DK169749B1 - DNA-fragment, der koder for et Pasteurella multocida-toxin eller for en immunogen subsekvens eller analog deraf, ekspressionsvektor, der omfatter DNA-fragmentet, fremgangsmåde til fremstilling af et Pasteurella multocida-toxin og anvendelse af Pasteurella multocida-toxinsekvens eller -analog til fremstilling af en vaccine - Google Patents

Description

DK 169749 B1

Den foreliggende opfindelse angår et DNA-fragment, der omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et Pasteurella multocida-toxin, der er nyttigt til fremstilling af toxi-net, fremgangsmåder til fremstilling og isolering af et L.

5 multocida-toxin og anvendelse af et P. multocida-toxin til fremstilling af en vaccine til immunisering af dyr mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin.

Atrofisk rhinitis er en sygdom, som i høj grad indvirker på 10 grisetrynens knoglestruktur. Det ætiologiske agens, som for nuværende anses for at være årsagen til væksthæmmende progressiv atrofisk rhinitis, er toxinogene (toxin-produceren-de) stammer af P. multocida, som koloniserer svins næsehule (Pedersen og Barfod, 1981, (ref. 1), Rutter og Rojas, 1982, 15 (ref. 2), Elling og Pedersen, 1985, (ref. 3), Pedersen et al., 1988 (ref. 4). Det er blevet vist, at næseslimhinden lettere koloniseres af P. multocida, når modstandskraften over for infektion er nedsat, som det fx er tilfældet, når grisene samtidig er inficeret med Bordetella bronchisepti-20 ca, eller når næseslimhinden eksponeres for et mildt kemisk irriterende stof (jf. Pedersen og Elling, 1984, (ref. 5)).

De patologiske manifestationer af P. multocida-infektioner kan tilskrives et toxin, der produceres af denne bakterie. Toxinet, som har en tilsyneladende molekylvægt på 143 kD og 25 en aktuel molekylvægt på 146,5 kD inducerer knogleresorption (osteolyse) af næsemuslingebenene og andre knoglestrukturer i næsehulen ved stimulering af osteoklast aktivitet i svinemuslingeben og forårsager nedsat osteoblasisk knogledannelse.

30 Sygdommen er af afgørende økonomisk betydning for svinepro-ducenter over hele verden, da den ud over de ovennævnte patologiske virkninger på næseknogler (og undertiden ansigtsknogler) forårsager en langsommere væksthastighed hos inficerede grise og som følge deraf højere produktionsomkost-35 ninger. Der har derfor været gjort forsøg på at reducere DK 169749 Bl 2 udbredelsen og betydningen af P. multocida-infektionen, fx ved produktion af SPF (specifik patogenfrie) svin via kejsersnit eller ved antibiotisk behandling af inficerede dyr eller profylaktisk vaccination.

5 Kendte vacciner til immunisering af dyr, først og fremmest svin, mod sygdomme, der tilskrives P. multocida-infektion, især atrofisk rhinitis, omfatter dræbte P. multocida-celler eventuelt kombineret med dræbte Bordetella bronchiseptica-celler (jf. EP 85 469) og/eller en inaktiveret (sædvanlig-10 vis ved varmebehandling eller tilsætning af formaldehyd) toxinholdig ekstrakt af toxinogene P. multocida. Vacciner af den sidstnævnte type er kommercielt tilgængelige fra Nordisk Droge & Kemikalie A/S, København, Danmark, under varemærket Atrinord®, såvel som fra Intervet International 15 BV, Boxmeer, Holland, linder varemærket Nobi-vacART®.

Nærværende opfindere antager, at en forbedret immunogen effekt i forhold til de kendte vaccinepræparater kan opnås ved anvendelse af et oprenset og passende modificeret to-xinpræparation til vaccinationsformål enten med henblik på 20 at erstatte de konventionelle vacciner eller som en bestanddel heraf.

Oprensningen af P. multocida-toxin er tidligere blevet beskrevet. Således beskriver Foged et al., 1987, (ref. 6) oprensningen af toxinet ved hjælp af kromatografi og polya-25 crylamidgelelektroforese. Det oprensede toxin anvendes alene til undersøgelse af dets toxiske og patologiske virkninger. Kamp et al., 1987, (ref. 7) beskriver ligeledes oprensning af P. multocida-toxinet med henblik på kliniske undersøgelser. De foreslår, at det oprensede toxin kan an-30 vendes som et antigen til fremstilling af specifikke antistoffer, der er nyttige til serologiske undersøgelser. Na-kai et al., 1984, (ref. 8) beskriver en metode til oprensning af P. multocida-toxinet ved hjælp af kromatografi og polyacrylamidgelelektroforese. De beskriver endvidere frem-35 stilling af polyklonale antistoffer rettet mod det oprense- 3 DK 169749 B1 de toxin, som de anvender til bestemmelse af det oprensede toxins renhed. Det foreslås, at antistofferne ydermere kan anvendes til undersøgelse af toxinets rolle i atrofisk rhinitis.

5 Ingen af disse publikationer foreslår anvendelsen af et oprenset toxin som en komponent i en vaccine til immunisering af dyr mod Pasteurella-infektion, og dette anses for at udgøre et nyt koncept.

I overensstemmelse hermed angår den foreliggende opfindelse 10 i ét aspekt et DNA-fragment, som koder for et Pasteurella multocida-toxin, eller en subsekvens eller analog deraf, som koder for en immunogen subsekvens eller analog af toxinet, hvilket toxin, subsekvens eller analog deraf er nyttig til fremstilling af en vaccine til immunisering af 15 et dyr, herunder et menneske, mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin, idet vaccinen omfatter en immunogent effektiv mængde af et rekombinant, immunogent, detoxificeret P.multocida-toxin eller en rekombinant, immunogen, detoxificeret P.multocida-20 toxinanalog sammen med en immunologisk acceptabel bærer eller et immunologisk acceptabelt vehikel.

Til fremstilling af de kendte vacciner dyrkes en toxinogen Pasteurella-stamme, og toxinet isoleres fra dyrkningsmediet eller fra en bakterieekstrakt efterfulgt af detoxifikation 25 ved fx termisk eller kemisk behandling. I sammenligning med denne fremgangsmåde har fremstilling af toxinet eller to-xinanalogen ved rekombinant-DNA-metoder en række fordele: det er muligt at fremstille toxinet eller toxinanalogen ved dyrkning af en non-patogen organisme, toxinet eller toxin-30 analogen kan produceres i højere mængder end de, der produceres af vildtype P. multocida-stammer, fx under anvendelse af en stærk promotor med henblik på at inducere et højt ekspressionsniveau af toxingenet eller under anvendelse af en højkopitalsvektor til kloning af toxingenet, og det er 35 muligt at producere toxinet eller toxinanalogen i en deto- 4 DK 169749 B1 xificeret form, fx ved at underkaste det gen, der koder for toxinet, behandling med et mutagen eller ved at deletere en del af nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller to-xinanalogen, substituere én eller flere nukleotider i se-5 kvensen, etc. Det rekombinante toxin eller den rekombinante toxinanalog kan anvendes i en i det væsentlige ren form i vaccinen ifølge opfindelsen, men kan tillige anvendes som en rå eller delvis oprenset præparation.

I nærværende sammenhæng angiver udtrykket "i det væsentlige 10 ren", at vaccinen er i det væsentlige fri for andre immuno-gent aktive komponenter, hvis tilstedeværelse kunne give anledning til uønskede immunreaktioner i de dyr, der immuniseres med vaccinen, og, hvad der er det væsentligste, at ingen andre komponenter af de mikroorganismer, der produce-15 rer toxinet eller toxinanalogen såsom cellerester eller cellulære proteiner bortset fra toxinet eller toxinanalogen selv eller et protein eller polypeptid, hvortil toxinet eller toxinanalogen er fusioneret (vide nedenfor), er til stede i vaccinepræparationen. En høj renhed af det detoxi-20 ficerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog anses for at resultere i en høj antitoxinrespons i forbindelse med immunisering med vaccinen ifølge opfindelsen, hvorfor en lavere dosis af toxinet eller toxinanalogen kan være påkrævet til immuniseringsformål i forhold til den dosis, der 25 anvendes i rå eller delvis oprensede vaccinepræparationer.

Et i det væsentlige rent toxin eller en i det væsentlige ren toxinanalog har den yderligere fordel, at den nøjagtige koncentration deraf i en given vaccinepræparation er kendt, således at en eksakt dosis kan administreres til det pågæl-30 dende dyr.

Mikroorganismen, der producerer et osteolytisk toxin (dvs. et toxin, som er direkte eller indirekte involveret i knogleresorption) , hvorimod vaccinen giver immunitet, er fortrinsvis P. multocida. Andre mikroorganismer, som har vist 35 osteolytiske virkninger eller regulering af specifikke markører for knoglemetabolisme, er fx Actinomyces viscosus og 5 DK 169749 B1

Bordetella pertussis (Trummel et al., 1979, (ref. 9) og Price (ref. 10)).

Som følge af P. multocida-toxinets toxiske aktivitet er det ikke muligt at anvende det native toxin som en vaccine 5 ifølge opfindelsen. Det skal tværtimod være til stede i en detoxificeret form. Udtrykket "detoxificeret" betyder i denne sammenhæng, at den toxiske aktivitet er blevet fjernet fra i det mindste et tilstrækkeligt antal, men ikke nødvendigvis alle, toxinmolekyler, der findes i vaccinepræ-10 parationen, således at vaccinen, når den administreres til et dyr, der skal immuniseres, ikke vil give anledning til nogen uønskede virkninger i de pågældende dyr, idet den stadig fremkalder en tilfredsstillende immunrespons.

Detoxifikationen af P. multocida-toxinet eller -toxinanalo-15 gen kan udføres på en række forskellige måder. Det er således muligt at underkaste toxinet eller toxinanalogen en termisk behandling, idet toxinet vides at være varmelabilt og at blive inaktiveret (dvs. detoxificeret) ved 70°C. Endvidere kan toxinet eller toxinanalogen underkastes behand-20 ling med et kemikalie såsom formaldehyd, glutaraldehyd eller et egnet proteolytisk enzym, fx trypsin. Detoxifika-tion kan ligeledes tilvejebringes ved mutagenisering af det gen, der koder for P. multocida-toxinet eller -toxinanalogen, fx ved hjælp af ultraviolet bestråling, ionise-25 rende bestråling eller et kemisk mutagen såsom mitomycin C, 5-bromuracil, methylmethansulfonat, nitrogensennep eller en nitrofuran. Endvidere kan toxinet detoxificeres ved substituering, deletion, addition eller insertion af én eller flere aminosyrer i toxinet eller toxinanalogen eller ved 30 substituering, addition, deletion eller insertion af ét eller flere basepar i nukleotidsekvenser, der koder for toxinet eller toxinanalogen, eller ved en kombination af disse metoder.

I modsætning til detoxifikation ved termisk eller kemisk 35 behandling frembyder den genetiske fremgangsmåde den åben- 6 DK 169749 B1 lyse fordel, at den resulterer i en ensartet population af ligeligt detoxificerede molekyler.

Det skal bemærkes, at udtrykkene "substituering, deletion, addition eller insertion" skal defineres i forhold til to-5 xinproteinet i sin fulde længde. "Substituering" skal således opfattes som udskiftning af én eller flere aminosyrer eller nukleotider i den totale aminosyre- eller nukleotid-sekvens med én eller flere andre, "addition" skal opfattes som addition af én eller flere aminosyrer eller nukleotider 10 i den ene eller den anden ende af den totale aminosyre-eller nukleotidsekvens, "insertion" skal opfattes som introduktion af én eller flere aminosyrer eller nukleotider i den totale aminosyre- eller nukleotidsekvens, og "deletion" angiver, at én eller flere aminosyrer eller nukleoti-15 der er blevet deleteret fra den totale aminosyre- eller nukleotidsekvens enten i den ene eller den anden ende af sekvensen eller på et hvilket som helst egnet punkt inden for denne. Det er klart, at detoxifikation af toxinet eller toxinanalogen også kan fremkaldes ved en kombination af to 20 eller flere af disse fremgangsmåder.

Udtrykket "toxinanalog" betegner i nærværende sammenhæng et protein eller polypeptid af en lignende aminosyresammensæt-ning eller -sekvens som P. multocida-toxinet. idet variationer, som ikke har en negativ virkning på analogens immuno-25 genicitet, er indbefattet.

Det analoge polypeptid eller protein kan stamme fra en mikroorganisme tilhørende en anden art end P. multocida eller kan delvis eller fuldstændig være af syntetisk oprindelse.

Det analoge polypeptid eller protein kan ligeledes være ét, 30 som omfatter i det mindste én epitop, der er reaktiv med anti-P. multocida-toxinantistoffer påvist i prøver fra individer med atrofisk rhinitis, og/eller som giver anledning til dannelse af antistoffer, der er reaktive med det native P. multocida-toxin. Udtrykket dækker endvidere over en 7 DK 169749 B1 hvilken som helst immunogen subsekvens, funktionel ækvivalent eller derivat af toxinet.

Udtrykket "immunogen subsekvens" angiver en sekvens af toxinet i sin fulde længde, som oprindeligt er produceret i 5 en trunkeret form i forhold til toxinproteinet af fuld længde, eller som efter produktion af proteinet i fuld længde dannes fx ved proteolytisk spaltning deraf eller ved ekspression af en nukleotidsekvens, der er kortere end den totale nukleotidsekvens, der koder for P. multocida-toxin.

10 Den mindste subsekvens er en sådan, som i det mindste omfatter én relevant epitop af toxinet, dvs. en epitop, som giver anledning til en relevant immunrespons i et dyr, der er immuniseret med vaccinen ifølge opfindelsen.

Udtrykket "funktionel ækvivalent" dækker over alle immuno-15 gent aktive substanser, som er i stand til at fremkalde en immunrespons i dyr, hvortil en vaccine indeholdende ækvivalenten er blevet administreret, som svarer til den immunrespons, der fremkaldes af det detoxificerede P. multocida-toxin, idet den er i stand til at fremkalde immunitet mod 20 sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin. Den funktionelle ækvivalent kan være afledt af en mikroorganisme hørende til en anden art end P. multocida eller kan delvis eller fuldstændig være af syntetisk oprindelse. Det er klart, at lighederne mellem P. mul-25 tocida-toxinet og den funktionelle ækvivalent snarere er kvalitative end kvantitative, idet de snarere angår den funktionelle ækvivalents natur end dens aktivitetsniveau.

Udtrykket "derivat" betegner i denne sammenhæng en modifikation af toxinet såsom en modifikation frembragt ved sub-30 stituering, insertion, addition eller deletion af én eller flere aminosyrer eller nukleotider eller en kombination af disser metoder som defineret ovenfor eller ved fusion med et andet polypeptid.

8 DK 169749 B1 I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse et DNA-fragment, der omfatter en nukleotidsekvens, der koder for et P. multocida-toxin eller en P. multocida-toxinanalocr som defineret ovenfor. DNA-fragmentet kan fx anvendes i en 5 fremgangsmåde til fremstilling af toxinet eller toxinanalo-gen ved hjælp af rekombinant-DNA-metoder eller som et diagnostisk middel (dvs. en DNA-probe) .

Det toxin, der produceres af P. multocida (i det følgende lejlighedsvis forkortet til PMT), som, hvad der er bemærket 10 ovenfor, i almindelighed anses for at være den agens, der fremkalder porcin atrofisk rhinitis, er i den foreliggende litteratur angivet med forskellige betegnelser: "dermone-krotisk toxin", "osteolytisk toxin", "muslingebenatrofito-xin" og "varmelabilt exotoxin", men det fremgår, at disse 15 betegnelser dækker over det samme toxin, da aminosyresam-mensætningen, det isoelektriske punkt og de biologiske aktiviteter for de forskelligt betegnede toxiner udviser basale lighedspunkter, selv om mindre variationer i egenskaber for toxiner isoleret fra forskellige stammer af 20 multocida synes at eksistere. Den estimerede aminosyresam-mensætning for PMT (som deduceret fra DNA-sekvensen) er som vist i det følgende:

Ala påvises 76 gange = 5,91%

Cys påvises 8 gange = 0,62% 25 Asp påvises 71 gange = 5,53%

Glu påvises 100 gange = 7,78%

Phe påvises 69 gange = 5,37%

Gly påvises 71 gange = 5,53%

His påvises 19 gange = 1,48% 30 Ile påvises 92 gange = 7,16%

Lys påvises 70 gange = 5,45%

Leu påvises 127 gange = 9,88%

Met påvises 36 gange = 2,80%

Asn påvises 73 gange = 5,68% 35 Pro påvises 62 gange = 4,82%

Gin påvises 56 gange = 4,36% 9 DK 169749 B1

Arg påvises 58 gange = 4,51% -

Ser påvises 97 gange = 7,55%

Thr påvises 66 gange = 5,14%

Val påvises 63 gange = 4,90% 5 Trp påvises 18 gange = 1,40%

Tyr påvises 53 gange = 4,12%

Det totale antal aminosyreenheder er 1285, og det totale toxin har en molekylvægt på 146,5 kD.

Det rekombinante toxin eller den rekombinante toxinanalog 10 ifølge opfindelsen, der kan anvendes i en vaccine, kan mere specifikt være et toxin eller en toxinanalog, der kodes af en DNA-sekvens i det væsentlige som vist i figur 10 (a)-(j) eller en subsekvens deraf, der koder for en immunogen sub-sekvens af toxinet eller toxinanalogen. Det skal bemærkes, 15 at aminosyresekvensen, der er afledt fra DNA-sekvensen, ligeledes er vist i figur 10 (a)-(j) over DNA-sekvensen. En egnet analog kan være én, der har en DNA-sekvens, som afviger fra det native toxins DNA-sekvens i ét eller flere basepar, og som kan være afledt ved substituering af én 20 eller flere nukleotider i toxin-DNA-sekvensen, hvilket enten giver anledning til dannelse af den samme aminosyre-sekvens, men hvor nukleotidsubstitutionerne gør sekvensen konform med kodonanvendelsen i den mikroorganisme, hvori sekvensen er indsat, eller som resulterer i en noget afvi-25 gende aminosyresekvens, som imidlertid funktionelt er lig med det native toxins aminosyresekvens.

Ud over toxinet eller toxinanalogen som defineret ovenfor omfatter en vaccine fremstillet ifølge opfindelsen ligeledes en immunologisk acceptabel bærer eller et immunolo-30 gisk acceptabelt vehikel. Dette vehikel kan være et hvilken som helst vehikel, der sædvanligvis anvendes i fremstillingen af vacciner, fx et fortyndingsmiddel såsom isotonisk saltvand, suspensionsmidler, etc. Vaccinen kan fremstilles ved blanding af en immunogent effektiv mængde af toxinet 35 eller toxinanalogen med vehiklet i en mængde, der resul- 10 DK 169749 B1 terer i den ønskede koncentration af toxinet eller toxin-analogen i vaccinepræparationen. Uanset at mængden af toxin eller toxinanalog pr. enhedsdosis af vaccinen vil være forskellig afhængig af alderen af de dyr, der skal immuni-5 seres, (fx afhængig af hvorvidt søer eller smågrise skal immuniseres mod P. multocida) administrationsvejen og -måden, og immunogeniciteten af det pågældende toxin, der findes i vaccinen, anses en egnet mængde af toxin eller toxinanalog at ligge inden for området 0,1-500 pr. dosis 10 af vaccinen.

Vaccinen kan endvidere omfatte en adjuvans med henblik på at forøge vaccinepræparationens immunogenicitet. Adjuvansen kan udvælges blandt Freund7s komplette eller inkomplette adjuvans, aluminiumhydroxid, Bordetella pertussis, et sa-15 ponin, et muramyldipeptid, et iscom (immunstimulerende kom-plex; jf. fx EP 109 942) og en olie såsom en vegetabilsk olie, fx jordnøddeolie, eller en mineralsk olie, fx silico-neolie.

Det kan i nogle tilfælde være fordelagtigt at koble toxinet 20 eller toxinanalogen til en bærer, især en makromolekylær bærer. Bæreren er sædvanligvis en polymer, hvortil toxinet bindes ved hydrofob non-kovalent interaktion såsom en plastic, fx polystyren, eller en polymer, hvortil toxinet bindes kovalent såsom et polysaccharid, eller et polypeptid, 25 fx bovint serumalbumin, ægalbumin eller keyhole-limpet-hæ-mocyanin. Bæreren er fortrinsvis non-toxisk eller non-al-lergen. Toxinet eller toxinanalogen kan kobles multivalent til den makromolekylære bærer, da dette resulterer i en forøget immunogenicitet af vaccinepræparationen. Det anta-30 ges ligeledes, at toxinet eller toxinanalogen kan præsenteres i multivalent form ved polymerisering af toxinet eller af toxinanalogen med sig selv.

I en særlig udførelsesform af vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse fusioneres toxinet eller toxinanalogen 35 som defineret ovenfor til et andet polypeptid. Metoder til 11 DK 169749 B1 fremstilling af fusionerede polypeptider er kendte fra fx Casadaban og Cohen, 1980, (ref. 30). Alternativt kan fusionen tilvejebringes ved fusion af den nukleotidsekvens, der koder for toxinet, til en nukleotidsekvens, der koder for 5 et andet polypeptid, således at den fusionerede nukleotidsekvens, når den indsættes i en hensigtsmæssig vektor, udtrykkes som et fusionspolypeptid ved transformation af vektoren til en egnet mikroorganisme og dyrkning af mikroorganismen under betingelser, der er gunstige for ekspression 10 af den fusionerede sekvens. Polypeptidet, hvortil toxinet er fusioneret, kan fx være et bærerpolypeptid som angivet ovenfor, lysozym eller et andet immunogent peptid såsom et Ty-protein fra Saccharomvces cerevisiae. protein A fra Staphylococcus aureus. Hepatitis B-core-antigen, etc.

15 Det antages ligeledes, at vaccinen kan være i form at en tablet, pille eller kapsel egnet til oral administration, da der foreligger tegn på, at immunogener kan absorberes gennem tarmvæggen og stimulere B-lymfocytter, som derefter migrerer til lokale epithelregioner, hvor de transformeres 20 til immungiobulin-producerende plasmaceller. En oral vaccine skal være forsynet med en enterisk coating med henblik på at beskytte toxinet eller toxinanalogen mod substanser i mavesaften, som kunne være ødelæggende for toxinet eller toxinanalogen, såsom pepsin. Den enteriske coating kan ud-25 vælges blandt shellak, celluloseacetatestere såsom cellu-loseacetatphthalat, hydroxypropylmethylcelluloseestere såsom hydroxypropylmethylcellulosephthalat, polyvinylace-tatestere såsom polyvinylacetatphthalat og polymerer af methacrylsyre og (meth)acrylsyreestere. Nyligt udviklede 3 0 fremgangsmåder til indkapslinger baseret på mikrokugler med en diameter på ca. 5-15 μπι er af særlig interesse, da sådanne partikler indeholdende en immunogen substans efter administration selektivt vil blive ført til Peyers's pletter og dermed fremkalde immunitet på slimhindeoverflader.

35 Stimulering af en immunrespons på luftvejsslimhindeoverflader kan ligeledes fremkaldes ved intranasale immuniseringer. (Mestecky, 1987, (ref. 12)).

DK 169749 Bl 12 DNA-fragmentet ifølge opfindelsen, der omfatter den xiukleo-tidsekvens, der koder for toxinet eller toxinanalogen, kan afledes fra komplementært cDNA vundet ved fremstilling af et cDNA-bibliotek på grundlag af mRNA fra en toxinproduce-5 rende P. multocida-stamme ved hjælp af standardfremgangsmåder. Nukleotidsekvensen kan alternativt og fortrinsvis hidrøre fra et P. multocida-qenom ved screening for genom-sekvenser, der hybridiserer til en DNA-probe fremstillet på grundlag af den hele eller delvise aminosyresekvens for 10 toxinet i overensstemmelse med anerkendte fremgangsmåder eller ved etablering af et toxingenbibliotek og screening for toxinproducerende kloner ved hjælp af et toxinspecifikt antistof (vedrørende en mere detaljeret beskrivelse af denne fremgangsmåde se eksempel 4) . For så vidt angår PMT er 15 det ikke muligt at fremstille en DNA-probe på grundlag af dets N-terminale aminosyresekvens, da PMT er blokeret i den N-terminale ende og derfor ikke nedbrydes ved fremgangsmåder til sekventering af aminosyrer.

En anden rutine-screeningsmetode, som har vist sig vanske-20 ligt anvendelig i tilfælde af PMT, er screening for toxinproducerende kloner ved hjælp af et anti-PMT-serum. Ved anvendelse af serum fra en kanin, der gentagne gange var immuniseret med PMT, fandt nærværende opfindere ved hjælp af colony blot-metoden 5 E. coli-kloner i det genbibliotek, 25 der er beskrevet i eksempel 5. Yderligere undersøgelser af de nævnte 5 kloner viste imidlertid, at ingen af disse producerede PMT. Disse resultater viser vigtigheden af at udføre screeningen med anti-PMT-monoklonale antistoffer som beskrevet i eksempel 5.

30 Nukleotidsekvensen kan ligeledes hidrøre fra en bakterio-fag, der er infektiøs for P. multocida, dvs. en fag, som er blevet overført fra en bakteriestamme, der oprindeligt indeholdt sekvensen, til en anden stamme, som oprindeligt ikke indeholdt sekvensen, ved hjælp af bakteriofagtransfek-35 tion. Tilsvarende kan nukleotidsekvensen hidrøre fra et 13 DK 169749 B1 plasmid eller et andet genetisk element overført fra en stamme til en anden ved hjælp af konjugation, transformation eller lignende.

Nukleotidsekvensen, der koder for toxinet, kan endvidere 5 være en syntetisk sekvens, dvs. en sekvens fremstillet i overensstemmelse med standardfremgangsmåder, fx som beskrevet i Matthes et al., 1984, (ref. 13). Endelig kan nukleotidsekvensen være en sammensat genom- og syntetisk sekvens eller en sammensat cDNA- og syntetisk sekvens frem-10 stillet ved ligering af DNA-fragmenter af genom-, cDNA-eller syntetisk oprindelse (afhængig af hvad der er hensigtsmæssigt) , hvilke DNA-fragmenter hver indeholder en del af den nukleotidsekvens, der koder for toxinet, i overensstemmelse med anerkendte fremgangsmåder.

15 Ifølge den i det foranstående givne forklaring kan DNA- fragmentet være et fragment, som er modificeret ved substituering, addition, insertion eller deletion af én eller flere nukleotider i sekvensen med det formål at tilvejebringe en sekvens, som, når den udtrykkes, resulterer i 20 produktionen af et detoxificeret toxin eller en detoxifi-ceret toxinanalog.

Den foreliggende opfindelse angår især et DNA-fragment, som omfatter en nukleotidsekvens i det væsentlige som vist i figur 10 (a)-(j) eller en modifikation deraf som angivet 25 ovenfor. Sekvensen, der koder for toxinet i sin fulde længde, starter i den i figuren viste sekvens' position 219 (eller 213), medens sekvensens ende er ved position 4073.

Den i figur 10 (a)-(j) viste DNA-sekvens er blevet fastslået ved hjælp af velkendte metoder som beskrevet i ek-30 sempel 7 nedenfor.

DNA-fragmentet ifølge opfindelsen kan yderligere omfatte en nukleotidsekvens, der koder for et andet polypeptid, fusioneret med nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, med det formål at producere et fusioneret 14 DK 169749 B1 polypeptid som forklaret i det ovenstående. Et yderligere formål med fremstilling af et fusioneret polypeptid kan være at gøre oprensningen af toxinet lettere. I dette tilfælde kan den fusionerede sekvens indsættes i en hensigts-5 mæssig vektor, som transformeres til en egnet værtsmikroorganisme, som dyrkes linder betingelser, der sikrer ekspression af den fusionerede sekvens, hvorefter det fusionerede polypeptid udvindes fra kulturen ved at underkaste det fusionerede polypeptid affinitetskromatografi, der involverer 10 et antistof eller en hvilken som helst anden ligand, der reagerer med det andet polypeptid. Efter oprensning kan det andet polypeptid derefter fjernes, fx ved en egnet prote-olytisk spaltning efterfulgt af adskillelse af de to poly-peptider.

15 I et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en ekspressionsvektor, som er i stand til at replicere i en værtsmikroorganisme, og som indeholder et DNA-fragment som beskrevet i det ovenstående. Vektoren kan enten være en vektor, som er i stand til autonom replikation såsom et 20 plasmid, eller en vektor, som repliceres sammen med værtskromosomet såsom en bakteriofag. Specifikke eksempler på ekspressionsvektorer ifølge opfindelsen er plasmiderne pSPE A-R, som er beskrevet i eksempel 9 nedenfor og vist i figur 13.

25 I endnu et yderligere aspekt angår den foreliggende opfindelse en mikroorganisme, som er i stand til at udtrykke et DNA-fragment som defineret ovenfor, og som indeholder en vektor som beskrevet ovenfor. Mikroorganismen er fortrinsvis en bakterie, især en gram-negativ bakterie såsom EL.

30 coli.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et immunogent detoxificeret P. multocida-toxin eller en immunogen detoxificeret P. multocida-toxinanaloq. idet fremgangsmåden omfatter 15 DK 169749 B1 a) isolering af en nukleotidsekvens, der koder for P. multocida-toxinet eller -toxinanalogen, b) indsættelse af denne sekvens, eventuelt i en passende modificeret form, der resulterer i ekspression af det 5 detoxificerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog eller en subsekvens, der koder for en immunogen subsekvens af toxinet eller toxinanalogen, i en ekspressionsvektor, c) transformation af en egnet værtsmikroorganisme med den i trin b) fremstillede vektor, 10 d) dyrkning af mikroorganismen fremstillet i trin c) under betingelser, der er egnede til ekspression af toxinet eller toxinanalogen, e) høstning af toxinet eller toxinanalogen fra kulturen, og f) eventuelt udsættelse af toxinet for post-translationelle 15 modifikationer for at frembringe det detoxificerede toxin eller den detoxificerede toxinanalog.

I trin a) ifølge metoden kan nukleotidsekvensen fx isoleres ved etablering af et P. multocida-genbibliotek og screening for toxinpositive kloner i overensstemmelse med aner-20 kendte fremgangsmåder som angivet i det ovenstående og som beskrevet i detaljer i nedenstående eksempel 4.

I trin b) ifølge metoden kan de eventuelt udførte modifikationer af sekvensen udføres før eller efter, at sekvensen er blevet indsat i vektoren. Modifikationen kan omfatte 25 substituering, addition, insertion eller deletion af én eller flere nukleotider i sekvensen eller en kombination deraf som forklaret ovenfor.

Transformationen i trin c) ifølge metoden kan udføres ved hjælp af standardfremgangsmåder såsom fremgangsmåder be-30 skrevet i Maniatis et al., (ref. 14).

16 DK 169749 B1

Dyrkningen af værtsmikroorganismen i trin d) ifølge metoden kan udføres i et dyrkningsmedium, der anvendes konventionelt til fermenteringsformål, fx Luria Broth-medium, og under pH-, temperatur- og beluftningsbetingelser, etc, der 5 er egnede til den pågældende type af mikroorganismer fx som beskrevet i Maniatis et al., (ref. 14).

I trin d) ifølge metoden kan høstning af toxinet eller toxinanalogen udføres ved hjælp af velkendte fremgangsmåder såsom ved præcipitation, gelfiltrering, ionbytning eller 10 HPLC-omvendt fasekromatografi eller immunoaffinitetskroma-tografi.

Såfremt nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, ikke er modificeret i trin b) ifølge metoden for at opnå ekspression af det detoxificerede toxin eller 15 den detoxificerede toxinanalog, underkastes toxinet eller toxinanalogen post-translationelle modifikationer i trin f) ifølge metoden, fx termisk behandling, behandling med et kemikalie såsom formaldehyd, glutaraldehyd eller et egnet proteolytisk enzym, fx trypsin, eller substituering, addi-20 tion, insertion eller deletion af én eller flere aminosyrer i toxinet eller toxinanalogen.

Den foreliggende opfindelse angår også anvendelse af et rekombinant detoxificeret immunogent P. multocida-toxin eller en rekombinant detoxificeret immunogen P. multocida-25 toxinanalog til fremstilling af en vaccine til immunisering af et dyr, herunder et menneske, mod sygdomme forårsaget af mikroorganismer, der producerer et osteolytisk toxin. Toxinet eller toxinanalogen, der anvendes til immunisering, kan være et toxin eller en toxinanalog, der kodes for af DNA-30 sekvensen vist i figur 10 (a)-(j), eller en modifikation deraf som forklaret i det ovenstående.

Den foreliggende opfindelse beskrives yderligere i det følgende idet der henvises til figurerne, hvor 17 DK 169749 B1 figur 1 er en graf, der viser titrering af PMT i en kvantitativ sandwich-ELISA. Absorbansen ved 492 nm målt i denne ELISA er afsat mod PMT-koncentrationen. Den mindste detek-terbare koncentration af PMT er ca. 1 ng/ml svarende til 5 ca. 50 pg eller 0,35 fmol.

Figur 2 viser en SDS-PAGE af fraktioner fra den i eksempel 3 beskrevne affinitetskromatografi. Bane A: kultursuperna-tanten påsat søjlen, bane O: effluenten fra søjlen, bane E. det eluerede oprensede PMT og bane M: molekylvægtmarkørpro-10 teiner.

Figur 3 er en Western blot, der viser de i screeningsproceduren påviste 5 positive rekombinante E. coli-kloners PMT-produktion. Bane 1: SPE 301; banerne 2 og 3: SPE 308; bane 4: SPE 315; banerne 5 og 6: SPE 312; bane 7: SPE 311; 15 bane 8: oprenset PMT.

Figur 4 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmi-det pSPE 308 med en længde på 21,5 kb (kilobasepar). Det skraverede felt angiver P. multocida-DNA, det tæt skraverede felt angiver pint -genet, og det lodret skraverede felt 20 betegner plasmidet pUN121-DNA.

Figur 5 er et restiktionsenzymsspaltningskort for plasmidet pSPE 312 med en længde på 13,8 kb. Det skraverede felt betegner P. multocida-DNA. det tæt skraverede felt angiver pint-genet, og det lodret skraverede felt angiver plasmidet 25 pUN121-DNA.

Figur 6 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmi-der konstrueret ved enzymatisk spaltning af plasmidet pSPE 308. Det skraverede felt angiver P. multocida-DNA. det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede 30 felt angiver plasmidet pON121-DNA.

Figur 7 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plasmi-der konstrueret ved enzymatisk spaltning af plasmidet pSPE

18 DK 169749 B1 312. Det skraverede felt angiver P. multocida-DNA. det lodret skraverede felt angiver plasmidet pUN121-DNA, og det tæt skraverede felt angiver omt-genet.

Figur 8 er et Western blot, der viser PMT-produktion af 5 derivater af plasmideme pSPE 308 og pSPE 312. Bane 1: oprenset PMT; bane 2: pSPE 350; bane 3: pSPE 349; bane 4: pSPE 341; bane 5: pSPE 345; bane 6: pSPE 312; banerne 7 og 8: oprenset PMT. Plasmid pSPE 349 er identisk med plasmid pSPE 347 vist i figur 7.

10 Figur 9 er et restriktionsenzymsspaltningskort for pmt- genet. Det tæt skraverede felt angiver jomt-genet, det lodret skraverede felt angiver en sandsynlig promotor, og det skraverede felt angiver en sandsynlig terminator.

Figur 10 (a)-(j) viser DNA-sekvensen for pmt-genregionen og 15 aminosyresekvensen udledt fra DNA-sekvensen. Aminosyrerne er identificeret med enkeltbogstavskoder i overensstemmelse med konventionelle regler. Det har vist sig, at aminosyresekvensen starter ved position 213 eller 219.

Figur 11 er et restriktionsenzymsspaltningskort for plas-20 midet pSPE 525 med en længde på 7,7 kb. Det skraverede felt angiver P. multocida-DNA. det tæt skraverede felt angiver pmt-genet, og det lodret skraverede felt angiver pUN121-DNA.

Figur 12 er et restriktionsenzymsspaltningskort for eks-25 pressionsvektoren pSPE 481 med en længde på 8,25 kb. Det skraverede felt (til højre) angiver P. multocida-DNA. det tæt skraverede felt angiver pmt-genet. det skraverede felt (til venstre) angiver APL-DNA, det krydsskraverede felt angiver amp-genet. og det lodret skraverede felt angiver 30 replikationsorigin.

Figur 13 er et restriktionsenzymsspaltningskort for den toxA-kodende region. Udstrækningen af den kodende region på 19 DK 169749 B1 hvert plasmidderivat (pSPE A-R) er angivet (A-R) med bjælker. Skraverede bjælker: kodende region i korrekt læseramme; åbne bjælker: kodende region, som ikke er i ramme med 5'-delen af den kodende region.

5 Figur 14 er en Western blot, der viser genkendelse med et muse-anti-PMT-antiserum af PMT-derivater produceret af plasmiderne pSPE A-L. Banerne 7, 13, 14 og 15: forskellige stammer indeholdende hele pmt-genet; bane 1: derivat A; bane 2: derivat I; bane 3: derivat B; bane 4: derivat J; 10 bane 5: derivat L; banerne 6 og 9: derivat E; bane 8: derivat C; bane 10: derivat G; bane 11: derivat H; bane 12: derivat D. Den omtrentligt størrelse (i kilodalton) af fremtrædende fuld-længde-derivater og nedbrydningsprodukter er angivet.

15 Figur 15 er en graf, der viser fordelingen af relative ab-sorbanser (A/A0) ved PMT-ELISA af ekstrakter af non-cytopa-tiske (skraverede bjælker) og cytopatiske (udfyldte bjælker) kliniske isolater af P. multocida fortyndet 1:1 i PBS-T-BSA.

20 Figur 16 er en graf, der viser middeltal + SD for relative absorbanser (A/A0) for fortyndinger af ekstrakter af cytopatiske (udfyldte firkanter) og non-cytopatiske (åbne firkanter) kliniske isolater af P. multocida.

Figur 17 er en graf, der viser forekomsten af anti-PMT-an- 25 tistoffer i serumprøver fra anti-PMT-antistofnegative, inficerede og vaccinerede grise påvist ved kompetitiv ELISA. Grafen viser 50% blokerende titerværdier ved en absorbans på 492 nm.

.... negativ 30 ---- inficeret _ vaccineret 20 DK 169749 B1

Figur 18 viser kolonihybridisering af - P. multocida-isola-ter, idet der er testet 17 toxinpositive og 18 toxinnegati-ve stammer bestemt ved ELISA og EBL-celleundersøgelser for tilstedeværelsen af pint-genet.

\ 5 Figur 19 viser måling af toxiske aktiviteter i cellefrie sonikater af rekombinante E. coli-kloner. E.coli-stamme MT102 med pUN121 viste ingen cytopatisk effekt på EBL-cel-ler i fortyndingen 1:25 i PBS (a). Sonikater af E. coli SPE 312 (b) og toxinogenet P. multocida (NCTC 12178) (c) 10 fortyndet 1:3125 viste signifikante og identiske virkninger (80 X forstørrelse).

Figur 20 viser P. multocida-DNA'et. der flankerer pmt-genet (sort felt). Udstrækningen af insertionerne af plasmiderne pSPE 308, pSPE 312, pSPE 344, pLOA03 og pLOB03 er angivet.

15 Der er vist DNA indeholdt i de til blotting anvendte prober (skråtskraveret felt) og de fragmenter, der indeholder de to homologe sekvenser (lodret skraveret felt) .

Figur 21 viser et Southern blot af restriktionsenzymf ordøjet P. multocida-DNA. Probe: 2,4 kb Βσΐ 11 -EcoRI - fragment 20 af pLOB03. Banerne 10*-14* er en korttidseksponering af banerne 10-14.

Banerne 1-4: toxinogene P. multocida 45/87. Banerne 5-9: non-toxinogene P. multocida MH81P8. Bane 10: pSPE 308.

Bane 11: pLOA03. Bane 12: pLOA02. Bane 13: pSPE 312. bane 25 14: pLOB03.

Anvendte restriktionsenzymer: HindiII: banerne 1, 5, 10, 11, 12 og 13.

EcoRI: banerne 2, 6 og 14. Bglll: banerne 3 og 7. PvuII: banerne 4 og 8.

30 PstI: bane 9.

21 DK 169749 B1

Figur 22 viser et dot blot af 24 forskellige P. multocida-bakteriofag-genomer. Probe: pLOA03. Proben hybridiserer ikke med B2 og C5. A7: pSPE 308; B7: pSPE 312, C7: pLOA03 og D7: pLOB03 er positive kontroller.

5 EKSEMPEL 1

Fremstilling af monoklonale antistoffer mod P. multocida-toxin

Immunisering P. multocida-toxin (PMT) blev oprenset som beskrevet af 10 Foged et al. (ref. 6), dvs. ved 50% (NH4)2S04-præcipitering af en cellefri ekstrakt af den toxinogene type D-stamme af P. multocida ssp. multocida 45/78 (referencerne 3 og 22) efterfulgt af DEAD-Sephacel®-kromatografi og præparativ polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) på en måde, der er 15 kendt per se.

En suspension af (NH4)2S04-præcipitatet fremstillet som beskrevet ovenfor og indeholdende ca. 25 μg/ml PMT blev detoxificeret ved inkubering med 0,37% formaldehyd ved 37°C i 1 time. Balb/c-hunmus (8-12 uger gamle) blev immuniseret 20 subkutant på dag 0 og dag 14 med 300 μΐ af en l:l-fortyn-ding af den rå præparation af detoxificeret P. multocida -toxin og Freund's inkomplette adjuvans (dag 0) eller PBS (dag 14). På dag 30 og 45 blev 1 μ$ nativt PMT i 200 μΐ PBS injiceret subkutant, og på dag 60 blev musene "boostet" in-25 travenøst med 0,5 μg PMT i 100 μΐ PBS. 3 dage efter boo- ster-injektionen blev musene aflivet og deres milte fjernet med henblik på fusion.

22 DK 169749 B1

Fremstilling af hvbridomcellelinier oa monoklonale antistoffer I overensstemmelse med fremgangsmåder beskrevet af Fazetas et al. (ref. 23) og Gebeyechu et al. (ref. 20) blev milt-5 cellerne og P3-X63-Ag8.653 myelomceller fusioneret under anvendelse af 50% PEG 4000 GK (Merck), og de resulterende hybridomceller blev dyrket selektivt i hypoxanthin/aminop-terin/thymin (HAT) -tilsat RPMI 1640-medium indeholdende 15% føtalt kalveserum (FCS) og 4% human endothelial celle-10 supernatant (Costar, Holland).

Hybridomcellelinier blev selekteret ved analyse af deres respektive monoklonale antistoffer ved ELISA og immunblot ting.

ELISA til påvisning oa titrering af monoklonale antistoffer 15 Mikrotiterplader (96-brønde Immuno Plate II, Nunc, Danmark) blev coatet med 50 /il/brønd af en 0,75 /ig/ml opløsning af oprenset PMT i PBS ved 4°C i 16 timer og ved 20°C i 1 time. Brøndene blev tømt og blokeret med 200 μΐ PBS-T-BSA (PBS indeholdende 0,05% (volumen/volumen) Tween®20 og 1% (vægt/-20 volumen) bovint serumalbumin) pr. brønd ved 20°C i 1 time, derefter vasket 3 gange med PBS-T. 50 /il/brønd hybridomkul-tursupernatant lodes reagere ved 20°C i 1 time, og pladerne blev vasket som beskrevet ovenfor. Anti-PMT-antistofaktiviteten blev målt kolorimetrisk efter inkubering ved 20°C i 1 25 time med 50 /il/brønd fåre-anti-muse-immunglobulin konjugeret med peberrodsperoxidase (Amersham International, GB) fortyndet 1:1500 i PBS-T-BSA og (efter 3 yderligere PBS-T-vaskninger som ovenfor) med 50 μΐ af en o-phenylendiamin (OPD)-H202-substratopløsning. Reaktionen blev standset med 30 150 /il 2M H2SO4 efter 5 minutter, og absorbansen blev be stemt i et Kontron SLT-210-fotometer (SLT Lab-instr.,

Zurich, Schweiz) ved 492 nm (ref. 620 nm).

23 DK 169749 B1

Middelabsorbansen ved titreringskurvens mætningsniveau (Asat) °9' middelkoncentrationen af de monoklonale antistoffer, der resulterede i 50% af Asat (C50%) blev bestemt ved hjælp af ELISA som beskrevet ovenfor med den undtagel-5 se, at der blev anvendt fortyndingsrækker af protein A-oprenset monoklonalt antistof (MAb) i PBS-T-BSA. Samtlige resultater er baseret på i det mindste dobbeltbestemmelser.

Immun-blottinq

Med henblik på at bestemme specificiteten af de monoklonale 10 antistoffer blev proteinerne i en rå cellefri ekstrakt af P. multocida 45/78 adskilt ved hjælp af SDS-PAGE forud for overføring til en nitrocellulosemembran og immunologisk påvisning. Polyacrylamidgeler (total acrylamid: 10%, relativ bis-acrylamid: 3%) og en elektroforesebuffer blev frem-15 stillet i henhold til Laemmli (ref. 24). Elektroforese blev udført vertikalt ved 10° C ved en konstant spænding på 60 V i 16 timer eller 250 V i 4 timer. Proteinbånd på gelerne blev enten visualiseret ved sølvfarvning med en de-tektionsgrænse på mindre end 1 ng protein pr. bånd (8) 20 eller overført til en nitrocellulosemembran (0,45 μτη) under anvendelse af en halvtør elektroblotter (Ancos, Ølstykke, Danmark (9)). Proteinerne på nitrocellulosemembranen blev enten påvist ved hjælp af en kolloid guld/sølvforstærk-ningsfarvemetode (detektionsgrænse: ca. 0,5 ng protein pr.

25 bånd) (ref. 25) eller immunologisk ved hjælp af en modifikation af den metode, der tidligere er beskrevet af Bjerrum et al. (ref. 26). En positiv reaktion i immun-blotting blev registreret som + eller (+), når der blev observeret en intens (eller svag) farvning af PMT-båndet, men ikke af noget 30 andet proteinbånd. Farvning af andre bånd eller ingen reaktion blev registreret som -.

PMT's molekylvægt blev bestemt ved sammenligning med kendte markører: ægalbumin (43,0 kD), BSA (66,3 kD) , phosphorylase B (97,4 kD), Ø-galactosidase (116,2 kD), RNA-polymerase β 35 (150,6 kD) og β' (155,2 kD) og myosin (ca. 200 kD).

24 DK 169749 B1 ELISA til påvisning af epitopspecificitet

Bestemmelse af tilsyneladende epitopspecificitet for anti-PMT-monoklonale antistoffer blev udført ved en kompetitiv ELISA svarende til en fremgangsmåde beskrevet af Anderson 5 et al. (ref. 27). Mikrotiterplader blev coatet med PMT og blokeret som beskrevet ovenfor. 50 μΐ af det konkurrerende MAb fortyndet til 10 jttg/ml i PBS-T-BSA blev tilsat og inkuberet i 1 time ved 20°C. Der blev tilsat 25 μΐ biotiny-leret monoklonalt antistof uden aspiration af brøndene, og 10. blandingen blev inkuberet i 20 minutter ved 20°C. Efter vaskninger tilsattes 50 μΐ af en 1:2500-fortynding af pe-berrodsperoxidase-konjugeret avidin (Kem-En-Tec, Danmark), og pladerne blev inkuberet i 45 minutter ved 20°C. Substratet, reaktionstiden og bestemmelse af absorbans var 15 som beskrevet ovenfor.

Det biotinylerede MAb blev anvendt ved en brugs fortynding, der resulterede i ca. 75% af absorbansen ved titreringskurvens mætningsniveau. Kurven blev opnået under anvendelse af et fortyndingsmiddel i stedet for det konkurrerende MAb 20 og fortyndingsrækker af det biotinylerede MAb. Graden af et kompetitivt MAb's blokering blev beregnet ud fra formlen (1-A/A0) x 100%, hvor A er middelabsorbansen for 3 brønde med det konkurrerende MAb, og A0 er middelabsorbansen for 8 brønde indeholdende fortyndingsmiddel i stedet for det kon-25 kurrerende MAb.

Data for 10 repræsentative monoklonale antistoffer, alle tilhørende IgG^-underklassen, ud af 92 ELISA-positive su-pernatanter er vist i tabellerne 1 og 2.

25 DK 169749 B1 TABEL 1

Karakterisering af 10 repræsentative MAb'er

Hybridan- Repræsentativt Agat C50% Irmiun-blotting gruppe nr. MAb 5 - 1 P3F51 1,2 110 + 2 P3F64 0,4 250 + 3 P3F37 0,7 30 (+) 4 P4F58 0,7 110 + 10 5 P3F22 0,6 35 + 6 P4F46 1,3 55 + 7 P4E38 1,9 40 + 8 P4f55 1,3 33 + 9 P3F50 1,8 315 + 15 10 P3F53 0,9 300 (+) a) angiver middelabsorbansen ved 492 nm ved rnætningsniveau i ELISA.-titreringen.

26 DK 169749 B1 TABEL 2

Graden af 10 repræsentative MAb'ers blokering i den kompetitive ELISA.

Konkurrerende Biotinyleret detéktor-MAb (% reduktion af Aq3·) MAb (hybri- ------------------------------------------------ 5 domgruppe nr. 123456789 10 P3E51 (1) 92 b P3F64 (2) 95 44 P3F37 (3) 63 95 78 10 P4F58 (4) 91 96 73 P3E22 (5) 71 88 P4F46C (6) 92 90 93 16 P4F38C (7) 93 92 95 27 P4F55C (8) 92 92 95 15 15 P3F50 (9) 16 24 13 84 91 P3F53 (10) 56 83

Aq 1,43 0,19 0,53 0,80 0,64 0,64 0,85 1,01 0,26 0,52 a) Aq angiver middelabsorbansen med fortyndingsmiddel i stedet for 20 konkurrerende MAb.

b) Ingen blokering (mellem 12% forøgelse og 9% reduktion af Aq) c) De nært beslægtede hybridcmgrupper 6, 7 og 8 blev differentieret ved hjælp af en to-sidet kompetitiv ELISA under anvendelse af et "catching" MAb (netoden er ikke beskrevet). Resultaterne viste, 25 at gruppen 6 var beslægtet med grupperne 3 og 4, gruppe 7 var ikke beslægtet med nogen anden gruppe, og gruppe· 8 var beslægtet med gruppe 1.

De selekterede hybridomcellelinier blev derefter klonet, indtil de var stabile. De resulterende kloner blev derefter 30 dyrket i "cell factories" (Nunc, Danmark) ved 37°C i RPMI 1640-medium suppleret med 10% FCS og injiceret i en mængde på ca. 5 x 106 celler/mus i Balb/c-mus, hvilket efter en 27 DK 169749 B1 vis inkuberingstid fører til dannelse‘af en tumor i peritoneum i musen, der frigiver store mængder antistof i sin bughulevæske (ca. 5-10 ml indeholdende 5-25 mg/ml).

Hybridomcellekultursupernatanterne blev passeret gennem en 5 protein A-agarosesøjle (Kem-En-Tec, Danmark). Bundne antistoffer blev elueret med 0,05M eddikesyre, pH 4,0, eller 0,03M citronsyre, pH 3,0, og straks neutraliseret med en egnet buffer. Oprensede antistoffer blev biotinyleret som beskrevet af Guesdon et al., 1979, (ref. 28).

10 To hybridomcellelinier, P3F37 og P3F51, der som vist i tabel 1 producerer MAb, blev deponeret den 3. december 1987

1 the European Collection of Animal Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, GB, under deponeringsnumrene ECACC

15 87120301 og ECACC 87120302.

EKSEMPEL 2

Kvantificering af PMT

Kvantificering af PMT blev udført ved hjælp af en sandwich-ELISA-fremgangsmåde. Sandwich-ELISA'en blev indledt ved en 20 coatning af alle brønde i en mikrotiterplade (96 brønde Immuno Plate II, Nunc, Danmark) med 50 μΐ indeholdende 2 jtig/ml af det monoklonale anti-PMT-antistof, P3F51 (fremstillet i eksempel 1) i 0,05M carbonatbuffer, pH 9,6, i 16 timer ved 4°C og 1 time ved 20°C. Hver brønd blev inkuberet 25 il time med 200 μΐ phosphat-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20 og 1% bovint serumalbumin (PBS-T-BSA) . Pladerne kunne opbevares i mindst 6 måneder før tilførsel af 20 /xl/brønd PBS-sorbitol og forsegling med klæbende tape. Analysen blev indledt med to PBS-T-vaskninger efterfulgt af 30 inkubering af 50 μ 1 /brønd opløsninger med formodet indhold af PMT. Opløsningerne blev fortyndet på en hensigtsmæssig måde i PBS-T-BSA og inkuberet i 1 time ved 20°C. Efter 3 28 DK 169749 B1 PBS-T-vaskninger blev hver brønd inkuberet med 50 μΐ af 0/5 /tg/ml af det biotinkonjugerede monoklonale antistof, P3F37, i 1 time ved 20“C efterfulgt af yderligere 3 PBS-T-vaskninger og inkubering med 50 μ 1/brønd af en 1:2500 for-5 tynding af peberrodsperoxidase-konjugeret avidin (Kem-En-Tec, Danmark) i 45 minutter ved 20°C. Sluttelig blev der tilsat 50 /il/brønd af en o-phenylendiamin/H202-opløsning. Reaktionen blev standset med 2M H2SC>4 efter 5 minutter, og absorbansen blev bestemt i et Kontron SLT-210-fotometer 10 (SLT Lab-instr., Zurich, Schweiz) ved 492 nm (ref. 620 nm).

Kalibrering blev udført med en PMT-præparation kvantificeret ved hjælp af aminosyreanalyse (ref. 6), og samtlige kvantitative data er gennemsnit af i det mindste dobbeltbestemmelser.

15 Under anvendelse, af en sandwich-ELISA med MAb P3F51 som "catching" antistof og biotinyleret MAb P3F37 som detek-tionsantistof var det muligt at detektere mindre end 50 pg PMT i en 50 μΐ prøve. PMT ved en koncentration på 1 ng/ml resulterede i en A492 på ca. 0,1 svarende til mere end 8 20 gange baggrundsabsorbansen (jf. figur 1).

EKSEMPEL 3

Affinitetsoprensning af PMT

Ca. 100 mg protein A-oprenset MAb P3F51 fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev koblet til 40 ml divinylsulfon-25 agarose (Mini-Leak, Kem-En-Tec, Danmark) som beskrevet af producenten og påsat en søjle (2,5 x 10 cm). Supernatanten vundet ved dyrkning af den toxinogene type D-stamme P. mul-tocida 45/78 blev centrifugeret (12000 x g i 30 minutter ved 4°C) , filtreret (Gelman, 0,45 μία) , blandet med 1/10 vo-30 lumen af 1M Tris-HCl, pH 7,7, og NaCl blev tilsat til 0,5M, før den blev påsat affinitetssøjlen. Gentagne vaskninger før eluering af søjlen blev udført med en 0,1M Tris-HCl- 29 DK 169749 B1 buffer indeholdende første gang 1% Triton® X-100, derefter 1,5M NaCl og sluttelig 0,1M NaCl. Alle vaskebuffere indeholdt 0,1% natriumazid og havde en pH-værdi på 7,8. PMT blev elueret med 0,1M glycin-HCl, pH 2,8, og straks neutra-5 liseret med 1M K2HPO4, pH 9,0.

Forekomsten af PMT i kultursupernatanterne påsat affini-tetssøjlen viste sig ved det ca. 143 kD proteinbånd, som blev påvist ved SDS-PAGE (figur 2). Proteinfarvningsmønsteret i det materiale, der passerer gennem søjlen (dvs.

10 effluenten) var identisk med det, der påvistes med materiale før påsætning med undtagelse af 143 kD proteinet, som blev tilbageholdt på søjlen. Derfor er det ca. 143 kD proteinbånd den eneste farvning, der iagttages, når proteinsammensætningen af det eluerede materiale visualiseres ved 15 hjælp af SDS-PAGE (figur 2).

Ca. 2,67 mg ud af de 3,41 mg PMT påsat søjlen blev elueret i et slutvolumen på 8 ml, hvilket resulterede i et udbytte på 78% ved affinitetskromatografi (tabel 3). Stort set alle af de resterende 22% af påsat PMT blev elueret i fraktioner 20 med PMT-koncentrationer under 50 /zg/ml.

Den specifikke renhed (^g PMT/mg protein) var 284 gange højere i det eluerede materiale end i kultursupematanten (tabel 3).

Den gennemsnitlige minimale dermonekrotiske dosis af affi-25 nitetsoprenset PMT i marsvin efter intradermal injektion og den gennemsnitlige MCD af PMT i embryonale bovine lungeceller (EBL) i den standardiserede EBL-celletest (ref. 29) var henholdsvis ca. 35 ng og 30 pg. LD50 for PMT i Balb/c-mus var 20-40 ng (svarende til ca. 1,5 ^g/kg) og 100 ng 30 (svarende til 0,5 /xg/kg) i Wistar-rotter, idet det blev administreret intraperitonealt i en enkelt dosis.

30 DK 169749 B1 IRRET i 3

Oprensning af ΕΜΓ ved affinitetskromatografi

Vol. Protein ΗΜΓ Oprensnings- Genvinding af (ml) (mg) (mg) faktor ΕΜΓ, % 5 - Påsat kultursu-pematant fra P. multocida 45/78 13200 970 3,41 1 100 10 Effluent fra affinitetssøjle 13200 970 <0,01 N.D.a <0,35

Elueret materiale 8 N.D. 2,67 284b 78 15 - a) N.D. ikke bestemt b) Estimeret ud fra den forudsætning, at ΕΜΓ i det eluerede materiale er rent.

EKSEMPEL 4 20 Etablering af et P. multocida-aenbibliotek i Escherichia coli

Donorstamme P. multocida-stamme 45/78. Stammen producerer et dermone-krotisk toxin som beskrevet af Foged et al. (ref. 6).

31 DK 169749 B1

Recipientstamme

Escherichia coli K-12-stamme MT102. Genotype: thi. araD139. (araleu)A7697. lacAX74. galU. rpsL. hsdR. Stammen blev konstrueret (af Mogens Trier Hansen, Novo Industri A/S, 5 Danmark) på følgende måde: MC1000

Pl-transduktion, donor: Sol386

Selektion for tetracyclin- / 10 resistens; screening for deo- ψ MT85 ,Pl-transduktion, donor: ν' #804 15 Selektion for deo+ / screening for tetracyclin følsomhed og r^ Λ, MT102

Escherichia coli-stammefortegnelse (samtlige stammer er K-20 12-stammer)

SIAMME GENOTYPE REFERENCE

TCTiT ih!R KILDE

MdOOO araD139, Δ (ara-Leu) 7697, AlacX74, galU, a) galK, rpsL.

25 Søl386 leu. Δ(deoO-deoC), TnlO-6 (91% co-transdu- b) cerbar med deo ΜΓ85 araD139, Δ (ara-leu) 7697, AlacX74, galU, c) galK, rpsL, TnlO-6, Δ (deoO-deoC) #804 met, supF, r-, m+, A(gal-lac) d) 32 DK 169749 B1 b) fra Bente Mygind, Laboratoriet for Biologisk Kara. B, Københavns Universitet, Danmark.

c) konstrueret af Mogens Trier Hansen som vist ovenfor, a) Casadaban og Cohen, 1980, (ref. 30).

5 d) røood, 1966, (ref. 31).

Medier P. multocida blev dyrket i Tryptic Soy Broth fremskaffet fra DIFCO. E. coli blev dyrket i LB-medium (ref. 27) .

Restriktionsenzymer og T4-DNA-ligase fremskaffet fra New 10 England Biolabs og anvendt ifølge producentens anbefalinger.

DNA-ekstraktion

Med henblik på at isolere kromosomalt DNA fra P. multocida-stamme 45/78 blev celler fra en 250 ml stationær kultur 15 dyrket natten over resuspenderet i 10 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM EDTA, og inkuberet med 25 mg lysozym i 20 minutter ved 37°C. 2 ml 10% (vægt/volumen) SDS blev sat til blandingen, som blev blandet og sat på is i 10 minutter.

Til opløsningen blev der derefter sat 15 ml phenol mættet 20 ned TE-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), hvorefter den blev opvarmet til 65°C, blandet forsigtigt og afkølet på is. Efter centrifugering i 30 minutter ved 4000 x g blev den vandige fase ekstraheret med ether og ethanol-præcipiteret, og pelleten blev resuspenderet i TE-25 buffer. DNA'et blev yderligere oprenset ved fremstilling af bånd i en CsCl-densitetsgradient (ref. 27). Efter oprensning blev DNA'et resuspenderet i 1 ml TE-buffer.

33 DK 169749 B1

Fremstilling af klonbare DNA-fragmenter 9-22 kilobasepar- (kb) DNA-fragmenter med 5' GATC-udhængende ender blev fremstillet på følgende måde. Kromosomalt DNA fremstillet som beskrevet ovenfor blev delvis nedbrudt ved 5 inkubering med restriktionsendonukleasen Sau3A. Ved bestemte intervaller efter påbegyndelsen af inkuberingen blev fraktioner af inkubationsblandingen standset med 1/20-volumen 0,25M EDTA. En prøve af hver fraktion blev kørt i en 1% agarosegel i TAE-buffer som beskrevet i (ref. 27), og 10 en fraktion indeholdende 4-22 kb-fragmenter blev identificeret . Denne fraktion blev yderligere fraktioneret i en 8 ml sucrosegradient (40-10%) ved påføring af DNA'et i et lag på toppen af gradienten forud for ultracentrifugering ved 41000 omdrejninger pr. minut i 7,5 timer. 0,5 ml sub-15 fraktioner blev ekstraheret, fortyndet med 1 volumen TE-buffer, ethanol-præcipiteret og resuspenderet i TE-buffer.

To af disse indeholdende henholdsvis 9-16 og 15-22 kb-fragmenter blev anvendt i de følgende kloningstrin.

Kloningsfremgangsmåde 20 9-16 kb- og 15-22 kb-DNA-fragmenter med 5'GATC-overhængende ender blev ligeret med Bell-behandlet pUN121 (referencerne 27 og 19) ved hjælp af T4-DNA-ligase. Insertion af DNA i det unikke Bell-sted i denne vektor fører til inaktivering af cl-genet, der koder for lambda cl-repressoren, som ef-25 terfølgende ikke er i stand til at undertrykke transskription fra plasmid-λ-PL-promotoren ind i tetracyclinresi-stensgenet. De resulterende plasmider blev transformeret til kompetente E. coli MT102-celler som beskrevet i (ref.

27). Positiv selektion for kloner med plasmidinsertioner 30 opnås ved tilsætning af tetracyclin til mediet (10 μg/ml) . Under anvendelse af standardtransformationsteknikker (ref.

27) blev der opnået 3332 tetracyclinresistente rekombinante E.coli-kloner svarende til, at 100% af disse indeholdt in-sertioner, hvorfor de udgjorde et P. multocida-stamme 45/78 35 genbibliotek i E. coli. Kolonier af E. coli-klonerne blev 34 DK 169749 B1 dyrket på LB-plader indeholdende 10 μg/ral tetracyclin. Et skrab af disse kolonier blev opbevaret ved -80°C i en 20% glycerolopløsning.

EKSEMPEL 5 5 Identifikation af P. multocida-toxinproducerende E. coli-kloner

Screeninqsprocedure

Genbiblioteket blev screenet under anvendelse af colony blot-fremgangsmåden til overførsel af kolonier til nitro-10 cellulose (ref. 14).

PMT-producerende kloner blev derefter detekteret ved inku-bering af nitrocelllulosefiltrene på følgende måde: A) 15 minutter i 50 mM Tris, pH 9,6, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20 (vaskebuffer) og 2 ^g/ml DNasel, B) 2 x 10 minutter i va-15 skebuffer uden DNasel, C) 30 minutter i vaskebuffer og 3% gelatine og opvarmning, D) 2 x 10 minutter i vaskebuffer med 1% Triton X-100; E) 60 minutter i en 10-folds fortynding i vaskebuffer af en tidligere beskrevet hybridomsuper-natant P3F51, F) 3 x 5 minutter i vaskebuffer, G) 60 minut-20 ter i vaskebuffer med hele peberrodsperoxidasekonjugerede anti-muse-Ig-antistoffer fra Amersham (NA.931) fortyndet 1:1000, H) 3 x 5 minutter i vaskebuffer, I) 1 minut i 10 mM Na2HP04, 10 mM citronsyre, pH 5,0 (C/P-buffer) og J) ca. 5 minutter i en farveopløsning blandet umiddelbart før anven-25 delse bestående af 80 mg dioctylnatriumsulfosuccinat (DONS), 24 mg 3,3',5,5'-tetrarnethylbenzidin, 10 ml ethanol, 30 ml C/P-buffer og 20 μΐ H202. Enzymreaktionen blev stoppet ved inkubering i 100 mg DONS i 12,5 ml ethanol og 37,5 ml H20.

30 Følgende kloner viste sig at være positive ved denne fremgangsmåde: SPE 301, 308, 311, 312 og 315.

35 DK 169749 B1

Western blot

De positive kloner vundet ved screeningsproceduren blev yderligere analyseret under anvendelse af Western blot-teknikken (ref. 32).

5 I Western blot-proceduren blev l ml af kulturer dyrket natten over pelleteret (6000 x g i 5 minutter) og resuspen-deret i 0,5M Tris-HCl, pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 5% mercaptoethanol og bromphenolblåt. Prøverne blev kogt i 5 minutter, før de blev overført til en gel. Proteiner blev 10 adskilt ved hjælp af natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) (11), idet den adskillende gel bestod af 7% (vægt/volumen) acrylamid (acrylamid/bisacryl-amidforhold på 40:1) i 0,4M Tris, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,05% glycerol.

15 Efterfølgende overførsel til nitrocellulosefiltre blev udført i en halvtør elektroblotter som beskrevet af Kyhse-Andersen (25). Yderligere håndtering af filtrene blev udført som beskrevet ovenfor under screeningsproceduren.

Resultaterne fremgår af figur 3, som viser et Western blot 20 af de 5 positive kloner.

Transformant-stammerne SPE 308 (banerne 2 og 3) og SPE 312 (banerne 5 og 6), der henholdsvis indeholder plasmiderne pSPE 308 og pSPE 312, fandtes at være PMT-producerende, hvorimod SPE 301, SPE 315 og SPE 311 fandtes ikke at pro-25 ducere PMT. Oprenset PMT (bane 8) blev anvendt som kontrol.

Det rekombinante toxin produceret af SPE 308 og SPE 312 udviser de samme egenskaber som det native protein med hensyn til genkendelse i den kompetitive ELISA som beskrevet i eksempel 1; størrelsen og den toxiske aktivitet i EBL-30 testen (ref. 29) er uændrede.

EKSEMPEL 6 36 DK 169749 B1

Restriktionskortlægning og lokalisering af pmt -genet

Plasmideme pSPE 308 og pSPE 312 blev analyseret for genkendelsessekvenser for restriktionsenzymer (restriktions-5 steder), idet der blev testet for restriktionssteder for de fleste af de kendte enzymer, der har en 6 basepar- (bp) genkendelsessekvens. Resultaterne er vist i figur 4 (pSPE 308) og figur 5 (pSPE 312). Det fremgår af figurerne, at de to plasmider indeholder en ca. 6 kb-overhængende ende (fra 10 position 11000 til 17000 i pSPE 308). pmt-genet er derfor lokaliseret inden for dette område.

Ved konstruktion af endepunktdeletioner i de overhængende områder i pSPE 308 og pSPE 312 blev pSPE 308-derivateme pSPE 336, pSPE 341, pSPE 344 og pSPE 350 såvel som pSPE 15 312-derivaterne pSPE 338, pSPE 343, pSPE 345, pSPE 347/349 og pSPE 525 konstrueret. Udstrækningerne af de resulterende plasmiderne er vist i figurerne 6 og 7.

Disse plasmider blev transformeret til E. coli-stammen MT102 og analyseret for produktion af PMT ved hjælp af 20 Western blotting som beskrevet ovenfor.

I dette Western blot blev et enkelt protein med en tilsyneladende molekylvægt på 125000 dalton påvist. Dette blot er vist i figur 8. Plasmidet pSPE 349, der koder for dette protein, er deleteret fra en region til højre for EcoRl-25 stedet i position 8200 i pSPE 312 (jf. figurerne 5 og 7). Plasmidet pSPE 349's genprodukt angiver derfor pmt-genets position og orientering (vist som skraveret felt i figur 5). Den kodende region begynder ca. 3,3 kb opstrøms for EcoRl-stedet i position 8200 i pSPE 312, dvs. omkring Clal-30 stedet i position 4900. Eftersom den totale kodende region anslås at være ca. 3,9 kb, slutter det strukturelle gen omtrent i position 8800 på kortet vist i figur 5.

EKSEMPEL 7 37 DK 169749 B1

Sekventering af prat-genet

Nukleotidsekvensen indeholdende prat-genet som lokaliseret i eksempel 4 blev bestemt under anvendelse af den af Sanger 5 et al. (ref. 33) beskrevne metode. Sekvensen for 4381 konsekutive bp blev bestemt. Regionens DNA-sekvens er vist i figur 10 (a)-(j), hvori den udledte aminosyresekvens er angivet oven for DNA-sekvensen begyndende i position 219. Methioninkodonen i position 219-221 foretrækkes som start-10 kodon fremfor methioninkodonen i position 213-218 som følge af dens perfekte afstand til det formodede ribosombindings-sted i position 201-210. Regionen indeholdende pmt-genet blev underkastet en mere detaljeret restriktionskortlægning ved en computersøgning for samtlige restriktionssteder for 15 restriktionsenzymer med 6 bp-genkendelsessekvenser.

Resultaterne er angivet i figur 9, som viser en høj grad af konformitet med det tidligere konstruerede restriktionskort .

EKSEMPEL 8 20 Ekspression af P. multocida-toxin i E. coli Mængden af PMT produceret i forskellige rekombinante E. coli-kloner blev bestemt ved måling af inkorporering af S-35-mærket methionin under anvendelse af den følgende fremgangsmåde. Celler blev dyrket i AB minimal-medium (ref.

25 21) suppleret med 0,2% glucose, 1 /jg/ml thiamin og 50 /ig/ml leucin ved 37°C. Ved en optisk densitet (OD45Q) på 0,6 blev 1 /ul af en 1 mCi/ml S-35-methioninopløsning (fremskaffet fra Amersham, SJ. 1015) tilsat en 1 ml prøve af kulturen ved 37°C. 3 minutter senere blev 50 μΐ af 10 mg/ml umærket 30 methionin tilsat som en "chase", og efter yderligere 3 minutter blev prøven lagt på is. Prøver blev pelleteret 38 DK 169749 B1 (6000 x g i 5 minutter) og resuspenderet i påsætningsbuffer (0,5M Tris-HCl, pH 6,8, 3% SDS, 15% glycerol, 5% mercapto-ethanol, bromphenolblåt). Efterfølgende blev proteiner adskilt i SDS-PAGE som beskrevet i eksempel 5. Ydermere blev 5 gelen tørret og Tinderkastet autoradiografi natten over på en KODAK XAR- 5 - røntgenf i Im. Relative mængder af PMT blev bestemt ved scanning af røntgenfilmen under anvendelse af β- og β'-underenhederne af E. coli-RNA-nolymerase som en reference.

10 Rekombinante kloner testet på denne måde var MT102-stammer indeholdende henholdsvis plasmidet pSPE 312, pSPE 525 (vist i figur 11) og pSPE 481 (vist i figur 12). Plasmidet pSPE 481 omfatter 7 kb-PstI-fragmentet af pSPE 525 ligeret til et 1,3 kb-PstI-fragment af plasmidet pPL 195, der indehol-15 der en del af ampicillinresistensgenet og lambda-PL-promo-toren og operatorregionen. pPL 195 blev konstrueret ved insertion af pUC8 EcoRI-Hindlll-polylinker (ref. 33) i en EcoRI og HindiII skåret PLc28-vektor (ref. 34). Det resulterende plasmid pSPE 481 indeholder lambda-PL-promotoren, 20 der transskriberer ind i pint-genet.

DK 169749 B1 UMBEL 4 33 Målte ΕΜΓ-mængder i rekorrfoinante E.coli-kloner SPE 312 SPE 525 SPE 481

Mblékyler/celle <500 3000-4000 12000-15000 5 Data anvendt i beregningerne ovenfor β β' ΕΜΓ

Mfethioninindhold (%) 2,76 2,56 2,80 (23) (24)

Størrelse (kD) 150 155 146,5 10 (23) (24)

Molékyler/celle 4500 4500 (ved 2,5-3 generationer/time) (25) (25)

Endvidere blev indholdet af PMT i SPE 481 målt under an-15 vendelse af den følgende fremgangsmåde. En 100 ml kultur med en optisk densitet (OD450) på 5 blev pelleteret (6000 x g i 5 minutter) og resuspenderet i 10 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,0. Supernatanten, som ikke indeholdt PMT, blev bortkastet, og de høstede celler blev åbnet ved hjælp 20 af sonikering. PMT blev derefter yderligere oprenset på en anionbyttersøjle som beskrevet i ref. 6. Den oprensede PMT blev derefter underkastet en kvantitativ ELISA som beskrevet i eksempel 2, hvorved der blev fundet en estimeret mængde på 2-5 mg PMT pr. ml kulturvæske.

25 Escherichia coli K-12-stammen MT102 indeholdende plasmidet pSPE 481 blev deponeret den 21. marts 1988 i overensstemmelse med Budapest Konventionen i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH under stammebetegnel- 40 DK 169749 B1 sen Escherichia coli K-12 SPE 481. Deponeringsnummeret er DSM 4488.

EKSEMPEL 9

Produktion og karakterisering af toxinderivater 5 Følgende derivater af toxin-kodende plasmider blev konstrueret med det formål at fremstille trunkerede, dvs. detoxi-ficerede, toxiner, som er potentielt nyttige til immunogene formål. Konstruktionerne blev fremstillet på basis af de i eksemplerne 6 og 7 beskrevne restriktionskortlægninger. De 10 hypotetiske toxinafledte proteiner produceret ud fra plas-miderne pSPE A til pSPE Q, proteinerne A-R, er vist i figur 13. Samtlige derivater blev udtrykt optimalt fra de respektive plasmider i stamme SG 21059, stillet til rådighed af Susan Gottesmann. Den kendte genotype for denne stamme er 15 Aqal lon!46::ATnlQ Alac.

1) pSPE A. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymet Stul forud for ligering. Denne deletion fremkalder et læserammeskift. Imidlertid kunne der som beskrevet nedenfor påvises et PMT-derivat i såvel 20 Western blotting som i EBL-toxicitetstesten. Dette kunne skyldes en ringe grad af fejlagtig rammeskift i translationsprocessen. Se figur 13.

2) pSPE B. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymet Xbal forud for ligering. Plasmidet 25 koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 108 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 169-468 i PMT. Se figur 13.

3) pSPE C. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymet Ndel forud for ligering. Denne deletion fremkalder et læserammeskift. Der kunne imidlertid 30 som beskrevet nedenfor detekteres et PMT-derivat i små mængder. Dette kunne skyldes fejlagtigt rammeskift i translationsprocessen. Se figur 13.

41 DK 169749 B1 4) pSPE D. Plasmidet blev konstrueret' ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymerne Ndel og SnaBI og efterfølgende at gøre de resulterende ender stumpe under anvendelse af T4-polymerase (fremskaffet fra New England Biolabs) som be-5 skrevet af producenten forud for ligering. Denne deletion forårsager et læserammeskift. Der kunne imidlertid som beskrevet nedenfor påvises et PMT-derivat i små mængder.

Dette kunne skyldes fejlagtigt rammeskift i translationsprocessen. Se figur 13.

10 5) pSPE E. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymet HindiII forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 53 kD, denne deletion fremkalder et læserammeskift. Se figur 13.

6) pSPE F. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 312 15 med restriktionsenzymet Hindlll forud for -ligering. Ligesom pSPE E koder dette plasmid for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 53 kD. Se figur 13.

7) pSPE G. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymerne SnaBI og Xhol og efterfølgende at 20 gøre de resulterende ender stumpe som ovenfor forud for li-gering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 135 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 507-568 i PMT. Se figur 13.

8) pSPE H. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 25 med restriktionsenzymerne SnaBI og Spel og efterfølgende at gøre de resulterende ender stumpe som ovenfor forud for li-gering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 88 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 569-1058 i PMT. Se figur 13.

30 9) pSPE I. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymet Nsil forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 79 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 634-1204 i PMT. Se figur 13.

42 DK 169749 B1 10) pSPE J. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 312 med restriktionsenzymet Nsil forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 70 kD. Se figur 13.

5 11) pSPE K. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE

481 med restriktionsenzymet Spel og gøre de resulterende ender stumpe som ovenfor forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 117 kD. Se figur 13.

10 12) pSPE L. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE

312 med restriktionsenzymet EcoRI forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 124 kD. Se figur 13.

13) pSPE O. Plasmidet blev konstrueret ved delvis at skære 15 non-methyleret pSPE 481 med restriktionsenzymet Bell forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat på 133 kD, idet derivatet mangler aminosyreme 30-150 i PMT. Se figur 13.

14) pSPE p. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE

20 481 med restriktionsenzymet Spel, med efterfølgende be handling med exonukleasen Bal31, skæring med EcoRI og sluttelig behandling med DNA-polymerase I Klenow-fragment under tilstedeværelse af samtlige 4 deoxyribonukleotider forud for ligering. Plasmidet koder for et hypotetisk PMT-derivat 25 på ca. 136 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 1043-1130 i PMT. Se figur 13.

15) pSPE Q. Plasmidet blev konstrueret fra et derivat af pSPE 481, pSPE 680. pSPE 680 blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymerne BamHI og Clal og be- 30 handling med DNA-polymerase I Klenow-fragment under tilstedeværelse af samtlige 4 deoxynukleotider forud for ligering. pSPE Q blev efterfølgende konstrueret ved at skære pSPE 680 med EcoRV forud for ligering. Plasmidet koder for 43 DK 169749 B1 et hypotetisk PMT-derivat på 127 kD, idet derivatet mangler aminosyrerne 175-246 i PMT.

16) pSPE R. Plasmidet blev konstrueret ved at skære pSPE 481 med restriktionsenzymerne Spel og EcoRI og gøre de re-5 suiterende ender stumpe som beskrevet ovenfor forud for ligering. Det resulterende plasmid koder for et hypotetisk PMT-derivat på ca. 117 kD. Se figur 13.

Udvalgte derivaters reaktivitet med et panel af monoklonale anti-PMT-antistoffer blev undersøgt ved hjælp af sandwich-10 ELISA7er baseret på detektion med non-kompetitive kombinationspar af monoklonale antistoffer. Ved hjælp af denne metode blev for hvert derivat bestemt en antigen-kode (Ag-kode), dvs. et udtryk, der angiver epitop-differencen for derivatet i forhold til PMT.

15 Den mindste dosis med cytopatisk effekt (MCD) på 120 μΐ af 1,5 x 105 embryonale bovine lungeceller blev målt for nogle affinitetsoprensede PMT-derivater.

Resultaterne af de to forsøg er vist i den følgende tabel (tabel 5).

20 TABEL 5

Derivat L 0 P B* C* G*

Ag-kode ΕΜΓ-α ΊΜΐ-β ΊΜΓ-β ΕΜΓ-γ ΡΜΓ-γ ΕΜΓ MCD (ng) 250 30000 5 n.d. n.d. n.d.

25 * ikke affinitetsoprensede (sonikater) n.d.: ikke udført

Antigen-koden "PMT" angiver, at derivatet reagerer indifferent i forhold til PMT ved sandwich-ELISA, dvs. samtlige epitoper karakteriseret ved hjælp af panelet af monoklonale 30 antistoffer, som er til stede på PMT, kan detekteres på de- 44 DK 169749 B1 rivatet. Ag-koden "PMT-x", hvor x er a, β eller 7, angiver, at de monoklonale antistoffer, der reagerer med epitop x på PMT, ikke reagerer med derivatet. Resultaterne af disse forsøg viser, at epitop a mangler på derivat L, β mangler 5 på 0 og P, og 7 mangler på B og C.

MCD for PMT er ca. 0,01-0,03 ng, og det er derfor klart, at de ovennævnte derivater L og 0 er praktisk taget non-cyto-patiske i sammenligning med PMT, hvorimod P udviser nogen tilbageværende cytopatisk aktivitet.

10 Der blev fremstillet et Western blot under anvendelse af et muse-anti-PMT-antiserum fremstillet som beskrevet i eksempel 1 og under anvendelse af helt peberrodsperoxidase-ka-nin-anti-muse Ig-antistof (fremskaffet fra Amersham) som det sekundære antistof. Stammer indeholdende plasmiderne 15 pSPE A, B, C, D, E, G, Η, I og L viste sig at reagere med anti-PMT-antiserum (jf. figur 14).

Museforsøg med henblik oå belysning af O-derivatets immunogene effekt

Formål 20 At undersøge PMT's immunogene effekt efter deletion i den N-terminale ende (O-derivat).

Fremgangsmåde

Til forsøgene anvendtes Balb/c-mus. Kønsmodne hunmus blev immuniseret subkutant 2 gange med 14 dages interval med 25 0,3 ml O-derivat (2,5-5 /tg/ml) i 20% Alhydrogel (jf. ek sempel 12) i PBS + 0,1% nul-museserum.

Samtidig med den første vaccination blev hunmusene parret. Derfor fandt den anden vaccination sted ca. 1 uge før forventet fødsel.

45 DK 169749 B1 1) Ca. 10 dage gamle blev museungerne delt i 2 grupper. Halvdelen blev dryppet intranasalt med PMT (ialt 60 ng PMT), den anden halvdel blev injiceret intraperitone-alt (i.p.) med PMT i forskellige koncentrationer. An- 5 tallet af døde dyr blev registreret.

2) Samtlige voksne hunmus blev tappet efter aflivning af de overlevende museunger. Blodprøverne blev analyseret ved ELISA som beskrevet i eksempel 13 for tilstedeværelse af antistoffer mod PMT. Umiddelbart efter udtag- 10 ning af blodprøver blev musene injiceret i.p. med for skellige koncentrationer af PMT. Antallet af døde dyr blev registreret.

Skematisk forsøgsplan

Forsøgsuge, nr.

15 - 3 - 31 Balb/c-hunmus blev parret og efterfølgende immuniseret med O-derivat - 2 - 20 - 1 - 31 Balb/c-hunrnus blev immuniseret anden gang med O-derivat 0-31 hunmus fødte 122 museunger 25 1 - museungerne blev delt i gruppe I (61), som blev behandlet intranasalt med PMT; grippe II (61), scm blev behandlet i.p. med ΕΜΓ 2 - overlevende museunger blev aflivet 30 Balb/c-hunrnus blev tappet

Balb/c-hunmus blev injiceret i.p. med ΕΜΓ 3 - antal overlevende Balb/c-hunmus blev registreret, og dyrene blev aflivet 35

Forseg afsluttet

Resultaterne er vist i tabellerne 6 og 7.

LD75 i ikke-beskyttede museunger var ca. 20 ng PMT injice-40 ret i.p.

46 DK 169749 B1 LD50 i ikke-beskyttede voksne mus var ca. 70 ng PMT injiceret i.p.

Konklusion

Det kan konkluderes, at mus født af mødre vaccineret med 0-5 derivat-vaccine i de beskrevne doser kan overleve i.p. injektion af mindst 25 x LD50 PMT. Beskyttelsen opnås via antistoffer overført med colostrum fra moder til afkom.

Det kan ydermere konkluderes, at O-derivat-vaccinerede dyr udvikler antistoffer mod PMT, selv om nogen variation iagt-10 tages. Musene kan overleve i.p.-injektion af mindst 50 x LD50 PMT.

Mus vaccineret med O-derivat kan således overføre en betydelig beskyttelse mod PMT til afkommet via colostrum.

Musene selv udvikler antistoffer mod PMT og er beskyttede 15 mod endog høje koncentrationer af PMT.

47 DK 169749 B1

tP

c o O ^ "Sf O \ \ vd s* m

pH

tP

c O 'ί' O \ o ro oo

C

S' O CO

S o \ \

CO O H CM

O

> _

cr> S

CO C 9 Pn £3 CT*

g o 'i* fe C

o \ < „ “ i? H CN O ^ ° ^ n LO CO 'tf c-| CO ~ l" g 0) g « H tn S g1

•r C tr> M

0 CD C H Φ ft H ^ _ d fe H O \ ^ β _

Eli {ti O O JS (0 r- 1 A co g ^ o \ ° £ g 3 S °

w g & gj |J

co S g * C ^ ^ fe O ° \ _ O &1

μ] Λ ft) LD I-H fj (DC

fe CO Ό γί Km^oSS

g g g1 «, g § £ S < \ s § s g f ,, s h ° ° i

ω S tn B h B

g c +„ « I »

B § ° 1 gg. I

C CN iH Eh ^ ^

S Φ r* <D

H u fe o \ u O Η Η Η H W 5° ^ u cd e g ε ·π > H ·£ . "7 ^ c o 3, a. ι ί ·.

fe O O * S ^ n H fe <0 m in m a W Cn a »> *> ^ · wc · O <N -Η CO 0\\*1"1

<; H ro o o H

g (C «5 M +J +| S u c g co ~ O CO ^ « w +* \ S' , \ ^ H o'ior-vo'.oo cn C+ m P ^ VD es o OH c 5* 2 .....* - g o\ g I^CcdoHHHH eso Ό 5

•s "S

Ό Ό Φ H S' d Γ0 "© <0

in +* co -P

ViHCSroC tø h cs co C

o < o < fe + fe + 48 DK 169749 B1 EKSEMPEL 10

Differentiering mellem PMT+- og PMT"-stammer ved PMT-ELISA

615 kliniske isolater og 7 reference-stammer af P. multoci-da blev undersøgt. De kliniske isolater blev opnået fra 5 næsesvaberprøver (603 isolater) og lunger (12 isolater) af svin fra 156 danske besætninger og blev identificeret på grundlag af følgende kriterier: syreproduktion ud fra glucose, saccharose, mannitol, sorbitol og ikke ud fra maltose, arabinose, dulcitol og inositol; og produktion af in-10 dol, ornithindecarboxylase, katalase, oxidase og ikke ure-ase.

Ekstrakter til toxinanalyser blev fremstillet ved høstning af kulturer dyrket på blodagar (9 cm Petri-skål) natten over (37°C) i 2 ml sterilt vand ved hjælp af en spatel.

15 Suspensionerne lodes henstå til ekstraktion ved 37°C i ca.

18 timer. Én del af ekstrakten blev undersøgt direkte ved hjælp af PMT-ELISA som beskrevet i eksempel 2. Alle absor-banser (A) blev udtrykt som procentdele af den absorbans, der blev vist ved en positiv kontrol (Ag) . Kontrollen var 20 en 1:1-fortynding af en til hver test frisk fremstillet ekstrakt af den toxinogene type D-reference-stamme P. mul-tocida ssp. multocida 45/78.

En anden del blev centrifugeret (30 minutter ved 1500 x g), supematanten sterilfiltreret og efterfølgende undersøgt i 25 EBL-celletesten som tidligere beskrevet (referencerne 22 og 29) .

De 615 kliniske isolater blev karakteriseret som toxinogene (250) eller non-toxinogene (365) ved EBL-celletesten og fandtes at være af kapseltype A (119 toxinogene og 92 non-30 toxinogene isolater) eller D (131 toxinogene og 273 non-toxinogene isolater).

49 DK 169749 B1

Der blev fundet fuld overensstemmelse -mellem EBL-cellete-sten og PMT-ELISA'en for de 615 kliniske isolater og de 7 reference-stammer (tabel 8).

TABEL 8

5 EBL-celletest EMT-ELISA

a) b) 250 kliniske isolater af P. multocida sso. multocida + + 10 365 kliniske isolater af P. multocida sso. multocida Type-stamme (CCUG 17977) P. multocida sso. septica Type-stamme (NCTC 10204) 15 P. multocida sso. cralicida Type-stamme (NCTC 10322) P. multocida ssd. multocida. type A -

Reference-stairme (ATGC 12945) P. multocida sso. multocida. type A - 20 Reference-stamme (NCIC 12177) P. multocida ssd. multocida. type A + +

Reference-stamme (ATCC 7707) P. multocida ssd. multocida. type D -

Reference-stamme (NCTC 12178) 25 P. multocida ssp. multocida. type D + + a) Samtlige EBL-positive (+) bakterieekstrakter havde EBL-titervændi-er over 103 (median 104, variation 103-106) i EBL-celletesten, EBL-negative (-) ekstrakter var non-cytcpatiske.

30 b) Alle 1:1-fortyndede ELISA-positive .(+) bakterieekstrakter havde relative absorbanser over 39% (middel ± SD: 94% ± 13%) i EMT-ELISA, hvorimod alle ELISA-negative (-) ekstrakter havde relative absorbanser under 9% (2,1% ± 1,9%).

50 DK 169749 B1

De cytopatiske og non-cytopatiske ekstrakter af de 615 kliniske isolater blev inddelt i to klart adskillelige grupper ved hjælp af PMT-ELISA (figur 15). Eftersom middel ± SD for absorbanseme (A) opnået ud fra 1:1-fortyndede ekstrakter 5 af de 250 toxinogene isolater var 1,72 ± 0,48, ville visuelle aflæsninger i stedet for fotometriske målinger af ELISA-resultater være tilfredsstillende med hensyn til differentiering af ekstrakter af P. multocida. Middel-PMT-kon-centration ± SD i ekstrakterne af de toxinogene isolater 10 af P. multocida blev bestemt til at være 2,8 ± 1,9 μg/ml, og da detektionsgrænsen for PMT-ELISA er ca. 50 pg (1 ng/ml) PMT (jf. eksempel 2), kan fortyndinger af ekstrakterne (figur 16) og ekstrakter med lave PMT-koncentra-tioner måles hensigtsmæssigt ved hjælp af PMT-ELISA. De 15 væsentligste fordele ved PMT-ELISA'en sammenlignet med eksisterende metoder er uafhængigheden af celledyrkning eller laboratoriedyrfaciliteter, det forhold, at en enkelt laborant er i stand til at håndtere adskillige hundrede prøver pr. dag og muligheden for at opnå kvantitative ob-20 jektive resultater på grundlag af bakterieekstrakter på 4 timer.

EKSEMPEL 11

Neutralisering af PMT med monoklonale anti-PMT-antistoffer

Prøver (30 μΐ) af enten PMT i PBS eller PMT i en rå celle-25 fri ekstrakt af P. multocida 45/78 (ref. 6) indeholdende PMT i mængder på op til 12 ng og 1 μ g oprenset MAb (P3F51) blev inkuberet i 15 minutter ved 20°C før tilsætning til embryonale bovine lungeceller (EBL) (120 μΐ, 1,5 x 105 cel-ler/ml) som beskrevet for den originale EBL-celletest (ref.

30 29). Den mindste cytopatiske dosis (MCD) for PMT blev be stemt, når der ikke var Mab til stede i prøven. Neutrali-sationstiterværdien blev registreret som det antal MCD'er, som kunne neutraliseres af 1 /ag MAb.

51 DK 169749 B1

Resultaterne fremgår af nedenstående tabel 9.

TABEL 9

Hybridan- Repræsentativt Neutralisering i gruppe nr. MAb EBL-celletest (x MCD)a 5 - 1 P3F51 130 2 P3F64 70 3 P3E37 <2 4 P4F58 30 10 5 P3F22 40 6 P4F46 100 7 P4F38 35 8 P4F55 40 9 P3F50 400 15 10 P3F53 55 a) Neutralisering af EMTs cytqpatiske effekt blev målt son antal mindste cytqpatiske doser (MCD) neutraliseret af 1 μg MAb. EMTs MCD er ca. 30 pg.

20 Som angivet i tabel 9 resulterede tilsætning af 1 pg MAb til PMT 15 minutter før tilsætning til EBL-cellerne i en 30-400 ganges forøgelse af MCD for 9 ud af de 10 repræsentative MAb'er, hvorimod MAb P3F37 havde en meget lav neutraliserende effekt over for PMT. Neutralisering af PMT's 25 cytopatiske effekt blev ligeledes opnået, når en rå celle-fri ekstrakt af P. multocida 45/78 blev anvendt i stedet for ren PMT.

Prøver (200 μΐ) indeholdende PMT i varierende mængder på op til 2,56 pg og oprenset MAb (P3F51) i mængder på mellem 30 0,15 og 15 μg blev inkuberet i 15 minutter ved 20°C og in jiceret intraperitonealt (i.p.) i Balb/c-hunmus (6 uger gamle, 15-20 g). Mus, der døde inden for en uge fra PMT-infektionstidspunktet, blev registreret, og den letale 52 DK 169749 B1 dosis af PMT og de monoklonale antistoffers neutraliserende effekt blev målt. Ved tilsætning af 1,5 eller 15 /zg P3F51, øgedes den letale dosis af PMT henholdsvis 4 og 32 gange, hvorimod 0,15 μg af det monoklonale antistof ikke havde 5 nogen neutraliserende effekt.

Med henblik på at undersøge monoklonale anti-PMT-antistof-fers in vivo neutraliserende egenskaber injiceredes en 200 μΐ opløsning indeholdende 15 /zg oprenset monoklonalt antistof (P3F51) (i.p.) i Balb/c-hunmus (6 uger gamle, 15- 10 20 g) 2 dage før i.p.-administration af en 200 μΐ opløsning indeholdende PMT i varierende mængder på op til 2,56 /zg enten i ren form eller som en rå cellefri ekstrakt af P. multocida 45/78 (ref. 6). Den neutraliserende virkning blev målt som beskrevet ovenfor.

15 Den letale dosis af PMT øgedes ca. 32 gange, når mus var passivt immuniseret med 15 μg P3F51 2 dage før disponering for PMT eller en rå cellefri ekstrakt af P. multocida 45/78.

EKSEMPEL 12 20 Vaccination med oprenset PMT eller O-derivat 15 ml PMT oprenset som beskrevet i eksempel 3 i 45 ml PMS blev dialyseret mod 0,35% formaldehyd i PBS, pH 7,3-7,9, i 36 timer ved 4°C, hvorefter 1 g/1 lysin-HCl blev tilsat dialysevæsken, og efter 18 timer blev dialysen fortsat med 25 gentagne udskiftninger af PBS. Det således fremstillede detoxificerede PMT blev analyseret for manglende (eller tilstrækkeligt reduceret) toxisk aktivitet i museletali-tetstesten, og cytopatitesten på EBL-celler som beskrevet ovenfor såvel som en dermonekrotisk test i marsvin som 30 beskrevet af Foged et al. (1).

53 DK 169749 B1 10 mg biologisk inaktivt (detoxificeret) PMT i 40 ml PBS blev derefter koblet til 10 ml aluminiumhydroxidgel fremskaffet fra Superfos, Danmark, under handelsnavnet Alhydro-gel som rekommanderet af producenten og fortyndet i 20% 5 aluminiumhydroxid i PBS til en slutkoncentration på ca.

5 /zg/ml eller 125 /xg/ml detoxificeret PMT.

Drægtige gylter blev immuniseret subkutant 4-6 uger og 2-3 uger før faring med en dosis på 3 ml af det detoxificerede PMT-vaccinepræparat som fremstillet ovenfor. Efter faring 10 blev smågrisene inokuleret intranasalt med Bordetella bron-chiseptica og P. multocida som beskrevet i ref. 1, og den beskyttende effekt af immunisering af søerne blev bestemt ved registrering af den daglige tilvækst før slagtning af svinene (ved ca. 90 kg levende vægt) og bestemmelse af 15 osteopatologiske tilstande i svinenes tryner ved slagtning. Svin fra immuniserede søer blev sammenlignet med svin fra ikke-immuniserede søer, og immuniseringens beskyttende effekt er vist i tabel 10.

TABEL 10 20 Antal dyr Gennemsnitlige Antal dyr med (kold) daglige til- alvorlig mos- vækst efter lingebensatrofi fravanning (%) 25 Svin fra ikke-immuni- 61 (8) 781 g 49 (80,3%) serede søer

Svin fra immuniserede 174 (20) 848 g 20 (11,5%) 30 søer 54 DK 169749 B1 I et igangværende forsøg immuniseredes gylter med 50 /jg/do-sis affinitets-oprenset O-derivat fra sonikater af en E. coli-klon indeholdende pSPE 0 som beskrevet i eksempel 9. Udover kobling til Alhydrogel blev der ikke gennemført 5 nogen modifikationer af O. Præliminære resultater af vaccinationsforsøget tyder på, at: a) serum- og colostrumtiterværdier over for nativt PMT er sammenlignelige for gylter vaccineret med O-derivat og formaldehydbehandlet PMT, 10 b) de specifikke antistoffer overføres lige godt i begge vaccinegrupper til smågrise gennem colostrum, c) de kliniske symptomer på atrofisk rhinitis forebygges lige godt i afkommet fra gylter vaccineret med O- (0-smågrise) og formaldehydbehandlet PMT (P-smågrise), og 15 at denne beskyttelse synes at være tæt på 100%, når der sammenlignes med smågrise født af ikke-vaccinerede gylter (kontrolgrise), d) toxinogene P. multocida anvendt til den eksperimentelle infektion kan reisoleres signifikant hyppigere fra 20 kontrolgrise end fra 0- eller P-smågrise ved 5 ugers alderen.

EKSEMPEL 13 Påvisning af anti-PMT-antistoffer

Ved i det væsentlige at gå frem som beskrevet i eksempel 2, 25 dog med inkubation af det coatende monoklonale anti-PMT-antistof med en forblandet præparation af serum og en konstant mængde PMT, er det muligt at påvise anti-PMT-antistoffer i serum af fx svin inficeret med P. multocida eller af dyr vaccineret med en vaccine ifølge opfindelsen. Blan- 30 dingen, der blev fremstillet med henblik på koncentrerede 55 DK 169749 B1 eller fortyndede serumprøver, blev inkuberet i 30 minutter ved 37°C før inkubering i 15 minutter i mikrotiterpladen. Tilstedeværelse af anti-PMT-antistoffer i serumprøven blev påvist ved en reduktion i absorbans målt i det væsentlige 5 som beskrevet i eksempel 1 (afsnittet benævnt "ELISA til påvisning af epitopspecificitet"). Resultaterne er vist i figur 17, der viser de 50% blokerende titerværdier for serum fra et anti-PMT-antistof-negativt svin (<2), et svin inficeret med en toxinproducerende P. multocida-stamme (ca.

10 14) og en gylt vaccineret med vaccinen beskrevet i eksempel 12 (ca. 250).

EKSEMPEL 14 Påvisning af PMT ved hjælp af colony blot og immun-blotting

Forekomsten af PMT i prøver kan påvises ved hjælp af en 15 colony blot-metode (ref. 14) som beskrevet i eksempel 5 (afsnittet benævnt "Screeningsprocedure").

Tilsvarende kan tilstedeværelsen af PMT i prøver påvises ved at adskille proteiner i prøverne elektroforetisk ved hjælp af SDS-PAGE (som beskrevet i eksempel 1) og elektro-20 foretisk overførsel af disse til en nitrocellulosemembran, hvor PMT, hvis det er til stede, kan visualiseres ved hjælp af immun-blotting som beskrevet i eksempel 1 (i afsnittet benævnt "Immun-blotting"). Den elektroforetiske lokalisering af det farvede proteinbånd angiver ligeledes den til-25 syneladende molekylvægt for PMT (ca. 143 kD) .

56 DK 169749 B1 EKSEMPEL 15

Genetisk distinktion mellem PMT+- og PMT--isolater af P. multocida bestemt ved kolonihybridisering P. multocida-isolater (17 toxinpositive og 18 toxinnegative 5 stammer som bestemt ved ELISA- og EBL-tests som beskrevet ovenfor) blev inokuleret på Tryptic Soy Broth Agar-plader (fremskaffet fra DIFCO). Efter inkubering natten over ved 37°C blev der fremstillet et replikat på et nitrocellulose-membranfilter (Schleicher & Schull BA 85). Dette replikat 10 blev placeret (med oversiden opad) oven på 4 på hinanden følgende Whatman 3MM-filtre vædet i henholdsvis 10% SDS, denatureringsbuffer (0,5M NaOH, 1,5M NaCl), neutraliseringsbuffer (0,5M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5M NaCl) og 2 x SSPE (360 mM NaCl, 20 mM NaH2P04, 2 mM EDTA, pH 7,4). Inkubering 15 blev udført i 5 minutter på hvert filter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev nitrocellulosefilteret tørret, og DNA blev fikseret til filteret ved "bagning" ved 80°C i 2 timer. Præhybridisering og hybridiseringer blev udført i 6 x SSC (0,1M NaCl, 0,015M natriumcitrat, pH 7), 0,5% SDS 20 og 5 x Denhardt-opløsning i henholdsvis 2 timer og natten over ved 65°C. Proben var et radioaktivt mærket Xbal-fragment fra position 1623 til 4376 i den i figur 10 (a)-(j) viste sekvens fremstillet ved nick-translationsmetoden (ref. 22). Efter hybridisering blev filteret vasket ved 25 25°C i 2 x SSC, 0,5% SDS i 2 x 15 minutter og i 0,2 x SSC, 0,5% SDS i 2 x 1 time ved 65°C og autoradiograferet natten over.

Resultaterne fremgår af figur 18, som viser, at kolonier i positionerne 5, 6, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 22, 30 34, 36, 37, 39, 45 og 50 var PMT+, og kolonier i positionerne 7, 23, 24, 26, 28, 30, 32, 42, 44, 47, 48, 53, 56, 58, 63, 66, 73 og 75 var PMT“. Disse resultater er i overensstemmelse med ELISA- og EBL-bestemmeIserne. Følgelig kan non-toxinogene P. multocida-stammers manglende evne til 57 DK 169749 B1 toxinproduktion tilskrives en mangel på det PMT-kodende pmt-cren.

EKSEMPEL 16

Oprensning af rPMT og sammenligning af rPMT med PMT

5 I toxinoprensningsproceduren blev celler høstet fra en l 1 stationær kultur af SPE 312 dyrket natten over resuspende-ret i 10 ml H20 og sonikeret adskillige gange i 0,5 minutter ved 0°C under anvendelse af en Branson sonifier 250 (Branson, Conn., U.S.A.). Sonikatet blev fortyndet til 10 50 ml i 0,1M Tris-HCl, pH 7,8, indeholdende 0,5M NaCl før påsætning til affinitetssøjlen, som var fremstillet ved immobilisering af anti-PMT-MAb P3F51 som beskrevet i eksempel 3. Efter gentagne vaskninger af affinitetssøjlen blev rPMT elueret med 0,1M glycin-HCl, pH 2,8, som t idlige-15 re beskrevet vedrørende affinitetsoprensning af PMT fra ekstrakter af toxinogent P. multocida. Samtlige fraktioner blev straks neutraliseret med 1M κ2ΗΡ04.

Et fortyndet bakteriesonikat af SPE 312 indeholdende ca.

82 μ$ rPMT som bestemt ved den kvantitative ELISA beskrevet 20 i eksempel 2 blev påsat en 1 ml affinitetssøjle, hvortil der var koblet ca. 5 mg anti-PMT-MAb P3F51. Der kunne ikke påvises rPMT i effluenten fra søjlen. Efter eluering blev der vundet ca. 75 μg rPMT i de to hovedfraktioner på hver 1,4 ml. Dette svarer til en genvindelse af 91% af den på-25 satte rPMT.

PMT-assavs

Kvantificering af rPMT blev udført som beskrevet for PMT (eksempel 2) under anvendelse af "capture" anti-PMT MAb P3F51 og den biotinylerede detektor MAb P3F37 i PMT-ELISA, 30 en sandwich-ELISA baseret på den samme teknik som forklaret nedenfor vedrørende undersøgelse af epitoper på rPMT og 58 DK 169749 B1 PMT. Kvantificering ved hjælp af PMT-ELISA blev sammenlignet med resultater opnået i et modificeret Coomassie brilliant blue-farvebindingsmikroassay tidligere anvendt til bestemmelser af proteinkoncentrationer og PMT's farvebin-5 dende egenskaber i sammenligning med bovint serumalbumin (BSA) .

Sammenligning af epitoper på rPMT og PMT blev udført ved hjælp af sandwich-ELISA7er baseret på 10 anti-PMT Måb'er (eksempel 1) oprenset fra hybridomsupernatanter på protein 10 A-agarosesøjler. Disse MAb'er har vist sig at reagere med forskellige epitoper på PMT. Sandwich-ELISA7erne blev udført som beskrevet i eksempel 2. Der blev udført dobbelt-bestemmelser for begge antigener i samtlige 100 kombinationer af de 10 "catching" MAb'er og de samme biotinylerede 15 detekterende MAb'er. Kombinationspar af MAb'er, der resulterede i absorbanser tinder 0,3, blev anset for at være kompetitive. For non-kompetitive kombinationspar blev resultaterne beskrevet som gennemsnittet af dobbeltbestemmelser af absorbans målt for rPMT i forhold til gennem-20 snittet af dobbeltbestemmelser af absorbans for PMT.

rPMT7s og PMT7s dermonekrotiske og letale effekter blev bestemt ved injektion af 200 /*1 af fortyndinger af de tidligere ELISA-kvantificerede prøver henholdsvis intradermalt i marsvin og intraperitonealt i Balb/c-mus. Prøver, der re-25 suiterede i en hudlæsion på 10 mm eller mere 48 timer efter intradermal injektion blev vurderet som dermonekrotiske, og prøver, der resulterede i død på mindre end 5 døgn efter intraperitoneal injektion, blev vurderet som letale. Alle resultater var baseret på i det mindste dobbeltbestemmel-30 ser.

Affinitetsoprenset rPMT og PMT havde meget ens reaktionsmønstre i den strukturelle ELISA-test baseret på 100 kombinationspar af 10 forskellige anti-PMT MAb'er og 100 ng/ml affinitetsoprenset antigen. For PMT resulterede 25 par i en 35 absorbansværdi (A492) under 0,3, hvilket blev anset for at 59 DK 169749 B1 angive konkurrence. De samme 25 par udviste kompetitive reaktioner, når antigenet var 100 ng/ml rPMT. De øvrige 75 non-kompetitive kombinationspar resulterede i over 0,3, både når der anvendtes PMT og rPMT. Det samlede 5 gennemsnit ± SD af de 75 beregnede værdier for de relative absorbanser for rPMT sammenlignet med PMT var 112% ± 8%.

Der blev kun fundet mindre afvigelser fra det samlede gennemsnit vedrørende gennemsnitsværdierne for de 10 "catching" MAb'er og de 10 biotinylerede detektor-MAb'er.

10 PMT og rPMT reagerede meget ens, når de blev testet for cytopatisk effekt på EBL-celler, for dermonekrotisk aktivitet i marsvin og for letalitet i mus, og deres evne til at binde Coomassie brilliant blue var den samme og ca. 2,5 gange svagere end BSA's farvebindende evne (tabel 11).

15 TABEL 11

Cytopatiske, deimonekrotiske, letale og farvebindende virkninger

af ΕΜΓ og rPMT

Prøve mindste mindste mindste farve- cytqpatiske dermonekro- letale binding 20 dosis (pg) tiske dosis dosis (ng) (%)a (ng) EMT 20-40 15-45 25-50 40-45 rEMT 20-40 35 30 35-45 25 --- a Koncentrationen af BSA i forhold til koncentrationen af prøve, der resulterer i sarrme farvedannelse i Goomassie brilliant blue-farvébindingsmikroassay.

DK 169749 60 EKSEMPEL 17

Undersøgelse af E. coli- og P. multocida-sonikater for cytopatisk aktivitet.

Sonikater af E. coli SPE 312 og P. multocida 45/78 frem-5 stillet som beskrevet i eksempel 16 blev undersøgt for cytopatisk effekt i celletesten ved embryonale bovine lungeceller (EBL) (ref. 29) . En 5-folds fortyndingsrække blev fremstillet for hvert sonikat, og 30 μΐ af hver prøve blev tilsat 1,8 x 10^ EBL-celler i 120 μΐ kulturmedium, og 10 blandingen blev inkuberet i 3 døgn ved 37“ C før fiksering og farvning. Prøver, der resulterede i monolag af EBL-celler, der morfologisk kunne skelnes fra epithellignende hvirvlende mønstre i negativ kontrolkultur, blev vurderet som cytopatisk. De cytopatiske effekter af affinitetsop-15 renset rPMT og PMT i EBL-celletesten blev bestemt på samme måde. Den mindste cytopatiske dosis (MCD) for prøverne blev beregnet som den mindste mængde rPMT eller PMT, bestemt ved den kvantitative PMT-ELISA, der fremkalder en cytopatisk effekt.

20 Neutralisering af den cytopatiske effekt af E. coli SPE

313-sonikat ved anti-PMT-MAb'er blev sammenlignet med neutralisering af rent PMT: Prøver (30 μΐ) indeholdende ca. 1 μ g MAb og varierende mængder sonikat eller PMT blev inkuberet i 15 minutter ved 20°C før tilsætning til EBL-celler.

25 Resultaterne blev registreret som antal MCD'er neutraliseret af hver MAb og som forhold mellem antal neutraliserede MCD'er af sonikatet og af rent PMT for hvert MAb.

Sonikater af SPE 308 og SPE 312 viste sig at fremkalde morfologiske ændringer i embryonale bovine lungeceller 30 (EBL), som var identiske med de forandringer, der fremkaldes af toxinogene stammer af P. multocida (figur 19 (data for SPE 308 ikke vist)). Som påvist for rent PMT kunne den cytopatiske effekt af E. coli SPE 312-sonikatet 61 DK 169749 B1 neutraliseres ved inkubering med anti-PMT-MAb'er. Mellem 5 og 125 gange sonikatets MCD kunne neutraliseres ved hjælp af forskellige anti-PMT-MAb'er, og mellem 3 og 125 gange MCD for det rene PMT blev neutraliseret. Det samlede gen-5 nemsnit ± SD af de 10 beregnede værdier af det relative antal neutraliserede MCD'er for E. coli SPE 312-sonikat sammenlignet med PMT var 95% ± 32%. Et PMT-urelateret MAb anvendt som kontrol neutraliserede ikke effekterne af de to cytopatiske præparationer.

10 EKSEMPEL 18

Analyse af beskaffenheden af DNA, der flankerer pmt-genet

Med henblik på at undersøge beskaffenheden af det DNA, der flankerer pmt-crenet i P. multocida 45/78 udførtes "chromosome walking" som beskrevet i ref. 37. Under anvendelse af 15 en kolonihybridiseringsprocedure blev plasmider indeholdende P. multocida-DNA isoleret fra P. multocida-aenbibliote-ket beskrevet i eksempel 4.

Prober

Plasmidet pLOL03 blev konstrueret ved at subklone et 0,8 kb 20 Accl-HindiII-DNA-fragment af pSPE 344 (figur 20) i vektoren pGEM-blue (Promega, Wi, USA). Plasmidet pLOR02 blev ligeledes konstrueret ved subkloning af 2,4 kb EcoRI-Bglll-fragmentet fra pSPE 312 (figur 20) i vektoren pGEM-blue. E. coli K12-stammen DH5alpha (BRL, Md, USA) blev anvendt som 25 værtsstamme for pLOL03 og pLOR02. pLOL03 og pLOR02 i line-ariserede former blev anvendt til generering af RNA-prober af P- multocida-DNA7et indeholdt i disse plasmider. RNA-proberne blev radioaktivt mærket under anvendelse af Ribo-probe System II-fremgangsmåden (Promega, Wi, USA) og an-30 vendt i kolonihybridiseringer og Southern blots beskrevet nedenfor.

62 DK 169749 B1

Kolonihvbridiserinq P. multocida-genbiblioteket blev spredt i egnet fortynding på adskillige LB-plader indeholdende 10 μg/ml tetracyclin og inkuberet natten over ved 37°C. Replikater af pladerne 5 blev udført på nitrocellulosemembranfiltre, og cellerne blev lyseret, og DNA'et fikseret til filtrene som beskrevet i eksempel 15.

Præhybridisering og hybridisering blev udført ved 65°C i 50% formamid, 6 x SSC (0,15 NaCl, 0,015M tri-natriumcitrat, 10 pH 7,0), 0,1% SDS, 5 x Denhardt-opløsning og 200 μg/ml denatureret laksesperma-DNA i henholdsvis mindst 2 timer og natten over. Efter hybridisering blev filtrene vasket 2 gange ved stuetemperatur i 1 x SSC, 0,1% SDS, og 2 gange ved 65°C i 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Efter vask lodes filtrene 15 autoradiografere natten over.

Denne fremgangsmåde resulterede i isoleringen af et antal kloner indeholdende P. multocida-DNA. der flankerer inser-tionerne i pSPE 308 eller pSPE 312. Disse kloner blev yderligere analyseret under anvendelse af Southern blot-teknik 20 (ref. 17). Southern blots viste, at følgende plasmider blev genkendt af RNA-proben, der kodes for af pLOL03: pLOAOl, pLOA02 og pLOA03. Tilsvarende blev plasmideme pLOBOl, pLOB02 og pLOB03 genkendt af RNA-proben, der kodes for af pLOR02.

25 pLOA03 (ca. 14,2 kb) og pLOB03 (ca. 12,7 kb) indeholdt de største insertioner. Deres restriktionskort og en Southern blot-analyse viser, at pLOA03 og pSPE 308 indeholder overlappende DNA på ca. 4,0 kb, og at pLOB03 og pSPE 312 indeholder overlappende DNA på ca. 1,7 kb som vist i figur 20.

30 Et Southern blot blev fremstillet under anvendelse af DNA ekstraheret som beskrevet i eksempel 4 (en Kl-gradient (0,875 g/ml) blev anvendt i stedet for CsCl2-gradient) fra den toxinogene P. multocida 45/78 og fra en non-toxinogen 63 DK 169749 B1 P. multocida-stamme MH81P8, type D (ref. 36) og plasmiderne pLOA03, pLOA02, pSPE 308, pSPE 312 og pLOB03 skåret med restriktionsenzymer som angivet i figur 21. Proben var 2,4 kb BglII-EcoRl-fragmentet af pLOB03 radioaktivt mærket 5 ved hjælp af nicktranslation (Rigby et al., 1977, (ref.

19)). Resultaterne viser, at: 1) Proben genkender en DNA-sekvens på hvert af plasmiderne pLOA03 og pLOB03. Der er således en homolog sekvens på hver side af pmt-genet. Afstanden mellem disse ho- 10 mologe sekvenser er ca. 25 kb.

2) Proben genkender distinkte fragmenter af kromosomalt DNA fra begge P. multocida-stammer anvendt i denne Southern blot.

De ovennævnte fund tyder på, at det DNA, der flankerer pmt-15 genet, og følgelig pmt-genet selv, oprindeligt har været indeholdt i en bakteriofag, en transposon, et plasmid eller et andet genetisk element, som er integreret i bakteriekromosomet .

Dot blot 20 DNA fra 24 bakteriofager, som var isoleret fra P. multocida- stammer. og som alle var fundet at være forskellige med hensyn til deres lyseringsmønstre over for en række P. multocida- stammer. blev bundet til et nylonfilter ved hjælp af dot blotting. Plasmidet pLOA03 blev radioaktivt mærket 25 ved hjælp af nicktranslation og anvendt som en probe mod filteret. Hybridiserings- og vaskningsbetingelser var som beskrevet ovenfor. Resultaterne er vist i figur 22. Proben hybridiserede til 22 ud af 24 bakteriofager og, som forventet, til de 4 positive kontroller. Under anvendelse af pSPE 30 308 og pLOB03 som prober blev lignende resultater opnået.

pSPE 312 gav kun ringe hybridisering til nogle af bakterio-fag-genomerne. 4,5 kb pmt-genet indeholdende Clal-PvuII-fragmentet af pSPE 312 (figur 5) viste ikke nogen homologi 64 DK 169749 B1 til nogen af bakteriofag-genomerne (autoradiografer er ikke vist).

Disse resultater viser, at der er sekvenser homologe med P. multocida-bakteriofacr-DNA på begge sider af pmt-genet. Det-5 te underbygger yderligere antagelsen om, at pmt-genet er indeholdt i en profag.

65 DK 169749 B1

BIBLIOGRAFI

1. K.B. Pedersen og K. Barfod, 1981. The aetiological significance of Bordetella bronchiseptica amd P. multocida in atrophic rhinitis of swine. Mord. Vet.-Med. 33: 5 s. 513-522.

2. J.M. Rutter og X. Rojas, 1982. Atrophic rhinitis in piglets: Differences in the pathogenicity of Pasteurella multocida in combined infections with Bordetella bronchiseptica. Vet. Rec. 110: s. 531-535.

10 3. F. Elling og K.B. Pedersen, 1985. The pathogenesis of persistent turbinate atrophy induced by toxigenic Pasteurella multocida in pigs. Vet. Pathol. 22: s. 469-474.

4. K.B. Pedersen, J.P. Nielsen, N.T. Foged, F. Elling, N.C. Nielsen og P. Willeberg, 1988. Atrophic rhinitis in pigs: 15 Proposal for a revised definition. Vet. Rec. 22: s. 490-491.

5. K.B. Pedersen og F. Elling, 1984. The pathogenesis of atrophic rhinitis in pigs induced by toxigenic Pasteurella multocida. J. Comp. Pathol. 94: s. 203-214.

20 6. N.T. Foged, K.B. Pedersen og F. Elling, 1987, Charac terization and biological effect of the P. multocida toxin. FEMS Microbiol. Lett. 43: s. 45-51.

7. E.M. Kamp, P.J. v.d. Heijden og B.J. Tetenburg, 1987, Purification of a heat labile dermonecrotic toxin from 25 culture fluid of Pasteurella multocida. Vet. Microbiol. 13: s. 235-248.

8. T. Nakai, A. Sawata, M. Tsuji, Y. Samejima og K. Kume, 1984. Purification of dermonecrotic toxin from a sonic extract of Pasteurella multocida SP-72 serotype D. Infect.

30 Immun. 46: s. 429-434.

66 DK 169749 B1 9. C.L. Trummel, J.O. Cisar, M.J. Pabst og P. Goforth, 1979. Stimulation of bone resorption by a factor from Actinomyces viscosus. J. Perdont. Res. 14: s. 263-264.

10. P.A. Price, 1987. Structure and function of vitamin K-5 dependent bone proteins. In: C. Christiansen, J.S. Johansen, B.J. Riis (eds.) Osteoporosis, Nørhaven A/S, Viborg, Denmark, s. 656-663.

11. (se 30.) 12. J. Mestecky, 1987. The common mucosal immune system and 10 current strategies for induction of immune response in external secretions. J. Clin. Immunol. 7 (4): s. 265-276.

13. H.W.D. Matthes, W.H. Zenke, T. Grundstrom, A. Staub, M. Wintzerith og P. Chambon, 1984. Simultaneous rapid chemical synthesis of over 100 oligonucleotides on a microscale.

15 The EMBO Journal 3: s. 801-805.

14. 14. T. Maniatis, E.F. Frisch og J. Sambrook, 1982. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.

15. 15. G. KShler og C. Milstein, 1975. Continuous cul-20 tures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256: s. 495-497.

16. G. Klein, J. Luka og J. Zeuthen, 1980. Transformation induced by Epstein-Barr virus and the role of the nuclear antigen. Cold Spring Harbor Svmp. Quant. Biol. 44: 25 s. 253-261.

17. J.W. Goding, 1983. Monoclonal antibodies: Principles and practice. Academic Press, London, 267 sider.

67 DK 169749 B1 18. E. Southern, 1975, Detection of specific sequences among DN BA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98. s. 503.

19. Rigby, P.W.J., Dieckmann, M., Rhodes, C., og Berg, P.

5 1977. Labelling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase.

I.J.Mol.Biol. 113: s. 237-251.

20. Gebeyechu, G., Rao, P.Y., SooChan, P., Simms, D.A., og Kievan, L. 1987. Novel biotinylated nucleotide - analogs 10 for labelling and colorimetric detection of DNA. Nucleic Acids Res. 15: s. 4513-4534.

21. R.K. Saiki, S.J. Scharf, F. Faloona, K.B. Mullis, G.T. Horn, H.A. Ehrlich og N.A. Arnhiem, 1985. Enzymatic ampli- 15 fication of jS-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle-cell anemia. Science 230: s. 1350-1354.

22. J.P. Nielsen, M. Bisgaard, og K.B. Pedersen, 1986, Production of toxin in strains previously classified as P^_ 20 multocida. Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sec. B, 94= S. 203-204.

23. S. Fazekas, Groth, S. og D. Scheidegger, Production of monoclonal antibodies: Strategy and tactics, J. Immunol.

Meth. 35. 1980, S. 1-21.

25 24. U.K. Laemmli, 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: s. 680-685.

25. J. Kyhse-Andersen, 1984, Electroblotting of multiple gels: A simple apparatus without buffer tank for rapid 30 transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose.

J. Biochem. Biophvs. Methods 10: s. 203-209.

68 DK 169749 B1 26. O.J. Bjerrum, K.P. Larsen og M. Wilken, 1983. Some recent developments of the electroimmunochemical analysis of membrane proteins. Application of Zwittergent, Triton X-114 and western blotting technique, s. 79-124. In H. Tsche- 5 sche (ed.), Modern methods in protein chemistry. Walther de Gruyter Berlin, New York.

27. L.J. Anderson, J.C. Hierholzer, Y.O. Stone, C. Tsou og B.F. Fernie, 1986. Identification of epitopes on respiratory syncytial virus proteins by competitive binding immu- 10 noassay. J. Clin. Microbiol. 23; s. 475-480.

28. J.L. Guesdon, T. Temynck og T. Avrameas, 1979. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J. Histochem. Cvtochem. 27: s. 1131-1139.

29. H. Towbin, T. Staehlin og J. Gordon, 1979, Electropho-15 retie transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: Procedure and applications. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 76: s. 4350-4354.

30. M.J. Casadaban og S. Cohen, 1980. Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in Escherichia 20 coli. J. Mol. Biol. 138: s. 179-207.

31. W.B. Wood, 1966. Host specificity of DNA produced by Escherichia coli: Bacterial mutations affecting the restriction and modification of DNA. J. Mol. Biol. 16: s. 118-133.

25 32. B. Nilsson, M. Uhlen, S. Josephson, S. Gatenbeck og L.

Philipson, 1983, An improved positive selection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis, Nucleic Acids Res. 11(22): s. 8019-8030.

69 DK 169749 B1 33. F. Sanger, S. Nicklin og A.R. Coulson, 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: S. 5463-5467.

34. D.J. Clark og 0. Maaløe, 1967. DNA replication and the 5 division cycle in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 23: s. 99-112.

35. K.K. Stanley, 1983, Solubilization and immune-detection of jS-galactosidase hybrid proteins carrying foreign antigenic determinants. Nucleic Acids Res. 11(12): 10 s. 4077-4092.

36. J.M. Rutter, 1983. Virulence of Pasteurella multocida in atrophic rhinitis of gnotobiotic pigs infected with Bordetella bronchiseotica. Res. Vet. Sci. 34: s. 287-295.

37. K. Kaiser og N. Murry, 1985: The use of phage lambda 15 replacement vectors in the construction of representative genomic DNA libraries. In: DNA cloning, Vol. I, A practical approach, D.M. Glover (ed.) IRL Press, Oxford.

Claims (25)

1. DNA-fragment, kendetegnet ved, at det omfatter en nukleotidsekvens som vist i figur 10 (a)-(j), som koder for et Pa-5 steurella multocida-toxin, eller en subsekvens eller analog deraf, som koder for en immunogen subsekvens eller analog af toxinet.

2. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nukleotidsekvensen hidrører 10 fra et Pasteurella multocida-genom.

3. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nukleotidsekvensen hidrører fra en for Pasteurella multocida infektiøs bakteriofag eller fra et plasmid.

4. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nukleotidsekvensen er en syntetisk sekvens.

5. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nukleotidsekvensen er en 20 blandet genom- og syntetisk sekvens.

6. DNA-fragment ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er modificeret ved substituering, addition, insertion eller deletion af ét eller flere nukleotider i sekvensen.

7. DNA-fragment ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det er en DNA-subsekvens valgt blandt de kodende regioner A-R som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

8. DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1, 6 30 og 7, DK 169749 B1 kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en nukleotidsekvens, som koder for et andet polypeptid, fusioneret til nukleotidsekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen.

9. Ekspressionsvektor, som er i stand til at replikere i en værtsmikroorganisme, kendetegnet ved, at den omfatter et indsat DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8.

10. Ekspressionsvektor ifølge krav 9, 10 kendetegnet ved, at det indsatte DNA-fragment er en hvilken som helst af de kodende regioner A-R som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

11. Mikroorganisme, kendetegnet ved, at den er i stand til at ud-15 trykke et DNA-fragment ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, og at den indeholder en vektor ifølge krav 9 eller 10.

12. Mikroorganisme ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den er en bakterie.

13. Mikroorganisme ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er en gram-negativ bakterie, fortrinsvis E. coli.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af et Pasteurella multo-cida-toxin eller en immunogen subsekvens- eller analog der-25 af, kendetegnet ved, at den omfatter dyrkning af en mikroorganisme indeholdende en ekspressions-vektor ifølge krav 9 eller 10 tinder egnede betingelser til ekspression af toxinet eller den immunogene subsekvens 30 eller analog deraf, DK 169749 B1 høstning af toxinet eller toxinsubsekvensen eller -analogen fra kulturen, og eventuelt udsættelse af toxinet for posttranslationel modifikation til opnåelse af det detoxificerede toxin eller den 5 detoxificerede toxinanalog.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den omfatter følgende initiale trin a) isolering af et DNA-fragment omfattende en nukleotid-10 sekvens som vist i figur 10 (a)-(j), som koder for toxinet, eller en subsekvens eller analog af DNA-fragmentet, der koder for den immunogene toxinsubsekvens eller -analog, b) insertion af DNA-fragmentet, eventuelt i en egnet modificeret form resulterende i ekspression af det detoxifice- 15 rede toxin eller den detoxificerede toxinanalog eller en subsekvens eller analog deraf, som koder for en immunogen subsekvens af toxinet eller toxinanalogen, i en ekspressionsvektor, c) transformation af en egnet værtsmikroorganisme med 20 vektoren fremstillet i trin b).

16. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller 15, kendetegnet ved, at sekvensen, der koder for toxinet eller toxinanalogen, er modificeret ved substituering, addition, insertion eller deletion af én eller flere 25 nukleotider i sekvensen.

17. Fremgangsmåde ifølge krav 14 eller 15, kendetegnet ved, at de eventuelle posttransla-tionelle modifikationer er valgt blandt termisk behandling, behandling med et kemikalie, og substituering, addition, 30 insertion eller deletion af én eller flere aminosyrer i toxinet eller toxinanalogen. DK 169749 B1

18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at kemikaliet er valgt blandt formaldehyd, glutaraldehyd og et egnet proteolytisk enzym.

19. Fremgangsmåde ifølge krav 14, 5 kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfatter en hvilken som helst af de kodende regioner A-R som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfat-10 ter den kodende region G som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfatter den kodende region L som beskrevet i eksempel 9 og vist 15 i figur 13.

22. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfatter den kodende region 0 som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

23. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at ekspressionsvektoren omfatter den kodende region Q som beskrevet i eksempel 9 og vist i figur 13.

24. Anvendelse af en immunogen subsekvens eller analog af

25 Pasteurella multocida-toxinet bestående af 1285 aminosyrer, som kodes for af DNA-sekvensen vist i figur 10 (a)-(j), idet subsekvensen eller analogen er én, som kan kodes for af et derivat af DNA-sekvensen som vist i figur 10 (a)-(j) fremstillet ved substituering, addition, insertion eller 30 deletion af ét eller flere nukleotider i sekvensen, til fremstilling af en vaccine til immunisering af et dyr mod atrofisk rhinitis.