-09-03 Ambrx公司 经过修饰的猪促生长素多肽和其用途
CN101906213B (zh) * 2010-07-23 2012-12-05 华南理工大学 一种新型的蛋白质糖基化接枝的方法
JP2013536199A (ja) * 2010-08-19 2013-09-19 ピーイージー バイオサイエンシーズ インコーポレイテッド 相乗性生体分子−ポリマーコンジュゲート
AR083006A1 (es) 2010-09-23 2013-01-23 Lilly Co Eli Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas
WO2012044684A2 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Biogen Idec Ma Inc. Interferon-beta for use as monotherapy or in combination with other cancer therapies
CA2822591C (en) 2010-12-22 2020-12-29 Baxter International Inc. Materials and methods for conjugating a water soluble fatty acid derivative to a protein
US10358470B2 (en) 2011-10-01 2019-07-23 Glytech, Inc. Glycosylated polypeptide and pharmaceutical composition containing same
AU2013226944B2 (en) 2012-02-29 2017-03-23 Toray Industries, Inc. Inhibitory agent for body cavity fluid accumulation
US9345766B2 (en) 2012-08-30 2016-05-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Combination therapies comprising anti-ERBB3 agents
DK2982686T3 (en) 2013-03-29 2018-10-08 Glytech Inc POLYPEPTIDE WITH SIALYLED SUGAR CHAIN CONNECTED
WO2016013911A1 (ko) 2014-07-24 2016-01-28 에이비온 주식회사 페길화된 인터페론 -베타 변이체
JP7105200B2 (ja) 2016-05-13 2022-07-22 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ 標的突然変異体インターフェロン－ベータおよびその使用
CA3052523A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
RU2661088C1 (ru) * 2017-05-24 2018-07-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства России (ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) Способ очистки лекарственного средства пролонгированного действия на основе рекомбинантного аналога интерферона бета 1b для лечения рассеянного склероза
US11896643B2 (en) 2018-02-05 2024-02-13 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
RU2739261C1 (ru) * 2019-12-31 2020-12-22 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Способ количественного определения антипролиферативной активности интерферона-бета человека
WO2022200525A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Innate Pharma Multispecific proteins comprising an nkp46-binding site, a cancer antgienge binding site fused to a cytokine for nk cell engaging
JP2024521405A (ja) 2021-06-09 2024-05-31 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム Ｎｋｐ４６、サイトカイン受容体、腫瘍抗原およびｃｄ１６ａに結合する多特異性タンパク質
WO2022258691A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkg2d, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a
WO2022258678A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Innate Pharma Multispecific proteins binding to nkp30, a cytokine receptor, a tumour antigen and cd16a

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1995013090A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
WO1999055377A2 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2360794C2 (de) * 1973-12-06 1984-12-06 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Verfahren zur Herstellung von Peptiden
CH596313A5 (ru) * 1975-05-30 1978-03-15 Battelle Memorial Institute
IL47468A (en) 1975-06-12 1979-05-31 Rehovot Res Prod Process for the cross-linking of proteins using water soluble cross-linking agents
US4002531A (en) * 1976-01-22 1977-01-11 Pierce Chemical Company Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4456748A (en) 1981-02-23 1984-06-26 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
DE3273787D1 (en) 1981-02-04 1986-11-20 Japan Found Cancer Human interferon-beta gene
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0098876A1 (en) 1982-01-19 1984-01-25 Cetus Corporation Multiclass hybrid interferons
US5149636A (en) 1982-03-15 1992-09-22 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for introducing cloned, amplifiable genes into eucaryotic cells and for producing proteinaceous products
US4695543A (en) 1982-03-23 1987-09-22 Bristol-Myers Company Alpha Interferon GX-1
US6936694B1 (en) * 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4470461A (en) 1982-09-30 1984-09-11 Phillips Petroleum Company Organic nitro compounds as cosurfactants in enhanced oil recovery processes
US4588585A (en) * 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
GB8334102D0 (en) 1983-12-21 1984-02-01 Searle & Co Interferons with cysteine pattern
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8412564D0 (en) * 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
CA1302320C (en) 1984-06-11 1992-06-02 Hideo Niwa Expression of human cromosomal interferon-_ in animal cells
US5231176A (en) 1984-08-27 1993-07-27 Genentech, Inc. Distinct family DNA encoding of human leukocyte interferons
FI90990C (fi) 1984-12-18 1994-04-25 Boehringer Ingelheim Int Rekombinantti-DNA-molekyyli, transformoitu isäntäorganismi ja menetelmä interferonin valmistamiseksi
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
ATE78262T1 (de) 1985-06-11 1992-08-15 Ciba Geigy Ag Hybrid-interferone.
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JP2514950B2 (ja) 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
JPS63152393A (ja) 1986-07-03 1988-06-24 Takeda Chem Ind Ltd グリコシル誘導体
US5183746A (en) 1986-10-27 1993-02-02 Schering Aktiengesellschaft Formulation processes for pharmaceutical compositions of recombinant β-
US4894226A (en) 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
US5004605A (en) 1987-12-10 1991-04-02 Cetus Corporation Low pH pharmaceutical compositions of recombinant β-interferon
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5135919A (en) 1988-01-19 1992-08-04 Children's Medical Center Corporation Method and a pharmaceutical composition for the inhibition of angiogenesis
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847625A (en) * 1988-02-16 1989-07-11 Ford Aerospace Corporation Wideband, aperture-coupled microstrip antenna
CA1340810C (en) 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
JPH04502011A (ja) 1988-11-23 1992-04-09 ジェネンテク，インコーポレイテッド ポリペプチド誘導体
CA2006596C (en) 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5116964A (en) * 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
US5286637A (en) 1989-08-07 1994-02-15 Debiopharm, S.A. Biologically active drug polymer derivatives and method for preparing same
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
JP3693671B2 (ja) 1991-03-15 2005-09-07 アムゲン インコーポレーテッド ポリペプチドのｐｅｇ化
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
WO1993000109A1 (en) 1991-06-28 1993-01-07 Genentech, Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
WO1993012145A1 (en) * 1991-12-19 1993-06-24 Baylor College Of Medicine Pva or peg conjugates of peptides for epitope-specific immunosuppression
ZA933926B (en) * 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
AU5098193A (en) 1992-09-01 1994-03-29 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5306344A (en) * 1992-12-02 1994-04-26 Edward C. Levy Company Mixture of portland cement concrete materials for freeze/thaw resistance
US5298410A (en) 1993-02-25 1994-03-29 Sterling Winthrop Inc. Lyophilized formulation of polyethylene oxide modified proteins with increased shelf-life
US5681811A (en) 1993-05-10 1997-10-28 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5874075A (en) 1993-10-06 1999-02-23 Amgen Inc. Stable protein: phospholipid compositions and methods
US5641656A (en) 1993-10-22 1997-06-24 University Of Connecticut Nucleic acids encoding avian interferon (IFN) proteins and recombinant methods using them
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5605976A (en) 1995-05-15 1997-02-25 Enzon, Inc. Method of preparing polyalkylene oxide carboxylic acids
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
AU1916295A (en) 1994-02-08 1995-08-29 Amgen, Inc. Oral delivery of chemically modified proteins
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
US5639725A (en) 1994-04-26 1997-06-17 Children's Hospital Medical Center Corp. Angiostatin protein
GB9415379D0 (en) * 1994-07-29 1994-09-21 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
AU697440B2 (en) * 1994-12-07 1998-10-08 Novozymes A/S Polypeptide with reduced allergenicity
US5672662A (en) * 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5702717A (en) 1995-10-25 1997-12-30 Macromed, Inc. Thermosensitive biodegradable polymers based on poly(ether-ester)block copolymers
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US5723125A (en) 1995-12-28 1998-03-03 Tanox Biosystems, Inc. Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide
US5747639A (en) * 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
JP2001508783A (ja) 1997-01-29 2001-07-03 ポリマスク・ファーマシューティカルズ・パブリック・リミテッド・カンパニー Ｐｅｇ化法
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
ATE375363T1 (de) 1997-07-14 2007-10-15 Bolder Biotechnology Inc Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine
US6180095B1 (en) 1997-12-17 2001-01-30 Enzon, Inc. Polymeric prodrugs of amino- and hydroxyl-containing bioactive agents
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5965119A (en) 1997-12-30 1999-10-12 Enzon, Inc. Trialkyl-lock-facilitated polymeric prodrugs of amino-containing bioactive agents
PT1411075E (pt) 1998-03-12 2008-08-05 Nektar Therapeutics Al Corp Método para a preparação de conjugados de polímeros
US6703381B1 (en) 1998-08-14 2004-03-09 Nobex Corporation Methods for delivery therapeutic compounds across the blood-brain barrier
PL200586B1 (pl) * 1998-10-16 2009-01-30 Biogen Idec Inc Polipeptydy zawierające mutanty interferonu-beta-1a, kodujące je cząsteczki kwasów nukleinowych, komórki gospodarza transformowane tymi cząsteczkami, sposób wytwarzania polipeptydów, zawierające je kompozycje farmaceutyczne i zastosowania polipeptydów
EP1656952B1 (en) * 1998-10-16 2013-12-18 Biogen Idec MA Inc. Polyalkylene glycol conjugates of interferon beta-1A and uses thereof
US7144574B2 (en) 1999-08-27 2006-12-05 Maxygen Aps Interferon β variants and conjugates
CZ2002521A3 (cs) * 1999-08-27 2002-05-15 Maxygen Aps Nové molekuly podobné interferonu beta
US6531122B1 (en) 1999-08-27 2003-03-11 Maxygen Aps Interferon-β variants and conjugates
AU781839B2 (en) 1999-12-22 2005-06-16 Nektar Therapeutics Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
US9506008B2 (en) 2013-12-23 2016-11-29 Exxonmobil Research And Engineering Company Method for improving engine fuel efficiency

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987000056A1 (en) * 1985-06-26 1987-01-15 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
WO1995013090A1 (en) * 1993-11-10 1995-05-18 Enzon, Inc. Improved interferon polymer conjugates
WO1999055377A2 (en) * 1998-04-28 1999-11-04 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Polyol-ifn-beta conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
US9314534B2 (en) 2016-04-19
NO20011860L (no) 2001-06-15
JP2007063283A (ja) 2007-03-15
ES2447772T3 (es) 2014-03-12
CN101062419B (zh) 2016-06-29
US20070098688A1 (en) 2007-05-03
AU762616B2 (en) 2003-07-03
IL142282A0 (en) 2002-03-10
KR100630849B1 (ko) 2006-10-04
CN1329082C (zh) 2007-08-01
HK1042434A1 (en) 2002-08-16
CZ20011329A3 (cs) 2001-09-12
EE200700058A (et) 2008-02-15
EE05201B1 (et) 2009-08-17
EP2599503B1 (en) 2017-05-17
US20160250340A1 (en) 2016-09-01
ATE318149T1 (de) 2006-03-15
WO2000023114A3 (en) 2000-09-28
ES2630278T3 (es) 2017-08-21
DK1121156T3 (da) 2006-06-06
LTC2599503I2 (lt) 2019-06-25
AU1446500A (en) 2000-05-08
IL142282A (en) 2007-03-08
BR9915542A (pt) 2001-08-14
IS5913A (is) 2001-03-30
EP1656952A2 (en) 2006-05-17
EP2260872A2 (en) 2010-12-15
EP1121156B1 (en) 2006-02-22
US20150011732A1 (en) 2015-01-08
SG2008070138A (en) 2017-08-30
SI1656952T1 (sl) 2014-04-30
TR200101086T2 (tr) 2001-08-21
HK1042434B (zh) 2008-01-25
ES2653589T3 (es) 2018-02-07
WO2000023114A9 (en) 2001-07-05
EE200100220A (et) 2002-06-17
US6962978B2 (en) 2005-11-08
PT1121156E (pt) 2006-05-31
EE04967B1 (et) 2008-02-15
HU229888B1 (en) 2014-11-28
LTPA2017030I1 (lt) 2017-10-25
CY1115125T1 (el) 2016-12-14
US7446173B2 (en) 2008-11-04
SK5062001A3 (en) 2002-01-07
WO2000023114A2 (en) 2000-04-27
EP1656952A3 (en) 2006-11-29
CY1105022T1 (el) 2010-03-03
NO20011860D0 (no) 2001-04-11
DK1656952T3 (da) 2014-01-20
NZ510689A (en) 2003-07-25
EP2260872A3 (en) 2011-04-27
JP5863865B2 (ja) 2016-02-17
EP1121156A2 (en) 2001-08-08
EP2599503A2 (en) 2013-06-05
SK287918B6 (sk) 2012-03-02
SG110047A1 (en) 2005-04-28
JP2011093937A (ja) 2011-05-12
EA004789B9 (ru) 2017-05-31
EP2599503A3 (en) 2013-07-24
PL206536B1 (pl) 2010-08-31
JP5396358B2 (ja) 2014-01-22
JP4616478B2 (ja) 2011-01-19
ES2257884T3 (es) 2006-08-01
SI1121156T1 (sl) 2006-08-31
PT1656952E (pt) 2014-02-21
CN1323225A (zh) 2001-11-21
PL347968A1 (en) 2002-04-22
US20030021765A1 (en) 2003-01-30
DE69930015D1 (de) 2006-04-27
CA2345138C (en) 2009-12-15
CA2345138A1 (en) 2000-04-27
LT2599503T (lt) 2017-06-26
EA200100446A1 (ru) 2001-10-22
CZ299164B6 (cs) 2008-05-07
CN101062419A (zh) 2007-10-31
HUP0200444A2 (en) 2002-06-29
JP2011026329A (ja) 2011-02-10
JP2014129420A (ja) 2014-07-10
BR9915542B1 (pt) 2016-06-07
BR9915542B8 (pt) 2017-10-31
KR20010103605A (ko) 2001-11-23
EP1656952B1 (en) 2013-12-18
BRPI9915542C1 (pt) 2021-05-25
EP2260872B1 (en) 2017-08-30
JP2002527491A (ja) 2002-08-27
DE69930015T2 (de) 2006-10-12
US20090104150A1 (en) 2009-04-23
IS2926B (is) 2015-09-15
HK1089393A1 (en) 2006-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA004789B1 (ru) Полимерные конъюгаты бета-1а-интерферона и их использование
EP1121382B1 (en) Interferon-beta fusion proteins and uses
JP2002527491A5 (ru)
MXPA01003791A (es) Conjugados polimericos de interferon beta - 1a y usos de los mismos

Legal Events

Date Code Title Description
TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AZ KZ KG TJ TM

TC4A Change in name of a patent proprietor in a eurasian patent
ND4A Extension of term of a eurasian patent
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MK4A Patent expired

Designated state(s): AM BY MD