DK153502B

DK153502B - Vanduoploeseligt enzymcomplex omfattende et penicillinacylaseenzym og fremgangsmaade til fremstilling af 6-aminopenicillansyre under anvendelse af et saadant enzymcomplex

Info

Publication number: DK153502B
Application number: DK683574AA
Authority: DK
Inventors: Thomas Adrian Savidge; Lawson William Powell
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1973-12-28
Filing date: 1974-12-27
Publication date: 1988-07-18
Also published as: ZA748253B; DK683574A; DE2459350A1; NL7416746A; DK153502C; FI377074A; ATA1013374A; NO144633C; CH603678A5; GB1492937A; HU169831B; IE41467L; AU7678674A; NO144637C; IN138389B; CA1034523A; IL46327A; DE2459350C2; NL186396C; JPS5095479A

Description

i

DK 153502B

Den foreliggende opfindelse angår i forhold til teknikkens standpunkt forbedrede enzymcomplexer, især sådanne, som fremstilles ud fra acylaseenzymer, der vides at spalte penicilliners amidbinding, samt en fremgangsmåde til fremstilling af 6-aminopenicillansyre, som i det 5 følgende betegnes "6-APA", under anvendelse af sådanne enzymcomplexer. Acylaseenzymer, der vides at spalte penicilliners amidbinding, betegnes her "penicillinacylaser", og de kan anvendes til fremstilling af 6-aminopenicillansyre ud fra penicilliner, der er vundet ved fermentationsprocesser med naturligt forekommende materialer, 10 idet enzymet anvendes under sådanne pH-betingelser, at der sker deacylering af penicillinen (eller spaltningen af amidgruppen) under dannelse af den ønskede 6-aminopenicillansyre.

Selv om sådanne penicillinacylase-(eller deacylase)-enzymer i enten cellebunden eller cellefri tilstand er blevet anvendt til det oven-15 nævnte formål siden ca. 1961, er anvendelsen forbundet med vanskeligheder, når det cellefrie enzym anvendes, da dette ikke let skilles fra reaktionsblandingen; desuden gælder, at det cellebundne enzym ikke er let at genanvende. Hertil kommer, at begge typer enzym producerer 6-APA, som er forurenet med spormængder af bakterielt 20 protein. Det er i britisk patentskrift nr. 1.193.918 foreslået af overvinde disse vanskeligheder ved at binde enzymet til et polymersubstrat og derved gøre det vanduopløseligt. Sådanne polymer-enzymcomplexer har imidlertid vist sig at have ringe mekanisk stabilitet, når de polymere, der anvendes som substrat, er sådanne, som er 25 almindeligt kommercielt tilgængelige til andre formål. De polymere må derfor tilpasses og fremstilles specielt til formålet, og dette er kostbart. Når 6-APA fremstilles under indvirkning af acylaseenzymer, er det endvidere nødvendigt at regulere reaktionsblandingens pH-værdi inden for et snævert område under hele reaktionen, og dette kræver 30 kontinuerlig tilsætning af et alkali til neutralisering af den carboxylsyre, som dannes ud fra den frigjorte penicillinsidekæde. Det har vist sig, at når acylaseenzymet er direkte bundet med en covalent binding til et polymersubstrat, må man være omhyggelig med valget af det alkali, der skal anvendes til denne neutralisation, og at det 35 sædvanligvis foretrukne alkali, natriumhydroxid, ikke kan anvendes uden at enzymet denatureres hurtigt. Hvis man som følge heraf ønsker

DK 153502 B

2 at anvende en flygtig base, f.eks. ammoniak eller triethylamin, kan det være nødvendigt at foretage en kostbar modifikation af det anlæg, som i forvejen anvendes til fremstilling af 6-APA ved hjælp af acylaseenzymet i dets cellebundne form, eftersom der med det 5 cellebundne enzym ikke er nogen vanskeligheder ved anvendelse af natriumhydroxid til neutralisation af den frigjorte sidekæde-syre.

Det er også blevet foreslået i tysk offentliggørelsesskrift nr.

2.143.062 at fremstille et vanduopløseligt penicillinacylasepræparat ved at adsorbere acylasen på et substrat og dér tværbinde den ved 10 indvirkning af et vandopløseligt dialdehyd med og uden dannelse af bindinger mellem polymersubstratet og enzymet. Ved denne metode bliver enzymet overvejende tværbundet omkring substratet og er ikke bundet dertil med covalente bindinger. I den nævnte publikation beskrives forskellige substrater, f.eks. anioribytterharpikser, dvs.

15 sådanne, som indeholder basiske grupper såsom primære, sekundære eller tertiære aminogrupper eller lignende nitrogeriholdige funktionelle grupper, eller carboxymethylcellulose, eller polymere med neutral reaktion, f.eks. fordi de tilstedeværende funktionelle grupper er estergrupper.

20 Det har vist sig, at substrater med negativt ladede funktionelle grupper er bedre end substrater med positivt ladede funktionelle grupper. Der er f.eks. udført to forsøg til sammenligning af cellulose med på den ene side positivt og på den anden side negativt ladede grupper, nemlig diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellulose) og 25 carboxymethylcellulose (CM-cellulose). Betingelserne for koblingen af penicillinacylase til hvert substrat blev optimeret, og samme enzymopløsning blev anvendt til kobling til hver bærer under anvendelse af disse optimale betingelser. Aktiviteten af det færdige immobiliserede enzympræparat udgjorde for henholdsvis DEAE- og CM-30 cellulose henholdsvis 11% og 42% af den oprindelige totale aktivitet af enzymopløsningen. DEAE-cellulosepræparaternes lavere aktivitet skyldtes dårlig adsorption af enzymet. Når forsøget blev gentaget under anvendelse af en anden enzymopløsning, var resultaterne 24% og 56% for henholdsvis DEAE- og CM-cellulose. Enzymcomplexer fremstillet 35 ud fra celluloser har imidlertid dårlig mekanisk stabilitet, således som det er beskrevet af D.L. Regan, P. Dunnill og M.D. Lilly

DK 153502B

3 "Immobilized Enzyme Reaction Stability: Attrition of the Support Material" i Biotechnology and Bioengineering: Vol. XVI, side 333-343 (1974).

Endvidere gælder, at de complexer, som er fremstillet ved adsorp-5 tions-tværbindings-teknikken, hvor substratet er en polymer med neutral aktivitet, har reaktivitets- og genanvendeligheds-egenskaber, som også kan betragtes som utilfredsstillende. Således er f.eks. stabiliteten af penicillinacylase adsorberet og tværbundet på det neutrale substrat "Amberlite" XAD-7 ("Amberlite" er et varemærke), 10 bestemt ved opbevaring af det immobiliserede enzympræparat ved en temperatur på 37°C, utilfredsstillende, da aktiviteten efter 14 dages opbevaring er faldet med 66%.

Det har vist sig, at hvis den i det ovennævnte offentliggørelses-skrift beskrevne teknik anvendes i forbindelse med homopolymere eller 15 copolymere af methacrylsyre, dvs. polymere med en carboxylsyre- funktion af den aliphatiske type, er de resulterende enzymcomplexer overraskende overlegne derved, at de har en høj enzymaktivitet, som bibeholdes efter gentagne anvendelser til fremstilling af 6-APA.

Substrater bestående af makroporøse eller af geltypen værende po-20 lymere af styren, acrylsyre eller phenol-formaldehyd med enten sulfonsyre-, phosphorsyre- eller carboxylsyre-funktionelle grupper har vist sig at være udpræget underlegne i forhold til makroporøse og gelpolymere og -copolymere af methacrylsyre. Disse præparaters særdeles gode stabilitet kan også vises ved resultater efter opbe-25 varing ved 37°C. Ved et sådant forsøg^konstateredes det, at aktiviteten af et immobiliseret enzympræparat, som var fremstillet ved at adsorbere og tværbinde acylase på en makroporøs polymer af methacrylsyre, som forhandles under varemærket "Amberlite" IRC-50, kun reduceredes med 5% i forhold til den oprindelige aktivitet efter 14 30 dages opbevaring ved 37°G.

Disse enzymcomplexer har også forbedret mekanisk stabilitet. Den mekaniske stabilitet er vigtig ved anvendelsen af en hvilken som helst reaktionsbeholder med omrøring, da det er nødvendigt at omrøre reaktionsblandingen meget kraftigt for at opretholde en ensartet pH-35 værdi og nedsætte alkali-nedbrydning af penicillin til det mindst

DK 153502B

4 mulige. I de forbedrede reaktorsystemer, som nu er under udvikling, f.eks. hvor det uopløselige enzymcomplex tilbageholdes i reaktoren ved hjælp af en sigte med egnet maskestørrelse, og hvor reaktionsmediet lades løbe af efter afslutningen af en reaktion til fremstilling 5 af 6-APA, forbliver det uopløselige enzympræparat i reaktoren og er klar til genanvendelse. På denne måde nedsættes de fysiske tab af enzym, som normalt forekommer, når hele blandingen fjernes fra beholderen, og det uopløselige enzympræparat genvindes ved filtrering eller centrifugering og tilbageføres til reaktionsbebolderen. Desuden 10 undgås mikrobiel forurening af enzympræparatet under manipulering.

Det er imidlertid vigtigt, at enzymcomplexet ikke nedbrydes mekanisk, således at der sker væsentlige tab som følge af, at det passerer gennem den tilbageholdende sigte. Endvidere gælder, som det er vist af Regan, Dunnill og Lilly (loc. cit.), at de små partikler, som 15 hidrører fra nedslidning af aminoethylcelluse, hvortil der er bundet /3-galactosidase, har højere specifikke aktiviteter end de større partikler, og tabet af sådanne partikler fra reaktoren vil derfor sandsynligvis føre til et tab af total aktivitet, som er helt ude af forhold med vægten af det tabte materiale.

20 I et andet reaktorsystem, som er beskrevet i beskrivelsen til belgisk patent nr. 782,646, tilbageholdes det uopløselige enzympræparat i en søjlereaktor, hvorigennem substrat cirkuleres med en hurtig strømningshastighed, således at de nødvendige pH-justeringer kan udføres i en beholder, som er adskilt fra det uopløselige enzympræparat.

25 Substratet må derfor have sådanne hydrauliske egenskaber, at det ikke nedbrydes mekanisk af de høje tryk, som kræves til opretholdelse af den hurtige strømning af reaktionsblandingen. Hvert af disse reaktorsys terner kan modificeres således, at de virker som kontinuerlige reaktorsysterner, og problemerne med tilstrækkelig mekanisk 30 stabilitet sammen med enzymreaktivitet og genanvendelighed vil stadig bestå.

En yderligere fordel ved at anvende homopolymere og copolymere af methacrylsyre er, at disse harpikser i sig selv har god mekanisk stabilitet. Desuden gælder, at når enzymcomplexer fremstillet ud fra 35 disse harpikser har undergået aktivitetstab til et uacceptabelt niveau efter gentagen genanvendelse i en reaktor, kan harpiksen

DK 153502B

5 regenereres ved fjernelse af det tilbageværende enzym ved behandling med varm alkali. Frisk enzym kan derefter knyttes til den samme harpiks.

Det har også vist sig, at når enzymcomplexerne fremstilles ved ad-5 sorption på de ovennævnte methacrylsyrepolymere og -copolymere med efterfølgende tværbinding med bestemte tværbindingsmidler, kan det resulterende vanduopløselige enzymcomplex anvendes til fremstilling af 6-APA,uden at det er nødvendigt at være særlig forsigtig i valget af det alkali, som kræves til neutralisering af den frigjorte 10 sidekæde-syre. Det har således vist sig, at til forskel fra de systemer, hvor enzymet er bundet direkte til et polymersubstrat med covalente bindinger, kan der anvendes natriumhydroxid til dette formål, således som det for tiden er almindeligt ved anvendelsen af de cellebundne systemer. Hermed undgås sådanne modifikationer af de 15 eksisterende anlægs afdampere, som ville være nødvendige, hvis der til neutralisationen skulle anvendes flygtige alkalier, f.eks. ammoniak eller triethylamin.

\ I USA patentskrift nr. 3.705.084 beskrives adsorptionen af enzymer på polymere overflader og deres efterfølgende tværbinding. Polymere og 20 copolymere af methacrylsyre angives at være egnede til fremstilling af sådanne polymere overflader. Patentskriftet angiver imidlertid, at de polymere overflader skal have adsorptionsfremmende grupper, som er nitrilogrupper (=N), syreamidgrupper (-CONH2) eller ureidogrupper (-NHCONH2). °g fer polymere og copolymere af methacrylsyre kan 25 anvendes i henhold til dette patentskrifts lære, må man derfor omdanne carboxylgrupper på den polymere og copolymere til en af disse angivne adsorptionsfremmende grupper. De polymere og copolymere af methacrylsyre, som anvendes i henhold til dette patentskrift, adskiller sig derfor fra dem, der anvendes i henhold til den 30 foreliggende opfindelse, ved tilstedeværelsen af disse specifikke adsorptionsfremmende grupper. Ved at angive tilstedeværelsen af disse specifikke adsorptionsfremmende grupper antyder dette patentskrift endvidere, at modificerede polymere og copolymere af methacrylsyre danner bedre enzymcomplexer end de umodificerede po-35 lymere og copolymere. Patentskriftet leder derfor bort fra den til grund for den foreliggende opfindelse liggende erkendelse, nemlig at

DK 153502 B

6 det, når der er tale om acylaseenzymer, er de umodificerede polymere og copolymere af methacrylsyre, som må foretrækkes.

Til påvisning af overlegenheden af homopolymere og copolymere af methacrylsyre i acylaseenzymcomplexer er der fremstillet acylase-5 complexer ud fra nylon og polyurethan, to polymere, som er repræsentative for de foretrukne og eksemplificerede polymere fra USA patentskriftet, under anvendelse af glutaraldehyd som tværbindings-middel, og deres aktivitet er blevet sammenlignet med et acylaseen-zymcomplex fremstillet ud fra "Amberlite" IRC 50 på lignende måde.

10 Når der toges hensyn til enzymcomplexernes afvigende partikelstørrelse, viste det sig, at "Amberlite” IRC-50-complexet var 2-3 gange mere aktivt end polyurethancomplexet og så meget som 11 gange mere aktivt end nyloncomplexet. Oisse resultater beskrives mere detaljeret i de følgende udførelseseksempler.

15 Ideen med at adsorbere et enzym på et substrat og tværbinde det in situ er også beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.257.263. Dette patentskrift omtaler imidlertid ikke penicillinacylaseenzymer, og det beskriver heller ikke anvendelsen af methacrylsyrepolymere og -copolymere som substrater, ligesom det heller ikke nævner de fordele, 20 som opnås ved at vælge substrater med god mekanisk stabilitet.

Alligevel udvider det ideen med at tværbinde enzymet omkring substratet ved at anbefale anvendelsen af andre polyfunktionelle reagenser end vandopløselige dialdehyder, f.eks. anvendelsen af bis-diazo-o-dianisidin. På tilsvarende måde antages det, at der til den 25 foreliggende opfindelses formål foruden glutaraldehyd også kan anvendes f.eks. glyoxal og formaldehyd som tværbindingsmidler.

Et aspekt af den foreliggende opfindelse angår således et vanduoplø-seligt enzymcomplex, som omfatter et penicillinacylaseenzym adsor-beret på et vanduopløseligt polymersubstrat og tværbundet med et 30 tværbindingsmiddel, som er glutaraldehyd, glyoxal eller formaldehyd, hvilket enzymcomplex er ejendommeligt ved, at polymersubstratet er en vanduopløselig eventuelt tværbundet homopolymer eller copolymer af methacrylsyre.

DK 153502B

7

Et andet aspekt af den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 6-aminopenicillansyre, ved hvilken benzyl-penicillin eller phenoxymethylpenicillin eller et salt deraf i vandig opløsning, som holdes ved en pH-værdi fra 6,0 til 9,0, behandles med 5 et vanduopløseligt enzymcomplex, hvilket enzymcomplex omfatter et penicillinacylaseenzym adsorberet på et vanduopløseligt polymersubstrat og tværbundet med et tværbindingsmiddel, som er glutaraldehyd, glyoxal eller formaldehyd, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at polymersubstratet er en vanduopløselig eventuelt tværbundet 10 homopolymer eller copolymer af methacrylsyre.

Acylaseenzymet til det foreliggende formål fås fortrinsvis ud fra bakterier, f.eks. stammer af Escherichia coli, når det skal anvendes til fremstilling af 6-APA ud fra benzylpenicillin, eller f.eks. ud fra fungi og actinomycetes, når der som udgangsmateriale anvendes 15 phenoxymethylpenicillin.

Deacylaseenzymets enzymatiske virkning bestemmes bekvemt i relation til dets evne til at producere 6-APA ud fra benzylpenicillin. Aktiviteten for deacylaseenzymerne angives derfor her som den mængde 6-APA (angivet i mikromol, μϋ), som produceres ud fra en opløsning af 20 benzylpenicillin ved pH-værdi 7,8 og 37°C pr. minut og pr. mg proteinindhold af enzymet, hvilket proteinindhold bestemmes efter standardmetoden i henhold til Lowry. Den enzymatiske aktivitet af de her omhandlede enzymcomplexer bestemmes ligeledes på basis af den mængde 6-APA (i/fM) som produceres ud fra benzylpenicillin ved pH-25 værdi 7,8 og 37°C pr. minut, men på basis af enzymcomplexet i gram.

Det har vist sig, at både adsorptions-tværbindings-reaktionens effektivitet og det dannede vanduopløselige enzymcomplex's specifikke aktivitet forbedres, når renheden af det oprindeligt anvendte enzym forøges. Ud over en vis renhed er der imidlertid et kendeligt fald i 30 de forbedringer, som opnås med en given forøgelse i renhed, og der er således en økonomisk grænse for den ønskelige renhed af enzymet. Deacylaseenzymets renhed ligger således sædvanligvis i området mellem 0,15 og 50 μΜ/min/mg proteinindhold og ligger hensigtsmæssigt i området 1,5-30 mikromol/min/mg protein.

DK 153502 B

8

Det kan således være ønskeligt at forbedre enzymets renhed, før man foretager adsorption og tværbinding. Dette kan opnås ved at opvarme enzymopløsningen ved ca. 50°C i et kort tidsrum, f.eks. 30 minutter, og/eller ved ultrafiltrering. Andre konventionelle metoder til en-5 zymrensning, f.eks. fraktioneret udfældning eller behandling med ioribyttercelluloser eller "Sephadex", kan også anvendes.

Substratet til den foreliggende opfindelses formål er homopolymere eller copolymere af methacrylsyre. De indeholder derfor frie carb-oxylgrupper, som giver den polymere en sur funktion. Makroporøse 10 polymere og copolymere af methacrylsyre må foretrækkes fremfor gelpolymere og -copolymere af methacrylsyre, da de makroporøse polymere og copolymere har en bedre kapacitet på grund af deres større til rådighed stående overfladeareal.

Det er nødvendigt, at de methacrylpolymere er vanduopløselige, og de 15 er derfor sædvanligvis i form af tværbundne copolymere, f.eks.

copolymere af methacrylsyre med divinylbenzen eller en diester af en glycol med methacrylsyre, f.eks. ved anvendelse af ethylenglycol-bis-methacrylat. Copolymere af methacrylsyre og divinylbenzen har den fordel, at de udviser større mekanisk stabilitet. Andre co-monomere, 20 f.eks. methacrylatestere, kan også have været anvendt ved fremstillingen af copolymere til den foreliggende opfindelses formål.

Det kan være fordelagtigt, at den polymere eller copolymere også indeholder benzensulfonylgrupper, da dette medfører en lille ændring i pH, der kan gøre det muligt at vælge et substrat med optimal pH-25 værdi. En fordel ved den foreliggende opfindelse er, at den muliggør anvendelsen af polymersubstrater, som allerede er kommercielle produkter til andre formål, især som kationbytterharpikser af svagt sur karakter. Særlig egnet er den methacrylsyre/divinylbenzen-copolymere, som forhandles under varemærket "Amberlite" IRC-50 af 30 Rohm og Haas Co., USA, og som er en svagt sur, carboxylisk kation-bytterharpiks, der kun har negligibel kapacitet ved pH under 4, og hvis saltform kan regenereres særdeles effektivt med syre, og som har en partikelstørrelse i våd H+-form på 16-50 mesh, en initial kvældning (H+-fonm*Na+-form) på 100%, en reversibel kvældning 35 (H+-f ormr+Na+-form) på 70%, en ionbytningskapacitet på 10,0 milliækvi- valenter/g (3,5 milliækvivalenter/ml) og en tilsyneladende pKa-værdi

DK 153502 B

9 på 5,9, og den methacrylsyrecopolymer, som tidligere forhandledes under navnet "Zeokarb” 227 ("Zeokarb" er et varemærke) af the Permutit Co. Ltd. Den sidstnævnte er en divinylbenzen/methacrylsyre-copolymer, som også indeholder nogle benzensulfonylgrupper.

5 Polymersubstraterne til den foreliggende opfindelses formål er fortrinsvis i form af findelte partikler eller småkugler, med en sådan partikelstørrelse, at de vil passere en 10 A.S.T.M. sigte, dvs. med en partikeldiameter på under 2,0 mm. Det resulterende enzym-complex må imidlertid ikke være så findelt, at det ikke kan adskilles 10 fra reaktionsblandingen ved en sigtefiltreringsproces eller ved anvendelse i en søjlereaktor. Den polymere bør således have en partikelstørrelse på over 0,01 mm, dvs. at den i det væsentlige bør tilbageholdes på en 800 A.S.T.M. sigte. Det specifikke valg af partikelstørrelse inden for dette område vil afhænge af karakteren af 15 det reaktorsystem, der skal anvendes.

Det acylaseenzym, som skal bringes i kontakt med den polymere, bør være en vandig opløsning og bør have været dialyseret, indtil dets ionledningsevne er blevet sænket fra den sædvanlige værdi på 5-10 m.mhos til inden for området 0,1-5 m.mhos, fortrinsvis ca. 1 m.mho.

20 Enzymopløsningens pH-værdi bør hensigtsmæssigt være mellem 4,5 og 7,0, og nogle empiriske eksperimenter kan være nødvendige for at fastslå den optimale pH-værdi inden for dette område, hvis der skal opnås maksimal adsorption og maksimal bibeholdt enzymaktivitet.

Denne optimale pH-værdi er imidlertid sædvanligvis mellem 5,2 og 6,5.

25 Den polymere bør bringes i kontakt med enzymopløsningen i et tilstrækkeligt tidsrum til at sikre maksimal enzymadsorption. Denne opholdstid er sædvanligvis mellem 2 og 16 timer.

Efter sin adsorption på substratet tværbindes enzymet in situ ved behandling med et tværbindingsmiddel, som er glutaraldehyd, glyoxal 30 eller formaldehyd. Det foretrækkes at anvende glutaraldehyd eller glyoxal, og især glutaraldehyd fører til enzymcomplexer med særdeles fordelagtige egenskaber ved anvendelsen til fremstillingen af 6-APA. Tværbindingsmidlet anvendes normalt i vandig opløsning i en koncentration mellem 0,1 og 15 vægtprocent, fortrinsvis 0,5-5,0 35 vægtprocent.

DK 153502 B

10 Når tværbindingsreaktionen er tilendebragt, er det ønskeligt at sikre, at eventuelt ikke-omsat tværbindingsmiddel fjernes eller gøres uskadeligt. Man kan f.eks. fjerne et overskud af tværbindingsmidlet ved at vaske med vand eller med en opløsning af en aminforbindelse, 5 og det har vist sig, at urinstof er meget effektivt til dette formål.

Før anvendelsen ved fremstillingen af 6-APA bør enzymcomplexets pH-værdi indstilles omhyggeligt på den værdi, der skal anvendes i produktionsprocessen, sædvanligvis ved tilsætning af alkali ved afslutningen af tværbindingsreaktionen. Denne pH-værdi ligger i området 10 6,0-9,0, men den er sædvanligvis mellem 7,0 og 8,5, og der fore trækkes en pH-værdi på 7,8. Til denne anvendelse bringes enzym-complexet ifølge opfindelsen i kontakt med en vandig opløsning af benzylpenicillin eller phenoxymethylpenicillin eller et salt deraf, hvilken opløsning har den ønskede pH-værdi. Reaktionstemperaturen 15 holdes sædvanligvis i området 30-50°C, fortrinsvis 37°C. Under reaktionen frigives phenyleddikesyre fra benzylpenicillin og phenoxyeddikesyre fra phenoxymethylpenicillin, og denne syre neutraliseres kontinuerligt eller med mellemrum for at holde reaktions-blandingens pH-værdi inden for det ønskede område. Som ovenfor nævnt 20 synes valget af alkali til denne neutralisation ikke at være kritisk.

Således anvendes særdeles hensigtsmæssigt natriumhydroxidopløsning, men der kan om ønsket anvendes en flygtig aminbase, f.eks. ammoniak eller triethylamin.

De vanduopløselige enzymcomplexer ifølge den foreliggende opfindelse 25 er ofte så stabile, både mekanisk og biologisk, at de kan anvendes til mindst 40 successive spaltninger af penicillin i en chargereaktor.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler, i hvilke der anvendes et partielt renset præparat af acylaseenzym, som er frem-30 stillet ved at frigøre enzymet fra cellerne af en acylaseproducerende stamme af Escherichia coli NC1B 8734 mekanisk i en homogenisator.

Cellerester fjernes derefter ved filtrering efter indstilling til pH-værdi 5,0, og enzymopløsningen renses yderligere, om nødvendigt, til

DK 153502 B

11 opnåelse af det ønskede område af specifik aktivitet (dvs. 1,5-30 mikromol/min/mg protein). Enzymopløsningen dialyseres derpå, indtil den har en ledningsevne på ca. 1 m.mho.

Eksempel 1.

5 Portioner på 20-25 eller 50 g kommercielle kation- og anioribyt- terharpikser af den nedenfor angivne art suspenderes i destilleret vand (ca. 100-500 ml) og indstilles på pH-værdier mellem 4,4 og 6,3 i tilfælde af de kationiske harpikser og på pH-værdier mellem 6,5 og 9,0 i tilfælde af de anioniske harpikser ved tilsætning af natrium-10 hydroxid eller saltsyre under kraftig omrøring. Harpikserne isoleres ved filtrering, vaskes godt med destilleret vand og gensuspenderes i en opløsning af partielt renset penicillinacylase (60-100, 250 eller 500 ml; specifik aktivitet 3,85-6,75 pM/min/ mg protein; ledningsevne <1 m.mho) indstilles til den passende pH-værdi, Den mængde enzym, som 15 harpiksen behandles med, varieres mellem 71 og 308 pM/min/mg harpiks.

Enzymet får lov at adsorbere under moderat omrøring i ca. 16 timer, idet pH-værdien holdes ved tilsætning af en titrant, hvorefter harpiksen isoleres ved filtrering, gensuspenderes i en opløsning af glutaraldehyd i vand (100 ml, 0,825%-3,3% w/v) og lades omsætte i ca.

20 16 timer, idet pH-værdien holdes ved tilsætning af en titrant. De resulterende enzym-harpikscomplexer fraskilles, vaskes tre gange med destilleret vand, gensuspenderes i vand eller 0,2m phosphoatpuffer med pH-værdi 7,8 og indstilles på pH-værdi 7,8, behandles i 1 time med en vandig opløsning af urinstof (100 ml, 0,1M, pH-værdi 7,8), 25 hvorpå de til slut vaskes tre gange med destilleret vand.

Hvert på denne måde fremstillet enzymcomplex anvendes til fremstilling af 6-APA ud fra benzylpenicillin under standardbetingelserne pH-værdi 7,8 og 37°C. Enzymcomplexernes aktiviteter fremgår af nedenstående tabel I. Aktiviteterne refererer til complexer, som er 30 fremstillet ved den optimale pH-værdi for enzymadsorption og bibeholdt enzymaktivitet.

Harpikserne "Bio-Rex" og "Chelex" er kommercielle produkter fra Bio-Rad Laboratories of California, U.S.A., "Lewatit"-harpikserne er

DK 153502 B

12 kommercielle produkter fra Bayer A.G., Forbundsrepublikken Tyskland, og harpikserne "Zeokarb" og "Zerolit” er kommercielle produkter fra the Permutit Co. Ltd, medens "Amberlite"-harpikserne er kommercielle produkter fra Rohm & Haas, Philadelphia, U.S.A. Det vil bemærkes, at 5 den foreliggende opfindelses fordele er begrænsede til de tilfælde, hvor substratet er en polymer eller copolymer af methacrylsyre.

13

DK 153502B

g <3

| -ri +> _ _ H QO

UTi^r r-ι r- oo (M ro co ' (tf M O’ - - - - - *·* ^00 CM \ cm o o o in ° σι ° o ° oo σι m oo

'l ·> fl ιη r-l ro oo H

g 1 -H

>iH g -P

n a \ tr> g § « a)H P > rd \ <m g <d h +> P O’ +) a a) Φ o >

-P

•HD Di

> (U -H

H > -P

•P tn , Λ x X p Η H VD o rd (U ή m· r- h ro ro οσι h h - » - ^ - - - - r-

Aja S' o o ^ m cm o σι o o o 'ί σ> o r- ro ri g \ Η Η H

*H O G

•ri O -ri u m g <U A! \ a-H g

ra ft P

\ g w o co to co to to cm s -Θ. -Q- & ^ (U Μ Μ P p p M 0) o o o o o ka \a a & a (¾ Λ HM 0 O o 2 8 M* rø j^HHAiHHA!HHHH^HH ,¾ ms, nj(UO)G(ua)id(U(U(U(Urt(ua) <e

MM? gDiDigDiD>gDiDiDiDigDiDi S

Μ <D <D <D 0) CL) S) <u

L_jv/ jJjJjJ 4J4J -P O +J

^ -ri 00 -ri i-l -H 00 -p -H -ri +J -P -P H X ^ Ή H a Η CO Η O H in -ri H HCO-rl -ri -ri H O (U 5 ί 71° m m du P'S1 P^f ύ M in Μ vo +> o -P H Gcmp! G ft Λ <D Min n td ajl (ui (Ui (dm <0 «a· 0)1 Gcm Go O (UHi l S l η φ i

Irt w S <1 o o rij S ΙΟ ni n &o P m ΛΙ O O \ O <U o o u £ w sSbksS S a s fU b S qjh (D cm C ft *ho ή O -ri ro ^ o |(ϋ

1¾ Η H 1¾ H |P S rij H S H GW GW N ro rfj H CQ ^ « rtj PQ 10 UH 1¾ H

(U

Γ—i

i—I

<D

G ^ ^ 4J -ri *rl G ^ t X G G O W 01

GJ 0 O g o S

r-l Ci P* S O W

w 1 i s w o

rj irt tn I CJ

Di CU -P UV

O tn -P -P P G1 , „ *; P P « G -G „N g

X-rifBfBGGG-H OJ SS

•H a G G P H H g 2 HR

PP PPtUggG H N " U

iji 4J-P G >1 >1 H W W W ffi S ® ® ’ ·£ί g (rt(rt>HH0 rororocoM rococMirt

-G >>,yooaooooooowH

<h x x \ aaiwcntncnmwau>.

rtS h b 1« h G G b G G i Λ G h h U

c« a a)o)Ha)Q)H(ua)a)(uo(U(ua)m

<Ua PP>iPP>iPPPjjGPPP-G

1) P >l>lM S-lt>iP J>1r0r0>1^ MM ^ij OjJ-PO-P-P-P-PÆ-P-P-Pi fjjUi (floiirtcntnfdtntncntnaincning tr> &

Μ (ΰ,ο o-d (UM-l DijGHtoMH g G O

O

DK 153502 B

14 <1 4 o σι i—t in o ^ s s ^ " ro i'- ιο o o Γ" ον η H oo in td td υ υ t

M

O) in O O 1-1

- 0) oo oo S

cn o\ S

• o · - “ 0)

td ·. td m o o in -P

u t~~ o H <n in 0) Λ 0)

Di c! <d e <m td

tn tn tn -P

s. Ό. & ·η (-1 MM ti o o o tn & Dl Pi Ej O O O 0) M MM ti

χ; Η H .¾ r-4 H C M

td 0) Q) <d <d 0) 0) <D 0) g Di D> S S Di Di Dl tn

Μ -H

+) (U Di

td M

O) (U <D M fd +J +) +) 0) Λ

Μ -Μ -M +) 4-> -P 4J Λ -M

O ΗηΗ^Ή ΉοΉ ·Η Μ T3 A) 44 Mr- MOO Η -Μ CO 4-1 Η td Μ Μ

<u i cu t o nil <d ολ: 83 •'O

Η Λ Ο Λ U MU3 £E4!SOiMVDOr^ > Die g o' B pi qjco <])3 0)!3 0)H0)O4 Ή id

H 3 H Æ H NN i^O lJU NN N N (1) H

0) ti 0) M

XI > Dl O

«3 -H g Ή (H Di 83 ti Di o · (U · td h m <ϋ x a) • H * xi a) in ,¾ 0)+)+)^ tn λ ή tn

03¾ i—i -M tn ti -H

ti +J ti -H o ti

ffi »· Q) H · Oti-MO

O QJ ^ 0) Ml -Η o +> -H

ffi Ο Η Ή ϋ| ti H (d 4J

0 U Xttuu td ti A3 <d

1 i /1 td Μ M o td M

03 <00 ·Η A3 <D o 4-1 4-1 >1 \| M-HgCM Al -P A3 4-> XJKW td g M D> M D> 0)0 η > Μ Ο 1 83id83(d Όοο m m +>>+>> ho w 4-) o tntntntn aæn! td i i (Dtiajo

000 6 4-1 DiQJAJH Μ Μ Μ M

OOOWWMtd »MX 0)(1)0)(1) UUUOOOH gti-HQ) 1 Υ I Ο Ο ή >i -P tn omHti

4J4J4JUO 1 M 0) Μ H

ttJrtJnJ |HO C ti fl) 0) 1111

i—1 h 1—1 / O td Μ Μ M

>1 >1 >1<(N /1 Cx! fl) 4-) ti M tdndDiO

ϋ ? << ϋ S Ϊ 2 X S φ φ » ®

« ««+!- as S I 3 * SSSS

ti >1 D< -ti 0)(1)0)0) tnHMtn tntntntn a) o td Q) A3 A3 A3 A3

IS ft B a Η Η Η H

ft ft ft ft ///1/1 MMMM

<h <ro <ro /δ< td <d td td

Di D1 M tn -ti ti > \ x|\ \ B B B B

DK 153502B

Eksempel 2-5.

15

Disse eksempler belyser virkningen af variation af acylaseenzymets renhed under adsorptionstrinet. Den anvendte procedure er beskrevet i eksempel 1. Enzymet adsorberes ved pH-værdi 5,7, og enzym-harpiks-5 complexet behandles med 3,3% w/v glutaraldehyd. Den anvendte harpiks er "Amberiite" IRC-50, som er vasket med alkali og derefter med syre.

De specifikke aktiviteter af de således fremstillede enzymcomplexer fremgår af nedenstående tabel II. Resultaterne i tabel II viser, at en forøgelse af renheden af det oprindelige enzym inden for dette 10 område forøger enzymcomplexets specifikke aktivitet.

Tabel II

Eksempel Specifik aktivitet Enzymaktivitet Specifik aktivitet af det oprindelige påført af enzymharpiks enzym 15 μΜ/min/mg protein μΜ/min/g harpiks μΜ/min/g fugtig vægt 2 4,64 . 216 38,1 3 7,87 463 72,0 4 20,5 1160 124,0 20 5 18,2 586 109,0

Eksempel 6-15.

Vigtigheden af den pH-værdi, ved hvilken enzymet adsorberes på harpiksen, vises i disse eksempler, hvor:

DK 153502 B

16 a) Fem prøver af "Amberlite" IRC-50-harpiks (50 g) indstilles på pH-værdi henholdsvis 4,9, 5,1, 5,3, 5,5 og 5,7, hvorpå de tørres, og derpå sættes hver prøve til en opløsning af partielt renset penicil-linacylase (95 ml; aktivitet 60,9 pM/min/ml, 16,8 mg protein/ ml, 5 ledningsevne 0,55 m.mhos, sat op til et slutrumfang på 200 ml).

Efter adsorption i 16 timer ved den pågældende pH-værdi, behandles enzymcomplexet på den i eksempel 1 beskrevne måde, eller b) fem yderligere prøver af samme harpiks behandles på samme måde med den forskel, at adsorptionsprocessen udføres i pH-værdi-området 5,7- 10 6,5. Det enzym, der anvendes til disse harpikser, har følgende egenskaber (105 ml; aktivitet 54,7 μΜ/min/ml; 9,03 mg protein/ml; ledningsevne 0,75 m.mhos).

Resultaterne af disse forsøg fremgår af nedenstående tabel III. Disse resultater viser, at den optimale pH-værdi for adsorptionstrinet er 15 fra 5,2 til 5,8.

Tabel III

Eksempel pH-værdi Specifik aktivitet af enzymcomplexet pM/min/g fugtig vægt 20 ___________ 6 4,9 30,2 7 5,1 21,2 8 5,3 40,8 9 5,5 49,0 25 10 5,7 57,2 11 5,7 44,4 12 5,9 13,0 13 6,1 8,4 14 6,3 5,6 30 15 6,5 5,6

Eksempel 16 og 17.

17

DK 153502 B

Disse eksempler viser virkningen af anvendelse af samme harpiks men med forskellig partikelstørrelse. Der anvendes en chromatografisk kvalitet af harpiksen "Amberlite" IRC-50, dvs. "Amberlite" CG-50 type 5 I med en partikelstørrelse, som passerer en 100 A.S.T.M. sigte, men som tilbageholdes på en 200 A.S.T.M. sigte, dvs. en partikelstørrelse på 0,074-0,149 mm.)

En prøve (15 g) af harpiksen lades adsorbere enzym (200 ml, 23,7 pM/min/ml; 3,86 pM/min/mg protein) ved pH-værdi 6,3 i 3 timer.

10 Enzymcomplexet fraskilles, behandles med glutaraldehyd (200 ml, 0. 825% w/v) i 16 timer, isoleres og vaskes som beskrevet i eksempel 1. Produktet (21 g) har en aktivitet på 114,5 pM/min/g fugtig vægt, og dette skal sammenlignes med det i eksempel 2 opnåede resultat, hvor "Amberlite" IRC-50 anvendes med partikelstørrelse, som passerer 15 en 14 A.S.T.M. sigte, men som tilbageholdes på en 50 A.S.T.M. sigte (dvs. med en partikelstørrelsesdiameter på 0,297-1,41 mm). Dette viser, at der opnås forbedrede resultater, når harpiksen er af den mindre størrelse.

Forsøget gentages under anvendelse af en farmaceutisk kvalitet af 20 "Amberlite", nemlig "Amberlite" IRP-64 med en partikelstørrelse, som passerer en 100 A.S.T.M. sigte, men som tilbageholdes på 500 A.S.T.M. sigte, dvs. en partikelstørrelse på < 0,037-0,149 mm diameter.

Harpiksen lades adsorbere enzym (3920 pM/min g harpiks; specifik aktivitet 17,4 pM/min/mg protein) ved pH-værdi 6,3. Enzymcomplexet 25 omsættes derefter med glutaraldehyd (3,3% w/v) og behandles som beskrevet i eksempel 1. Det resulterende enzym-harpikscomplex har en specifik aktivitet på 478,4 pM/min/g fugtig vægt.

Eksempel 18.

pH-Værdien af "Amberlite" IRC-50-harpiks indstilles på 5,5, enten ved 30 vaskning med 0,2M phosphatpuffer med denne pH-værdi eller ved opslæmning i destilleret vand og tilsætning af natriumhydroxidop-

DK 153502 B

18 løsning. Harpiksen vaskes derefter yderligere med destilleret vand, indtil der ikke længere kan konstateres ændring i vandets ledningsevne.

Den fugtige harpiks (100 g) sættes til penicillinacylasen med ak-5 tivitet 5,25 pM/min/mg protein i 500 ml 0.02M phosphatpuffer med en pH-værdi 5,5 og omrøres i 20 timer ved stuetemperatur. Det faste stof fraskilles ved filtrering, gensuspenderes i 500 ml 0,25% w/v glutaraldehyd opløst i phosphatopløsningen og omrøres i yderligere 20 timer ved stuetemperatur. Det resulterende enzymeomplex fraskilles 10 derefter ved filtrering og vaskes med 0,2M phosphatpufferopløsning ved pH-værdi 7,8, indtil harpiksen er ækvilibreret ved denne pH-værdi.

Det på denne måde fremstillede enzymeomplex (15 g) anvendes derefter til spaltning af 200 ml en 6,25% w/v vandig opløsning af benzylpeni-15 eillin i 0,02M phosphatpuffer med en pH-værdi på 7,8 i 2 timer ved 37°C. Det viser sig, at enzymeomplexet let kan genvindes til genanvendelse, og at den mekaniske og biologiske stabilitet begge bibeholdes i en sådan grad, at complexet kan genanvendes mindst 25 gange.

20 Eksempel 19.

Dette eksempel illustrerer bedre anvendelsen af et enzymeomplex ifølge opfindelsen i produktion i stor målestok af 6-APA og comple-xets fremragende genanvendelighed under disse betingelser.

Der fremstilles et enzymeomplex under anvendelse af "Amberlite" IRC-25 50. Det har en aktivitet på 26,3 μΜ/min/g, og anvendes til spaltning af 40 liter benzylpenicillinopløsning med koncentration 6,5% w/v i 0,02M phosphatpuffer. Enzymeomplexet tilbageholdes i beholderen ved hjælp af en trådsigte. Når reaktionen er tilendebragt, frafiltreres opløsningen af 6-APA-produkt, complexet vaskes med vand, og en 30 yderligere reaktion sættes i gang. Den gennemsnitlige effektivitet med hensyn til omdannelse til 6-APA ved 50 successive genanvendelser, hver på 6 timers varighed, er 95%.

19

DK 153502 B

Eksempel 20.

Dette eksempel illustrerer den mekaniske stabilitet af et enzymcomplex ifølge opfindelsen fremstillet som beskrevet i eksempel 1 ud fra harpiksen "Amberlite" IRC-50 sammenlignet med et enzymcomplex 5 fremstillet på lignende måde, men ud fra et polymersubstrat med neutral aktivitet, nemlig harpiksen XAD-7, som er en tværbunden acrylatester, som er i handelen (Rohm & Haas Corp. U.S.A.).

En prøve af hvert enzymcomplex (1,6 kg) suspenderes i 8 liter 0,2M phosphatpuffer ved pH-værdi 7,8 og 37°C, og hver blanding omrøres i 10' 72 timer ved 200 omdrejninger pr. minut i en New Brunswick Magnaferm fermentor med prelplader. Der udtages prøver med intervaller på 4 timer, og prøverne undersøges visuelt til konstatering af nedbrydning af harpikskuglerne. Nedbrydningen af XAD-7-kuglerne er væsentlig større end nedbrydningen af IRC-50-kuglerne, således at en prøve af 15 den sidstnævnte taget efter 64 timers forløb ligner en prøve af XAD-7-harpiks taget efter 8 timers forløb. Disse resultater viser klart den større mekaniske styrke af IRC-50-harpiks.

Eksempel 21.

"Amberlite" IRC-50 (235 g, 39,4 μΜ/min/g), fremstillet som beskrevet 20 i eksempel 1, anvendes til spaltning af 6,25% w/v kaliumbenzylpeni-cillin G i en serie på 10 på hinanden følgende forsøg. Hvert forsøg udføres under anvendelse af 1 liter kaliumbenzylpenicillin G i 2 1/2 time ved 37°C og ved en pH-værdi på 7,8. "Amberlite" IRC-50-harpiksen fjernes ved filtrering efter hvert forsøg og vaskes med destilleret 25 vand. Filtratet og vaskevandet koncentreres ved inddampning på roterende vakuuminddamper, og koncentratet blandes med et lige så stort rumfang methylisobutylketon, afkøles til 4-10°C og syrnes til slut til udfældning af 6-aminopenicillansyre. 6-Aminopenicillansyren vaskes med en ringe mængde destilleret vand, vaskes med acetone og 30 ovntørres. Det gennemsnitlige vægtudbytte af 6-aminopenicillansyre ved de 10 forsøg er 91,3%.

Eksempel 22.

DK 153502B

20

Adsorption af acylaseenzym til urethan-overtrukket polyethylen.

Partikler af polyethylen med lav massefylde (<400 μα) overfrakkes med en urethanpolymer ("Urithane" 641W, Cray Valley Products Limited) og 5 lades tørre i 10 dage. Materialet vaskes derefter i 1 time med 20% v/v vandig acetoneopløsning og skylles omhyggeligt med destilleret vand, og prøver på hver 5 g lades adsorbere enzym (125 ml, 54,0 μΜ/min/ml, 3,80 μΜ/min/mg protein) i 5 timer i pH-værdiområdet 4,8-9,0. De urethan-overtrukne partikler fraskilles ved filtrering, 10 behandles med glutaraldehyd (75 ml, 3,3% w/v) i 3 timer og ækvili-breres derefter til pH-værdi 7,8 som beskrevet i eksempel 1.

På trods af, at de urethan-overtrukne partikler i gennemsnit har mindre størrelse end IRC-50, er de opnåede specifikke aktiviteter 2-3 gange mindre end dem, der opnås ved anvendelse af IRC-50.

15 pH-Værdi Aktivitet, fugtig vægt μΜ/min/g 4,8 11,3 5,2 14,0 20 5,6 16,4 6.0 13,2 6.4 13,6 7.0 12,3 7.5 7,8 25 8,0 10,0 8.5 9,0 9.0 12,2 21

DK 153502 B

Eksempel 23.

Adsorption af acylaseenzym til nylon.

"Orgolacq" (pulveriseret nylon 6, diameter <30 jum, Ato Chimie (U.K.)

Limited) vaskes i 1 time med 65¾ w/v myresyre og skylles derefter 5 omhyggeligt med destilleret vand. Prøver på hver 10 g lades adsorbere enzym (100 ml, 50,9 μΜ/min/ml, 4,7 μΜ/min/mg protein) i 16 timer i pH-værdiområdet 4,8-9,0. Det pulveriserede nylon fjernes ved filtrering, behandles med glutaraldehyd (100 ml, 3,3% w/v) i 3 timer og fraskilles og vaskes som beskrevet i eksempel 1. Den højeste 10 opnåede aktivitet (pH-værdi 4,8) er 41,7 μΜ/min/g fugtig vægt, hvilket er sammenligneligt med et typisk præparat af IRC-50. Når imidlertid forskellen i partikelstørrelse mellem nylonet og IRC-50 tages i betragtning, ses det, at IRC-50 er langt overlegen. Således kan IRP 64 (farmaceutisk kvalitet af IRC-50, partikelstørrelse 0,037-15 0,149 mm) kobles med acylase til opnåelse af præparater med specifik aktivitet på 478 μΜ/min/g fugtig vægt, mere end 11 gange større end nylonpræparatemes aktivitet.

pH-Værdi Aktivitet, fugtig vægt μΜ/min/g 20 _ 4,8 41,7 5,2 36,1 5,6 26,9 6,0 22,2 25 6,4 15,7 7.0 17,6 7.5 17,6 8.0 21,3 8.5 15,7 30 9,0 9,3

Claims

1. Vanduopløseligt enzymcomplex, som omfatter et penicillinacylase-enzym adsorberet på et vanduopløseligt polymersubstrat og tværbundet med et tværbindingsmiddel, som er glutaraldehyd, glyoxal eller form- 5 aldehyd, kendetegnet ved, at polymersubstratet er en vanduopløselig eventuelt tværbundet homopolymer eller copolymer af methacrylsyre.

2. Enzymcomplex ifølge krav 1, kendetegnet ved, at enzymrenheden er i området 1,5-30 10 mikromol/min/mg protein.

3. Enzymcomplex ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at substratet er i makroporøs form.

4. Enzymcomplex ifølge krav 1, 2 eller 3, kendetegnet ved, at substratet er en copolymer af metha-15 crylsyre og divinylbenzen.

5. Enzymcomplex ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den polymere eller copolymere indeholder benzensulfonylgrupper.

6. Enzymcomplex ifølge krav 4, 20 kendetegnet ved, at substratet er en svagt sur, carboxylisk kationbytterharpiks, der kun har negligibel kapacitet ved pH under 4, og hvis saltform kan regenereres særdeles effektivt med syre, og som har en partikelstørrelse i våd Η*-form på 16-50 mesh, en initial kvældning (H+-form^Na+-form) på 100%, en reversibel kvældning (ff*--25 form->Na+-form) på 70%, en ioribytningskapacitet på 10,0 milliækviva- lenter/g (3,5 milliækvivalenter/ml) og en tilsyneladende pKa-værdi på 5,9.

7. Enzymcomplex ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at det er i form af findelte partikler 30 eller småkugler med partikelstørrelse i området 2,0-0,01 mm. DK 153502B

8. Fremgangsmåde til fremstilling af 6-aminopenicillansyre, ved hvilken benzylpenicillin eller phenoxymethylpenicillin eller et salt deraf i vandig opløsning, som holdes ved en pH-værdi fra 6,0 til 9,0, behandles med et vanduopløseligt enzymcomplex, hvilket enzymcomplex 5 omfatter et penicillinacylaseenzym adsorberet på et vanduopløseligt polymersubstrat og tværbundet med et tværbindingsmiddel, som er glutaraldehyd, glyoxal eller formaldehyd, kendetegnet ved, at polymersubstratet er en vanduopløselig eventuelt tværbundet homopolymer eller copolymer af methacrylsyre.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at penicillinacylaseenzymets renhed ligger i området 1,5-30 mikromol/min/mg protein.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 8 eller 9, kendetegnet ved, at substratet er i makroporøs form.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 8, 9 eller 10, kendetegnet ved, at substratet er en copolymer af methacrylsyre og di vinylbenzen.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at den polymere eller copolymere også 20 indeholder benzensulfonylgrupper.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, at substratet er en svagt sur carboxylisk kationbytterharpiks, der kun har negligibel kapacitet ved pH under 4, og hvis saltform kan regenereres særdeles effektivt med syre, og som 25 har en partikelstørrelse i våd H+-form på 16-50 mesh, en initial kvældning (H+-form-+Na+-form) på 100%, en reversibel kvældning (H+-form->Na+-form) på 70%, en ionbytningskapacitet på 10,0 milliækvi-valenter/g (3,5 milliækvivalenter/ml) og en tilsyneladende pKa-værdi på 5,9. DK 153502B

14. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8-13, kendetegnet ved, at enzymcomplexet er i form af findelte partikler eller småkugler med partikelstørrelse i området 2,0-0,01 mm.

15. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 8-14, kendetegnet ved, at reaktionstemperaturen er i området 30-50°C, og at pH-værdien holdes i området 7,0-8,5 ved kontinuerlig eller periodisk tilsætning af natriumhydroxid.