DK2816111T3 - Fremgangsmåder, sammensætninger og kits til generering af rRNA-depleterede prøver eller isolering af rRNA fra prøver - Google Patents

Claims (12)

1. Sammensætning, der omfatter antisense-rRNA-molekyler, hvor antisense-rRNA-molekylerne omfatter multiple forskellige antisense-rRNA-molekyler, som er komplementære til i det væsentlige alle de sekvenser, der udvises af rRNA-molekyler, som er valgt fra grupperne bestående af: mindst fire rRNA-molekyler, som er valgt blandt 25S, 26S, 28S, 18S, 5.8S og 5S eukaryote cytoplasmatiske rRNA-molekyler; to rRNA-molekyler bestående af 12S og 16S eukaryote mitokondriske rRNA-molekyler; fire rRNA-molekyler bestående af 16S, 23S, 4.5S og 5S eukaryote chloroplast-rRNA-molekyler; samt tre rRNA-molekyler bestående af 23S, 16S og 5S prokaryote rRNA-molekyler; hvor antisense-rRNA-molekylerne omfatter affinitetsmærker i et forhold på mindst ét affinitetsmærke for hver 10 nukleobaser af antisense-rRNA-molekylerne, eller hvor antisense-rRNA-molekylerne omfatter affinitetsmærker i et forhold på mindst ét affinitetsmærke for hver 8 nukleobaser af antisense-rRNA-molekylerne.

2. Sammensætningen ifølge krav 1, hvor affinitetsmærket omfatter biotin.

3. Sammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 1 eller 2, hvilken sammensætning yderligere omfatter RNA-molekyler afledt af mindst én organisme eller species, hvor RNA-molekylerne omfatter rRNA-molekyler og ikke-rRNA-RNA-molekyler, hvor mindst nogle af de affinitetsmærkede antisense-rRNA-molekyler i sammensætningen forekommer som dobbeltstrengede hybrider med mindst nogle af rRNA-molekylerne.

4. Sammensætningen ifølge krav 3, hvilken sammensætning yderligere omfatter en bindingsmatrix, der omfatter affinitetsmærkebindende molekyler, hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og de i antisense-rRNA-molekylerne forekommende affinitetsmærker er mindst 8 til 1, eller hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og de i antisense-rRNA-molekylerne forekommende affinitetsmærker er mindst 10 til 1.

5. Fremgangsmåde til generering af en rRNA-depleteret prøve fra en initial prøve, hvilken fremgangsmåde omfatter, at: a) der tilvejebringes; i) en initial prøve, der omfatter RNA-molekyler afledt af mindst én eukaryot organisme eller species, hvor RNA-molekylerne omfatter rRNA-molekyler og ikke-rRNA-RNA-molekyler; ii) sammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3; iii) en bindingsmatrix, der omfatter affinitetsmærkebindende molekyler; b) den initiale prøve bringes i kontakt med sammensætningen, der omfatter antisense-rRNA-molekyler, under sådanne betingelser, at mindst nogle af de affinitetsmærkede antisense-rRNA-molekyler og mindst nogle af rRNA-molekylerne danner dobbeltstrengede rRNA-hybrider, hvorved der genereres en behandlet prøve; c) den behandlede prøve bringes i kontakt med bindingsmatrixen under betingelser, hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og de affinitetsmærker, som forekommer i de i trin b) anvendte antisense-rRNA-molekyler, er mindst 8 til 1, således at mindst en del af de dobbeltstrengede rRNA-hybrider binder til bindingsmatrixen og fjernes fra den behandlede prøve, hvorved der genereres en rRNA-depleteret prøve, hvor den rRNA-depleterede prøve omfatter mindst en del af de i den initiale prøve forekommende ikke-rRNA-RNA-molekyler og i det væsentlige er depleteret eller fri for rRNA-molekyler, der udviser sekvenser, som udvises af det mindst ene rRNA-molekyle.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, hvor mindst den ene eukaryote organisme eller species er valgt fra gruppen bestående af et menneske, et dyr, en plante og en svampeorganisme eller species.

7. Fremgangsmåden ifølge krav 6, hvor RNA-molekylerne i den initiale prøve og det mindst ene rRNA-molekyle er afledt af den samme eukaryote organisme eller species, eller hvor RNA-molekylerne er fra en første eukaryot organisme eller species, og hvor det mindst ene rRNA-molekyle er fra en anden eukaryot organisme eller species.

8. Fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 5-7, hvor affinitetsmærkerne er associeret med mindst én nukleobase, der er valgt fra gruppen bestående af: adenin (A), cytosin (C), guanin (G) og uracil (U); og hvor affinitetsmærkerne forekommer på antisense-rRNA-molekylerne i et forhold på mindst ét affinitetsmærke for hver 8 nukleobaser af antisense-rRNA-molekylerne; og/eller hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og affinitetsmærkerne under kontakten i trin b) er mindst 10 til 1.

9. Fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 5-8, hvor det antal molekyler, der udviser sekvensen for det mindst ene rRNA-molekyle i den rRNA-depleterede prøve, depleteres med 99,0 % i forhold til det antal molekyler, der udviser sekvensen for det mindst ene rRNA-molekyle i den initiale prøve.

10. Fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 5-9, hvor RNA-molekylerne i den initiale prøve omfatter RNA, der er ekstraheret, isoleret eller oprenset fra en kilde, der er valgt fra gruppen bestående af: en vævsprøve, en celleprøve, en i paraffin indlejret prøve, en i paraffin indlejret formalinfikseret (FFPE) prøve og en miljøprøve bestående afjord, vand, vækstmedium eller en biologisk væske eller prøve.

11. Fremgangsmåden ifølge et hvilket som helst af kravene 5-10, hvor betingelserne i trin b) omfatter inkubering i nærværelse afen hybrid iseringsbuffer ved en temperatur på ca. 60-75 °C i et første tidsrum og inkubering ved omtrent stuetemperatur i et andet tidsrum, og hvor bindingsmatrixen i trin c) omfatter en flerhed af individuelle partikler eller en bindingssøjle, og hvor betingelserne i trin c) indbefatter mindst lejlighedsvis blanding ved stuetemperatur og/eller ved 35-60 °C.

12. Kit, der omfatter a) sammensætningen ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3; og b) en bindingsmatrix, der omfatter affinitetsmærkebindende molekyler, hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og de i antisense-rRNA-molekylerne forekommende affinitetsmærker er mindst 8 til 1, eller hvor forholdet mellem de affinitetsmærkebindende molekyler og de i antisense-rRNA-molekylerne forekommende affinitetsmærker er mindst 10 til 1, og hvor bindingsmatrixen omfatter en flerhed af individuelle partikler, der er valgt blandt nanopartikler, magnetiske partikler og en flerhed af småkugler, såsom makroporøse småkugler; hvor kittet eventuelt yderligere omfatter: c) en hybridiseringsbuffer; d) en vaskeopløsning; e) glycogen; f) natriumacetat; g) RNAse-frit vand; h) RNAse-inhibitor; i) en bindingsmatrixresuspenderingsopløsning; j) en kontrolprøve, der omfatter total-RNA fra en celle- eller vævsprøve og/eller k) et total-RNA-oprensningsreagens.