DK175195B1 - Hirudinekspression - Google Patents

Description

DK 175195 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår forbedringer af den i FR 85 06672 beskrevne opfindelse. Den angår vektorer til ekspression af et protein med blodigle-(H. medicinalis)-hirudins aktivitet.

I FR 85 06672 beskrives en fremgangsmåde, der gør det muligt at få 5 gærstammer såsom S. cerevisiae til at producere hirudin, som udskilles i dyrkningsmediet i aktiv form.

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte vektorer, som sikrer produktionen af hirudin, især HV1, under bedre betingelser.

Den foreliggende opfindelse angår især funktionelle DNA-blokke, der 10 tillader fremstilling af hirudin ud fra gær, hvilke blokke er ejendommelige ved, at de i det mindste omfatter sekvensen ‘ str * Lex ' scl * H-gen, hvor H-gen er det gen, der koder for hirudin eller en variant deraf; 15 H-genet er ifølge den foreliggende opfindelse fortrinsvis det gen, der koder for HV1 eller HV2; H-genet kan eventuelt følges af en gærterminatorsekvens, fx fra PGK-genet;

Str er en DNA-sekvens, der omfatter de signaler, som sørger for transkription af H-genet véd hjælp af gær; 20 - Lex er en ledersekvens, der er nødvendig for at opnå udskillelse af genproduktet; og

Sci er en DNA-sekvens, som koder for spaltningsstedet for proteinasen yscF, hvilket spaltningssted er unikt og befinder sig i hirudinprecursoren umiddelbart opstrøms for H-genet; desuden kan 25 elementet $ci - H-gen være gentaget flere gange.

Denne type ekspressionsblok gør det muligt at opnå et unikt, modent og korrekt protein.

Med den i FR 85 06672 beskrevne konstruktion producerer S. cerevisiae faktisk hirudin i form af en precursor, der har to spaltningssteder 30 for proteinasen yscF, som er et genprodukt af KEX2 (1). Endo-pep- tidase-aktiviteten af yscF er nødvendig for modningen af denne hiru- —-------

I DK 175195 B1 I

i 2 I

I dinprecursor. Imidlertid muliggør kun spaltningsbegivenhederne i det I

I andet sted, som er fjernest fra precursorens NH2-ende, frigivelse af H

I aktivt hirudin; når spaltningen finder sted i det første sted og ikke H

I i det andet, er det derimod en længere form, som udskilles, og som H

I 5 adskiller sig fra hirudin ved en forlængelse af aminosyreresterne I

I ved NH2-enden. Denne uønskede sidstnævnte form kan kontaminere moden · I

I og korrekt hirudin i løbet af de forskellige oprensningstrin og såle- I

I des vanskeliggøre oprensningsprocessen og medføre et forringet ud- I

I bytte ved fremstillingen af ren hirudin. I

10 Ifølge den foreliggende opfindelse lades gær syntetisere en hirudin- I

I precursor, som kun har ét enkelt spaltningssted for yscF, således at I

I dens modning til hirudin kun fører til udskillelse af den ønskede I

form.

Blandt Lex-sekvenserne kan der især nævnes den såkaldte "præ-pro"- I

15 sekvens, som muliggør udskillelse af α-kønspheromonet fra gær. I

I Som et eksempel på sekretionssystemet har man valgt systemet fra o- I

I pheromonet, dvs. at i ovenstående sekvens stammer Lex-sekvensen fra I

I genet for α-kønspheromonet fra gær, men andre systemer kan også an- I

I vendes (fx Killer-proteinsystemet) (4). I

20 Det er vigtigt, at værtsgærstammerne for de plasmider, som bærer de I

I funktionelle blokke ifølge opfindelsen, fortrinsvis kan være af en I

I hvilken som helst kønstype og desuden kan dyrkes i fravær af selek- I

I tionstryk. I

Under disse betingelser kan de transformerede gærstammer anvendes i I

I 25 industrien på- en særlig hensigtsmæssig måde. I

Til dette formål angår den foreliggende opfindelse DNA-ekspressions- I

blokke som beskrevet ovenfor, men i hvilke Scr-sekvensen omfatter en I

I anden gærgenpromotor end MFal-genpromotoren, og det kan fx dreje sig I

I om PGK-gærgenpromotoren. I

30 I de konstruktioner, der er beskrevet i FR 85 06672, transkriberes I

genet for hirudinprecursoren nemlig ud fra MFal-genpromotoren. Denne I

3 DK 175195 B1 promotor virker kraftigst i stammer med Mata-kønstype. Valget af vært indskrænker sig således til denne type s tamme, hvilket udelukker stammer af Mata-kønstypen samt diploide eller polyploide stammer uden kønstype. Specielt udelukker dette de gærstammer, der anvendes i 5 industrien, og som oftest falder ind under sidstnævnte kategori. Ved at ændre promotor kan der opnås ekspression af hirudin uafhængigt af værtsstammens kønskarakteristika.

Disse DNA-blokke bæres almindeligvis af plasmider, som desuden bærer et replikationsinitieringssted i gær, fx replikationsinitierings-10 stedet fra plasmidet 2μ.

For at lette konstruktionen af vektorerne kan disse plasmider være "coli-gær-shuttleplasmider" og omfatte elementer, der sørger for deres replikation i E, coli. fx et replikationsinitieringssted såsom det fra pBR322 og en selektionsmarkør såsom amp^. Disse plasmider 15 omfatter ligeledes en selektionsmarkør for gær, fx et gen, som koder for resistens over for visse toxiske kemiske forbindelser, eller et gen, der gør det muligt at komplementere en auxotrofi; der anvendes især URA3-genet.

I W0 86/01224 er det påvist, at indførelse af visse mutationer, der 20 meddeler resistens over for 5-FU, i en ura3-stamme, som er transformeret til ura+ ved hjælp af et plasmid, muliggjorde et større valg af medier til dyrkning af disse transformerede stammer; der kan især anvendes komplekse industrielle medier.

Den foreliggende opfindelse angår mere specielt syntese og sekretion 25 af HV1-varianten.

HVl-genet er allerede blevet syntetiseret kemisk ved hjælp af ekspression deraf i E. coli (FR 84 13250).

Størstedelen af de syntetiske oligonukleotider, der anvendes ifølge FR 84 13250, er bevaret til konstruktionen af den sekvens, som koder 30 for HVl-precursoren, med undtagelse af de oligonukleotider, der muliggør de forskellige forbindelser med de sekvenser, som skal fusioneres opstrøms og nedstrøms for sekvensen.

I DK 175195 B1 I

I I

I Opnåelse af udskilt hirudin kræver tilstedeværelse af en precursor, H

I der indeholder de informationer, som er nødvendige for sekretionen og H

I den korrekte modning af dette polypeptid ad den normale metaboliske I

I vej for gær. I FR 85 06672 er det påvist, at den NH2-terminale se- I

I 5 kvens fra precursoren for a-faktoren kan anvendes til sekretion af * H

I hirudinvarianten HV2. Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af H

I dette system til sekretion af HVl-varianten. I

I Opfindelsen angår især en funktionel DNA-blok, der muliggør fremstil- I

I ling af hirudin ud fra gær, hvilken DNA-blok er ejendommelig ved, at H

I 10 den i det mindste omfatter I

I HV1-genet; I

I - en DNA-sekvens (Str), der omfatter de signaler, soro sørger for I

I transkription af HVl-genet ved hjælp af gær. I

I Denne funktionelle blok, der er integreret i et plasmid eller i chro- I

I 15 mosomerne på en gær, fortrinsvis af slægten Saccharomvces. kan efter

I transformation af gæren muliggøre ekspression af hirudin, enten i I

I aktiv form eller i form af en inaktiv precursor, der ved aktivering I

kan regenerere hirudin. I

I Disse funktionelle blokke har fortrinsvis følgende struktur:. I

I 20 - str * Lex * scl ' H'gen. I

I hvor I

I - H-gen er det gen, der koder for HV1; H-genet kan eventuelt føl- I

I ges af en gærterminatorsekvens, fx fra PGK-genet; I

I · Str er en DNA-sekvens, der omfatter de signaler, som sørger for I

25 transkription af H-genet ved hjælp af gær; I

I - Lex er en ledersekvens, der er nødvendig for at opnå udskillelse I

I af genproduktet; og I

I - Sci er en DNA-sekvens, som koder for et spaltningssted, og som I

I eventuelt ved 3'-enden før H-genet omfatter en ATG-kodon eller I

I 30 to kodoner, som koder for Lys-Arg, eller fem kodoner, som koder I

I for Ser-Leu-Asp-Lys-Arg; I

5 DK 175195 B1 desuden kan elementet Sci - H-gen være gentaget flere gange.

Blandt Lex-sekvenserne kan nævnes den fra α-kønspheromonet fra gær, og med hensyn til Str kan nævnes MFol-genpromotoren og også PGK-gen-promotoren, men andre sekvenser kan benyttes, og især er der som 5 eksempel på et sekretionssystern valgt det fra a-pheromonet, dvs. at Lex-sekvensen i ovenstående sekvens stammer fra genet for a-kønsphe-romonet fra gær, men andre systemer kan anvendes (fx KiIler-proteinsy s ternet) (4) .

Til styring af ekspressionen og sekretionen af hirudin i dyrkningsme-10 diet indsættes det tilsvarende gen i en gærvektor eller et plasmid, som omfatter den ovenfor beskrevne funktionelle blok og i det mindste ét replikationsinitieringssted i gær. Plasmidet omfatter fortrinsvis følgende elementer: replikationsinitieringsstedet fra gærplasmidet 2μ; 15 - ura3-genet; et replikationsinitieringssted i E. coli og en markør for resistens over for et antibiotikum; 5'-regionen fra MFol-genet, som omfatter transkriptionspromoto-ren, "leder"-sekvensen og præ-pro-sekvensen fra precursoren for 20 a-faktoren, og denne sekvens fusioneres i fase opstrøms for den sekvens, der koder for HVlrhirudin; transkriptionsterminatoren fra PGK-gærgenet, som anbringes ned-strøms for hirudin-genet.

Ekspressionsblokkene ifølge opfindelsen kan almindeligvis indsættes i 25 en gær, især Saccharomvces. enten i et plasmid med autonom replika-tion eller i gærchromosomet.

Når plasmidet er autonomt, omfatter det elementer, der sørger for dets replikation, dvs. et replikationsinitieringssted såsom det fra plasmidet 2μ. Desuden kan plasmidet omfatte selektionselementer såsom 30 URA3- eller LEU2-genet, der sørger for komplementering af gærene ura3* eller leu2*. Disse plasmider kan også omfatte elementer, der sikrer deres replikation i bakterier, når plasmidet skal være et "shuttle"-plasmid, fx et replikationsinitieringssted såsom det fra

I DK 175195 B1 I

i 6 I

I pBR322, et markørgen såsom Ampr og/eller andre elementer, som er I

I kendte for fagfolk. B

I Den foreliggende opfindelse angår også gsr transformeret med en eks- B

I pressionsblok ifølge opfindelsen, enten båret af et plasmid eller fl

I 5 integreret i chromosomerne deraf, især Saccharomvces-stammer og spe- * B

I cielt S. cerevisiae-stammer, især med Mata-kønstype eller diploide B

I eller polyploide stammer uden kønstype, men især ura*-gærstammer, der B

I er transformeret til ura+ ved hjælp af et plasmid ifølge opfindelsen B

I og er blevet resistente over for 5-fluoruracil, idet disse stammer B

I 10 kan dyrkes i industrielle medier. B

I Når promotoren stammer fra genet for α-pheromonet, har gæren for- B

I trinsvis Mato-kønstype. Der anvendes fx en stamme med genotypen ura3* B

I eller leu2* eller en anden, komplementeret af plasmidet for at sikre B

I bevarelse af plasmidet i gær ved et hensigtsmæssigt selektionstryk. B

I 15 Den foreliggende opfindelse angår endelig en fremgangsmåde til frem- B

I stilling af hirudin eller en variant deraf ved fermentering af en B

I transformeret gær som beskrevet ovenfor i et dyrkningsmedium og iso- B

I lering af det fremstillede hirudin i dyrkningsmediet i moden form B

I eller i form af en precursor for hirudin, der kan modnes in vitro B

20 eller in vivo. samt hirudin eller varianter deraf, der er fremstillet B

B ved denne fremgangsmåde. fl I Selv om det er muligt at fremstille hirudin ved fermentering af oven- fl I stående transformerede stammer i et tilpasset dyrkningsmedium ved fl

B akkumulering af hirudin i cellerne, foretrækkes det således alligevel B

25 at lade hirudin blive udskilt i mediet, enten i moden form eller i B

B form af en precursor, som skal forarbejdes in vitro. B

B Denne modning kan ske i flere trin. Først kan det være nødvendigt at B

B spalte visse elementer stammende fra translationen af Lex-sekvensen, B

B idet denne spaltning udføres i den sekvens, der svarer til Sci- Før B

B 30 det modne hirudin kan der være en methioninrest, som spaltes selek- B

B tivt med cyanogenbromid. Denne fremgangsmåde kan anvendes, fordi den B

B sekvens, der koder for hirudin, ikke omfatter methionin. B

7 DK 175195 B1

Det er også muligt ved N-terminalen at tilvejebringe dipeptidet Lys-Arg, som spaltes til COOH af en specifik endopeptidase; da dette enzym er aktivt i sekretionsprocessen, kan det modne protein således fås direkte i mediet. I visse tilfælde kan det dog være nødvendigt at 5 foretage en enzymatisk spaltning efter sekretionen, idet der tilsættes et specifikt enzym.

I visse tilfælde, især efter en behandling med cyanogenbromid, kan det være nødvendigt at renaturere proteinet ved at gendanne disul-fidbroerne. Til dette formål denatureres peptidet, fx med guanidin-10 hydrochlorid, hvorefter det renatureres i nærværelse af reduceret og oxideret glutathion.

Opfindelsen angår endelig hirudin, der er vundet ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen.

Det således vundne hirudin kan anvendes som inhibitor af thrombin, 15 som antikoagulationsmiddel, som laboratorieprodukt til forhindring af koagulation og/eller som diagnostisk middel under anvendelse af det mærkede produkt.

HV1 kan især anvendes i farmaceutiske præparater, alene eller i kombination med andre aktivstoffer, eller til tests eller diagnose in 20 vitro eller in vivo. I sidstnævnte tilfælde kan det være fordelagtigt at mærke molekylet, fx ved· radioaktiv, fluorescerende eller enzymatisk mærkning eller anden mærkning.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler og den led- · sagende tegning, hvor 25 fig. 1 viser konstruktionen og strukturen af M13TG897, fig. 2 viser mutagenese in vitro af fag-DNA fra M13TG897 til M13TG1827: a) oligonukleotidsekvens til mutagenesen, b) delsekvens af DNA fra M13TG897, der hybridiserer til 30 oligonukleotidet, c) muteret sekvens, fig. 3 viser konstruktionen af pTG883, fig. A viser konstruktionen af pTG892,

I DK 175195 B1 I

I I

I fig. 5 viser konstruktionen af M13TG889, I

I fig. 6 viser strukturen af pTG1828 og pTG1833, I

I fig· 7 viser strukturen af precursoren for hirudin svarende til de H

I sekvenser, der bares af forskellige plasmider; forbindelsen H

I S mellem a) spaltningsstedet (lys arg) tættest på precur-

I sorens NH2-terminal og b) den modne sekvens af hirudin HV2 H

I (NH2*Ile-Thr etc.) er vist, I

I fig. 8 viser sekvenserne og stillingen af de oligonukleotider, der I

I anvendes til syntese af den DNA-sekvens, som koder for I

I 10 HV1, og I

I fig. 9 og 10 viser et kort over restriktion og translation af H

I aminosyresekvensen ved syntesen af den DNA-sekvens, som H

I koder for HV1. I

I De plasmider og strategier, der er anvendt og beskrevet i FR 85 I

I 15 06672, er ikke vist i den foreliggende beskrivelse. H

I EKSEMPEL 1 I

I Plasmidet pTG897 bærer information for en hirudinprecursor, der kun I

I indeholder ét spaltningssted for proteinasen yscF. Modningen ved I

I dette spaltningssted frigør inaktivt hirudin. Spaltning med proteina- I

I 20 sen yscF frigiver et hirudinmolekyle, der ved NH2 er forlænget med 4 I

I rester, Glu Ala Glu Ala. Deletion af det DNA-fragment, der koder for I

I denne Glu Ala Glu Ala-sekvens, tillader frigivelse af en korrekt op- I

I arbejdet hirudinkæde. Denne deletion blev udført ved en styret muta- I

I geneseteknik in vitro. I

I 25 Plasmidet pTG897 blev spaltet ved dobbelte Pstl-BgIII-spaltninger; I

I DNA-fragmentet omfattende hirudinsekvensen blev klonet i replikativ I

I form i den enkeltstrengede fag M13TG131, hvilket gav fagen M13TG897 I

I (fig· 1)· I 1

I J'-TCTTTGGATAAAAGAATTACCTATACAGAG-}’ I

Et oligonukleotid med sekvensen I

9 DK 175195 B1 blev hybridiseret til genomisk DNA fra denne fag M13TG897. Dette oligonukleotid hybridiserer i den første halvdel deraf (15 basepar) til sekvensen på 15 basepar direkte opstrøms for den sekvens, der skal deleteres, og i den anden halvdel med sekvensen på 15 basepar 5 direkte nedstrøms (fig. 2). Dette oligonukleotid tjente som skabelon til syntesen In vitro af den komplementære streng til genomet fra fagen M13TG897. Efter påvirkning fra T4-DNA-ligase, der på covalent måde skal lukke den nydannede streng, transficeres en modtagerbakterie, fx JM103 (Δ (Lac-Pro) SupE Thi EndlA sbcB15 strA rk- mk+ZF1 10 TraD36 ProAB+ LaclQ LacZ Δ M15), og de fager, der fremkom ved denne transfektion, blev analyseret ved DNA-DNA-hybridisering, idet der som probe anvendtes det ovenfor beskrevne oligonukleotid mærket med ved kinasebehandling ifølge de sædvanlige teknikker, der er kendte for fagfolk (2). Dette korrekt muterede fag-DNA danner sammen med 15 oligonukleotidet fra mutagenesen et hybridiseringscomplex, der kan genkendes ved sin større stabilitet, sin større resistens over for stringente betingelser, hvorimod det hybridiseringscomplex, der er dannet af ikke-muteret fag-DNA og oligonukleotidet, destabiliseres ved tilstedeværelsen af en enkeltstrenget DNA-løkke.

20 EKSEMPEL 2

Overførsel af det muterede fragment til en hidtil ukendt ekspres- # sionsvektor

Plasmidet pTG883 er afledt af plasmidet pTG876 ved simpel undertrykkelse af Bglll-stedet tæt ved transkriptionsterminatoren fra PGK-25 genet.

Til dette formål blev plasmidet pTG876 delvis spaltet med Bglll, hvorefter Klenow-fragmentet fra DNA-polymerase I fra E, coli lodes virke i nærværelse af de 4 nukleotider, og DNA-molekylerne blev covalent bundet til sig selv ved hjælp af DNA-ligase fra fagen T4. Plas-30 midet pTG883 har derefter kun ét Bglll-sted opstrøms for pheromon-genpromotoren (fig. 3).

I DK 175195 B1 I

I 10 I

I Plasmidet pTG883 (20 μg) blev lineariseret ved spaltning med Bglll og I

I derefter underkastet spaltning ved hjælp af nukleasen Bal31 (1,4 I

I enheder, 10 minutter - Boehringer Mannheim) ifølge de sædvanlige H

I teknikker. Det således behandlede DNA blev oprenset ved successive I

I 5 ekstraktioner med phenol og chloroform/lsoamylalkohol, hvorefter en I

I fraktion (5 /xg) blev underkastet påvirkning fra Klenow-polymerase for I

I at få et maksimalt antal stumpe ender. Det således behandlede DNA I

I blev underkastet ligation med ikke-phosphorylerede BamHI-linkere H

I (5'-CGGATCCCG) i nærværelse af ligase fra fagen T4 ifølge den af H

I 10 Lathe et al. beskrevne teknik (3). Efter transformation af E. coli I

I 1106 og selektion for ampicillinresistens blev der isoleret et plas- I

I mid, pTG892, hvor 5'-regionen omkring MFol-genet (fig. 4) var delete- I ret, idet BamHl-linkeren var placeret én base opstrøms for ATG ifølge

I nedenstående skema: I

I 15 5' - CGGGATCCCG A ATG AGA TTT ... I

I BamHI-linker kodende del af MTq^_2 I

I Det således vundne nye BamHI-Sall-fragment blev klonet mellem BamHI- I

I Sall-stederne på fagen M13TG120 til dannelse af fagen M13TG889 (fig. I

I 4). Ud fra fagen M13TG889 blev det BamHI-Bglll-fragment, der inde- I

I 20 holdt hele den kodende del af o-pheromonet, isoleret og derefter li- I

I geret med det store Bglll-fragment fra plasmidet pTG848. Det efter I

ligation vundne plasmid, pTG892b, indeholder BamHI-Bglll-fragmentet

I svarende til den kodende del af pheromonet, indsat efter Bglll-stedet I

I fra PGK-genpromotoren. I 1

I 5'-GATCCACCTGACATCTGCATGCG I

I GTCGACTGTAGACGTACGCAGCT-5' I

25 DNA fra pTG892b omfatter et unikt Bglll-sted, et unikt Sall-sted, og I

I de to steder omgiver en kort sekvens, der omfatter et Pstl-sted. Ved I

dobbelt spaltning med Bglll og Sall, eluering af det store fragment I

I og ligation med en syntetisk polylinker blev den korte sekvens er- I

stattet med den syntetiske polylinker. Denne polylinker med sekven- I

I 30 sen: I

DK 175195 B1 n har en kohæsiv ende med fragmenterne frigivet af Bglll, en kohæsiv ende med fragmenterne frigivet af Sall samt genkendelsessteder for bl.a. enzymerne Pvul, Bglll og SphI.

Den således vundne hidtil ukendte vektor blev betegnet pTC1819. DNA 5 fra denne vektor blev spaltet med enzymerne SphI og Pstl. Ved denne dobbelte spaltning fås tre fragmenter: et Pstl-Pstl-fragment på 6,5 kb, et Pstl-SphI-fragment på 1,9 kb og endnu et SphI-Pstl-fragment på 0,5 kb.

De to længste fragmenter blev oprenset og blandet med SphI-Pstl-frag-10 mentet svarende til muteret hirudin og stammende fra fagen M13TG1827, hvilket gav en hidtil ukendt ekspressionsvektor: pTG1828 (fig. 6).

EKSEMPEL 3

Overforsel af fragmentet til vektoren PTG881: hidtil ukendt plasmid PTG1833 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ____ _ ___- 1 DNA fra pTG881 blev delvis spaltet med Pstl, således at der blev 2 frigivet et fragment på 6,1 kb. Dette fragment blev isoleret og der 3 efter spaltet fuldstændigt med Bglll, hvilket frigiver et Pstl-Pstl- 4 fragment og et Pstl-Bglll-fragment. Disse to fragmenter blev ligeret 5 med Pstl-Bglll-fragmentet på 0,62 kb stammende fra pTG1828. Der dan- 6 nes således en hidtil ukendt vektor, pTG1833, som kun er forskellig 7 fra plasmidet pTG897 ved deletionen af de sekvenser, der koder for 8

Glu Ala Glu Ala. Den således dannede precursors struktur er vist i 9 fig. 7. Dette plasmid pTG1833 har et replikationsinitieringssted for 10 E. coli. et gen for ampicillinresistens, Leu2-genet fra S. cerevi- 11 siae. et fragment fra plasmidet 2μ, som tillader replication i S.

cerevisiae. promotoren fra MFal-genet, som koder for præ-pro og hiru-dingenet (fig. 6).

I DK 175195 B1 I

I I

I EKSEMPEL 4 I

I Transformation af gær ved hialp af plasmiderne nTG1828 oe nTG1833 I

I Stammen S. cerevisiae TGYlsp4 (Mata ura3-251-373-328 his3-ll-15) blev I

I transformeret med plasmiderne pTG1818, pTGl828 og pTG1833. De i tabel I

I 51 anførte resultater viser, at pTG1818 og pTG1833 fremkalder sekre- I

I tion af hirudinaktivitet i samme niveau. Derimod udskiller TGYlsp4

I pTG1828 to gange mindre hirudinaktivitet end de to andre stammer. Som I

I kontrol blev der medtaget en stamme TGYlsp4 pTG881, som ikke indehol- I

der den genetiske information for hirudin. Man sammenlignede også I

10 produktionen af hirudin udskilt af stammerne af S. cerevisiae (Mat a) I

I TGY14-1 transformeret enten med pTG1828 eller med pTG1833 og TGY14-2 I

I transformeret med de samme plasmider (tabel 2). Også her bemærkes, at I

i tilfælde af stammen TGY14-2 (kønstype Mata) inducerer plasmidet I

I pTG1833 en bedre hirudinsekretion end plasmidet pTG1828. I tilfælde I

I 15 af stammen TGY14-1 (konstype Mata) pTG1833 induceres derimod som I

I forventet ikke hirudinsekretion, mens TGY14-2 producerer hirudin. I

I TABEL 1 I

I Antithrombin-aktivitet 1 supernatanter fra earkulturer (10 ml) (48 I

I timers dyrkning. YNBG-medium og 0.5Z casaminosvrerl I

I 20 Modtager Plasmid Samlet aktivitet I

I TGYlsp4 pTG881 ikke detekterbar I

I pTG1818 158 I

I pTG1828 73 I

I pTGl833 149 I

I 25 _____ I

TABEL 2 DK 175195 B1 13

Antithrombin-aktivitet i sunernatanter fra pærkulturer (10 ml) (72 timers dvrkninp. YNBG-medium +0.5¾ casaminosvrer)

Modtager Plasmid Samlet aktivitet 5 TGY14-1 pTG881 ikke detekterbar pTG1828 54 pTG1833 ikke detekterbar TGY14-2 pTG881 ikke detekterbar pTG1828 103 10 PTG1833 210 EKSEMPEL 5

Isolering af stammer, der kan dvrkes i komplet medium, uden at plas-midfænotvpen går tabt 15 I WO 86/01224 er det påvist, at indforing af visse mutationer, der meddeler resistens over for 5-FU, i en ura3-stamme, der er transformeret til ura+ ved hjalp af et plasmid, tillod et større valg af medier til dyrkning af disse transformerede stammer; der kunne isar anvendes komplekse industrielle medier. Ud fra stammen TGYlsp4 20 pTG1833 blev der isoleret spontane mutanter, der kunne danne kolonier på komplet medium (YPG) beriget med 1 mg/ml 5-fluoruracil ifølge den i W0 86/01224 beskrevne fremgangsmåde. 6 mutanter blev dyrket på komplet medium, og der valgtes én mutant, som ikke havde nogen koloni, der havde mistet plasmidet efter mere end 20 generationers vækst 25 under ikke-selektive betingelser.

Mutanten, der blev betegnet TGYlsp4-3, kan anvendes til fremstilling af hirudin i komplet medium.

I DK 175195 B1 I

I I

I EKSEMPEL 6 I

I Strategi for syntese af den DNA-sekvens. som koder for HV1

I Denne sekvens skal bære de elementer, der muliggør fusion i fase af I

I HV1-sekvensen med præ-pro-delen af MFal, og de signaler, der muliggør I

I 5 korrekt modning af det udskilte hirudin; især skal forbindelsesregio- I

I nen indeholde en Lys-Arg-dublet umiddelbart opstrøms for den første I

I NH2- terminale rest i HV1. I

I Den anvendte strategi svarer til den, der er beskrevet i FR 84 13250. I

I Syntesen sker i to separate blokke, som derefter samles ved hjælp af I

I 10 deres kohæsive BamHI-ender. Den første blok omfatter 9 oligonukleo- I

I tider nummereret 1-9, og den anden blok omfatter 10 nukleotider num- I

mereret 10-19. Deres sekvenser og stillingen af oligonukleotiderne I

I er vist i fig. 8. I

I Restriktionskortet samt translationen af aminosyresekvensen er vist i I

I 15 fig. 9 og 10. I

I EKSEMPEL 7 I

I Samling af det syntetiske gen I

I Første syntetiske blok I

I

Oligonukleotiderne 2-8 (fig. 8) blev phosphoryleret i deres 5'-ende I

20 for at undgå dannelse af dimerer eller polymerer: 500 picomol af I

H hvert oligonukleotid blev behandlet med polynukleotidkinase (2 enhe- I

I der) i et slutvolumen på 25 μΐ 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, I

I 8 mM dithiothreitol indeholdende 3,3 pmol y-ATP ^2p (5000 Ci/nmol); I

efter 15 minutters inkubation ved 37°C tilsættes 5 nmol umærket ATP. I

I 25 Efter 30 minutters inkubation ved 37"C blev de komplementære frag- I

H menter hybridiseret to og to med undtagelse af fragmenterne 1, 2 og I

3, idet disse blev blandet tilsammen. 300 pmol af hvert oligonukleo- I

15 DK 175195 B1 tid blev anvendt i et slutvolumen på 10 μΐ 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0,5 mM speimidin, 8 mM DTT.

Disse blandinger blev opvarmet til 100°C i 3 minutter og derefter langsomt afkølet til 37"C i løbet af 2 timer. De hybridiserede oligo-5 nukleotider 1-2-3 blev blandet med oligonukleotiderne 4-5 og inkuberet ved 37*C i 2 timer. På samme måde blev der foretaget hybridise-ring af oligonukleotidparret 6-7 til 8-9. I et sidste trin blev de således forbehandlede 9 oligonukleotider samlet og inkuberet i 2 timer ved 37eC i et slutvolumen på 100 μΐ.

10 14 pmol af disse hybridiserede oligonukleotider blev underkastet behandling med T4-ligase i 15 timer ved 15°C. Derefter blev der til reaktionsblandingen sat 50 ng af det store Hindlll-BamHI-fragment fra M13TG131, der i forvejen var oprenset på en gel. Ligationsblandingen blev derefter anvendt til transformation af kompetente E. coli JM103-15 celler. Blandt 12 således vundne fagkloner havde 1 den ønskede sekvens: M13TG1888.

Anden syntetiske blok

Der blev benyttet samme strategi for at syntetisere den anden blok (fig. 8), som blev klonet mellem BamHI- og Sall-stedet i fagen 20 M13TG131. 2 kloner af de 12 testede havde en indsætning svarende til den ønskede sekvens. 1 af disse kloner betegnedes M13TG1889.

Samling af det syntetiske gen

De to dobbeltstrengede DNA’er fra M13TG1888 og M13TG1889 blev spaltet henholdsvis med Hindlll og BamHI og med BamHI og Sall og blandet med 25 det store HindiII-Sall-fragment fra pBR322, der var oprenset på en gel. Efter ligation blev blandingen anvendt til transformation af E. coli 1106. Ved selektion for ampicillinresistens vandtes plasmidet pTG1890, som indeholder den korrekt rekonstituerede syntetiske sekvens .

I DK 175195 B1 I

i 16 I

I EKSEMPEL 8 I

I Konstruktion af vektoren PTG1891. som muliggør sekretion af svn- I

I tetiseret hirudin I

I DNA-fragmentet fra pTGl890, som bærer den sekvens, der koder for HV1, I

I 5 blev anvendt i form af et Hindlll-BgIII-fragment (hvor Bglll-stedet I

I findes umiddelbart opstrøms for Sall-stedet, som blev anvendt til den I

I tidligere kloning) og indsat mellem Hindlll- og Bglll-stedet i plas- I

I midet pTG881, der er beskrevet i FR 85 06672. I det resulterende I

I plasmid, pTG1891, findes HVl-genet således indsat mellem præ-pro- I

I 10 sekvenserne fra MFal og transkriptionsterminatoren; denne konstruk- I

I tion skal således sørge for modning og sekretion af HVl-hirudin,

I eftersom den er identisk med pTG1818 (FR 85 06672) med undtagelse af I

de sekvenser, som koder for HV2, og som er erstattet med HVl-sekven- I

I ser.

I 15 EKSEMPEL 9 I

Transformation af en stamme TCY1sp4 med DNA fra nlasmidet oTG1891 I

I Stammen TGYlsp4 (a-1 ura3-251-373-328, His3-ll-15) blev transformeret I

I med plasmidet pTG1891; 2 kloner, der blev opnået ved selektion for I

I ura+-karakter, blev dyrket, og deres produktion af hirudin, der blev I

I 20 udskilt i dyrkningsmediet, blev bestemt. Som kontrol bestemte man I

I under samme betingelser den mængde hirudin, der blev udskilt af I

I TGYlsp4 pTG1818. I

Der måles to gange så meget antithrombin-aktivitet i supernatanten I

I fra kulturen af stammen TGYlsp4 pTG1891 (0,9 mg/1 kultursupernatant) I

I 25 som i kulturen af stammen TGYlsp4 pTGl833. I

I Deponering af stammer, der er repræsentative for opfindelsen I

H Følgende stammer er deponeret hos Collection Nationale de Cultures de I

I Microorganismes de 1'Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 I

I Paris Cédex 15: I

17 DK 175195 B1 6. juni 1986:

Saccharomvces cerevisiae TGYlsp4 pTG1828, nummer 1-569,

Saccharomvces cerevisiae TGYlsp4-3 pTG1833, nummer 1-570.

6. november 1986: 5 Saccharomvces cerevisiae TGYlsp4 pTG1891, nummer 1-623,

REFERENCER

1) T. Achstetter og D.H. Wolf (1985) EMBO Journal 4, 173.

2) M.J. Zoller og M.H. Smith (1983) Meths in Enzym. 100. 469.

3) R. Lathe, M.P. Kieny, S. Skory og J.-P. Lecocq (1984) DNA 3, 10 173.

4) H. Bussey, D. Seville, D. Greene et al. (1983) Mol. Cell. Biol.

3, 1362-1370.

Claims (15)

1. Funktionel DNA-blok, der muliggør fremstilling af hirudin ud fra I I , I I kendetegnet ved, at den i det mindste omfatter sekvensen: I I 3 * Str - Lex - Sc^ - H-gen, I I hvor I I - H-gen er det gen, der koder for hirudin eller en variant deraf; I I - Str er en DNA-sekvens, der omfatter de signaler, som sørger for I I transkription af H-genet ved hjælp af gær; I I 10 Lex er en ledersekvens, der er nødvendig for at opnå udskillelse I I af genproduktet; og I I - Sc^ er en DNA-sekvens, som koder for spaltningsstedet for pro- I I teinasen yscF, hvilket spaltningssted er unikt og befinder sig i I hirudinprecursoren umiddelbart opstrøms for H-genet. I I 15 2. Funktionel blok ifølge krav 1, I I kendetegnet ved, at Lex-sekvensen er en sådan, der mulig- I gør sekretion af α-kønspheromonet fra gær. I

3. Funktionel blok ifølge krav 1 eller 2, I I kendetegnet ved, at Str-sekvensen omfatter en promotor fra I 20 et gærgen, der er forskellig fra promotoren fra MFol-genet, fx promo- I I toren fra PGK-gærgenet. I

4. Funktionel blok ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, I kendetegnet ved, at H-genet er det gen, der koder for HV1 I I eller HV2. I I 25 5. Plasmid, der omfatter de nødvendige elementer for sekretion af I I hirudin i en gær, I I kendetegnet ved, at det omfatter en funktionel blok ifølge I I et hvilket som helst af kravene 1-4 og i det mindste ét replikations- I initieringssted i gær, fx replikationsinitieringsstedet fra plasmidet I I 30 2μ. I DK 175195 B1

6. Plasmid ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det desuden omfatter URA3-genet.

7. Funktionel DNA-blok, der muliggør fremstilling af HVl-hirudin ud fra gær, 5 kendetegnet ved, at den i det mindste omfatter sekvensen: - str · Lex - scl ' H-gen, hvor H-gen er det gen, der koder for HV1; Str er en DNA-sekvens, der omfatter de signaler, som sørger for 10 transkription af H-genet ved hjælp af gær; Lex er en ledersekvens, der er nødvendig for at opnå udskillelse af genproduktet; og Sci er en DNA-sekvens, som koder for et spaltningssted, og som eventuelt ved 3'-enden før H-genet omfatter en ATG-kodon eller 15 to kodoner, som koder for Lys-Arg, eller fem kodoner, som koder for Ser-Leu-Asp-Lys-Arg; desuden kan elementet Sci - H-gen være gentaget flere gange.

8. Funktionel blok ifølge krav 7, kendetegnet ved, at Lex-sekvensen er sekvensen fra o-kcns-20 pheromonet fra gær.

9. Funktionel blok ifølge krav 7 eller 8, kendetegnet ved, at H-genet følges af en gærterminator-sekvens såsom sekvensen fra PGK-genet.

10. Plasmid, der omfatter de nødvendige elementer til sekretion af 25 hirudin fra en gær, kendetegnet ved, at det omfatter en funktionel blok ifølge et hvilket som helst af kravene 7-9 og i det mindste ét replikations-initieringssted i gær. 1 Plasmid ifølge krav 10, 30 kendetegnet ved, at det omfatter: I DK 175195 B1 I I 20 I I - replikationsinitieringsstedet fra gærplasmidet 2μ·, I I ura3-genet; I I - et replikationsinitieringssted i E. coli og en markør for resi- I I stens over for et antibiotikum; I I 5 - 5'-regionen fra MFal-genet, som omfatter transkriptionspromoto- I I ren, "leder"-sekvensen og præ-pro-sekvensen fra precursoren for I I o-faktoren, idet denne sekvens fusioneres i fase opstrøms for I I den sekvens, der koder for HV1-hirudin; I I - transkriptionstenninatoren fra PGK-gærgenet, som anbringes ned- I H 10 strøms for hirudin-genet. I I 12. Gær, I H kendetegnet ved, at den er transformeret med et plasmid I ifølge et hvilket som helst af kravene 5, 10 eller 11 eller med en I I funktionel blok ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4 eller 7-9. I I 15 13. Gær ifølge krav 12, I kendetegnet ved, at den er en Saccharomvces- stamme. især I I S. cerevisiae. I

14. Gær ifølge krav 13, I H kendetegnet ved, at den er af en stamme med Mata-kønstype I 20 eller en diploid eller polyploid stamme uden kønstype. I

15. Gær ifølge et hvilket som helst af kravene 12-14, I kendetegnet ved, at den er en stamme, som efter transfer- I mation er resistent over for 5-fluoruracil. I

16. Fremgangsmåde til fremstilling af hirudin eller en variant deraf, I 25 kendetegnet ved, at en gær ifølge et hvilket som helst af I H kravene 12-15 fermenteres, og hirudin, der er dannet i dyrkningsme- I diet, isoleres i moden form eller i form af en precursor, der kan I modnes in vitro eller in vivo. I

17. Hirudin eller en variant deraf, I 30 kendetegnet ved, at det er vundet ved en fremgangsmåde I ifølge krav 16. I DK 175195 B1

18. HVl-hirudin ifølge krav 17.

19. Anvendelse af hirudin eller en variant deraf ifølge krav 17 eller 18 som antikoagulationsmiddel eller som thrombin-inhibitor.

20. Anvendelse ifølge krav 19 som lægemiddel.