DK158234B - Fremgangsmaade til fremstilling af alfa-isopropylaeblesyre - Google Patents

Description

i

DK 158234 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af α-isopropylæblesyre ved gæring, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at Yarrouiia lipolytica ATCC 20628 dyrkes i et vandigt medium indeholdende assimilerbare 5 kilder for carbon, nitrogen, L-leucin og uorganiske salte under submerse aerobe gæringsbetingelser, hvorpå den dannede α-isopropylæblesyre udvindes fra mediet.

Isolering af α-isopropylæblesyre fra dyrkningsmedier af en leucin-krævende mutantstamme af Neurospora crassa 10 er rapporteret af Burns et al., Biochemistry 2, 1053 (1963) og af Calvo et al., Biochemistry 3^, 2044 (1964).

Dannelsen af α-isopropylæblesyre [Ø-carboxy-Ø-hydroxy-isocapronsyre eller S(-)-2-hydroxy-2-(l-methylethyl)-butandisyre] som et metabolisk produkt af leucin-krævende 15 mutanter (auxotrophe) af Saccharomyces cerevisiae og dens isolering fra gæringsvæskerne ved syrning og ether-ekstraktion af væsken er rapporteret af Sai, Agr. Biol.

Chem. 32^, 522-524, (1968).

En delvis bibliografi over opdagelsen af α-isopropy1-20 æblesyre som forstadium til leucin-biosyntese i Toru- lopsis utilis, som metabolisk produkt af nogle stammer af bakterier og svampe, som kræver leucin for vækst, og dens enzymatiske dannelse i cellefrie præparater af bagegær er angivet af Sai (loc. cit.).

25 I fransk patentskrift nr. 2 417 548, udstedt den 19.

oktober 1979, er beskrevet fremstillingen af a-isopro-pylæblesyre ved aerob gæring af Brevibacterium- eller Corynebacterium-arter.

Fultz et al., <3. Bacteriol. 142, 513-520 (1980) rap-30 porterer konstruktionen af to Salmonella typhimurium stammer ved en række P22-formidlede transduktioner.

2

DK 158234 B

Den ene stamme akkumulerede og udskilte udelukkende α-isopropylæblesyre, idet mængden af denne syre, som kunne isoleres fra dyrkningsmedier deraf, var mere end fem gange den, der produceres af Neurospora crassa.

5 Den anden stamme akkumulerede og udskilte en blanding af a- og β-isopropylæblesyrer.

α-isopropylæblesyre er af Mikami et al., Agr. Biol.

Chem. 3j4, (6), 977-979 (1970) rapporteret at være en plantevækstregulator. I japansk patentskrift nr.

10 70 032 919 fra den 23. oktober 1970 (Chem. Abstr. 73, 31511v, 1971) er beskrevet dens anvendelse til at forbedre tobaksaroma. Dens anvendelse som mellemprodukt for fremstilling af de tobaksaroma-modificerende midler 2-isopro-pyl-4,4-dimethyl-5-methylen-2-cyclopenten-l-on og 2,5-15 diisopropy1-2-cyclopenten-l-on ved tør destillation er angivet i japansk offentliggørelsesskrift nr.

77 113 945, offentliggjort den 24. september 1977 (Chem. Abstr. 8j3, 6205u, 1978). I DE offentliggørelsesskrift nr. 2 922 222, offentliggjort den 13. december 1979 20 (Chem. Abstr. 9ji, 152039g, 1980), er beskrevet anvendelsen af den og dens natrium- og ammoniumsalte som hærdningsretarderingsmidler for gips.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en ny gærings-fremgangsmåde til fremstilling af α-isopropylæblesyre 25 i væsentligt større mængder, end der produceres af kendte mikroorganismer, herunder en særlig fordelagtig fremgangsmåde til udvinding af α-isopropylæblesyren fra den gæringsvæske, der dannes ved den nye fremgangsmåde.

Gæringsfremgangsmåden omfatter dyrkning af en hidtil 30 ukendt stamme af Yarrowia lipolytica, ATCC 20628, hvilken stamme er auxotroph for L-leucin, under submerse aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen, L-leu- 3

DK 158234 B

cin og uorganiske salte, hvorpå den dannede a-isopropyl-æblesyre udvindes fra mediet.

Den fordelagtige fremgangsmåde til udvinding af a-isopro-pylæblesyre fra den dannede gæringsvæske består i.klaring 5 og syrning af væsken efterfulgt af ekstraktion med methyl-ethylketon.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås en koncentration i gæringsvæsken, som er 10 gange højere end ved nogen kendt procedure, og de kombinerede gærings/ 10 udvindings-trin giver et 30 gange større udbytte end de kendte procedurer.

Gæringsfremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvorved der udelukkende produceres α-isopropylæblesyre, består i at dyrke en hidtil ukendt stamme af Y. lipolytica un-15 der aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium med en begyndelses-pH-værdi på fra omkring 6,0 til omkring 7,0, fortrinsvis 6,0 - 6,5. Denne hidtil ukendte stamme er blevet deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A., en anerkendt depone-20 ringsinstitution, som yder permanent deponering og let adgang dertil for offentligheden i 30 år fra deponerings-datoen. Denne mikroorganisme blev givet betegnelsen Yarrowia lipolytica ATCC 20628.

Den hidtil ukendte kultur Y. lipolytica ATCC 20628 er 25 i Pfizer Inc. kultursamlingen identificeret som PC 30781. Taxonomiske undersøgelser (se nedenfor) af kulturen blev genenmført af J. R. DeZeeuwi og I. Stasko som anbefalet af Lodder i "The Yeasts", second edition, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970, undtagen at alle 30 kemisk definerede medier inkluderede 149 mg/liter L- leucin-ethyles'ter-hydrochlorid som aminosyresupplement.

DK 158234 B

å

Stamme .· Stamme CBS 5991 ATCC 20628

Celleform ovoid ovoid

Gennemsnitlig cellestørrelse 3,1x8,3 3,2x6,8 (/um)

Formering knopning knopning

Dalmau pladekultur Pseudomycelium Pseudomycelium og egentligt my- og egentligt myce-celium overvejen-lium overvejende. Biasto- de. Biastosporer fore- sporer forekommer, mest kommer, mest som enkelte som enkelte i pleurale i pleurale positioner. positioner.

Carotenoidpigmentering ingen ingen

Nitratassimilation

Glucoseforgæring

Assimilation af car- bonforbindelser: L-Arabinose

Cellobiose

Erythritol + + D-Galactose D-Glucose + +

Inositol

Lactose

Maltose D-Mannitol + +

Melibiose

Saccharose

Trehalose D-Xylose '*'CBS 599 er typekulturen for arten Candida lipolytica [også kendt som Saccharomycopsis lipolytica; nu klassificeret som Yarrowia lipolytica (Wickerham et al.) af van der Walt og von Arx, Antonie van Leeuwenhoek 46, 517-521, 1980].

5

DK 158234 B

Ingen af stammerne viste nogen vækst ved 37 °C, men begge viste god vækst ved 28 °C i et basalmedium indeholdende 6,7 g/1 Bacto-gærnitrogenbase, 200 yug/l thi-amin-hydrochlorid, 149 mg/1 L-leucin-ethylester-hydro-5 chlorid og 5,0 g/1 D-glucose. Begge stammer kræver thi amin for vækst, og begge assimilerer ammoniumsulfat og urinstof.

På basis af dens taxonomi sammenlignet med taxonomien for C. lipolytica CBS 599, PC 30781, er ATCC 20628 en stamme af Y. lipolytica.

10 Det vandige næringsmedium skal indeholde assimilerbare kilder for carbon, nitrogen, L-leucin og uorganiske salte. Repræsentative carbonkilder er et carbonhydrat, såsom D-glucose, glycerol, D-mannitol, majsstivelse-hydrolysat, enzymatisk hydrolyseret majsmel og enzyma-15 tisk hydrolyseret majsgrutning, og fedtstoffer og olier, som kan eksemplificeres ved afsmeltningsfedt og majsolie, n-alkaner, såsom n-hexadecan og n-alkanblanding (C^..^? forhandlet af Exxon Chemical Co., Baytown, Texas, U.S.A.). Foretrukne carbonkilder er D-glucose, majsstivelsehydroly-sat og majsmelhydrolysat, da de for et givet indhold 20 af de nævnte carbonkilder, beregnet som deres glucose- ækvivalens, har tendens til at give optimale udbytter af α-isopropylæblesyre. Carbonkilden anvendes almindeligvis i en koncentration på fra omkring 80 til omkring 100 g/1, beregnet på basis af glucoseindhold eller -æk-25 vivalens.

Egnede kilder for nitrogen er sojabønnehydrolysat, enzymatisk nedbrudt casein, gærekstrakt, urinstof, ammoniumsulfat, majsstøbevand, aminosyrer og peptoner.

En kilde for vækststoffer, såsom "distiller's solubles", 30 gærekstrakt og melasseekstraktrester, såvel som mineral- 6

DK 158234 B

salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, monobasisk kaliumphosphat, magnesiumsulfat og calciumcarbonat (der også tjener som puffer), og spormineraler, såsom zink, jern og kobber, er gavnlige for mikroorganismens vækst.

5 Desuden kræves visse vitaminer, såsom thiamin, sædvanligvis som hydrochloridsaltet, for mikroorganismens rette vækst.

En essentiel komponent i mediet er en kilde for L-leu-cin. L-leucinet kan tilsættes som sådan eller i form 10 af et forstadium, dvs. et stof, som omdannes til L-leu- cin under gæringen. Repræsentative L-leucin-forstadier er leucinholdige peptider eller proteinhydrolysater, f. eks. sojabønnemel. Koncentrationer af L-leucin eller forstadier dertil, beregnet på basis af deres L-leucin-15 ækvivalens, på fra omkring 0,2 til omkring 5,0 g/1 me dium er særlig nyttige til opnåelse af optimal produktion af α-isopropylæblesyre. Den foretrukne koncentration af L-leucin eller et forstadium dertil er fra omkring 0,5 til omkring 1,0 g/l beregnet som L-leucin. Den 20 foretrukne L-leucin-kilde er L-leucin selv.

Som anført ovenfor er gæringen aerob. Selv om enhver form for aerob inkubation er tilfredsstillende, foretrækkes kontrolleret beluftning, som f. eks. ved omrøring af mediet under luft eller ved gydning af luft 25 igennem mediet. Mikroorganismen dyrkes ved en tempera tur på fra omkring 24 til omkring 30 °C, og fortrinsvis ved 28 °C.

Antiskumningsmidler, såsom siliconer, vegetabilske olier og ikke-ioniske overfladeaktive midler, især blokpoly-30 mere af ethylenoxid og propylenoxid, tilsættes almindeligvis gæringsmediet for at kontrollere skumning.

7

DK 158234 B

Podemediet, som kræves for gæringen, opnås ved fjernelse af de vegetative celler fra skråsubstrater inkuberet med en kultur af Y. lipolytica ATCC 20628. Et fast medium, som er egnet til begyndelsesvækst på skråsubstra-5 ter, er følgende:

Bacto-pepton 25,0 g/1

Bacto-næringsvæske 8,0 g/1

Bacto-gærekstrakt 5,0 g/1 D-glucose 5,0 g/1

Gentamicin 50,0 mg/1

Agar 20,0 g/1

Skråsubstraterne podes med Y. lipolytica stammen og inkuberes i 24 timer ved 28 °C. De dannede vegetative celler fjernes og anvendes til at pode glas eller ryste-flasker indeholdende det ovenfor beskrevne medium, men 10 uden agaren. Inkubation udføres i 22 timer ved 28 °C

på en gyroterende ryster. De således dannede vegetative celler anvendes til at pode større beholdere, f. eks.

4 liters gærkar, indeholdende et passende medium for vækst, som eksemplificeres i det følgende. Inkubationen 15 udføres ved fra omkring 24 til omkring 28 °C i op til 9 dage under anvendelse af en beluftningshastighed på 2 liter/minut/kar. Sterilitet opretholdes hele tiden.

Efter fuldførelse af gæringen udvindes a-isopropylæble-syren ved syrning af væsken til en pH-værdi på fra omkring 20 1,0 til omkring 2,0, fortrinsvis til pH 1,5, ved tilsæt ning af en mineralsyre, f. eks. svovlsyre eller saltsyre. Den syrnede væske omrøres i 1 - 2 timer, hvorpå den filtreres. Den klarede væske ekstraheres derpå med methylethylketon, og ct-isopropylæblesyren opnås ved 25 inddampning. Yderligere produkt kan udvindes fra raffi- natet ved ekstraktion som før.

8

DK 158234 B

Gæringsvæsken behøver ikke at klares.før udvindingen af α-isopropylæblesyren. Imidlertid tjener klaring før ekstraktionen til at forenkle udvindingsprocessen.

Andre med vand ublandbare opløsningsmidler, som methyliso-5 butylketon, n-butanol, isobutanol, ethylacetat og selv følgelig ether kan anvendes. Men methylethylketon er det foretrukne opløsningsmiddel på grund af sikkerheden ved håndtering og den lethed, hvormed krystallinsk a-isopropylæblesyre kan opnås ved koncentrering af ekstrak-10 terne.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal belyses nærmere ved de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Fremstilling og udvinding af a-isopropylæblesyre med 15 D-glucose som carbonkilde

Kultur fremstilling

Det faste stof fra et standardfrysetørringsglas med Y. lipolytica ATCC 20628 blev suspenderet i 1,0 ml sterilt vand. Derpå blev skråsubstrater indeholdende 17 20 ml medium A størknet med Bacto-agar (20 g/1) pr. 25 x 150 mm reagensglas podet med 0,2 ml portioner af suspensionen.

Medium A

Bacto-pepton 25,0 g/1 25 Bacto-næringsvæske 8,0 g/1

Bacto-gærekstrakt 5,0 g/1 D-glucose 5,0 g/1

Gentamicin 0,05 g/1

DK 158234B

9

Mediets pH-værdi var 6,8 - 6,9. Massen blev steriliseret ved autoklavering i 30 minutter ved 103 kPa. Glu-cosen blev steriliseret separat.

Skråsubstraterne blev inkuberet i 24 timer ved 28 °C 5 før anvendelse til fremstilling af podematerialet.

Fremstilling af podemateriale

Et skråsubstrat fremstillet som beskrevet ovenfor blev vasket med 20 ml sterilt destilleret vand. Den resulterende cellesuspension blev anvendt til at pode 70 reagensglas 10 (25 x 150 mm) indeholdende 10 ml medium A pr. glas i en koncentration på 0,2 ml cellesuspension pr. glas.

Glassene blev tilproppet med vat og inkuberet i 22 timer ved 28 °C på en gyroterende ryster med et udslag på 2,54 cm ved 200 omdr./min, stillet i en vinkel på 30°.

15 Vækstmaterialet fra glassene blev derpå hældt sammen.

Gæring

Der fremstilledes følgende massemedium: (NH4)S04 4,0 g/1

Majsstøbevand 5,0 g/1 20 ' KH2P04 0,5 g/1

MgS04.7H20 0,25 g/1

CaCO^ (marmorhvidt) 15,0 g/l L-leucin 1,0 g/1

Thiamin.HC1 400,0 pg/1 25 Vandværksvand op til 80% volumen (pH = 6,1 - 6,2)

Alle ingredienser undtagen D-glucose blev fyldt op til 80% af slutvolumen. Massemediet (1600 ml) sattes til hvert af 8 omrørte 4 liters gærkar, som blev sterili- 10

DK 158234 B

seret ved 103 kPa i 30 minutter. Derpå sattes D-glu-cose som en 50 vægt/vol.-% opløsning, steriliseret ved autoklavering ved 103 kPa i 30 minutter, til hvert kar i en mængde på 200 ml/kar. "Pluronic® L-81" [et flydende 5 ikke-ionisk overfladeaktivt middel af poly(oxypropylen)- poly(oxyethylen)-typen med en gennemsnitsmolekylvægt på 2750; forhandlet af BASF Wyandotte], 1,0 ml/kar (steriliseret som ovenfor) tilsattes som antiskumningsmiddel.

Hvert kar blev podet med 80 ml sammenhældt podemateriale 10 og inkuberet i 9 dage ved 26 °C under omrøring med 1750 omdr./min og beluftning med 2 liter/minut/kar.

Klaring Væsken fra gærkarrene blev kombineret (pH 4,13), indstillet til pH 1,5 ved tilsætning af koncentreret svovlsyre 15 og derpå omrørt i 1 time. Derefter blev væsken vakuum- filtreret, hvorved der blev opnået 11,55 liter klaret væske (50 ml udtaget til prøvning viste et a-isopropyl-æblesyre-indhold på 42,8 mg/ml, svarende til en samlet mængde på 494,3 g.

20 Udvinding af tx-isopropylæblesyre

Den klarede væske (11,5 mi) blev ekstraheret med et lige så stort volumen methylethylketon, og ekstrakten blev befriet for opløsningsmiddel under formindsket tryk i en rotationsfordamper delvis neddykket i et vandbad 25 ved 40-41 °C. Det første raffinat, pH 1,77, blev indstillet til pH 1,5 ved tilsætning af svovlsyre og derpå vakuumfiltreret.

Filtratet blev ekstraheret med et lige så stort volumen methylethylketon mættet med vand, og opløsningsmidlet 30 blev afdampet som beskrevet ovenfor. Det andet raffinat 11

DK 158234 B

(pH 1,57) blev indstillet til pH 1,5 ved hjælp af svovlsyre og ekstraheret med et lige så stort volumen methyl-ethylketon mættet med vand. Ekstrakten blev befriet for opløsningsmiddel ligesom de to tidligere ekstrakter.

5 De koncentrerede ekstrakter blev kombineret (totalvolumen 1800 ml) og affarvet ved behandling med 13,0 g aktivkul. Den opnåede klare ravfarvede opløsning blev koncentreret under formindsket tryk ved 70 °C til en delvis fast masse. Den blev overført til et 1 1 bæger-10 glas og tilsat tilstrækkeligt vand ved 85 °C til at frembringe opløsning. Opløsningen blev omrørt og fik lov at afkøles, indtil den nåede stuetemperatur. Efter henstand ved stuetemperatur natten over blev den krystallinske a-isopropylæblesyre skilt fra ved vakuum-15 filtrering, og filterkagen vasket med et lille volumen koldt vand. Krystallerne blev tørret natten over i et dampopvarmet skab, hvorved der blev opnået 381,9 g næsten hvide krystaller.

Kombinationen af modervæske og vaskevand blev koncen-20 treret i vakuum ved 70 °C, og koncentratet oparbejdet som ovenfor, hvorved der blev opnået 62,9 g lysebrune krystaller. Kombinationen af modervæske og vaskevand . . blev koncentreret i vakuum som før til opnåelse af en viskøs væske, som ikke krystalliserede. Den viste sig 25 ved prøvning at indeholde 24,8 g α-isopropylæblesyre.

Den totale mængde α-isopropylæblesyre udvundet fra 11,5 1 klaret væske var 469,6 g.

De kombinerede raffinater viste ved prøvning 1,38 mg/ml α-isopropylæblesyre, svarende til ialt 17,9 g a-iso-30 propylæblesyre.

Identiteten af produktet som α-isopropylæblesyre [S(-)~ 2-hydroxy-2-(l-methylethyl)butandisyre] blev fastslået 13 1 ved sammenligning af smp., IR, C-NMR og H-NMR med 12

DK 158234 B

de tilsvarende spektre for α-isopropylæblesyre produceret af Neurospora crassa.

EKSEMPEL 2

Fremstilling og udvinding af α-isopropylæblesyre med 5 ma.jsmel som carbonkilde__ Gæring

Et podemateriale fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev gæret i gærkar (4 1) under anvendelse af et medium med den følgende sammensætning: 10 Rå majssirup (indeholdende 263 mg D-glucose/g) 380,0 g/1

Majsstøbevand 5,0 g/1 (NH4)2S04 4,0 g/1 KH2P04 0,5 g/1 15 MgS04.7H20 0,25 g/1

CaCOj (marmorhvidt) 15,0 g/1 L-leucin 1,0 g/1

Thiamin.HC1 400,0 ug/1 "PluronicR L-81" 0,5 ml/1 20 Vandværksvand (pH = 6,1-6,2)

Hvert af otte 4 1 kar blev påfyldt 760 g rå majssirup og fortyndet op til 1000 ml med vandværksvand, indstillet til pH 6,1 med kaliumhydroxid. Der tilsattes 30,0 g 25 calciumcarbonat og 500 ml vandværksvand, og blandingen blev steriliseret ved autoklavering ved 103 kPa i 30 minutter. De resterende ingredienser (undtagen "Pluronic L-81") blev blandet til 25¾ af slutvolumen, 500 ml portioner deraf blev steriliseret separat ved 103 kPa i 30 30 minutter og sat til hvert kar. "Pluronic L-81" blev 13

DK 158234 B

steriliseret som ovenfor, og 1 ml sat til hvert kar.

Hvert kar blev inkuberet med 80 ml podemateriale ifølge proceduren fra eksempel 1.

Klaring og udvinding 5 Væsken fra 4 kar blev klaret ifølge proceduren fra ek sempel 1, hvorved der blev opnået 6,2 1 klaret væske som ved prøvning viste 39,7 g a-isopropylæblesyre/1.

Udvinding ifølge proceduren fra eksempel 1 gav 238,5 g α-isopropylæblesyre ud fra 6,19 1 klaret væske. De kom-10 binerede raffinater (8500 ml) viste ved prøvning 0,98 mg/ml, ækvivalent med 8,3 g α-isopropylæblesyre i raf-finatet.

Prøvningsprocedure for målingen af koncentrationen af g-isopropylæblesyre_ 15 (En tilpasning af proceduren ifølge Calvo et al., Anal.

Biochem. 28, 164-181, 1969).

10 ml gæringsvæske blev indstillet til pH 1,5 med fortyndet svovlsyre og derpå tilsat tilstrækkeligt destilleret vand til at forøge volumenet til 50 ml. En por-20 tion (10-20 ml) af den syrnede og fortyndede væske blev klaret ved centrifugering, og 5 ml af den klarede opløsning blandet med 5 ml puffer (0,2 M ^£$0^ indstillet til pH 1,5 med 0,2 M H^O^).

4 ml af den pufrede opløsning blev derpå sat på en 25 "ClinElut" éngangsekstraktionssøjle (Fisher Scientific

Company, Pittsburgh, PA, USA., Catalog No. 1005). Prøven fik 3 minutter til at adsorberes på søjlen, og derpå sendtes 8 ml methylethylketon gennem søjlen ved tyng- 14

DK 158234 B

destrømning. Eluatet blev opsamlet 1 en 25 ml volume-trisk kolbe, og elueringen blev gentaget to gange mere med 8 ml volumener methylethylketon. Volumenet af de kombinerede eluater blev derpå bragt op på 25 ml ved 5 tilsætning af methylethylketon.

En prøve på 1,0 ml af eluatet blev inddampet til tørhed i et reagensglas under anvendelse af en nitrogen-strøm og en 65 °C varmeblok. Til remanensen sattes 0,4 ml 95% koncentreret h^SO^, glasset blev inkuberet 10 i et vandbad ved 30 °C i 20 minutter og derpå afkølet.

Derefter tilsattes 0,25 ml kold 1,84 M vandig resorci-nolopløsning, blandingen blev inkuberet i et vandbad ved 30 °C i 30 minutter, og derpå tilsattes 9,35 ml vand. En 0,1 ml portion af den resulterende opløsning 15 blev fortyndet til 10 ml med pH 10 puffer (0,1 M

HjBOj -0,4 M Na^CO^), og fluorescensen blev bestemt under anvendelse af et Aminco-Bowman-instrument, idet der anvendtes indstillinger for maximal fluorescens: 360 nm for excitation og 453 nm for emission, og værdi-20 erne blev sammenlignet med værdierne for en standard.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af a-isopropyl-æblesyre, k e n d e t e g n e t ved, at Yarrowia lipolytica ATCC 20628 dyrkes i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, 5 nitrogen, L-leucin og uorganiske salte under submerse aerobe gæringsbetingelser, hvorpå den dannede a-iso-propylæblesyre udvindes fra mediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som carbonkilde anvendes D-glucose.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at der som carbonkilde anvendes enzymatisk hydrolyseret majsmel.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at der som L-leucin- 13 kilde anvendes L-leucin selv.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de forudgående krav, kendetegnet ved, at a-isopropylæble-syren udvindes ved methylethylketon-ekstraktion af gæringsvæsken ved pH 1,0-2,0.