DK176000B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ud fra gærsvampe under anvendelse af et inducerbart system, samt vektorer og transformerede stammer til brug ved fremgangsmåden - Google Patents

Description

DK 176000 B1

Opfindelsen angår inducerbare ekspressionssysterner, hermed transformerede stammer samt fremgangsmåder til fremstilling heraf til brug ved produktion af proteiner, navnlig heterologe proteiner, i gærsvampe.

5 Rekombinant-DNA-teknik gør det muligt at udtrykke gener, der koder for heterologe proteiner, i gær. Konstruktionen af vektorer, der omfatter gærpromo-tor-sekvenser, der er knyttet til gener for glycolytiske enzymer i Saccharomy-ces cerevisia, såsom 3-phospho-glyceratkinase (PGK), en alkoholdehydro-genase (ADH1) eller glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GPD), gør 10 det således muligt at producere interessante proteiner ved at fusionere den sekvens, der koder for enzymerne, med gærpromotoren, f.eks. leucocytisk interferon ifølge Hitzeman, R.A. et al., Nature, 293, 717-722 (1981), eller hepatitis B-overfladeantigenet ifølge Bitter, G.A. et al., Gene, 263-274 (1984).

15 len række tilfælde er det blevet observeret, at heterologe proteinprodukter er toxiske for værtscellen og fremkalder ustabilitet af plasmidet og selektion af celler, som ikke længere udtrykker det pågældende protein. Der er fundet metoder, som muliggør undertrykkelse af ekspressionen af genet for proteinet under cellens vækstfase, hvorefter der induceres en forhøjet produktion 20 af proteinet under kulturens slutfase, idet man har anvendt en promotor, der er reguleret ved et skift i kulstofkilde, f.eks. promotoren for genet galactoki-nase (GAL1) eller promotoren for genet uridindiphosphoglucose-4-epimerase (GAL10), hvilken promotor er knyttet til to af de fire gener, der er ansvarlige for udnyttelse af galactose hos gær, og hvis ekspression undertrykkes af glu-25 kose og induceres af galactose. Vektorer, som omfatter promotoren GAL1 bundet til et heterologt gen, er blevet beskrevet, hvilket muliggør, at gæren dyrkes i et medium, der indeholder glukose, hvorefter proteinet udtrykkes, når galactose tilsættes til mediet. Gærstammer, som er transformeret med sådanne vektorer, er blevet beskrevet, f.eks. i GB patent nr. 2.137.208, hvor 30 der under kontrol af promotoren GAL1 ved tilstedeværelse af galactose udtrykkes protein, såsom hormonet bovint væksthormon eller prorenin. De fleste gærpromotorer indeholder opstrøms TATA-elementer, som medierer initiering af transskription, transkriptionsregulerende elementer “upstream acti- 2 DK 176000 B1 vating sequence” (kaldet UAS), som repræsenterer bindingsstedet for transkriptionsregulerende proteiner, såsom GAL4 til aktivering af galactose-metabolisme-gener, der i sig selv er under styring af deres egne promotorer.

5 Webster et al. (Cell, Vol. 52, No. 2, side 169-178,1988) beskriver stimuleringen af transskription af gener i de humane celler HeLa ved et transaktiveringsprotein GAL4 i gær, under styring af en promoter stammende fra højere eukarioter, som omfatter en regulerende sekvens UASg stammende fra gær, lige som de beskriver en transaktiverings chimer i GAL4-domænet til fastgø-10 relse af DNA for en receptor for human østrogen hER, som styres af en promoter stammende fra højere eukarioter, som omfatter en human sekvens "estrogåne-responsive enhancer element" ERE.

Der er tidligere blevet foreslået forskellige midler til at forbedre transkriptions 15 effektiviteten af heterologe gener i gær. Det er navnlig blevet foreslået at anvende hybride promotorer, som opstrøms TATA-elementet for en konstitutiv gærpromotor bærer en ekstern regulerende sekvens UAS, såsom UASg, der hører sammen med den intergeniske sekvens GAL1-GAL10, og som man i f.eks. indsætter opstrøms TATA-elementet for en konstitutiv gærpromotor, 20 såsom GPD, som beskrevet i patentskriftet WO 86/00680, eller såsom PGK, som beskrevet i patentskriftet EF 258.067. De indføjede UASg-sekvenser muliggør successivt at undertrykke og derefter udtrykke den konstitutive promotor ved hjælp af den anvendte carbonkilde, såsom glukose som repressor og galactose som inducer.

25

Med anvendelsen af promotorer i almindelighed eller især en hybridpromotor er det imidlertid vanskeligt at opnå et totalt undertrykt eller induceret niveau, i fordi de griber ind i en samling af transkriptionsregulerende proteiner. Således aktiverer genet GAL4 transskriptionen ved tilstedeværelse af galactose, 30 der direkte eller indirekte er ansvarlig for dissocieringen af et kompleks mellem GAL4 og et antagonist-protein GAL80, medens andre proteiner vil gribe ind i undertrykkelsen ved hjælp af glukose, såsom GAL82 og GAL83 ifølge Yocum, R.R. et al., MBC 4, 1985-1998 (1984).

3 DK 176000 B1

Foruden de allerede nævnte ulemper er denne type af induktionssystemer med galactose og/eller undertrykkelsessystemer med glukose ikke bredt anvendelige, de kan faktisk ikke anvendes til de gærsvampe, som ikke assimilerer glukose og/eller galactose, og de kan ikke anvendes i de tilfælde, hvor 5 ét af disse elementer udgør det hele eller en del af dyrkningsmediets kulstofsubstrat.

Det er derfor interessant at anbringe induktionssystemer i gær, hvilke systemer kan induceres af produkter, der ikke i sig selv er nødvendige for denne 10 cellekultur, hvilket f.eks. er tilfældet med hormoner, navnlig steroidhormoner.

Det er derfor den foreliggende opfindelse angår en Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ud fra gær, hvor - der dyrkes gærceller, som indeholder følgende 15 »en DNA-sekvens, der koder for proteinet, under styring af elementer, som sikrer dets ekspression i gær, hvilke elementer omfatter en transkriptionsstyringssekvens, som er funktionel i højere eukaryote celler og som omfatter en naturlig “URE" aktivatorsekvens, en variant eller en afledet af denne sekvens, der kan induceres af et kompleks, som er 20 dannet mellem en receptor og en ligand, • en DNA-sekvens, som er funktionel i gær, der koder for receptoren, som er en naturlig kemereceptor valgt blandt receptorer for et steroid, receptorer for retinoider, receptorer for thyroidhormoner og receptorer for vitamin D3, samt varianter eller chimere receptorer af en naturlig receptor, 25 hvilken receptor omfatter to essentielle dele, hvoraf den ene del genkender liganden på en sådan måde, at den danner et kompleks med liganden, og den anden del bindes til transkriptionsstyringssekvensen, og liganden ikke er nødvendig for cellekulturen, men er i stand til at trænge ind i cellerne, når den tilsættes til dyrkningsmediet, 30 - liganden tilsættes dyrkningsmediet på et tidspunkt, som er passende for induktion, og - det syntetiserede protein indvindes.

DK 176000 B1 4

Ekspression af proteiner i gær under anvendelse af rekombinant DNA-teknik betragtes som værende velkendt af en fagmand. I et betragteligt antal publikationer er der tidligere blevet beskrevet fremstilling af proteiner, navnlig heterologe proteiner, ved hjælp af gær under anvendelse af ekspressionsvekto-5 rer. Disse ekspressionsvektorer omfatter i de fleste tilfælde foruden den sekvens, der koder for proteinet, elementer, som styrer ekspression i gær, det vil generelt sige en promotor og en terminator.

I de fleste tilfælde er disse vektorer ikke-integrerende vektorer, dvs. plasmi-, 10 der, og de omfatter derfor et replikationsstartsted, der er effektivt i gær, navnlig replikationsstartstedet fra plasmid 2μ eller en sekvens, der egner sig til den pågældende gærsvamp.

Disse ikke-integrerende ekspressionsvektorer omfatter bl.a. elementer, som 15 gør det muligt at sikre deres opretholdelse i cellerne, enten ved som selektiv markør at anvende et resistensgen eller ved at anvende et element, som komplementerer en auxotrofi hos værtsstammen, f.eks. URA3 eller LEU2.

I visse tilfælde og for at afhjælpe de ulemper, der er forbundet med at anven-20 de autoreplikerende vektorer, har man kunnet udvikle vektorer, der sikrer integration af de pågældende sekvenser på kromosomniveau. Denne type vektor gør det muligt at opnå en mere stabil stamme, men amplifikation af ekspressionen er undertiden meget svagere end med et ikke-integrerende plasmid.

25

De integrerende vektorer omfatter oftest mindst én sekvens, der er homolog med en kromosom sekvens, hvilket sikrer udskiftning og integration.

Det skal forstås, at ved den foreliggende opfindelse, der navnlig angår induk- 30 tion af transskription, kan de ekspressionsvektorer, som anvendes, lige så godt være af den integrerende som af den ikke-integrerende type.

i ' DK 176000 B1 5

Selv om den pågældende fremgangsmåde navnlig er beregnet til fremstilling af heterologe proteiner, er det muligt at anvende den til at udtrykke gærpro-teiner, navnlig i tilfælde med systemer, der sikrer hyperekspression af et gen, hvilket i visse tilfælde kan føre til cellernes død, før den optimale biomasse er 5 opnået.

Med “heterologt protein” menes et protein, der er fremmed for den værtscelle, som udtrykker det, dvs. af en anden oprindelse end værtscellen, der ifølge opfindelsen er en gær. Proteinet kan være af bakteriel oprindelse, f.eks. be-10 ta-galactosidase fra Escherichia coli, eller hidrøre fra en højere eukaryot, f.eks. være af human oprindelse, såsom f.eks. lymfokiner, blodkoagulerings-j faktorer, hormoner, vaccinationsantigener og generelt alle proteiner, der har | terapeutisk eller industriel interesse.

15 Som allerede anført, er det vigtige element ifølge opfindelsen associeringen af en transkriptionsstyringssekvens og en receptor, der er kompleksbundet med en ligand. Valget af førstnævnte er betinget af valget af sidstnævnte.

Blandt de anvendelig transkriptionsstyringssekvenser kan navnlig nævnes de 20 sekvenser, der sædvanligvis fungerer i højere eukaryote celler, dvs., de naturlige transkriptionsaktiverende sekvenser i højere eukaryote celler, såsom f.eks. et HRE (for "hormone responsive element") eller en variant eller et syntetisk derivat af en sådan sekvens, og som i gær ligeledes har denne transkriptionsaktiverende funktion. Disse sekvenser er generelt perfekte eller 25 ikke-perfekte, naturlige eller syntetiske palindromsekvenser.

I det tilfælde for eksempel, hvor den anvendte transkriptionsstyringssekvens er en HRE-sekvens, er receptoren det tilsvarende hormon. j 30 Som tidligere anført, repræsenterer transkriptionsstyringssekvensen ét af de elementer, som sikrer ekspression i gær af det ønskede protein. Ekspressionen i gær kan derfor også sikres ved hybridsekvenser, som foruden transkriptionsstyringssekvensen defineret ifølge opfindelsen omfatter se- j i i i | 6 DK 176000 B1 kvenser svarende til gærpromotorsekvenser. Blandt de anvendelige promotorer kan nævnes den tidligere omtalte inducerbare promotor GAL1, men også konstitutive gærpromotorer, såsom promotoren PGK.

5 Generelt bevarer man promotorens TATA-element, og man kan anbringe transkriptionsstyringssekvénsen i varierende afstande opstrøms TATA-elementet. Det er navnlig interessant at kunne råde over en minimal struktur for hybrid promotoren, dvs, en struktur, hvor afstanden mellem TATA-elementet og transkriptionsstyringssekvensen er lille og dog forbliver til-10 strækkelig til at sikre tilfredsstillende inducerbarhed.

Med udtrykket “receptor” menes ved den foreliggende opfindelse et protein, som er funktionelt i højere eukaryote celler, eller tilsvarende varianter eller syntetiske derivater, som i gæren udøver receptorens oprindelige funtionelle 15 egenskaber.

Udtrykket “receptor” omfatter også chimere proteiner, dvs, strukturer hvor de to essentielle dele er af forskellig oprindelse. For eksempel omfatter en fore-trukken fremgangsmåde fremstilling af en hybridreceptor, i hvilken den del, 20 som genkender liganden, er af en højere eukaryot oprindelse, og den del, som bindes til transkriptionsstyringssekvensen, hidrører fra gær, men det er muligt at anvende sekvenser, som helt hidrører fra andre mikroorganismer, f.eks. bakterier. Transkriptionsstyringssekvensen omfatter således en sekvens, der er funktionel i gær, dvs, en naturlig transkriptionsaktiverende se-25 kvens i gær. Man kan f.eks. nævne UAS fra promotoren GAL 1, som er en gærpromotor.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe forskellige funktionelle kombinationer mellem en transkriptionsstyringssekvens, 30 enten en naturlig eller et derivat, navnlig ved kemisk syntese, og receptoren, som kan være en naturlig receptor, et derivat eller en chimerreceptor. Naturen af liganden er igen bestemt af valget af receptor.

7 DK 176000 B1

Blandt de anvendelige receptorer skal nævnes kemereceptorer, navnlig for et steroid, og andre kemereceptorer, f.eks. for retinoider eller for thyroid hormoner samt vitamin D3. Receptoren for et steroid kan være en naturlig receptor for steroidhormoner, f.eks. receptoren for østrogener, receptor for progeste-5 ron, receptoren for testosteron eller en variant af receptoren eller et chimer-derivat, som kan fungere samnmmen med transkriptionsstyringssekvensen. Steroidet kan være et naturligt steroid, såsom østradiol, progesteron, testosteron eller en analog eller et derivat deraf, som kan fungere i det kompleks, ! over for hvilket transkriptionsstyringssekvensen, som omfatter vektoren ifølge 10 opfindelsen, er følsom.

Receptoren for østrogener kan være den naturlige receptor (herefter kaldt hER) eller en variant eller et chimerderivat, der fungerer i nærværelse af østradiol over for transkriptionsstyringssekvensen, som omfatter vektoren 15 ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår navnlig det tilfælde, hvor den vigtige del af receptoren, som genkender liganden, hidrører fra den humane østrogenreceptor, kaldet hERG, der i forhold til receptoren kaldet hER, har glycin i stedet for valin i 20 position 400, hvor liganden så er østradiol. Ifølge en udførelsesform for opfindelsen kan man som receptor anvende hele hERG-receptoren.

I forhold til den humane østrogenreceptor hER, hvis komplementære DNA-sekvens er blevet publiceret i Green, S. et al., (1986), Nature, 320, 134-139, 25 omfatter hERG-receptoren altså en glycin i stedet for en valin i position 400.

Man har kunnet konstatere, at ved at anvende denne receptor i stedet for hER-receptoren, opnås en meget større stabilitet af receptoren ved at undertrykke denatureringsrisikoen, som kunne føre til en meget svagere binding af 30 den specifikke ligand, i dette tilfælde østradiol. Dette fænomen gælder navnlig omkring 25 °C, dvs. ved temperaturer, hvor man anvender fremgangsmåden til fremstilling af rekombinerede proteiner omfattende et induktionstrin ifølge opfindelsen. Det foretrækkes derfor at anvende den receptor, som gør 8 DK 176000 B1 det muligt at anvende en mindre mængde østradiol i dyrkningsmediet for at fremkalde induktion.

Ifølge en anden udførelsesform for opfindelsen tilsættes østradiol i en kon-5 centration på mellem 2 og 50 nM, fortrinsvis ca. 10 nM.

Opfindelsen angår navnlig det tilfælde, hvor styringssekvensen er sekvensen -605 til -634 i vitellogene gen i høns, hvilken sekvens er transkriptionssty-ringssekvensen for dette gen, som er følsomt over for østradiol (herefter kaldt 10 ERE for “estrogen responsive element”). Syntesen af oligonukleotider, som omfatter denne sekvens eller gentagelser af denne, gør det ifølge opfindelsen muligt at opnå en ekspressionsvektor, som omfatter denne sekvens eller gentagelser af denne (herefter kaldt ERE1 eller ERE3).

15 En af fordelene ved opfindelsen er, at induktion af ekspression kan frembringes meget enkelt ved til dyrkningsmediet at tilsætte en ligand, der er tilpasset receptoren. Anvendelsen af induktion bliver således fuldstændigt uafhængig af naturen af dyrkningsmediet.

20 Det tidspunkt, hvor det er hensigtsmæssigt at tilsætte liganden, kan let bestemmes; i praksis vil det dreje sig som det tidspunkt, hvor der er opnået et højt biomasseniveau i fermentationsbeholderen.

Opfindelsen angår navnlig vectorer, hvis struktur og fremgangsmåde til op-25 nåelse heraf er anført senere som eksempler i den eksperimentelle del.

Det skal bemærkes, at ekspressionselementeme for proteinet og de elementer, som sikrer ekspressionen af receptoren, kan befinde sig på et enkelt plasmid eller på to forskellige plasmider, som hver bærer et replikationsstart-30 sted, der er funktionelt i gær. Men det er ligeledes muligt at forudse anvendelsen af vektorer, som sikrer integration af visse af disse elementer, f.eks. kan produktionen af receptoren hidrøre fra sekvenser, som er integreret i et af cellens kromosomer.

DK 176000 B1 g

Der er derfor, at den foreliggende opfindelse ligeledes angår vektorer, som omfatter sekvenser, der kan anvendes til transformation af gærceller.

Opfindelsen angår også gærstammer, som kan anvendes ved fremgangs-5 måden ifølge den foreliggende opfindelse.

Som gærstammer kan alle de stammer, der normalt anvendes til opnåelse af rekombinerede proteiner, anvendes. Der kan navnlig nævnes Saccharomy-ces-stammer, såsom Saccharomyces cerevisiae. Der kan navnlig nævnes 10 stammer, som har en eller flere defekter i proteolytisk aktivitet, f.eks. mutationen pep4. Der kan endvidere nævnes stammer, der har en undertrykkelse af den proteolytiske funktion, der kodes af genet PRC1, Anvendelsen af disse stammer gør det muligt at forbedre kvaliteten af de opnåede proteiner.

15 På tegningen viser - figur 1 strukturen af pTG848, - figur 2 viser i skematiseret form den strategi, der gør det muligt at frembringe pYERE, - figur 3 viser skematiseret den strategi, som gør det muligt at opnås pYE- 20 RE/hER, - figur 4a viser skematiseret strukturerne af pYERE1/hER, pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYGAL/hER og viser sekvenserne af elementerne ERE og EREm, - figur 4b viser for RNA-ekstrakter fra inducerede eller ikke-inducerede cel- 25 ler indeholdende de angivne plasmider de RNA-fragmenter, som er be skyttet mod fordøjelse af ribonukleaseme A og Ti efter hybridisering med en antisense Gali-RNAprobe, - figur 5a viser skematisk resultatet af at indsætte en tandem af en del af ! den sekvens, som koder for PRC1, i pUC8 (BamHI-stedet) til opnåelse af 30 pTG2893, - figur 5b viser skematisk den indførte deletion i PRC1-fragmentet ved at udskære EcoRV-fragmentet fra pTG2893 til frembringelse af pTG2894, hvor pilene angiver transkriptionsretningen, DK 176000 B1 | i 10 i i ! - figur 6 repræsenterer den skematiske struktur af plasmid pTG3809, hvor pilene angiver transkriptionsretningen, j - figur 7 viser den skematiske struktur af fag M13TG2890, - figur 8 viser skematisk konstruktionen af plasmid pTG3851, og 5 - figur 9 viser effekten på transkriptionsaktivering i gærceller ved tilsætning af stigende mængder af østradiol sammen med som receptor dels den humane østrogenreceptor hER (cirkler), dels den humane østrogenreceptor hERG (trekanter).

10 De efterfølgende eksempler illustrerer opfindelsen uden at begrænse denne.

j EKSEMPEL 1: Konstruktion af pYERE/hER-vektorer:

Metoder: 15 De molekylærbiologiske metoder, der blev anvendt ved konstruktionen af de forskellige plasmider, er beskrevet i manualerne “Molecular cloning, a laboratory manual”, T. Maniatis, E.F. Fritsch og J. Sambnook, Cold Spring Harbor,

New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1982) og “Current Protocols in Molecular Biology", F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.A.

20 Smith, J.G. Seidman og K. Sruhl, Greene Publishing Associates and Wifey Intersciences (1987) De omfatter navnlig fordøjelsen af DNA med restriktionsenzymer, separation af DNA-fragmenter ved agarose-gelelektroforese eller polyacrylamidgelelektroforese, ligering af DNA-fragmenter med enzymet T4-DNA-ligase, transformation af E. coli med rekombinerede plasmider, be-25 stemmeisen af nukleotidsekvensen under anvendelse af Sanger-metoder.

De anvendte plasmider bærer ampicillinresistens genet, hvilket muliggør selektion af bakterier, som er transformeret med et plasmid, på agarplader, der indeholder ampicillin (50 pg/ml) 30

Den anvendte E. coli-stamme er stammen med genotype DH5: F-, endAl, HsdRI7(rk-md+), supE44, thi-1, lambda-, reca&, gyrA96, relAI (Hanahan DNA

11 DK 176000 B1 cloning: a practical approach, bind 1, s. 109-135, red. D.M. Glover, IRL Press, Oxford (1985)).

Metoder til transformation og dyrkning af gærstammer er beskrevet i "Labora-5 tory Course Manual for Methods in Yeast Genetics”, F. Sherman, G.R. Find og J.B. Hicks, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1986).

!

Den anvendte gærstamme er TGY14-1a, pep4.3 genotype Mat a, ura3-251-10 373-328, Ieu2, pep4.3.

Moderplasmidet pTG848, der er beskrevet i patentskrift nr. EP 200655, er et E. coli/gær færgeplasmid, som muliggør ekspression i gær af et fremmed gen under styring af promotoren for genet phosphoglyceratkinase (PGK).

15 Dette plasmid indeholder et pBR 322-replikationsstartsted og ampicillinre-sistens genet til selektion i E. coli, et 2 pm replikationsstartsted og generne ura3 et Ieu2 til selektion i gær, såvel som promotoren for genet PGK og dets 3-ende, som indeholder polyadenyleringssignalet. Dette gen er blevet modificeret ved at indføre et Bglll-sted inden for ATG-initieringskoden, hvilket gør 20 det muligt at indsætte det område, som koder for det andet protein, mellem dette sted og BgAII-stedet, som er anbragt opstrøms polyadenyleringssignalet (Figur 1).

Konstruktion af plasmideme pUC18 ERE1, PUCU18 EREm. PUC18 ERE3: 25

Plasmidet pUC18 (C. Yanisch-Perron, J. Vieira og J. Messing, Gene 33,103-1190 (1986)) indeholder et pBR322-replikationsstartsted, ampicillinresistens-genet og en polylinker, som navnlig indeholder Xbalog Hindlll-restriktionssteder. Dette plasmid blev fordøjet med restriktionenzymeme 30 Xmal og Hindlll; til det således fordøjede plasmid blev der derefter ved hjælp af teknikker med komplementære oligonukleotider tilføjet: 5' -CCGGGTCTAGAAGATCTA-3’ 3' -CAGATCTTCTAGATTCGA-5’ 12 DK 176000 B1

Det afledte plasmid pUC18 Bglll har således en polylinker, som i rækkefølge indeholder restriktionstedeme for Xmal, Xbal, Bglll og Hindlil.

I det plasmid, som er fordøjet med Bg1 II, blev der derefter indføjet respektive 5 fragmenter bestående af ERE1: 5’ -GATCCAATATTCCTGGTCAGCGTGACCGGAGCTGA-3’ 3’ -GTTATAAGGACCAGTCGCACTGGCCTCGACTCTAG-5’ EREm: 5’ -GAT CCAATATT CCCCGT CAG CGT G ACCGGAGCT G A-3’ 10 3’ -GTTAT AAGGGGCAGTCGCACTGGCCT CGACTCTAG-5' ERE3, som består af direkte gentagelse af tre ERE1-fragmenter. ERE1 indeholder ERE-sekvensen (ERE for “estrogen responsive element”) -605 til -634 af vitellogenpromotoren. EREm er en mutant, hvor en GC-transversion i 15 ERE-sekvensen i betragtelig grad reducerer dens aktivitet i MCF7-celleme.

Konstruktion af plasmideme pLREREI. pLREREm. pLRERE3:

Plasmidet pLR1 Δ20 er beskrevet i artiklen af R.W. West, R.R. Yocumn og M. Ptashne, Molecular and Cellular Biology, 4, 2467-2478 (1984). Dette 20 plasmid indeholder et aktivt og chimert beta-galactosidase-gen under styring af GaM-promotoren (figur 2).

Formålet med konstruktionen er at erstatte UAS’eme (“upstream activating sequence) af Gall-genet, hvilke sekvenser er anbragt mellem Xmal- og Xhol-25 restriktionsstedeme i Gali-promotorområdet, med fragmenterne ERE1, EREm henholdsvis ERE3.

PLRERE1:

Plasmidet pUC18ERE1 blev fordøjet med restriktionenzymet Bglll. Restrik-30 tionstedet blev udfyldt med DNAPolymerase I (Klenow-fragment) i nærværelse af de fire deoxynukleosidtriphosphater. En Xhol-linker (Biolabs reference 1030) blev derefter tilføjet i enderne. Plasmidet blev derefter fordøjet med 13 DK 176000 B1

Xmal og Xhol, og det Xmal-Xhol-fragment, som indeholdt sekvensen ERE1, blev isoleret.

Dette fragment blev derefter klonet i plasmidet pLR1-A20 mellem restrikti-5 onsstederne for Xmal og Xhol til frembringelse af plasmidet pLREREl.

oLREREm. PLRERE3: På samme måde blev plasmideme pLREREm og pLRERE3 konstrueret ved at erstatte pUC18ERE1 med pUC18EREm henholdsvis pUC18ERE3 i oven-10 stående protokol.

Konstruktion af plasmideme pYEREI . pYEREm. pYERE3:

Plasmideme pLREREl, pLREREm, pLRERE3 har i 3’-enden af det chimere lacZ-gen (beta-galactosidase) et genkendelsessted for Tthllll (figur 2) 15 pYEREI:

Plasmidet pLREREl blev fordøjet med enzymet Tthilll; restriktionsstedet blev derefter udfyldt med DNA-Polymerase I (Klenow-fragment). En Xmal-linker (Biolabs reference 1048) blev derefter tilføjet i enderne.

20 DNA’et blev fordøjet med Xmal, og det Xmal-Xmalfragment, som indeholdt det chimere lacZ-gen under styring af hybridpromotoren (EREA-Gall), blev indsat i det unikke Xmal-sted i plasmid pTG848 til frembringelse af plasmidet pYEREI.

25 pYEREm, PYERE3: På samme måde blev plasmideme pYEREm og pYERE3 konstrueret ved at erstatte pLREREl med pLREREm henholdsvis pLRERE3 i den ovenstående protokol.

Konstruktion af plasmidet pYGAL:

Plasmidet pLR1A20 blev fordøjet med restriktionenzymet Tth1111, og restriktionstedet blev udfyldt med DNA-Polymerase I (Klenow-fragment). En Xmal- 30 14 DK 176000 B1 linker (Biolabs reference 1048) blev derefter tilføjet i enderne, hvorefter DNA’et blev fordøjet med enzymet Xmal. Det Xmal-fragment, som indeholdt det chimere lacZ-gen under styring af Gal1-promotoren, blev indsat i Xmal-stedet i plasmid pTG848, hvilket gav plasmid pYGAL.

5

Konstruktion af plasmideme pYERE1/hER, pYERE1/hERR. pYEREm/hER. pYERE 3/hER, pYGAL J hER:

Formålet med disse konstruktioner er at placere det cDNA, som koder for den humane østrogenreceptor (hER) under styring af PGK-promotoren i 10 Bglll-stedet i plasmideme pYEREl, pYEREm, pYERE3, pYGAL (figur 3).

Plasmidet pKCR2-ER, som indeholder cDNA’et for den humane østrogenreceptor (S. Green et al., Nature, 320, 134-139 (1986)) blev fordøjet med restriktionsenzymet EcoRI, og restriktionsstedet blev derefter udfyldt med DNA-15 Polymerase I (Klenow-fragment). En BamHI-linker (Biolabs reference 102) blev derefter tilføjet i enderne. Efter fordøjelse med BamHI, blev det fragment, som koder for den humane østrogenreceptor, isoleret.

Dette fragment blev indsat i vektoren pYEREl, som var fordøjet med Bglll, til 20 frembringelse af plasmideme pYERE1/hER og pYERE1/hERR, der adskiller sig ved orienteringen af hER-cDNA i forhold til PGK-promotoren.

I pYEREl/hER er PGK-promotoren anbragt 5’ for hER-cDNA og inducerer derfor transkriptionen af det mRNA, som koder for hER-proteinet.

25 I pYEREl/hERR er orienteringen omvendt, og der induceres således transskription af en antisense-RNA af hER-mRNA.

pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYGAL/hER blev konstrueret efter den samme 30 model som pYERE1/hER ved at erstatte pYEREl med pYEREm, pYERE3 henholdsvis pYGAL i ovenstående konstruktion.

15 DK 176000 B1

Disse plasmider (figur 4a), som blev konstrueret i E. coli DH5, blev ved transformation overført i gærstammen TGV14.la, som bærer mutationen ura3. Tilstedeværelsen af ura3-genet på disse plasmider muliggør komplementeringen i de transformerede gærsvampe ved hjælp af et plasmid, hvilke gær-5 svampe således selekteres på agarplader, som indeholder et medium uden uracil (fremstilling: 0,67 g Difco-medium nr. 0919-15, 0,5 g casaminosyrer, 1 g glukose, 2 g Agar til 100 ml).

EKSEMPEL 2: Østradiolinduktion af transkriptionen fra ERE-Gal1-10 hvbridpromotorer. som findes på vektorerne pYERE/hER:

Forskellige gær, som indeholdt plasmiderne pYERE1/hER, pYEREm/hER, pYERE3/hER, pYERE1/hERR henholdsvis pYGAL/hER, blev dyrket i et gærmedium 0,67 g Difco nr. 0919-15/100 ml og 0,5 % casaminosyrer inde-15 holdende 1% glukose eller 2% galactose éller 100 nM østradiol (tilsat til kulturen 2 timer før indvinding af cellerne), hvilket er anført i figur 4b.

RNA blev fremstillet ud fra 109 celler ifølge den metode, som er beskrevet i Methods in Yeast Genetics, s. 143-144.

20

For at måle Gal1- eller ERE-Gal1-promotorernes transkriptionelle aktivitet blev deres RNA hybridiseret med en radioaktivt mærket RNA-probe afledt fra 5-enden af Gal1-genet (den komplementære streng til mRNA). De hybridiserede fragmenter vil være beskyttet mod fordøjelsen med RNaseme 25 A og T1. Proben blev fremstillet ud fra EcoRI-fragmentet (indeholdende Gal1-promotoren) fra plasmid pLR1A20 (R.W. West, R.R. Yocum og M. Plashne,

Molecular og Cellular Biology 4, 2467-2478 (1984)) klonet i plasmidet Bluescribe M13+ (Stratagene reference 211201) Det fremkomne plasmid blev derefter lineariseret med Hindill, og den radioaktive probe blev derefter 30 syntetiseret ved hjælp af en promotor fra fag T7 med Stratagenekittet nr.

211604. Probens længde er af størrelsesordenen 1000 nukleotider.

16 DK 176000 B1

Der findes adskillige transkriptionsinitieringssteder i Gal1-promotoren, og proben er komplementær med Gal1-RNA over en længde på fra 154 til 165 nukleotider.

5 Proben blev inkuberet med 20 pg RNA, og blandingen indeholdende de eventuelle hybrider blev fordøjet med ribonukleaseme A og T1 ifølge den protokol, som er beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology.

De ikke-fordøjede fragmenter blev derefter identificeret ved gelelektroforese i 10 polyacrylamid-urinstof og ved autoradiografi (figur 4b).

For de konstruktioner, som udtrykker hER-receptoren, observeres i nærværelse af østradiol induktion af en mRMA, der er specifik for ERE-Gal1-hybridpromotoren; transkriptionsinitieringsstedeme er identiske med stederne 15 for promotoren Gal1 (pYGAL) induceret af galactose: de beskyttede fragmen ter er af samme længde.

Induktion af transkriptionen fra hybridpromotoren ERE-Gal1 er strengt afhængig af tilstedeværelsen af østradiol. Induktion med Østradiol nødvendig-20 gør tilstedeværelsen af hER-receptoren (konstruktionen pYERE/hERR er inaktiv). Den nødvendiggør ligeledes tilstedeværelsen af et ERE-element (for konstruktionen pYGAL/hER sker der ikke induktion med østradiol).

Den mængde Gal1-RNA, som påvises for de celler, der indeholder pYE-25 RE3/hER, er omkring 10 gange højere end for de celler, som indeholder pYERE1/hER; tandem-gentagelsen af ERE-elementer (pYERE3 indeholder en ERE-trimer, pYEREl en monomer) synes således at have en synergistisk virkning på transkriptionsaktiveringen.

30 i i 17 DK 176000 B1 EKSEMPEL 3: Den østradiol-inducerbare ekspression af beta-oalactosidase i gær, som indeholder pYERE/hER-vektorer:

Beta-galactosidase-aktiviteten blev målt i følge protokollen efter West et al., 5 (1984). Den efterfølgende tabel 1 viser beta-galactosidase-aktiviteten hos gærstammer, som respektivt bærer plasmideme pYEREl/ hER, pYE-RE3/hER, pYEREm/hER, pYEREl/hERR og pYGAL/hER i nærværelse eller fravær af glukose, galactose eller østradiol som anført i tabellen.

10 Promotorernes konstitutive aktivitetsniveau er meget lavt og er ikke påvirket af tilstedeværelsen af hER-proteinet (pYGAL og pYGAL/hER eller pYEREl/hER og pYERE1/hERR giver det samme aktivitetsniveau). I modsætning hertil medfører tilsætning af østradiol en kraftig induktion af hybridpromotorerne for pYEREl/hER og pYERE3/hER.

15

Den kendsgerning, at promotorerne for pYEREm/hER og pYGAL/hER ikke er følsomme over for induktion med østradiol, viser nødvendigheden af et funktionelt ERE element i den promotor, som styrer ekspressionen af lacZ, medens fravær af induktion for pYEREl/hERR viser, at tilstedeværelsen af hER-20 receptoren ligeledes er nødvendig for at observere induktion med østradiol.

Det opnåede ekspressionsniveau er sammenligneligt med niveauet opnået med Gali-promotoren (med pYGAL/hER) i nærværelse af galactose.

25 Tilstedeværelsen af tre ERE-elementer i tandem (med pYERE3/hER) giver en aktivitet, som er to gange højere end i det tilfælde, hvor promotoren kun indeholder et enkelt ERE-element (pYEREl/hER).

18 DK 176000 B1 TABEL 1

Hormoninduktion af beta-galactosidase-aktivitet ved hjælp af yhER_

Medium Beta-galactosidase aktivitet (enheder)

Plasmid__Glucose Galactose Østradiol__ pYERE1/hER__+__:__60_ pYERE1/hER +__:__+ 1060_ pYERE1/hERR +__:__60_ pYEREVhERR +__-__+ 60_ pYERE3/hER +__-__60_ pYERE3/hER +__-__+ 2060_ pYEREm/hER +__-__60_ pYEREm/hER +__-__+ 260_ pYGAL/hER__+__:__180_ pYGAL/hER__+__;__+ 180_ pYGAL__+__ 180_ pYGAL I - I + I - 12300 Gær transformeret med de anførte plasmider blev dyrket i nærværelse af 1 % glukose eller 2 % galactose, som nævnt i tabellen; for induktion med østra-5 diol blev der tilsat 100 nM hormon 2 timer før høst af cellerne.

Måling af beta-galactosidase-aktivitet blev udført på traditionel måde (West, R.W. jr., Yocum, R.R. og Ptashne, M., Mol. Cell. Biol., 4, 2467-2478 (1984)).

10 EKSEMPEL 4: Integration af et komplementært DNA. som koder for hER. i en aærstammes genom

Fremstilling af en ekspressionsvektor. som bærer en hER-ekspressions-kassette indsat i PRC1-genet (pTG3809) 15 hER-ekspressionskassetten blev indsat i et fragment af PRC1-genet for efter transformation af en gærstamme med pTG3809 at opnå en gærstamme, som 19 DK 176000 B1 har en undertrykkelse af den proteolytiske funktion, der kodes af PRC1-genet.

Der blev først fremstillet en hER-ekspressionskassette (M13TG2896) på føl-5 gende måde: - gær-PGK-promotoren (fragment Hindlll-Bglll) og dens terminator (fragment Hindlll-Bglll) blev indført i fagen M13TG130 (Kieney, M.P. et al.

(1983), Gene, 26, s. 91-99) der var lineariseret ved fordøjelse med Hindill, til frembringelse af fagen M13TG2890, 10 - BainHI-fragmentet fra pKCR2- hER, hvilket fragment bærer den humane østrogenreceptor, blev indført i M13TG2890 lineariseret ved fordøjelse med Bglll til opnåelse af hER-ekspressionskassetten kaldet M13TG2896.

Denne hER-ekspressionskassette blev derefter indsat i PRC1-genet til frem-15 bringelse af plasmidet pTG3809, hvorved det kunne integreres i gærgeno-met.

Sekvensen af PRC1-genet er blevet publiceret af Vails, L.A. et al. (1987) (Cell, 48, s. 887-897). Der blev konstrueret to oligonukleotider ud fra denne 20 sekvens. Den første er komplementær til 5’-området af genet og denne sekvens er følgende: 5' AAG AAA GAC TGG GAC TTT GTG 3’ 25 Den anden er komplementær til 3’-området af genet, og dens sekvens er følgende: 5’ GAT TGG ATG AAG CCT TAC CAC 3’ 30 Ud fra et genomisk gærbibliotek (kromosomale DNAfragmenter, som er del vis fordøjede med Sau3A og indsat i BamHI-stedet i pFL1 (Parent, S.A. et al.

(1985), Yeast, i, s. 83-138), og ved hybridisering med de to oligonukleotider 20 DK 176000 B1 blev der selekteret en E. coli-klon, som indeholdt PRC1 -genet indsat i pFL1, og den blev kaldt pTG2863.

Det 1,1 kb lange BamHI-fragment fra pTG2863, som bærer en del af den 5 sekvens, der koder for PRC1-genet, blev indført i BamHI-stedet i plasmid p(JC8. Denne indføjelse blev udført i tandem, og plasmidet pTG2893 blev opnået (figur 5a).

Koordinaterne for den første base i restriktionsstedeme i forhold til adenin i 10 ATG i den sekvens, som koder for PRC1, var følgende: BamHI-1: 482;

EcoRV-1:1102; EcoRV-2:1153; EcoRV-3:1234 og BamHI-2: 1574.

En deletion i den sekvens, som koder for PRC1, blev opnået ved EcoRV-fordøjelse af pTG2893 til opnåelse af pTG2894 (figur 5b).

15 hER-ekspressionskassetten blev indført i det indre fragment, som var delete-ret fra PRC1-genet i pTG2894, på følgende måde: ekspressionskassetten (M13TG2896) blev fordøjet med BamHI, enderne blev udfyldt med Klenow-polymerase, og efter spaltning med EcoRV blev der isoleret et fragment. Det-20 te fragment bærer hele kassetten, den blev indført i EcoRV-stedet i pTG2894 til frembringelse af plasmidet pTG3809 (figur 6), der mellem to PRC1-fragmenter bæren - adskillige genkendelsessteder for restriktionsenzymerne Sphl, Xbal, Kpnl hidrørende fra M13TG130, 25 - gær-PGK-terminatoren, - DNA komplementær til hER, - gær-PGK-promotoren.

Transformation af en aærstamme med det plasmid, som bærer hER-30 ekspressionskassetten indføjet i et deleteret PRC1 -gen-fragment (pTG3809): ,

Den transformerede gærstamme var en stamme af S. cerevisiae TGY2sp13b (MATa; ura3-251, -373, -328; leu2-3, -112) 21 DK 176000 B1

Plasmidet pTG3809 blev spaltet med BamHI. DNA-sekvenseme i enderne af det således isolerede fragment er homologe med enderne af sekvensen for PRC1-genet. Disse sekvenser vil muliggøre integration af fragmentet i den genomiske del af PRC1 -genet i gærstammen. Denne indføjelse fører til de-5 struktionen af det genomiske PRC1-gen ved deletion.

Eftersom fragmentet ikke bærer selektionsmarkører, blev plasmidet pLRE-RE3 anvendt som co-transformationsvektor. Den muliggør selektion af pro-totrofe Uratstammer. Blandt de prototrofe Ura+-stammer bærer de kloner, 10 som har integreret hER-ekspressionskassetten, en mutation i PRC1 -genet, som medfører et tab af aktiviteten af carboxypeptidase yscY. Disse mutanter blev påvist ved en kolorimetrisk test (Jones, E.W. (1977), Genetics, 85, s. 23-33). Strukturen af det modificerede PRC1-locus blev bekræftet ved Southem-metoden.

15

Denne stamme af S. cerevisiae, hvor hER-ekspressionskassetten er integreret i det deleterede PRC1-gen, er blevet kaldt TGY2sp13bprc1-d: :hER.

Konstruktion af et plasmid, som bærer ERE3-sekvensen og et fragment af 20 promotoren for PGK-qenet (pTG3851):

Et Xhol-sted blev indført i M13TG2890-vektoren i forbindelsespunktet mellem 5’-, 3’-endeme af den deletion, der er udført med styret mutagenisering under anvendelse af følgende oligonukleltid: 25 -506 .. -401 5' AATTACCGTCGCTCG AGCGACGGCTCACAG 3’

Xhol til frembringelse af vektoren M13TG3829 (figur 7). De angivne positioner blev 30 bestemt i forhold til ATG i PGK-genet. I det følgende blev den deleterede form af PGK-promotoren kaldt PGK-dp401. Overensstemmelse med sekvensen blev herefter bekræftet ved sekventering.

22 DK 176000 B1

Denne vektor bærer TATA-sekvensen og transkriptionsinitieringsstedet, den anden aktivatorsekvens nedenfor kaldt HSE, fra -256 til -377 (Piper, P.W. et al. (1988), Nucleic Acids Res., 16, s. 1333), men bærer ikke længere UAS fra -402 til -479. Xhol-stedet muliggør ligering med ERE3-sekvensen og Bglll-5 stedet muliggør indførelsen af et gen, som muliggør påvisning af en aktivitet ved enzymtest.

Værtsstammen for M13-fager er stammen E. coli JM103 (delta(lac, pro), thi, strA, supE, endA, sbcB, hsdR, F’traD36, proAB, laclQ, lacZdeltaM15).

10

Plasmidet pLRERE3 blev fordøjet med Xmal og Ecol. Det DNA-fragment, som indeholdt ERE3-sekvenser, blev oprenset på agarosegel og derefter indsat i Xmal- EcoRI-stederne i plasmid pTZ18R (Pharmacia, LKB Biotechnology) til frembringelse af plasinidet pTG3833. Værtsstammen for plasmi-15 derne er stammen E. coli 1106 (supE, hsdR, hsdM, met, supF).

Fagen M13TG3829 (figur 7) blev behandlet med Xhol og EcoRI og blev derefter indsat i Xhol-EcoRI-stedet i plasmid pTG3833 til frembringelse af PTG3834.

20 lacZ-genet blev taget fra pCH110 (Hall, C.V. et al. (1983), J. Mol. Appl. Gen., 2, s. 101-109) ved Hindlil- BamHI-fordøjelse og blev klonet i pPolyll (Lathe, R. et al. (1987), Gene, 57, s. 193-201) til frembringelse af pTG1174. Plasmidet pTG2145 svarer til plasmidet pTG1174, i hvilket restriktionsstedeme for 25 Hindlil, Pstl og Sall er blevet fjernet. Det indeholder på et Bglll-BamHI-fragment følgende E. coli-genfusion: gpt: :trpS: :lacZ.

Sekvenserne ved siden af ATG blev modificeret på en måde, som muliggør en korrekt tolkning i gæren på følgende måde: 30 - pTG2145 blev fordøjet med Bglll og Knpl, og det 200 basepar lange frag ment indeholdende ATG blev oprenset på acrylamidgel, - dette fragment blev indsat i BamHI-Kpnl-stedeme i fag M13TG131 (Kieny, M.P. et al. (1983), Gene, 26, s. 91-99) til frembringelse af M13TG3838, 23 DK 176000 B1 - sekvensen “AGC” svarende til den anden codon for en serin i M13TG3838 blev udskiftet med sekvensen 'TCT, cytosinerne i position -3 og -1 i forhold til ATG blev udskiftet med adeniner og et Bglll-genkendelsessted blev frembragt 5’ for ATG for at muliggøre en fusion med de gener, som skulle indsæt- 5 tes, efter hybridpromotoren, ved at udføre en styret mutagenisering ved hjælp af følgende oligonukleotid: 5’ -CGATGTA l I I I I CAGACATTTTAAGA’1 ΌΤCCAGCCTGTTT-3’ 10 til frembringelse af fagen M13TG3842. Nedenfor er de baser, som er blevet modificeret ved denne mutagenisering, understreget: -G ACACTTCACAT GAGC- (M13TG3838) - AGATCTTAAAAT GTCT- (M13TG3842) 15

Det 130 basepar lange Bglll-Kpnl-fragment fra M13TG3842 blev indsat i pTG2145 for deri at erstatte det 200 basepar lange Bglll-Kpnl-fragment. Derved blev plasmidet pTG3843 opnået.

20 Plasmidet pTG848 (figur 1) blev fordøjet med Bglll, derefter ligeret igen til frembringelse af pTG2886. Det store Hindill-EcoRi-fragment fra pTG2886 blev ligeret i nærværelse af T4-ligase til det 2,1 kb lange Hindill-EcORI-fragment fra plasmidet pFL1 (Parent S. A. et al. (1985), Yeast, 1, s. 83-138), der bærer en 2p-plasmidsekvens fra S. cerevisiae, til frembringelse af plas-25 midet pTG2886 LEU2-d, URA3-d. Det 0,9 kb lange Hindlil-fragment fra plasmidet pTG2800, som er beskrevet i europæisk patentpublikation nr. EP-A- 0.258.501, hvilket fragment bærer URA3-d-genet, blev derefter indsat i genkendelsesstedet for Hindill i dette plasmid til frembringelse af pTG2886 URA3-d, delta LEU2-d. Smal-Bglll-fragmentet fra M13TG131 (Kieny, M.P. et 30 al: (1983), Gene, 26, s. 91-99), som har adskillige restriktionsteder, indføres derefter i dette plasmid til frembringelse af pTG3828.

i 24 DK 176000 B1

Plasmidet pTG3843 blev fordøjet med Bglll og BamHI. og det fragment, som bærer lacZ-fusionsgenet, blev oprenset på agarosegel. Dette fragment blev derefter indsat i Bglll-genkendelsesstedet i pTG3846 (figur 8).

5 Plasmidet pTG3834 blev fordøjet med Xmal og Bglll, og fragmentet blev indført i genkendelsesstedet for Xmal og Bglll i pTG3846 til frembringelses af plasmidet pTG3851 (figur 8).

Inducerbar ekspression af lacZ: 10 S. cerevisiae-stammen TGY2spi3b prc1-d::hER blev kureret for sit plasmid ved co-transformation med pLRERE3 og derefter transformeret med plasmidet pTG3851 ved lithiumacetatmetoden (Ito, H. et al. (1983) , J. Bacteriol., 153, s. 163-168), og de prototrofe Ura+-stammer blev selekteret. De blev derefter dyrket i en Erlenmeyer-kolbe ved 30 °C i et selektivt medium (0,7% 15 nitrogenbaser til gær uden aminosyre (Yeast Nitrogen Bases), 0,5% casami-nosyrer, 2 % glukose og, om nødvendigt, 2 % agar). Disse dyrkninger blev udført med eller uden østradiol. Til induktion med østradiol blev der tilsat 100 nM hormon 2 timer før høst af cellerne. Cellerne blev høstet, blev vasket og findelt i nærvær af proteasehæmmere, og derefter blev de cellulære rester 20 præcipiteret ved centrifugering (10.000 omdrejninger pr. minut). Proteinkoncentrationen blev bestemt i supematanten ved den metode, som er beskrevet af Bradfom (1976) (Anal. Biochem., 72, s. 248) og derefter beta-galactosidase-aktiviteten ved den samme metode, som er beskrevet i eksempel 3. Beta-galactosidase-aktiviteten blev også bestemt ved den metode, 25 som blev anvendt i eksempel 3, hvor analysen blev udført på permeabilise-rede celler.

I tabel 2 vises de basale aktiviteter (i fravær af østradiol (-(Øst))) og den inducerede aktivitet (i nærværelse af østradiol (+(Øst))) af beta-galactosidase 30 under styring af hybridpromotoren ERE3::PGK-dp. Denne aktivitet er udtrykt i nmol ONPG (O-nitrophenyl-beta-D-glucopyranosid) hydrolyseret pr. minut og pr. mg protein ved 30 °C; værdierne i parenteser er direkte sammenlignelige med de værdier, som er givet i tabel 1, udtrykt i “enheder". Inducerbarhed 25 DK 176000 B1 svarer til forholdet mellem den specifikke aktivitet uden østradiol og den specifikke aktivitet med østradiol.

__TABEL 2__

VektorPGK promoter__Specifik aktivitet__Inducerbarhed __-(Øst)__+(Øst)__ pTG3851 ;PGK-dp401 20(30) 460(770) 23 5 EKSEMPEL 5: Fremstilling af en ekspressionsvektor for beta-oalactosidase i gær, hvilken vektor ligeledes bærer en sekvens, der koder for receptoren hERG (pYERE1/hERG): 10 Man går ud fra plasmidet pYERE1/hER. Ved hjælp af følgende oligonukleo-tid: 5’ -GGAGCACCCAGGGAAGCTACT GT-3’ og udfører under anvendelse af stedsspecifik mutagenisering en mutation i 15 den codon, GTG, som koder for valin, i det komplementære DNA, som koder for den humane østrogenreceptor (hER) på følgende måde: det komplementære DNA, som koder for hER-receptoren, der er beskrevet af Green et al.

(1986) (Nature, 320, s. 134-139) blev subklonet i EcoRI-stedet i den eukaryote ekspressionsvektor pSG1 beskrevet af Green et al. (1988)(Nucl. Acids 20 Res. 16, s. 369). Der blev derefter fremstillet enkeltstrenget DNA og ved hjælp af stedsstyret mutagenisering blev der udført en punktmutation i den codon, GTG, som koder for valin ved position 400, således at der blev opnået en codon, GGG, som koder for glycin, ved hjælp af det ovenfor definerede oligonukleotid (nukleotidskiftet er understreget). DNA-sekvensen blev be-25 kræftet. Derefter blev vektoren pYERE1/hERG konstrueret ved at indsætte det komplementære hERG-DNA i vektoren pYERE1/hER.

26 DK 176000 B1 EKSEMPEL 6: Med østradiol inducerbar ekspression af beta-oalactosidase i aær. som indeholder vektoren pYERE1/hERG:

Betingelserne for transformation og dyrkning af celler er identiske med de 5 betingelser, der er beskrevet tidligere. Da den optiske densitet nåede 600, blev der tilsat 10 riM østradiol. Figur 9 viser, at 50 % af den maksimale aktivitet af beta-galactosidase blev opnået ved en østradiolkoncentration på 5 nM med pYERE1/hERG (trekanter), medens med pYERE1/hER (cirkler) var en koncentration på omkring 50 nM nødvendig.

10

Man har for øvrigt kunnet konstatere, at den mutation, som erstatter val-400 med gly-400 i bindingsområdet for østradiol, stabiliserer receptorens struktur og forstærker dens affinitet for østradiol ved 25 °C.

15 Saccharomyces-staminen TGY 14-la pYERE3/hER er blevet deponeret hos Collection Nationale de cultures de Microorganismes (CNCM) de l’lnstitut Pasteur - 25 rue du Docteur-Roux, 75724 Paris Cédex 15 (Frankrig), den 17. juni 1988 under nr. 1-770.

j i i i i

Claims (21)

27 DK 176000 B1

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et protein ud fra gær, hvor - der dyrkes gærceller, som indeholder følgende 5. en DNA-sekvens, der koder for proteinet, under styring af elementer, som sikrer dets ekspression i gær, hvilke elementer omfatter en transkriptionsstyringssekvens, som er funktionel i højere eukaryote celler og som omfatter en naturlig “URE” aktivatorsekvens, en variant eller en afledet af denne sekvens, der kan induceres af et kompleks, som er 10 dannet mellem en receptor og en ligand, • en DNA-sekvens, som er funktionel i gær, der koder for receptoren, som er en naturlig kemereceptor valgt blandt receptorer for et steroid, receptorer for retinoider, receptorer for thyroidhormoner og receptorer for vitamin D3, samt varianter eller chimere receptorer af en naturlig receptor, 15 hvilken receptor omfatter to essentielle dele, hvoraf den ene del i genkender liganden på en sådan måde, at den danner et kompleks med liganden, og den anden del bindes til transkriptionsstyringssekvensen, og liganden ikke er nødvendig for cellekulturen, men er i stand til at trænge ind i cellerne, når den tilsættes til dyrkningsmediet, 20. liganden tilsættes dyrkningsmediet på et tidspunkt, som er passende for induktion, og - det syntetiserede protein indvindes.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at ”HRE” transkrip- 25 tionsstyringssekvensen er en ERE-sekvens.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at transkrip- tionsstyringssekvensen er en perfekt eller ikke-perfekt, naturlig eller syntetisk palindromisk sekvens. 30

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at denne palindromiske sekvens kan være gentaget adskillige gange. 28 DK 176000 B1

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 4, k e n d e -tegnet ved, at receptoren er en kernereceptor, og at liganden er den hertil svarende specifikke forbindelse,

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at receptoren for trinsvis er østrogenreceptoren, at liganden er en østrogenforbindelse og den essentielle del, som genkender liganden, hidrører fra hER-receptoren.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den essentielle 10 del af receptoren, som genkender liganden, hidrører fra den humane østrogenreceptor, benævnt hERG, hvor liganden er en østrogenforbindelse.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at receptoren er hERG, og liganden er østradiol. 15

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at østradiol tilsættes ved en koncentration på mellem 2 og 50 nM, fortrinsvis ca. 10 nM.

10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 9, k e n d e -20 tegnet ved, at den DNA-sekvens i gæren, som koder for proteinet under de styringselementer, som sikrer dets ekspression i gær, og/eller den DNA-sekvens, som koder for receptoren, findes på et plasmid med et replikations-startsted, der er funktionelt i gær.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at de to DNA sekvenser befinder sig på det samme plasmid.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 11, k ende-tegnet ved, at den DNA-sekvens, som er funktionel i gær, og som koder 30 for receptoren, bæres af et kromosom i gæren.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kraveneli til 12, k ende-tegnet ved, at der anvendes en gærstamme, som er defekt i proteaser. 29 DK 176000 B1

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 13, k ende· tegnet ved, at liganden tilsættes efter cellevækstfasen,

15. Inducerbar ekspressionsvektor for et protein lokaliseret i gærceller, der er transformeret med vektoren, kendetegnet ved, at den omfatter - en DNA-sekvens, som koder for proteinet, under styring af elementer, som sikrer dets ekspression i gær, hvilke elementer omfatter: - en transkriptionsstyringssekvens, der hidrører fra en højere eukaryot 10 omfattende en naturlig ”HRE” aktivatorsekvens, en variant eller en af ledet af denne sekvens, som kan induceres af et kompleks, der er dannet mellem en receptor og dens ligand, hvor gærcellerne omfatter en DNA-sekvens, som er funktionel i gær, og som koder for receptoren, som er en naturlig kernereceptor valgt blandt receptorer 15 for et steroid, receptorer for retinoider, receptorer for thyroid hormoner og receptorer for vitamin D3, samt varianter eller chimere receptorer af en naturlig receptor til udførelse af fremgangsmåden ifølge etaf kravene 1 til 14.

16. Vektor ifølge krav 15, kendetegnet ved, at den DNA-sekvens, der 20 koder for denne receptor, bæres af den inducerbare ekspressionsvektor.

17. Ekspressionsvektor ifølge krav 15 eller 16, kendetegnet ved, at den transkriptionsstyringssekvens, som hidrører fra en højere eukaryot, er følsom over for et kompleks dannet mellem en steroidreceptor og det tilsvarende 25 steroid. I ;

18. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 15 til 17, k en-d e t e g n e t ved, at transkriptionsstyringssekvensen, som hidrører fra en højere eukaryot, er følsom over for et kompleks dannet mellem østradiolre- 30 ceptoren og østradiof.

19. Ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 15 til 18, k en-d e t e g n e t ved, at transkriptionsstyringssekvensen, som hidrører fra en DK 176000 B1

30 I højere eukaryot, omfatter sekvensen eller gentagelser af sekvensen fra -605 til -634 i det vitellogene gen i høns.

20. Ekspressionsvektor ifølge et krav 19, som består af plasmidet pYE-5 RE3/hER, som er deponeret hos CNCM under nummer 1-1770.

21. Gærstammer transformeret med ekspressionsvektoren ifølge et hvilket som helst af kravene 15 til 20. | i » i