DK162449B - Fremgangsmaade til fremstilling af den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller farmaceutisk acceptable salte deraf, samt et renset actinomycet-isolat til brug ved fremgangsmaaden - Google Patents
Fremgangsmaade til fremstilling af den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller farmaceutisk acceptable salte deraf, samt et renset actinomycet-isolat til brug ved fremgangsmaaden Download PDFInfo
- Publication number
- DK162449B DK162449B DK432984A DK432984A DK162449B DK 162449 B DK162449 B DK 162449B DK 432984 A DK432984 A DK 432984A DK 432984 A DK432984 A DK 432984A DK 162449 B DK162449 B DK 162449B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- proton
- protons
- multiplet
- compound
- doublet
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
- C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
- C07D309/20—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hydrogen atoms and substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms
- C07D309/22—Radicals substituted by oxygen atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 162449 Β * Γ
Den foreliggende opfindelse angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af den antibiotiske forbindelse CL-1957A eller farmaceutisk acceptable salte deraf, som karakteriseret i krav 1's indledning, hvilken frem-5 gangsmåde er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del anførte. Endvidere angår opfindelsen et hidtil ukendt renset isolat af en actinomycet til brug ved ovennævnte fremgangsmåde, og som er ejendommeligt ved det i krav 2's kendetegnende del anførte.
10 Den antibiotiske forbindelse CL-1957A har antitu mor-aktivitet .
J. Antibiotics, vol. 36 (1983) Nr. 6 (juni), side 639-645 og 646-650 beskriver antifungale og cytotoxiske antibiotica omfattende et antibioticum betegnet leptomy- 15 cin B, <6©r hvilket der er angivet følgende strukturformel:
Den kemiske struktur af forbindelsen CL-1957A svarer, som nedenfor nærmere omtalt, til følgende formel O OH CH, nr ii i r
o c CHSCH-CSCH*— CH-CH,-CHsCH-CsCH-CH-C-CH-CH-CH
25 I I * I I I Γ CHjCH, CH, CH, CH, CH, in, HOOC-HCsC-CHg dvs. samme strukturformel som for leptomycin B, svarende til betegnelsen 19-(3,6-dihydro-3-methyl-6-oxo-2H-pyran- 2-yl)-17-ethyl-6-hydroxy-3,5,7,9,11,15-hexamethyl-8-oxo-2,10,12,16,18-nonadecapentaensyre.
Den omhandlede særlige fremgangsmåde til fremstilling af den antibiotiske forbindelse CL-1957A eller farmaceutisk acceptable salte deraf er ejendommelig ved, at 35 en stamme af en actinomycet, identificeret som isolat ATCC 39366, dyrkes under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon og nitrogen, indtil der er dannet en betydelig mængde DK 162449Β 1 ί 2 CL-1957A, hvorefter nævnte forbindelse CL-1957A isoleres og, om ønsket, overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
Isolatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, 5 at det er et isolat af stammen ATCC 39366.
Den ved den omhandlede fremgangsmåde fremstillede forbindelse kan anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af mikrobielle infektioner hos pattedyr indebærende anvendelse af en effektiv mængde af forbindelsen CL-1957A 10 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer.
Den ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse kan også anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af tumorer hos pattedyr indebærende anvendelse af en effek-15 tiv mængde af forbindelsen CL-1957A eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf i kombination med en farmaceutisk acceptabel bærer.
I det følgende henvises til tegningerne, på hvilke 20 Fig. la, lb, lc og ld viser henholdsvis ultraviolet, infrarødt, 360 MHz protonmagnetisk resonans- og 13 90,5 MHz C kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet 25 CL-1957A.
Den actinomycet-stamme, der er egnet til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er fundet i en.. 3 ordpr øve indsamlet i Pennsylvania, USA. Denne mikroorganisme blev isoleret fra jordprøven ved anvendelse af et egnet agar-30 pladedyrkningsmedium, nemlig et sådant indeholdende salte, såsom kaliumphosphat, magnesiumsulfat og ferrosul- · fat, og carbonkilder, såsom glycerol og asparagin. Mikroorganismestammen blev spredt på agarmediet og efter spredning inkuberet ved en gunstig temperatur, navnlig 35 45°C, for at tillade udviklingen af jord-mikroorganismerne .
Den CL-1957A-producerende organisme, der blev isoleret fra jordprøven ved agar-spredningsteknik, er > r 3
DK 162449 B
et uidentificeret actinomycet- i solat og er deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852, hvor den bevares i dens permanente kultursamling son ATCC 39366. Denne organisme, der fremstil-5 ler CL-1957Å, holdes også som hvilende kultur i lyofi*· le rør, cryogene medicinglas og i jordrør i the Warner-Lambert/Parke-Davis Culture Collection, 2800 Plymouth Road, Ann Arbor, Michigan 48105, hvor den betegnes som kultur WP-2053.
10 Forbindelsen CL-1957A, der viser både anti>.
biotiske og antitumor-egenskaber, fremstilles af isolat ATCC 39366 under aerob fermentation under styrede betingelser. Fermentationsmediet består af kilder for carbon, nitrogen, mineraler og vækstfaktorer. Eksempler på car-15 bonkilder er glycerol og forskellige simple sukkerarter, såsom glucose, mannose, fructose, xylose, ribose eller andre carbonhydrat-holdige forbindelser, såsom dextrin, stivelse, majsmel og valle. Den normale mængde carbon-kilde-materialer i fermentationsmediet varierer fra ca.
20 0,1 til ca. 10 vægt%.
Nitrogenkilder i fermentationsmediet er organisk, uorganisk eller blandet organisk-uorganisk materiale. Eksempler på sådanne materialer er bomuldsfrømel, sojabønnemel, majskimmel, majsstøbevæske, "distillers 25 dried solubles", jordnødmel, peptoniseret mælk og forskellige ammoniumsalte.
Tilsætningen af mineraler og vækstfaktorer bidrager også til fremstillingen af forbindelsen CL-1957A. Eksempler på mineraladditiver til fermentationsmediet omfatter kaliumchlorid, natriumchlorid, ferrosulfat, cal-ciumcarbonat, dobaltchlorid og zinksulfat. Kilder for vækstfaktorer omfatter forskellige gærarter og mælkeprodukter .
Den foretrukne fremgangsmåde til fremstilling af 35 forbindelsen CL-1957A er ved submers kultur-fermentation. Ifølge denne udførelsesform for opfindelsen frem- 4 ' r
DK 162449 B
stilles fermentations-bestanddelene i opløsning eller suspension, og blandingen steriliseres derefter ved autoklavering eller vanddampopvarmning. Det vandige mediums pH indstilles fortrinsvis mellem ca. 4 og ca. 8, og 5 blandingen bliver efter sterilisering afkølet til en temperatur mellem ca. 16°C og 45°C. Det afkølede, sterile fermentationsmedium inokuleres med organismen, og der gennemføres derefter fermentation med luftning og omrøring . ____ 10 Ved metoden med submers kultur gennemføres fer mentation i rystekolber eller i stationære tankfermen-tatorer. I rystekolber opnås luftning ved omrøring af kolberne for at tilvejebringe sammenblanding af mediet med atmosfærisk luft. Ved stationære tankfermantatorer 15 foretages omrøring med skovlhjul, der kan have form af pladeturbiner, skovlplader, åbne turbinepropeller eller skibspropeller. Luftning opnås ved at injicere atmosfærisk luft eller oxygen i den omrørte blanding.
Passende fremstilling af forbindelsen CL-1957& 20 opnås normalt under disse betingelser efter en periode på fra ca. to til ti dage.
Ved en alternativ udførelsesform kan forbindelsen CL-1957A også fremstilles ved fermentation i fast tilstand af mikroorganismen.
25
Karakteristika for ATCC 39366
Kulturkarakteriserings-undersøgelser gennemførtes på mikroorganismen betegnet ATCC 39366 (CL 1957-producent), og resultaterne blev sammenlignet med de publicerede da-30 ta for Streptomyces sp 81-484 (kazugamycin-producent) og Streptomyces ATS 1287 (leptomycin-producent).
Kulturelle og morfologiske karakteristika for ATCC 39366 er vist i tabellerne A, B og C.
35
DK 162449 B
5 ' ,
Tabel A
Carbonhydrat-udnyttelsesmønster for ATCC 39366 sammenlignet med publicerede data for Streptomyces ATS 1287 og Streptomyces 81-484.
5
Streptomyc·« Strcptomyc·«
Carbon* ATCC 39366 ATS 1287 61-484 substrat (CL 1957) (leptomydn) (Kazugamycin) l-arablnow - d-fructoM + + 10
d-galactoM * + ND
d-glucoM + + ND
glycerol + NO* ND
Mnoaitol + +
15 inulln - ND ND
laetOM - NO ND
maltOM - ND ND
d-m«nnitol - -
d- mannose + ND ND
20 rafSnoaa + ± - rhamnoM + + +
Mildn + - ND
tucroM - d-xyloaa + kontrol_-_~ *ND ' ikke foretaget ' /
DK 162449 B
6
Tabel B
Fysiologisk karakterisering af ATCC 39366 sammenlignet med publicerede data for Streptomyces ATS 1287 og Strep-tomyces 81-484.
5 - ATCC 39366 Streptomyces Streptomyces
Reaktion_(CL 1957) ATS 1287 81-484
Melaninpigment Intet Intet Intet
Andet pigment Intet Intet Positiv
Nitratreduktion Positiv Negativ Negativ 10
Gelatinesmeltning Positiv Negativ Negativ Mælkekoagulation Negativ Negativ Negativ
Maelkefremstilling Positiv svag frem- Tvivlsom stilling 15 ATCC afviger fra 81-484 ved udnyttelsen af d-fructose, raffinose og d-xylose. Den afviger med hensyn til nitratreduktion og gelatinesmeltning. ATCC 39366 tilhører den grå serie, og 81-484 tilhører den gule serie.
* / 7
DK 162449 B
Tabel C
Kulturelle og morfologiske karakteristika for ATCC 39366 sammenlignet med publicerede data for Streptomy- ces ATS 1287 og Streptomyces 81-484._ 5 Streptomyces Streptomyces ATCC 39366 ATS 1287 81-484
Kategorier (CL 1957) (Leptomycin) (Kazuqamycin)
Luftmycelium Gærekstrakt-
Maltekstrakt 1 q ISP 2 skifer (13 ih) gråt elfenben
Havremelsagar ISP 3 intet gråt bleggult
Uorganiske salte stivelsesagar 15 ISP 4 tin (13 fe) tyndt elfenben
Glycerol-aspar a- ginagar ISP 5 næsten gråt gråt brunlighvidt (7 ml) 20 Gruppering grå serie grå serie gul serie
Bagside ISP2 sennepsgul (2 pg) olivenbrungul pastelgul ISP 3 oliven (2 pi) intet bleggul ISP 4 farveløs intet elfenben 2^ ISP 5 lys hvede (2 ea) olivenbrungul gulliggrå
Sporer spiralspore- . spiralspore- lige sporekæder; >10 kæder; >10 kæde; >6 sporer/kæde; sporer/kæde; sporer/kæde; glat spore- glat spore- glat sporeoverflade; overflade; overflade; 30 cylindrisk ikke beskre- cylindrisk sporeform vet sporeform
Cellevæg PAP LL- ikke rapporteret LL- 25 Hvidt cellesukker arabinose ikke rappor- ikke rappor- _______teret_teret_ * Klassificeret som Streptomyces, hvilket indikerer, at ingen væsentlige sukkerarter er fundet.
1 r
DK 162449B
8
Opfindelsen beskrives nærmere gennem følgende eksempler.
5 Fermentativ fremstilling· af forbindelsen CL-1957A
Eksempel 1
Actinomycet-kulturen (ATCC 39366) ifølge opfin-’-delsen blev, efter isolering fra agarpladen, overført til et agar-skråsubstrat ved anvendelse af medium CXH 23 10 og inkuberet ved 28°C i 7 til 14 dage.
Tabel I
Sammensætning af medium CIM 23:
Amidex-majsstivelse 10 g N-Z-amin, type A 2 g 15 Kødekstrakt (Difco) 1 g Gærekstrakt (Difco) _ 1 g
Cobaltchlorid-pentahydrat 20 mg
Agar 20 g
Destilleret vand 1000 ml 20
Eksempel 2
En del af den mikrobielle vækst fra. agar-skrå·«· 25 substratet anvendtes til at inokulere et forsøgsrør på 18 mm x 150 mm indeholdende 5 ml podningsmedium SD-05.
Den inokulerede podning blev rystet ved 24°C, 170 rpm, i tre til fire dage.
DK 162449 B
9
Tabel II
Sammensætning af podningsmedium SD-05
Amberex 1003 (Amber Laboratories) 0,5% 5 Glucose-monohydrat (Cerelose) 0,1%
Dextrin-Amidex B 411 (Kornprodukter) 2,4% N-Z Case (Humko Sheffield) 0,5%
Sprøjtetørrede opløselige kødstoffer (Daylin,. Labs) 0,3%
Calciumcarbonat 0,2%
Eksempel 3
En portion på 1 ml af den mikrobielle vækst fra Eksempel 2 blev overført til et rysterør på 185 ml in-15 deholdende 25 ml screeningsmedium SM-57.
Tabel III
Sammensætning af screeningsmedium SM-57 Sucrose 1,5 %
Lactose 1,0.% 20 Peptoniseret mælk 0,65%
Fiskemel 0,35%
Torula-gær 0,25%
Det inokulerede rysterør blev inkuberet ved 24°C i fire dage med rystning (170 rpm rotationsrystning, 25 5 cm slaglængde) . Fremstilling af forbindelsen CL-1957A blev første gang observeret i denne suppe.
For at bekræfte fermentationsaktiviteten af mi·'-kroorganismen blev en anden portion screeningsmedium SM-57 på 50 ml, indeholdt i en med ledeplader forsynet 30 rystekolbe på 300 ml, inokuleret med 2 ml mikrobiel pod-ning fra Eksempel 2. Denne blanding blev inkuberet ved 24°C i fire dage med rystning (170 rpm rotationsrystning, 5 cm slaglængde). Efter fire dage var fermentationsmasken granulær til mycelieagtig i udseende, og pH lå i 35 området pH 5,5 - 6,0.
Antitumor-aktiviteten af denne fennentationssuppe bestemtes ved en fortynding på 1:100 versus L1210 muse-leukæmiceller dyrket i vævskultur. Prøveteknikken er beskrevet detaljeret i Cancer Chemotherapy Reports, del 3, bind 3, Nr. 2 (1972), Deran, Greenberg,
DK 162449 B
10
MacDonald, Schumacher og Abbott. En suppe, der gav L1210 leukæmicellevæksthastigheder på 0 til 35%, sammenlignet med væksten af disse celler under kontrolbetin-5 gelser, blev betragtet som aktiv med 0% som mest aktiv.
De observerede aktiviteter af fermentationssuppen fra Eksempel 3 er anført i Tabel IV.
Tabel IV
Antitumor-aktivitet af fermentationssuppe fra Eksem-2q pel 3 (målt over for L1210 muse-leukæmiceller)
Prøve % I^lO-cellevækst
Suppe fra rysterør 11
Suppe fra rystekolbe - 6
Den rå fermentationsmask fra Eksempel 3 blev og-15 så testet for antimikrobiel aktivitet over for flere mikroorganismer under anvendelse af agar-plademetoden. Den rå mask fandtes at være aktiv over for
Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes viscolactis, Bacillus subtilis, Branhamella catarhalis, 20 Escherichia coli, Micrococcus luteus og
Micrococcus lysodeikticus.
Eksempel 4 25 To rystekolber på 2 liter, hver indeholdende 300 ml screeningmedium SM-57, blev inokuleret med 12 ml mikrobiel podning. Kolberne blev inkuberet i fire dage ved 24°C med rystning (170 rpm rotationsrystning, 5 cm slaglængde).
30 Fermentationsmasken fra de to kolber blev sam let og testet for antitumor-aktivitet over for både L1210 muse-rleukæmicellevækst i vævskultur og P388 murin lymfocyt-leukæmi in vivo. Begge tests gennemførtes ved metoderne, der er beskrevet detaljeret i Cancer Chemothe-35 rapy Reports, del 3, bind 3, Nr. 2 (1972) omtalt ovenfor.
Den rå mask fandtes at begrænse L1210 cellevækst til 6% in vitro. Resultaterne af nævnte P388 in vivo-tests er vist i Tabel V. De deri anførte data er i % T/C.-værdier, hvor:
DK 162449B
5 11 % T/C - 9emansn:*-l:^9 overlevelsestid for behandlede mus χ gennemsnitlig overlevelsestid for kontrolnus
Tabel V
Antitumor-aktivitet af fermentationssuppe fra Eksempel 4 (målt over for P388 mur in lymfocyt-leukæni in vivo) 10 Fortynding af fermen- * T/c tationsmask_Test 1_Test 2
Ufortyndet Toxisk 1:2 66 (toxisk) 59 (toxisk) 1:4 146 126 15 1:8 --- 140 1:16 --- 117
Eksempel 5 20 Kultursuspension (1 ml) fra et cryogent medicin glas blev optøet og overført aseptisk til en 2 liters kolbe udstyret med ledeplader og indeholdende 600 ml podningsmedium SD-05. Det inokulerede kolbeindhold blev inkuberet i 72 timer ved 24°C med rystning (130 rpm rota-25 tionsrystning, 5 cm slaglængde).
Efter 72 timer blev indholdet af podningskolben overført aseptisk til en 30 liters kar-fermentator indeholdende 16 liter podningsmedium SD-05. Det inokulerede karindhold blev inkuberet i 24 timer ved 24°C under om-30 røring ved 300 rpm og sprøjtet med atmosfærisk luft ved en hastighed på 1 vol/vol/min.
Eksempel 6 35 Tre 30 liters kar med omrøring, hvert indeholden de 16 liter produktionsmedium PM-10, blev steriliseret ved autoklavering i 40 minutter ved 121°C. Fermentatorer-ne med indhold blev afkølet, og hver blev inokuleret med ca. 800 ml af den mikrobielle vækst fra Eksempel 5. De inokulerede produktionskar blev inkuberet i 6 dage ved 12
DK 162449 B
24 C med omrøring ved 300 rpm og sprøjtet med atmosfærisk luft ved en hastighed på 1 vol/vol/min. Dow Corning "C"-antiskummiddel anvendtes til bekæmpelse af 5 skum.
Tabel VI
Sammensætning af produktionsmedium PM-10 Maltose lf5 %
Glucose-monohydrat 1,0 % 10 Bomuldsfrømel (Pharmamedia) 0,75%
Majsmel 0,4 %
Torula-gær 0,25%
bem.: pH indstillet til 6,5 med NaOH
15 Fremstillingen af forbindelsen CL-1957Å fulgtes under hele fermentationscyclus'en ved prøve over for L1210 muse-leukæmi in vitro og ved at måle antimikrobiel aktivitet over for forskellige mikroorganismer. Endvidere blev sådanne fermentations-parametre som pH og pro-20 cent sedimentation registreret under hele fermentationscyclus ' en. De fundne data er anført i Tabel VII.
O
• 13
DK 162449 B
ο σι fM
O I I I I I - - ir> I I I I I CM ro ·» i—l o m o co σι ω in i i i i i “ g ol ! i i * i f>3 oS * rH t> r-i tji o in m 3 O I I III - ^ M rrj S i I 1 i l —I —( 14-1 ® »*
flj H
"tQ Sj O
S |dtn S i i ^ ^ S δ ω e ·· i i rH o o o o i uli 5 S|| s ^ „
ti 8iti S I +a " X I I
h cl) O ·· i g m io in i i
g PlH>H H
•H
Λ ___.___ +1 O i S-ι m 0) ^ >8 § ^ o —' δ ø g g +j i |. in u> vo r- t"
ID S E 3 I I i—li—! rH I—I I—I
Λ 9 w H i 1 H O « |.Λ H IW 8 M 2 > ø -P 0
0 Ό tO
H +> S <0 -j 5 M *H u 3 I I ro ro o σι σι Λ ly rrt +j ιιγμμΠιΗγΗ
<0 £ © £ A I I
61 n 8g 1 ø n r* w ·. · I|Sa “
i w i ø 3 I I rH σι σ cn rH
m Ή me O I 1 CNHHr-tnj
S β ffi I I
W
5 c 4J i r- 'f o r-' o iH
rrl n Ifl I *. w ·* ·^ ·* ^ S ·Η V ^ Γ' 00 00 tN ΙΛ ιο·μΐ «-· »-* <#p 43 m
Π2 nM’OlOJHOrH
ft - - * - *> *· λ· n loioinininioiD *w * 3 tf 8 g 2
JL H
tf* « ii g ο^οοσινοο^ + .
c-H γί ’a· vo cn cj s Øj rH i—I J2 fo • 14
DK 162449 B
Eksempel 7
En portion på 1 ml af en cryogent bevaret.kultur 5 af isolat ATCC 39366 anvendtes til at inokulere 600 ml podningsmedium SD-05 indeholdt i en 2 liters rystekolbe udstyret med ledeplader. Det inokulerede rystekolbeind-hold blev inkuberet i 71 timer ved 24°C med rystning (130 rpm rotationsrystning, 5 cm slaglængde).
10 Den mikrobielle vækst fra 2 liters kolben an vendtes til at inokulere 16 liter podningsmedium SD-05 indeholdt i en 30 liters kar-fermentator med omrøring.
Det inokulerede fermentatorindhold blev inkuberet ved 24°C i 24 timer under omrøring ved 300 rpm og sprøjtet 15 med atmosfærisk luft ved en hastighed på 1 vol/vol/min.
En 757 liters fermentator indeholdende 606 liter produktionsmedium PM-10 blev steriliseret ved opvarmning med vanddamp i 40 minutter ved 121°C. Fermentator en og dens indhold blev afkølet til 24°C og inokuleret med ca.
20 15 liter af den mikrobielle vækst fra 30 liters kar-fer-mentatoren med omrøring. Det inokulerede produktionsmedium blev inkuberet ved 24°C i fem dage med omrøring ved 155 rpm under sprøjtning med atmosfærisk luft ved en hastighed på 0,7i> vol/vol/min. Dow Corning "C"-antiskum-25 middel blev tilsat efter behov for at bekæmpe skumning af fermentationsmediet.
Fremstillingen af forbindelsen CL-1957A fulgtes under hele fermentationscyclus'en under anvendelse af L1210 muse-leukæmicelleprøven, ved måling af den anti-30 mikrobielle aktivitet af fermentationsmasken over for Micrococcus luteus og Bacillus subtilis,.og ved hjælp af sådanne fermentationsparametre som pH og procent sedimentation. De fundne data er anført i Tabel VIII.
35
DK 162449 B
15 o «3· 1-4 o i i i I vo n in i i 1 i ·—i I ··
0) iH
^ C O _ 0 δ O O 00 fil S I I I I U) n d " s Π3 > -P 5-j o , in oo in -η w S in i i * * » (D ,y r-1 ·· i irrnmo
+* |h d1 H
t s 85 S o £ 811 S , +s °. . , lo 0¾¾ « I g in ID i i o &Ά&- - Λ---—- ιο
4-> *H
S H
H JJ
Φ _ 3 > "g Έ Γ, g to i in in in o
m «Η- I
S3 ΤΓ 10 ΙΟΟΗΠΟ
Sum P cm ro oj cm ^ So h
lj O JJ (0 H
H SU « 5> £ g n
H ® S
il 8 ^ g S BS | •S I * § 3- ø i o m m o m O I * % * fe ffl O | O M« ID ID 00
O r-l pH i—I H
____i__ g ^ i r- 'tf r-~ m r-' •H 4J I k ^ k v v rr} m i > 05 H ^ © S »S <“* r-i CO Ql <#>3£ > Ή in in o jj w nioHocno ^ Q, •‘'‘•‘••‘'•'dr! IDlDlDVDiniD ©
<D
g H
.1 $1 +.
H jj o io ro ro io vo s
s o· ro m cn .-c S
E r-t i a fa -P___—-
DK 162449 B
16
Den rå mask blev indhøstet, og forbindelsen CL-1957A blev isoleret som nedenfor beskrevet.
5 Kemisk isolering af forbindelsen CL-1957A
Eksempel 8
Fermentationsmask fremstillet som ovenfor i Eksempel 7 blev indstillet på pH 3,5 med svovlsyre og blan-10 det i 1 time med ethylacetat (227 liter). Celite 545 (11,4 kg) blev tilsat, og blandingen blev filtreret gennem en 46 cm's plade- og ramme-filterpresse. Filtratet blev henstillet til adskillelse af den nedre vandige fase fra ethylacetatekstrakten. Filterkagen blev vasket med 15 ethylacetat (132 liter), og vaskevæsken blev, efter fortynding med 76 liter frisk ethylacetat, anvendt til at ekstrahere det ovennævnte fraskilte vandige lag. Efter henstilling af blandingen til afsætning blev det vandige og det organiske lag fra den anden ekstrakt adskilt, og 20 det vandige lag blev ekstraheret en tredie gang med frisk ethylacetat (189 liter). De tre organiske lag blev samlet og vasket med deioniseret vand (95 liter) . Blandingen blev henstillet til afsætning, og vandvaskevæsken blev fraskilt. t)et øvre ethylacetatlag (529 liter) blev 25 koncentreret i vakuum til 31 liter og derefter koncentreret yderligere under udskiftning af ethylacetat med methanol, hvorved vandtes 4,5 liter af et methanolisk koncentrat, Dette koncentrat blev, efter fortynding med 1/10 volumen vand, ekstraheret to gange med portioner af 30 fire liter af petroleumsether (kogepunkt 30-60°C) og derefter koncentreret til ca. 500 ml. Fortsat koncentrering, idet methanol blev erstattet med vand, gav ca. 400 ml af en vandig suspension, der blev ekstraheret tre gange med portioner på 400 ml af ethylacetat. Ethylacetatekstrakt-35 erne blev samlet, tørret over vandfrit natriumsulfat, filtreret, koncentreret til lille volumen og derefter blandet med 250 g af en blanding af kiselsyre og Celite 545 (1:1). Den resulterende grød blev inddampet i vakuum til et tørt fast stof, der blev opslemmet med dichlor-
DK 162449B
17 methan (300 ml) og sat til toppen af en søjle indeholdende 4 kg af en blanding af kiselsyre og Celite 545 (1:1) pakket i dichlormethan. Søjlen blev vasket med 5 dichlormethan (16 liter) og derefter elueret med dichlormethan! methanol (99:1, 14 liter), dichlormethan: methanol (98:2, 20 liter) og dichlormethan:methanol (96:4, 20,5 liter). De fraktioner, der elueredes med dichlormethan:methanol (99:1) og dichlormethan:metha-10 nol (98:2), blev samlet og koncentreret i vakuum til en viskos olie indeholdende rå CL-1957A.
Rensning af CL-1957A
15 Eksempel 9
Den rå CL-1957A-fraktion vundet ovenfor blev tritureret to gange med portioner på 750 ml af n-heptan.
Det heptan-uopløselige materiale blev opløst i methanol (250 ml), og den resulterende methanoliske opløsning blev 20 filtreret og koncentreret til tørhed i vakuum, hvorved vandtes 22 g af en fast rest indeholdende CL-1957A. Det faste stof blev igen opløst i methanol (20 ml) og chroma tograf eret over 2 liter Sephadex LH-20 pakket i methanol. Efter fremkomst af farve i effluenten blev der op-25 samlet én fraktion på 100 ml og fem fraktioner på hver 200 ml. Fraktionerne 5 og 6, der indeholdt mest af CL-1957A (baseret på HPLC-prøve)., blev samlet og koncentreret til tørhed, hvorved vandtes 13,6 g rå CL-1957A.
Dette materiale blev derefter renset yderligere ved 30 chromatografi over 1,9 kg C^g-silicagel (Sepralyte C-18, 40ym partikelstørrelse, Analytischem International,
Harbor City, Californien) indeholdt i en rustfri stålkolonne (17 cm [i.d.] x 85 cm) under anvendelse af methanol: vand (80:20) som elueringsmiddel. Ialt atten 500 35 ml's fraktioner og syv én liters fraktioner blev opsamlet. Fraktioner 9 til 17 indeholdt alt CL-1957A (ifølge HPLC-prøve) og blev samlet svarende til den vurderede renhed af CL-1957A tilstede i de individuelle fraktioner. Således gav fraktionerne 9 til 12, 13 til 15 og 16 til 17 henholdsvis 5,75 g, 12,5 g og 0,7 g faste stoffer.
DK 162449 B
18
Hver portion af faste stoffer blev derefter chromatogra-feret over separate søjler indeholdende silicagel (40-60 lim, E. Merck Reagents) deaktiveret ved tilsætning af 1% 5 vand. Efter prøvepåføring blev hver søjle vasket med dichlormethan:methanol (98:2) og elueret med dichlor·^-methan:methanol (95:5). For eksempel blev de 12,5 g produkt fra C18 -silicagel-fraktionerne 13 til 15 chro-matograferet over 200 g deaktiveret silicagel indeholdt 10 i en glaskolonne på 2,5 cm [i.d.] x 85 cm. Efter at der var opsamlet fem 150 ml's fraktioner af dichlormethan: methanol (98:2), blev søjlen elueret med dichlormethan: methanol (95:5) opsamlet i tre 150 ml’s fraktioner, otte 50 ml’s fraktioner og én 150 ml's fraktion. Fraktionerne 15 8 til 12 af 5% methanol-eluaterne indeholdt mest af CL-1957A (baseret på HPLC- og TLC-prøve) og blev samlet og koncentreret til tørhed, hvorved vandtes 1,03 g renset CL-1957A som et bleggult fast skum. Tilsvarende gav silicagel-chromatografirensning af C^g-silicagelfraktio-20 nerne 9 til 12 og 16 til 17 henholdsvis 1,6 g og 0,4 g renset CL-1957A.
De kemiske og fysiske egenskaber af CL-1957A
fremgår af Tabel IX, og ultraviolet, infrarødt, 360 MHz 13 protonmagnetisk resonans- og 90,5 MHz C kernemagnetisk 25 resonans-spektrum for forbindelsen er vist i henholdsvis Fig. la, lb, lc og ld.
19 ro
DK 162449 B
Η <0 n +3
u - -P
0ip ^ fB
o * S ro
S -x 0 «> 4J
«. H O -P - P
in Ό - or^· q ^ -en O
Φ h r~~ <Ti tn op-- — — M-i *. > vd iH konto an k cl JC · O *H k φ Φ O —
β || vHH*-HHCC4JC
tip O in I· * H 0000
Η H Cd H g -p - *“ *“·Ρ -P P -P
rj< 4J ^ r-- 0 P ' * -—' P 0 0 ft 0
.. & «Η φ P -- d <D P P P
oo 0) g in β φ P O -P ft ftH ft
H G ^vo 0 G <1) -P -P
' K ih OOi +1 O fi O Jlntil »H
η β o ^ ο -P O P H -P
H -a· o &> p 0 -P PoQ *· *· <D " ri & cm n 0 ftp 0 β p-P H+>
—^ »31 ·* ft^HOlDdlftO
in ιο — cd Ό -in cn ft HPHH
ryi - &1 g 0) in O m -P Ijl P P ft η cn β ή > · t- H - cn p cd G cd η h
[' U) *'-) ^ · —« (Ti H +J *" Q) ^ 3 H
ri J HP ltf g Cd ΙΠ CM Φ P *·Η +> 01 1¾ β -P
S R .. O «L — g G g - «· H0J4J ft φ ------ £ v <n oi g tin flin ΛΗΝΗ cn H OP Ό P Go X Φ m S -y rj t^· in o H UCM^O-OOCDCdll >CNrtf'H(Qr-tiPJHrHOln i, æ O H P ftCN g H'-'PGGO*··'**' Λ η - *Q o G cd P P Ό g'-'CMCMCMrn O in PWP»'-'®<‘^~'-'w oo (DO Φ wmt'- oo - - - »· qj CM - >d H “ Ό Hg Π3 Γ- -nOCKOn,^^^
irt -|xid.G--GOdHeoooHr--PGGG
O Φ o H β S ftH ' - -Η O O o O
Jj <X> o|0 O (tf 00 CO OHHHG-P-PP
0) - cn tr. Hfifiidr-ω-Φ R S B S
o io m fd id O P on Cm > *·*·-·—*·ΡΡΡΡ cd S-iO - β Λ3 ;d ·Ή <D Om —·»-<><- POftftft v; φ (0 00 U Γ» 4J4J βΟι^Ί1 MMBBIIlit·
KA to ir) rr O - Φ ft 0 PH ΦΦ0)0)£ ftH Η H
Q S φΚ -POgpH ft H S G G O
0) Λ Π U w O"^— Ρ*·Π3000Ρ(Μ-*·-
i ι-n ri m ιφ HtO Ifl OKI C-D-D-D O
o) o) o) u dp (D «a g * b·« PP ii
η φ in gO cdPO,QOHPPPft-PHHH
td Φ ro P oo r- g P O cdH mftftft Oftftft
Cj i? rn Γ) - in p β P II MHHHH
^ ro “pcnUHOH-P φ - φοηοηοη ftp P P
h g io o i w in id id h« h ΓΤ1 d d d to g p ^ φ H ^ cd u cd w ^ 0 0) ·· ^ II ^ w ftOft-P+J-PO-ScSs ih HC4J i>ig «Ε HTd -Η Φ Φ ΦΗ (d &1 φ ΙΓ0 to G OC OH O H H H &1__ tp Φ Ό (Μ Q Λ dd O o iH G O n TlO ^ Tl^i ·ΗΡ33·ΗΟΗΙί100 Ϊ 3 3 H s HOI Ideo Mi UDdHil -
Φ in PQ ft M* *—1 ft CM ϋ CN ft --- Pi ^ ^ CM CM CM CM
X
CO
H .
P I
Φ t' ®
W S M
*3 H (· ? w S
kj qj 0J S *H Φ ro — ft do+J-P&^
c + U 0 M-I <D d C
φ 0 H o d o H
tn ro -P u trO d Η Φ »d ftOd^ro s § ” 82 lal Η Η Φ raoodft (d +j -P Λ +> H o jj i 4J Cd 4-J cd H o -P i 01 cd Α!·Ρ<ϋ at Li dOH -P ftOJ-l > « 3 u o Og ft o HP ft i-ι Φ ©- d n ro p >sd ΦΛίί>Ρ kprerop
praedP cdPSdM
og ΗΗΜΛ! p-id 2 5
ΗΦ Φ-Ρ-ΡΦ iwroodH
OH glftHft G ft IO O id gpq w©Dcn Hracnroo
DK 162449 B
20
-P
-P Φ I QJ i—I -P
- ΗΛ0)
— Λ ØH
0 ø TJ XI
O 'C ø
-P I'd ·. ».«. .fcCO
O t" co in co ^inOOllH OHMS -
O4 *“ I— ·> 0 - - - - CN
in -m ricoiooH
h tn +1 ID m <j N
* - - Φ HH tj1
0 ^ -.—· H O
0 flÆ -POØOØ · O00NHH i'
+)+>Ο-Ρ0β (OHCOIOID DJ
Φ O -P O ø - -- -- ft- Η P O 0 H OOrriON 0 Λ ft p ftro -H co ro r·* cn Η Ή
0 ft OO DJ H H G
dH Η -H DJ
H CO — — — ·©_ m - - x: h 00 cn h 00 h nj +) -+) (Ji-P O H •'tf CN O ft
Φ-ΡΦΟΦ - -- -^ O
-Pi—I Φ i—i g i—i m .—i n ro g Φ X! H XJ — (0 ft ro co ro H i-t HØftØØØHH o
rQ Ό 0 'Ø O -P *W
0 ~ H —' 4-1 O) — — — — — · O
ODJO-PcoromcocMø P
"Ή'-'Γ-Μ o m co m id 0 O
CN Ol ft 0 - -- - -η H
ft-co-5-iininiorocoH Λ σι in to in Η Ή h ro η ro h dj o - — CN i—I 1—i t—i
*tf -in - -Ό >1 -P
— Λ — +1 ø Ό — — — —jø Φ -P -ø -øiDoj φ -tf in *tf 00 4J 5-i d ^ O'' oh 0 >^00010 æ φ
0Jø+Jø+JX3ø----g TJ
-P OOOOø ø co o o ro ø ø
0 4J ø -P ø øl g Φ ro cn -tf h ø H
O O ft O ft^ ft Η Η H -P X4 Ή 0 0 ft 0 0) α
ft 1—I ft 1—i CN 0 ·—·-·—·—4-J H
co tn o co in 00 X H -iH - -0 η σι ft co o ø 0 Ή H -p S-ICOO Dl - - - - 0 φ 0
- Φ - φ -P ft cn in co iø -P
H -PH-P4J-0 Φ ro CN 'tf H -P Dl Φ ΦΧ3Φ4->^-0ΗΗΗ *0 0 •'ri' -ØHØHØØftø Cd 0 01 cd ftod ftri o ft — — — —Ό H 0 E-ι Ή HXJ-PH H ft H O in φ g Xi •P -PØO OO1 OMO 0 hcdhø5i»c---- m o oø øoø ftøHHcoincogH m ft - g - g H φ 0 tn CN "tf H ft - *· 0
-P - (dHP ft Η H ft in O . -P O
l i Φ H
0 t n 0 -P
— g H *r ft ø X .g 5B-P S Φ dj
Dl I Eh g 5 DJ 0 ·* 01 H 0 5-1 -ri
•H 0 ^ Id *M * I- O Φ H
+> 0 I DJ H g in Λ 0 -<tf 01 H . XI H
ΦΦ dj λ; σ di ft in - 01 ø m ft ο 0 04- 1 ^Cd-rilOOCDØl ftCN β il .
tn ø >1 ftro -0 O fri H o 01 Di i β ¢- ilfl 01 -ΟΚΉ 4-> ØH >i >t
g ti ft 4-)ø -ørt! ftø ø o 01 x3 HH
Φ ^ ø ·ηΟΦΦ3ιη·—'g g co -Θ- ϋ ø 44 ØH S.fflH+1 in S OH .0 5- t g 0 Xi ft Ti ø - ·· øø — 54H fto .øø Φ0Ο1 —· eigØin(D+l- i®OH 5454
44 0 Ό- -01 pHlPDlø O ft ·» SU
-P Η ΌΗΗ-0 Η H 01 0 -o — -P
O 44 ft H»pøgip»ø-gtnøxJcniH øh 00ΦΟ -P 0 tn ϋ Η H ft H \ 0 Η U O Φ Φ H ft g oipø ΗΦ-ΡΗΗΗΗΡΗ0 g>0 oip øtnOogOøPg-PHøøø φΐ0
N 01 o O O H ro Ό -P 4-1 Ό Olgøxl HH
SS ø H h 4-> Η H φ-rim G Ό-Ρ Hg gøo -PØHXOIEOØ - >i«g * -Η Φ — Øp 0 g Dl ΦΟ10 OH -P ft fri g g + m o o φοι · 4) øj g +> w - 01 Η -ΡΡΟΟΓ0000Φ,0 O ®χ! ΦΧίΗ · Η Η Η O Φ i*-1 σιΡΟ frJOOHOØØØXiPi
DK 162449B
1 I
21
Den kemiske struktur af CL-1957A svarer til den nedenstående struktur I, der er i overensstemmelse med de i Tabel IX anførte spektrale data.
5 I ^ O^cr^CHsCH-Ca CH CH-CH--CH* CH-C=CH-CH-C-CH-CH-CH t T \
I I 1 III JL
CHjC*, CHg CH, CH, CH, jHj HOOC-HC=6-CH3 10 Den nøjagtige cisrtrans-konfiguration af de grupper, der er bundet til lactonringen, og de nøjagtige E-Z-konfigurationer omkring carbon-carbon-dobbelt-bindingerne er ikke kendt med sikkerhed endnu. Den foreliggende opfindelse skal derfor forstås at omfatte 15 fremstilling af alle mulige cis-trans- og E-Z-isomere med strukturen I vist ovenfor. Den kemiske betegnelse for den ovenfor anførte forbindelse (uden at specificere cistrans- eller E-Z-konfiguration) er som allerede anført 19-(3,6-dihydro-3-methyl-6-oxo-2H-pyran-2-yl)-17-ethyl-20 6-hydroxy-3,5,7,9,11,15-hexamethyl-8-oxo-2,10,12,16,18-nonadecapentaensyre.
Biologisk aktivitet af CL-1957A 25
Eksempel 10
Den antimikrobielle aktivitet af CL-1957A blev vurderet ved at mætte 12,7 mm papirplader med opløsninger af CL-1957A fremstillet med koncentrationer på 10, 30 100 og 500 yg/ml og anbringe hver mættet papirplade på en bioprøvebakke indeholdende et agarmedium podet med en særlig organisme. Pladen og det inokulerede medium blev inkuberet i 16 timer ved 37°C, og diameteren af den resulterende væksthæmningszone, om tilstede, måltes. Da-35 ta fra disse tests er anført i Tabel X.
__22_
DK 162449 B
H
^ oooooooooooooo ^ o in 1 H s 3 oo 0) c a g S λ w o D*i rH *rj « s a H c \ £ ΠΓ S' ονο'ψοοοοοοο^σιΓ'Ο y
g Ln 3- HH CM HHH Q
$ σι 25 Λ Η ο Η 1 ο <· «Η J Η c id υ 5 Μ 0) „ί 1 å s ^ κΙ
.6 00 Q
\ Og tji oiocnoooooooinocMCMO cm >ι 3. r-H CM Η Η ΓΟ ri ri Μ Ν r-( ' 'g ft P 3 o
O H O
in >*co y n x I ..
H > S
(Ug (U -H
9 fi S S fi ffl CQ O HQ
Φ ^ι *·^ι0 ·Ο·ΑιΡΐιΑι32Ο .¾ H
s * £ £ * S » * * 88 s |j +M -Sh g t> 3 s oo o δ g σι ro ro ro Η ω 3 vorooroincovococM^rcM cm η Ή c iHvovoioor^ooovDioooinino 0> G CMOooHroinooo^'tf^o Urt
2 ^ HrocMinmcMOOvo Q
P UUouososoooKiino (Dl H % % 9 ^QQQQQQQQQ 3$ 3 rrtajfortjriiPjcuaiaiftaiOifiift -y y .2 w - Il 3 S 8 § § § 3 1 3 co co in f 3 9 N 3 3 8 S? “ I! ^ . S ! -Jj . wajrtrtrtw ^ Jj
£j •H‘ri"y*Hp^rtK>yrt(Q(QrtrC HP
S >-y-P-jJOrtOrtrtHp3=(D4 S fi
rt ΛΛΛ y &> o o o g S
S’ ΐϊ11ίΛίΙίρΠ8! ** O 1^9^-6 2^3^1-8 881 ""
S S533SS 35 ί,ϊί,Ι B
V »-1 r-l H r-l 0 n Æ o ω o S S S si H Q
5 ίβιΗ-Η-ΗΛΦΟ-Η-ΡΡΏιΰίΟιΐ^ SS
s 21888118282221-
Swmfflwwffidiftswrøwxi + t 23
DK 162449 B
Eksempel 11
Aktiviteten af CL-1957A in vivo over for P388 5 leukæmi hos mus blev prøvet under anvendelse af protokollen fastlagt i Cancer Chemotherapy Reports, bind 3, del 3, 1-87 (1972). Musene blev inficeret intraperitone-alt på Dag 0 og fik derefter på Dag 1-5 den i Tabel XI anførte dosis af CL-1957A. Resultaterne fra disse tests 10 er anført i Tabel XI udtrykt som % T/C-værdier som ovenfor defineret.
Tabel XI
In vivo aktivitet af CL-1957A over for P388 leukæmi hos mus.
15 -
CL-1957A dosis % T/C
(yg/kg/injek- tion) Test 1 Test 2 100 toxisk toxisk 20 50 148 146 25 127 141 12,5 118 137 25 Eksempel 12
Cytotoxiciteten af CL-1957A over for L1210 muse-leukæmiceller og over for humane colon-adenocarci- nomaceller blev målt in vitro. ID-Værdierne er vist
DU
i Tabel XII.
30 Tabel XII
Forbindelse IDcri
DU
L1210 Muse-leukæ- Humane colon- miceller adenocarcino- 35 ma-celler CL-1957A 0,118 ng/ml 0,02 ng/ml t 24
DK 162449B
Eksempel 13 I dette eksempel blev in vivo-aktiviteten af 5 CL-1957A testet over for Ridgeway Osteogent Sarcoma hos mus som nedenfor beskrevet. AKR-Hanmus blev fordelt i grupper, inokuleret subcutant ved hjælp af trocar med 30-60 mg fragmenter af Ridgeway Osteogent Sarcoma, igen fordelt i grupper og fordelt tilfældigt til behandlings-10 grupper på Dag 0.
Passende mus fik intraperitoneale injektioner af forsøgsforbindelsen opløst i 0,9% natriumchloridopløsning på Dag 2,6 og 10 og derefter ugentligt. Tumorer måltes på Dag 24 og 35. Resultaterne er vist i Ta-15 bel XIII som % T/C (som nedenfor defineret). % T/C-værdier på mindre end 40 på Dag 35 betragtes som aktive.
s. m/r - Tumorstørrelse hos behandlede dyr 1nn ' ~ Tumorstørrelse hos kontroldyr
20 Tabel XIII
Aktivitet af CL-1957A over for Ridgeway Osteogent Sarcoma hos mus
Dosis % T/C
25 <tojektionrSV$9t/ Dag 24 Dag 35 0,50 0 0 0,25 15 9 0,125 14 22 30
Eksempel 14
In vivo-aktiviteten af CL-1957A over for Bl6 melanoma hos mus blev testet under anvendelse af proto-35 kolien fastlagt i Cancer Chemotherapy Reports, bind 3, del 3, 1-87 (1972) . Mus blev inokuleret ved hjælp af trocar med B16 melanoma på Dag 0 og fik derefter intra-' peritoneale injektioner af CL-1957A på Dag 1, 5 og 9.
Aktiviteten af forbindelsen over for B16 melanoma er vist i Tabel XIV udtrykt som % T/C-værdier, der repræsenterer « 0 25
DK 162449 B
forholdet mellem middel-levetid i dage for behandlede mus og for ubehandlede mus, udtrykt som en procentdel.
5 Tabel XIV
Aktivitet af CL-1957A over for B16 melanoma hos mus
Dosis
mg/kg legemsvægt/injektion % T/C
10 0,60 toxisk 0,30 141 0,15 145 0,075 201 15
Forbindelsen fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen danner farmaceutisk accepEable salte ned organiske og uorganiske baser. Eksempler, .på egnede uorganiske-baser er.amnonium-hydroxid, natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbo-20 nat, calciumhydroxid, natriumbicarbonat og lignende. Farmaceutisk acceptable salte dannes også med amin-kationer afledt af organiske nitrogenbaser, der er stærke nok til at danne kationer.
De farmaceutisk acceptable salte af syren frem-25 stilles for eksempel ved at suspendere syren i vand og indstille pH med den farmaceutisk acceptable base eller ved at omsætte forbindelserne med ét ækvivalent af den farmaceutisk acceptable base i et opløsningsmiddel og fjerne opløsningsmidlet ved reduceret tryk.
30 Ved angivelsen farmaceutisk acceptabel metal- kation menes de positivt ladede ioner afledt af sådanne metaller som natrium, kalium, calcium, magnesium, aluminium, zink, jern og lignende. Saltene fremstilles ved at bringe den frie syreform af forbindelsen i kontakt 35 med en ækvivalent mængde af den Ønskede base på sædvanlig måde. Den frie syreform kan regenereres ved at behandle saltformen med en syre. For eksempel kan fortyndede vandige syreopløsninger anvendes til at regenerere den frie syref orm fra et respektivt salt. Fortyndet van^· dig saltsyre er egnet til dette formål. Den frie syre-
DK 162449 B
r Λ r form afviger noget fra dens respektive saltf ormer med hensyn til visse fysiske egenskaber, såsom opløselighed i polære opløsningsmidler, men saltene er iøvrigt ækviva-5 lente med den respektive frie syreform, hvad angår formålene i forbindelse med opfindelsen.
Ved angivelsen farmaceutisk acceptabel aminkat·^ ion menes den positivt ladede ammoniumion og analoge ioner afledt af organiske nitrogenbaser, der er stærke 10 nok til at danne sådanne kationer. Baser, der kan anvenr- des til det formål at danne farmakologisk acceptable % ikke-toxiske additionssalte af sådanne forbindelser, der indeholder frie carboxylgrupper, udgør en klasse, hvis afgrænsning er let erkendelig for fagmanden. Blot til 15 illustration kan de siges i kationform at omfatte dem med formlen: ©^-•Ra H-N ——Rb
Rc 20 hvor Ra, og Rc uafhasngigt er hydrogen, alkyl med fra ca. 1 til ca. 6 C-atomer, cycloalkyl med fra ca. 3 til ca. 6 C-atomer, aryl med ca. 6 C-atomer, aralkyl med fra ca. 7 til ca. 11 C-atomer, hydroxyalkyl med fra ca.
2 til ca. 4 C-atomer eller monoarylhydroxyalkyl med fra 25 ca. 8 til ca. 15 C-atomer, eller vilkårlige to af R , α
Rk og Rc kan, sammen med det nitrogenatom, hvortil de er bundet, danne en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring indeholdende carbon, hydrogen, oxygen eller nitrogen, hvilke heterocycliske ringe og hvilke arylgrupper 30 er usubstituerede eller mono- eller dialkylsubstituere-de, idet disse alkylgrupper indeholder fra ca. 1 til ca.
6 C-atomer. Illustrerende for R&“, og Rc-gruppehol-dige farmaceutisk acceptable kationer afledt af ammoniak eller en basisk amin er derfor ammonium, mono-, di- og 35 trimethylammonium, mono-, di- og triethylammonium, mono-, di- og tripropylammonium (iso og normal) , ethyldimethyl-ammonium, benzyldimethylammonium, cyclohexylammonium, benzylammonium, dibenzylammonium, piperidinium, morpho-linium, pyrrolidinium, piperazinium, pyridinium, 1-me- t 27
DK 162449 B
thylpiperidinium, 4-ethylmorpholinium, 1-isopropylpyrro-lidinium, 1,4-dimethylpiperazinium, 1-n-butylpiperi-dinium, 2-methylpiperidinium, l-ethyl-2-methylpiperidi-5 nium, mono-, di- og triethanolammonium, ethyldiethanol-ammonium, n-butylmonoethanolammonium, tris(hydroxymethyl) methyl ammonium, phenylmonoethanolammonium og lignende.
Eksempel 15 10 Fremstilling af natriumsaltet af CL-1957A.
Afkølet natriumhydroxidopløsning (10 mg,0,0176M) blev dråbevis sat til en afkølet opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 2,5 ml methanol. Under tilsætningen dannedes et hvidt bundfald, der genopløstes mod slut-15 ningen af tilsætningen af baseopløsningen. Den resulterende opløsning blev koncentreret i' vakuum og fortyndet til 40 ml med vand. Portioner på 2 ml af denne opløsning blev sat til hver af flere 6 ml's medicinglas. Lyofili-sering af indholdet i hvert medicinglas gav et hvidt 20 fast stof svarende, i hvert medicinglas, til 5 mg CL-195 7A-natriumsalt.
Eksempel 16
Fremstilling af calciumsaltet af CL-1957A.
25 Afkølet calciumhydroxidopløsning (10 ml, 0,0088M) blev dråbevis sat til en afkølet opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 2,5 ml methanol. Efter tilsætning af baseopløsningen dannedes en hvid suspension, og noget materiale koagulerede på væggene af opløs-30 ningsbehoIderen. Methanolen blev fjernet ved inddampning, og tilstrækkelig 1,1-dimethylethanol blev tilsat for at opløse det vanduopløselige calciumsalt af CL-1957A. Den resulterende opløsning blev lyofiliseret, hvorved vandtes det faste calciumsalt, der fandtes at være uopløse-35 ligt i vand, men opløseligt i ethanol.
Eksempel 17
Fremstilling af kaliumsaltet af CL-1957A.
Afkølet kaliumhydroxidopløsning (10 ml, 0,0176M) blev dråbevis under omrøring sat til en afkølet 28
DK 162449B
opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 2,5 ml methanol. Den resulterende opløsning blev koncentreret i vakuum og derefter fortyndet med 40 ml vand. Portioner 5 på 2 ml af denne opløsning blev derefter sat til hvert af flere 6 ml's medicinglas. Lyofilisering af indholdet af hvert medicinglas gav et hvidt fast stof svarende, i hvert medicinglas, til 5 mg CL-1957A-kaliumsalt.
10 Eksempel 18
Fremstilling af triethylammoniumsaltet af CL-1957A.
En afkølet opløsning af triethylarain (2,45 ml, 0,176 mmol) i 7,55 ml vand blev dråbevis under omrøring sat til en opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 15 2,5 ml methanol. Den resulterende opløsning blev koncentreret til et slutvolumen på ca. 2 ml på en rotationsfordamper og derefter fortyndet til 40 ml med vand. Portioner på 2 ml af denne opløsning blev sat til hvert af flere 6 ml's medicinglas. Lyofilisering af indholdet i 20 hvert medicinglas gav et hvidt fast stof svarende, i hvert medicinglas, til 5 mg CL-1957A-triethylammoniumsalt, der fandtes at være opløseligt i vand.
Eksempel 19 25 Fremstilling af natriumsaltet af CL-1957A med mannitol.
Afkølet natriumhydroxidopløsning (10 ml, 0,0176M) blev dråbevis sat til en afkølet opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 2,5 ml methanol. Den resulterende opløsning blev koncentreret i vakuum for at 30 fjerne methanolen, og derefter blev der til koncentratet sat 500 mg mannitol indeholdt i 10 ml vand. Denne blanding blev fortyndet til 40 ml med vand. Portioner på 2 ml af denne opløsning blev sat til hvert af flere 6 ml*s medicinglas. Lyofilisering af indholdet af hvert 35 medicinglas gav et hvidt fast stof svarende, i hvert medicinglas, til 5 mg CL-1957A-natriumsalt med mannitol som fyldstof.
DK 162449 B
29
Eksempel 20
Fremstilling af natriumsaltet af CL-1957A 5 med ascorbinsyre og mannitol.
Afkølet natriumhydroxidopløsriing (10 ml, 0,0176M) blev dråbevis sat til en afkølet opløsning af 100 mg (0,176 mmol) CL-1957A i 2,5 ml methanol. Den resulterende opløsning blev koncentreret i vakuum for at fjerne me-10 thanolen, og derefter blev der til koncentratet sat 500 mg mannitol og 73,3 mg ascorbinsyre, begge indeholdt i 10 ml vand. Den resulterende blanding blev fortyndet til 40 ml med vand. Portioner på 2 ml af denne opløsning blev sat til hvert af flere 6 ml's medicinglas. Lyofilisering 15 af indholdet i hvert medicinglas gav et hvidt fast stof svarende i hvert glas til 5 mg CL-1957A-natriumsalt og 2,48 mg ascorbinsyre med mannitol som fyldstof.
Eksempel 21 20 Fremstilling af N-methyl-D-rglucaminsaltet af CL-1957A.
5 ml Opløsning af 11 mg N-methyl-D-glucamin i vand blev dråbevis under omrøring sat til 32 mg CL-1957A i 2 ml methanol, afkølet i et isbad. Opløsningen blev koncentreret i vakuum for at fjerne methanol og fortyn-25 det til 10 ml med henblik på lyofilisering. Det lyofi-liserede faste stof var hvidt og pulverformet. N-Methyl-D-glucaminsaltet er opløseligt i vand.
Den antibiotiske forbindelse CL-1957A, enten i 30 dens frie syreform eller i form af ét eller flere af dens farmaceutisk acceptable salte, er på grund af dens antimikrobielle og antitumor-aktivitet anvendelig som farmaceutiske kompositioner i kombination med en kompatibel farmaceutisk acceptabel bærer. Disse kompositioner 35 kan også indeholde andre antimikrobielle og/eller antitumor-midler. Kompositionerne kan fremstilles i enhver farmaceutisk egnet form for den ønskede anvendelsesvej. Eksempler på sådanne former omfatter faste former til oral anvendelse, såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granuler, flydende former til topisk eller oral 30
DK 162449B
anvendelse, såsom opløsninger, suspensioner, sirupper og elixirer, og former egnede til parenteral anvendelse, såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner.
5 Til fremstilling af farmaceutiske kompositioner ud fra de omhandlede forbindelser kan indifferente, farmaceutisk acceptable bærere være enten faste eller flydende. Faste præparatformer omfatter pulvere, tabletter, dispergerbare granuler, kapsler, oblatkapsler og suppo-10 sitorier..En fast bærer kan være ét eller flere stoffer, der også kan fungere som fortyndingsmidler, smagsstoffer, opløsningsformidlere, smøremidler, suspenderingsmidler, bindemidler eller tablet*-disintegrationsmidler. Den kan også være et indkapslende materiale. I pulvere kan bære-15 ren være et findelt fast stof, der foreligger i blanding med den findelte aktive forbindelse. I tabletter er den aktive forbindelse blandet med bærer, der har de nødvendige bindende egenskaber, i passende blandingsforhold og komprimeret i ønsket form og størrelse. Pulverne 20 og tabletterne indeholder fortrinsvis fra 5 eller 10 til ca. 70% af den aktive bestanddel. Egnede faste bærere er magnesiumcarbonat, magnesiumstearat, talkum, sukker, lactose, pectin, dextrin, stivelse, gelatine, traga-canth, methylcellulose, natriumcarboxymethylcellulose, 25 en lavtsmeltende voksart, kakaosmør og lignende. Angivelsen "præparat” skal forstås at omfatte kombinationen af den aktive forbindelse med indkapslende materiale som bærer under tilvejebringelse af en kapsel, hvori den aktive komponent (med eller uden andre bærere) er 30 omgivet af bærer, der på denne måde er kombineret med den aktive bestanddel. Tilsvarende er oblatkapsler inkluderet. Tabletter, pulvere, oblatkapsler og kapsler kan anvendes som faste dosisformer egnede til oral indgift.
Til fremstilling af suppositorier bliver en layt-35 smeltende voksart, såsom en blanding af fedtsyreglyce·’-· rider eller kakaosmør, først smeltet, og den aktive be-r· standdel dispergeres homogent deri ved omrøring. Den smeltede homogene blanding hældes derefter i forme af passende størrelse og henstilles til afkøling og derned '
DK 162449B
størkning. ^ ^
Flydende præparatformer omfatter opløsninger, suspensioner og emulsioner. Som eksempel kan nævnes vand-5 eller vand/propylenglycol-opløsninger til parenteral injektion. Flydende præparater kan også foreligge i opløs-' ning i vandig polyethylenglycolopløsning. Vandige opløsninger egnede til oral anvendelse kan fremstilles ved at opløse den aktive komponent i vand og tilsættes egnede 10 farvningsmidler, smagsstoffer, stabiliseringsmidler og fortykningsmidler, som ønsket. Vandige suspensioner egnede til oral anvendelse kan fremstilles ved at disper-gere den findelte aktive komponent i vand med viskost materiale, d.v.s. naturlige eller syntetiske gummiarter, 15 harpikser, methylcellulose, natriumcarboxymethylcellulo-se og andre velkendte suspenderingsmidler.
Ligeledes omfattet er faste præparatformer, der er beregnet til kort før brug at blive omdannet til flydende præparatformer til enten oral eller parenteral an-20 vendelse. Sådanne flydende former omfatter opløsninger, suspensioner og emulsioner. Disse særlige faste præparatformer tilvejebringes bedst i enhedsdosisform og anvendes som »sådan til tilvejebringelse af en enkelt flydende dosisenhed. Alternativt kan der foreligge til-25 strækkeligt fast stof til, at der efter omdannelse til flydende fora kan vindes flere individuelle flydende doser ved afmåling af forud fastlagte voluminer af den flydende præparatform, f.eks. med en sprøjte, teske eller anden målebeholder. Når der på denne måde fremstil-30 les flere flydende doser, foretrækkes det at opbevare den ikke-anvendte del af de flydende doser ved lav temperaturer (d.v.s. under afkøling) for at forhale eventuel dekomponer ing. De faste præparatf ormer, der er beregnet til at blive omdannet til flydende form, kan for-35 uden det aktive materiale indeholde smagsmidler, farvningsmidler, stabiliseringsmidler, puffere, syntetiske og naturligs sødemidler, dispergeringsmidler, fortykningsmidler, opløsningsformidlere og lignende. Den til fremstilling af den flydende præparatform anvendte væ- 32
DK 162449B
« * , ske kan være vand, isotonisk vand, ethanol, glycerol, propylenglycol og lignende samt blandinger deraf. Den anvendte væske vil blive valgt under hensyn til anven-5 delsesvejen, idet for eksempel flydende præparater indeholdende store mængder ethanol ikke er egnede til parenteral anvendelse.
Det farmaceutiske præparat er fortrinsvis i enhedsdosisform. I sådan form er præparatet underopdelt 10 i enhedsdoser indeholdende passende mængder af den aktive komponent. Enhedsdosisformen kan være et emballeret præparat, idet emballagen indeholder separate præparatmængder, for eksempel emballerede tabletter, kapsler og pulvere i medicinglas eller ampuller. Enhedsdosisformen 15 kan også være en kapsel, oblatkapsel eller tablet i sig selv, eller den kan være det passende antal af enhver af disse i emballeret form.
Mængden af aktiv forbindelse i en præparat-enhedsdosis kan varieres eller indstilles fra 0,1 mg til 500 20 mg, fortrinsvis fra 5 til 100 mg, alt efter den foreliggende anvendelse og styrken af den aktive bestanddel. Kompositionerne kan, om ønsket, også indeholde andre kompatible terapeutiske midler.
Ved terapeutisk anvendelse ligger dosisområdet 25 til et pattedyr på 70 kg fra 1 til 1500 mg/kg legemsvægt pr. dag eller fortrinsvis fra 2 til 750 mg/kg legemsvægt pr. dag. Doserne kan imidlertid varieres alt efter patientens behov, alvoren af den tilstand, der behandles, og den anvendte forbindelse. Fastlæggelse af den rette do-30 sis i en given situation ligger inden for fagmandens kunnen. Behandling indledes i almindelighed med mindre doser, der er mindre end den optimale dosis af forbindelsen. Derefter hæves dosen med små stigninger, indtil den optimale effekt under de foreliggende omstændigheder er 35 nået. Den totale daglige dosis kan, om ønsket, opdeles og indgives i portioner i dagens løb.
Claims (2)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af den antibiotiske forbindelse CL-1957A eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, hvilken forbindelse CL-1957A er ka-5 rakteriseret ved: a) en molekylvægt på 540 atommasseenheder, b) et smeltepunkt på 41-44°C (med forudgående blødgøring), c) en optisk rotation [a]^ på -157°, (0,7% i chloroform), d) et ultraviolet absorptionsspektrum i methanol (fri ^ syreform), der viser en inflektion ved 290 nm og en slutabsorption under 260 nm, e) et ultraviolet absorptionsspektrum i methanol (car-boxylatanionform) visende maksima ved 240 nm (a = 61,1), 287 nm (a = 6,6) og 378 nm (a = 3,5), 15 f) et infrarødt absorptionsspektrum i chloroform visende principale absorptionsspidser ved 2975, 2940, 1715, 1700 (skulder), 1645, 1455, 1375, 1255, 1105 og 965 cm *, g) et 360 MHz protonmagnetisk resonansspektrum i deute- 9Ω u rochloroform-opløsning visende signaler ved 0,77 (dublet, 3 protoner), 0,97 (dublet, 3 protoner), 1,03 (triplet, 3 protoner), 1,05 (dublet, 3 protoner), 1,10 (dublet, 3 protoner), 1,13 (dublet, 3 protoner), 1,73 (multiplet, 1 proton), 1,80 (singlet, 3 proto-ner), 1,88 (dublet af dubletter, 1 proton), 2,06 (triplet, 2 protoner), 2,11 (singlet, 3 protoner), 2,17 (multiplet, 1 proton), 2,17 (kvartet, 2 protoner) , 2,51 (multiplet, 1 proton), 2,65 (multiplet, 1 proton), 2,80 (multiplet, 1 proton), 3,56 (triplet, 30. proton), 3,64 (multiplet, 1 proton), 4,97 (dublet af dubletter, 1 proton), 5,06 (dublet, 1 proton), 5,21 (dublet, 1 proton), 5,57 (multiplet, 1 proton), 5,66 (singlet, 1 proton), 5,70 (dublet af dubletter, 1 proton), 5,97 (dublet, 1 proton), 5,98 (dublet, 1 35 proton), 6,62 (dublet, 1 proton) og 6,93 (dublet af dubletter, 1 proton) ppm nedad fra tetramethylsilan og DK 162449B 13 < t * 34 h) et 90,5 MHz C kernemagnetisk resonans spektrum i deuterochloroform-opløsning visende principale signaler ved 215,08; 171,01; 164,30; 161,06; 151,47; 137,90; 136,44; 135,53; 135,18; 130,18; 128,14; 5 128,01; 122,76; 120,05; 116,85; 81,49; 74,32; 46,74; 45,70'; 45,65; 40,84; 33,58; 32,21; 26,61; 20,85; 18,65; 16,08; 13,68; 13,62; 13,08; 12,61 og 12,38 ppm nedad fra tetramethylsilan, og har den kemiske betegnelse 19-(3,6-dihydro-3-methyl-10 6-oxo-2H-pyran-2-yl)-17-ethyl-6-hydroxy-3,5,7,9,11,15-hexamethyl-8-oxo-2,10,13,16,18-nonadecapentaensyre. kendetegnet ved, at en stamme af en actinomycet, identificeret som isolat ATCC 39366, dyrkes under aerobe betingelser i et dyrkningsmedium 15 indeholdende assimilerbare kilder for carbon og nitrogen, indtil der er dannet en betydelig mængde CL-1957A, hvorefter nævnte forbindelse CL-1957A isoleres og, om ønsket, overføres i et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.
2. Renset isolat .af en actinomycet til brug ved 20 fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det er et isolat af stammen ATCC 39366.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US53112983A | 1983-09-12 | 1983-09-12 | |
US53112983 | 1983-09-12 | ||
US64198484A | 1984-08-21 | 1984-08-21 | |
US64198484 | 1984-08-21 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK432984D0 DK432984D0 (da) | 1984-09-11 |
DK432984A DK432984A (da) | 1985-03-13 |
DK162449B true DK162449B (da) | 1991-10-28 |
DK162449C DK162449C (da) | 1993-11-08 |
Family
ID=27063472
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK432984A DK162449C (da) | 1983-09-12 | 1984-09-11 | Fremgangsmaade til fremstilling af den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller farmaceutisk acceptable salte deraf, samt et renset actinomycet-isolat til brug ved fremgangsmaaden |
DK36191A DK163638C (da) | 1983-09-12 | 1991-02-28 | Farmaceutisk praeparat indeholdende den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller et farmaceutisk salt deraf |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK36191A DK163638C (da) | 1983-09-12 | 1991-02-28 | Farmaceutisk praeparat indeholdende den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller et farmaceutisk salt deraf |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0139458B1 (da) |
AU (1) | AU574713B2 (da) |
CA (1) | CA1230567A (da) |
DE (1) | DE3480707D1 (da) |
DK (2) | DK162449C (da) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1232852A (en) * | 1983-09-12 | 1988-02-16 | Gerard C. Hokanson | Cl-1957b antibiotic compound and its production |
AU649116B2 (en) * | 1991-03-27 | 1994-05-12 | Sankyo Company Limited | New compounds, named the "Leustroducins", their preparation and their therapeutic uses |
US5700353A (en) * | 1993-06-16 | 1997-12-23 | Ranpak Corporation | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
US5711853A (en) * | 1993-06-16 | 1998-01-27 | Ranpak Corp. | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
US5316942A (en) * | 1993-06-16 | 1994-05-31 | Battelle Memorial Institute | Process for the production of low-cost soluble high-molecular weight collagen |
US5700354A (en) * | 1993-06-16 | 1997-12-23 | Ranpak Corp. | Paper strengthened with solubilized collagen and method |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE54287B1 (en) * | 1982-02-24 | 1989-08-16 | Warner Lambert Co | Cl 1565 antibiotic compounds and their production |
GB2119787B (en) * | 1982-04-07 | 1985-07-10 | Ss Pharmaceutical Co | Pyrones |
EP0128651A3 (en) * | 1983-05-12 | 1987-01-07 | Warner-Lambert Company | Pyranones and related compounds and methods for their production and use |
CA1232852A (en) * | 1983-09-12 | 1988-02-16 | Gerard C. Hokanson | Cl-1957b antibiotic compound and its production |
-
1984
- 1984-09-10 AU AU32856/84A patent/AU574713B2/en not_active Expired
- 1984-09-11 EP EP84306191A patent/EP0139458B1/en not_active Expired
- 1984-09-11 DE DE8484306191T patent/DE3480707D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-11 DK DK432984A patent/DK162449C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-09-12 CA CA000462963A patent/CA1230567A/en not_active Expired
-
1991
- 1991-02-28 DK DK36191A patent/DK163638C/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU574713B2 (en) | 1988-07-14 |
AU3285684A (en) | 1986-09-11 |
DK432984D0 (da) | 1984-09-11 |
DK162449C (da) | 1993-11-08 |
DK36191D0 (da) | 1991-02-28 |
DE3480707D1 (de) | 1990-01-18 |
CA1230567A (en) | 1987-12-22 |
EP0139458B1 (en) | 1989-12-13 |
DK163638B (da) | 1992-03-23 |
EP0139458A3 (en) | 1987-04-15 |
DK36191A (da) | 1991-02-28 |
DK163638C (da) | 1992-09-07 |
DK432984A (da) | 1985-03-13 |
EP0139458A2 (en) | 1985-05-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0376300B1 (en) | Novel substance dc 113 and production thereof | |
FI87803C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt vaerdefulla tricykliska foereningar | |
EP0137632B1 (en) | Physiologically active substance k-252, process for producing same and a pharmaceutical composition containing same | |
CA2012955C (en) | Antitumor substance be-13793c | |
KR900004066B1 (ko) | 생물학적으로 활성인 ws 6049의 제조방법 | |
IE56651B1 (en) | Rebeccamycin and process for its preparation | |
KR0135600B1 (ko) | 항암 항생물질 mi43-37f11, 그 제조방법 및 그 용도 | |
DK162449B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af den antibiotiske forbindelse cl-1957a eller farmaceutisk acceptable salte deraf, samt et renset actinomycet-isolat til brug ved fremgangsmaaden | |
NL8501708A (nl) | Antitumor antibioticum. | |
US4578383A (en) | CL 1565 antibiotic compounds | |
US5756536A (en) | Microbial transformation of taxol and cephalomannine | |
US4771070A (en) | CL-1957A antibiotic compound | |
CA1232852A (en) | Cl-1957b antibiotic compound and its production | |
WO1996016053A1 (en) | Phthalide compounds and their production process | |
JPH1045738A (ja) | 抗生物質エポキシキノマイシンcおよびdとその製造法ならびに抗リウマチ剤 | |
JP2593495B2 (ja) | 化合物tan−999、その製造法および用途 | |
JP3124373B2 (ja) | 免疫抑制物質 | |
US4918100A (en) | CL-1957B antibiotic compound and its production | |
US4725621A (en) | CL-1957E antibiotic compound and its production | |
JPH0959275A (ja) | 新規物質トリプロスタチン、その製造方法、細胞周期阻害剤および抗腫瘍剤 | |
CA2016149C (en) | Dc115a compounds | |
JPH09157266A (ja) | 新規抗生物質エポキシキノマイシンaおよびbとその製造法 | |
CS59492A3 (en) | Canglemycin c, process of its preparation, its use, a pharmaceutical and astrain for said canglemycin c preparation | |
KR0177585B1 (ko) | 항종양성 물질 b e-13793c-생성 균주 | |
JPH06228185A (ja) | D329物質とその誘導体,その製造法及び用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |