DK157170C - Concentrate of the anti-haemophilic Factor VIII and method of preparation thereof - Google Patents

Description

iin

DK 157170 CDK 157170 C

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art. til fremstilling af et koncentrat af den anti-hæmofi le Faktor VIII, også kaldet AHF.The present invention relates to a method of the kind set forth in claim 1. to produce a concentrate of the anti-haemophilic Factor VIII, also called AHF.

Det er kendt, at blodets evne til at koagulere styres af et system af koagulationsproteiner, hvoraf AHF eller Faktor VIII er en vigtig komponent.It is known that the blood's ability to coagulate is controlled by a system of coagulation proteins, of which AHF or Factor VIII is an important component.

Personer med hæmofili-A eller blødersygdom har helt eller delvis mistet evnen til at producere AHF. Til behandling af denne sygdom injiceres AHF-holdige præparater, og det har derfor betydning at råde over præparater indeholdende passende høje koncentrationer af AHF og med lavest muligt indhold af andre proteiner, såsom fibrinogen og immunglobuliner.People with haemophilia-A or haemophilia have completely or partially lost the ability to produce AHF. For the treatment of this disease, AHF-containing preparations are injected, and it is therefore important to have preparations containing suitably high concentrations of AHF and with the lowest possible content of other proteins, such as fibrinogen and immunoglobulins.

Især ved behandling af inhibitorpatienter, d.v.s. patienter, der producerer antistoffer mod AHF, og som derfor skal have præparatet tilført i overskud, med høje doser af AHF, er det vigtigt, at den specifikke aktivitet (enh. AHF/mg protein) er høj, idet en tilførsel af "andre proteiner" i større mængder kan fremkalde uønskede bivirkninger. Ved 1 AHF enhed forstås faktor VIII aktiviteten af 1 ml normalt blodplasma. Bivirkninger ved AHF-behand-ling forårsaget af immunglobuliner er f.eks. beskrevet af Tilsner et al., Munch. Med. Wschr. 124 (1982) nr.Especially in the treatment of inhibitor patients, i.e. in patients who produce antibodies to AHF and who therefore need to have the preparation in excess, with high doses of AHF, it is important that the specific activity (unit of AHF / mg protein) is high as a supply of "other proteins" "in greater quantities can cause unwanted side effects. By 1 AHF unit is meant the factor VIII activity of 1 ml of normal blood plasma. Side effects of AHF treatment caused by immunoglobulins are e.g. described by Tilsner et al., Munch. With. Wschr. 124 (1982) no.

22, p. 553-557.22, pp. 553-557.

AHF udvindes normalt af det såkaldte kryopræcipitat, der hovedsageligt består af fibrinogen, albumin, IgG og IgM, mens AHF udgør mindre end 1¾ af den totale proteinmængde. Den specifikke aktivitet af et kryopræcipitat er typisk 0,1 - 0,3 enh. AHF/mg protein.AHF is usually extracted from the so-called cryoprecipitate, which consists mainly of fibrinogen, albumin, IgG and IgM, while AHF constitutes less than 1¾ of the total amount of protein. The specific activity of a cryoprecipitate is typically 0.1 - 0.3 unit. AHF / mg protein.

Det er kendt, at man kan fjerne en del af det unødvendige 2It is known that one can remove part of the unnecessary 2

DK 157170 CDK 157170 C

protein ved fældning med glycin eller po1yethylengiyco1 (PEG). Eventuelt kan fældning udføres flere gange, først med det ene og derefter med det andet fældningsmidde-i.protein by precipitation with glycine or polyethylene glycol (PEG). Optionally, precipitation can be performed several times, first with one and then with the other precipitant.

Det har således længe været kendt at fælde AHF med ca.Thus, it has long been known to trap AHF by approx.

5 2 M glycin ved lav temperatur, jfr. Webster et al., se Arner. J. Med. Sc. 250, nr. 6, p. 643-650 (1965).5 2 M glycine at low temperature, cf. Webster et al., See Arner. J. Med. Sc. 250, No. 6, pp. 643-650 (1965).

Webster anvendte et kryopræcipitat, som opløstes i vand og fraktioneredes ved lav temperatur (< 10°C) med stigende koncentrationer af glycin indtil 2,3 molær. Ved denne 10 type fældning udnyttes, at AHF i kulden udfældes sammen med fibrinogen ved tilsætning af glycin. Herved opnås en specifik aktivitet på 0,3 - 0,5 enh. AHF/mg protein.Webster used a cryoprecipitate which was dissolved in water and fractionated at low temperature (<10 ° C) with increasing concentrations of glycine up to 2.3 molar. In this type of precipitation, it is utilized that AHF in the cold precipitates with fibrinogen by the addition of glycine. Hereby a specific activity of 0.3 - 0.5 unit is obtained. AHF / mg protein.

Fra beskrivelsen til EP patentskrift nr. 32655, er det 15 kendt, at man ved at gennemføre fraktioneringen af genop løst kryopræcipitat med 2M glycin som fældningsmiddel ved højere temperaturer, såsom 30-45°C, først får udfældet en stor del af de andre proteiner, såsom fibrinogen, således at AHF forbliver i supernatanten, hvorfra det 20 kan udvindes.From the specification of EP Patent No. 32655, it is known that by performing the fractionation of redissolved cryoprecipitate with 2M glycine as a precipitant at higher temperatures, such as 30-45 ° C, a large part of the other proteins is first precipitated. , such as fibrinogen, so that the AHF remains in the supernatant from which it can be recovered.

Når PEG anvendes som fældningsmiddel, foretages hyppigst en fraktioneret PEG-fældning, hvor hovedparten af fibrino-genet og noget IgM fjernes ved fældning med lav PEG-koncentration (2-6S), hvorefter AHF udfældes fra den 25 albuminholdige supernatant med høj PEG-koncentration (5-15¾). Sådanne PEG/PEG-fældninger er beskrevet af bl.a. Newman et al., Br i t, 3 , Haema t o logy 2_1 , 1972, p.When PEG is used as a precipitant, a fractional PEG precipitation is most often performed, with the majority of the fibrino gene and some IgM removed by low PEG concentration (2-6S) precipitation, after which AHF is precipitated from the 25 high albumin-containing PEG concentration supernatant. (5-15¾). Such PEG / PEG precipitates are described by e.g. Newman et al., Br i t, 3, Haema t o logy 2_1, 1972, p.

1; US patentskrift nr. 3.652.530; DK patentskrift, nr.1; U.S. Patent No. 3,652,530; DK patent publication no.

146 895, FR patentskrift nr. 2.460.305, DK patentansøgning 30 nr. 3602/81. Ved disse metoder opnås et AHF-koncentrat med en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.146,895, FR Patent No. 2,460,305, DK Patent Application 30 No. 3602/81. By these methods, an AHF concentrate with a specific activity of 1-3 units / mg protein is obtained.

Ifølge US patentskrift nr. 4 027 013 (Bick et al.) befries en blanding indeholdende koagulerbart fibrinogen og Faktor VIII, der ud fra eksemplerne må antages at være genopløst 3According to U.S. Patent No. 4,027,013 (Bick et al.), A mixture containing coagulable fibrinogen and Factor VIII is released which, from the Examples, is presumed to be redissolved 3

DK 157170 CDK 157170 C

kryopræcipitat, for 90 % af fibrinogenindholdet ved fældning med en b1okcopo1ymer af "Pluronic" ® typen, idet man i en mindre foretrukken udførelsesform,-der fører til væsentligt lavere udbytter, også kan anvende PEG.cryoprecipitate, for 90% of the fibrinogen content by precipitation with a "Pluronic" ® type copolymer, in which a less preferred embodiment leads to substantially lower yields, PEG can also be used.

Supernatanten fra den første fibrinogenfældning behandles derpå med højere koncentrationer af "Pluronic" ® til udfældning af faktor VIII og residualt fibrinogen.The supernatant from the first fibrinogen precipitate is then treated with higher concentrations of "Pluronic" ® to precipitate factor VIII and residual fibrinogen.

Det faktor V 111-holdige bundfald genopløses i mere koncentreret form og behandles derpå med et thrombinmimeti sk enzym, der angiveligt specifikt koagulerer den totale mængde residual fibrinogen, men ikke i væsentlig grad påvirker faktor V111's biologiske aktivitet. Dette sidste er dog ikke nærmere dokumenteret.The factor V111-containing precipitate is redissolved in more concentrated form and then treated with a thrombin mimetic enzyme which reportedly specifically coagulates the total amount of residual fibrinogen but does not significantly affect the biological activity of factor V111. However, this last is not further documented.

Det er vigtigt at bemærke, at Bick for at stabilisere faktor VIII under den efterfølgende 1yofi 1isering tilsætter albumin, hvilket ikke er tilfældet ved lyofilisering af koncentratet fremstillet ifølge opfindelsen.It is important to note that in order to stabilize factor VIII during subsequent lyophilization, Bick adds albumin, which is not the case in lyophilization of the concentrate prepared according to the invention.

Processer med flertrinsfældninger, hvor mere end et fældningsmiddel anvendes, er ligeledes kendt. F.eks. kan glycinfældning ved lav temperatur udføres før eller efter PEG/PEG-fældninger, evt. kan glycinfældninger udføres både før og efter PEG/PEG-fældningerne. Dette er beskrevet i US patentskrift nr. 3 682 881 og US patentskrift 3.631.018. Almindeligvis opnås herved præparater med en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.Multistage precipitation processes in which more than one precipitant is used are also known. For example. For example, low temperature glycine precipitation can be performed before or after PEG / PEG precipitation, possibly For example, glycine precipitates can be performed both before and after the PEG / PEG precipitates. This is described in U.S. Patent No. 3,682,881 and U.S. Patent No. 3,631,018. Generally, compositions having a specific activity of 1-3 units / mg protein are hereby obtained.

Når der i denne sammenhæng fældes med glycin ved lav temperatur, udnyttes det AHF-holdige bundfald, d.v.s. at der ved efterfølgende PEG-fældninger på genopløst AHF-holdigt præcipitat kun er en lav koncentration af glycin i opløsningen.When precipitated with glycine at low temperature in this context, the AHF-containing precipitate, i.e. that in subsequent PEG precipitates on redissolved AHF-containing precipitate there is only a low concentration of glycine in the solution.

DK 157170 CDK 157170 C

kk

Anvendes glycin ved høj temperatur i forbindelse med PEG-fældning, udføres først en glycinfældning, der efterlader AHF i supernatanten, hvor koncentrationen -af glycin er høj, og derefter fældes AHF derfra med en PEG-fældning 5 ved høj PEG-koncentrati on. Herved kan opnås en specifik aktivitet på 1 - 3 enh./mg protein.If high temperature glycine is used in conjunction with PEG precipitation, a glycine precipitate is first left leaving the AHF in the supernatant where the concentration of glycine is high, and then the AHF is precipitated therefrom with a PEG precipitate 5 at high PEG concentration. Hereby a specific activity of 1 - 3 units / mg protein can be obtained.

Det ved denne type glycin/PEG-fældning opnåede koncentrat ligner et koncentrat opnået ved PEG/PEG-fældning. Som det fremgår af tabel 1, indeholder 1. fældningssuperna-10 tant mere IgM og IgG efter en varm fældning med 2 MThe concentrate obtained by this type of glycine / PEG precipitate is similar to a concentrate obtained by PEG / PEG precipitation. As shown in Table 1, the 1st precipitate supernatant contains more IgM and IgG after a warm 2 M precipitation

glycin end efter en fældning med lav PEG-koncentration (4¾). Efter slutfældningen med høj PEG-koncentration (9¾) indeholder koncentratet fra glycin/PEG-fældningen imidlertid mindre IgM og IgG end koncentratet fra PEG/-15 PEG-fældningen.glycine than after a low PEG concentration precipitate (4¾). However, after the high PEG concentration (9¾) final precipitate, the glycine / PEG precipitate concentrate contains less IgM and IgG than the PEG / -15 PEG precipitate concentrate.

TABEL 1TABLE 1

Sammenligning mellem PEG/PEG- og varm qlycin/PEG- fældning af AHF fra genopløst kryopræcipitat Fraktion » AHF ¾ IgM S IgG Kr yopræcipi tat 100 100 100 1. PEG, 4 ?0, supernatant 72 38 55 PEG/PEG, 4¾. 9¾ koncen-t ra t 40 24 15 2M glycin supernatant 68 76 79 2M qlycin/PEG, 9S, koncentrat 36 18 8Comparison between PEG / PEG and hot glycine / PEG precipitation of AHF from redissolved cryoprecipitate Fraction »AHF ¾ IgM S IgG Kr yop Precipitate 100 100 100 1. PEG, 4? 0, supernatant 72 38 55 PEG / PEG, 4¾. 9¾ Concentrate 40 24 15 2M Glycine Supernatant 68 76 79 2M Qlycine / PEG, 9S, Concentrate 36 18 8

Arsagen hertil er ikke tidligere erkendt, men det må antages, at den polære aminosyre i giycinsupernatanten virker indsaltende, især på basiske proteiner, således at IgM og IgG ikke så let udfældes med PEG alene. Det 20 ved glycin/PEG-fældningen opnåede koncentrat har dog stadig et uønsket højt indhold af fibrinogen, IgG og IgM, jfr. tabel 2 nedenfor.The reason for this is not previously recognized, but it must be assumed that the polar amino acid in the giycin supernatant acts as a salting agent, especially on basic proteins, so that IgM and IgG are not readily precipitated by PEG alone. However, the concentrate obtained by the glycine / PEG precipitation still has an undesirably high content of fibrinogen, IgG and IgM, cf. Table 2 below.

55

DK 157170 CDK 157170 C

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et højrent, direkte lyofiliserbart AHF-koncentrat, der har en så høj opløselighed og specifik aktiv i-t et, at det kan indgives intravenøst i injektionsdoser på 1000 enheder opløst i 2-5 ml injektionsmedium, og som indeholder faktor V111-kompleksets anden bestanddel faktor VIII: RP, der virker stabiliserende på den koagulationsaktive faktor V111:C.The object of the present invention is to provide a high-purity, directly lyophilizable AHF concentrate which has such a high solubility and specific activity that it can be administered intravenously in injection units of 1000 units dissolved in 2-5 ml injection medium and containing factor V111 complex, second component of factor VIII: RP, which stabilizes the coagulation active factor V111: C.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.This is achieved by the method according to the invention, which is characterized by the characterizing part of claim 1.

Det bemærkes, at der ikke er en entydig sammenhæng mellem et AHF-koncentrats specifikke aktivitet og dets opløselighed, idet sidstnævnte afhænger af arten af øvrige proteiner, især fibrinogen, men at en høj specifik aktivitet alt andet lige også vil indebære en høj opløselighed.It should be noted that there is no clear correlation between the specific activity of an AHF concentrate and its solubility, the latter being dependent on the nature of other proteins, especially fibrinogen, but that otherwise a high specific activity would also imply a high solubility.

Fra US patentskrift nr. 4 361 509 (Zimmermann et al.) kendes ganske vist et faktor V111:C præparat, fremstillet ud fra plasma eller kommercielle faktor VIII koncentrater og som er befriet for faktor VIII:RP ved direkte immunadsorption på en søjle af agarosegel, hvortil der er koblet monoclonale antistoffer, der udviser høj affinitet over for faktor VIII:RP, men dog binder såvel faktor V111:C som VIIIrRP, og efterfølgende desorption af faktor V 111;C med en calciumholdig buffer. Zimmermann's Faktor V111;C koncentrat udviser en meget høj specifik aktivitet (ca. 2300 enh./mg) og en meget høj opløselighed (545-1172 enh./mg) i vandige injektionsmedier, men er som nævnt til forskel fra koncentratet ifølge opfindelsen også befriet for faktor VIIIrRP.It is known from U.S. Patent No. 4,361,509 (Zimmermann et al.) To a factor V111: C preparation prepared from plasma or commercial factor VIII concentrates and which is released from factor VIII: RP by direct immunosorption on a column of agarose gel. , to which are coupled monoclonal antibodies that exhibit high affinity for factor VIII: RP, yet bind both factor V111: C and VIIIrRP, and subsequent desorption of factor V 111; C with a calcium-containing buffer. Zimmermann's Factor V111; C concentrate exhibits a very high specific activity (about 2300 units / mg) and a very high solubility (545-1172 units / mg) in aqueous injection media, but, as mentioned, unlike the concentrate of the invention also liberated by factor VIIIrRP.

66

DK 157170 CDK 157170 C

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at man kan opnå et særlig rent AHF-præparat, indeholdende såvel faktor V111:C som VIII:RP, men som i det væsentlige er befriet for andre proteiner, især immung1 obu 1 i -ner, ved at fraktionere et kryopræcipitat med PEG på en sådan måde, at der først udfældes en væsentlig del, fortrinsvis mindst 80 %, af fibrinogenet, og at der i et efterfølgende trin fældes med mere PEG i nærværelse af et indsaltningsmiddel. Tilsætningen af indsalt-ningsmidlet medfører ikke i sig selv udfældninger, men på grund af tilstedeværelsen af indsaltningsmidlet modificeres betingelserne under den efterfølgende PEG-fæld-ning, således at der opnås en skarpere fraktionering, dvs. et renere AHF-koncentrat med en høj specifik aktivitet, jfr. Tabel 2 nedenfor. Den høje renhed bevirker at præparatet har en opløselighed på 200-500 enheder faktor VIII : C (AHF) pr. ml. Da en normal injektionsdosis er 1000 enheder, kan man således nøjes med ca. 2-5 ml injektionsmedium. Da opløseligheden af de bedste på markedet værende AHF-præparater angives at være 40-50 enheder pr. ml svarende til et injektionsvolumen på 25-20 ml, medfører præparatet fremstillet ifølge opfindelsen således en meget betydelig lettelse for patienten.The invention is based on the surprising realization that a particularly pure AHF preparation can be obtained, containing both factor V111: C and VIII: RP, but which is essentially liberated from other proteins, especially immunoglobulin 1, by fractionating a cryoprecipitate with PEG in such a way that a substantial portion, preferably at least 80%, of the fibrinogen is precipitated first and that in a subsequent step more PEG is precipitated in the presence of a salting agent. The addition of the salting agent does not in itself cause precipitation, but due to the presence of the salting agent, the conditions are modified during the subsequent PEG precipitation so that a sharper fractionation is obtained, ie. a cleaner AHF concentrate with a high specific activity, cf. Table 2 below. The high purity causes the composition to have a solubility of 200-500 units of factor VIII: C (AHF) per liter. ml. As a normal injection dose is 1000 units, it is thus sufficient to approx. 2-5 ml injection medium. As the solubility of the best AHF preparations on the market is stated to be 40-50 units per day. Thus, in accordance with an injection volume of 25-20 ml, the preparation according to the invention provides a very considerable relief to the patient.

77

DK 157170 CDK 157170 C

TABEL 2TABLE 2

Effekt af g 1yc inti 1sætn inq under PEG/PEG-fældninq fra qenoplost kryopræcipitatEffect of g1yc inti set insert in PEG / PEG precipitation from dissolved cryoprecipitate

Proces AHF enh./mq % IqG % IqM % F i b r Kryopræcipitat 0,32 100 100 100 4% PEG/9?ό PEG 2,53 15 24 1 2M glycin/9?é PEG 2,27 Θ 18 2 4» PEG/12 % PEG + 2M glycin 4,36 4 13 0,5 Ved fældningen ifølge opfindelsen er glyci n således anvendt som indsaltninqsmiddel, idet det stabiliserer de uønskede proteiner ved at holde dem i opløsning, hvorimod de hidtil kendte metoder udnytter glycins udsal-5 tende effekt på fibrinogen/AHF. Ved anvendelse af ind- saltningsmiddel under en PEG/PEG-fældning i henhold til krav 1 opnås altså en mere selektiv udfældning af AHF .Process AHF unit / m2% IqG% IqM% F in Cryoprecipitate 0.32 100 100 100 4% PEG / 9? EG PEG 2.53 15 24 1 2M glycine / 9? É PEG 2.27 Θ 18 2 4 »PEG / 12% PEG + 2M glycine 4.36 4 13 0.5 In the precipitate of the invention, glycine is thus used as a salting agent, it stabilizes the unwanted proteins by keeping them in solution, whereas the known methods utilize the glycine saline. inflammatory effect on fibrinogen / AHF. Thus, using a salting agent during a PEG / PEG precipitation according to claim 1, a more selective precipitation of AHF is obtained.

Uden at ville være bundet til nogen bestemt teori antages 10 det, at indsaltningsmidlets virkning beror på, at det forøger forskellen i overfladeladning mellem Faktor VIII og de øvrige proteiner, navnlig IgG.Without being bound by any particular theory, it is believed that the effect of the salting agent is because it increases the difference in surface charge between Factor VIII and the other proteins, in particular IgG.

Det er vigtigt at fjerne hovedparten af fibrinogenet i første trin, fordi AHF-præparatet ellers ville være 15 stærkt forurenet med fibrinogen, og fordi tilstedeværelsen af fibrinogen i andet trin vil modvirke indsa1tnings-effekten og hindre en selektiv udfældning af Faktor VIII.It is important to remove most of the fibrinogen in the first step because otherwise the AHF preparation would be highly contaminated with fibrinogen and because the presence of fibrinogen in the second step would counteract the insertion effect and prevent a selective precipitation of Factor VIII.

Som indsaltningsmiddel ved fremgangsmåden ifølge opfin-20 delsen benyttes hensigtsmæssigt en aminosyre, især basiske aminosyrer, fortrinsvis lysin eller arginin tilsat i form af hydrochlori det. Andre anvendelige aminosyrer er f.eks. histidin, samt polære aminosyrer, såsom serin, glutaminsyre, glycin og £-aminohexansyre. Andre anvendelige 8As the salting agent of the process according to the invention, an amino acid, especially basic amino acids, preferably lysine or arginine added in the form of hydrochlorine is suitably used. Other useful amino acids are e.g. histidine, as well as polar amino acids such as serine, glutamic acid, glycine and β-aminohexanoic acid. Other applicable 8

8DK 157170 C8DK 157170 C

indsa1tningsmidler er kulhydrater, fortrinsvis monoeller disaccharider f.eks. glucose, og saccharose, men også oligosaccharider samt sukkeralkoholer, f.eks. snr-bitol og glycerol.Inserting agents are carbohydrates, preferably mono or disaccharides e.g. glucose, and sucrose, but also oligosaccharides and sugar alcohols, e.g. snr-bitol and glycerol.

5 En oversigt er givet i Tabel 3.5 An overview is given in Table 3.

TABEL 3TABLE 3

Effekt af indsaltninqsmidler på PEG/PEG-fældninq af AHF fra qenopløst kryopræcipitatEffect of salting agents on PEG / PEG precipitation of AHF from redissolved cryoprecipitate

Indsaltningsmiddel Spec. aktivitet S udbytte af _enh ♦ /mg_AHF fra plasmaDesiccant Spec. activity S yield of _enh ♦ / mg_AHF from plasma

Intet 2,53 18 2M glycin 4,36 17 0,5M lysin, HC1 00 O 18 0,5M arginin, HC1 7,0 14 1,0M £. -aminohexansyre 5,0 10 1,5M glucose 3,85 18 1, OM saccharose 3,35 20Nothing 2.53 18 2M glycine 4.36 17 0.5M lysine, HCl 00 O 18 0.5M arginine, HCl 7.0 14 1.0M £. -aminohexanoic acid 5.0 10 1.5M glucose 3.85 18 1, OM sucrose 3.35 20

Det foretrukne indsaltningsmiddel er lysin-HCl. På tegningen er vist lysins indflydelse på PEG/PEG-fældning af AHF udtrykt som henholdsvis enh. AHF/mg protein (fig. 1) og % udbytte i forhold til kryopræcipitatet ved for-10 skellige lysinkoncentrationer (fig. 2). Lysin tilsættes fortrinsvis i koncentrationer på 0,1 - 0,9, især 0,3 - 0,8, helst 0,5 - 0,7 mol/1.The preferred salting agent is lysine HCl. The drawing shows the influence of lysine on PEG / PEG precipitation of AHF expressed as unit, respectively. AHF / mg protein (Figure 1) and% yield relative to the cryoprecipitate at different lysine concentrations (Figure 2). Lysine is preferably added at concentrations of 0.1 - 0.9, especially 0.3 - 0.8, most preferably 0.5 - 0.7 mol / l.

Som det fremgår af fig. 1 er der proportionalitet mellem tilsat lysinmængde og specifik aktivitet af slutproduk-15 tet, men selv små lysinmængder har en klar effekt. Som det ses af fig. 2 falder udbyttet af AHF ved den anvendte PEG-koncentration imidlertid, hvis der anvendes mere end 0,75M lysin, idet denne mængde lysin også virker indsaltende på AHF.As shown in FIG. 1, there is proportionality between added lysine amount and specific activity of the final product, but even small amounts of lysine have a clear effect. As seen in FIG. 2, however, the yield of AHF decreases at the PEG concentration used if more than 0.75 M lysine is used, this amount of lysine also salting on AHF.

99

DK 157170 CDK 157170 C

Et andet foretrukket indsaltningsmiddel er arginin-HCl hvis indflydelse på PEG/PEG-fældningen af AHF fremgår af nedenstående tabel 4, hvoraf det ses, at tilfreds stillende udbytter opnås ved koncentrationer på 0,2 5 - 0,8. Under hensyn til udbyttet er den foretrukne mængde 0,3 - 0,5, især 0,4 mol/1.Another preferred salting agent is arginine HCl whose influence on the PEG / PEG precipitation of AHF is shown in Table 4 below, which shows that satisfactory yields are obtained at concentrations of 0.2 5 - 0.8. Considering the yield, the preferred amount is 0.3 - 0.5, especially 0.4 mol / l.

TABEL 4TABLE 4

Arqinins i ndflydelse på PEG/PEG- fældninq af AHF arqinin/1 % udbytte fra plasma enh. AHF/mq protein 0 20 2,3 0,2 20 4,9 0,4 17 6,4 0,6 14 6,1 o 00 4 4,6Arqinins affect PEG / PEG precipitation of AHF arquinine / 1% yield from plasma unit. AHF / mq protein 0 20 2.3 0.2 20 4.9 0.4 17 6.4 0.6 14 6.1 o 00 4 4.6

De anvendte koncentrationer af PEG og indsaltningsmiddel samt pH under fældningen afhænger især af det anvendte indsaltningsmiddel, idet det som generel regel kan siges, 10 at de mere ladede indsaltningsmidler kan anvendes i mindre koncentrationer. Den valgte indsaltningsmiddelkon-centration hviler på et kompromis, idet man ved høje koncentrationer kan reducere IgG-mængden næsten fuldstændigt, men samtidig indsaltes også en del Faktor VIII, 15 hvorved udbyttet reduceres.The concentrations of PEG and the salting agent used, as well as the pH during the precipitation, depend in particular on the salting agent used, as it can generally be said that the more loaded salting agents can be used in smaller concentrations. The selected saline concentration is based on a compromise, since at high concentrations it is possible to reduce the IgG amount almost completely, but at the same time also a portion of Factor VIII, which reduces the yield.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes PEG med en molekylvægt på 200-20.000, fortrinsvis 2.000-12.000, især 3.000-6.000, men PEG 3000 foretrækkes. PEG-koncen-trationen i det første fældningstrin er 2-6 vægt-Si, 20 fortrinsvis ca. 4 vægt-X og i det andet trin 6-20 vægt-50, fortrinsvis ca. 12 vægt-ϊί. pH under første fældningstrin kan være 6,0 - 8,5, fortrinsvis 6,2 - 6,6, især ca.In the process of the invention, PEG having a molecular weight of 200-20,000, preferably 2,000-12,000, especially 3,000-6,000 is used, but PEG 3000 is preferred. The PEG concentration in the first precipitation step is 2-6% by weight Si, preferably about 4 weight-X and in the second step 6-20 weight-50, preferably approx. 12 weight-weight. The pH during the first precipitation step may be 6.0 - 8.5, preferably 6.2 - 6.6, in particular approx.

6,4, og under andet trin 5,0 - 8,5, fortrinsvis 6,0 - 6,6, især ca. 6,3.6.4, and in the second step 5.0 - 8.5, preferably 6.0 - 6.6, in particular approx. 6.3.

1010

10DK 157170 C10DK 157170 C

Temperaturen i det første fældningstrin kan være 6 -22 °C, fortrinsvis 18 - 22 °C. I andet fældningstrin er temperaturen også fortrinsvis 18 - 22 °C (stuetemperatur).The temperature of the first precipitation step may be 6 -22 ° C, preferably 18-22 ° C. In the second precipitation step, the temperature is also preferably 18 to 22 ° C (room temperature).

Ved udvindingen af det omhandlede Faktor VIII koncentrat kan man anvende kryopræcipitat fra humant blodplasma eller andre Faktor VIH-holdige blodfraktioner, ligesom man kan anvende plasmafraktioner fra dyrearter, eksempelvis svin.In the extraction of the present Factor VIII concentrate, cryoprecipitate from human blood plasma or other Factor VIH-containing blood fractions can be used, as well as plasma fractions from animal species, for example pigs.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere ved hjælp af nogle eksempler, der også illustrerer oparbejdningen af koncentratet. Til præparatfremsti 11 ing kan AHF-opløsningen om ønsket underkastes en varmebehandling i 10 timer ved 60°C i nærværelse af en passende stabilisator såsom en blanding af glycin og saccharose for at opnå en hepatitissikring og/eller om ønsket 1yofi 1 i se res.The process according to the invention will be explained in the following by means of some examples which also illustrate the working up of the concentrate. For preparation, the AHF solution may, if desired, be subjected to heat treatment for 10 hours at 60 ° C in the presence of a suitable stabilizer such as a mixture of glycine and sucrose to obtain hepatitis protection and / or, if desired, 1of 1 in view.

EKSEMPEL 1EXAMPLE 1

Kryopræcipitat fra 600 ml human blodplasma indeholdende 240 enheder Faktor VIII:C genopløses i 28 ml citrat/glu-cosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med A^Oj. Derefter tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?é PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i c itrat/g 1ucose-NaC1, pH 7,8. Det genopløste bundfald, der indeholdt 112 enheder faktor V11 I:C og 9 mg total-protein, har således en specifik aktivitet på 12 enheder Faktor V11 I:C (AHF) pr. mg protein, og udbyttet af Faktor 11Cryoprecipitate from 600 ml of human blood plasma containing 240 units Factor VIII: C is redissolved in 28 ml of citrate / glucose buffer and freed from prothrombin complex by adsorption with A 2 O 2. Then 4 wt% PEG 3000 is added. The pH is adjusted to 6.4 with 0.5 M HCl and the mixture is incubated for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and lysine HCl is added to a concentration of 0.55 mol / l. An additional 8% by weight of PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1 M NaOH. After 45 minutes incubation at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in c itrate / g of 1ucose-NaCl, pH 7.8. Thus, the redissolved precipitate containing 112 units of factor V11 I: C and 9 mg of total protein has a specific activity of 12 units of Factor V11 I: C (AHF) per ml. mg of protein, and the yield of Factor 11

DK 157170 CDK 157170 C

fra plasma er 20?ί. Der blev ikke foretaget opløselig-hedsbestemmelse, men det må antages at opløseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml, jvf. eksempel 5 og 6.from plasma is 20? No solubility determination was made, but it must be assumed that the solubility is at least 200 units Factor VIII: C / ml, cf. Examples 5 and 6.

5 Disse resultater er optaget i nedenstående tabel 5 sam men med resulater fra sammenligningsforsøg uden lysintil-sætning. Tabellen viser, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan opnås en væsentlig forøgelse i specifik aktivitet og en reduktion af indholdet af immunglobulin 10 Gi forhold til PEG/PEG fældninger uden tilstedeværelse af indså 1tningsmiddel.5 These results are listed in Table 5 below, together with results from comparison experiments without light addition. The table shows that the process of the invention can achieve a significant increase in specific activity and a reduction in the content of immunoglobulin 10 Gi relative to PEG / PEG precipitates without the presence of seeding agent.

EKSEMPEL 2 30 ml kryoopløsning opnået analogt med eksempel 1 og adsorberet med A^Oj, tilsættes 4 vægtprocent PEG 3000.EXAMPLE 2 30 ml of cryo solution obtained by analogy with Example 1 and adsorbed with A 2 O 2 are added 4% by weight PEG 3000.

13 pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inku beres 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og "indsaltningsmiddel" tilsættes. Herefter tilsættes yderligere 8 vægt-% PEG 3000, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inku-20 bation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i citrat/glucose-NaCl, pH 7,8.13 pH is adjusted to 6.4 with 0.5 M HCl and the mixture is incubated for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and "saline" is added. Then an additional 8% by weight of PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1 M NaOH. After incubation for 45 minutes at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in citrate / glucose NaCl, pH 7.8.

Tabel 6 angiver de opnåede resultater for forskellige indsaltningsmidler. Der blev ikke foretaget opløselig-25 hedsbestemmelser, men det antages at opløseligheden er mindst 200 enheder Faktor VIII:C/ml, jvf. eksempel 5 og 6.Table 6 gives the results obtained for different salts. No solubility determinations were made, but it is assumed that the solubility is at least 200 units Factor VIII: C / ml, cf. Examples 5 and 6.

12DK 157170 C12DK 157170 C

η = 3 (middeltal af 3 Enheder mg protein deraf IgG % faktor Specifik Proces forsøg) Faktor V111 : C i slutpro- mg V/111 : C aktivitet i slutprodukt produkt fra plasma enheder/ _______mg proteinη = 3 (average of 3 Units mg protein thereof IgG% factor Specific Process experiment) Factor V111: C in final prog mg V / 111: C activity in final product product from plasma units / _______mg protein

so oco <r <r CM CMso oco <r <r CM CM

Os CO O *"H I CMUs CO O * "H I CM

ΓΛ O O O f—i KSΓΛ O O O f — i KS

C •H O \ to •H -U U. 4-> L_ • Ή 0) o Ή X) u O •*H to α o -L> X α c σ LO CD ω EC • H O \ to • H -U U. 4-> L_ • Ή 0) o Ή X) u O • * H to α o -L> X α c σ LO CD ω E

CD E U CO O CD Jj (J H J* ·· D. CD *-h L. H (D HH U > C- CD CT>CD E U CO O CD Jj (J H J * ·· D. CD * -h L. H (D HH U> C- CD CT>

CD U 0) CPX ECD U 0) CPX E

O Os o CM •s •s •v •K ·> 20 SOO Os o CM • s • s • v • K ·> 20 SO

Os CO OsOs CO Os

CM CMCM CM

SO OK u _J -j Q.4-1 u o OJ ω u D Z> < G. X CO O CO CO o- Os cn u o *-H ΓΆ Γ-» ε •H CL· i—1 CM CJ 4J «· JC HH D HH X HH O > u o u, Cl <-H ω u HJ X! O D II ω -U «-Η Os <r CM .c J* CO CO CM O o »-H c CD o O eH •"H H O LJ Li- •iH *-H «“Ί έ® 00 r-i CM LJ CD «—1 O U CJ CO H CL· X CM ω CD CD 1 O X) o? LJ U c o XJ CM CL O. -*H •*H \ rø X ε ^H £? > 0) U) CM CM *-H > er CO e-H c X .u •H C | 1 tA E C ♦*H ιΛ 0) 4J u CD CD CD HJ «“H >N LJ LJ U O CO CO -L> Q_ CL· Q_ Q) CO \ ω CP X jO XI HJ δΐ έ? to c O c X E K t—1 ε ♦H CM lA CM CJ X i C •H COSO OK u _J -j Q.4-1 uo OJ ω u DZ> <G. X CO O CO CO o- Os cn uo * -H ΓΆ Γ- »ε • H CL · i — 1 CM CJ 4J« · JC HH D HH X HH O> uou, Cl <-H ω u HJ X! OD II ω -U «-Η Os <r CM .c J * CO CO CM O o» -H c CD o O eH • "HHO LJ Li- • iH * -H« "Ί έ® 00 ri CM LJ CD «—1 OU CJ CO H CL · X CM ω CD CD 1 OX) o? LJ U co XJ CM CL O. - * H • * H \ rø X ε ^ H £?> 0) U) CM CM * - H> is CO eH c X .u • HC | 1 tA EC ♦ * H ιΛ 0) 4J u CD CD CD HJ «“ H> N LJ LJ UO CO CO -L> Q_ CL · Q_ Q) CO \ ω CP X jO XI HJ δΐ έ? To c O c XEK t — 1 ε ♦ H CM lA CM CJ X i C • H CO

CM Os CM -HCM Os CM -H

lala

Os A* CMOs A * CM

,0M saccharose 123 , 35M arqinin_108, 0M sucrose 123, 35M arqinin_108

OISLAND

1313

DK 157170 CDK 157170 C

EKSEMPEL 3EXAMPLE 3

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genopløses i 100 ml c itrat/g 1ucosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-5K PEG 5 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og arginin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,40 mol/1. Yderligere 8 vægt-% PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M 10 NaOH. Efter inkubation 45 minutter ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 20 ml citrat/saccharose/NaC1, pH 7,8. Koncentratet indeholder 360 enheder Faktor V111:C og 52 mg protein (specifik aktivitet 7 enh./mg). Der blev ikke foretaget 15 bestemmelse af opløseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.Cryoprecipitate from 2.5 L of plasma is redissolved in 100 ml of c itrate / g 1ucose buffer and freed from prothrombin complex by adsorption with Al 2 O 2. 4 weight-5K PEG 5,000 is added. The pH is adjusted to 6.4 with 0.5M HCl and the mixture is incubated for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and arginine HCl is added to a concentration of 0.40 mol / l. An additional 8% by weight of PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1M 10 NaOH. After incubation for 45 minutes at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in 20 ml of citrate / sucrose / NaCl, pH 7.8. The concentrate contains 360 units Factor V111: C and 52 mg protein (specific activity 7 units / mg). No solubility of the concentrate was determined, but at least 200 units / ml are assumed, cf. Examples 5 and 6.

EKSEMPEL 4EXAMPLE 4

Kryopræcipitat fra 2,5 1 plasma genopløses i 100 ml 20 c itrat/glucosepuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-K PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1, og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin-HCl tilsættes til 25 en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-* PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1M NaOH. Efter inkubation 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 5 ml citrat /saccha rose/NaC 1 , pH 7,8. Koncentratet indeholder 30 460 enh. Faktor V111 : C og 30 mg protein (specifik aktivi tet 15 enh./mg). Der blev ikke foretaget bestemmelse af opløseligheden af koncentratet, men der antages at være mindst 200 enheder/ml jvf. eksempel 5 og 6.Cryoprecipitate from 2.5 L plasma is redissolved in 100 ml of 20 c itrate / glucose buffer and freed from prothrombin complex by adsorption with Al 2 O 2. 4 wt K PEG 3000 is added. The pH is adjusted to 6.4 with 0.5M HCl and the mixture is incubated for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and lysine HCl is added to a concentration of 0.55 mol / l. An additional 8 wt * PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1M NaOH. After incubation 45 min. at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in 5 ml of citrate / saccha rose / NaC 1, pH 7.8. The concentrate contains 30 460 units. Factor V111: C and 30 mg protein (specific activity 15 units / mg). No solubility of the concentrate was determined, but it is assumed to be at least 200 units / ml, cf. Examples 5 and 6.

1414

14DK 157170 C14DK 157170 C

EKSEMPEL 5EXAMPLE 5

Kryopræcipitat fra 80 kg plasma genopløses i 2500 ml c itrat-puffer og befries for prothrombinkomplex ued adsorption med A^Oj. Der tilsættes 4 vægt-X PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5 M HC1, og blandingen inkuberer 30 minutter ved stuetemperatur. Udfældet protein fjernes ved centrifugering, og lysin- HC1 tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-X PEG 3000 tilsættes, og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation på 45 min. ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 60 ml citrat/saccharose/NaCl. Opløsningen sterilfiltreres og dispenseres i 15 hætteglas. Efter frysning og frysetørring indeholder hvert hætteglas 1000 enh.Cryoprecipitate from 80 kg of plasma is redissolved in 2500 ml of c itrate buffer and freed from prothrombin complex without adsorption with A ^ Oj. 4 weight X PEG 3000 is added. The pH is adjusted to 6.4 with 0.5 M HCl and the mixture incubates for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and lysine HCl is added to a concentration of 0.55 mol / l. An additional 8 weight-X PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1 M NaOH. After incubation for 45 min. at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in 60 ml of citrate / sucrose / NaCl. The solution is sterile filtered and dispensed into 15 vials. After freezing and freeze-drying, each vial contains 1000 units.

AHF, med en specifik aktivitet på 37 enh./mg protein.AHF, with a specific activity of 37 units / mg protein.

Da de i alt 15.000 enheder AHF er udvundet af 60 ml opløsning, kan det fastslås, at opløseligheden er mindst 250 enheder/ml.As the total of 15,000 units of AHF is extracted from 60 ml of solution, it can be determined that the solubility is at least 250 units / ml.

EKSEMPEL 6EXAMPLE 6

Kryopræcipitat fra 13 1 plasma genopløses i 525 ml ci-trat/glucosebuffer og befries for prothrombinkomplex ved adsorption med Al^O^. Der tilsættes 4 vægt-% PEG 3000. pH indstilles til 6,4 med 0,5M HC1 og blandingen inkuberes 30 minutter ved stuetemperatur.Udfældet protein fjernes ved centrifugering og lysin-HCl tilsættes til en koncentration på 0,55 mol/1. Yderligere 8 vægt-?i PEG 3000 tilsættes og pH justeres til 6,3 med 0,1 M NaOH. Efter inkubation 45 min ved stuetemperatur isoleres bundfaldet ved centrifugering og genopløses i 2,1 ml citrat/saccharose/NaCl, pH 7,8. Koncentratet, som er på 3,1 ml, indeholder 2180 enh. FVIII.-C og 81 mg protein opløseligheden er således 703 enh/ml og den specifikke 15Cryoprecipitate from 13 L plasma is redissolved in 525 ml of citrate / glucose buffer and freed from prothrombin complex by adsorption with Al 2 O 2. 4% by weight of PEG 3000 is added. The pH is adjusted to 6.4 with 0.5M HCl and the mixture is incubated for 30 minutes at room temperature. Precipitated protein is removed by centrifugation and lysine HCl is added to a concentration of 0.55 mol / l. An additional 8% by weight of PEG 3000 is added and the pH is adjusted to 6.3 with 0.1 M NaOH. After 45 min incubation at room temperature, the precipitate is isolated by centrifugation and redissolved in 2.1 ml of citrate / sucrose / NaCl, pH 7.8. The 3.1 ml concentrate contains 2180 units. Thus, FVIII.-C and 81 mg of protein solubility are 703 units / ml and the specific 15

DK 157170 CDK 157170 C

aktivitet 27 enh/mg. EKSEMPEL 7 I dette eksempel undersøges det, hvorvidt den indsaltede virkning af glycin kunne forbedres ved tilsætning af 5 NaCl, der hæver ionstyrken, og hvorvidt NaCl, der er et kendt indsaltningsmiddel, alene har tilstrækkelig ind-saltende virkning under en PEG-fældning til at føre til et koncentrat af den her omhandlede art.activity 27 units / mg. EXAMPLE 7 In this example, it is investigated whether the salted action of glycine could be enhanced by the addition of 5 NaCl which raises the ionic strength and whether NaCl, a known salting agent, has sufficient saline effect alone during a PEG precipitation to lead to a concentrate of the kind in question.

For yderligere at variere procesbetingelserne valgtes 10 det at gennemføre fældningen ved lav temperatur (6-9 °C).To further vary the process conditions, it was chosen to effect the low temperature precipitation (6-9 ° C).

50 g kryopræcipitat genopløses i 200 ml dest. h^O ved stuetemperatur. 12,3 ml 1,3 % A^O^ °9 9 PEG 3000 (3 %) tilsættes. pH justeres til 6,7 med 1M HAc og blandingen nedkøles til 9 °C. Efter nedkøling fjernes bundfald 15 ved centrifugering 15 min ved 9 °C. Yderligere 8¾ PEG, 2M glycin (13 %) og 14 % NaCl tilsættes, hvorefter pH justeres til 5,7 og blandingen nedkøles til 6 °C. Bundfaldet isoleres ved centrifugering i 15 min ved 6 °C og genopløses i 50 ml (1/5 kryo vol.) 5mM citrat, 0,13 20 M NaCl, 0,1 M glycin pH 7,3.50 g of cryoprecipitate is redissolved in 200 ml of dest. h ^ O at room temperature. 12.3 ml of 1.3% A₂O ^ 9 9 PEG 3000 (3%) is added. The pH is adjusted to 6.7 with 1M HAc and the mixture is cooled to 9 ° C. After cooling, precipitate 15 is removed by centrifugation for 15 min at 9 ° C. An additional 8¾ PEG, 2M glycine (13%) and 14% NaCl are added, after which the pH is adjusted to 5.7 and the mixture is cooled to 6 ° C. The precipitate is isolated by centrifugation for 15 min at 6 ° C and redissolved in 50 ml (1/5 cryo vol.) Of 5 mM citrate, 0.13 20 M NaCl, 0.1 M glycine pH 7.3.

Γ V11 I og proteinindholdet i det genopløste koncentrat var lav. Derfor blev det med varierende NaCl- og glycin-koncentrationer undersøgt, om indsaltningen som forventet skyldes glycin. Som det fremgår af nedenstående 16Γ V11 I and the protein content of the redissolved concentrate were low. Therefore, with varying NaCl and glycine concentrations, it was investigated whether, as expected, the salting is due to glycine. As shown in the 16 below

DK 157170 CDK 157170 C

tabel, udfældes F V/1 I I kun i ringe grad uden NaCl. NaCl tilsætning alene medfører imidlertid ikke øget proteinudfældning (som PEG tilsætning). Tværtimod virker Natl i høj grad indsaltende. Ved den lave temperatur medvir-5 ker glycin til at fælde FVIII, men den høje specifikke aktivitet kan ikke opnås uden NaCl tilsætning.Table, F V / 1 I I precipitates only slightly without NaCl. However, NaCl addition alone does not result in increased protein precipitation (like PEG addition). On the contrary, Natl seems to be highly saline. At the low temperature, glycine helps to precipitate FVIII, but the high specific activity cannot be achieved without NaCl addition.

Effekt af glycin og varierende NaCl koncentration O' /0 NaCl + 13 % glyci n -glycin mg* % FVIII:C Spec. akt. mg* S FVIII.-C spec.akt. protein udbytte enh/mg protein udbytte enh/mg 0 5,86 5 0,22 6,50 14,4 0,58 5 3,96 26 1,74 10 2,26 58 6,73 3,89 15,9 1,07 12 2,18 41 4,90 14 0,88 17 5,02 2,82 5,2 0,49Effect of glycine and varying NaCl concentration O '/ 0 NaCl + 13% glycine n -glycine mg *% FVIII: C Spec. act. mg * S FVIII.-C spec. protein yield unit / mg protein yield unit / mg 0 5.86 5 0.22 6.50 14.4 0.58 5 3.96 26 1.74 10 2.26 58 6.73 3.89 15.9 1 , 07 12 2.18 41 4.90 14 0.88 17 5.02 2.82 5.2 0.49

Kryopræc. 100 0,58 3» PEG/ A^Oj super natant 73 0,77Kryopræc. 100 0.58 3 »PEG / A ^ Oj super natant 73 0.77

* bestemt som E28O* determined as E28O

EKSEMPEL 8 (Bestemmelse af faktor VI11:RP-indholdet)EXAMPLE 8 (Determination of Factor VI11: RP Content)

Det fremgår af Zimmermann, US patentskrift nr. 4 361 509 10 at der for at opnå en adskillelse af de to komponenter i Faktor VIII komplexet må tages tilflugt til specifikke rensningsmetoder, såsom immunadsorption eller ionbytningskromatografi .It is apparent from Zimmermann, U.S. Patent No. 4,361,509, 10 that in order to achieve a separation of the two components of the Factor VIII complex, specific purification methods such as immunosorption or ion exchange chromatography must be resorted to.

I de foregående eksempler hvor der som udgangsmateriale 15 anvendes (opløst) kryopræcipitat, der således indeholder 17In the preceding examples, where (starting material 15) is used (dissolved) cryoprecipitate, thus containing 17

DK 157170 CDK 157170 C

Faktor V111-komplexet, foretages der på intet tidspunkt sådanne rensninger, og det er derfor evident for gennemsnits fagmanden, at de i eksemplerne opnåede Faktor VIII koncentrater stadig indeholder såvel koagulationsaktivt 5 Faktor VIII:C som von Wi1lebrand-faktoren Faktor VIII:RP.Factor V111 complex, no such purifications are carried out at any time, and it is therefore evident to those of ordinary skill in the art that the Factor VIII concentrates obtained in the Examples still contain both coagulation active Factor VIII: C and von Wi1lebrand Factor Factor VIII: RP.

Imidlertid blev der ikke gennemført målinger af Faktor VI11:RP-indholdet og det er derfor ikke muligt at indføje talværdier herfor i de eksisterende eksempler.However, no measurements of Factor VI11: RP content were performed and it is therefore not possible to include numerical values for this in the existing examples.

10 1110 11

Der er imidlertid gennemført Faktor VIII:C og Faktor VIIIrRP bestemmelse på en række AHF-præparater ifølge opfindelsen, der forhandles under betegnelsen "N0RDI0CT og som er fremstillet analogt med eksempel 5, altså i enhedsdoser på 1000 enheder Faktor VIII:C (+ 20¾).However, Factor VIII: C and Factor VIIIrRP determination has been carried out on a number of AHF compositions of the invention, which are marketed under the designation "NODDIOCT and prepared analogously to Example 5, ie in unit doses of 1000 units Factor VIII: C (+ 20¾) .

Der opnåedes følgende resultater:The following results were obtained:

Præparat FV111 :RP, Enh/dosis FVIII:C, Enh/dosis 44102 727 847 44203 936 1028 44301 825 1161 44302 942 1109 44401 566 909 44402 808 1034 FVIII-RP er bestemt ved raketimmunelektroforese med antistof fra DAKO (A 082). Som standard er anvendt en pool af normal plasma (<υ1 Enh F VII I-RP/ml).Preparation FV111: RP, Enh / dose FVIII: C, Enh / dose 44102 727 847 44203 936 1028 44301 825 1161 44302 942 1109 44401 566 909 44402 808 1034 FVIII-RP is determined by rocket immune electrophoresis with antibody A2 from D By default, a pool of normal plasma (<υ1 Enh F VII I-RP / ml) is used.

15 FV111:C er bestemt ved et-trinskoagulationsassay. Som standard er anvendt en pool af normal plasma (V1 Enh FVIII:C/ml) .FV111: C is determined by one-step coagulation assay. By default, a pool of normal plasma (V1 Enh FVIII: C / ml) is used.

2020

Claims (8)

18 DK 157170 C18 DK 157170 C 1. Fremgangsmåde til fremstilling af et koncentrat af den antihæmofile faktor VIII (AHF) i det væsentlige fri for denatureret AHF og andre i udgangsmaterialet for koncentratet tilstedeværende plasmaproteiner, men ikke for faktor VIII:RP og som udviser en opløselighed i et vandigt injektionsmedium på 200-500 enheder AHF/ml og en specifik aktivitet på 3,85-50 enheder AHF/mg protein stammende fra udgangsmaterialet for koncentratet, hvorved en opløsning af et kryopræcipitat fra blodplasma eller en anden faktor VIII-holdig blodfraktion renses til fjernelse af pro-thrombin og dernæst fraktioneres med polyethylenglycol, PEG, omfattende et trin til udfældning af hovedparten af fibrinogen ved hjælp af 2-6 vægt-% PEG 200-20.000 og et efterfølgende trin til udfældning af AHF, kendetegnet ved, at supernatanten fra den førstnævnte PEG-fældning fældes med 6-20 vægt-% PEG 200-20.000 i nærværelse af et indsaltningsmiddel valgt blandt aminosyrer, fortrinsvis basiske, kulhydrater og sukkeralkoholer, hvorpå det udskilte bundfald med koncentreret indhold af AHF udvindes.A process for preparing a concentrate of the anti-hemophilic factor VIII (AHF) substantially free of denatured AHF and other plasma proteins present in the concentrate, but not of factor VIII: RP and exhibiting a solubility in an aqueous injection medium of 200 -500 units of AHF / ml and a specific activity of 3.85-50 units of AHF / mg of protein derived from the starting material of the concentrate, thereby purifying a solution of a cryoprecipitate from blood plasma or another factor VIII-containing blood fraction to remove pro-thrombin and then fractionated with polyethylene glycol, PEG, comprising a step of precipitating the majority of fibrinogen by 2-6% by weight of PEG 200-20,000 and a subsequent step of precipitating AHF, characterized in that the supernatant from the first PEG precipitate is precipitated by 6-20% by weight of PEG 200-20,000 in the presence of a salting agent selected from amino acids, preferably basic, carbohydrates and g of sugar alcohols, upon which the precipitated precipitate with concentrated content of AHF is recovered. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes lysin-HCl eller arginin-HCl.Process according to claim 1, characterized in that lysine-HCl or arginine-HCl is used as a salting agent. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes et kulhydrat, fortrinsvis et mono- eller disaccharid.Process according to claim 1, characterized in that a carbohydrate, preferably a mono- or disaccharide, is used as a salting agent. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at der som indsaltningsmiddel anvendes saccharose.Process according to claim 3, characterized in that sucrose is used as a salting agent. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, kendetegnet ved, at der ved fældningen i første trin tilsættes PEG 19 DK 157170 C til en koncentration på ca. 4 vægt-% af opløsningen.Process according to claims 1-4, characterized in that at the first stage precipitation, PEG 19 DK 157170 C is added to a concentration of approx. 4% by weight of the solution. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, kendetegnet ved, at der i andet fældningstrin tilsættes PEG svarende til en totalkoncentration på ca. 12 vægt-%.Process according to claims 1-5, characterized in that in the second precipitation step PEG corresponding to a total concentration of approx. 12% by weight. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der tilsættes lysin-HCl eller arginin-HCl i en mængde svarende til en lysin- eller arginin-koncentration på 0,1-0,9, fortrinsvis 0,3-0,8 mol/1.Process according to claim 2, characterized in that lysine-HCl or arginine-HCl is added in an amount corresponding to a lysine or arginine concentration of 0.1-0.9, preferably 0.3-0.8 mol. / 1st 8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, kendetegnet ved, at pH under første fældningstrin er 6,0-8,5, fortrinsvis 6,2-6,6, især ca. 6,4, og under andet fældningstrin er 5,0-8,5, fortrinsvis 6,0-6,6, især ca. 6,3.Process according to claims 1-7, characterized in that the pH during the first precipitation step is 6.0-8.5, preferably 6.2-6.6, in particular approx. 6.4, and during the second precipitation step are 5.0-8.5, preferably 6.0-6.6, in particular approx. 6.3.