DK169134B1 - A process for expressing a protein product in Aspergillus, and a process for preparing protein products in Aspergillus oryzae - Google Patents

Description

DK 169134 B1DK 169134 B1

Den foreliggende opfindelse angar en- fremgangsmåde til fremstilling af proteinprodukter i Aspergillus oryzae.The present invention provides a process for producing protein products in Aspergillus oryzae.

Det har overraskende vist sig, at Aspergillus oryzae producerer højere udbytter af genprodukterne end andre Aspergillus stammer.Surprisingly, it has been found that Aspergillus oryzae produces higher yields of the gene products than other Aspergillus strains.

Indtil nu har der været udviklet et stort antal 5 fremgangsmåder til fremstilling af polypeptider eller proteiner ved hjælp af rekombinant DNA-teknologi..Hovedinteressen har været koncentreret om bakterier og gær, f.eks. E. coli, Bacillus subtilis og Saccharomyces cerevisiae, der er velkarakteriserede arter hvad angår f.eks. ekspression og 10 selekteringssystemer.Up to now, a large number of 5 methods have been developed for the production of polypeptides or proteins by recombinant DNA technology. The main interest has been concentrated on bacteria and yeast, e.g. E. coli, Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae, which are well-characterized species, e.g. expression and 10 selection systems.

Foruden de ovennævnte mikroorganismer er filamentøse svampe, såsom Aspergillus niger, attraktive kandidater som værtsorganismer for rekombinant DNA-vektorer, idet de er velkarakteriserede mikroorganismer, der i vid udstrækning er 15 blevet anvendt til kommerciel produktion af enzymer. Bestræbelserne har især været koncentreret om udviklingen af transformeringssystemer, ved hvilke der anvendes en selektionsmarkør, der tillader selektering af transformanter fra ikke-transformerede værtsorganismer.In addition to the aforementioned microorganisms, filamentous fungi such as Aspergillus niger are attractive candidates as host organisms for recombinant DNA vectors, being well-characterized microorganisms widely used for commercial production of enzymes. In particular, efforts have been focused on the development of transformation systems using a selection marker that allows the selection of transformants from non-transformed host organisms.

20 I de seneste år er der blevet beskrevet selekte ringsmarkører til transformering af Aspergillus nidulans, og der er for nylig blevet udviklet procedurer til integrativ transformering af den filamentøse svamp Aspergillus nidulans med det formål at undersøge de genetiske og molekylære 25 processer, der kontrollerer svampecelledifferentiering.20 In recent years, selective markers for transforming Aspergillus nidulans have been described, and procedures have recently been developed for integrative transformation of the filamentous fungus Aspergillus nidulans for the purpose of investigating the genetic and molecular processes controlling fungal cell differentiation.

Transformering af A. nidulans er blevet demonstreret ved anvendelse af plasmider indeholdende Neurospora crassa pyr-4 genet (Ballance, D.J. et al.,Transformation of A. nidulans has been demonstrated using plasmids containing the Neurospora crassa pyr-4 gene (Ballance, D.J. et al.,

Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983) 284-289), A. nidulans 30 amdS genet (Tilburn, J.G. et al., Gene 2_6 (1983) 205-221), A. nidulans trpC genet (Yelton, M.M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A., 81 (1984) 1470-1474) og A. nidulans argB genet (John, M.A. og Peberdy J., Microb.Technol. (3 (1984) 386-389). Det 2 DK 169134 B1 transformerede DNA fandtes at være integreret i værtsgenomet med temmelig lave frekvenser (typisk <^1000 transformanter/pg DNA).Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983) 284-289), A. nidulans 30 amdS gene (Geburn, JG et al., Gene 2_6 (1983) 205-221), A. nidulans trpC gene (Yelton, MM et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 81 (1984) 1470-1474) and A. nidulans argB gene (John, MA and Peberdy J., Microb.Technol. (3 (1984) 386-389 The transformed DNA was found to be integrated into the host genome with fairly low frequencies (typically <1000 transformants / µg DNA).

For nylig er transformering af Aspergillus niger 5 med amdS genet fra A. nidulans blevet beskrevet (Kelly, J.M. og Hynes, M.J., EMBO Journal _4 (1985), 475-479), og amdS blev vist at være en potentiel selektionsmarkør til anvendelse ved transformering af Aspergillus niger, der ikke kan gro stærkt på acetamid som den eneste nitrogenkilde. Transformering af 10 Aspergillus niger under anvendelse af argB genet fra Aspergillus nidulans er også blevet beskrevet for nylig (Buxton, F.P. et al., Gene _37 (1985), 207-214).Recently, transformation of Aspergillus niger 5 with the amdS gene from A. nidulans has been described (Kelly, JM and Hynes, MJ, EMBO Journal _4 (1985), 475-479), and amdS has been shown to be a potential selection marker for use in transformation of Aspergillus niger that cannot grow strongly on acetamide as the only nitrogen source. Transformation of 10 Aspergillus niger using the argB gene from Aspergillus nidulans has also been described recently (Buxton, F.P. et al., Gene _37 (1985), 207-214).

Der er indtil nu ikke blevet udviklet nogle systemer til ekspression af fremmede proteiner i den filamen-15 tøse svamp Aspergillus oryzae hovedsageligt på grund af utilstrækkeligt kendskab til, hvordan genekspressionen i denne svamp skal kontrolleres, og på grund af mangel på egnede selekterbare genetiske markører på kloningsvektorer.To date, no systems have been developed for the expression of foreign proteins in the filamentous fungus Aspergillus oryzae mainly due to insufficient knowledge of how to control gene expression in this fungus and due to a lack of suitable selectable genetic markers on cloning.

Ifølge den foreliggende opfindelse er det nu blevet 20 vist, at den ovenfor beskrevne transformeringsteknik kan anvendes til opnåelse af et højt niveau af ekspression af heterologe proteiner eller til at forøge produktionen af homologe proteiner i Aspergillus oryzae..According to the present invention, it has now been demonstrated that the transformation technique described above can be used to achieve a high level of expression of heterologous proteins or to increase the production of homologous proteins in Aspergillus oryzae.

Som anvendt her betyder udtrykket "heterologe 25 proteiner" proteiner, der ikke produceres af A. oryzae, hvorimod "homologe proteiner" betyder proteiner, der produceres af A. oryzae selv.As used herein, the term "heterologous 25" means proteins not produced by A. oryzae, whereas "homologous proteins" means proteins produced by A. oryzae itself.

Det er mere specifikt blevet vist, at selektering for A. oryzae stammer, der er transformeret med DNA, der 30 koder for et ønsket proteinprodukt, er mulig ved anvendelse af de markørgener, der anvendes til transformering af A. niger og A. nidulans. På grund af den fylogenetiske forskel mellem de sidstnævnte svampe og A. oryzae (Raper, K.B. og Fennell, D.I. (1965) The Genus Aspergillus) kunne dette ikke 35 forudses på nogen måde.More specifically, it has been shown that selection for A. oryzae strains transformed with DNA encoding a desired protein product is possible using the marker genes used to transform A. niger and A. nidulans. Due to the phylogenetic difference between the latter fungi and A. oryzae (Raper, K.B. and Fennell, D.I. (1965) The Genus Aspergillus), this could not be predicted in any way.

3 DK 169134 B13 DK 169134 B1

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til ekspression af et proteinprodukt i Aspergillus ved (a) tilvejebringelse af et rekombinant DNA- 5 kloningsvektorsystem, der er i stand til at integreres i genomet af en Aspergillusvært i en eller flere kopier og omfattende: DNA-sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspression, omfattende en promotor, transskriptionsstartsteder og transskriptionsterminerings- og poly-10 adenyleringsfunktioner, idet promotoren kan forudgås af upstream aktiveringssekvenser, en egnet markør til selektering af transformanter; og en DNA-sekvens, der koder for det ønskede produkt; (b) transformering af Aspergillusværten, der ikke 15 indeholder et funktionelt gen for den valgte selekteringsmarkør, med det rekombinante DNA-kloningsvektorsystem fra trin a, og (c) dyrkning af den transformerede Aspergillus-stamme i et egnet dyrkningsmedium kendetegnet ved, at der som 20 Aspergillusvært anvendes Aspergillus oryzae.Thus, the present invention relates to a method for expressing a protein product in Aspergillus by (a) providing a recombinant DNA cloning vector system capable of being integrated into the genome of an Aspergillus host in one or more copies and comprising: DNA sequences encoding functions that facilitate gene expression, including a promoter, transcription start sites, and transcription termination and poly-adenylation functions, the promoter being preceded by upstream activation sequences, a suitable marker for selecting transformants; and a DNA sequence encoding the desired product; (b) transforming the Aspergillus host, which does not contain a functional gene for the selected selection marker, with the recombinant DNA cloning vector system of step a, and (c) culturing the transformed Aspergillus strain into a suitable culture medium characterized in that as Aspergillus host Aspergillus oryzae is used.

Den foreliggende opfindelse vedrører desuden en fremgangsmåde til fremstilling af et proteinprodukt i Aspergillus oryzae, ved hvilken fremgangsmåde en Aspergillus oryzae stamme, der er transformeret med et rekombinant DNA-25 kloningsvektorsystem, som beskrevet ovenfor dyrkes i et egnet næringsmedium, og produktet udvindes fra næringsmediet.The present invention further relates to a method for producing a protein product in Aspergillus oryzae, wherein a method is transformed with an Aspergillus oryzae strain transformed with a recombinant DNA cloning vector system as described above into a suitable nutrient medium and the product is recovered from the nutrient medium.

Den foreliggende opfindelse skal illustreres yderligere med reference til tegningen på hvilken, fig. 1 viser DNA-sekvensen af TAKA-amylasepromo-30 toren og upstream-promotorregioner, præregionen og 5'-delen af det strukturelle gen for TAKA-araylasen, 4 DK 169134 B1 fig. 2 viser et endonucleaserestriktionskort for plasmid pTAKAl7, fig. 3 viser konstruktionen af plasmid p285'proC, fig. 4a og b viser DNA-sekvensen af- præpro Rhizomu-5 cor miehei aspartat proteinase cDNA sammen med den afledte aminosyresekvens karakteriseret ved trebogstavsforkortelser, fig. 5 viser konstruktionen af plasmid pRMP, fig. 6 viser endonucleaserestriktionskortet for plasmid pCAMG91, 10 fig. 7a viser konstruktionen af plasmid pICAMG/Term, fig. 7b viser konstruktionen af plasmid p686, fig. 8 viser konstruktionen af plasmid pRMPAMGTerm, fig. 9a viser konstruktionen af plasmid pB408.3, 15 fig. 9b viser konstruktionen af plasmid p778, fig. 10 viser konstruktionen af plasmid p719, fig. 11 viser konstruktionen af plasmid p777, fig. 12 viser sekvensen af præpro Rhizomucor miehei lipase cDNA sammen med den afledte aminosyresekvens angivet 20 ved trebogstavsforkortelser, fig. 13a viser konstruktionen af plasmid pB544, fig. 13b viser konstruktionen af plasmid p787, fig. 14 viser DNA-sekvensen af et syntetisk fragment RML5', 25 fig. 15a viser konstruktionen af plasmid pTOC51 og fig. 15b viser konstruktionen af plasmid pTOC56.The present invention will be further illustrated with reference to the drawing in which; 1 shows the DNA sequence of the TAKA amylase promoter and upstream promoter regions, the pre-region and the 5 'portion of the structural gene for the TAKA aryase, 4 FIG. 169134 B1 FIG. Figure 2 shows an endonuclease restriction map for plasmid pTAKA17; 3 shows the construction of plasmid p285'proC; 4a and b show the DNA sequence of prepro Rhizomu-5 cor miehei aspartate proteinase cDNA together with the deduced amino acid sequence characterized by three-letter abbreviations; 5 shows the construction of plasmid pRMP; FIG. 6 shows the endonuclease restriction map for plasmid pCAMG91; FIG. 7a shows the construction of plasmid pICAMG / Term; 7b shows the construction of plasmid p686; 8 shows the construction of plasmid pRMPAMGTerm; FIG. 9a shows the construction of plasmid pB408.3, FIG. 9b shows the construction of plasmid p778; 10 shows the construction of plasmid p719; FIG. 11 shows the construction of plasmid p777; FIG. 12 shows the sequence of prepro Rhizomucor miehei lipase cDNA together with the deduced amino acid sequence indicated 20 by three-letter abbreviations; 13a shows the construction of plasmid pB544; 13b shows the construction of plasmid p787; 14 shows the DNA sequence of a synthetic fragment RML5 ', 25 fig. 15a shows the construction of plasmid pTOC51 and FIG. 15b shows the construction of plasmid pTOC56.

Den anvendte transformeringsteknik var en metode tilpasset fra metoderne til transformering af A. nidulans 30 (Ballance et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289; Tilburn et al., Gene 26 (1983), 205-221, Yelton et al. Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 81 (1984), 1470-1474) og lignende metoden beskrevet af Buxton et al., (Gene _37 (1985), 207-214) til transformering af A. niger. Ved fremgangsmåden 35 ifølge den foreliggende opfindelse transformeres Aspergillus oryzae med et vektorsystem, der indeholder en selekteringsmarkør, der er i stand til at inkorporeres i værtsstammens 5 DK 169134 B1 genom, men som ikke indeholdes i værtsstammen før transformering. Der kan derpå selekteres for transformanter, og disse kan isoleres fra ikke-transformanter på basis af den inkorporerede selekteringsmarkør.The transformation technique used was a method adapted from the methods of transforming A. nidulans 30 (Ballance et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 112 (1983), 284-289; Auerurn et al., Gene 26 (1983) , 205-221, Yelton et al. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81 (1984), 1470-1474) and the similar method described by Buxton et al. (Gene _37 (1985), 207-214) by A. niger. In the method 35 of the present invention, Aspergillus oryzae is transformed with a vector system containing a selection marker capable of being incorporated into the genome of the host strain 5 but not contained in the host strain prior to transformation. Transformants can then be selected and isolated from non-transformants on the basis of the incorporated selection marker.

5 Foretrukne selekteringsmarkører er argB-(A.Preferred selection markers are argB- (A.

nidulans eller A. niger), trpC-(A. nidulans), amdS-(A. nidulans), eller pyr4-(Neurospora crassa) gener, eller DHFR-(dihydrofolatreduktase eller mutanter deraf) genet. Mere foretrukne selekteringsmarkører er argB- eller amdS-genet.nidulans or A. niger), the trpC (A. nidulans), amdS (A. nidulans), or pyr4 (Neurospora crassa) genes, or the DHFR (dihydrofolate reductase or mutants thereof) gene. More preferred selection markers are the argB or amdS gene.

10 Vildtype A. oryzae stammer er normalt argB+ (d.vs. argB genet er funktionelt i A. oryzae). Hvis argB vælges som selekteringsmarkøren, må der som værtsorganisme anvendes en argB mutantstamme af A. oryzae, der er defekt i genet for denne markør. A. oryzae argB mutanter kan fremstilles som beskrevet 15 af F.P. Buxton et al., (Gene 3J7 (1985), 207-214). En argB mutant er defineret som en mutant, der har en defekt i ornithintranscarbamylasegenet. På den anden side kan amdS genet anvendes som selekteringsmarkør for transformering af vildtype A. oryzae, da vildtypestammerne ikke indeholder 20 dette gen.Wild type A. oryzae strains are usually argB + (i.e., the argB gene is functional in A. oryzae). If argB is selected as the selection marker, an argB mutant strain of A. oryzae that is defective in the gene for that marker must be used as the host organism. A. oryzae argB mutants can be prepared as described 15 by F.P. Buxton et al. (Gene 3J7 (1985), 207-214). An argB mutant is defined as a mutant having a defect in the ornithine transcarbamylase gene. On the other hand, the amdS gene can be used as a selection marker for transforming wild-type A. oryzae, as the wild-type strains do not contain this gene.

Den anvendte promotor, ovenfor hvilken der som bekendt kan findes upstream-aktiverende sekvenser og enhancersekvenser, kan være enhver DNA-sekvens, der udviser en stærk transskriptionsaktivitet i Aspergillus oryzae og kan 25 afledes fra gener, der koder for både ekstracellulære og intracellulære proteiner, såsom amylaser, glucoamylaser, proteaser, lipaser, cellulaser og glycolytiske enzymer.The promoter used above, which as is known, can be found upstream activating sequences and enhancer sequences, can be any DNA sequence that exhibits strong transcriptional activity in Aspergillus oryzae and can be derived from genes encoding both extracellular and intracellular proteins, such as amylases, glucoamylases, proteases, lipases, cellulases and glycolytic enzymes.

Egnede promotorer kan fås fra gener for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei aspartat proteinase, A. niger 30 glucoamylase, A. niger neutral α-amylase, A. niger syrestabil α-amylase og Rhizomucor miehei lipase. Eksempler på promotorer fra gener for glycolytiske enzymer er TPI, ADH og PGK.Suitable promoters can be obtained from genes for A. oryzae TAKA amylase, Rhizomucor miehei aspartate proteinase, A. niger 30 glucoamylase, A. niger neutral α-amylase, A. niger acid stable α-amylase and Rhizomucor miehei lipase. Examples of promoters from genes for glycolytic enzymes are TPI, ADH and PGK.

6 DK 169134 B16 DK 169134 B1

En foretrukken promotor ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er A. oryzae TAKA-amylase-promo-toren. TAKA-amylasen er en velkendt a-amylase (Toda et al.,A preferred promoter of the method of the present invention is the A. oryzae TAKA amylase promoter. The TAKA amylase is a well known α-amylase (Toda et al.,

Proc.Japan Acad. Ser. B (1982) 208-212). DNA, der koder 5 for promotorregionen blev isoleret fra TAKA-amylasegenom-klonen. Sekvensen for promotoren og regioner oven for promotoren sammen med præregionen og 51-enden af det strukturelle gen for TAKA-amylase er illustreret i fig. 1.Proc.Japan Acad. Ser. B (1982) 208-212). DNA encoding the promoter region was isolated from the TAKA amylase genome clone. The sequence of the promoter and regions above the promoter together with the pre-region and 51 end of the structural gene for TAKA amylase are illustrated in FIG. First

Som beskrevet i yderligere detaljer i eksempel 2 10 blev en DNA-sekvens, der koder for TAKA-amylasen omfattende præregionen og promotor- og upstreamaktiveringssekvenser, isoleret fra A. oryzae mycelium og indsat i BamHI-fo'rdøjet pBR322 til dannelse af pTAKA 17 (se fig. 2). I pTAKA 17 er DNA fra A. oryzae vist som en 5,5 kb BamHI/Sau3AI -15 BamHI/Sau3AI fragment, idet promotor- og upstreamsaktive-ringssekvenserne repræsenterer et 2,1 kb fragment, der starter ved position 0. Den fastlagte DNA-sekvens af promotor- og upstreamaktiveringssekvenserne op til Bglll spaltningsstedet er vist i fig. 1. Promotoren ender ved 20 nucleotid(-l), der går forud for Met(l) kodonen for TAKA-amylasepræsekvensen. Nucleotidsekvensen, der koder for præsekvensen, udgøres af 63 nucleotider, og den modne TAKA-amylase starter ved en position, der svarer til nucleotid 64.As described in further detail in Example 21, a DNA sequence encoding the TAKA amylase comprising the pre-region and promoter and upstream activation sequences was isolated from A. oryzae mycelium and inserted into BamHI-digested pBR322 to form pTAKA 17 ( see Fig. 2). In pTAKA 17, DNA from A. oryzae is shown as a 5.5 kb BamHI / Sau3AI -15 BamHI / Sau3AI fragment, the promoter and upstream activation sequences representing a 2.1 kb fragment starting at position 0. The determined DNA sequence of the promoter and upstream activation sequences up to the BglII cleavage site is shown in FIG. 1. The promoter ends at 20 nucleotide (-1) preceding the Met (1) codon of the TAKA amylase sequence. The nucleotide sequence encoding the pre-sequence is constituted by 63 nucleotides and the mature TAKA amylase starts at a position corresponding to nucleotide 64.

Fra pTAKA 17 kan hele promotorsekvensen omfattende 25 sekvenser ovenfor promotoren eller funktionelle dele deraf isoleres på måder, der er indlysende for en fagmand. Promotorsekvensen kan forsynes med linkere med det formål at indføre et specifikt restriktionsspaltningssted, der gør det nemmere at ligere promotorsekvensen med yderligere DNA, 30 f.eks. genet, der koder for det ønskede proteinprodukt, eller forskellige præregioner (signalpeptider).From pTAKA 17, the entire promoter sequence comprising 25 sequences above the promoter or functional parts thereof can be isolated in ways obvious to one skilled in the art. The promoter sequence may be provided with linkers for the purpose of introducing a specific restriction cleavage site which makes it easier to ligate the promoter sequence with additional DNA, e.g. the gene encoding the desired protein product, or various pre-regions (signal peptides).

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er sekvensen fra nucleotid -1144 (se fig. 1) ( der repræsenterer starten af en Sall spaltningssted) til 35 nucleotid -10 blevet anvendt som et eksempel på en velfungerende del af promotorregionen. I en yderligere udførelsesform for den foreliggende opfindelse var nucleotidsekvensen fra ^ DK 169134 B1 nucleotid -1176 til -1 forudgået af en endnu ikke sekventeret 1,05 kb fragment fra pTAKA 17. Det er indlysende for en fagmand, at der kan anvendes forskellige fragmenter.In the method of the present invention, the sequence from nucleotide-1144 (see Fig. 1) (representing the onset of a SalI cleavage site) to 35 nucleotide-10 has been used as an example of a well-functioning part of the promoter region. In a further embodiment of the present invention, the nucleotide sequence from DK DK 169134 B1 nucleotide -1176 to -1 was preceded by a yet to be sequenced 1.05 kb fragment from pTAKA 17. It will be apparent to one skilled in the art that various fragments may be used.

Ifølge en udførelsesform for fremgangsmåden ifølge 5 den foreliggende opfindelse anvendes der således som promotor- og upstreamaktiveringssekvens følgende sekvens eller en funktionelt ækvivalent nucleotidsekvens:Thus, according to an embodiment of the method of the present invention, the following sequence or a functionally equivalent nucleotide sequence is used as the promoter and upstream activation sequence:

GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 10 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA 15 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT 20 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC 25 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA 30 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 10 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA 15 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT 20 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC 25 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA 30 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG

der repræsenterer sekvensen fra nucleotid -1144 til -10 i fig. 1.representing the sequence from nucleotide -1144 to -10 in FIG. First

35 8 DK 169134 B135 8 DK 169134 B1

Ifølge en yderligere udførelsesform for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan der anvendes en promotor- og upstreamaktiveringssekvens med følgende sekvens eller en funktionelt ækvivalent nucleotid-5 sekvens:According to a further embodiment of the method of the present invention, a promoter and upstream activation sequence having the following sequence or a functionally equivalent nucleotide sequence may be used:

AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA 10 GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC 15 CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG 20 GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC 25 AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG 30 AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTTAGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA 10 GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC 15 CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG 20 GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC 2 5 AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG 30 AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT

der repræsenterer sekvensen fra nucleotid -1176 til -1 i fig.representing the sequence from nucleotide -1176 to -1 in FIG.

1, idet denne sekvens kan forudgås af den endnu ikke sekventerede upstream-region på 1,05 kb fra pTAKA 17 35 (position 0 til 1,05 i fig. 2).1, this sequence being preceded by the as yet sequenced upstream region of 1.05 kb from pTAKA 17 35 (position 0 to 1.05 in Fig. 2).

9 DK 169134 B19 DK 169134 B1

Terminator- og polyadenyleringssekvenserne kan fås fra de samme kilder som promotorerne. Enhancersekvenser kan også indsættes i konstruktionen.The terminator and polyadenylation sequences can be obtained from the same sources as the promoters. Enhancer sequences can also be inserted into the construct.

Det udtrykte produkt kan akkumuleres inden for 5 cellerne, hvilket kræver en sprængning af cellerne for at isolere produktet. For at undgå dette yderligere trin og også for at minimere mængden af eventuel nedbrydning af det udtrykte produkt i cellerne, foretrækkes det, at produktet secerneres fra cellerne. Til dette formål udstyres genet for 10 det ønskede produkt med en præregion, der sikrer effektiv ledelse af det udtrykte produkt ind i cellens sekretionsvej. Denne præregion, som kan være et naturligt forekommende signal- eller lederpeptid eller funktionelle dele deraf eller syntetiske sekvenser, der tilvejebringer sekretion, 15 fraspaltes sædvanligvis fra det ønskede produkt under sekretionen, hvorved det modne produkt er klar til isolering fra næringsvæsken.The expressed product can accumulate within the 5 cells, requiring a rupture of the cells to isolate the product. To avoid this further step and also to minimize the amount of possible degradation of the expressed product in the cells, it is preferred that the product be secreted from the cells. For this purpose, the gene for the desired product is equipped with a pregregation which ensures effective delivery of the expressed product into the secretory pathway of the cell. This pre-region, which may be a naturally occurring signal or leader peptide or functional parts thereof or synthetic sequences providing secretion, is usually cleaved from the desired product during secretion, whereby the mature product is ready for isolation from the nutrient liquid.

Præregionen kan fås fra gener for secernerede proteiner fra vilkårlige organismer.The pre-region can be obtained from genes for secreted proteins from arbitrary organisms.

20 Ifølge den foreliggende opfindelse kan præregionen fås fra et glucoamylase- eller amylasegen fra en Aspergillus-art, et amylasegen fra en Bacillusart, et lipase- eller proteinasegen fra Rhizomucor miehei, genet for α-faktoren fra S. cerevisiae eller kalveprochymosingenet. Mere foretrukket 25 fås præregionen fra genet for A. oryzae TAKA-amylase, A. niger neutral a-amylase, A. niger syrestabil a-amylase, B. licheniformis α-amylase, den maltogene amylase fra Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α-amylase eller B. licheni-formis subtilisin. Effektive signalsekvenser er A. oryzae 30 TAKA-amylasesignalet, Rhizomucor miehei aspartat proteinase-signal og Rhizomucor miehei lipasesignalet.According to the present invention, the pre-region can be obtained from a glucoamylase or amylase gene of an Aspergillus species, an amylase gene of a Bacillus species, a lipase or proteinase gene of Rhizomucor miehei, the gene for the α-factor of S. cerevisiae or the calf prochymosin gene. More preferably, the pre-region is obtained from the gene for A. oryzae TAKA amylase, A. niger neutral α-amylase, A. niger acid stable α-amylase, B. licheniformis α-amylase, maltogenic amylase from Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α -amylase or B. licheni-formis subtilisin. Effective signal sequences are the A. oryzae 30 TAKA amylase signal, Rhizomucor miehei aspartate proteinase signal and Rhizomucor miehei lipase signal.

TAKA-amylasesignalet har følgende sekvens ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCT MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaPro 35 10 DK 169134 B1TAKA amylase signal has the following sequence ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCT MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaPro 35 10

GCTTTGGCTGCTTTGGCT

AlaLeuAlaAlaLeuAla

Genet for det ønskede produkt, der funktionelt er 5 forbundet med promotor- og terminatorsekvenser, kan inkorporeres i en vektor, der indeholder en selekteringsmarkør, eller kan anbringes på en separat vektor eller et separat plasmid, der er i stand til at integreres i værtsstammens genom. Som anvendt her betyder udtrykket "vektorsystem" en 10 enkelt vektor eller et enkelt plasmid eller to eller flere vektorer eller plasmider, der sammen indeholder den totale DNA-information, der skal integereres i værtsgenomet.The gene of the desired product that is functionally associated with promoter and terminator sequences can be incorporated into a vector containing a selection marker, or may be placed on a separate vector or plasmid capable of integration into the host strain genome . As used herein, the term "vector system" means a single vector or single plasmid or two or more vectors or plasmids that together contain the total DNA information to be integrated into the host genome.

Vektorer eller plasmider kan være lineære eller lukkede cirkulære molekyler. Ifølge en foretrukket udførelsesform for 15 den foreliggende opfindelse kotransformeres A. oryzae med to vektorer, hvoraf den ene indeholder selekteringsmarkøren og den anden omfatter det resterende fremmede DNA, der skal introduceres i værtsorganismen, inklusive promotoren,genet for det ønskede produkt og transskriptionsterminator og 20 polyadenyleringssekvenser.Vectors or plasmids can be linear or closed circular molecules. According to a preferred embodiment of the present invention, A. oryzae is co-transformed with two vectors, one containing the selection marker and the other comprising the residual foreign DNA to be introduced into the host organism, including the promoter, gene for the desired product and transcription terminator, and polyadenylation sequences. .

Normalt er A. oryzae-transformanter stabile og kan dyrkes i fravær af et selekteringstryk. Hvis transformanterne viser sig at være ustabile, kan selekteringsmarkøren anvendes til selektering under dyrkningen. De transformerede celler 25 dyrkes da under et selektionstryk, der svarer til den anvendte markør.Normally A. oryzae transformants are stable and can be grown in the absence of a selection pressure. If the transformants are found to be unstable, the selection marker can be used for selection during cultivation. The transformed cells are then grown under a selection pressure corresponding to the marker used.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangsmåde til fremstilling af høje udbytter af mange forskellige polypeptider eller proteinprodukter i A. oryzae. A.The present invention provides a method for producing high yields of many different polypeptides or protein products in A. oryzae. A.

30 oryzae har i årevis været anvendt i kommerciel målestok til produktion af f.eks. TAKA-amylaseenzymet eller proteolytiske enzymer, og følgelig er fermenteringsteknologien for denne mikroorganisme veludviklet, og mikroorganismen er godkendt til anvendelse i fødevareindustrien. Den foreliggende 35 opfindelse giver mulighed for at anvende A. oryzae til industriel produktion af store mængder af i princippet ethvert polypeptid eller proteinprodukt. Eksempler på sådanne 11 DK 169134 B1 produkter er chymosin eller prochymosin og andre mælkekoaguleringsenzymer, proteases, amyloglucosidaser, syrestabile amylaser fra Aspergillus, svampelipaser eller prokaryote lipaser samt thermostabile bakterie- og 5 svampeamylaser.30 oryzae have for years been used on a commercial scale to produce e.g. The TAKA amylase enzyme or proteolytic enzymes, and consequently the fermentation technology for this microorganism is well developed and the microorganism is approved for use in the food industry. The present invention provides for the use of A. oryzae for the industrial production of large quantities of basically any polypeptide or protein product. Examples of such products are chymosin or prochymosin and other milk coagulation enzymes, proteases, amyloglucosidases, acid stable amylases from Aspergillus, fungal lipases or prokaryotic lipases, as well as thermostable bacterial and fungal amylases.

Den foreliggende opfindelse illustreres ved hjælp af produktionen af prochymosin, Rhizomucor miehei aspartat proteinase, TAKA-amylase og en lipase fra Rhizomucor miehei.The present invention is illustrated by the production of prochymosin, Rhizomucor miehei aspartate proteinase, TAKA amylase and a lipase from Rhizomucor miehei.

Generne for disse enzymer blev isoleret fra cDNA 10 biblioteker eller genome biblioteker som beskrevet i yderligere detaljer i det følgende.The genes for these enzymes were isolated from cDNA 10 libraries or genome libraries as described in further detail below.

De som udgangsmaterialer anvendte plasmider i de følgende eksempler er som følger: 15 p285: (ATCC nr. 20681) pCAMG91: Boel et al. EMBO Jornal 3^ (1984), 1581-1585 pICI9R: Marsh et al. Gene 32 (1984), 481-485 pSal43: Berse et al. Gene 2j5 (1983), 109-117 20 John & Peberdy, Enzyme Microb.The plasmids used as starting materials in the following examples are as follows: p285: (ATCC No. 20681) pCAMG91: Boel et al. EMBO Jornal 3 (1984), 1581-1585 pICI9R: Marsh et al. Gene 32 (1984), 481-485 pSal43: Berse et al. Gene 2J5 (1983), 109-117 John & Peberdy, Enzyme Microb.

Technol. 6 (1984), 386-389 p3SR2: J.M. Kelly and M.J. Hynes, EMBOTechnol. 6 (1984), 386-389 p3SR2: J.M. Kelly and M.J. Hynes, EMBO

Journal 4 (1985), 475-479 pBR322: Bolivar F. et al., Gene 2_ (1977), 25 95-113 pBR327: Covarrubias L. et al., Gene 13 (1981), 25-35 pUC9, pUCl3, Vieira et al., Gene Γ9 (1982), 259-and pUC19: 268 og Messing, Meth. in Enzymology 30 101 (1983), 20-27.Journal 4 (1985), 475-479 pBR322: Bolivar F. et al., Gene 2_ (1977), 95-113 pBR327: Covarrubias L. et al., Gene 13 (1981), 25-35 pUC9, pUC13, Vieira et al., Gene Γ9 (1982), 259 and pUC19: 268 and Messing, Meth. in Enzymology 101 (1983), 20-27.

Der anvendtes følgende stammer: A. niger: ATCC 1015, ATCC 10582 A. oryzae: ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011,The following strains were used: A. niger: ATCC 1015, ATCC 10582 A. oryzae: ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011,

35 ATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCCATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCC

11601 og ATCC 12892.11601 and ATCC 12892.

E. coli: MC1000 (Casabacan, M.J. and Cohen, 5 12 DK 169134 B1 S.N., J.Mol.Biol. U8, 179-207) (NCIB 11956)E. coli: MC1000 (Casabacan, M.J. and Cohen, 5, 169134 B1 S.N., J. Mol. Biol. U8, 179-207) (NCIB 11956)

Rhizomucor miehei: CBS 370.65Rhizomucor miehei: CBS 370.65

Eksempel 1Example 1

Fremstilling af plasmid 285'proC indeholdende 10 prochymosingenetPreparation of plasmid 285'proC containing the prochymosin gene

Præprochymosingenet fra kalvemave cDNA-bibliotek og indsat i Pstl-spaltningsstedet i pBR322 ved G-C-tailing (Chirgwin et al., Biochemistry _18 (1979), 5294 og Truelsen et al., Nucleic Acids Res. £ (1979), 3061) til opnåelse af pR26.Preprochymosin gene from calf gastric cDNA library and inserted into the Pst I cleavage site of pBR322 by GC tailing (Chirgwin et al., Biochemistry _18 (1979), 5294 and Truelsen et al., Nucleic Acids Res. (1979), 3061) to obtain of pR26.

15 pUC9 blev skåret med Sall og udfyldt med Klenow polymerase og lieret med T4 ligase. Det fremkomne plasmid blev skåret med BamHI-EcoRI, og det 2,7 kb store fragment blev ligeret med et 0,47 kb BamHI-EcoRI-fragment fra pR26, der indeholder den N-terminale ende af prochymosingenet, til dannelse af pUC9'.15 pUC9 was cut with SalI and filled with Klenow polymerase and ligated with T4 ligase. The resulting plasmid was cut with BamHI-EcoRI and the 2.7 kb fragment was ligated with a 0.47 kb BamHI-EcoRI fragment from pR26 containing the N-terminal end of the prochymosin gene to generate pUC9 '.

20 pUC9' indeholder et Hindlll-spaltningssted i den N-terminale ende af prochymosingenet. pUC13 blev skåret med BamHI-Narl og Narl-Xmal, og det store henholdsvis lille fragment blev ligeret med et 0,64 kb Xmal-Bc11-fragment fra pR26, der indeholder den C-terminale ende af prochymosingenet, til 25 opnåelse af plasmid pUCl3'. pUCl3' indeholder et Xbal- spaltningssted ved den C-terminale ende af prochymosingenet.20 pUC9 'contains a HindIII cleavage site at the N-terminal end of the prochymosin gene. pUC13 was cut with BamHI-Narl and Narl-Xmal, and the large and small fragment, respectively, was ligated with a 0.64 kb Xmal-Bc11 fragment from pR26 containing the C-terminal end of the prochymosin gene to obtain plasmid pUCl3 '. pUC13 'contains an XbaI cleavage site at the C-terminal end of the prochymosin gene.

Et 0,65 kb Xmal-Xbal-fragment af pUCl3‘ blev ligeret med et 0,46 kb Hindlll-Xmal-fragment fra pUC9' og et 11 kb Xbal-Hindlll-fragment fra p285 til dannelse af plasmid p285' proC, 30 der indeholder prochymosingenet som vist i fig. 3.A 0.65 kb XmaI-XbaI fragment of pUC13 was ligated with a 0.46 kb HindIII-XmaI fragment from pUC9 'and an 11 kb XbaI-HindIII fragment from p285 to generate plasmid p285' proC, 30 which contains the prochymosin gene as shown in FIG. Third

DK 169134 Bl 13DK 169134 Pg 13

Eksempel 2Example 2

Kloning af A. ory2ae TAKA-amylase genetCloning of the A. ory2ae TAKA amylase gene

Isolering af en partiel cDNA klon 5 Fra A. oryzae Hw 325, der blev dyrket på kartoffel stivelse, blev mRNA fremstillet ifølge Kaplan et al.,Isolation of a partial cDNA clone 5 From A. oryzae Hw 325, grown on potato starch, mRNA was prepared according to Kaplan et al.

Biochem.J. 183, (1979) 181-84. En partiel cDNA klon, der indeholdt 1050 bp fra TAKA-amylasegenet blev opnået ved specifik priming af mRNA med en 14-mer 10 oligonucleotidblanding:Biochem. 183, (1979) 181-84. A partial cDNA clone containing 1050 bp from the TAKA amylase gene was obtained by specific priming of mRNA with a 14-mer 10 oligonucleotide mixture:

A A A AA A A A

5'GG TT TC TG TT 3'(NOR-168),5'GG TT TC TG TT 3 '(NOR-168),

G G G GG G G G G

15 der er komplementær til den kodende sekvens for aminosyrer 295-299 i TAKA-amylasen (Toda et al., Proc.Japan Acad. 58,Which is complementary to the coding sequence for amino acids 295-299 of the TAKA amylase (Toda et al., Proc.Japan Acad. 58,

Ser. B, (1982) 208-212). Der blev anvendt en kloningsprocedure som beskrevet af Gubier & Hoffmann, Gene 25, (1983) 20 263-269. Sekventering ved enderne og i midten af cDNA klonen viste tilstedeværelsen af sekvenser, der svarer til aminosy-resekvensen af TAKA-amylasen.Ser. B, (1982) 208-212). A cloning procedure as described by Gubier & Hoffmann, Gene 25, (1983) 20 263-269 was used. Sequencing at the ends and in the middle of the cDNA clone showed the presence of sequences corresponding to the amino acid sequence of the TAKA amylase.

Isolering af en genomklon 25 Mycelium fra A. oryzae Hw 325 blev høstet og videreforarbejdet til fremstilling af DNA ifølge metoden anvendt for A. niger beskrevet af Boel et al., supra. Restriktionsfragmenter på 3 - 10 kb, der var dannet ved delvis fordøjelse med Sau3A, blev ligeret med BamHI-fordøjet, 30 dephosphoryleret pBR322 (New England Biolabs). 50.000 rekom-binanter blev screenet med den ovenfor beskrevne oligonu-cleotidprobe NOR-168, og der blev fundet 7, der indeholdt DNA kodende for TAKA-amylasen. En klon blev udvalgt til yderligere anvendelse af promotorregionen med 2,1 kb ovenfor mRNA-35 starten. Restriktionskortet for plasmid pTAKA 17 er vist i fig. 2. pTAKA 17 transformeret i en E. colistamme er blevet deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), 14 DK 169134 B1Isolation of a Genome Clone 25 Mycelium from A. oryzae Hw 325 was harvested and further processed to produce DNA according to the method used for A. niger described by Boel et al., Supra. Restriction fragments of 3 - 10 kb formed by partial digestion with Sau3A were ligated with BamHI digested, 30 dephosphorylated pBR322 (New England Biolabs). 50,000 recombinants were screened with the above-described oligonucleotide probe NOR-168, and 7 containing DNA encoding the TAKA amylase were found. A clone was selected for further use of the 2.1 kb promoter region above the mRNA-35 start. The restriction map for plasmid pTAKA 17 is shown in FIG. 2. pTAKA 17 transformed into an E. coli strain has been deposited by the Deutsche Sammlung von Microorganism (DSM), 14 DK 169134 B1

Griesebachstrasse 8, D-3400, Gottingen, d. 23. februar 1987 og fik deponeringsnummeret DSM 4012. DSM, der er et internationalt deponeringsinstitut autoriseret under Budapesttrakta-ten fra 1977, sikrer permanent deponering og offentlighedens 5 adgang .dertil ifølge regel 9 og 11 i ovennævnte traktat.Griesebachstrasse 8, D-3400, Gottingen, on February 23, 1987 and received the landfill number DSM 4012. DSM, an international landfill authorized under the Budapest Treaty of 1977, ensures permanent landfill and public access 5, in accordance with Rules 9 and 11. of the above Treaty.

Eksempel 3Example 3

Konstruktion af et Rhizomucor miehei cDNA bibliotek 10 Fycomyceten Rhizomucor miehei (med hensyn til en morfologisk og taxonomisk beskrivelse af denne art henvises til: Schipper, M.A.A. On the genera Rhizomucor and Parasitella. I: Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Sciences and Letters. No. 17 (1978), 15 53-71) udskiller en sur proteinase (Rhizomucor miehei proteinase, i det følgende forkortes til RMP), der i vid udstrækning anvendes til koagulering af mælk i osteproduktion. For at opnå cDNA rekombinantkloner af dette protein i E. coli blev total RNA ekstraheret fra homogeniseret R. miehei 20 mycelium som beskrevet af Boel et al. (EMBO J., 3^: 1097-1102, 1984) og Chirgwin et al., (Biochemistry (Wash.), .18, 5294-5299, 1979). Poly(A)-indeholdende RNA blev opnået ved to gange affinitetskromatografi på oligo(dT)-cellulose, som beskrevet af Aviv og Leder (PNAS, USA, J59, 1408-1412, 1972).Construction of a Rhizomucor miehei cDNA library 10 The Rhizomucor miehei phycomycete (for a morphological and taxonomic description of this species, see: Schipper, MAA on the genera Rhizomucor and Parasitella. In: Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Sciences and Letters, No. 17 (1978), 15, 53-71) secrete an acidic proteinase (Rhizomucor miehei proteinase, hereafter abbreviated to RMP), which is widely used for coagulation of milk in cheese production. To obtain cDNA recombinant clones of this protein in E. coli, total RNA was extracted from homogenized R. miehei 20 mycelium as described by Boel et al. (EMBO J., 3: 1097-1102, 1984) and Chirgwin et al. (Biochemistry (Wash.), 18, 5294-5299, 1979). Poly (A) -containing RNA was obtained by two-affinity chromatography on oligo (dT) cellulose, as described by Aviv and Leder (PNAS, USA, J59, 1408-1412, 1972).

25 Oligo(dT)-initieret komplementært DNA blev syntetiseret og gjort dobbeltstrenget ifølge Gubier og Hoffman (Gene, 25, 263-269, 1983). Dobbeltstrenget cDNA blev forsynet med hale med dCTP og terminal deoxynucleotidyltransferase som beskrevet af (Roychoudhury et al. (Nucleic Acids Res., 30 101-106, 1976). Plasmid pBR327 blev lineariseret med PstI og forsynet med hale med dGTP. Oligo(dC) dscDNA forsynet med hale blev baseparret til denne med oligo(dG)-hale forsynede vektor som beskrevet af Peacock et al., Biochem.Biophys.Oligo (dT) initiated complementary DNA was synthesized and double-stranded according to Gubier and Hoffman (Gene, 25, 263-269, 1983). Double-stranded cDNA was provided with tail with dCTP and terminal deoxynucleotidyltransferase as described by (Roychoudhury et al. (Nucleic Acids Res. 30, 101-106, 1976). Plasmid pBR327 was linearized with PstI and provided with dGTP. Oligo (dC) The dscDNA with tail was base paired with the oligo (dG) tail vector as described by Peacock et al., Biochem.Biophys.

Acta, 655, 243-250, 1981) og anvendt til at transformere et 35 hsdR , M+ derivat af E. coli MC1000 (Casadaban and Cohen, J.Mol.Biol., 138, 179-207, 1980) til dannelse af rekombinantkloner.Acta, 655, 243-250, 1981) and used to transform a 35 hsdR, M + derivative of E. coli MC1000 (Casadaban and Cohen, J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980) to form recombinant clones .

„R DK 169134 B1 15"R DK 169134 B1 15

Identificering af RMP specifikke cDNA rekombinanter En blanding af 16 heptadecamer oligodeoxyribonucleotiderIdentification of RMP specific cDNA recombinants A mixture of 16 heptadecamer oligodeoxyribonucleotides

5 ' A A A A5 'A A A A

d(GC TCCA AA ΤΑ TA),d (GC TCCA AA ΤΑ TA),

G G G GG G G G G

af hvilken en er komplementær til RMP mRNA i regionen kodende 10 for Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Ale (Bech og Foltmann, Neth-milk Dairy J. 3J5: 275-280, 1981) blev syntetiseret på en Applied Biosystems, Inc. DNA syntesemaskine og oprenset ved hjælp af polyacrylamidgelelektroforese. Omtrent 10.000 E. coli rekombinanter fra Rhizomucor miehei cDNA-biblioteket blev overført 15 til Whatman 540 papirfiltre. Kolonierne blev lyseret og immobiliseret som beskrevet af Gergen et al. (Nucleic Acidsof which one is complementary to RMP mRNA in the region encoding Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Ale (Bech and Foltmann, Neth-milk Dairy J. 3J5: 275-280, 1981) was synthesized on an Applied Biosystems, Inc. DNA synthesizer and purified by polyacrylamide gel electrophoresis. About 10,000 E. coli recombinants from the Rhizomucor miehei cDNA library were transferred to Whatman 540 paper filters. The colonies were lysed and immobilized as described by Gergen et al. (Nucleic Acids

Res. 7, 2115-2135, 1979). Filtrene blev hybridiseret med 32 P-mærket RMP-specifik heptadecamerblanding som beskrevet af Boel et al., (EMBO J. .3, 1097-1102, 1984). Hybridisering og 20 vask af filtrene blev udført ved 40°C efterfulgt af autoradiografi i 24 timer med en forstærkningsskærm. Miniprep plasmid DNA blev isoleret fra en hybridiserende koloni pRMPl016 ved standardprocedure (Birnboim og Doly, Nucleic Acids Res., 1_, 1513-1523, 1979), og DNA-sekvensen af det 25 indsatte cDNA fragment blev bestemt ved Maxam og Gilbert proceduren (Methods Enzymol £5, 499-560, 1980). pRMP1016 blev påvist at indeholde en del af den 5' ikke translaterede ende af mRNA og udstrækker sig derpå gennem regionerne, der koder for en 69 aminosyre lang præprore.gion og 300 aminosyrer i den 30 modne del af RMP proteinet. Da pRMPl016 ikke indeholdt nogetRes. 7, 2115-2135, 1979). The filters were hybridized with 32 P-labeled RMP-specific heptadecamer blend as described by Boel et al. (EMBO J.. 3, 1097-1102, 1984). Hybridization and washing of the filters were performed at 40 ° C followed by autoradiography for 24 hours with a gain screen. Miniprep plasmid DNA was isolated from a hybridizing colony of pRMP1016 by standard procedure (Birnboim and Doly, Nucleic Acids Res. 1, 1513-1523, 1979), and the DNA sequence of the 25 cDNA fragment was determined by the Maxam and Gilbert procedure (Methods Enzymol 5, 499-560, 1980). pRMP1016 was shown to contain part of the 5 'untranslated end of mRNA and then extends through the regions encoding a 69 amino acid preprion and 300 amino acids in the 30 mature portion of the RMP protein. Since pRMPl016 contained nothing

indsat fragment svarende til den fuldstændige 3' ende af RMPinserted fragment corresponding to the complete 3 'end of RMP

32 mRNA, blev cDNA biblioteket screenet igen med et P nick-translateret 3' specifikt restriktionsfragment fra klon pRMP1016, hvorved klonen pRMP2931 blev isoleret. Denne klon 35 indeholder en del af den 3' ikketranslaterede region og en åben læseramme med 270 tripletter, der koder for den carboxy-terminale ende a:: RMP-proteinet. pRMPl016 og pRMP2931 har 16 DK 169134 B1 derfor en væsentlig overlapning, og den kombinerede sekvens af de to kloner giver sekvensen for R. miehei præproRMP-cDNA. Der blev sekventeret et totalt antal på 1416 nucleotider mellem G:C enderne resulterende fra cDNA kloningsproceduren.32 mRNA, the cDNA library was screened again with a P nick-translated 3 'specific restriction fragment from clone pRMP1016, thereby isolating clone pRMP2931. This clone 35 contains a portion of the 3 'untranslated region and an open reading frame of 270 triplets encoding the carboxy-terminal end of the :: RMP protein. Therefore, pRMP1016 and pRMP2931 have a significant overlap, and the combined sequence of the two clones yields the sequence of R. miehei preproMP cDNA. A total of 1416 nucleotides were sequenced between the G: C ends resulting from the cDNA cloning procedure.

5 Den fastlagte DNA-sekvens er vist i fig. 4a og b sammen med den heraf udledte aminosyresekvens af en precursor for RMP. I fig. 4a og 4b angiver de vandrette linier positionen af en syntetisk oligoblanding anvendt til screening af cDNA bibliotek. En pil viser den position, hvor der sker spaltning i 10 modning af naturligt RMP. Nucleotiderne er nummereret fra den første base i start-Met-kodonen, og aminosyrerne er nummereret fra den første aminosyrerest i det modne RMP. Fra denne cDNA sekvens kan det konkluderes, at RMP syntetiseres som en 430 aminosyre lang precursor med et propeptid på 69 amino-15 syrer. Et formodet signalpeptidasespaltningssted (von Heijne,5 The determined DNA sequence is shown in FIG. 4a and b together with the deduced amino acid sequence of a RMP precursor. In FIG. 4a and 4b, the horizontal lines indicate the position of a synthetic oligo mixture used for screening the cDNA library. An arrow shows the position where cleavage occurs in 10 ripening of natural RMP. The nucleotides are numbered from the first base of the starting Met codon, and the amino acids are numbered from the first amino acid residue in the mature RMP. From this cDNA sequence, it can be concluded that RMP is synthesized as a 430 amino acid precursor with a propeptide of 69 amino acids. A putative signal peptidase cleavage site (von Heijne,

Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) i denne precursor kunne være mellem Ala(-48) og Arg(-47), og det modne RMP ville blive dannet ved autoproteolytisk spaltning mellem Glu(-l) og Ala(+1). Den fra cDNA afledte aminosyresekvens af RMP er i 20 god overensstemmelse med den tidligere publicerede delvise aminosyresekvens (Bech og Foltmann, Neth-Milk Dairy J. 35: 275-280, 1981).Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) in this precursor could be between Ala (-48) and Arg (-47), and the mature RMP would be formed by autoproteolytic cleavage between Glu (-l) and Ala (+1). The cDNA-derived amino acid sequence of RMP is in good agreement with the previously published partial amino acid sequence (Bech and Foltmann, Neth-Milk Dairy J. 35: 275-280, 1981).

For at gøre det yderligere konstruktionsarbejde med RMP-cDNA lettere, blev der indsat en Hindlll-linker i et 25 Banl-spaltningssted netop efter 3'-enden af TAA- termineringskodonen identificeret i klon pRMP2931 som følger: 25 pg pRMP2931 blev fordøjet med PstI to opnåelse af RMPcDNA-fragmentet. Dette fragment blev oprenset ved 1% agarosegelelektroforese, elektroelueret fra gelen, renset med 30 phenol- og kloroformekstraktioner, og udfældet med NaCl og ethanol. Dette fragment, der koder for 3'-halvdelen af RMP, blev fordøjet med BanI, og de kohesive Banl-restriktionsspaltningssteder blev udfyldt med en blanding af 4 dNTP'er og Klenowfragmentet af E. coli DNA-polymerase. Til 35 disse udfyldte ender blev der tilføjet Hindlll-linkere i en T4-DNA ligasereaktion. Ligeringsblandingen blev ekstraheret med phenol og kloroform, og DNA blev udfældet med 4M NH^+ 17 DK 169134 B1 acetat/ethanol. Det oprensede DNA blev fordøjet med et overskud af Hindlll enzym, og et 380 bp fragment blev oprenset på en 61 polyacrylamidgel. Dette fragment, der indeholder 3'-enden af den åbne læseramme for :RMP plus TAA-5 termin-eringskodonen, blev ligeret til pIC19R, der var fordøjet med Hindlll og behandlet med alkalisk phosphatase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og transformanter blev udvalgt på ampicillinholdige agarplader. Plasmid DNA blev oprenset fra 10 transformanterne, og korrekte rekombinanter blev identificeret ved restriktionsendonucleasefordøjelse og agarosegelelek-troforese. Fra en sådan korrekt rekombinant pRMP3' blev der isoleret et 210 bp Bglll/Hindlll-fragment ved 6% polyacryl-amidgelelektroforese. Dette fragment indeholder 31-enden af 15 RMP-cDNA fra Bglll-spaltningsstedet ved aminosyrerne 297-299 og strækker sig gennem TAA-termineringskodonen til den indsatte Hindlll-linker.To facilitate further construction work with RMP cDNA, a HindIII linker was inserted into a Banl cleavage site just after the 3 'end of the TAA termination codon identified in clone pRMP2931 as follows: 25 µg pRMP2931 was digested with PstI two obtaining the RMPcDNA fragment. This fragment was purified by 1% agarose gel electrophoresis, electroeluted from the gel, purified with 30 phenol and chloroform extractions, and precipitated with NaCl and ethanol. This fragment encoding the 3 'half of the RMP was digested with BanI and the cohesive Ban1 restriction cleavage sites were filled with a mixture of 4 dNTPs and the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase. To these filled ends, HindIII linkers were added in a T4 DNA ligase reaction. The ligation mixture was extracted with phenol and chloroform, and the DNA was precipitated with 4M NH 4 + acetate / ethanol. The purified DNA was digested with an excess of HindIII enzyme and a 380 bp fragment was purified on a 61 polyacrylamide gel. This fragment containing the 3 'end of the open reading frame for: RMP plus the TAA-5 termination codon was ligated to pIC19R digested with HindIII and treated with alkaline phosphatase. The ligation mixture was used to transform competent E. coli cells and transformants were selected on ampicillin-containing agar plates. Plasmid DNA was purified from the 10 transformants and correct recombinants were identified by restriction endonuclease digestion and agarose gel electrophoresis. From such a properly recombinant pRMP3 ', a 210 bp BglII / HindIII fragment was isolated by 6% polyacrylamide gel electrophoresis. This fragment contains the 31-end of 15 RMP cDNA from the BglII cleavage site at amino acids 297-299 and extends through the TAA termination codon to the inserted HindIII linker.

5'-delen af RMP-cDNA blev isoleret fra pRMP 1016 som et 997 bp HindIII/BglII-fragment ved 1% agarose gelelek-20 troforese. Hindlll-spaltningsstedet er i RMP-DNA lokaliseret ved en position svarende til resterne -36/-35 i prosegmentet. Dette 997 bp 5'-fragment blev ligeret til 210 bp 3*-fragmentet i pICl9R fordøjet med Hindlll og behandlet med phosphatase. Med denne ligeringsblanding blev der opnået rekombinanter 25 fra E. coli, og et korrekt plasmid, pRMP, med 5'-delen af RMP forbundet med 3'-delen blev identificeret ved restriktionsenzymanalyse. Konstruktionen af pRMP er illustreret i fig. 5. pRMP koder ikke for RMP-præregionen og 5' halvdelen af prosegmentet.The 5 'portion of RMP cDNA was isolated from pRMP 1016 as a 997 bp HindIII / BglII fragment by 1% agarose gel electrophoresis. The HindIII cleavage site is located in RMP DNA at a position corresponding to residues -36 / -35 in the prosegment. This 997 bp 5 'fragment was ligated to the 210 bp 3 * fragment in pIC199 digested with HindIII and treated with phosphatase. With this ligation mixture, recombinants 25 from E. coli were obtained and a correct plasmid, pRMP, with the 5 'portion of the RMP associated with the 3' portion was identified by restriction enzyme analysis. The construction of pRMP is illustrated in FIG. 5. The pRMP does not encode the RMP pre-region and the 5 'half of the process segment.

3030

Eksempel 4Example 4

Konstruktion af en Aspergillus ekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af aktivt RMP 35 I dette eksempel blev der konstrueret et plasmid til ekspression af RMP under kontrol af glucoamylasepromo-toren, glucoamylasesignalet og glucoamylaseterminatorse- 18 DK 169134 B1 kvenser. Glucoamylasepromotoren og terminatorsekvenserne blev opnået fra det genome glucoamylasegen klonet i vektor pCAMG91. Konstruktionen af pCAMG91 er beskrevet af Boel et al. (EMBO Journal 3_ (1984), 1581-1585), og et endonucleasere-5 striktionskort for plasmid pCAMG91 er vist i fig. 6.Construction of an Aspergillus Expression Vector Designed to Achieve Secretion of Active RMP 35 In this example, a plasmid for expression of RMP was constructed under the control of the glucoamylase promoter, glucoamylase signal, and glucoamylase terminator sequence. The glucoamylase promoter and terminator sequences were obtained from the genome glucoamylase gene cloned in vector pCAMG91. The construction of pCAMG91 is described by Boel et al. (EMBO Journal 3_ (1984), 1581-1585), and an endonuclease restriction map for plasmid pCAMG91 is shown in FIG. 6th

pCAMG91 blev fordøjet med Sall og PstI restrik-tionsendonucleaser. Fra en sådan fordøjet blanding blev der isoleret et 698 bp fragment på en agarosegel. Dette Sall-Pstl-fragment indeholder den region, der koder for den 140 bp 10 3' ikketranslaterede del af glucoamylase-mRNA plus 540 bp 3' i forhold til poly(A)-additionsstedet. Dette 3'-fragment blev behandlet med T4-DNA polymerase for at forsyne restriktionsspaltningsstedet med lige afskårne ender før påsætningen af Xbal-linkere og fordøjelse med Xbal restriktionsenzym. Denne 15 3'-ende af glucoamylasegenet blev ligeret til pUCl3, der var lineariseret med Xbal, til dannelse af plasmid pAMG/Term, der indeholder poly(A)-additionsregionen af glucoamylasegenet. Konstruktionen af pAMG/Term er illustreret i fig. 7a.pCAMG91 was digested with SalI and PstI restriction endonucleases. From such a digested mixture, a 698 bp fragment was isolated on an agarose gel. This SalI-Pstl fragment contains the region encoding the 140 bp 10 3 'nontranslated portion of glucoamylase mRNA plus 540 bp 3' relative to the poly (A) addition site. This 3 'fragment was treated with T4 DNA polymerase to provide the restriction cleavage site with straight cut ends prior to the application of Xba I linkers and digestion with Xba I restriction enzyme. This 15 'end of the glucoamylase gene was ligated to pUCl3 linearized with XbaI to form plasmid pAMG / Term containing the poly (A) addition region of the glucoamylase gene. The construction of pAMG / Term is illustrated in FIG. 7a.

3'-enden af A. niger glucoamylasegenet blev opnået 20 som et 700 bp Xbal-fragment fra pAMG/Term. Dette terminator-fragment blev ligeret til pICl9R, der var fordøjet med Xbal og behandlet med phosphatase. Med denne ligeringsblanding blev der opnået rekombinanter fra E. coli, og et korrekt plasmid, pICAMG/Term, med 5'-enden af terminatorfragmentet 25 stødende op til Hindlll spaltningsstedet i det multiple kloningssted i pIC19R-vektoren, blev identificeret ved restriktionsenzymanalyse. Konstruktionen af pICAMG/Term er illustreret i fig. 7a. Fra pICAMG/Term blev glucoamylaseter-minatoren (AMG terminator) regionen isoleret som et 750 bp 30 Hindlll/Clal -spaltningsfragment ved 1% agarosegelelektro-forese. Fra pCAMG91 blev glucoamylasepromotoren (AMG promotoren) isoleret sammen med de regioner, der koder for glucoamy-lasesignalpeptidet, hexapeptid-prosegmentet og ampicillin-resistensgenet (Amp) fra pBR322 som et 3,5 kb Clal/BssHII-35 fragment ved 1% agarosegelelektroforese. Der blev fremstillet en syntetisk BssHII/Hindlll-linker fra to syntetiske 31'-mer Λ DK 169134 B1 19 oligonucleotider, fremstillet på en Applied Biosystems Inc. DNA-syntesemaskine. Den syntetiske linker har følgende struktur:The 3 'end of the A. niger glucoamylase gene was obtained 20 as a 700 bp XbaI fragment from pAMG / Term. This terminator fragment was ligated to pIC199 digested with XbaI and treated with phosphatase. With this ligation mixture, recombinants from E. coli were obtained and a correct plasmid, pICAMG / Term, with the 5 'end of terminator fragment 25 adjacent to the HindIII cleavage site in the multiple cloning site of the pIC19R vector was identified by restriction enzyme analysis. The construction of pICAMG / Term is illustrated in FIG. 7a. From the pICAMG / Term, the glucoamylase ether miner (AMG terminator) region was isolated as a 750 bp HindIII / Clal cleavage fragment by 1% agarose gel electrophoresis. From the pCAMG91, the glucoamylase promoter (AMG promoter) was isolated along with the regions encoding the glucoamylase signal peptide, hexapeptide fragment and ampicillin resistance gene (Amp) of pBR322 as a 3.5 kb Clal / BssHII 35 fragment at 1% agarose gel. A synthetic BssHII / HindIII linker was prepared from two synthetic 31'-mer 169 DK 169134 B1 19 oligonucleotides manufactured on an Applied Biosystems Inc. DNA synthesizer. The synthetic linker has the following structure:

5 ' RVSKQSESKD5 'RVSKQSESKD

CGCGTAAGTAAGCAGAGCGAGAGCAAGGATACGCGTAAGTAAGCAGAGCGAGAGCAAGGATA

ATTCATTCGTCTCGCTCTCGTTCCTATTCGAATTCATTCGTCTCGCTCTCGTTCCTATTCGA

Denne linker blev anvendt i en ligeringsreaktion 10 med 3,5 kb fragmentet indeholdende glucoamylasepromotoren og 750 bp fragmentet indeholdende glucoamylaseterminatoren. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli, og der blev identificeret en korrekt rekombinant, p673 ved restriktionsendonucleasespaltning. Den isolerede p673 er en 15 Hindlll-kloningsvektor, i hvilken der kan indsættes et passende Hindlll-cDNA-fragment mellem glucoamylasehexapeptid-prosegmentet og glucoamylasetransscriptionsterminator-regionen. Det indsatte cDNA vil være under transscriptionel kontrol af glucoamylasepromotoren, og sekretionen af det 20 translaterede fusionsprodukt vil være dirigeret af glucoamy-lasesignalpeptidet plus glucoamylasehexapeptidprosegmentet. p673 blev fordøjet med Hindlll, behandlet med alkalisk phpsphatase og ligeret til et 1,2 kb HindIII-fragment oprenset fra en fordøjet blanding af pRMP, 25 Ligeringsblandingen blev anvendt til at transforme re E. coli og en rekombinant p686 med RMP-cDNA indsat i korrekt orientering til opnåelse af RMP-ekspression blev isoleret og karakteriseret ved restriktionsendonucleasespalt-ninger. p686 koder for en RMP-precursor med følgende 30 struktur: glucoamylasesignalpeptid, glucoamylasehexapropep-tid, aminosyrer -45 til -1 af propeptidet fra RMP, 361 aminosyrer af moden RMP. Konstruktionen af p686 er illustreret i fig. 7b.This linker was used in a ligation reaction 10 with the 3.5 kb fragment containing the glucoamylase promoter and the 750 bp fragment containing the glucoamylase terminator. The ligation mixture was used to transform E. coli and a correct recombinant, p673 was identified by restriction endonuclease cleavage. The isolated p673 is a HindIII cloning vector into which a suitable HindIII cDNA fragment can be inserted between the glucoamylase hexapeptide process segment and the glucoamylase transcription terminator region. The inserted cDNA will be under the transcriptional control of the glucoamylase promoter and the secretion of the translated fusion product will be directed by the glucoamylase signal peptide plus the glucoamylase hexapeptide segment. p673 was digested with HindIII, treated with alkaline phpsphatase and ligated to a 1.2 kb HindIII fragment purified from a digested mixture of pRMP, the ligation mixture was used to transform E. coli and a recombinant p686 with RMP cDNA inserted into proper orientation to achieve RMP expression was isolated and characterized by restriction endonuclease cleavages. p686 encodes an RMP precursor having the following structure: glucoamylase signal peptide, glucoamylase hexapropeptide, amino acids -45 to -1 of the propeptide from RMP, 361 amino acids of mature RMP. The construction of p686 is illustrated in FIG. 7b.

35 20 DK 169134 B135 20 DK 169134 B1

Eksempel 5 I en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse skal den åbne læseramme af præproRMP indsættes i et ekspressionsplasmid under kontrol af promotoren fra 5 glucoamylasegenet fra A. niger eller TAKA-amylasegenet fra A. oryzae. Til opnåelse af dette blev der indsat et BamHI-restriktionsendonucleasespaltningssted lige foran 5'-enden af startmethioninkodonen for signalpeptidet for præproRMP på følgende måde: pRMPl016 blev fordøjet med-Ddel, som spalter i 10 cDNA-et ved en position svarende til aminosyreresterne Ser(-66) og Gin(-65), og med Hindlll, der spalter i cDNA-et ved en position svarende til aminosyreresterne Lys(-36) og Leu(~35). Det fremkomne 89 bp Ddel/Hindlll-fragment blev oprenset på en 8% polyacrylamidgel, elektroelueret og ethanolfældet efter 15 phenol og CHCl^ ekstraktioner. Et syntetisk DNA-fragment med følgende sekvens blev syntetiseret som to oligonucleotider på en Applied Biosystems Inc. DNA syntesemaskine:Example 5 In a preferred embodiment of the present invention, the open reading frame of the preproMP is to be inserted into an expression plasmid under the control of the promoter of the A. niger glucoamylase gene or the A. oryzae TAKA amylase gene. To achieve this, a BamHI restriction endonuclease cleavage site was inserted just in front of the 5 'end of the start methionine codon of the preproRMP signal peptide as follows: pRMP1016 was digested with Ddel which cleaves in the 10 cDNA at a position corresponding to the amino acid residues Ser (- 66) and Gln (-65), and with HindIII cleaving in the cDNA at a position corresponding to the amino acid residues Lys (-36) and Leu (~ 35). The resulting 89 bp Ddel / HindIII fragment was purified on an 8% polyacrylamide gel, electroeluted and ethanol precipitated after 15 phenol and CHCl3 extractions. A synthetic DNA fragment of the following sequence was synthesized as two oligonucleotides on an Applied Biosystems Inc. DNA synthesizer:

M L F SM L F S

20 GATCCACCATGCTGTTCTC oligo 697/69820 GATCCACCATGCTGTTCTC oligo 697/698

GTGGTACGACAAGGAAGTGTGGTACGACAAGGAAGT

Dette fragment har en BamHI-kohesiv ende i 5'-enden af startMet-kodonen og en Ddel-kohesiv ende i 3' enden. De to 25 oligonucleotider blev kineret med ATP og T4 polynucleotidkinase, baseparret til hinanden og derpå ligeret til 89 bp Ddel/Hindlll RMP-fragmentet oprenset fra pRMP 1016 i en BamHI/HindIII-fordøjet pUC13 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og korrekte 30 rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepoprensede plasmider. Korrekte rekombinant-plasmider blev sekventeret til verificering af sekvensen af de anvendte oligonucleotider. Et sådant korrekt plasmid pRMP5' blev fordøjet med BamHI og Hindlll, og et 110 bp 35 BamHI/HindIII-f ragment med startMet-kodonen, RMP-signalpep-tidet og en del af RMP-prosegmentet blev oprenset ved 10% polyacrylamidgelelektroforese. Fragmentet blev elektroelue- 21 DK 169134 B1 ret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. Den resterende del af den åbne RMP læseramme og AMG-terminatorse-kvenserne blev opnået fra plasmid p686 efter fordøjelse med EcoRI og delvis Hindlll fordøjelse. Herved blev der frigjort 5 et 1,9 kb fragment, og dette fragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese, elektroeluering, phenol- og CHCl^ ekstraktion før ethanoludfældning. Dette 1,9 kb fragment blev ligeret til 110 bp BamHI/HindIII-fragmentet fra pRMP5' i en pUC13 vektor, der var blevet fordøjet med BamHI og EcoRI.This fragment has a BamHI cohesive end at the 5 'end of the startMet codon and a Ddel cohesive end at the 3' end. The two oligonucleotides were kinated with ATP and T4 polynucleotide kinase, base-paired to each other and then ligated to the 89 bp Ddel / HindIII RMP fragment purified from pRMP 1016 in a BamHI / HindIII digested pUC13 vector. The ligation mixture was used to transform E. coli cells and correct 30 recombinants were identified by restriction enzyme cleavages on miniprep-purified plasmids. Correct recombinant plasmids were sequenced to verify the sequence of the oligonucleotides used. Such a correct plasmid pRMP5 'was digested with BamHI and HindIII, and a 110 bp BamHI / HindIII fragment with the startMet codon, RMP signal peptide and a portion of the RMP process segment was purified by 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The fragment was electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted and precipitated with ethanol. The remaining portion of the open RMP reading frame and the AMG terminator sequences were obtained from plasmid p686 after digestion with EcoRI and partial HindIII digestion. Thereby, a 1.9 kb fragment was released and this fragment was purified by agarose gel electrophoresis, electroelution, phenol and CHCl 3 extraction before ethanol precipitation. This 1.9 kb fragment was ligated to the 110 bp BamHI / HindIII fragment from pRMP5 'in a pUC13 vector that had been digested with BamHI and EcoRI.

10 Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler og korrekte rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepoprensede plasmider.The ligation mixture was used to transform E. coli cells and correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavages on miniprep-purified plasmids.

En sådan korrekt rekombinant var pRMPAMGTerm. Konstruktionen af pRMPAMGTerm er illustreret i fig. 8.One such correct recombinant was pRMPAMGTerm. The construction of pRMPAMGTerm is illustrated in FIG. 8th

1515

Eksempel 6Example 6

Konstruktion af en Aspergillusekspressionsvektor designet til at opnå sekretion af’ aktiv RMPi A. oryzae ved hjælp af 20 Aspergillus niger glucoamylasepromotor • Glucoamylasepromotoren blev isoleret som følger: 25 μg af pCAMG91 blev fordøjet med EcoRI og BssHII restriktions-endonucleaser. Efter denne dobbelte fordøjelse kunne der isoleres et 270 bp DNA fragment ved agarosegelelektrophorese.Construction of an Aspergillus Expression Vector Designed to Obtain Secretion of Active RMPi A. oryzae by 20 Aspergillus niger glucoamylase promoter • The glucoamylase promoter was isolated as follows: 25 µg of pCAMG91 was digested with EcoRI and BssHII restriction endonucleases. Following this double digestion, a 270 bp DNA fragment could be isolated by agarose gel electrophoresis.

25 Dette fragment indeholder en del af promotorregionen, den 5' ikketranslaterede region og signalpeptidet af glucoamylase-genet (AMG-gen). Efter elektroeluering af DNA fra agarose-gelen blev fragmentet oprenset ved phenol- og CHCl3-ekstrak-tioner før ethanolfældning. Det 270 bp lange fragment blev 30 derpå fordøjet med SfaNI. Dette enzym har et spaltningssted netop før 5'-enden af start-ATG-methioninkodonen af glucoamy-lasegenet. Efter fuldstændig fordøjelse blev DNA behandlet med det store fragment (Klenow) af DNA polymerase I og alle fire dNTP'er til dannelse af lige afskårne ender på DNA.This fragment contains part of the promoter region, the 5 'untranslated region, and the signal peptide of the glucoamylase gene (AMG gene). After electroelution of DNA from the agarose gel, the fragment was purified by phenol and CHCl3 extractions before ethanol precipitation. The 270 bp fragment was then digested with SfaNI. This enzyme has a cleavage site just before the 5 'end of the start ATG methionine codon of the glucoamylase gene. After complete digestion, DNA was treated with the large fragment (Klenow) of DNA polymerase I and all four dNTPs to form straight cut ends on DNA.

35 Dette DNA blev forsynet med Bglll-linkere med DNA-ligase, og DNA blev fordøjet med overskud af Bglll-restriktionsenzym.This DNA was provided with BglII linkers with DNA ligase and DNA was digested with excess BglII restriction enzyme.

Efter adskillelse af DNA-fragmenter på en 10% 22 DK 169134 B1 polyacrylamidgel kunne der isoleres et 175 bp BglII-fragment ved elektroeluering. Dette fragment har en Bgm-linker indsat i en position svarende til SfaNI-restriktionsspaltningsstedet netop foran 5'-enden af 5 startmethioninkodonen. Dette stykke DNA blev ligeret til en pIC19R-vektor, der var fordøjet med Bglll og behandlet med alkalisk phosphatase, og ligeringsblandingen blev anvendt til transformering af E. coli celler. Blandt de fremkomne transformanter blev korrekte plasmider identificeret ved 10 restriktionsenzymspaltninger på miniprepplasmider. Et sådant korrekt plasmid pB404.1 blev fordøjet med Nsil og Bglll til frigørelse af et 0,16 kb fragment, der indeholder den 5'-ikketranslaterede region af glucoamylasegenet sammen med ca.After separating DNA fragments on a 10% polyacrylamide gel, a 175 bp BglII fragment could be isolated by electroelution. This fragment has a Bgm linker inserted at a position corresponding to the SfaNI restriction cleavage site just in front of the 5 'end of the 5 start methionine codon. This piece of DNA was ligated to a pIC19R vector digested with BglII and treated with alkaline phosphatase and the ligation mixture used to transform E. coli cells. Among the resulting transformants, correct plasmids were identified by 10 restriction enzyme cleavages on mini prep plasmids. Such a correct plasmid pB404.1 was digested with Nsil and BglII to release a 0.16 kb fragment containing the 5 'nontranslated region of the glucoamylase gene together with ca.

100 bp af 3'-enden af promotorregionen. Dette fragment blev 15 oprenset ved polyacrylamidgelelektroforese, elektrolueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og ethanolfældet. For at knytte dette fragment til den resterende del af gluco-amylasepromotorregionen fra pCAMG91 blev følgende trin udført: 25 pg pCAMG91 blev fordøjet med BssHII og derpå yder-20 ligere delvist fordøjet med Ndel. Efter udfyldning af fragmentets ender med alle fire dNTP og Klenow fragmentet af DNA-polymerase, blev der isoleret et 1,4 kb DNA-fragment på en 1% agarosegel. Dette fragment indeholder hele promotorregionen sammen med den 5'-ikketranslaterede region 25 og regionen kodende for signalpeptidet. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol til koncentrering af DNA. Efter fordøjelse med Nsil, blev DNA kørt på en 1% agarosegel, og der blev isoleret et 1,2 kb Ndel - Nsil-fragment ved elektroeluering. Dette DNA 30 var blevet forsynet med lige afskårne ender ved Ndel- spaltningsstedet i en tidligere reaktion og blev nu ligeret til 0,16 kb Nsil - BglII-fragmentet fra pB401.1 i en pIC19R-vektor fordøjet med Nrul - Bglll. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler og blandt de 35 fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant pB408.3 blev 23 DK 169134 B1 fordøjet med Hindlll og Bglll, og glucoamylase-(AMG) promotoren blev isoleret som et 1,4 kb fragment’på en 1% agarosegel. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^ ekstraheret og ethanolfældet. Dette glucoamylasepromotor-5 fragment blev derpå ligeret til et 2,0 kb BamHI-EcoRI-fragment fra pRMPAMGTerm (se eksempel 5) i en pUCl9 vektor fordøjet med Hindlll-EcoRI. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved 10 restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant p778 blev dyrket i stor skåle til isolering af rekombinantplasmid, og plasmidpræparationen blev oprenset ved CSCl/ethidiumbromid-centrifugering. Dette plasmid dirigerer syntesen af RMP under kontrol af 15 glucoamylasepromotor- og glucoamylaseterminatorsekvenser. Konstruktioner af p408.3 er illustreret i fig. 9a, og konstruktionen af p778 er illustreret i fig. 9b.100 bp of the 3 'end of the promoter region. This fragment was purified by polyacrylamide gel electrophoresis, electrolyzed, phenol and CHCl 3 extracted and ethanol precipitated. To attach this fragment to the remaining portion of the glucoamylase promoter region of pCAMG91, the following steps were performed: 25 µg of pCAMG91 was digested with BssHII and then further partially digested with Ndel. After filling the ends of the fragment with all four dNTPs and the Klenow DNA polymerase fragment, a 1.4 kb DNA fragment was isolated on a 1% agarose gel. This fragment contains the entire promoter region together with the 5 'non-translated region 25 and the region encoding the signal peptide. The fragment was electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted and precipitated with ethanol to concentrate DNA. After digestion with Nsil, DNA was run on a 1% agarose gel and a 1.2 kb Nde I - Nsil fragment was isolated by electroelution. This DNA 30 had been provided with straight cut ends at the Nde I cleavage site in a previous reaction and was now ligated to the 0.16 kb Nsil - BglII fragment of pB401.1 in a pIC19R vector digested with Nrul - BglII. The ligation mixture was used to transform E. coli cells and among the 35 transformants obtained, correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavages of miniprep plasmids. Such correctly recombinant pB408.3 was digested with HindIII and BglII, and the glucoamylase (AMG) promoter was isolated as a 1.4 kb fragment on a 1% agarose gel. The fragment was electroeluted, phenol and CHCl3 extracted and ethanol precipitated. This glucoamylase promoter-5 fragment was then ligated to a 2.0 kb BamHI-EcoRI fragment from pRMPAMGTerm (see Example 5) in a pUC19 vector digested with HindIII-EcoRI. The ligation mixture was used to transform E. coli cells, and among the resulting transformants, correct recombinants were identified by 10 restriction enzyme cleavages of miniprep plasmids. Such proper recombinant p778 was grown in large dishes to isolate recombinant plasmid and the plasmid preparation was purified by CSCl / ethidium bromide centrifugation. This plasmid directs the synthesis of RMP under the control of 15 glucoamylase promoter and glucoamylase terminator sequences. Constructions of p408.3 are illustrated in FIG. 9a, and the construction of p778 is illustrated in FIG. 9b.

20 Eksempel 7Example 7

Konstruktion af en Aspergillus ekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af aktiv RMP ved hjælp af Aspergillus oryzae TAKA-amylasepromotoren 50 pg af plasmid pTAKA17 (se eksempel 2), der 25 indeholder det genome Aspergillus oryzae TAKA-amylasegen, blev fordøjet med Sall. Dette enzym har et restriktionsspaltningssted i det genome DNA ved en position svarende til aminosyreresten 26 i den modne TAKA-amylase. Et andet Sall restriktionsspaltningssted er anbragt ca. 1300 nucleotider 30 oven for denne position, d.v.s. i 5’-enden af upstream-promo-torregionen. Efter Sall-fordøjelse blev dette 1300 bp fragment, der indeholder promotoren, oprenset ved agarosegelelektroforese, og DNA blev oprenset ved phenol- og CHCl^-ekstraktioner og ethanolfældet. DNA blev derpå opløst i 35 exonuclease III puffer og fordøjet med exonuclease III ifølge Henikoff, S. (Gene, 2_8: 351-359, 1984). Reaktionen blev standset til opnåelse af ca. 130 bp deletioner i hver ende af 24 DK 169134 B1 DNA'et. Deletionen af ca. 130 bp fra Sall-spaltningsstedet i den kodende del af TAKA-amylasegenet giver på—denne måde muligheden for at indføre et multipelt kloningslinkerfragment netop ovenfor startmethioninkodonen. Det exonuclease III-5 behan-dlede DNA blev fordøjet med SI nuclease ifølge Henikoff, S. (Gene, 28_: 351-359, 1984) og fældet med ethanol efter phenol- og CHCl^-ekstraktioner. Reparering af Sl-nucleasebe-handlet DNA til opnåelse af ligerbare lige afskårne ender blev udført med alle fire dNTP'er og Klenovfragmentet af DNA 10 polymerase I ifølge Henikoff, S., (Gene, 2J3: 351-359, 1984). DNA blev fordøjet med EcoRI, som spalter ét sted i 1300 bp Sall-fragmentet til dannelse af to grupper af fragmenter. Den ene gruppe var ca. 380 bp lang og repræsenterede upstreamregioner, medens den anden gruppe var ca. 620 bp lang 15 og indeholdt promotorregionen. Disse grupper af EcoRI- fordøjede produkter blev adskilt på en agarosegel, og de ca.Construction of an Aspergillus expression vector designed to achieve secretion of active RMP by the Aspergillus oryzae TAKA amylase promoter 50 µg of plasmid pTAKA17 (see Example 2) containing the Aspergillus oryzae TAKA amylase gene was digested with Sall. This enzyme has a restriction cleavage site in the genomic DNA at a position corresponding to amino acid residue 26 of the mature TAKA amylase. Another SalI restriction cleavage site is located approx. 1300 nucleotides 30 above this position, i.e. at the 5 'end of the upstream promoter region. After SalI digestion, this 1300 bp fragment containing the promoter was purified by agarose gel electrophoresis and DNA was purified by phenol and CHCl 2 extractions and the ethanol precipitated. DNA was then dissolved in 35 exonuclease III buffer and digested with exonuclease III according to Henikoff, S. (Gene, 2: 8: 351-359, 1984). The reaction was stopped to obtain ca. 130 bp deletions at each end of the 24 DNA. The deletion of ca. 130 bp from the SalI cleavage site in the coding portion of the TAKA amylase gene — in this way, allows the insertion of a multiple cloning linker fragment just above the starting methionine codon. The exonuclease III-5 treated DNA was digested with SI nuclease according to Henikoff, S. (Gene, 28: 351-359, 1984) and precipitated with ethanol after phenol and CHCl 2 extractions. Repair of S1 nuclease-treated DNA to obtain ligatable straight cut ends was performed with all four dNTPs and the Klenov fragment of DNA 10 polymerase I according to Henikoff, S., (Gene, 2J3: 351-359, 1984). DNA was digested with Eco RI, which cleaves one site in the 1300 bp Sall fragment to form two groups of fragments. One group was approx. 380 bp long and represented upstream regions, while the other group was approx. 620 bp long 15 and contained the promoter region. These groups of EcoRI digested products were separated on an agarose gel and the ca.

620 bp lange DNA-fragmenter blev elektroelueret og ligeret til en EcoRI/Smal-fordøjet pUC19 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, 20 og miniprepplasmid DNA blev isoleret fra rekombinanterne.620 bp DNA fragments were electroeluted and ligated to an Eco RI / SmaI digested pUC19 vector. The ligation mixture was used to transform competent E. coli cells, 20, and miniprep plasmid DNA was isolated from the recombinants.

Disse deletionsmutanter blev karakteriseret ved restriktionsenzymspaltninger til identificering af plasmider med deletionsendepunkter netop ved 5' for startmethioninkodonen. Nogle få kandidater med de ønskede 25 karakteristika blev sekventeret, og en mutant (p9) , der havde 9 bp deleteret ved 5' for af A i ATG-methioninkodonen, blev udvalgt til yderligere konstruktioner. p9 blev fordøjet med EcoRI og Hindlll, og et 645 bp TAKA-amylasepro-motorindeholdende fragment blev isoleret ved' agarosegelelek-30 troforese, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. pTAKAl7 blev fordøjet med Sall og EcoRI, og et 510 bp fragment indeholdende TAKA-amylasepromotorupstreamregio-nerne blev isoleret ved agarosegelelektroforese, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. Disse promotorre-35 gioner blev ligeret til hinanden og til en pICl9R vektor, der var blevet fordøjet med Sall og Hindlll. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og korrekte ,s DK 169134 B1These deletion mutants were characterized by restriction enzyme cleavages to identify plasmids with deletion endpoints just at 5 'of the starting methionine codon. A few candidates with the desired 25 characteristics were sequenced and a mutant (p9) having 9 bp deleted at 5 'of A in the ATG methionine codon was selected for further constructs. p9 was digested with Eco RI and HindIII, and a 645 bp TAKA amylase promoter-containing fragment was isolated by agarose gel electrophoresis, phenol- and CHCl4-extracted, and precipitated with ethanol. pTAKA17 was digested with SalI and EcoRI, and a 510 bp fragment containing the TAKA amylase promoter upstream regions was isolated by agarose gel electrophoresis, phenol and CHCl4 extracted and precipitated with ethanol. These promoter regions were ligated to each other and to a pIC19R vector that had been digested with SalI and HindIII. The ligation mixture was used to transform E. coli cells, and correct, s DK 169134 B1

LOLO

rekombinanter blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger af plasmider ekstraheret som minipreppreparater. I en sådan rekombinant p719 blev TAKA-amylasepromotorregionen fra Aspergillus oryzae fundet som et 1,1 kb fragment, der kan 5 udskæres ved hjælp af et antal forskellige restriktionsenzymer. Konstruktionen af p719 er illustreret i fig. 10.recombinants were identified by restriction enzyme cleavages of plasmids extracted as mini prep preparations. In such a recombinant p719, the TAKA amylase promoter region of Aspergillus oryzae was found as a 1.1 kb fragment that can be excised by a number of different restriction enzymes. The construction of p719 is illustrated in FIG. 10th

Fra pRMPAMGTerm blev den åbne læseramme af præproRMP og glucoamylaseterminatorregionen (AMGTerm) isoleret som et 2 kb fragment efter fordøjelse med BamHI og 10 EcoRI. Dette fragment blev oprenset ved agarosegelelektro-forese, phenol- og CKCl^-ekstraktioner og derpå koncentreret ved ethanolfældning. Promotoren fra TAKA-amylasen fra A. oryzae blev nu isoleret som et 1,1 kb fragment opnået efter fordøjelse af p719 med Sall og BamHI. Dette fragment blev 15 oprenset ved agarosegelelektroforese, phenol- og CHCl^- ekstraktioner og derpå fældet med ethanol. 1,1 kb promotorfragmentet blev ligeret til 2 kb BamHI/EcoRI-fragmentet fra pRMPAMGTerm i en pUC19 vektor, der var blevet fordøjet med Sall og EcoRI. Ligeringsblandingen blev anvendt til at trans-20 formere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger af miniprepplasmider. En sådan korrekt rekombinant p777 blev dyrket i stor skala til isolering af rekombinant plasmid, og plasmidpræparationen blev oprenset 25 ved CsCl/ethidiumbromidcentrifugering. Konstruktionen af p777 er illustreret i fig. 11.From pRMPAMGTerm, the open reading frame of the preproMP and the glucoamylase terminator region (AMGTerm) was isolated as a 2 kb fragment after digestion with BamHI and 10 EcoRI. This fragment was purified by agarose gel electrophoresis, phenol and CKCl 2 extractions and then concentrated by ethanol precipitation. The promoter of the A. oryzae TAKA amylase was now isolated as a 1.1 kb fragment obtained after digestion of p719 with SalI and BamHI. This fragment was purified by agarose gel electrophoresis, phenol and CHCl 3 extractions and then precipitated with ethanol. The 1.1 kb promoter fragment was ligated to the 2 kb BamHI / EcoRI fragment from pRMPAMGTerm in a pUC19 vector that had been digested with SalI and EcoRI. The ligation mixture was used to transform E. coli cells and among the resulting transformants, correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavages of miniprep plasmids. Such proper recombinant p777 was grown on a large scale to isolate recombinant plasmid and the plasmid preparation was purified by CsCl / ethidium bromide centrifugation. The construction of p777 is illustrated in FIG. 11th

Eksempel 8 30 Konstruktion af en Aspergillusekspressionsvektor designet til opnåelse af sekretion af Rhizomucor miehei lipase under kontrol af Aspergillus oryzae TAKA-amylase promotorenExample 8 Construction of an Aspergillus Expression Vector Designed to Achieve Secretion of Rhizomucor miehei Lipase Under the Control of the Aspergillus oryzae TAKA Amylase Promoter

Konstruktion og identificering af en lipase cDNA-klon i E.Construction and identification of a lipase cDNA clone in E.

35 coli 26 DK 169134 B135 coli 26 DK 169134 B1

For at opnå informationer, der tillader konstruktionen af en specifik oligonucleotidprobe, blev der udført en delvis sekvensbestenunelse på oprenset Rhizomucor miehei lipase (Moskowitz, G.J. et al., J.Agric. Food;Chem., 2j> 5 (1977), 1146-1150). I den følgende tekst anvendes forkortelsen RML for Rhizomucor miehei lipasen. Supernatanten fra en kulturvæske af Rhizomucor miehei, fra hvilken myceliet og stoffer med lav molekylvægt var blevet fjernet, blev underkastet en anionbytningschromatografi. Den største lipolytiske 10 fraktion fra kolonnen blev afsaltet og ultrafiltreret før lyophilisering. Det lyophiliserede pulver blev derpå underkastet affinitetskromatografi. De samlede lipasefraktioner fra kolonnen blev afsaltet og koncentreret ved ultrafiltrering. Dette koncentrat blev derpå underkastet en hydrofobisk 15 interaktionskromatografi (HIC), og lipasen fra HlC-oprensnin-gen blev anvendt til aminosyresekvensbestemmelse. Sekvensbestemmelsen blev udført både på det native enzym (N-terminal sekvens) og på udvalgte fragmentet opnået efter proteolytisk spaltning af lipasen med Armillaria mellea protease. Sekvens-20 bestemmelsen blev udført på en gasfasesekvenator (AppliedTo obtain information permitting the construction of a specific oligonucleotide probe, a partial sequence analysis was performed on purified Rhizomucor miehei lipase (Moskowitz, GJ et al., J. Agric. Food; Chem., 2j> 5 (1977), 1146- 1150). In the following text, the abbreviation RML is used for the Rhizomucor miehei lipase. The supernatant from a culture liquid of Rhizomucor miehei from which the mycelium and low molecular weight substances had been removed was subjected to anion exchange chromatography. The largest lipolytic fraction from the column was desalted and ultrafiltered before lyophilization. The lyophilized powder was then subjected to affinity chromatography. The total lipase fractions from the column were desalted and concentrated by ultrafiltration. This concentrate was then subjected to hydrophobic interaction chromatography (HIC) and the lipase from HI C purification was used for amino acid sequencing. Sequencing was performed both on the native enzyme (N-terminal sequence) and on the selected fragment obtained after proteolytic cleavage of the Armillaria mellea protease lipase. Sequence determination was performed on a gas phase sequencer (Applied

Biosystems Model 470A) som beskrevet af Thim, L. et al. (FEBS Lett., 212 (1987), 307-312).Biosystems Model 470A) as described by Thim, L. et al. (FEBS Lett., 212 (1987), 307-312).

RML blev fordøjet med Armillaria mellea protease som beskrevet af Moody et al. (FEBS Lett. 172 (1984), 142-25 148) med den ene undtagelse, at forhold mellem enzym og substrat var 1:40 (mol:mol). De opnåede fragmenter blev separeret ved HPLC, og UV-absorptionen blev monitoreret ved 280 nm og 214 nm. For at identificere egnede fragmenter til konstruktion af oligonucleotidprober, blev der kun sekvente-30 ret peptider med et højt forhold mellem 280 nm og 214 nm, da disse fragmenter indeholder Trp og/eller Tyr.RML was digested with Armillaria mellea protease as described by Moody et al. (FEBS Lett. 172 (1984), 142-25 148) with the one exception that the ratio of enzyme to substrate was 1:40 (mol: mol). The obtained fragments were separated by HPLC and the UV absorption was monitored at 280 nm and 214 nm. To identify suitable fragments for constructing oligonucleotide probes, only peptides with a high ratio of 280 nm to 214 nm were sequenced, as these fragments contain Trp and / or Tyr.

Følgende N-terminale sekvens blev fundet ved anvendelse af nativt RML: 35 27 DK 169134 B1 5 10 15The following N-terminal sequence was found using native RML: 35 27 DK 169134 B1 5 10 15

Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Thr-Ser-Gln-glu-Ile-Asn- 20 25Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Thr-Ser-Gln-glu-Ile-Asn-25

Glu-Leu-Thr-Tyr-Tyr-Thr-X-Leu-(Ser)-(Ala)-.Glu-Leu-Thr-Tyr-Tyr-Thr-X-Leu- (Ser) - (Ala) -.

55

Et af de isolerede fragmenter fra den proteolytiske spaltning havde sekvensen: Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Trp-Asp-X-Ile-His, og dette fragment blev anvendt til syntese af en specifik oligonucleotidprobe.One of the isolated fragments from the proteolytic cleavage had the sequence: Arg-Thr-Val-Ile-Pro-Gly-Ala-Thr-Trp-Asp-X-Ile-His, and this fragment was used for the synthesis of a specific oligonucleotide probe.

10 Rhizomucor miehei cDNA biblioteket fra eksempel 3 konstrueret til isoleringen af aspartatprotease-(RMP) rekombinanter fra denne organisme blev også anvendt til identificeringen af lipasespecifikke rekombinanter. En blanding af oligonucleotider blev syntetiseret på en Applied 15 Biosystems Inc. DNA-syntesemaskine. Blandingen med følgende struktur:The Rhizomucor miehei cDNA library of Example 3 constructed for the isolation of aspartate protease (RMP) recombinants from this organism was also used for the identification of lipase-specific recombinants. A mixture of oligonucleotides was synthesized on an Applied 15 Biosystems Inc. DNA synthesizer. The mixture having the following structure:

AA

5' TCCCANGTNGCNCC 3' 430/4315 'TCCCANGTNGCNCC 3' 430/431

20 G20 G

er komplementær til RiML mRNA i en region, der koder for aminosyrerne Gly-Ala-Thr-Trp-Asp. Dette pentapeptid blev identificeret som et segment fra en aminosyresekvens opnået 25 fra proteolytiske fragmenter af oprenset RML protein (se ovenfor).is complementary to RiML mRNA in a region encoding the amino acids Gly-Ala-Thr-Trp-Asp. This pentapeptide was identified as a segment from an amino acid sequence obtained from proteolytic fragments of purified RML protein (see above).

Rhizomucor miehei cDNA-biblioteket blev screenet 32 med blandingen af P-kineret lipaseoligonucleotider som beskrevet i forbindelse med screeningen af den RMP-specifikke 30 blanding. Hybridisering og den første vask af filtrene blev udført ved 43°C. Efter autoradiografi blev filtrene vasket ved 47°C. Kolonier, der viste en stærk hybridisering, blev isoleret, og det indsatte cDNA i de tilsvarende plasmider blev sekventeret til identificering af RML-specifikke 35 rekombinanter. To sådanne rekombinanter p353.7 og p353.16 havde indsatte fragmenter på ca. 1,2 kb. DNA-sekvensen opnået fra disse to rekombinanter startede i midten af DK 169134 B1 28 signalpeptidet (se fig. 12) og strækker sig gennem poly-A-enden. I denne region kunne der identificeres en lang åben læseramme. Da de to rekombinanter ikke indeholder sekvensen for 5'-delen af signalpeptidet med dets startméthioninkodon, 5 blev der syntetiseret et syntetisk oligonucleotid (584) 5' CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3' 584.The Rhizomucor miehei cDNA library was screened 32 with the mixture of β-kinase lipase oligonucleotides as described in connection with the screening of the RMP-specific mixture. Hybridization and the first washing of the filters were performed at 43 ° C. After autoradiography, the filters were washed at 47 ° C. Colonies showing strong hybridization were isolated and the cDNA inserted into the corresponding plasmids was sequenced to identify RML-specific 35 recombinants. Two such recombinants p353.7 and p353.16 had inserted fragments of ca. 1.2 kb. The DNA sequence obtained from these two recombinants started in the middle of the DK 169134 B1 28 signal peptide (see Fig. 12) and extends through the poly-A end. In this region, a long open reading frame could be identified. Since the two recombinants do not contain the sequence of the 5 'portion of the signal peptide with its starting methionine codon, 5 a synthetic oligonucleotide (584) 5' CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3 '584 was synthesized.

Dette oligonucleotid 584 er komplementær til RML-mRNA i den region, der koder for en aminosyresekvens Pro-Pro-Leu-Ile- 10 Pro-Ser-Arg fundet i propeptidregionen (se fig. 12). Efter at oligo 584 var blevet kineret til høj specifik aktivitet med o o T4 polynucleotidkinase og P-^-ATP, blev den anvendt i en primer-ekstensionsreaktion på Rhizomucor miehei mRNA med AMV revers transcriptase ifølge publicerede procedurer (Boel, E.This oligonucleotide 584 is complementary to RML mRNA in the region encoding an amino acid sequence Pro-Pro-Leu-Ile-Pro-Ser-Arg found in the propeptide region (see Figure 12). After oligo 584 was kinated to highly specific activity with o T4 polynucleotide kinase and β - ATP, it was used in a primer extension reaction to Rhizomucor miehei mRNA with AMV reverse transcriptase according to published procedures (Boel, E.

15 et al., PNAS, USA, 80, 2866-2869, 1983). Produkterne fra primer-ekstensionsreaktionen blev elektroforeret på en 10% polyacrylamid/urinstofgel, og to cDNA-produkter blev isoleret. Disse to cDNA', den ene 150 nucelotider lang og den anden 160 nucleotider lang, blev begge elektroelueret og 20 sekventeret ved hjælp af den kemiske nedbrydningsprocedure for DNA-sekventering. Begge cDNA-fragmenterne gav læselige sekvenser, der strækker sig fra primer-regionen og op til en position 9 nucleotider 5' for startmethioninkodonen., Et al., PNAS, USA, 80, 2866-2869, 1983). The products of the primer extension reaction were electrophoresed on a 10% polyacrylamide / urea gel and two cDNA products were isolated. These two cDNAs, one 150 nucleotides long and the other 160 nucleotides long, were both electroeluted and sequenced by the chemical sequencing procedure for DNA sequencing. Both cDNA fragments yielded readable sequences extending from the primer region up to a position 9 nucleotides 5 'of the starting methionine codon.

Sekvensen bekræftede den sekvens, der blev opnået fra lipase-25 rekombinant cDNA-plasmider. Længden af de to cDNA-produkter fra primer-ekstensionen viser, at 5'-enden (CAP-stedet) af lipase-mRNA er lokaliseret ca. 5 eller 15 nucleotider oven for 5'-enden af det første A nucleotid vist i fig. 12. En mikroheterogenicitet ved 5'-enden i mRNA fra svampe er meget 30 almindelig. Ved kombination af den sekvens, der blev opnået fra de to klonede cDNA-fragmenter p353.7 og p353.16 med sekvensen fra primerekstensionsanalysen, kan aminosyresekven-sen af RML-precursoren fastlægges. DNA-sekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens af RML-precursoren er vist i 35 fig. 12. I fig. 12 angiver de vandrette linier positionen af syntetiske oligonucleotider anvendt til cDNA syntese og til screening af cDNA-bibliotek. En pil viser den position, hvor 29 DK 169134 B1 spaltning sker under modningen af det native RML. Nucleoti-derne er nummereret fra den første base i startMet-kodonen, og aminosyrerne er nummereret fra den første aminosyrerest i det modne native RML. Dette RML kodes af en åben læseramme, 5 der strækker sig fra startMetkodonen og gennem 363 kodoner, før der nås en stopkodon. I denne precursor udgør de første 24 aminosyrerester et typisk hydrofobt signalpeptid. Ifølge von Heijnes regler (Eur.J.Biochem. 133, 17-21, 1983) vil signalpeptidet spaltes fra det følgende propeptid ved hjælp 10 af signalpeptidasespaltning mellem Ala- og Val-resterne henholdsvis i position -71 og -70.The sequence confirmed the sequence obtained from lipase recombinant cDNA plasmids. The length of the two cDNA products from the primer extension shows that the 5 'end (CAP site) of lipase mRNA is located approx. 5 or 15 nucleotides above the 5 'end of the first A nucleotide shown in FIG. 12. A microheterogeneity at the 5 'end of fungal mRNA is very common. By combining the sequence obtained from the two cloned cDNA fragments p353.7 and p353.16 with the sequence from the primer extension assay, the amino acid sequence of the RML precursor can be determined. The DNA sequence and corresponding amino acid sequence of the RML precursor are shown in FIG. 12. In FIG. 12, the horizontal lines indicate the position of synthetic oligonucleotides used for cDNA synthesis and for screening cDNA libraries. An arrow indicates the position at which cleavage occurs during the maturation of the native RML. The nucleotides are numbered from the first base of the startMet codon and the amino acids are numbered from the first amino acid residue in the mature native RML. This RML is encoded by an open reading frame 5 extending from the startMet codon and through 363 codons before reaching a stop codon. In this precursor, the first 24 amino acid residues constitute a typical hydrophobic signal peptide. According to von Heyne's rules (Eur. J. Biochem. 133, 17-21, 1983), the signal peptide will be cleaved from the following propeptide by means of signal peptidase cleavage between the Ala and Val residues at positions -71 and -70, respectively.

Da den N-terminale aminosyresekvensanalyse af oprenset RML opnået fra kultursupernatenten fra Rhizomucor miehei identificerede Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg som den N-15 terminale ende af det aktive RML-enzym, består propeptidet af RML-precursoren af de næste 70 aminosyrerester i precursoren. Begyndende med denne N-terminale Ser-rest udstrækker det modne RML sig gennem 269 rester, før det når termineringskodonen. I dette modne 29500 dalton enzym er et 20 lipasesubstratbindingssted lokaliseret omkring aminosyrerest Ser(144), som er bevaret i et antal lipaser. I 3'enden af RML-mRNA blev 104 nucleotider lokaliseret som en ikke-translateret region mellem TAA-stopkodonen og poly(A)-enden.Since the N-terminal amino acid sequence analysis of purified RML obtained from the culture supernatant of Rhizomucor miehei identified Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg as the N-terminal end of the active RML enzyme, the propeptide consists of the RML precursor of the next 70 amino acid residues in the precursor. Starting with this N-terminal Ser residue, the mature RML extends through 269 residues before reaching the termination codon. In this mature 29500 dalton enzyme, a lipase substrate binding site is located around amino acid residue Ser (144), which is conserved in a number of lipases. At the 3 'end of RML mRNA, 104 nucleotides were localized as an untranslated region between the TAA stop codon and the poly (A) end.

23 nucleotider oven for 5'-enden af denne poly(A)-ende blev 25 der fundet en repetitiv struktur bestående af 7 AT-basepar, medens der ikke kunne identificeres noget typisk eukaryotisk polyadenyleringssignal.Twenty-three nucleotides above the 5 'end of this poly (A) terminus, 25 found a repetitive structure consisting of 7 AT base pairs, while no typical eukaryotic polyadenylation signal could be identified.

I en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse blev der udført en række ændringer på RML cDNA. 30 Disse ændriner involverer fjernelse af G:C-haler sat til cDNA under kloningen og indførelse af restriktionsendonuclease-spaltningssteder ved 5'-enden og 3'-enden af den åbne læseramme. Et antal passende restriktionsspaltninssteder blev også indført i signalpeptid- og i propeptidregionerne i cDNA.In a preferred embodiment of the present invention, a number of changes were made to the RML cDNA. These alterations involve removal of G: C tails added to cDNA during the cloning and introduction of restriction endonuclease cleavage sites at the 5 'end and 3' end of the open reading frame. A number of suitable restriction cleavage sites were also introduced into the signal peptide and propeptide regions of the cDNA.

30 DK 169134 B1 p353.16 blev fordøjet med FnuDII, og et 880 bp DNA-fragment (fra 3'-enden af RML-cDNA) blev isoleret ved agarosegelelektroforese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol.B1 p353.16 was digested with FnuDII and an 880 bp DNA fragment (from the 3 'end of RML cDNA) was isolated by agarose gel electrophoresis. The fragment was electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted and precipitated with ethanol.

5 Denne 3'-ende af RML cDNA blev derpå ligeret til en pUCl9 vektor, der var blevet spaltet med Smal og behandlet med alkalisk phosphatase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identi-10 ficeret ved restriktionsenzymspaltning af miniprepplasmider.This 3 'end of RML cDNA was then ligated to a pUC19 vector that had been cleaved with SmaI and treated with alkaline phosphatase. The ligation mixture was used to transform competent E. coli cells and among the resulting transformants, correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavage of miniprep plasmids.

En sådan passende rekombinant p435.2 blev fordøjet med Banll og HinduI, og et 0,69 kb fragment blev isoleret ved agarosegelelektrof orese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol. Dette fragment af 15 RML cDNA indeholdt nu en væsentlig del af det multiple pUCl9 kloningssted knyttet til dets 3'-ikketranslaterede region.Such a suitable recombinant p435.2 was digested with Ban11 and HinduI, and a 0.69 kb fragment was isolated by agarose gel electrophoresis. The fragment was electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted and precipitated with ethanol. This fragment of 15 RML cDNA now contained a substantial portion of the multiple pUC19 cloning site associated with its 3 'nontranslated region.

51-enden af RML-cDNA blev gendannet ved anvendelse af syntetiske oligonucleotider for at indføre passende restriktionsspaltningssteder. DNA-sekvensen af det syntetiske 20 fragment (RML 5') er vist i fig. 14. Positionen af introducerede restriktionsspaltningssteder og de forenede fragmenter af de individuelt syntetiserede oligonucleotider er angivet ved hjælp af vandrette henholdsvis lodrette/vandrette linier. Det fremkomne fragment (RML 5') blev oprenset som et 150 bp 25 fragment på en 2% agarosegel, elektroelueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret og fældet med ethanol før yderligere ligeringsreaktioner.The 51-end of RML cDNA was recovered using synthetic oligonucleotides to introduce appropriate restriction cleavage sites. The DNA sequence of the synthetic 20 fragment (RML 5 ') is shown in FIG. 14. The position of introduced restriction cleavage sites and the unified fragments of the individually synthesized oligonucleotides is indicated by horizontal and vertical / horizontal lines, respectively. The resulting fragment (RML 5 ') was purified as a 150 bp fragment on a 2% agarose gel, electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted and precipitated with ethanol before further ligation reactions.

p353.7 blev fordøjet med BanI og Banll, og et 387 bp RML-fragment blev oprenset ved hjælp af 10% 30 polyacrylamid-gelelektroforese. Fragmentet blev elektroelueret, phenol- og CHCl^-ekstraheret før ethanolfældning og derpå ligeret til det syntetiske RML 5'-fragment og 0,69 kb Banll/Hindlll-fragmentet fra p435.2 i en BamHI/Hindlll-fordøjet pUCl3 vektor. Ligeringsblandingen blev 35 anvendt til at transformere kompetente E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltninger 3i DK 169134 B1 på miniprepplasmider. I en sådan korrekt rekombinant pB544, blev den syntetiske del sekventeret til bekræftelse af den forventede struktur. Konstruktionen af pB544 er illustreret i fig. 13a. Fra pB544 blev præpro-RML-cDNA isoleret som et 1,2 5 kb BamHI-fragment ved agarosegelelektroforese. Der blev fremstillet en ekspressionsvektor baseret på promotoren fra Aspergillus oryzae TAKA-amylasegenet og terminatoren fra Aspergillus niger glucoamylasegenet som følger: p719 (se eksempel 7) blev fordøjet med Sall og BamHI. Det fremkomne 10 1,1 kb TAKA amylase promotorfragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese. plCAMG/Term (se eksempel 4) blev fordøjet med BamHI og EcoRI. Det fremkomne 0,75 kb glucoamylaseterminatorfragment blev oprenset ved agarosegelelektroforese. Efter phenol- og CHCl^-ekstraktioner 15 blev disse to fragmenter fældet med ethanol og ligeret til en Sall/EcoRI-fordøjet pUC19 vektor. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transformere E. coli celler, og blandt de fremkomne transformanter blev korrekte rekombinanter identificeret ved restriktionsenzymspaltning af miniprepplasmider.p353.7 was digested with BanI and BanII, and a 387 bp RML fragment was purified by 10% polyacrylamide gel electrophoresis. The fragment was electroeluted, phenol- and CHCl4-extracted before ethanol precipitation, and then ligated to the synthetic RML 5 'fragment and the 0.69 kb BanIII / HindIII fragment from p435.2 in a BamHI / HindIII digested pUC13 vector. The ligation mixture was used to transform competent E. coli cells, and among the resulting transformants, correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavages 3 in DK 169134 B1 on mini prep plasmids. In such properly recombinant pB544, the synthetic moiety was sequenced to confirm the expected structure. The construction of pB544 is illustrated in FIG. 13a. From pB544, prepro-RML cDNA was isolated as a 1.2 5 kb Bam HI fragment by agarose gel electrophoresis. An expression vector based on the promoter of the Aspergillus oryzae TAKA amylase gene and the terminator of the Aspergillus niger glucoamylase gene were prepared as follows: p719 (see Example 7) was digested with SalI and BamHI. The resulting 1.1 kb TAKA amylase promoter fragment was purified by agarose gel electrophoresis. plCAMG / Term (see Example 4) was digested with BamHI and EcoRI. The resulting 0.75 kb glucoamylase terminator fragment was purified by agarose gel electrophoresis. After phenol and CHCl 3 extractions, these two fragments were precipitated with ethanol and ligated to a SalI / EcoRI digested pUC19 vector. The ligation mixture was used to transform E. coli cells and among the resulting transformants, correct recombinants were identified by restriction enzyme cleavage of miniprep plasmids.

20 En sådan korrekt rekombinant p775 blev fordøjet med BamHI og behandlet med alkalisk phosphatase. 1,2 kb BamHI RML-præpro-cDNA-fragmentet fra pB544 blev ligeret til denne p775 vektor og transformeret i E. coli. En rekombinant p787 med RML-præpro-cDNA indsat i korrekt orientering mellem promotoren og 25 terminatoren blev identificeret ved restriktionsenzymspaltninger på miniprepplasmider ekstraheret fra E. coli transformanter. p787 plasmid DNA blev dyrket i stor skala, og plasmidpræparationen blev oprenset ved CsCl/ethidiumbromid-centrifugering. Konstruktionen af p787 er illustreret i fig.Such a properly recombinant p775 was digested with BamHI and treated with alkaline phosphatase. The 1.2 kb BamHI RML prepro cDNA fragment from pB544 was ligated to this p775 vector and transformed into E. coli. A recombinant p787 with RML prepro cDNA inserted in the correct orientation between the promoter and the terminator was identified by restriction enzyme cleavages on mini prep plasmids extracted from E. coli transformants. p787 plasmid DNA was grown on a large scale and the plasmid preparation was purified by CsCl / ethidium bromide centrifugation. The construction of p787 is illustrated in FIG.

30 13b.13b.

Eksempel 9Example 9

Transformering af Aspergillus oryzae (generel procedure) 35 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in YeastTransforming Aspergillus oryzae (General Procedure) 35 100 ml YPD (Sherman et al., Methods in Yeast

Genetics, Cold Spring Harbour Laboratory, 1981) blev podet med sporer af A. oryzae, IFO 4177 eller argB mutanter heraf, 32 DK 169134 B1 og inkuberedes under omrystning ved 37°C i to ca. dage.Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981) was seeded with spores of A. oryzae, IFO 4177 or argB mutants thereof, and incubated with shaking at 37 ° C for two ca. days.

Myceliet blev høstet ved filtrering gennem miraklæde og vasket med 200 ml 0,6 M MgSO^. Myceliet blev suspenderet i 15 ml 1,2 M MgS04, 10 mM NaH2P04, pH = 5,8. Suspensionen blev 5 afkølet på is, og der blev tilsat 1 ml puffer indeholdende 120 mg Novozym® 234, batch 1687. Efter 5 minutters forløb blev der tilsat 1 ml af 12 mg/ml BSA (Sigma type H25), og inkuberingen blev fortsat under mild omrøring i 1,5 - 2,5 timer ved 37°C, indtil et stort antal protoplaster var 10 synlige i en prøve undersøgt under mikroskop.The mycelia were harvested by filtration through miracle cloth and washed with 200 ml of 0.6 M MgSO 4. The mycelium was suspended in 15 ml 1.2 M MgSO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, pH = 5.8. The suspension was cooled on ice and 1 ml of buffer containing 120 mg of Novozym® 234, batch 1687. After 1 minute, 1 ml of 12 mg / ml of BSA (Sigma type H25) was added and the incubation was continued under gentle stirring for 1.5 - 2.5 hours at 37 ° C until a large number of protoplasts were visible in a sample examined under a microscope.

Suspensionen blev filtreret gennem miraklæde, filtratet blev overført til sterile rør og belagt med 5 ml 0,6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH = 7,0. Der blev centrifugeret i 15 minutter ved 1000 g, og protoplaster blev samlet 15 fra toppen af MgSO^-puden. Der blev tilsat 2 rumfang STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, 10 mM CaCl2) til proto-plastsuspensionen, og blandingen blev centrifugeret i 5 minutter ved 1000 g. Protoplastpillen blev resuspenderet i 3 ml STC og repelleteret. Dette blev gentaget. Til slut blev 20 protoplasterne resuspenderet i 0,2 - 1 ml STC.The suspension was filtered through miracle cloth, the filtrate was transferred to sterile tubes and coated with 5 ml of 0.6 M sorbitol, 100 mM Tris-HCl, pH = 7.0. Centrifuge for 15 minutes at 1000 g and protoplasts were collected 15 from the top of the MgSO 2 pad. 2 volumes of STC (1.2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl pH = 7.5, 10 mM CaCl 2) were added to the protoplast suspension and the mixture was centrifuged for 5 minutes at 1000 g. The protoplast pellet was resuspended in 3 ml. STC and the repeller. This was repeated. Finally, the 20 protoplasts were resuspended in 0.2 - 1 ml of STC.

100 μΐ af protoplastsuspensionen blev blandet med 5-25 pg af det pågældende DNA i 10 μΐ STC. Protoplasterne fra argB-stammerne blev blandet med pSal43 DNA (et plasmid bærende et A. nidulans argB-gen), og protoplaster fra argB+ 25 stammerne blev blandet med p3SR2 (et plasmid bærende et A. nidulans amdS-gen). Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, og der blev tilsat 0,2 ml 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 og 10 mM Tris-HCl pH = 7,5, og der blev blandet omhyggeligt (to gange), hvorpå der til slut blev 30 tilsat 0,85 ml af den samme opløsning og blandet omhyggeligt. Blandingen blev henstillet ved stuetemperatur i 25 minutter, centrifugeret i 15 minutter ved 2500 g, og pillen blev resuspenderet i 2 ml 1,2 M sorbitol. Efter en yderligere sedimentering blev protoplasterne spredt ud på passende 35 plader. Protoplaster fra argB-stammerne transformeret med pSal43 blev spredt ud på minimalplader (Cove,100 μΐ of the protoplast suspension was mixed with 5-25 μg of the DNA in 10 μΐ STC. The protoplasts from argB strains were mixed with pSal43 DNA (a plasmid carrying an A. nidulans argB gene) and protoplasts from argB + 25 strains were mixed with p3SR2 (a plasmid carrying an A. nidulans amdS gene). The mixture was allowed to stand at room temperature for 25 minutes and 0.2 ml of 60% PEG 4000 (BDH 29576), 10 mM CaCl2 and 10 mM Tris-HCl pH = 7.5 were added and carefully mixed (twice). finally, 0.85 ml of the same solution was added and mixed thoroughly. The mixture was left at room temperature for 25 minutes, centrifuged for 15 minutes at 2500 g, and the pill resuspended in 2 ml of 1.2 M sorbitol. After further sedimentation, the protoplasts were spread on appropriate 35 plates. Protoplasts from argB strains transformed with pSal43 were spread on minimal plates (Cove,

Biochem,Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) med glucose og 33 DK 169134 B1 urinstof som henholdsvis carbon- og nitrogenkilde og indholdende 1,2 M sorbitol til osmotisk stabilisering-. Protoplaster fra argB -stammerne transformeret med p3SR2 blev udspredt på minimalplader (Cove, Biochem.Biophys. Acta 113 -(1966) 51-56) 5 indeholdende 1,0 M sucrose, pH = 7,0, 10 mM acetamid som nitrogenkilde og 20 mM CsCl til inhibering af baggrundsvæksten. Efter inkubering i 4-7 dage ved 37°C blev sporerne taget op, suspenderet i sterilt vand og spredt ud til enkeltkolonier. Denne procedure blev gentaget, og .sporerne fra en 10 enkelt koloni efter den anden reisolering blev opbevaret som en specifik transformant.Biochem, Biophys.Acta 113 (1966) 51-56) with glucose and 33 DK 169134 B1 urea as carbon and nitrogen source respectively and containing 1.2 M sorbitol for osmotic stabilization. Protoplasts from the argB strains transformed with p3SR2 were spread on minimal plates (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 - (1966) 51-56) 5 containing 1.0 M sucrose, pH = 7.0, 10 mM acetamide as a nitrogen source and 20 mM CsCl to inhibit background growth. After incubation for 4-7 days at 37 ° C, the spores were taken up, suspended in sterile water and spread to single colonies. This procedure was repeated and the spores from a single colony after the second re-isolation were stored as a specific transformant.

Eksempel 10 15 Ekspression af TAKA-amylase i en vildtype A. oryzae stamme pTAKA 17 blev transformeret i A. oryzae IFO 4177 ved kotransformering med p3SR2 indeholdende amdS-genet fra A. nidulans som beskrevet eksempel 9. Protoplaster fremstillet som beskrevet blev inkuberet med en blanding af lige store 20 mængder pTAKA 17 og p3SR2, idet der anvendtes ca. 5 pg af hver. 9 transformanter, som kunne anvende acetamid som eneste nitrogenkilde, blev reisoleret to gange. Efter vækst på YPD (Sherman et al., 1981) i tre dage blev kultursupernatanterne analyseret ved SDS-PAGE. Gelerne blev farvet med coomassie 25 brilliant blue R. De bedste transformanter producerede 10 -20 gange mere amylase end ikke-transformeret IFO 4177. En transformant blev udvalgt til yderligere studier og dyrket i en 2 liter Kieler-fermenteringsbeholder på 4% sojabønnemel, idet der tilførtes glucose under væksten. Kulturen blev 30 omrørt kraftigt under gæringen. Under disse betingelser gav IFO 4177 ca. 1 g/1, og transformanten ca. 12 g/1 amylase bestemt ved hjælp af enzymaktivitet. Enzymaktiviteten blev målt som evnen til at nedbryde stivelse (Cereal Chemistry 3j5 (1939), 712-723). Den anvendte stivelse var Merck Amylum 35 solubile erg B.6, og prøven blev udført ved pH 4,7 og ved 37°C. Der blev ikke tilsat β-amylase.Example 10 Expression of TAKA Amylase in a Wild Type A. Oryzae Strain pTAKA 17 was transformed into A. oryzae IFO 4177 by cotransformation with p3SR2 containing the A. nidulans amdS gene as described Example 9. Protoplasts prepared as described were incubated with a mixing equal 20 amounts of pTAKA 17 and p3SR2 using approx. 5 pg of each. 9 transformants which could use acetamide as the sole source of nitrogen were re-isolated twice. After growth on YPD (Sherman et al., 1981) for three days, the culture supernatants were analyzed by SDS-PAGE. The gels were stained with coomassie 25 brilliant blue R. The best transformants produced 10-20 times more amylase than non-transformed IFO 4177. A transformant was selected for further studies and grown in a 2 liter Kieler fermentation container of 4% soybean flour, glucose was added during growth. The culture was stirred vigorously during fermentation. Under these conditions, IFO 4177 gave approx. 1 g / l and the transformant approx. 12 g / l amylase determined by enzyme activity. Enzyme activity was measured as the ability to break down starch (Cereal Chemistry 3j5 (1939), 712-723). The starch used was Merck Amylum 35 solubilized B.6 and the sample was carried out at pH 4.7 and at 37 ° C. No β-amylase was added.

DK 169134 Bl 34DK 169134 Pg 34

Eksempel 11Example 11

Ekspression af RMP i A. oryzae p777 fra eksempel 7 eller p778 fra eksempel 6 blev transformeret i IFO-4177 ved kotransformeringen med p3SR2 på 5 den i eksempel 9 beskrevne måde. Transformanter blev selekteret og reisoleret som beskrevet i eksempel 9.Expression of RMP in A. oryzae p777 from Example 7 or p778 from Example 6 was transformed into IFO-4177 by the cotransformation with p3SR2 in the manner described in Example 9. Transformants were selected and re-insulated as described in Example 9.

Transformanter blev dyrket i tre dage i YPD, og supernatanterne blev analyseret ved hjælp af SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting og ELISA. Supernatanterne fra 10 transformanter af både p777 og p778 indeholdt fra 50 - 150 mg/1 protein, der reagerer med RMP-antistof. Proteinasen var overglycosyleret i sammenligning med R. miehei-produceret proteinase. Der blev set to former, af hvilke den ene blev antaget at være proformen og den anden at være fraspaltet 15 moden proteinase. To transformanter af p778 og tre transfor-manter af p777 blev dyrket i en fermenteringsbeholder som beskrevet ovenfor for TAKA-amylasetransformanterne. De to transformanter af p778 gav ca. 0,2 g/1 og 0,4 g/1, og de tre transformanter af p777 gav ca. 0,5 g/1, 2,4 g/1 og 3,3 g/1 af 20 RMP bestemt som mælkekoaguleringsaktivitet ved hjælp afTransformants were grown for three days in YPD and the supernatants analyzed by SDS-PAGE followed by Western blotting and ELISA. The supernatants of 10 transformants of both p777 and p778 contained from 50 - 150 mg / l protein that reacts with RMP antibody. The proteinase was overglycosylated in comparison with R. miehei-produced proteinase. Two forms were seen, one of which was thought to be the proform and the other to be cleaved off of mature proteinase. Two transformants of p778 and three transformants of p777 were grown in a fermentation vessel as described above for the TAKA amylase transformants. The two transformants of p778 yielded ca. 0.2 g / l and 0.4 g / l, and the three transformants of p777 yielded ca. 0.5 g / l, 2.4 g / l and 3.3 g / l of 20 RMP determined as milk coagulation activity by

Kunitz-metoden (Kunitz M., Jour .Gen. Physiol. 1É5 (1935), 459-466), idet det antoges, at den specifikke aktivitet af rekom-binant RMP er den samme som aktiviteten af Rhizomucor miehei enzymet. (Dette er senere blevet bekræftet). SDS-PAGE og 25 SDS-PAGE efterfulgt af Western-blotting og ELISA viste, at der kun fandtes en form for RMP, når der blev dyrket i stor skala. Denne RMP var også overglycosyleret under disse vækstbetingelser. Proteinmængden set på geler_svarer godt til mængden bestemt ud fra enzymaktivitet.The Kunitz method (Kunitz M., Jour. Gen. Physiol. 1É5 (1935), 459-466), assuming that the specific activity of recombinant RMP is the same as that of the Rhizomucor miehei enzyme. (This has been confirmed later). SDS-PAGE and 25 SDS-PAGE followed by Western blotting and ELISA showed that there was only one form of RMP when grown on a large scale. This RMP was also overglycosylated under these growth conditions. The amount of protein seen on gels_ corresponds well to the amount determined from enzyme activity.

30 RMP blev oprenset fra kulturvæskesupernatanten ved affinitetskromatografi og størrelseseksklusionskromatografi.30 RMP was purified from the culture liquid supernatant by affinity chromatography and size exclusion chromatography.

Den N-terminale sekvens af det oprensede rekombi-nante RMP blev bestemt ved anvendelse af en gasfasesekvenator som beskrevet af Thim et al. (FEBS Lett, 1987 under 35 trykning).The N-terminal sequence of the purified recombinant RMP was determined using a gas phase sequencer as described by Thim et al. (FEBS Lett, 1987 under 35 printing).

35 DK 169134 B135 DK 169134 B1

Der blev fundet to former for rekombinant RMP, hvilket viser, at spaltningen ved den N-terminale ende er heterogen. Den ene form har følgende N-terminale sekvens: Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-, og den anden form 5 har følgende N-terminale sekvens: Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-. En sådan heterogen spaltning ved den N-terminale ende er også beskrevet for nativt RMP fra Mucor miehei (Paquet, D. et al., Neth.Milk.Dairy J., 35 (1981), 358-360). Da den heterogene spaltning af det rekombinante RMP 10 svarer godt overens med spaltningen af nativt RMP, er det i følge den foreliggende opfindelse blevet demonstreret, at A. oryzae er i stand til at spalte rekombinant RMP i den korrekte region.Two forms of recombinant RMP were found, showing that the cleavage at the N-terminal end is heterogeneous. One form has the following N-terminal sequence: Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-, and the other form 5 has the following N-terminal sequence: Gly-Ser-Val-Asp -Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-. Such heterogeneous cleavage at the N-terminal end is also described for native RMP from Mucor miehei (Paquet, D. et al., Neth. Milk.Dairy J., 35 (1981), 358-360). Since the heterogeneous cleavage of the recombinant RMP 10 corresponds well with the cleavage of native RMP, it has been demonstrated in the present invention that A. oryzae is capable of cleaving recombinant RMP in the correct region.

1515

Eksempel 12Example 12

Konstruktion af et ekspressionsplasmid til produktion af prochymosin i A. oryzaeConstruction of an expression plasmid for production of prochymosin in A. oryzae

Konstruktionen indeholder prochymosingenet umiddel-20 bart forudgået af signalpeptidsekvensen fra A. oryzae TAKA-amylasegenet under kontrol af A. oryzae TAKA-amylasepromoto-ren. Konstruktionen indeholder yderligere terminatoren fra A. niger glucoamylasegenet plus en E. coli replicon.The construct contains the prochymosin gene immediately preceded by the signal peptide sequence of the A. oryzae TAKA amylase gene under the control of the A. oryzae TAKA amylase promoter. The construct further contains the terminator of the A. niger glucoamylase gene plus an E. coli replicon.

Et ca. 430 bp BamHI/Xmal-fragment fra p285' proC 25 (se eksempel 1) og en syntetisk oligomer med følgende sekvensAn approx. 430 bp Bam HI / Xmal fragment from p285 'proC 25 (see Example 1) and a synthetic oligomer of the following sequence

AATTCCAGCTGCCGCGGCCGAGATCACCAGAATTCCAGCTGCCGCGGCCGAGATCACCAG

GGTCGACGGCGCCGGCTCTAGTGGTCCTAGGGTCGACGGCGCCGGCTCTAGTGGTCCTAG

30 blev indsat i EcoRI-Xmal-skåret pUCl9 plasmid til dannelse af plasmid pToC50a.30 were inserted into EcoRI-Xmal cut pUC19 plasmid to generate plasmid pToC50a.

pToC50a blev skåret med EcoRI-SacII, og det store fragment indeholdende pUC19 og 5'-enden af prochymosingenet (prochymosin') blev isoleret. Dette fragment blev ligeret til 35 et 0,6 kb EcoRI-Banl-fragment fra pTAKA 17 og den følgende syntetiske oligomer 36 DK 169134 B1pToC50a was cut with Eco RI-SacII and the large fragment containing pUC19 and the 5 'end of the prochymosin gene (prochymosin') was isolated. This fragment was ligated to a 0.6 kb EcoRI-Banl fragment from pTAKA 17 and the following synthetic oligomer 36 DK 169134 B1

GCACCTGCTTTGGCGCACCTGCTTTGGC

GACGAAAC (KFN 280/281) 5 - Efter transformering blev der isoleret et plasmid pToC51 indeholdende 5'-delen af prochymosingenet {prochymosin') forbundet med signalsekvensen fra A. oryzae TAKA-amylasegenet (preTAKA) og forudgået af ca. 500 bp upstream TAKA-amylasesekvenser. Konstruktionen af pToCSl er 10 illustreret i fig. 15a.GACGAAAC (KFN 280/281) 5 - After transformation, a plasmid pToC51 containing the 5 'portion of the prochymosin gene (prochymosin') associated with the signal sequence of the A. oryzae TAKA amylase gene (preTAKA) was isolated and preceded by ca. 500 bp upstream TAKA amylase sequences. The construction of pToCS1 is illustrated in FIG. 15a.

pR26 blev spaltet med HinfI, behandlet med det store fragment (Klenow) af DNA polymerase I og de fire dNTP'er og skåret med Xmal. Et 750 bp fragment indeholdende 3'-enden af prochymosingenet blev isoleret. Med det formål at 15 indsætte et Hindlll-spaltningssted ved 31-enden af dette fragment blev pUC9 spaltet med Xmal/HincII, og det store fragment blev ligeret til 750 bp fragmentet indeholdende 3'-enden af prochymosingenet.pR26 was digested with HinfI, treated with the large fragment (Klenow) of DNA polymerase I and the four dNTPs, and cut with Xmal. A 750 bp fragment containing the 3 'end of the prochymosin gene was isolated. For the purpose of inserting a HindIII cleavage site at the 31-end of this fragment, pUC9 was digested with Xmal / HincII, and the large fragment was ligated to the 750 bp fragment containing the 3 'end of the prochymosin gene.

Et 5,6 kb EcoRI-Clal-fragment fra pTAKA 17 blev 20 isoleret og ligeret til et 2,6 kb Clal-Hindlll-fragment fra det samme plasmid plus et 0,7 kb EcoRI-Hindlll-fragment fra pICAMG/Term (se eksempel 4) indeholdende A. niger glucoamyla-segenterminatoren og polyA-stedet. Det fremkomne plasmid er vist i fig. 15b som pToC52.A 5.6 kb EcoRI-ClII fragment from pTAKA 17 was isolated and ligated to a 2.6 kb Clα-HindIII fragment from the same plasmid plus a 0.7 kb EcoRI-HindIII fragment from pICAMG / Term (see Example 4) containing the A. niger glucoamyla signal terminator and the polyA site. The resulting plasmid is shown in FIG. 15b as pToC52.

25 pToC52 blev skåret med Hindlll og delvis med EcoRI, og der blev isoleret et 6,4 kb fragment. Dette blev ligeret til et 0,9 kb EcoRI-Xmal-fragment fra pToC51 og et 0,7 kb XmaI-HindIII-fragment fra pUC9'PC indeholdende 3'-delen af prochymosingenet ('prochymosin). Det fremkomne plasmid er 30 benævnt pToC56 og er vist i fig. 15b.25 pToC52 was cut with HindIII and partially with EcoRI, and a 6.4 kb fragment was isolated. This was ligated to a 0.9 kb EcoRI-Xmal fragment from pToC51 and a 0.7 kb XmaI-HindIII fragment from pUC9'PC containing the 3 'portion of the prochymosin gene (' prochymosin). The resulting plasmid is designated pToC56 and is shown in FIG. 15b.

37 DK 169134 B137 DK 169134 B1

Eksempel 13Example 13

Ekspression af prochymosin i A. oryzae pToC56 blev transformeret i A. oryzae IFO 4177 eller en argB-mutant deraf ved kotransformation med enten 5 p3SR2 (amdS-gen) eller pSal43 (argB-gen). Transformanter, der voksede på selektive medier, blev reisoleret to gange som beskrevet i eksempel 9.Expression of prochymosin in A. oryzae pToC56 was transformed into A. oryzae IFO 4177 or an argB mutant thereof by cotransformation with either 5 p3SR2 (amdS gene) or pSal43 (argB gene). Transformants growing on selective media were re-isolated twice as described in Example 9.

Transformanterne blev dyrket i tre dage på YPD, og prochymosinindholdet i supernatanterne blev analyseret ved 10 hjælp af ELISA på en Western blot efter SDS-PAGE. Transformanterne producerede 1-10 mg/1 af et immunoreaktivt protein af prochymosinstørrelse i supernatanterne. Der kunne ikke påvises andre immunoreaktive proteiner i supernatanterne.The transformants were grown for three days on YPD and the prochymosin content of the supernatants was analyzed by ELISA on a Western blot after SDS-PAGE. The transformants produced 1-10 mg / l of an immunoreactive prochymosin size protein in the supernatants. No other immunoreactive proteins could be detected in the supernatants.

1515

Eksempel 14Example 14

Ekspression i RML i A. oryzae p787 fra eksempel 8 blev transformeret i IFO-4177 ved kotransformation med p3SR2 på den i eksempel 9 beskrevne 20 måde. Transformanterne blev selekteret og reisoleret som beskrevet i eksempel 9.Expression in RML in A. oryzae p787 from Example 8 was transformed into IFO-4177 by cotransformation with p3SR2 in the manner described in Example 9. The transformants were selected and re-insulated as described in Example 9.

Supernatanter fra YPD-kulturer af transformanterne dyrket i tre dage blev analyseret ved SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting og ELISA. Den bedste transformant producere-25 de 2 mg/1 af et protein af samme størrelse som moden RML.Supernatants from YPD cultures of the transformants grown for three days were analyzed by SDS-PAGE followed by Western blotting and ELISA. The best transformant produces 25 mg / l of a protein of the same size as mature RML.

Lipaseaktiviteterne i supernatanterne blev målt som evnen til at spalte tributyrin (NOVO metode AF 95.1/3-GB).The lipase activities in the supernatants were measured as the ability to cleave tributyrin (NOVO method AF 95.1 / 3-GB).

Målingen bekræftede, at der var 2 mg/1 aktiv lipase til stede i supernatanterne.The measurement confirmed that 2 mg / l of active lipase was present in the supernatants.

Claims (7)

38 DK 169134 B138 DK 169134 B1 1. Fremgangsmåde til ekspression af et protein produkt i Aspergillus ved (a) tilvejebringelse af et rekombinant DNA-kloningsvektorsystem, der er i stand til at integreres i genomet af en Aspergillusvært i en eller flere kopier og 15 omfattende: DNA-sekvenser, der koder for funktioner, der letter genekspression, omfattende en promotor, transskriptionsstartsteder og transskriptionsterminerings- og poly-adenyleringsfunktioner, idet promotoren kan forudgås af upstream aktiveringssekvenser, en egnet markør til selek- 20 tering af transformanter; og en DNA-sekvens, der koder for det ønskede produkt; (b) transformering af Aspergillusværten, der ikke indeholder et funktionelt gen for den valgte selekteringsmarkør, med det rekombinante DNA-kloningsvektorsystem fra 25 trin a, og (c) dyrkning af den transformerede Aspergillus-stamme i et egnet dyrkningsmedium, kendetegnet ved, at der som Aspergillusvært anvendes Aspergillus oryzae.A method for expressing a protein product in Aspergillus by (a) providing a recombinant DNA cloning vector system capable of integration into the genome of an Aspergillus host in one or more copies and comprising: DNA sequences encoding for functions that facilitate gene expression, including a promoter, transcription start sites and transcription termination and poly-adenylation functions, the promoter being preceded by upstream activation sequences, a suitable marker for selecting transformants; and a DNA sequence encoding the desired product; (b) transforming the Aspergillus host, which does not contain a functional gene for the selected selection marker, with the recombinant DNA cloning vector system from step a, and (c) culturing the transformed Aspergillus strain into a suitable culture medium, characterized in that Aspergillus host Aspergillus oryzae is used. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg ne t ved, at selektionsmarkøren fås fra genet for A. nidulans eller A. niger argB, A. nidulans trpC, A. nidulans amdS, Neurospora crassae Pyr4 eller DHFR.Method according to claim 1, characterized in that the selection marker is obtained from the gene for A. nidulans or A. niger argB, A. nidulans trpC, A. nidulans amdS, Neurospora crassae Pyr4 or DHFR. 39 DK 169134 B139 DK 169134 B1 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at promotor- og upstream-aktiveringssekvenserne fås fra et gen, der koder for et ekstracellulært eller intracellulært protein, såsom en amylase, en glucoamylase, en 5 protease, en lipase, en cellulase eller en glycolytisk enzym, fortrinsvis fra et gen for A. oryzae TAKA-amylase, Rhizomucor miehei aspartatproteinase, A. niger neutral α-amylase. A. niger syrestabil α-amylase, A. niger glucoamylase eller Rhizomucor miehei lipase. 10Method according to claim 1, characterized in that the promoter and upstream activation sequences are obtained from a gene encoding an extracellular or intracellular protein such as an amylase, a glucoamylase, a protease, a lipase, a cellulase or a glycolytic. enzyme, preferably from a gene for A. oryzae TAKA amylase, Rhizomucor miehei aspartate proteinase, A. niger neutral α-amylase. A. niger acid stable α-amylase, A. niger glucoamylase or Rhizomucor miehei lipase. 10 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at promotoren er A. oryzae TAKA-amylasepromotoren eller funktionelle dele deraf.Method according to claim 3, characterized in that the promoter is the A. oryzae TAKA amylase promoter or functional parts thereof. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg ne t ved, at promotor og upstream-aktiveringssekvenserne har følgende sekvens: GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 20 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA5. A method according to claim 4, characterized ne in that the promoter and upstream activating sequences have the following sequence: GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC 20 CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA 25 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT25 GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT 30 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC30 TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC 35 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG35 AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG 40 DK 169134 B1 CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA 5 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG eller en funktionel ækvivalent nucleotidsekvens, eller AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA 10 CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC 15 CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT 20 AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT 25 CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC 30 CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT eller en funktionel nucleotidsekvens, der kan være forudgået af en 1,05 kb ikke-sekven-teret region oven for positionen 0 til 1,05 i plasmid pTAKA 35 17 (DSM 4012).40 DK 169134 B1 CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA 5 AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG or a functional equivalent nucleotide sequence or AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA 10 CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC 15 CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTAT AT 20 AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT 25 CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC 30 CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAG5bcet of a CCCTTCTCTG 17 (DSM 4012). 41 DK 169134 B141 DK 169134 B1 5 PATENTKRAV5 PATENT REQUIREMENTS 6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at vektorsystemet yderligere indeholder en præregion, der tilvejebringer sekretion af det udtrykte produkt i kulturvæsken, og kan fås fra et glucoamylase- eller 5 et amylasegen fra en Aspergillusart, et amylasegen fra en Bacillusart, et lipase- eller proteinasegen fra Rhizomucor miehei, genet for α-faktoren for S. cerevisiae eller kalveprochymosingenet, idet præregionen fortrinsvis fås fra genet for A. oryzae TAKA amylase, A. niger neutral a-amylase,Method according to claim 1, characterized in that the vector system further contains a pre-region which provides secretion of the expressed product in the culture fluid and can be obtained from a glucoamylase or an amylase gene from an Aspergillus species, an amylase gene from a Bacillus species, a lipase. - or the proteinase gene from Rhizomucor miehei, the gene for the α-factor of S. cerevisiae or the calf prochymosin gene, the pre-region being preferably obtained from the gene for A. oryzae TAKA amylase, A. niger neutral α-amylase, 10 A. niger syrestabil α-amylase, B. licheniformis a-amylase, den maltogene amylase fra Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α-amylase eller B. licheniformis subtilisin.10 A. niger acid stable α-amylase, B. licheniformis α-amylase, the maltogenic amylase from Bacillus NCIB 11837, B. stearothermophilus α-amylase or B. licheniformis subtilisin. 7. Fremgangsmåde til produktion af et protein produkt i Aspergillus oryzae, kendetegnet ved, at en Aspergillus oryzae stamme, der er transformeret med et rekombinant DNA-kloningsvektorsystem som beskrevet i krav 1 dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og produktet udvindes fra 20 dyrkningsmediet.Process for producing a protein product in Aspergillus oryzae, characterized in that an Aspergillus oryzae strain transformed with a recombinant DNA cloning vector system as described in claim 1 is grown in a suitable culture medium and the product is recovered from the culture medium.