DK173112B1 - N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoyl - Google Patents

N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoyl Download PDF

Info

Publication number
DK173112B1
DK173112B1 DK198305925A DK592583A DK173112B1 DK 173112 B1 DK173112 B1 DK 173112B1 DK 198305925 A DK198305925 A DK 198305925A DK 592583 A DK592583 A DK 592583A DK 173112 B1 DK173112 B1 DK 173112B1
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
carbamoylsarcosine
dsm
amidohydrolase
sarcosine
determination
Prior art date
Application number
DK198305925A
Other languages
English (en)
Other versions
DK592583D0 (da
DK592583A (da
Inventor
Joachim Siedel
Joachim Ziegenhorn
Rolf Deeg
Albert Roeder
Helmgard Gauhl
Original Assignee
Roche Diagnostics Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics Gmbh filed Critical Roche Diagnostics Gmbh
Publication of DK592583D0 publication Critical patent/DK592583D0/da
Publication of DK592583A publication Critical patent/DK592583A/da
Application granted granted Critical
Publication of DK173112B1 publication Critical patent/DK173112B1/da

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/70—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving creatine or creatinine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/98—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/815—Enzyme separation or purification by sorption
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/83—Arthrobacter
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/859—Micrococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)

Description

DK 173112 B1
JT
Den foreliggende opfindelse angår N-carbamoylsarcosin-amidohy-• drolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangs måde til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin og et reagens til anvendelse ved bestemmelsen.
Det har vist sig, at mikroorganismer har evnen til at omdanne ^ creatinin til N-carbamoylsarcosin. Til udforskningen af denne nedbrydningsvej ville en specifik metode til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin være ønskelig. Endvidere kunne en sådan fremgangsmåde også anvendes til bestemmelse af creatinin selv ved hjælp af forudgående omdannelse til N-carbamoylsarcosin.
Opfindelsen tager derfor sigte på at muliggøre en specifik bestemmelse af N-carbamoylsarcosin.
10
Denne opgave løses ved hjælp af en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin, der er ejendommelig ved, at man med N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase ifølge opfindelsen omdanner N-carbamoyl-sarcosinet ti! sarcosin i en prøveopløsning og bestemmer sidstnævnte.
15 Opfindelsen angår derfor også det hidtil ukendte enzym N-car-bamoy1sarcosin-amidohydrolase, forkortet CSH, som specifikt danner sarcosin udfra N-carbamoylsarcosin under fraspaltning af CO2 og NH3 i overensstemmelse med følgende reaktionsskema: N-carbamoylsarcosin N-carbamoylsarcosin- Sarcosin amidohydrolase 20 . _ λ
/NHl // ... s o-C 9 0H " 'OH
\ I +H*° V
-ch2 -CH2 I I + co2 ch3 ch3 2 f + NHj og som opnås udfra en af følgende mikroorganismer: Arthro-bacter DSM 2563, DSM 2564, Micrococcus spec. DSM 2565 eller Moraxella DSM 2562, der dyrkes på N-N-methyl-hydantoin.
2 DK 173112 B1
De navnte mikroorganismer er blevet deponeret i overensstemmelse med Budapest-traktaten.
Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen dannede saroosin 5 kan bestemmes ved hjælp af kendte metoder, eksempelvis under anvendelse af sarcosin-dehydrogenase og måling af dannet NADH eller ved hjælp af sarcosinoxidase og måling af dannet H202 eller forbrugt 02. Fortrinsvis gennemføres bestemmelsen under ^ anvendelse af sarcosin-oxidase og måling af dannet H202. Sidst- 10 nævnte kan bestemmes såvel titrimetrisk som potentiometrisk, polarografisk og kolorimetrisk samt enzymatisk. Fortrinsvis anvendes herunder de enzymatiske metoder under anvendelse af katalase eller peroxidase (POD), da disse er yderst specifikke og pålidelige. Bestemmelsen ved hjælp af katalase 15 foregår i nærværelse af Ø-diketoner, såsom eksempelvis acetylacetone og methanol eller ethanol eller methylenglycol. Bestemmelsen med peroxidase foregår i nærværelse af en eller ^ flere chromogener. Eksempler på egnede chromogener er 2,2'- j aminobenzthiazolinsulfonsyre (ABTS), indikatorsystemet ifølge j 20 Trinder (Ann. Clin. Biochem. 6 (1969), 24-27),hvorved phenol eller en anden aromatisk alkohol eller en aromatisk amin oxi-dativt kobles med 4-aminophenazon eller et 4-aminophenazon-derivat til dannelse af et farvestof. Egnede aromatiske alkoholer eller aminer er eksempelvis p-chlorphenol, aminophenoler, 25 naphthol og derivater deraf, naphthylamin og derivater deraf, aminoquinoliner, hydroxyquinoliner, dihydroxyphenyleddikesyre og lignende. I stedet for 4-aminophenazon kan anvendes = 4-aminophenazon-derivat, phenylendiaminsulfonsyre, methylbenzo-thiazolonhydrazon (MBTH), sulfoneret methylbenzothiazolonhy-30 drazon (S-MBTH) og derivater deraf.
Bestemmelsen ifølge opfindelsen af N-carbamoyl-sarcosin foregår hensigtsmæssigt i pufret opløsning. Egnede pH-værdier ligger mellem ca. 6 og 9.
- 35 ~ Opfindelsen angår fremdeles en fremgangsmåde, til udvinding af ™ N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase ifølge krav 1, der er ejendommelig ved π
TI
; 11 ; 11
f TI
; m 3 DK 173112 B1 at man oplukker en på N-methylhydantoin dyrket mikroorganisme med et til oparbejdningen lønnende indhold af N-carbamoylsar-cosin-amidohydrolase, satter 0,3 til 0,5 vagt* polyethy1enimin til den for uopløselige materialer befriede klare ovenstående vaske, fjerner det dannede bundfald og fra den ovenstående 5 vaske udfalder og isolerer N-carbamoylsarcosIn-amidohydrolasen ved fortynding med H2O.
Opfindelsen angår endvidere et reagens til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin, der er ejendommeligt ved, at det indeholder N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase ifølge krav 1, sarcosinoxidase, et system til påvisning af H202 samt puffer, pH 6 til 9, og eventuelt 10 et overfladeaktivt middel.
Til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin kan også benyttes sarcosindehydrogenase og NAD.
Følgende egenskaber blev bestemt for enzymet N-carbamoylsarco-sin-amidohydrolase (CSH):
Stabilitet 15
Stabilitetsoptimum: pH 6 til 6,5; gode stabilitetsegenskaber foreligger i phosphatpuffer, bedste stabilitet opnås ved tilsætning af glycerol.
Opvarmning af CSH 20 mg/ml, i" 50% glycerol, pH 6,5, i 20 minutter: 20
Restaktivitet %: 40°C/100 50°C/ 48 60°C/ 24 80°C/ 0
'W
4 DK 173112 B1
Ved +4°C i 50% glycerol er aktivitetsbevarelsen efter 4 uger 100%.
Specificitet 5
Creatinin, creatin, sarcosin, N-methylhydantoin og hydantoin omsættes ikke.
Michaelis-konstanter for N-carbamoylsarcosin ved 25°Cf pH 10 8,0, 0,1 M/l trispuffer: 3,3 til 3,8 x 10 ^M.
I 0,1 M/l K4P2°7_PU^fer, pH 8,5: 5,0 til 7,1 x 10 ^ M.
pH-optimum 15 pH-optimununet afhænger af puf fermaterialet. I tilfælde af K4P207-puffer blev det bestemt til 8,5, og i tilfælde af trispuffer og hepespuffer blev det bestemt til 8,0.
20 Molekylvægt MG = ca. 40.000. Bestemmelse ved hjælp af plade-elektroforese.
Inhibitorer 25 5 μg merthiolat/ml hæmmer til 95%. i
Ligevægt 30 Ligevægten blev bestemt med 0,5 U/ml CSH i 90 mmol/1 tris, pH 8,0: N-carbamoylsarcosin __ 12,5 mM > 1 χ 104
; sarcosin <0,001 mM
3 5
Udvindingen af CSH sker ved dyrkning af en egnet mikroorganisme = °9 udvinding af enzymet fra biomassen eller dyrkningsvæsken.
? 1 - "9 n <r·.
5 DK 173112 B1
Mikroorganismer af slægterne Arthrobacter og Moraxella viser sig at være særlig egnede. De bedste resultater blev opnået med Arthrobacter DSM 2563, DSM 2564, Micrococcus spec. DSM 2565 eller Moraxella DSM 2562.
5
Mikroorganismerne kan anvendes i form af en cellesuspension til bestemmelsesmetoden ifølge fremgangsmåden. Fortrinsvis anvender man imidlertid et renset enzympræparat til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Til dettes fremstilling oplukker 10 man en på N-methylhydantoin dyrket mikroorganisme med et til oparbejdningen lønnende indhold af N-carbamoylsarcosin-amido-hydrolase og adskiller fra uopløseligt materiale. Til oplukningen egner sig de sædvanlige metoder, såsom højtryksdispersion, ultralyd, desintegrationsmølle eller lysozym-tilsætning.
15 Den opnåede klare ekstrakt tilsættes 0,3 til 0,5 vægt% poly- ethylenimin, det dannede bundfald fraskilles, og den ovenstående væske fortyndes med vand, hvorved enzymet udfældes og kan fraskilles.
20 Til finrensningen kan det således udvundne enzym underkastes de sædvanlige metoder til enzymfinrensning. Fortrinsvis bliver det som ovenfor fremstillede enzympræparat opløst i egnede puffere og fraktioneret mellem 1,3 og 2,2 M ammoniumsulfat. ved hjælp af kromatografi over phenyl-"sepharose·" og DE-52-25 cellulose samt gelf iltrering over "Sephacry1"· S 200 opnår man et for fremmede aktiviteter frit præparat med en specifik aktivitet på 2 U/mg protein i et udbytte på ca. 70*, regnet i forhold til den mængde, der forelå i celleekstrakten. Det således udvundne enzym kan uden aktivitetstab opbevares i 30 50% glycerol/vand-opløsning, pH 6,5, ved +4°C i mindst et halvt år.
Opfindelsen muliggør specifik bestemmelse af N-carbamoylsar-cosin. En sådan metode er et vigtigt bidrag, især til opklar-35 ing af creatinin-stofskiftet. I forbindelse med omdannelsen af creatinin til N-carbamoylsarcosin kan fremgangsmåden ifølge opfindelsen også anvendes direkte til creatininbestemmelsen.
6 DK 173112 B1
De følgende eksempler belyser opfindelsen yderligere.
Eksempel 1 5 Bestemmelse af N-carbamoylsarcosin Princip;
CSH
N-carbamoylsarcosin + H20 -> sarcosin + CO2 + nh^ 10
Sarcosin + 02 + H20 Sarc-01^ giyCin + formaldehyd + H202 H202 + 4-aminophenazon Peroxidase_^ farvestof + 2 H20 + phenol-derivat.
15
Reagens: 0,1 mol/1 trispuffer, pH 8 0,2 mmol/1 4-aminophenazon j FarvedannelsessYstem 20 2,0 mmol/1 tribromhydroxybenzoat ) 0,4¾ "Triton·" X-100 (overfladeaktivt middel som opløselig- hedsforbedrer) 2,0 U/ml carbamoylsarcosin-amidohydrolase j 2,0 U/ml sarcosin-oxidase j 25 2,0 U/ml POD.
Prøve;
Vandig opløsning med 0-35,6 μπιοΐ/ΐ N-carbamoylsarcosin.
30 v Forsøqsmænqde: 2 ml reagens 100 μΐ prøve.
35 i s a s ΤΪ 7 DK 173112 B1
Forsøqsqennemførelse:
Prøve og reagens blandes, lades henstå i 30 minutter ved stuetemperatur, overføres til kuvetter, og prøvens ekstinktion 5 aflæses mod reagensbiindværdi ved λ = 546 nm.
Resultat;
Det viser sig, at ekstinktionen afhænger lineært af N-carba-moylsarcosinkoncentrationen i prøven.
Eksempel 2.
A) 10 ml af et medium indeholdende N-methyl-hydantoin (sammen-, _ sætning se nedenfor) podes med Arthrobacter DSM 2563 fra skråagar af samme sammensætning, og rystes i 100 ml Erlen-meyerkolber i ca. 24 timer ved 28eC og 160 omdrejninger pr. minut (1. kultur). Derpå bliver 100 ml af nævnte N-methyl-hydantoinholdige medium podet med 1 ml af den 1.
20 kultur (ca. 1%) og rystes i 500 ml Erlenmeyerkolber i ca.
24 timer ved 28eC og 160 omdrejninger pr. minut (2. kultur).
5 af disse portioner fra det 2. dyrkningstrin (500 ml) 25 overføres til 50 1 medium af samme sammensætning og vide- refermenteres i en fermenteringsbeholder, der er udrustet med to bladomrørere/skvulpeplader, med 1000 1 luft/time og 500 omdrejninger pr. minut ved 28eC.
30 Efter 10 til 12 timer begynder dannelsen af de N-methyl-hydan-toin-nedbrydende enzymer, der ophører ved afslutningen af den logarithmiske vækstfase. Efter 18 dyrkningstimer finder høsten sted. Mikroorganismerne fraskilles i en kølecentrifuge, biomassen vaskes derpå i 0,1 M phosphatpuffer, pH 8, centri-35 fugeres på ny og nedfryses. På denne måde udvindes ca. 800 g biomasse fra 50 1 kulturvæske.
6 DK 173112 B1
Mediumsammensatninq t
Pr. liter: 7 g Na2HPC>4 x 2 H20, 3 g KH2PO4/ 0,5 9 M9S04 x 7 H20, 10 g N-methyl-hydantoin {sterilfiltreret), 5 5 g gsrekstrakt/Difco, 1 ml sporopløsning 1*, 0,1 ml sporopløsning 2**, 1 ml vitaminopløsning*** {sterilf iltreret).
*Sporoplosning 1: 10 100 mg MnCl2 x 4 H20, 100 g FeCl3 x 6 HjO, 100 mg CaCl2 x 2 H20 opløst og steriliseret i 100 ml to gange destilleret vand. 1 ml af denne opløsning pr. liter medium.
15 **Sporoplosning 2; 1 mg CuCl2 x 2 H20, 1 mg til Cl2f 1 mg (NH4)2MoC>4, 1 mg CoCl2 x 6 H20 opløst og steriliseret i 1000 ml to gange destilleret : vand. 0,1 ml af denne opløsning pr. liter medium.
20 j * **Vitaminopløsninq: 0,1 mg Biotin, 0,1 mg pyridoxol, 0,1 mg pyridoxamin x HCl, 0,1 mg p-aminobenzoesyre, 1,0 mg riboflavin, 1,0 mg nicotina-25 mid, 1,0 mg folinsyre, 10,0 mg thiamin x HCl oplast og steril-filtreret i 100 ml to gange destilleret vand. 1 ml af denne opløsning pr. liter medium.
B) De vaskede celler (1 kg tørvægt) optages i 50 mM/1 kalium-30 phosphat-puffer, pH 6,5, pr. 15 liter og oplukkes ved ca.
600 x 105 Pa i højtryksdispersionen. Celleresten fraskil les. Den klare ekstrakt indeholder CSH-mængden. Den tilsættes 4% 10%’ig polyethylenimin (6-35-)opløsning, pH 6,5.
Efter fraskillelse af nucleinsyrerne udfældes enzymet ved 35 fortynding med vand. Det ringe proteinbundfald optages i 50 mM/1 kaliumphosphat-puffer, pH 6,5, og fraktioneres " mellem 1,3 og 2,2 M/l med ammoniumsulfat. Ved hjælp af på- rm m m 11 -ΓΒ3 9 DK 173112 B1 følgende hydrofob kromatografi på phenyl-"sepharose·" fjernes sarcosinoxidase fuldstændigt, I de aftagende gradienter 20 mM/1 kaliumphosphat-puffer, 5 pH 6,5, der indeholder 1,0 M/l ammoniumsulfat, indtil 20 mM/1 kaliumphosphat-puffer, pH 6,5, elueres CSH ved ca. 0,4 M/l ammoniumsulfat.
jø Eluatet dialyseres koldt mod 20 mM/1 kaliumphosphat-puffer og påføres på en med samme puffer ækvilibreret søjle med DE-52-cellulose. CSH-mængden elueres ved hjælp af en stigende gradient med ovennævnte puffer mellem 50 og 500 mM/1 NaCl. Eluatet koncentreres ved hjælp af ultrafiltrering.
15
Efter den påfølgende gelfiltrering i 0,1 M kaliumphosphat-puffer, pH 6,5, {"Sephacryl*”-S-200) opnår man CSH-mængden i 53% udbytte og med en specifik aktivitet på 2,1 U/mg.
Enzymet kan uden tab opbevares i 50% glycerol-opløsning, 20 pH 6,5, ved +4°C i 6 måneder.
Enkeltheder er vist i den efterfølgende tabel.
FraskiHelse og rensning af CSH fra 1 kg tørmasse Arthrobacter 25
Trin Protein CSH U/mg Udbytte i g KU %
Celleoplukning Λ (ekstrakt) 200 28 0,14 100 30
Cellefragmenter = tømte celler - 0,5 - 1,7
Celleekstrakt + G-35, 2. bundfald 54 27 0,50 96 1,3 - 2,2 M AS/ bundfald 40 24 0,60 86 35
Phenylsepharose- . eluat 13,8 22 1,60 79 DE-52-cellulose- eluat 10 18 1,80 64
Slutpræparat efter gelfiltrering 7,1 15 2,10 53 10 DK 173112 B1 r
Eksempel 3.
Fra en kulturmangde af Moraxella DSM 2562 (BMTU 2193-1), der er dyrket på N-methylhydantoin, således som beskrevet i ek-5 sempel 2 A), udvindes 180 g tørmasse. CSH-mængden renses på lignende måde som i eksempel 1 B). Imidlertid bliver cellerne i stedet for i højtryksdispersionen lyseret med 0,05% lysozym (g/g tørmasse) ved pH 7,0.
10 Isolering af CSH fra 180 g tørmasse Moraxella
Trin Protein CSH U/mg Udbytte i g KU % 15 Celle-lyse-ekstrakt 28,4 3,5 0,12 100 1 Cellefragmenter - - - ! Celleekstrakt + G-35, ! 2. bundfald 7,7 3,4 0,44 97 1,25 - 2,1 M AS/ bundfald 5,7 3,3 0,58 94 2 0
Phenylsepharose- eluat 2,0 3,3 1,65 94 DE-52-cellulose- eluat 1,2 2,5 2,1 71
Slutpræparat efter gelfiltrering 1,2 2,4 2,0 68 _ 25______________
Eksempel 4.
30 Bestemmelse af CSH med o-dianisidin.
Z Princip:
”5 CSH
:f N-carbamoylsarcosin + H20 -sarcosin + C02 + NH^ 35
* 1 OD
Sarcosin + 02 + H20 -1f Glycin + formaldehyd + H202 - 1*1 H2°2 + °~dianisidin > farvestof + 2 H20 1*1 ri fm : m i -ΐϊ· ; 1¾ _____ 11 DK 173112 B1
Opløsninger: 1. tris-puffer, 0,1 mol/lj pH 8,0 5 2. ortho-dianisidin-opløsning; 66 mg o-dianisidin-hydrochlo- rid opløses i 10 ml puffer (1).
3. Forsøgspuffer: 1,0 ml opløsning 2 pipetteres i 99 ml opløsning 1, og der blandes. Holdbar i 1 uge ved +4°C.
4. Peroxidase: 2 mg POD (Boehringer Mannheim’s katalog nr. BM
108090, renhedsgrad I) opløses i 1 ml H2O.
5. Sarcosin-oxidase: 100 U/ml renset Sarc-OD (urikase- og katalasefrit) opløses i HjO.
6. N-carbamoylsarcosin, 0,25 mol/1.
15 Prøve: Fortyndinger med kold 50 mmol/1 KPO^-puffer, pH 6,5. Udførelse; 2 “1 436 nm; 25°C; V « 2,00 ml; d = 1 cm; ε = 8,3 cm x μΐηοΐ x 1.
20
Pipettering i kuvetter__________________
Puffer (3) 1,80 ml POD (4) 0,01 ml
Sarc-OD (5) 0,05 ml 2 5 Carbamoylsarcosin____(_§J_______Qa_L° JP1__ blandes, der ventes i ca. 10 minutter, hvorpå der startes med prøve_________________________
Prøve__________________0,04 ml__„ der blandes, 10 minutter lades forløbe, og E/min. beregnes 3q ud fra den lineare fase__________
Beresnin9! AE/rcin. *,jLx,fortyMina . u/ml.
8,3 x benyttet ml prøve ' 35

Claims (8)

1. N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase, som specifikt danner 5 sarcosin udfra N-carbamoylsarcosin i overensstemmelse med følgende reaktionsskema: /NHi / rS^° O - C 9 °- "OH \ +H1° H\ N-CHj -CH2 I + CO, ch3 ch3 2 + nh3 15 ’ og som opnås udfra en af følgende mikroorganismer: Arthro- bacter DSM 2563, DSM 2564, Micrococcus spec. DSM 2565 eller * Moraxella DSM 2562, der dyrkes på N-N-methyl-hydantoin. 20
2. Fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin, kendetegnet ved, at man med N-carbamoylsarcosin- amidohydrolase ifølge krav 1 omdanner N-carbamoylsarcosinet til sarcosin i en prøve opløsning og bestemmer sidstnævnte. 5 25 Γ
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at sarcosinbestemmelsen gennemføres med sarcosinoxidase og måling af dannet H2O2 eller forbrugt O2. 3Q
4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at omsætningen gennemføres 1 pufret opløsning ved en pH-værdi mellem 6 og 9.
- 5. Fremgangsmåde til udvinding af N-carbamoylsarcosin-amido- - 35 hydrolase ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man oplukker en på N-methylhydantoin dyrket mikroorganisme med et til oparbejdningen lønnende indhold af N-carbamoylsarcosin- 11 'Hl 5 71 11 'TU DK 173112 B1 amidohydrolase, sætter 0,3 til 0,5 vægt% polyethylenimin til den for uopløselige materialer befriede klare ovenstående væske, fjerner det dannede bundfald og fra den ovenstående væske udfælder og isolerer N-carbamoylsarcosin-amidohydrolasen 5 ved fortynding med H20.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at man anvender en mikroorganisme af slægten Arthrobacter Micrococcus eller Moraxella. 10
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man anvender Arthrobacter DSM 2563, DSM 2564, Micrococcus spec. DSM 2565 eller Moraxella DSM 2562.
8. Reagens til bestemmelse af N-carbamoylsarcosin, kendetegnet ved, at det indeholder N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase ifølge krav 1, sarcosin-oxidase, et system til påvisning af H202 samt puffer, pH 6 til 9, og eventuelt et overfladeaktivt middel. 20 25 30 35
DK198305925A 1982-12-27 1983-12-22 N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoyl DK173112B1 (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3248145 1982-12-27
DE19823248145 DE3248145A1 (de) 1982-12-27 1982-12-27 Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK592583D0 DK592583D0 (da) 1983-12-22
DK592583A DK592583A (da) 1984-06-28
DK173112B1 true DK173112B1 (da) 2000-01-31

Family

ID=6181852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK198305925A DK173112B1 (da) 1982-12-27 1983-12-22 N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoyl

Country Status (13)

Country Link
US (1) US4645739A (da)
EP (1) EP0112571B1 (da)
JP (2) JPS59132891A (da)
AT (1) ATE28758T1 (da)
AU (1) AU545903B2 (da)
CA (1) CA1210675A (da)
DD (2) DD216255A5 (da)
DE (2) DE3248145A1 (da)
DK (1) DK173112B1 (da)
ES (1) ES528117A0 (da)
IE (1) IE56346B1 (da)
IL (1) IL70529A (da)
ZA (1) ZA839522B (da)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3406770A1 (de) * 1984-02-24 1985-08-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Nucleosidtriphosphat-abhaengige 1-methylhydantoinase und ihre verwendung
US4812399A (en) * 1986-04-21 1989-03-14 Eastman Kodak Company Analytical element and method for the determination of creatinine or creatine
DE3821077A1 (de) * 1988-02-12 1989-08-24 David Diagnostics Inc Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens
DE4029844A1 (de) * 1990-09-20 1992-03-26 Boehringer Mannheim Gmbh Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert
DE4103220A1 (de) * 1991-02-02 1992-08-06 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel
BR9600672A (pt) * 1996-03-08 1997-12-30 Dedini S A Administracao E Par Processo de hidrólise ácido de material lignocelulósico e reator de hidrólise

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2122255C3 (de) * 1971-05-05 1987-01-22 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin
US4039384A (en) * 1975-04-05 1977-08-02 Noda Institute For Scientific Research Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them
JPS603480B2 (ja) * 1980-11-10 1985-01-28 東洋紡績株式会社 クレアチニンおよびクレアチンの定量法
IT1137075B (it) * 1981-05-28 1986-09-03 Chemical Lab S R L Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione

Also Published As

Publication number Publication date
DE3372870D1 (en) 1987-09-10
DK592583D0 (da) 1983-12-22
IL70529A0 (en) 1984-03-30
AU2187083A (en) 1984-07-05
DK592583A (da) 1984-06-28
EP0112571B1 (de) 1987-08-05
US4645739A (en) 1987-02-24
IE832856L (en) 1984-06-27
IL70529A (en) 1987-10-20
DE3248145A1 (de) 1984-06-28
CA1210675A (en) 1986-09-02
ES8406541A1 (es) 1984-08-01
DD222631A5 (de) 1985-05-22
EP0112571A1 (de) 1984-07-04
JPH047673B2 (da) 1992-02-12
IE56346B1 (en) 1991-07-03
AU545903B2 (en) 1985-08-08
DD216255A5 (de) 1984-12-05
ATE28758T1 (de) 1987-08-15
JPS63102680A (ja) 1988-05-07
ZA839522B (en) 1984-09-26
JPS59132891A (ja) 1984-07-31
JPS639839B2 (da) 1988-03-02
ES528117A0 (es) 1984-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Racker [79] Alcohol dehydrogenase from baker's yeast: RCH2OH+ DPN+⇄ RCHO+ DPNH+ H+
US3907644A (en) Creatinine amidohydrolase composition and process for the determination of creatinine
Rafter et al. [127] Enzymatic preparation of DPNH and TPNH
JPH05192193A (ja) 非酵素的グリコシル化タンパク質の検定法
JPS60259185A (ja) グリセリンオキシダ−ゼの取得法
US4317878A (en) Test composition containing acidic uricase used for quantitative determination of uric acid in sample
DK173112B1 (da) N-carbamoylsarcosin-amidohydrolase og en fremgangsmåde til udvinding deraf, en fremgangsmåde til bestemmelse af N-carbamoyl
McDonald [63] Deoxyribonucleases
EP0199943A2 (en) Process for producing D-alpha-amino acids
US4186052A (en) NADH Peroxidase for hydrogen peroxide determination
US4657856A (en) Glutathione peroxidase, process for production thereof, method and composition for the quantitative determination of lipid peroxide
Hummel et al. Enzymatic determination of L-phenylalanine and phenylpyruvate with L-phenylalanine dehydrogenase
US4769323A (en) Method for fractional determination of aspartate aminotransferase isozymes, and composition therefor
Schräder et al. Purification and characterization of protein PC, a component of glycine reductase from Eubacterium acidaminophilum
EP0790302B1 (en) Novel hexokinase
JPH0117677B2 (da)
KR890004091B1 (ko) 과산화 수소를 형성하는 살코신 산화효소 및 그 제법
Goldiger et al. The pyruvate metabolism of sea urchin eggs during the process of cell division
EP0663405A1 (en) Catalase and production process thereof
CA1089384A (en) Protease inactivated alpha-amylase preparations
US5082770A (en) Method for quantitative determination of polyamines
Barlas et al. Synthesis of catalase T under anaerobic conditions in a mutant of Saccharomyces Cerevisiae
US4550079A (en) Determination of L(+)-tartrate or D(+)-malate with L(+)-tartrate dehydrogenase
EP0119332B1 (en) Novel pyranose oxidase processes for the production and use thereof and test compositions for use therein
JP2017158441A (ja) カタラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
B1 Patent granted (law 1993)
PBP Patent lapsed