DK175794B1 - Fremgangsmåde til isolation og karakterisering af et gen-enzymsystem til inaktivering af herbicidet phenmedipham - Google Patents

Description

i DK 175794 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til isolation og karakterisering af et gen-enzymsystem til inaktivering af herbicidet phenmedipham. Enzymet er en car-bamat-hydrolase af Arthrobacter oxidans, hvilken carbamat-hydrolase er ansvarlig for spaltningen af -OOC-N-bindingen mellem begge phenylringene i phenmedipham (IU-5 PAC-betegnelse for 3-m-toly!carbamo- yloxyphenylcarbamat).

I praksis må der ofte anvendes flere herbicider eller herbicidblandinger til bekæmpelse af forskellige ukrudtsarter. Dette problem kunne undgås ved hjælp af genteknologisk forandrede planter, som udviser en resistens over for ikke-selektive herbicider.

10

Kravet om herbicidtolerante planter står dermed i dag mere og mere i forgrunden for plantebeskyttelse.

For at frembringe herbicidtolerante planter er der et behov for primært en fremgangs-15 måde til isolation og efterfølgende oprensning af et enzym, som er i stand til at inaktivere et herbicid ved metabolisering, og sekundært en fremgangsmåde til karakterisering af gen-enzymsystemet, som indeholder den ansvarlige DNA-sekvens for kodningen af det aktive enzym.

20 En sådan fremgangsmåde til isolation og efterfølgende karakterisering af et gen-enzymsystem, som kan inaktivere phenmedipham, har hidtil ikke været kendt.

Det er således formålet med den foreliggende opfindelse at anvise en fremgangsmåde til isolation og efterfølgende karakterisering af et gen-enzymsystem, som kan inaktive-25 re phenmedipham. Hertil gennemføres til at begynde med en screening af mikroorganismer for at identificere de mikroorganismer, som besidder den evne, at de kan inaktivere herbicidet phenmedipham ved metabolisering. , i i

Det har nu vist sig, at der fra jordmikroorganismer, såsom Arthrobacter oxidans, kan 30 isoleres en carbamat-hydrolase, som er ansvarlig for hydrolysen af -OOC-N-bindingen mellem begge phenmediphams phenylringe. Hydrolysen af -OOC-N-bindingen mellem

I DK 175794 B1 I

I 2 I

begge phenmediphams phenylringe fører til herbicidinaktive forbindelser, såsom I

methyl-3-hydroxyphenyl-carbamat og m-toluidin efter følgende reaktion: I

I wcHj I

I / OH ) I

I <> * — *“· i

ff Jr m-Toluidin I

S -\ I

HN-COOCH3 HN-COOCHj

H Pftenmedipham Hethyl-3-hydroxy- I

H 10 phenyl-car&amat I

Til isolation og efterfølgende oprensning af et gen-enzymsystem, som kan hydrolysere I

phenmedipham ifølge den ovenfor beskrevne reaktion, dyrkes Arthrobacter oxi- I

15 dans-mikroorganismer i næringsmedier. Carbamat-hydrolasen, som er ansvarlig for I

spaltningen af phenmedipham, isoleres ved hjælp af ultralydscelleoplukning og centri- I

I fugering og oprenses indtil elektroforetisk homogenitet ved anionbytterchromatografi, I gradienteluering, ammononiumsulfatfældning og FPLC-separation. Ud fra den opren-

sede carbamat-hydrolase isoleres efter BrCN-spaltning to peptider, hvis sekvens kan I

I 20 fastlægges ved Edman-nedbrydning. I henhold til disse peptiders sekvensinformation, I

I syntetiseres oligonukleotider, der anvendes som hybridiseringssonder til påvisning af I

carbamat-hydrolase-genet. I

I alle anførte isolater fra jordbakterien Arthrobacter oxidans kunne der efter cellelyse I

25 og ekstraktion af nukleinsyreme påvises plasmider. I

I Hos stammen Arthrobacter oxidans P52 kan det vises, at carbamat-hydrolasen kodes I

I ved hjælp af et plasmid. H

3 DK 175794 B1

Ved tab af plasmidet pHP52 mister denne stamme evnen til hydrolytisk at spalte phen-medipham. En carbamat-hydrolase kan ikke påvises biokemisk i det plasmidfrie derivat fra stammen P52.

5 Plasmidet pHP52 isoleres præparativt og kortlægges med restriktionsendonukleaser. De elektroforetisk adskilte restriktionsfragmenter overføres til membranfilter og hybridise-res med oiigonukleotideme. Ud fra dataene fra aftryks-hybridiseringen fremkommer det, at carbamat-hydrolase-genet er lokaliseret på et Pstl-restriktionsfragment med størrelsen 3,3 kb.

10

Dette fragment isoleres præparativt fra plasmidet pHP52 og indbygges på Pstl-stedet hos vektoren pUC19C (C. Yanish-Perron, J. Vieira & Messing (1985), gen 33,103 ff.).

Efter transformation af E. coli DHa med ligeringsblandingen opnås to typer af rekom-binante E. coli-kloner (pp52Pst og pp52Pst inv.), som indeholder carba-15 mat-hydrolase-genet i forskellig orientering til vektorens lac-promotor (se fig. 5).

Carbamat-hydrolasen udtrykkes funktionelt i nærværelse af induktoren isopro-pyl-/3-D-thiogalaktosid fra kulturer af kloner af typen E. coli DHa5 (pp52Pst). I proteinekstrakter af kloner af typen E. coli DHa5 (pp52 inv.), som indeholder carba-20 mat-hydrolase-genet i invers orientering til lac-promotoren, kan der ikke påvises nogen ekspression af carbamat-hydrolasegenet. Deraf kan det udledes, at E. coli RNA-poly-merasen ikke genkender Arthrobacter-promotoren.

Carbamat-hydrolase-genets nukleotidsekvens fastlægges efter metoden af Sanger et al.

25 (F. Sanger, S. Nicklen & A. Coulson (1977), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 74, 5463-5468).

. Ud fra det klonede 3,3 kb lange Pstl-restriktionsfragment konstrueres 15 subkloner i de enkeltstrengede DNA-bakteriofager Ml3 mpl8 og mpl9 (J. Messing, (1983) Methods 30 in Enzymol. 101, 20-78). Fig. 6 viser et nøjagtigt restriktionskort for det kodende om- i råde, hvoraf sekvensstrategien fremgår.

_______________

I DK 175794 B1 I

I 4 I

Den fastlagte nukleotidsekvens med proteinsekvensen, som kan afledes deraf, er vist på I

fig. 7. Aminosyresekvenseme hos begge de fastlagte peptider, som er spaltet med

BrCN (se eksempel 4), kan identificeres i den samme læseramme på DNA-niveau. I

I Denne læseramme slutter med et TGA-translationsstopkodon (se fig. 7, nukleo- I

I 5 tid-position 1789-1791) og begynder meget sandsynligt med et GTG-startkodon (fig. 7,

nukleotid-position 340-342). I alt resulterer en læseramme på 1479 basepar. Opstrøms I

for det formodede GTG-startkodon kan der fastslås en region med signifikant homologi

til konsensus-sekvensen for E. coli ribosombindingssteder ("Shine-Dalgamo Box”) (se I

I fig. 7. nukleotid-position 298-302). I

I

I i Ved Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) i Gottingen, Tyskland, blev H

I følgende mikroorganismer (deponingsnumre) deponeret:

I Arthrobacter oxidans P16/4/B (DSM 4038) den 24.03.1987 I

I 15 Arthrobacter oxidans P 67 (DSM 4039) " I

I Arthrobacter oxidans P 75 (DSM 4040) I

I Arthrobacter oxidans Pll/l/-b (DSM 4041) I

I Arthrobacter oxidans P 15/4/A (DSM 4045) den 27.03.1987 I

I Arthrobacter oxidans P21/2 (DSM 4046) " I

I 20 Arthrobacter oxidans P 52 I

I indeholdende plasmidet pHP52 (DSM 4044) I

I Beskrivelse af tegningen I

I 25 Forkortelser H

I g - centrifugalkraft I

I DEAE - diethylaminoethyl H

I FPLC - (Fast Protein/Peptid/Polynukleotid Liquid H

I 30 Chromatography) = hurtig væskekromatografi ; H

I for proteiner, peptider og polynukleotider j I

5 DK 175794 B1 pH - den negative 1 O-tals logaritme til hydrogenion- koncentrationen kb - kilobase SDS - natriumlaurylsulfat 5 DTT - dithiothreit 1 x SSC - 0,15 M NaCl, 0,015 M tri-natriumcitrat pH 7,0 1 x Denhardt - 0,02 (vægt/volumen%) okseserumalbumin (Sigma, fraktion V) 0,02 (vægt/volumen%) Ficoll 400 10 0,02% polyvinylpyrrolidon MCS - multipelt kloningssted 15 Forkortelser for restriktionsendonukleaser IBm = BamHI, Bs = BstEII, Cl = Clal, EV = EcoRV, HH = Hindn, Kp = Kpnl, Nc =

Ncol, Nd = Ndel, Nh = Nhel, Ps = PstI, Pvl = Pvul, PvII = PvuII, Sc = SacI, Sp = Sphl, ! St = Stul, xb = Xbal.

Figurer figur 1 viser fremgangsmåden til isolation og efterfølgende oprensning af den phenme-dipham-spaltende carbamat-hydrolase fra Arthrobacter oxidans (eksempel 2), figur 2 viser den elektroforetiske adskillelse af råekstrakten og de isolerede og poolede proteinfraktioner efter de enkelte oprensningstrin på en SDS-polyacrylamidgel, hvorved der som markør for molekylvægten løber standardproteiner (S) med A: Råekstrakt fra centrifugeringssupemantanten fra ultralydcelleoplukningen af Arthro-30 bacter oxidans

I DK 175794 B1 I

I 6 I

B: Poolet proteinfraktion efter gradienteluering på en DEAE-Sephacel-søjle I

C: Ammoniumsulfat-fældning af fraktionen fra B I

5 D: Proteinfraktion efter gelfiltrering af ammoniumsulfatfældningen og efterfølgende I

H separation på en Sephacryl S-300 søjle I

E: Proteinfraktion efter separation af den poolede fraktion fra D ved hjælp af FPLC I

(anionbytter-chromatografi) I

i I

F: Proteinfraktion efter separation af den poolede fraktion E på en Superose 6-søjle I

I (eksempel 2), I

I figur 3 viser et diagram, hvorpå carbamat-hydrolasens pH-optimum (pH 6,8) kan ses.

15 pH-optimummet kan fastlægges, idet man bestemmer enzymaktiviteten i % mod I

pH-værdien (eksempel 2), I

I figur 4 viser restriktionskortet for plasmidet pHP52 fra Arthrobacter oxidans (stamme I

I P52), I

I 20 I

figur 5 viser et kloningsskema for carbamat-hydrolasegenet. For oversigtens skyld er I

I det med oligonukleotider hybridiserede genområde indbefattet de 5'- og 3'-flankerende I

regioner vist i forstørrelse nedenfor det ringformede plasmidkort. De rekombinante I

I kloner pp52Pst og pp52Pst inv. repræsenteres lineært. Transkriptionsretningen hos lac I

I 25 Z'-genet er antydet ved hjælp af en pil (-*>), H

I figur 6 viser restriktionskortet for det klonede 3,3 kb Pstl-restriktionsfragment, hvorfra I

carbamathydrolase-genets nøjagtige beliggenhed fremgår (start: GTG = startkodon, H

I stop: TGA = stopkodon). De sekvenserede områder er markeret ved hjælp af pile ne- H

I 30 denfor restriktionskortet. Ud fra pilenes længde kan længden for de enkelte sekvense- H

DK 175794 B1 7 rede områder aflæses. Restriktionsfragmenteme, som indeholder homologiområdeme til de i eksempel 4 beskrevne oligonukleotider, er fremhævet på kortet (-H§-) .

I DK 175794 B1 I

Is I

Ml3 klonerne kan beskrives som følger: I

Klon Indbygget fragment Ml 3 vektor I

Η A Ndel/SacI (pUC191^-500 mp 18 I

5 I

Η B Ndel/SacI 1269 bp mp 18 I

H C Pvul/PstI 700 bp mp 19 I

0 Pvul/Pvul 564 bp mp 18 I

I I

E BamHI/BamHI (pUC 19) mp 16

ns 1060 bp I

F BamHI/BamHI 956 bp mp 18 I

6 Pvul/Pvul 564 bp mp 16 I

I 15 I

H PvuII/SacI 476 bp mp 1B I

I I Clal/BamHI 561 bp mp 18 I

K Clal/BamHI 397 bp mp 16 I

1 20 I

I L PvuII/SacI 476 bp mp 19 I

I M KpnI/Hindll 445 bp mp 19 I

I N BamHI/BamHI 958 bp mp 18 - I

I I

I 0 BamHI/BamHI 1100 bp .mp 18 H

I P Kpnl/HindiI 445 bp mp 16 I

I figur 7 viser nuldeotidsekvensen for carbamat-hydrolase-genet indbefattet 5’- og I

30 3'-flankeringsområdeme. I

DK 175794 B1 9 Særligt markeret er 1. GTG-startkondonet 5 2. Det ribosomale bindingssted (Shine-/Dalgamo Box; S/D) 3. Homologiområdeme til de i eksempel 4 beskrevne oligonukleotider (Oligo I &

Il/oligo IH).

10 Den kodende nukleotidsekvens oversattes formelt i en aminosyresekvens. Læserammen bestemmes entydigt ved hjælp af de på proteinniveau fastlagte aminosyrepartialsekven-

Iser.

Eksempel 1

Isolation af mikroorganismer, som besidder den evne, at de kan inaktivere herbicidet phenmedipham.

Til identifikation af mikroorganismer, som besidder den evne, at de kan inaktivere her-20 biddet phenmedipham ved metabolisering, gennemføres en screening af mikroorganismer. Som kilde for mikroorganismerne anvendes jordprøver fra forskellige lokaliteter (forsøgsmarker, som flere gange er blevet behandlet med phenmedipham) og også rensningsslam. Som udvælgelseskriterier for identifikationen af mikroorganismer, som kan gennemføre en carbamatfraspaltning, fremdrages følgende egenskaber: a) Vækst i næringsmedium med phenmedipham som eneste carbon- henholdsvis nitrogen-kilde b) Nedbrydning af phenmedipham til i vand letopløselige forbindelser efter den følgende reaktion:

I DK 175794 B1 I

I 10 . I

I S „„/“O

_/ΜΗ\ / ^z0" ! \ /

/ \ ~ / \ — I

5 \_^ -’ V_^ -ΤΙ,!«. I

HM-C00CH3 hn-cooch3 · I

Phenmedipham Hethyl-3-hydroxy- I

phenyl-carbamat I

10 Ud fra det store antal tilstedeværende mikroorganismer i jordprøverne, hvilke mi- I

kroorganismer er i stand til at spalte phenmedipham, udvælges syv repræsentanter, som I

særligt tydeligt viser en nedbrydning. Disse jordbakterier, som alle er repræsentanter I

fra slægten Arthrobacter og inden for denne slægt tilhører arten oxidans, dyrkes i kul- I

H tursupper, som indeholder et syntetisk medium (M9-medium) omfattende I

I 15 I

I 1,0 g/1 NHiCl I

I : 0,25 g/1 MgS04 x 7H20 I

I 3,0 g/1 KH2P04 I

I 7,0 g/1 Na2HP04 x 2H20 I

I 20 2,0 g/1 glucose I

I : og 0,5 g/lNaCl. I

M9-mediet indeholder endvidere 1 mg/1 thiamin (vitamin Bl) samt sporelementer, som I

I tilsættes i form af en stamopløsning (1 ml/1 M9-medium). Denne sporele- I

I 25 ment-stamopløsning indeholder I

I 0,5 g/1 borsyre I

I 0,04 g/1 CuS04x5H20 I

I 0,2 g/1 FeClj x 6H20 : I

I 30 0,4 g/1 MnS04 x 7H20 I

I 0,4 g/lZnCl2 I

DK 175794 B1 11 0,2 g/1 (NH4)6Mo7024 x 4H20.

For rystekulturer i det flydende medium suppleres det syntetiske medium med 0,1% casaminosyrer (Difco®).

5 i

Jordbakterieme inkuberes under god ventilering i dette M9-medium ved 28°C til af- ! slutningen på den logaritmiske vækstfase. Til en enzymoprensning podes i alt 10 liter medium med en stationær forkultur 1:100.

10 Ved hjælp af HPLC-analyse af kultursuppeme kunne det vises, at i kulturerne af Arth-robacter oxidans fuldbyrdes den ønskede spaltning af phenmedipham til de herbicidt inaktive produkter.

I Eksempel 2

Isolation og oprensning af carbamat-hydrolase ud fra Arthrobacter oxidans.

Isolationen og den efterfølgende oprensning af carbamathydrolase indtil elektroforetisk homogenitet gennemføres over en 6-trins oprensningsfremgangsmåde. Fra 6 liter af en 20 slutlogaritmisk kultur af Arthrobacter oxidans (pHP52) (DSM nr. 4044) kan 0,5-1 mg carbamat-hydrolase isoleres reproducerbart. Til isolationen af carbamat-hydrolasen høstes cellerne ved hjælp af centrifugering (7000 x g) og gensuspenderes i ca. 40 ml oplukningspuffer (10 mM natriumphosphat pH 6,8/1 mM DTT). Cellesuspensionen oplukkes ved hjælp af ultralyd og homogeniseres samtidigt. Det således udvundne homo-25 genat centrifugeres derefter i 45 min. ved 40000 x g og en temperatur på 4°C. Bundfaldet kastes bort, og supematanten overføres til en DEAE Sephacel-søjle, som er ækvi-libreret med 100 mM tris-HCl pH 7,2/100 mM NaCl/1 mM DTT (søjlediameter 2,6 mm, gellagets højde 20,5 cm, søjlevolumen ca. 100 ml).

30 Før overførslen fortyndes celleekstrakten i forholdet ca. 1:10 med startpuffer [100 mM tris/100 mM NaCl/1 mM DTT]. Søjlen vaskes derefter med startpuffer for at fjerne ik-

DK 175794 B1 I

I i

ke-bindende materiale. Carbamat-hydrolasen elueres derpå med en lineær gradient 100 I

mM NaCl -* 500 mM NaCl (5 x søjlevolumen). De enzymatisk aktive fraktioner poo- I

les (forenes), og der tilsættes fast ammoniumsulfat [(NH4)2 S04] til en slutkoncentrati- I

on på 33% af den mættede opløsning. Det derved fremkomne proteinbundfald sedi- I

5 menteres ved hjælp af centrifugering (20000 x g/30 min.) og bortkastes. Til supematan- I

ten sættes (NH4)2S04 [fast] til en slutkoncentration på 60% af den mættede opløsning, I

og der omrøres ca. 12 timer ved 0°C. De udfældede proteiner samles ved hjælp af een- I

trifugering (20000 x g/30 min). Bundfaldet opløses i ca. 1 ml startpuffer, der tilsættes I

10 vægt/volumen% saccharose, og den resulterende blanding overføres til en Sephacryl I

10 S-300 søjle. Gelfiltreringen gennemføres med en væskehastighed på 2,5 cm/time (elue- I

ringspuffer -*· startpuffer). Søjlen har følgende mål: diameter = 2,6 cm, h = 95 cm, vo- I

I lumen = 475 ml. De enzymatisk aktive fraktioner oparbejdes derefter videre ved hjælp I

I af en FPLC-søjle (mono Q HR 5/5; anionbytter). (Gradienteluering: 100 mM NaCl -* I

300 mM NaCl; væskehastighed: 0,5 ml/mm; påføringsvolumen: 2 ml). De ikke-bin- I

15 dende proteiner fjernes ved isokratisk eluering med 19 ml startpuffer. (Gradientelu- I

I ering: 100 mM NaCl -» 300 mM NaCl i løbet af 20 ml i 100 mM tris/HCl pH 7,2/1 I

I mMDTT). I

De enzymatisk mest aktive fraktioner koncentreres efter elektroforetisk analyse af ren- I

I 20 heden (SDS-polyacrylamid-gelelektroforese efter Låmmli) ved hjælp af ultrafiltrering H

I (Amicon®, Centriklon 10 koncentrator) og overføres på en FPLC-gelfiltreringssøjle I

I (Superose 6, HR 10/30, Pharmacia). (Væskehastighed: 0,2 ml/min; påføringsvolumen: I

I 100 μΐ; løbemiddel: 100 mM tris/HCl pH 7,2/10 mM NaCl). Den aktive proteinfrakti- I

I on, som fremkommer ved dette trin, er elektroforetisk ensartet.

I 25 I

I Det isolerede enzym er aktivt i pufrede opløsninger (herunder sædvanlige puffere inden H

I for biokemien, såsom phosphatpuffer, trispuffer etc.; pH 6,8). Cofaktorer eller metalio- H

I ner er ikke nødvendige til reaktionen, der foreligger heller ikke en følsomhed over for H

SH-reagenser. H

I 30 I

I Enzymets pH-optimum ligger ved en pH-værdi på 6,8. H

DK 175794 B1 13 Såvel under denaturerende/dissocierende betingelser (SDS-gelelektroforese) som under naturligt forekommende betingelser (gelfiltrering) ligger carbamathydrolasens molekylvægt i området fra 50-60 kd, fortrinsvis 53-57 kd. Deraf kan det sluttes, at det ved 5 carbamat-hydralasen drejer sig om et monomert protein. Carbamat-hydrolasens isoe-lektriske punkt ligger ved pi = 6,2.

Eksempel 3 10 Fremgangsmåde til påvisning af carbamat-hydrolase.

Til hurtig og pålidelig påvisning af enzymaktiviteten under oprensningen af protein-! råekstrakten udvikles en in vitro-enzymtest. Testen er baseret på den egenskab hos en zymet, at det kan omdanne i vand tungtopløseligt phenmedipham til opløselige hydro-15 lyseprodukter. Dertil suspenderes fast phenmedipham i vand og mikroniseres ved hjælp af ultralyd. Denne mikrosuspension hældes derpå ved 50°C under omrøring i en agaro-seopløsning og fyldes i petriskåle før stivning. Der dannes en uklar gelmatriks. Enzymopløsningen anbringes derefter i stansehulrum, der var blevet indført i den faste ma-triks. Efter inkubering af testplademe i 2-4 timer ved 30°C viser enzymaktiviteten sig 20 ved forekomsten af klare zoner i den på grund af phenmedipham mælkeagtige, uklare matriks.

Eksempel 4 25 Identifikation af aminosyresekvensen hos to BrCN-spaltningspeptider og syntese af oligonukleotider til specifik påvisning af carbamat-hydrolase-genet ved hybridisering.

Ud fra den oprensede carbamat-hydrolase isoleres efter BrCN-spaltning to peptider, hvis sekvens delvis kan fastlægges ved hjælp af Edman-nedbrydning.

30 i

BrCN peptid I: j

I DK 175794 B1 I

I 14 I

H2N - Ser - Asp - Glu - Phe - Ala - Asn - Leu - Asp - I

- Arg - Trp - Thr - Gly - Lys - Pro - Phe - Val - Asp (Val) - I

I - Gly (His) - Leu - Asp - Glu - Val - Ala - Val - COOH I

I 5 I

I BtCN peptid Π: I

N^H - Glu - His - Thr - Lys - Phe(Val) - Asn(Gly) - Glu - ArgfCys) -

H - Pro - Leu - Ala - Phe - Tyr - Pro -Val - Phe - Asn - Glu - COOH I

I .10 I

I henhold til disse peptiders sekvensinformation syntetiseres oligonukleotider, der an- I

vendes som hybridiseringssonder til påvisningen af carbamat-hydrolase-genet: I

Oligonukleotid 1(17 mer, "blandet prøve") I

15 indeholder som enkeltstrenget DNA-fragment sekvensinformationen fra BrCN-peptid I

I I-aminosyrer position 10-15 (komplementærstreng). I

I U I C I A I A I I

I 20 5’ ' TTT| GCC ( GGT I CCA-3' I

I lc I I C I C I I

I IT I I T I T i

I Phe I Pro I Lys I Gly I Thr I Trp I

1 25 I

I . Oligonukleotid II (42 mer) I

I indeholder som enkeltstrenget DNA-fragment sekvensinformationen fra BrCN-peptid I

I I-aminosyrer pos. 8-21 (komplementær- streng). Kodonudvæl gelsen sker under anta- I

I gelse af en guanin I

I 30 (G)- og cytosin(C)-rig DNA-sekvens (der bliver taget hensyn til den tredje position af I

I triplettens guanin(G)- og cytosin I

DK 175794 B1 15 (C)-nukleotider før adenin(A)- og thyrnin(T)-nukleotider).

5'- CTG I GTC 1 CAG [ GCC | GTC | CAC | GAA | 5 Gin I Asp I Leu | Gly | Asp | Val | Phe | CGG I CTT I GCC I GGT | CCA j GCG j

Pro j Lys 1 Gly I Thr ( Trp | Arg | GTC |-3'

^ Asp I

Oligonukleotid ΙΠ indeholder som enkeltstrenget DNA-fragment sekvensinformation fra BrCN-peptid Π 15 (komplementærstreng) 5' - TTC I GTT I GAA | GAC j CGG | GTA | GAA j CGC |

Glu j Asn J Phe | Val j Pro ( Tyr | Phe j Ala | 20 Under anvendelse af disse oligonukleotider er det muligt ved hjælp af hybridisering af lokalisere herbicidase-genet inden for plasmidet pHP52. Dertil spaltes plasmid-DNA'et med restriktionsendonukleaser, og de derved fremkomne fragmenter oplukkes ved hjælp af agarosegelelektroforese og overføres derefter efter metoden af E.M. Southern (J.Mol-Biol. 98, 503-517 (1975)) i enkeltstrenget form til membranfilter (Gene Screen 25 Plus® Hybridisierungsmembranen, Du Pont de Nemours/ NEN-Research Products).

Oligonukleotideme endemarkeres under anvendelse af T4-poly- nukleotidkinase (Boehringer Mannheim) og [>32P]-adenosin-5'-triphosphat (>5000 Ci/mmol, Du Pont de Nemours/NEN-Research-Products) (R.B. Wallace og C.G. Miyada, Methods in Enzy-30 mology, 152, 432-442(1987)) og anvendes uden yderligere oprensning til hybridiserin-gen.

I ' DK 175794 B1 I

I 16 I

Hybridiseringen gennemføres under anvendelse af standardfremgangsmåde (P.J. Ma- I

I son & J.G. Williams in "Nucleic acid hybridisation" S. 113-160 (1985) B.D. Hames & I

S.J. Higgins Hrsg. IRL Press Oxford, Washington D.C.)- Under følgende betingelser I

5 opnås en specifik hybridisering: 6 x SSC: 10 x Denhardt; 0,5 (vægt/volumen%) SDS I

og 100 pg/ml t-RNA (Båckerhefe, Boehringer Mannheim) samt 10 ng/ml markeret oli- I

H gonukleotid Ι/ΙΙ/ΠΙ ved 41°C (>6 timer). Påvisningen af hybriderne sker ved hjælp af

I autoradiografi (T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. Sambrook, "Molecular cloning", Cold I

I Spring Harbor Laboratory (1982)). I

I 10 I

I Eksempel 5 I

I ' Isolation og karakterisering af plasmidet pHP52 fra Arthrobacter oxidans P52. I

15 Til isolation af plasmidet pH52 fra Arthrobacter anvendes den alkaliske ekstrak- I

I tionsmetode efter Bimboim og Doly (H.C. Bimboim & J. Doly (1979) Nucl. Acid. I

I Res., 7, 1513-1523) med en modifikation af Brandsch og Decker (R. Brandsch & K. I

I Decker (1984) Arch. Microbiol. 138, 15-17). Til en præparation dyrkes bakterierne i 6 I

liter LB-medium bestående af H

I 20 I

I Bacto-Trypton (Difco®) 10 g/1 I

I Bacto-Hefe-Extrakt (Difco®) 5 g/1 I

I NaCl 10 g/1 I

25 indtil en celletæthed på OD550 = 1,4 og høstes derefter ved centrifugering. H

I Cellerne gensuspenderes derpå i i alt 210 ml opløsning I (50 mM glucose; 10 mM ED- I

I TA; 25 mM tris/HCl pH 8,0; 1 mg/ml lysozym) og inkuberes en time ved stuetempera- H

I tur. Lysen sker ved tilsætning af 360 ml opløsning II (0,2 M NaOH; 1% SDS). Efter I

I 30 forsigtig, grundig blanding og efterfølgende inkubation i 5 min. ved stuetemperatur og H

I efterfølgende afkøling på is i 5 min. neutraliseres blandingen ved tilsætning af 180 ml H

DK 175794 B1 17 opløsning ΠΙ (2M tris/HCl pH 7,0/0,5 M KC1). Efter en times inkubation på is i]emes det uopløselige praecipitat ved hjælp af centrifugering. Plasmid-DNA’et fældes ved tilsætning af 0,6 volumen% isopropanol til den klare supernatant og pelleteres ved centri-I fugering (15000 x g/30 min) efter inkubation i 15 min. ved stuetemperatur. Det 5 plasmidholdige bundfald tørres i vakuum Og opløses derefter i 24 ml 10 x TE puffer (100 mM tris/HCl pH 8,0; 10 mM EDTA). Denne plasmidholdige opløsning oprenses derefter ved hjælp af isopyknisk cæsiumchloridtæthedsgradientcentrifugering i nærværelse af ethidiumbromid (T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. Sambrook i "Molecular Cloning" (1982), Cold Spring Harbor, N.Y.).

10

Det oprensede plasmid-DNA analyseres derefter med restriktionsendonukleaser ved enkeltspaltninger og gentagne spaltninger samt efterfølgende gelelektroforetisk separation af restriktionsffagmenteme i 0,8 vægt/volumen% agarose-geler. Til bestemmelse af fragmenternes størrelser anvendes det med nukleaseme Hind III samt Hind III/Eco 15 RI behandlede DNA fra bakteriophagen λ som standard.

Ved hjælp af disse informationer konstrueres et ringformigt restriktionskort for plasmi-det pHP52 (se fig. 4). Plasmidets størrelse fastlægges som summen af re-striktionsfragmentlængdeme til 41 kb.

20

Alle de opførte fremgangsmåder i dette eksempel gennemfares efter standardmetoder (sml. T. Maniatis, E.F. Fritsch & J. Sambrook i "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)).

25

Eksempel 6

Identifikation af den kodende region i carbamat-hydrolasegenet ved hjælp af oligo-nukleotid-hybridisering. -30 i

I DK 175794 B1 I

I 18 I

Ved hybridisering af de gelelektroforetisk adskilte og til membranfilter overførte re- I

striktionsfragmenter af plasmidet pHP52 med de i eksempel 4 beskrevne 32P-markerede I

oligonukleotider kan den kodende regions beliggenhed i carbamat-hydrolase-genet en- I

tydigt fastlægges på restriktionskortet for plasmidet pHP52. På figur 5 er det hybridise- I

5 rende område vist i forstørrelse. Alle tre oligonukleotideT hybridiserer med den centrale I

del af et Pstl-restriktionsfragment med en størrelse på 3,3 kb. På figur 6 er vist et detal- I

jeret restriktionskort for fragmentet, hvoraf fremgår de nøjagtige positioner for de hy-

I bridiserende områder inden for fragmentet. I

I 10 Eksempel 7 I

I Kloning af carbamat-hydrolase-genet i E. coli og påvisning af gen-ekspression under I

I lac-promotorkontrol. I

15 Til kloningen af carbamat-hydrolase-genet i E. coli anvendes vektoren pUC 19 (C. Ya- I

I nish-Perron, J. Vieira & J. Messing (1985) Gene 33, 103ff). pUC 19 DNA'et linearise- I

res ved hjælp af spaltning med restriktionsnukleasen PstI og behandles med alkalisk

phosphatase. DNA'et fra det 3,3 kb lange Pstl-restriktionsfragment fra plasmidet H

I pHP52 isoleres efter spaltning af vildtype plasmid-DNA'et med PstI ved præparativ H

I 20 agarosegelelektroforese. Den lineariserede og dephosphorylerede vektor DNA og det H

I 3,3 kb lange PstI-fragment ligeres derefter med T4 DNA-ligase. E. coli DH5 transfor- I

I meres med ligationsblandingen. Derved opnås to typer af kloner, som indeholder ff ag- I

I mentet i forskellig orientering til transskriptionsretningen for lac Z'-genet fra vektoren H

I pUC 19. Det er klonerne pp52 Pst og pp52 Pst inv. Re strikti on skort ene for begge klo- I

I 25 ner er vist på figur 5. Klonen af typen E. coli pp52 Pst udtrykker efter tilsætning af in- I

duktoren isopropyl-jS-D-thiogalaktosid til kulturmediet carbamat-hydrolase. Uden in- ; I

I duktor-tilsætning (reprimeret tilstand hos lac-promotoren) til logaritmiske kulturer af I

I klonen pp52 Pst samt ved reprimerede og inducerede logaritmiske kulturer af klonen H

I pp52 Pst inv kan der i enzymekstrakter ved den i eksempel 3 beskrevne påvisnings- H

30 fremgangsmåde ingen enzymaktivitet påvises. H

DK 175794 B1 i 19 }

Dette betyder, at carbamat-hydrolase-genet i kloner af typen pp52 Pst ligger i den samme transskriptionsretning (5'-3'- orientering) som lac Z' -genet i vektoren. Arthro-bacterpromotoren kan åbenbart ikke (eller kun utilstrækkeligt) genkendes i E. coli.

i* 5 Eksempel 8

Nukleotidsekvens for carbamat-hydrolase-genet fra Arthrobacter oxidans (stamme P52) og deraf afledt proteinsekvens for enzymet.

10 Nukleotidsekvensen for carbamat-hydrolase-genet fastlægges efter metoden af Sanger (F. Sanger, S. Nicklen & A. Coulson (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5468).

Ud fra DNA'et for klonen E. coli pp52 Pst konstrueres hertil 15 subkloner i de enkelt-15 strengede DNA-bakteriophager Ml 3 mp!8 og Ml3 mp!9 (J. Messing (1983) Methods in Enzymol. 101, 20-78). Efter transfektion i E. coli DH5F fastlægges sekvensen for de . enkeltstrengede rekombinante desoxyribonukleinsyrer.

På figur 6 er vist sekvensstrategien for carbamat-hydrolasegenet. I alt fastlægges sekvensen på 1864 basepar (streng og modstreng se figur 6).

i 20 På figur 7 er vist den fastlagte nukleotidsekvens med den deraf afledte proteinsekvens for carbamat-hydrolasen. Læserammen definerer entydigt to BrCNspaltningspeptider ved hjælp af de i eksempel 4 beskrevne aminosyredelsekvenser. Læserammen slutter med et TGA-stopkodon (nukleotid-positioner 1789-1791 på fig. 7). Som translations-25 startkodon kommer et GTG (nukleotidposition 340-342) på tale. Dette giver en længste åben læseramme på 1479 bp (= 493 aminosyrer). Ingen åbne læserammer, som begynder med det sædvanlige ATG startkodon, giver nogen proteiner med passende størrelse (sammenlign molekylvægtbestemmelsen for proteinet).

I DK 175794 B1 I

I 20 I

Fastlæggelsen af translationsstarten for GTG (position 340-342) understøttes endvide- I

re af eksistensen af en tydelig homologiregion til konsensus-sekvensen for ribosomale I

E. coli-bindingssteder i afstande på 7 bp opstrøms for det formodede GTG-startkodon. I

5 Alle kloningstrin gennemføres efter standardfremgangsmåde (sml. T. Maniatis, E.F. I

I Fritsch & J. Sambrook (1982) i "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor, N.Y.)· Se- - I

kvensreaktionen gennemføres under anvendelse af "Sequenase® DNA-sequencing I

Kits" (United States Biochemical Corporation) efter fremstillerens anvisning. Separati- I

onen af de markerede reaktionsprodukter udføres i 6 vægt/volumen% polyacryla- I

I 10 mid/urinstof-geler (A.M. Maxam & W. Gilbert (1980) Methods Enzymol. 65, I

I 497-559). I

Claims (14)

1. 2. BrCN-spaltningspeptid, af en carbamat-hydrolase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de udviser aminosyresekvenseme: peptid I: H2N - Ser - Asp - Glu - Phe - Ala - Asn -Leu - Asp -
2. 20. Arg - Trp - Thr - Gly - Lys - Pro - Phe - Val - Asp (Val) - - Gly (His) - Leu - Asp - Glu - Val - Ala - Val - COOH peptid II: V - Glu - His - Thr - Lys - Phe(Val) - Asn(Gly) - Glu - Arg(Cys) -
3. 25. Pro Leu - Ala - · Tyr - Pro -V.l - Phe - Asn - Glu - COOH
4. 3. Anvendelse af peptiderne I og Π ifølge krav 2 til fremstillingen af syntetiske oligo-nukleotider med sekvenseme:01igonukleotid I (komplementærstreng): DK 175794 B1 I I 22 I a c a a
5. 51. AA GGG TTT 6CC GGT CCA-3' C C C I I I phe Pro Lys Gly Ihr irp I 5 I I Oligonukleotid Π (komplementærstreng): I I 10 5'- CTG GTC CAG GCC GTC I CAC GAA I Gin Asp Leu Gly Asp j Val Phe I I CGG CTT GCC GGT CCA GCG I I Pro Lys Gly Thr Trp Arg I I GTC - 3 I I Asp I I I I Oligonukleotid ΙΠ (komplementærstreng): I 20 I 5' - TTC GTT GAA GAC I CGG i GTA I GAA CGC I Glu Asn j Phe Val j Pro | Tyr j Phe Ala I
6. 4. Anvendelse af syntetiske oligonukleotider ifølge krav 3 til isolation af carba- I I mat-hydrolase-genet. I 25 I
7. 5. Artbrobacter oxidans p52 (pHP52) (DSM 4044) indeholdende det 41 kb lange I I plasmid pHP52 med det 3,3 kb lange Pst-restriktionsfragment, hvorpå carbamat-hy- I drolase-genet, som har sekvensen ifølge figur 7, er lokaliseret, som tilvejebringer en I I carbamat-hydrolase, der kan isoleres og oprenses ved fremgangsmåden ifølge krav 1. I I 30 I DK 175794 B1 23 >
8. 6. Arthrobacter oxidans ifølge krav 5, kendetegnet ved, at carbamat-hydrolase-genet består af en læseramme med en nukleotidsekvens på 1479 basepar.
9. 7. Arthrobacter oxidans P 16/4/B (DSM4038). 5
10. 8. Arthrobacter oxidans P 67 (DSM4039).
11. 9. Arthrobacter oxidans P 75 (DSM 4040).
12. 10. Arthrobacter oxidans P 11/1/-b (DSM 4041).
13. 11. Arthrobacter oxidans P 15/4/A (DSM 4045).
14. 12. Arthrobacter oxidans P 21/2 (DSM 4046). 15 1