DK173239B1 - Fremgangsmåde og middel til desinficering af udstyr i levnedsmiddelvirksomheder, fortrinsvis udstyr, der anvendes ved slagt - Google Patents

Description

i DK 173239 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til desinficering af udstyr i levnedsmiddelvirksomheder, fortrinsvis udstyr, der anvendes ved slagtning eller kødforarbejdning.

Ved slagtning og forarbejdning af kød på slagterier råder høj hygiejne, hvilket bl.a. opnås ved hyppig rengøring af lokaler og udstyr. Desuden får operatørerne særlige arbejds-5 instruktioner, der fremmer hygiejnen, og slagteriet tilrettelægger arbejdet så hygiejnen bliver optimal. Alligevel kan det ikke undgås, at der sker en vis bakteriel forurening af kødet. Det skyldes bl.a., at det ikke altid er praktisk muligt at sterilisere udstyret mellem hvert emne, og derfor sker det, at bakterier overføres fra et behandlet emne til efterfølgende emner. Følgerne af forureningerne søges bl.a. imødegået ved indførelse af såkaldte hurdler, 10 hvor kødemnerne og udstyret, der kommer i kontakt med emnerne, udsættes for et miljø, så bakteriernes udvikling sættes i stå for en tid. Bakterierne slås ikke helt ihjel, men væksten hæmmes af hurdlerne, så bakteriernes niveau forbliver uskadeligt.

Når det er muligt at sterilisere udstyret mellem hvert emne, sker dette i vid udstrækning, f.eks. ved neddypning af knive i skoldende vand. Herved foretages ikke nogen rengøring 15 af værktøjet, og der kan derfor ske en påbrænding af organiske rester, som kan give grobund for bakterievækst. Der kan anvendes kemiske desinfektionsmidler, men de har hver nogle ulemper, der udelukker dem eller begrænser deres brug i levnedsmiddelvirksomheder. F.eks. er chlor stærkt korroderende, og det inaktiveres ved kontakt med organisk materiale.

20 En af forureningskilderne i slagterimiljø er den film af mikroorganismer og levnedsmiddeldele, som findes på overfladen af udstyret. Denne såkaldte biofilm forekommer på alle typer udstyr og kan være vanskelig at fjerne ved almindelig rengøring eller desinfektion med skoldende vand.

Formålet med opfindelsen er at tilvejebringe en ny fremgangsmåde til desinficering af 25 udstyr i levnedsmiddelvirksomheder, som udviser væsentlige fordele i forhold til de kendte metoder, og f.eks. muliggør tilvejebringelse af et mikrobiologisk nulpunkt for udstyret mindst én gang om dagen.

DK 173239 B1 2

Det er specielt formålet med opfindelsen at tilvejebringe en fremgangsmåde, der kan anvendes til desinficering af udstyr til slagtning og forarbejdning af kødemner, og ved hvilken der ikke forekommer påbrænding. Udstyret skal kunne anvendes umiddelbart efter desinficeringen, uden at påvirke kødemnets egenskaber (udseende, smag og funktionalitet).

5 De angivne formål opfyldes af fremgangsmåde ifølge opfindelsen, der er kendetegnet ved, at et vandigt medium indeholdende reuterin påføres på overfladen af udstyret.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen bygger på den overraskende iagttagelse, at det kendte stof reuterin er effektivt mod bakterier, der sidder på overfladen af levnedsmiddeludstyr, og på såvel kort som langt sigt er i stand til at nedsætte bakterietallet. Reuterin er virksomt 10 ved de temperaturer der råder i arbejdslokalerne i levnedsmiddelvirksomheder. Det påvirker desuden ikke levnedsmidlernes egenskaber, såsom kødegenskaber, og ibrugtagning af levnedsmiddeludstyret efter behandling med reuterin kræver derfor ingen eller kun let afskylning. Reuterin er derfor et nyt desinfektionsmiddel, der er specielt egnet til brug på udstyr, der anvendes ved slagtning eller kødforarbejdning.

15 Ved hjælp af den foreliggende opfindelse er det blevet muligt at forebygge biofilm i levnedsmiddelvirksomheder, et problem, som det hidtil ikke har været praktisk muligt at løse med traditionelle midler.

Ved påføringen af det vandige medium indeholdende reuterin på udstyrets overflade nedsættes bakterietallet næsten øjeblikkeligt til et lavt niveau. Reuterin er bredspektret, så 20 det påvirker alle bakterietyper. Det viser sig virksomt over for organismer, der hæfter til udstyrets overflade, og det hæmmer bakteriers kolonisering af en overflade. Reuterin tåler varme. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebringer således en ny metode til at højne hygiejnen på levnedsmiddelvirksomheder.

Reuterin, dets fremstilling og konserverende virkning i kød og brug som antibiotikum er 25 beskrevet flere steder i litteraturen, f.eks. i EP 0 357 673 Bl og den tilsvarende danske DK 173239 B1 3 patentansøgning PA 1989 05428, som også omtaler en reuterinproducerende stamme benævnt ATCC 53 608.

I alle anvendelser og undersøgelser, der er angivet i PA 1989 05428, er reuterin “langsomt” virkende. F.eks. viser fig. 14, at reuterin så at sige ingen virkning har i oksekød det første 5 døgn. Virkningen blev først markant efter tre dage. På fig. 15 ses, at virkningen (i oksekød) efter én dag er ca. 1 log-enhed, og at den kraftige virkning først indtræder efter 2-3 dage.

En særlig egenskab ved desinfektionsmidler er, at de skal være hurtigt virkende, så de behandlede flader er “rene” umiddelbart efter behandlingen, og reuterin synes derfor ifølge den kendte teknik være uegnet som desinfektionsmiddel.

10 Den foreliggende opfindelse er baseret på den overraskende iagttagelse, at reuterin er hurtigt virkende ved påføring på overfladen af udstyr. Det er desuden tilstrækkeligt virksomt mod bakterier i det kolde miljø, der er på overfladen af udstyr på f.eks. slagterier.

Ud over disse iagttagne egenskaber har reuterin andre egenskaber, der gør det særdeles attraktivt i forhold til kendte desinfektionsmidler inden for fødevareindustrien. Især skal 15 nævnes, at reuterin ikke har lugtproblemer, ikke giver påbrændingsproblemer og har lang eftervirkningstid på overfladen af udstyr. Reuterin påvirker heller ikke køds pH, farve eller tekstur og kan derfor få lov af blive siddende på kødbehandlingsudstyr når dette ibrugtages efter desinfektion.

Ved en udførelsesform af fremgangsmåden ifølge opfindelsen påføres det vandige medium 20 mindst én gang dagligt, således at der opnås et bakterielt “nulpunkt” mindst én gang dagligt.

Behandlingen er mest effektiv, når det vandige medium påføres i det mindste umiddelbart efter (daglig) rengøring af udstyret.

Det vandige medium kan påføres i forbindelse med arbejdspauser eller holdskift.

DK 173239 B1 4

Det vandige medium kan påføres 1 til 24 gange dagligt med et tidsinterval på 1 til 24 timer eller for hvert n antal emner, der behandles, hvor n er lig 10 til 10.000.

Mediet kan påføres som spray (tåge), væskefilm eller stråle.

Mediet kan påføres med eller uden efterfølgende aftørring inden udstyret anvendes igen.

5 Mediet kan yderligere indeholde glycerol og en reuterinproducerende bakteriestamme, således at der produceres mere reuterin over en tidsperiode. Mediet indeholder da desuden fortrinsvis glucose i en koncentration på £ 20 mM. Mediet kan indeholde 105 til 107 CFU/ml reuterinproducerende bakteriestamme.

Mediet kan yderligere indeholde mindst en af følgende bestanddele: fortykkelsesmiddel, 10 tensid eller mælkesyre.

Mediet kan indeholde 1-500 AU reuterin pr. ml.

Opfindelsen angår desuden et middel til desinficering af udstyr i levnedsmiddelvirksomheder. Det er kendetegnet ved, at det omfatter et vandigt medium indeholdende reuterin.

15 Mediet indeholder fortrinsvis 1-500 AU reuterin pr. ml.

Mediet kan yderligere indeholde glycerol og en reuterinproducerende bakteriestamme, fortrinsvis 105 til 107 CFU/ml reuterinproducerende bakteriestamme. Mediet kan da desuden indeholde glucose i en koncentration på < 20 mM.

Mediet kan yderligere indeholde mindst en af følgende bestanddele: fortykkelsesmiddel, 20 tensid eller mælkesyre.

DK 173239 B1 5

Ved reuterin skal i foreliggende beskrivelse især forstås en ligevægtsblanding af monomer, hydreret monomer og cykliske dimere former af β-hydroxypropionaldehyd.

Reuterinet, der anvendes ved fremgangsmåden og i midlet ifølge opfindelsen, kan fremstilles ved dyrkning af en stamme af Lactobacillus reuteri. Ifølge den kendte 5 produktions-metode fremstilles reuterin i to trin. I første frin dyrkes en sådan stamme først under betingelser, der er gunstige for cellevækst. Når der er opnået en tilstrækkelig cellemasse, høstes cellerne, og de dyrkes under anaerobe forhold (trin 2) i et nyt medium, der indeholder glycerol. Cellemassen kan fjernes fra dyrkningsmediet ved sterilfiltrering.

Den reuterinholdige væske kan anvendes som den er (evt. efter tilsætning afhjælpestoffer), 10 eller den kan lyofiliseres (frysetørres), så der opnås fast reuterin, som efterfølgende opløses i et vandigt medium inden det appliceres på udstyret.

I dansk patentansøgning PA 1999 01800 er beskrevet en ny fremgangsmåde til produktion af reuterin, som muliggør opformering af celler og produktion af reuterin i samme trin. Fremgangsmåden består i, at en Lactobacillus reuteri-stamme dyrkes i batch i et vandigt 15 medium indeholdende s 20 mM glucose (f.eks. s. 15 mM glucose) og > 50 mM glycerol (f.eks. > 75 mM glycerol), eller dyrkes i et vandigt medium indeholdende s 20 mM glucose (f.eks. ^ 15 mM glucose), hvilket medium kontinuerligt tilsættes > 50 mM glycerol (f.eks. > 75 mM glycerol) under dyrkningen. Reuterinet kan produceres ved såvel batchfermenteringer som ved kontinuerlige (chemostat) fermenteringer. Chemostat-20 fermenteringer tillader en kontinuerlig produktion af reuterin.

Det er særlig fordelagtigt at anvende en højtydende stamme til produktionen af reuterinet, såsom Lactobacillus reuteri 12002, der er deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH under betegnelsen DSM 12246. Denne stamme har vist sig at have en væsentligt større produktion af reuterin end kendte Lactobacillus 25 reuteri-stammer, f.eks. LMG 9213.

DK 173239 B1 6

Ved udstyr skal der i foreliggende sammenhæng især forstås knive, værktøjer, borde, behandlingsaggregater og andre indretninger, som anvendes i levnedsmiddelvirksomheder og har en overflade, der kommer i kontakt med skiftende levnedsmiddelemner.

Ved den omhandlede anvendelse af reuterin til desinficering af levnedsmiddeludstyr er 5 følgende forhold vigtige:

Reuterin er en naturlig forbindelse, der er vandopløselig og stabil i pH-området fra 2 til 9.

Ved neutral eller sur pH iagttages ingen formindskelse af aktiviteten efter flere måneder ved 5 °C, og ved temperaturer op til 37 °C er aktiviteten konstant i adskillige uger. Hvis pH er over 9 mister reuterin hurtigt sin virkning (dvs. tilbageværende reuterin på levneds-10 middeludstyr kan om ønsket inaktiveres med en base).

Reuterin tåler varmebehandling ved 100 °C i 5 minutter uden at miste virkning.

Opfindelsen beskrives nærmere i de følgende eksempler under henvisning til tegningen, hvori 15 - fig. 1 viser overlevelseskurver for E. coli 0157.Ή7 og L. monocytogenes, der udsættes for 500 AU reuterin/ml i Butterfield phosphatbuffer ved stuetemperatur, - fig. 2 den gennemsnitlige nedsættelse af CFU/cm2 af E. coli 0157.Ή7 stamme MKR 1452 podet på overfladen af kogt skinke ved behandling med forskellige midler efter 15 sekunder og 24 timer, og 20 - fig. 3 tilsvarende resultater for L. monocytogenes stamme.

I eksemplerne er de angive procenter vægt/volumen-procenter (w/v), med mindre andet er angivet.

Reuterins desinficerende virkning på knive i DK 173239 B1

Eksempel 1 7 I dette forsøg undersøges reuterins desinficerende virkning på knive. Forsøget er gennemført under produktionsforhold på et svineslagteri.

5 Efter at knivene er afskyllet med ca. 40 °C varmt vand i 1-2 sekunder, udsættes de for en af følgende desinficerende opløsninger: 1) 5 %'s bufferet mælkesyreopløsning med en temperatur på 82 °C. Knivene neddyppes i den varme opløsning (pH 2,5-3,5) i 10 sek.

2) 250 AU reuter in i 5 %’s bufferet mælkesyreopløsning med en temperatur på ca. 20 °C.

10 Knivene holdes på siden og påsprøjtes ca. 2 ml opløsning. Virketiden er 10 sekunder, hvorefter opløsningen slås af kniven.

3) 250 AU reuterin i vandig opløsning med en temperatur på ca. 20 °C. Knivene holdes på siden og påsprøjtes ca. 2 ml opløsning. Virketiden er 10 sekunder, hvorefter opløsningen slås af kniven.

15 Efter behandlingen tages prøver fra hele den ene side af knivbladet (med særlig vægt lagt på området omkring skæftet) og 2 cm op ad skæftet.

Behandling 1): Det aerobe kimtal bestemmes ved 72 timers inkubation af prøverne på petrifilm, type AC ved 25 °C. Behandling 2) og 3): Prøverne underkastes membran-filtrering umiddelbart efter udtagningen. Membranfiltrene dyrkes på PCA i 72 timer ved 20 25 °C, hvorefter det aerobe kimtal bestemmes. Petrifilmundersøgelse kan ikke anvendes ved behandling 2) og 3), fordi de små mængder reuterin, der overføres til filmen, kan hæmme fremvæksten af tilstedeværende kim.

DK 173239 B1 8

Efter behandling 1) med skoldende mælkesyreopløsning findes et kimtal på 1,43 (log 10) ±0,57, dvs. 0,46-log-enheder lavere end ved traditionel desinficering (13 sekunders neddypning i 82 °C varmt vand, hvilket giver et kimtal på 1,89 (log 10) ±0,87). Der opnås således en lille reduktion alene ved behandling med skoldende mælkesyreopløsning, men 5 der er stor forskel på de individuelle prøvers kimtal. Arbejdet med varm mælkesyre-opløsning kan give arbejdsmiljømæssige problemer, da dampene generer luftvejene.

Efter behandling 2) med reuterin i kold mælkesyreopløsning findes et kimtal på 1,20 (log 10) ±0,60. Der er således opnået et fald i kimtallet på 0,69 log-enheder i forhold til traditionel desinficering, dvs. behandlingen er væsentligt mere effektiv end traditionel 10 skoldning, men der er dog store forskelle på de enkelte prøvers kimtal.

Efter behandling 3) med reuterin i kold vandig opløsning er kimtallet 1,81 (log 10) ±0,38. Kimtallet svarer til det, der opnås ved en traditionel desinficering med varmt vand. En kold reuterinopløsning er altså lige så effektiv til desinficering som en traditionel desinficering af knive med 82 °C varmt vand og giver ingen påbrændingsproblemer.

15 Eksempel 2

Reuterins desinficerende virkning på plader af rustfrit stål

Formålet med dette forsøg er at undersøge reuterins desinficerende virkning på overflader af rustfrit stål, der er tilsmudset med svinekød og fedt, og derefter podet med L. monocytogenes.

20 Polerede plader af rustfrit stål steriliseres ved 121 °C i 15 minutter. Pladerne opdeles i tre grupper med fire plader i hver gruppe. Én gruppe gnides med svinekød og én med spæk.

Denne behandling giver en tynd film af kød og fedt. Den sidste gruppe plader forbliver ubehandlet.

> DK 173239 B1 9

Ved hjælp af en steril, L-formet glasstav podes pladerne med L. monocytogenes 11139, idet der udspredes 0,1 ml afen 18 timers kultur i BHI, så der fås et forureningsniveau på ca.

Ι,ΟχΙΟ4 CFU pr. plade. Cellerne får lov at vedhæfte i 30 minutter ved stuetemperatur (ca.

20 °C). Nogle plader behandles med 250 μΐ reuterin-opløsning (500 AU), medens andre 5 ikke behandles (kontrol). Pladerne opbevares i otte timer ved stuetemperatur og 100 % relativ fugtighed.

Antallet af L. monocytogenes-kim bestemmes inden opbevaringen og efter 8 timers opbevaring. Der anvendes følgende metode til bestemmelse af kimtallet: Pladerne skylles med en vandig pepton-opløsning (0,8 % NaCl og 0,1 % pepton (pH 7,2)). 1 ml af passende 10 1 O-gangsfortyndinger overføres til petriskåle med 10 ml blodagar, og der inkuberes ved 37 °C. De typiske kolonier tælles efter 24 og 48 timer.

Resultaterne er vist i nedenstående tabel.

Kimtal (CFU pr. plade) for ubehandlede og reuterinbehandlede plader

Tid Tilsmudsning Behandling 15 Kontrol 500 AU reuterin 0 timer Ingen 2,4xl04 ±0,3 2,6xl04 ±0,3

Fedt 8,3xl04 ±0,3 2,0xl04 ±0,2 Kød 2,4x10" ±0,2 2,3xl04 ±0,2 20 8 timer Ingen l,3xl04 ±0,7 < 103

Fedt 4,0xl04 ±0,9 < 103 Kød 3,3xl04 ±0,8 < 103

Det ses, at overfladebehandling med reuterin inaktiverer bakterier, der har hæftet til polerede plader af rustfrit stål. Ved forsøg med upolerede plader af rustfrit stål er opnået 25 lignende resultater.

Reuterins virkning på køds pH

DK 173239 B1 10

Eksempel 3

Til dette forsøg anvendes prøver af kogt skinke, der behandles med forskellige midler, som anført i tabellen nedenfor.

5 Prøvernes pH bestemmes før og umiddelbart efter reuterinbehandling samt efter 24 timers opbevaring. Der anvendes et pH-meter til målingen.

Overflade-pH af behandlede kødprøver ved 7 °C

Behandlingsmiddel 15 sek. 24 timer 10 Kontrol 6,18±0,02 6,19±0,01

Reuterin (500 AU/ml) 6,10±0,012 6,19±0,02

Reuter in (500 AU/ml) + 5,14±0,02 5,35±0,02 mælkesyre (5 %)

Reuterin (500 AU/ml) + 5,36 ±0,04 5,41 ±0,03 15 mælkesyre (5 %) + ethanol (40 % (v/v)) Mælkesyre (5 %) + 5,31 ±0,10 5,39±0,15 ethanol (40% (v/v)) Målingerne viser, at reuterin ikke ændrer kødoverfladens pH, hvorimod dette er tilfældet 20 for mælkesyre. Ethanol synes at formindske mælkesyrens syrevirkning.

Eksempel 4

Reuterins indflydelse på kødkvaliteten (farve, tekstur) DK 173239 B1 11 I dette forsøg undersøges forskellige behandlingsmidlers indflydelse på svinekøds sensoriske egenskaber.

5 Ferske svinekødsfileter dyppes i opløsninger af behandlingsmidlerne. De behandlede prøvers farve, tekstur og samlede kvalitet bedømmes efter 24 timers lagring ved 7 °C. 18 dommere bedømmer prøverne efter en beskrivende skala med hensyn til farve (1 = lys, meget uønsket farve; 9=meget ønsket farve), tekstur (1 =ekstrem tør; 9 = saftig) og samlet kvalitet (1 = yderst uønsket; 9=yderst ønsket).

10 De forskellige behandlingsmidlers virkning på farven, teksturen og den samlede kvalitet er vist i nedenstående tabel.

Sensoriske egenskaber af behandlede kødprøver

Behandlingsmiddel Farve Tekstur Samlet kvalitet 15 Kontrol 7,5 ±1 7,3 ±1,3 7,6 ±0,6

Reuterin (500 AU/ml) 6,6 ±1,1 6,6 ±1,1 6,8 ±1 Mælkesyre (5 %) 4,3 ±1,6 4,9 ±2,4 4,3 ±1,7

Reuterin (500 AU/ml) + 4,4 ±1,5 4,3 ±1,6 4,3 ±1,6 mælkesyre (5 %) 20 Reuterin (500 AU/ml) + 5,2 ±1,3 5,9 ±1,3 5,3 ±1,1 mælkesyre (5 %) + ethanol (40 % (v/v)) DK 173239 B1 12

Som det ses, forårsager reuterin ikke væsentlige ændringer af kødets kvalitet. Mælkesyre alene eller mælkesyre i kombination med reuterin bevirker misfarvning af kødet og giver uacceptabel tekstur og kvalitet. Ethanol synes at formindske mælkesyres skadelige virkning.

5 Eksempel 5

Reuterins væksthæmning og inaktivering afL. monocytogenes og E. coli 0157:H7 in vitro

Formålet med dette forsøg er at undersøge, hvilken virkning reuterin har på kort sigt på bakterier i suspension.

L. monocytogenes stamme 121 og E. coli 0157.Ή7 stamme MKR 1542 suspenderes i 10 Butterfield phosphatbuffer ved stuetemperatur. Bakteriesuspension (ca. 8 (log 10) CFU/ml) anvendes til at pode 10 ml reuterinopløsning (500 AU/ml). Efter en virketid på 10, 20 og 30 sekunder samt 1, 5, 10, 15, 20 og 30 minutter ved stuetemperatur overføres 1 ml af opløsningen til en quenchingopløsning indeholdende 0,5 % pepton, 0,8 % NaCI og ca. 0,1 ml 15 %’s K3P04-opløsning (pH 9,0). Levedygtige celler bestemmes ved dybdeudsæd i 15 Plate Count Agar (PCA), der inkuberes ved 37 °C i 48 timer.

Reuterinkoncentrationen, der kræves for at hæmme væksten af E. coli 0157:H7-stammen er 4 AU/ml, medens den for L. monocytogenes-stammen er 8 AU/ml under optimale betingelser for organismerne.

I fig. 1 er vist stammernes overlevelseskurver i Butterfield phosphatbuffer, der er tilsat 500 20 AU reuterin/ml. Kontrolforsøg uden reuterin viser ingen signifikant formindskelse af bakterietallet, medens forsøgene med reuterin ved en virketid på $ 1 min. viser en øjeblikkelig virkning med ti ganges formindskelse af antallet for begge organismer (i fig.

1 vist til tiden 0 min.). Ved en virketid af reuterin på op til 30 min. reduceres antallet af levedygtige celler med 3 (log 10) og 5 (log 10) (henholdsvis E. coli 0157.Ή7 og L.

DK 173239 B1 13 monocytogenes). Reuterin har derfor på kort sigt en betydelig virkning på bakterier i suspension.

Eksempel 6

Reuterins inaktivering afL. monocytogenes og E. coli Q157:H7på kødoverflader ved 7 °C

5 Formålet med dette forsøg er at undersøge forskellige midlers hæmmende virkning på kort og langt sigt over for organismer på kødoverflader.

Blokke af kogt skinke, der er hentet fra et slagteri umiddelbart efter varmebehandlingen, udskæres aseptisk i stykker på 5x5x0,5 cm og lagres ved 7 °C i en time inden brug. Prøverne indeholder mindre end 10 CFU/g (bestemt efter 48 timers inkubation ved 30 °C 10 ved dybdeudsæd i PCA). Rodoverfladerne podes med E. coli 0157.Ή7 stamme 1542 eller L. monocytogenes stamme 121, idet der ved hjælp af en steril L-formet glasstav udspredes 75 μ\ af en 18 timers kultur i BHI, så der opnås et forureningsniveau på ca. 5 (log 10) CFU/cm2. Cellevedhæftning får lov at forløbe i 30 minutter ved 7 °C. Kødoverfladen desinficeres ved 7 °C ved neddypning af kødstykkerne i 15 sekunder i 25 ml opløsning 15 indeholdende i) reuterin, ii) reuterin og mælkesyre, iii) reuterin, mælkesyre og ethanol, eller iv) mælkesyre og ethanol. De anvendte koncentrationer er: 500 AU reuterin/ml, 5 % (v/v) mælkesyre (L(+)-mælkesyre, 80 % (w/w)) og 40 % (viv) ethanol. Behandlede prøver og ubehandlede kontrolprøver opbevares i tætlukkede petriskåle ved 7 °C. Prøverne undersøges for overlevelse af E. coli 0157.Ή7 og L. monocytogenes straks (15 sek.) efter 20 behandlingen og igen efter 24 timer. Hver skive skæres i to lige store dele, der overføres til sterile Stomacher-poser og homogeniseres med bufferet pepton-saltopløsning (0,1 g/1 pepton og 8,5 g/1 NaCl) i en Stomacher i 2 minutter. De homogeniserede prøver fortyndes 10 gange i PBS og spredes på plader af Blood Agar Base (Merck) tilsat 5 % defibrineret hesteblod (Difco) (L. monocytogenes) eller på Tryptone Glucose Beef Extract Agar (Difco) 25 (E. coli 0157.Ή7). Antallet af kolonier tælles efter inkubation af pladerne i 48 timer ved 37 °C og kontrolleres ved haemolyse, kolonimorfologi og mikroskopi.

DK 173239 B1 14

En trevejs ANOVA-analyse viser, at behandlingsmidlet, tid og organismetype har signifikans (P s 0,05). Fig. 2 og 3 viser resultaterne for henholdsvis E.coli og L. monocytogenes. Som det ses har behandlinger med reuterin såvel en korttids- som en langtidsvirkning ved 7 °C.

5 Eksempel 7

Reuterins virkning på levedygtigheden af E. coli 0157.Ή7på oksekødoverflader 1. Formålet med nedenstående forsøg er at undersøge reuterins virkning på celle-kolonisering af kødoverflader.

10 Forsøget udføres som beskrevet at Chung et al.: Effects of nisin on growth of bacteria attached to meat, Appl. Environ. Microbiol. 55, 1329-1333 (1989). Koncentreret reuterin-opløsning fortyndes i 10 mM HC1 indeholdende 0,75 % NaCl (pH 5,5) til en slut-koncentration på 200 AU/ml. Frosne oksekødsprøver optøs ved 7 °C i 15 timer og udskæres ved hjælp af en steril skalpel i stykker på 1x1x0,5 cm.

15 Kødstykkerne nedsænkes i reuterinopløsningen i indtil 10 minutter. Kødet dyppes derefter i en cellesuspension af E. coli 0157.Ή7 (106 CFU/ml), og der inkuberes i 0, 2, 5 og 10 minutter. Med passende tidsintervaller skylles prøverne forsigtigt med fysiologisk saltopløsning. Desuden udføres kontrolforsøg uden reuterinbehandling.

Forsøgene viser, at E. coli 0157:H7's vedhæftning til kød når sit maksimum efter 2 20 minutters neddypning i podemediet. Forlængelse af neddypningstiden til 10 minuter forøger ikke niveauet af vedhæftede celler.

Når kødet er blevet neddyppet i reuterinopløsning, vedhæfter et færre antal E. coli 0157:H7-ce\ler. Den procentvise nedsættelse af vedhæftede celler efter at kødet er blevet neddyppet i reuterinopløsning i 2, 5 og 10 minutter er henholdsvis 43,7, 77,5 og 85,8 %.

v DK 173239 B1 15

Der findes ikke vedhæftede E. coli 0157:H7-celler, når neddypningstiden forlænges til 40 minutter.

Forsøgene viser således, at en forudgående reuterinbehandling kan hindre eller hæmme cellevedhæftning på kødoverflader.

5 2. Formålet med nedenstående forsøg er at undersøge reuterins virkning på vedhæftede celler.

Kødoverfladen podes med cellesuspension, og der inkuberes i 10 minutter. Prøverne skylles med fysiologisk saltopløsning og neddyppes i reuterinopløsning (200 AU/ml). Prøver udtages efter 0, 2, 5, og 10 minutter. Kontrolforsøg udføres samtidig under anvendelse af 10 den samme neddypningsopløsning, men uden reuterin. Forsøgene udføres ved stuetemperatur.

Forsøgene viser, at reuterin har en virkning på vedhæftede E. coli 0157:H7-cel\er, men at den er lavere end når cellerne er under vedhæftning. Den procentvise formindskelse i antallet af levedygtige celler efter 2, 5 og 10 minutters neddypning er henholdsvis 40, 49 15 og 49%.

Eksempel 8

Produktion af reuterin ved hjalp afLb. reuteri 12002

Lb. reuteri 12002 inkuberes ved 37 °C i 18 timer i MRS-bouillon indeholdende 40 mM glycerol. Kulturen centrifugeres, vaskes to gange med 50 mM phosphatbuffer (pH 7,0) og 20 suspenderes i en sterilfiltreret blanding af vand og glycerol (250 mM glycerol). Kulturen inkuberes i 3 timer ved 37 °C under anaerobe forhold. Efter inkubation lyofiliseres den sterilfiltrerede supernatant, og indholdet af reuterin bestemmes i arbitrære enheder (AU) ved MIC-assay ved hjælp af E. coli IMG 8223 som indikatorstamme (jvf. Chung et al.: In vivo studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri, Microb. Ecol. Health and Des., DK 173239 B1 16 2, 137-144 (1989)). Reuterinkoncentrationen defineres som den reciprokke værdi af den højeste fortynding, som ikke tillader synlig vækst af indikatorstammen.

Efter 3 timers inkubation af Lb. reuteri 12002 ved 37 °C findes koncentrationen af reuterin at være 128-256 AU/ml. Forlængelse af inkubationstiden forøger ikke slutkoncentrationen.

5 I dyrknings-blandingen kan kun detekteres tre forbindelser: Glycerol, 1,3-propandiol og reuterin.

Eksempel 9

Reuterinproduktion I dette forsøg anvendes Lb. reuteri stamme 12002 til produktion af reuterin ved en 10 totrinsproces.

1. Til produktion af biomasse af Lb. reuteri udføres batchfermenteringer i en 15 liters Applikon-fermentor med en Applikon ADI 1020 styreenhed. Der dyrkes i modificeret MRS-bouillon, der pr. liter destilleret vand indeholder 10 pepton (Merck), 8 g kødekstrakt (Merck), 4 g gærekstrakt (Difco), 1,5 g natriumacetat, 2 g K2HP04, 1,2 g Tween 80 15 (Sigma), 2 g (NH4)2 HQI^O,, 0,2 g MgS04 (7^10), 0,02 g Mn$0 og 0,25 g anti-skummemiddel (pH 4,3).

Efter autoklavering af mediet ved 121 °C i 15 minutter tilsættes steril filtreret glucose (Sigma) i en mængde på 60 mM. Fermenteren podes med en suspension af Lb. reuteri 12002, der er tilberedt som beskrevet i eksempel 8. Det effektive fermentervolumen er 14 20 1, omrøringshastigheden 250 omdr./min., og temperaturen 37 °C. pH overvåges og holdes ved tilsætning af 6 N NaOH eller 3 N H3P04. Der skylles med 60 ml/min. sterilfiltreret nitrogen så anaerobe forhold opretholdes. Cellerne høstes efter 20 timer ved centrifugering (7000 G, 10 min., 4 °C), og der vaskes to gange med phosphatbuffer (pH 7,2, 50 mM).

DK 173239 B1 17 2. De vaskede celler inkuberes i en vandig glycerolopløsning (250 mM glycerol) under anaerobe forhold (skylning med nitrogen). Den resulterende supernatant steriliseres ved filtrering og lyofiliseres derefter til formindsket volumen. Det lyofiliserede reuterin opbevares ved 4 °C og kan holde sig i mere end et år uden tab af aktivitet.

Claims (18)

1. Fremgangsmåde til desinficering af udstyr i levnedsmiddelvirksomheder, fortrinsvis udstyr, der anvendes ved slagtning og kødforarbejdning, kendetegnet ved, at et vandigt medium indeholdende reuterin påføres på overfladen af udstyret.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vandige medium påføres mindst én gang dagligt.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vandige medium påføres i det mindste umiddelbart efter (daglig) rengøring af udstyret.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vandige medium påføres i 10 forbindelse med arbejdspauser eller holdskift.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det vandige medium påføres 1 til 24 gange dagligt med et tidsinterval på 1 til 24 timer eller for hvert n antal emner, der behandles, hvor n er lig 10 til 10.000.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet påføres som spray (tåge), 15 væskefilm eller stråle.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet påføres med eller uden efterfølgende aftørring inden udstyret anvendes igen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet yderligere indeholder glycerol og en reuterinproducerende bakteriestamme.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at mediet desuden indeholder glucose i en koncentration på s 20 mM. 19 DK 173239 B1

10. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet yderligere indeholder mindst en af følgende bestanddele: fortykkelsesmiddel, tensid eller mælkesyre.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mediet indeholder 1-500 AU reuterin pr. ml.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at mediet indeholder 105 til 107 CFU/ml reuterinproducerende bakteriestamme.

13. Middel til desinficering af udstyr i levnedsmiddelvirksomheder, fortrinsvis udstyr, der anvendes ved slagtning eller kødforarbejdning, kendetegnet ved, at det omfatter et vandigt medium indeholdende reuterin.

14. Middel ifølge krav 13, kendetegnet ved, at mediet yderligere indeholder glycerol og en reuterinproducerende bakteriestamme.

15. Middel ifølge krav 13, kendetegnet ved, at mediet indeholder 1-500 AU reuterin pr. ml.

16. Middel ifølge krav 14, kendetegnet ved, at mediet indeholder 105 til 107 CFU/ml 15 reuterinproducerende bakteriestamme.

17. Middel ifølge krav 14, kendetegnet ved, at mediet desuden indeholder glucose i en koncentration på s 20 mM.

18. Middel ifølge krav 13, kendetegnet ved, at mediet yderligere indeholder mindst en af følgende bestanddele: fortykkelsesmiddel, tensid eller mælkesyre.