DK152220B - Enzymatisk detergentadditiv, detergent og fremgangsmaade til vask af tekstiler - Google Patents

Description

DK 152220 B

Den foreliggende opfindelse angar et enzymatisk detergentadditiv, et detergent og en fremgangsmåde til vask af tekstiler.

Det område, som omfatter enzymatiske additiver, har 5 været i kraftig vækst i de sidste decennier. Der kan f.eks.

henvises til artiklen "How Enzymes Got into Detergents”, bind 12, Developments in Industrial Microbiology, en publikation fra Society for Industrial Microbiology, American Institute of Biological Sciences, Washington, D.C. 1971, af Claus Dambmann, 10 Poul Holm, Villy Jensen og Mogens Hilmer Nielsen.

Det mest almindelige enzymatiske detergentadditiv er et proteolytisk additiv, men også lipolytiske detergentadditiver er beskrevet, f.eks. i USA patentskrift nr. 4 011 169, spalte 4, linie 65 til spalte 5, linie 68, og engelsk patentskrift nr.

15 1 293 613, side 2, linie 6 til 29.

Man kan også finde en omfattende oversigtsartikel om lipaser som detergentadditiver af Hans Andree et al. i Journal of Applied Biochemistry, 2, 218 - 229 (1980), med titlen "Lipases as Detergent Components".

20 Hvis vaskeprocessen gennemføres ved høj temperatur og høj alkalinitet, vil det fedtindeholdende snavs blive opløst ved forsæbning. Man foretrækker imidlertid på grund af energikrisen vaskeprocesser ved lav temperatur (omkring 60°C og derunder), og ved disse lave temperaturer kan de kendte lipaser kun opløse en 25 del af det fedtholdige snavs.

Effektiviteten af lipolytiske enzymatiske detergentadditiver kan hensigtsmæssigt måles ved hjælp af EMPA-lapper nr.

101 (olivenolie/bomuld) og 102 (olivenolie/uld) under anvendelse af den metode, der er beskrevet i engelsk patentskrift nr. 1 361 30 386 (især side 4 og 7) og USA patentskrift nr. 3 723 250 (især spalte 15 - 19). EMPA er en forkortelse for Eidgenossische Materialpriifungs- und Versuchsanstalt, St. Gallen, Schweiz.

Herved har det vist sig, at de enzymer, der er kendt som lipolytiske detergentadditiver, er ret utilfredsstillende i den 35 forstand, at de udviser en utilfredsstillende lav lipolytisk renseeffektivitet, hvilket manifesterer sig ved den lave værdi af den differentielle remissionsværdi Δ R ved i økonomisk henseende rimelige lipaseaktiviteter i vaskeflotten.

DK 152220 B

Der foreligger således et behov for et lipolytisk detergentadditiv, som udviser en betydeligt bedre lipolytisk renseeffektivitet, svarende til en betydeligt højere differentiel remissionsværdi, & R, ved i økonomisk henseende rimelige lipase-5 aktiviteter i vaskeflotten.

I henhold til det første træk ved opfindelsen er der tilvejebragt et lipolytisk detergentadditiv, som udviser en betydeligt bedre lipolytisk renseeffektivitet, svarende til en betydeligt højere differentiel remissionsværdi, Δ. R, ved i økono-10 misk henseende rimelige lipaseaktiviteter i vaskeflotten, hvorved dette lipolytiske detergentadditiv er kendetegnet ved, at lipasen er identisk med den lipase, der produceres ved hjælp af Fusarium oxysporum DSM 2672, ATCC 7808, CBS 620.72, CBS 645.78 eller CBS 794.70.

15 Definitionen af arten Fusarium oxysporum har ændret sig noget i de sidste decennier. I forbindelse med denne opfindelse er definitionen af arten Fusarium oxysporum imidlertid fastlagt som den definition, der er angivet i "The Genus Fusarium", C. Booth, CMI, 1971.

20 I forbindelse med visse stammer af Fusarium oxysporum er der beskrevet en lipasedannelse, jfr. f.eks. Agric.Biol.Chem. 43 (10) (1979), 2126, tabel I, hvor der figurerer en lipase fra Fusarium lini (i henhold til den ovenfor angivne definition af Fusarium oxysporum tilhører Fusarium lini nu Fusarium oxysporum), 25 og Indian Journal of Experimental Biology, bind 11, (1973), side 37 - 39 med benævnelsen "Lipids and Lipase Activity in Strains of Fusarium vasinfectum" (i henhold til den ovenfor angivne definition af Fusarium oxysporum tilhører Fusarium vasinfectur. nu Fusarium oxysporum).

30 Nogle stammer hørende til Fusarium oxysporum er dårlige lipaseproducenter. I forbindelse med den foreliggende opfindelse defineres en lipaseproducerende stamme af Fusarium oxysporum som en stamme, der producerer mere end 10 LU/ml (LU er lipaseen-heder, som er defineret senere i denne beskrivelse) under 35 følgende betingelser: man fremstiller et substrat, der er tænkt anvendt i rystekolber, med følgende bestanddele i gram per liter:

3 DK 152220 B

Sojabønnemel .......... 45

Glucose ............... 70 KH2P04 ................ 2

Na2HP04 ............... 3 5 Sojaolie .............. 5

Steriliseringen fandt sted ved 12l°C i 40 minutter. En 500 ml Erlenmeyerkolbe med 100 ml substrat blev podet med sporer fra et skråagarglas, som tidligere var blevet podet med den stamme af Fusarium oxysporum, som skal udersøges hvad angår 10 lipaseproduktion. Kolberne blev rystet ved 230 omdrejninger pr. minut og ved 30°C i 5 dage, hvorefter lipaseudbyttet blev bestemt. Der skal henvises til eksempel 29.

Det har således overraskende vist sig, at detergentadditivet ifølge opfindelsen udviser en på drastisk måde forbedret 15 lipolytisk renseeffektivitet, hvilket vil fremgå af den dokumentation, som præsenteres senere i denne beskrivelse.

Det har vist sig, at lipasen fra Fusarium oxysporum stammerne DSM 2672, ATCC 7808, CBS 620.72, CBS 645.78 og CBS

794.70 udviser gennemsnitlige værdier for pH-aktivitetsoptimet på 20 omkring 9 - 11, og at det gennemsnitlige temperaturaktivitetsoptimum er omkring 35 - 50°C (analysetid: 20 minutter). På basis af krydset immunelektroforese med antistoffer fremstillet ud fra lipasen fra DSM 2672 har det vist sig, at de lipaser, der hidrører fra de før angivne 5 stammer, er identiske 25 eller partielt identiske. På basis af de før angivne iagttagelser kan man drage den slutning, at den aktive komponent af det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen er en gruppe af tæt beslægtede lipaser.

Lipaseaktiviteten bestemmes i henhold til NOVO-metoden 30 til bestemmelse af lipaseaktivitet. Denne metode er baseret på hydrolysen af tributyrin af enzymet. Den smørsyre, som frigøres, bestemmes ved titrering med NaOH. En NOVO-lipaseenhed (LU) er den mængde enzym, der i en pH-stat og under de nedenfor angivne standardbetingelser frigør en mængde titrerbar smørsyre, som er 35 ækvivalent med 1 pmol NaOH per minut.

DK 152220B

Standardbetingelser

Temper atur .......... 30,0°C

pH.................. 7,0

Reaktionstid ........ 20 minutter 5 Substrat ............ tributyrin

Yderligere detaljer om denne metode er beskrevet i publikationen AF 95/4 dateret 1982-08-18; denne kan rekvireres fra NOVO Industri A/S, Bagsværd, Danmark.

Lipasen i det enzymatiske detergentadditiv ifølge 10 opfindelsen er med fordel identisk med den lipase, der produceres ved hjælp af Fusarium oxysporum DSM 2672. Stammen Fusarium DSM 2672 er blevet klassificeret som Fusarium oxysporum Schlecht ex Fries, emend. Snyder & Hansen. De morfologiske egenskaber af stammen DSM 2672 Fusarium oxysporum svarer nøjagtigt til 15 artsbeskrivelsen af Fusarium oxysporum i The Genus Fusarium, C. Booth, CMI, 1971. pH-aktivitetskurven af lipasen er blevet tegnet op, hvorved lipaseaktiviteten er målt i henhold til AF 95/4-GB, modificeret ved indstilling af substratets pH-værdi til 4, 5 og 6, og 8, 9 og 10 ved siden af substratets normale pH-værdi på 7. 20 På grund af det forhold, at tributyrin nedbrydes uden lipase ved høje pH-værdier, korrigeres pH-kurven for en sådan autodekomposition. Herved har man fundet et pH-aktivitetsoptimum på ca. 10. Stabiliteten af enzymet er udmærket over et bredt pH-interval, idet man kan iagttage en restaktivitet på over 80% 25 efter 18 timer i pH-intervallet 4,5 - 11 ved 5°C cg i pH- intervallet 5-10 ved 25°C. Temperaturoptimet for lipaseaktiviteten er ca. 40°C. Enzymet er stabilt op til 40°C i 30 minutter, hvilket er meget fordelagtigt i forbindelse med de tidligere anførte vaskeprocesser ved lave temperaturer omkring 60°C og 30 derunder.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen foreligger additivet som et ikke støvende granulat. Disse granulater kan fremstilles på mange forskellige måder. Der kan henvises til GB 35 patentskrift nr. 1 362 365, som beskriver fremstillingen af enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver ved hjælp af et apparat omfattende en ekstruder og en sfæronisator (solgt som

5 DK 152220 B

MARUMERIZER®) og US patentskrift nr. 4 106 991, der beskriver fremstillingen af enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver ved hjælp af en tromlegranulator.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for det 5 enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen foreligger additivet som en væske med et enzymstabiliserende middel. Det stabiliserende middel kan være propylenglycol eller andre midler, der er kendte som stabiliserende midler til enzymopløsninger. Flydende .detergenter udviser en voksende popularitet på grund af 10 den lethed, hvormed de tilføres.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen ligger lipaseak-tiviteten mellem ca. 20.000 og ca. 100.000 LU/g additiv. På denne måde frembringes der en hensigtsmæssig lipaseaktivitet i vaske-15 flotten, når detergentadditivet tilsættes til detergentet i en mængde af 0,2 - 2 g/100 g detergent, og når detergentet tilsættes til vaskeflotten i en mængde på 1 - 5 g detergent/1 vaskeflotte.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen indeholder 20 additivet et proteolytisk enzym ved siden af lipasen. Det har overraskende vist sig, at det proteolytiske detergentadditiv ikke nedbryder lipasen (som er et protein), hverken i additivet, i detergentet eller i vaskeflotten. De proteolytiske og de lipoly-tiske detergentadditiver er således forligelige, og det har vist 25 sig, at dette detergentadditiv har en meget høj renseeffektivitet, hvilket resulterer i en meget høj AR værdi. Det proteolytiske enzym ALCALASE® fra NOVO Industri A/S, fremstillet ad mikrobiel vej ved hjælp af Bacillus licheniformis, kan anvendes med fremragende resultater. Det blandede enzymatiske 30 additiv kan enten fremstilles ved blanding af et i forvejen fremstillet granulat af proteinase med et i forvejen fremstillet granulat af lipase eller ved blanding af et koncentrat af proteinase med et koncentrat af lipase, efterfulgt af, at denne blanding indføres i et granuleringsapparat sammen med de 35 sædvanlige granuleringshjælpemidler.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen ligger den proteolytiske aktivitet mellem ca. 0,5 og ca. 3,0 Ansonenheder/g

6 DK 152220B

additiv. På denne måde fremkommer der en hensigtsmæssig proteolytisk aktivitet i vaskeflotten, når detergentadditivet tilsættes til detergentet i en mængde på 0,2 - 2 g/100 g detergent, og når detergentet tilsættes til vaskeflotten i en 5 mængde på 1 - 5 g detergent/1 vaskeflotte.

Det andet træk ved opfindelsen er et detergent indeholdende et enzymatisk detergentadditiv, hvis aktive komponent er en ad mikrobiel vej fremstillet lipase, hvor det enzymatiske detergentadditiv er det enzymatiske detergentadditiv 10 ifølge opfindelsen.

Ved en særligt foretrukket udførelsesform for detergentet ifølge opfindelsen indeholder detergentet det enzymatiske cetergentadditiv ifølge opfindelsen i en mængde på mellem 0,2 og 2,0% w/w. På denne måde fremkommer der en rimelig balance mellem 15 enzymvirkning og virkningen af de andre detergentbestanddele.

Opfindelsens tredje træk er en fremgangsmåde til vask af tekstiler, hvilken fremgangsmåde foretages ved en pH-værdi, der ligger mellem 7 og 11, hvorved temperaturen er under 60°C, oc hvorved detergentet ifølge opfindelsen anvendes som detergent.

20 Ved en særligt foretrukket udførelsesform for frem gangsmåden ifølge opfindelsen indeholder vaskeopløsningen detergentet ifølge opfindelsen i en mængde på mellem 1 og 5 g/1 vaskeflotte. På denne måde fremkommer der en hensigtsmæssig enzymaktivitet i vaskeflotten, d.v.s. typisk mellem 1000 og 5000 LU/1 25 vaskeflotte. Under disse betingelser opnår man meget høje Δ R værdier ved sædvanlige vasketider, d.v.s. ca. 20 minutter.

Opfindelsen skal nu illustreres ved de følgende eksempler.

Eksempel 1 30 Dette eksempel illustrerer fremstillingen i rystekolber af den aktive komponent i det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen.

Substratet består af de følgende bestanddele i gram per liter.

7 DK 152220 Β Λ

Sojabønnemel 50 Glucose 50 KH2P04 2

Na2HP04 3 5 Sojaolie 1

Steriliseringen fandt sted ved 121°C i 40 minutter. Man 7 podede en 500 ml Erlenmeyerkolbe med 100 ml substrat med 10 sporer fra et agarskråglas, som tidligere var podet med Fusariuir. oxysporum DSM 2672. Kolberne blev rystet med en hastighed af 230 10 omdrejninger pr. minut og ved 25 - 30°C i 2 - 5 dage. Udbyttet var 30 - 80 LU/ml.

Eksempel 2

Dette eksempel og eksemplerne 3-15 illustrerer fremstillingen af den aktive komponent i det enzymatiske deter-15 gentadditiv ifølge opfindelsen i en laboratoriefermentor med en volumenkapacitet på 2 liter. Man tilvejebragte en 500 ml Erlenmeyerkolbe med 260 ml af følgende medium.

Glucose 24 g per liter

Majsstøbevand 24 g - 20 Sojaolie 3,8 g - calciumcarbonat 3,8 g -pH = 5,5 før tilsætning af CaCO^

Steriliseringen fandt sted ved 121°C i 40 minutter. Efter podning med sporer fra et agarskråglas på samme 25 måde som angivet i eksempel 1 blev kolben omrørt med en hastighed af 230 omdrejninger pr. minut og ved 30°C i 2 dage. 120 ml af denne podekultur blev overført til en fermentor med en volumenkapacitet på 2 liter og indeholdende 1,3 liter medium, som blev steriliseret i 1 time ved 121°C, og som havde følgende 30 sammensætning:

8 DK 152220 B

Glucose 50 g per liter

Sojabønnemel 50 g - KH2P04 2,0 g -

Na2HP04 2H20 3,0 g - 5 Sojaolie _10 g -

Pluronic 0,3 ml

Efter podningen initieredes beluftningen (700 ml/min). Man initierede også omrøringen, og dennes hastighed var 600 omdrejninger per minut i de første 24 timer, og derefter forøges 10 den til 800 omdrejninger per minut. Temperaturen blev holdt på 30°C. Man gærede i 100 timer, i løbet af hvilket tidsrum pH-værdien steg fra 6,3 til 8,5. Supernatanten blev analyseret, og det viste sig, at lipaseaktiviteten var 90 LU/ml.

Man gennemførte en forsøgsserie på samme måde som 15 angivet i eksempel 2, med undtagelse af temperaturen, jfr. den følgende tabel.

Eksempel nr. 3_4_5_6 7

Temperatur i fermentoren, 20 °C 28 30 32 34 36 LU/ml i supernatanten 60 90 125 140 60

Af den ovenfor angivne tabel fremgår det, at den optimale temperatur er ca. 34°c.

25 For at undersøge indflydelsen af pH gennemførtes to nye forsøg ved 34°C og som angivet i eksempel 6, med undtagelse af pH: i intet af de to forsøg blev pH kontrolleret i de første 24 timer af gæringen i fermentoren; i det første forsøg (eksempel 8) blev pH holdt på 6,5 ved hjælp af Η^Ρ04 efter de første 24 30 timers gæring i fermentoren, og i det andet forsøg (eksempel 9) blev pH ikke styret på noget tidspunkt under hele gæringen. · Resultaterne fremgår af den nedenstående tabel.

DK 152220B

Eksempel nr._8_9

Temperatur i fermentor, °C 34 34 5 efter 24 timer holdt på 6,5 x '

PH

ingen regulering x 10 _ LU/ml i supernatanten 180 140

Af den ovenfor angivne tabel fremgår det, at lipaseud-byttet forbedres, hvis pH-værdien styres på den angivne måde.

For at undersøge indflydelsen af omrøringsgraden 15 gennemførtes tre forsøg på samme måde som angivet i eksempel 8, med undtagelse af omrøringsgraden: omrøringshastigheden blev hævet fra 600 omdrejninger per minut til forskellige niveauer under hele gæringstiden efter de første 24 timers gæring, jfr. den følgende tabel. Også resultaterne fremgår af den følgende 20 tabel.

Eksempel nr._10 11 12

Temperatur i fermentor, °C 34 34 34

Efter 24 timer blev 25 pH holdt på 6,5 x x x

Hastighed cf omrører, omdrejninger per min. 700 800 900 LU/ml i supernatanten 100 180 160

Af den ovenfor angivne tabel fremgår det, at den 30 optimale omrøringsgrad er ca. 800 omdrejninger/minut.

10 DK 152220 B

For at undersøge påvirkningen af koncentrationen af sojaolie i fermentationsmediet udførte man tre forsøg på samme måde som angivet i eksempel 11 (d.v.s. med optimale værdier for temperatur, pH og omrøringsgrad), med undtagelse af koncentra-5 tionen af sojaolie, se den følgende tabel.

Eksempel nr._13 14 15

Temperatur i fermentor, °C 34 34 34

Efter 24 timer blev 10 pH holdt på 6,5 x x x

Hastighed af omrører, omdrejninger/minut 800 800 800 sojaolie, % 012 LU/ml supernatant 50 170 170 15 Eksempel 16

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af den aktive komponent i det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen i en fermentor i pilot plant skala.

I en podetank med et volumen på 300 1 fremstilledes 20 følgende medium.

Majsstøbevand 7,2 kg

Sojaolie 1,5 -

Calciumcarbonat 1,5 -

Pluronic 25 ml 25 Vand ad 290 1

Mediet blev steriliseret ved 121°C i en timel En tolv liter opløsning indeholdende 7,2 kg glucose og 7,2 g citronsyre blev steriliseret ved 121°C i en halv time og tilsat til blandingen med majsstøbevand. Efter afkøling til 30°C blev mediet 30 podet med sporer af DSM 2672 fra en Fernbachkolbe med gærekstrakt, phosphat, magnesium, glucose og agar, og som var blevet inkuberet ved 30°C i 7 dage. Man initierede øjeblikkeligt beluft-

11 DK 152220B

ningen (300 1/minut) og omrøringen (250 omdrejninger/minut) blev initieret efter 20 timers forløb. Temperaturen blev holdt på 30°C, og væksten blev opretholdt i 29 timer. 30 liter af denne podekultur blev overført til hovedfermentoren, som indeholder: 5 ” Sojabønnemel 15 kg KH2P04 0,6 -

Na2HP04 12H20 1,2 -

Sojaolie 3

Pluronic 25 ml 10 Vand ad 275 liter

Mediet blev steriliseret i 1 time ved 121°C. 15 kg glucose og 15 g citronsyre i 25 liter vand blev steriliseret separat ved 121°C i 30 minutter og tilsat til blandingen med sojabønnemel.

15 Efter podningen initieredes beluftningen (300 liter/minut). Omrøringen blev også initieret, og hastigheden deraf blev forøget til 400 omdrejninger/minut under de første 10 timers gæring. Temperaturen blev holdt ved 34°C. Gæringen blev gennemført i 60 timer, hvorved pH-værdien steg fra 6,64 til 8, og 20 derpå blev tanken afkølet og myceliet separeret ved centrifugering. Den flydende supernatant blev analyseret, og det viste sig, at lipaseaktiviteten var 90 LU/ml.

Eksempel 17

Dette eksempel illustrerer fremstillingen af den aktive 25 komponent i det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen i en fermentor af pilot plant skala.

Lipasen blev fremstillet ved submers aerob gæring af Fusarium oxysporum DSM 2672.

Man fremstillede et agarsubstrat med følgende 30 sammensætning i en Fernbachkolbe:

12 DK 152220B

Gærekstrakt Difco 4 g K-HPO. 1 2 4

MgS04 7H20 0,5 -

Glucose 15 5 Destilleret vand ad 1000 ml

Agar Merck ' 15 - g

Blandingen blev autoklaveret i 40 minutter ved 120°C. (Substratet benævnes YPG-agar)

Stammen DSM 2672 blev kultiveret ved 30°C i en uge på 10 en YPG-skråagar. Sporerne fra skråagaren blev suspenderet i - steriliseret skummetmælk, og suspensionen blev lyophiliseret i små beholdere. Indholdet af en lille beholder med lyophiliseret materiale blev overført til Fernbachkolben. Kolben blev derpå inkuberet en uge ved 30°C.

15 Man fremstillede et substrat med følgende sammensætning i en 500 liter podefermentor:

CaCO^ 1,5 kg

Glucose 7,2 -

Majsstøbevand 7,2 - 20 Pluronic® skumdæmpningsmiddel 30 ml

Man tilsatte ledningsvand til et totalt volumen på ca. 240 liter. pH-værdien blev indstillet på ca. 5,5 før tilsætning af CaCO^. Substratet blev dampsteriliseret i 25 podefermentoren i 1 time ved 121°C. Det sluttelige volumen før podningen var ca. 300 liter.

Sporesuspensionen fra Fernbachkolben blev overført til podefermentoren. Betingelserne i podefermentoren var:

DK 152220B

Fermentortype: Konventionelt beluftet og omrørt fermentor med et forhold højde/diameter på ca. 2.

Omrøring: 300 omdrejninger/minut (to 5 turbineblade)

Beluftning: - 300 normale liter luft per minut

Temper atur: 3 0 °C

Tryk: 0,5 atm.

Tid: Ca. 17 timer 10 For at forhindre overdreven skumning var reduktion af omrørings- og beluftningshastigheden mulig. I den her beskrevne podefermentor anvendte man imidlertid ikke denne mulighed. Efter 1/2 - 1 dag, når der var opnået god vækst, her ca. 17 timer efter podning, overførtes 15 25 liter fra podefermentoren til hovedfermentoren.

Man fremstillede et substrat med følgende sammensætning i en 500 liter hovedfermentor:

Ristet, afskallet sojamel 39 kg

Glucose 15 ' - 20 Sojaolie 3 KH2P04 0,6 -

Na2HP04 12H20 1,2 -

Pluronic® skumdæmpningsmiddel 30 ml 25 Man tilsatte vandværksvand til et totalt volumen på ca.

250 liter. Sojabønnemelet blev suspenderet i vand. pH-værdien blev indstillet på 8,0 med Na2C02, og temperaturen blev hævet til 50°C. Derefter tilsattes ca. 480 Ansonenheder Alcalase®L (4 AU/ml) til suspensionen.

30 Blandingen blev holdt ved 50°C og pH = 8,0 (tilsætning af Na2C02) i 4 timer uden nogen beluftning, ved et overtryk på 0 atm. og ved en omrøring på 150 - 200 omdrejninger/minut. Derefter tilsatte man de resterende substratkomponenter, og pH blev indstillet til ca. 6,5 35 med phosphosyre. Substratet blev vanddampsteriliseret i hovedfermentoren i en time ved 121°C. Efter afkøling til 34°C blev pH indstillet til ca. 6,0 med en sterili-

14 DK 152220B

seret opløsning af ^200^ (3 kg ^200^ i 20 liter totalt volumen). Det sluttelige volumen før podning var ca. 280 liter. Derpå tilsattes 25 liter podekultur.

Gæringsbetingelserne var: 5 Fermentortype: Konventionelt beluftet og omrørt fermentor med et forhold højde/diameter på ca. 2.

Omrøring: 150 omdrejninger/minut (0-6 timer) og 400 omdrejninger/minut (6 timer til 10 afslutning) (2 turbineblade).

Beluftning: 200 - 250 normale liter luft/minut (0 -

22 timer) og 300 normale liter luft/minut (22 timer til afslutning). Temperatur: 34°C

15 Tryk: 1,0 atm (0 - 34 timer) og 0,5 atm (34 timer til afslutning)

Tid: ca. 112 timer.

For at forhindre overdreven skumning var det muligt at variere omrøringen, beluftningen og trykket. Ved den 20 her beskrevne gæring anvendte man denne mulighed, hvilket fremgår af de ovenfor angivne data.

pH-værdien under gæringen blev holdt på ca. 6,5 ved tilsætning af en opløsning af phosphorsyre. Ved den her beskrevne gæring doseres fra tidspunktet svarende til ca. 30 gæringstimer 25 til afslutningen af gæringen. Man fremstillede opløsningen af phosphorsyre i en 500 liter dosistank på følgende måde: til 20 kg koncentreret phosphorsyre (80%) tilsattes vandværksvand til et totalt volumen på ca. 160 liter. Opløsningen blev vanddampsteriliseret i doseringstanken i en time ved 121°C. Det sluttelige 30 volumen før initieringen af doseringen var ca. 200 liter. Man tilsatte kun den mængde phosphorsyreopløsning, som krævedes til at holde pH-værdien under gæringen på ca. 6,5 til hovedfermentoren.

15

DK 152220B

Under gæringen tilsattes steriliseret skumdæmpningsmid-del P2000 (polypropylenglycol) til hovedfermentoren for at holde skumdannelsen nede. Ved den her beskrevne gæring anvendtes 3,5 liter P2000.

5 Efter ca. 112 gæringstimer standsedes gæringsprocessen.

Hovedfermentoren indeholdt ca. 315 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var ca. 200 LU/g gæringsvæske, målt i henhold'til NOVO's LU-bestemmelsesmetode nr. 95/5-GB med tributyrin som substrat.

10 Eksempel 18

Lipasen blev fremstillet som beskrevet i eksempel 17, men gæringen blev gennemført i en 2500 liter hovedfermentor med tilsvarende større substratmængder og -volumina.

Omrøring: 250 omdrejninger/minut (to turbineblade) 15 For at forhindre overdrevet skumning varieres beluft- ning og tryk på følgende måde:

Beluftning: 750 NI luft/minut (0 - 13 timer) 1200 NI luft/minut (13 - 37 timer) 1500 Ni luft/minut (37 timer til 20 afslutning)

Tryk: 0,7 atm (0 - 25 timer) 0,5 atm (25 timer til slut)

Der tilsattes intet skumdæmpningsmiddel P2000 ved denne gæring. Ved slutningen af gæringen indeholdt fermentoren ca. 1800 25 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var ca. 125 LU/g gæringsvæske.

Eksempel 19

Lipasen blev fremstillet som i eksempel 17, men gæringen blev gennemført i en 2500 liter hovedfermentor med 30 tilsvarende større mængder og volumina af substrat, og man undgik behandlingen med Alcalase af sojamelet. Man anvendte 200 kg soja-mel, og voluminet før podningen var 1400 liter. Substratet blev vanddampsteriliseret i hovedfermentoren i 1,5 time ved 123°C.

Omrøring: 250 omdrejninger/minut (to turbineblade)

DK 152220B

For at forhindre overdreven skumning varieres beluftning og tryk på følgende måde:

Beluftning: 750 NI luft/minut (0-3 timer) 900 NI luft/minut (3-11 timer) 5 1100 NI luft/minut (11 - 24 timer) 1300 NI luft/minut (24 - 27 timer) 1500 NI luft/minut (27 timer til afslutningen)

Tryk: 1,0 atm (0-27 timer) 10 0,75 atm (27 - 40 timer) 0,5 atm (40 timer til afslutning)

Der tilsattes ved denne gæring ikke noget skumdæmpningsmiddel P2000. Ved slutningen af gæringen indeholdt fermentoren ca. 1400 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var 15 ca. 198 LU/g gæringsvæske. Gæringstiden var ca. 140 timer.

Eksempel 20

Lipasen fremstilledes som beskrevet i eksempel 17, men gæringen blev gennemført i en 2500 liter hovedfermentor med tilsvarende større substratmængder og -volumina, og behandlingen 20 med Alcalase af sojamelet blev udeladt. Man anvendte 170 kg sojamel, og voluminet før podning var 1400 liter. Substratet blev vanddampsteriliseret i hovedfermentoren i 1,5 time ved 123°C.

Omrøring: 250 omdrejninger/minut (to turbineblade)

For at forhindre overdreven skumning varieredes 25 beluftning og tryk på følgende måde:

17 DK 152220 B

Beluftning: 750 Ni luft/minut (0 - 11 timer) 1150 NI luft/minut (11 - 19 timer) 1300 NI luft/minut (19 - 27 timer) 1500 Ni luft/minut (27 timer til 5 > afslutning)

Tryk: 1,0 atm (0-27 timer) 0,5 atm (27 timer til afslutningen)

Ved denne gæring anvendtes 0,5 liter skumdæmpningsmiddel P2000. Ved slutningen af gæringen indeholdt fermentoren ca.

10 1400 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var ca. 221 LU/g gæringsvæske. Gæringstiden var ca. 144 timer.

Eksempel 21

Lipasen blev fremstillet som beskrevet i eksempel 17, men koncentrationen af sojamel i substratet i hovedfermentoren 15 var reduceret til 5%, og man udelod behandlingen med Alcalase af sojamelet.

For at forhindre overdreven skumning varierede man omrøringen på følgende måde:

Omrøring: 0 omdrejninger/minut (0-22 timer) 20 100 - 150 omdrejninger/minut (22 - 33 timer) 300 omdrejninger/minut (33 timer til afslutning)

Der tilsattes ikke noget skumdæmpningsmiddel P2000 ved denne gæring. Ved afslutningen af gæringen indeholdt fermentoren 25 ca. 310 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var ca. 146 LU/g kulturvæske.

Eksempel 22

Lipasen blev fremstillet som beskrevet i eksempel 17, men koncentrationen af sojamel i substratet i hovedfermentoren 30 var reduceret til 5%, man udelod behandlingen med Alcalase, sojaolie blev fjernet fra det oprindelige gæringsmedium, og i

18 DK 152220B

stedet for tilsatte man steriliseret sojaolie til hovedfermen-toren, 1 liter ad gangen, efter 48, 60, 72 og 84 gæringstimer, totalt 4 liter sojaolie.

For at forhindre overdreven skumning varierede man 5 omrøring, beluftning og tryk på følgende måde: .

Omrøring: 200 - 300 omdrejninger/minut (0-24 timer) 400 omdrejninger/minut (24 timer til afslutning)

Beluftning: 150 NI luft/minut (0-17 timer) 10 275 NI luft/minut (17 - 25 timer) 300 NI luft/minut (25 timer til afslutning) Tryk: 0,9 - 1,0 atm (0-33 timer) 0,5 atm (33 timer til afslutning)

Ved denne gæring anvendte man 2 liter P2000 skumdæmp-15 ningsmiddel.

Ved slutningen af gæringen indeholdt fermentoren ca.

285 liter kulturvæske, og det opnåede lipaseudbytte var ca. 113 LU/g kulturvæske.

Eksempel 23 20 Kulturvæsken fra eksempel 19 blev indstillet på pH 8,0 med natriumhydroxyd og flokkuleret med 1% calciumchlorid, 1% "Servamine KZA 346" kationisk flokkuleringsmiddel, 0,03% "Superfloc A-130" anionisk flokkuleringsmiddel og 0,5% "Triton X-100" tensid, som frigør lipaseaktiviteten fra myceliet.

25 Den flokkulerede kulturvæske blev centrifugeret på en skivecentrifuge (Westfalia SAMS).

Centrifugatet blev indstillet på pH 4,5 med eddikesyre. Ved dette pH dannedes et bundfald. Bundfaldet blev separeret fra supernatanten ved centrifugering (Westfalia SAMS) og derpå 30 behandlet med Triton X-100. Det behandlede bundfald blev derpå fortyndet med vand og centrifugeret igen.

Centrifugatet fra de to centrifugeringer blev_blandet, og slammet fra det andet centrifugeringstrin blev kasseret.

Centrifugatet blev diafiltreret (DDS-modul GR60P-35 membraner) og derpå ultrafiltreret og koncentreret.

19 DK 152220 B

Det efter ultrafiltrering foreliggende koncentrat blev filtreret på et polypropylenklæde med "Hyflo Super-Cell" filterhjælpemiddel. Filtratet blev derpå indstillet til pK 8,0 med natriumhydroxid og filtreret på Supra 100 filterplader (Seitz) og 5 til sidst kimfiltreret på Supra EKS (Seitz).

Kimfiltratet blev bundfældet med en lige så stor mængde acetone og vasket med ren acetone.

Bundfaldet blev tørret i et vakuumkammer. Det fremkomne tørrede koncentrat havde en aktivitet på ca. 90.000 LU/g.

10 Eksempel 24

Vaskeeffektivitet af lipase fra Fusarium oxysporum DSM 2672 i sammenligning med andre lipaser.

Forsøgsmateriale: EMPA 101 (olivenolie/bomuld)

Detergentopløsning: Detergent A *), 5 g/1 10°dH vand

15 Vaskemaskine: TERG-O-TOMETER

Vaskeprogram: 40°C i 20 minutter

Antal lapper: 9/900 ml vaskeflotte

Lipase: Fusarium oxysporum lipase

Aspergillus niger, AMANO AP6 20 Candida cylindracea, Sigma

Mucor miehei, SP 225

Lipasekoncentration: 0, 750, 1500, 2250, 3000 LU/1

Lipaseaktivitetsenhederne fra Fusarium oxysporum DSM 2672 blev indført som passende volumina af supernatanten fra 25 centrifugeringen af den kulturvæske, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1.

Vaskeeffektiviteten udtrykkes som R = Remissionsværdi, målt ved Elrepho-fotometeret, filter R 46, gennemsnit af to aflæsninger på 9 lapper.

20 DK 152220 B

*) Detergent A havde følgende sammensætning:

Lineært alkyl-benzen-sulfonat (LAS, anionisk overfladeaktivt middel 17%

Nonyl-phenol-ethoxylat, EO = 12 (ikke-ionisk 5 overfladeaktivt middel) _ 3%

Natriumtripolyphosphat (STPP) 30%

Natriumsilicat 4%

Natriumcarbonat 3%

Natriumsulfat 37% 10 Vand 6% I tabellen forekommer resultaterne som R og = R-Rq, hvor Ro er remissionsværdien af lapper, som er vasket uden lipase, og hvor R er remissionsværdien af lapper, der er vasket med lipase.

15 Lipasekoncentration, LU/1 750 1500 2250 3000

Lipase R AR R R Ar R AR

Ingen, Rq 46,1 0,0 46,1 0,0 45,1 0,0 45,2 0,0

Fusarium oxysporum 20 DSM 2672 lipase - - 53,2 7,1 53,4 8,3 54,0 8,8 A. niger, AMANO AP6 47,0 0,9 48,2 2,1 48,6 3,5 49,8 4,6 C. cylindracea, Sigma 46,2 0,1 46,4 0,3 46,4 1,3 45,6 0,4 M. miehei, SP 225 49,6 3,5 48,1 2,0 49,9 4,8 49,6 4,4

Eksempel 25 25 For at påvise den lipolytiske effekt på andre tekstil materialer end bomuld fremstilledes ligeledes forsøgsmaterialer på basis af polyester/bomuld og acryliske materialer.

21 DK 152220 B

Forsøgsbesmudsning: 10% olivenolie 1,5% emulgeringsmiddel 0,4% jordfarve 0,3% tusch 5 87,8% vand

Opløsningen blev emulgeret i en Rannie-homogenisator. Stykker af bomuld, polyester/bomuld og acrylisk materiale blev nedsænket i den homogeniserede opløsning. Overskuddet af besmuds-ning blev vredet af, og klædestykkerne blev tørret i en 10 rotationstørrer i 30 minutter.

Vaskebetingelser:

Forsøgsmateriale: Olivenolie på: I bomuld II polyester/bomuld III acrylisk materiale 15 Detergentopløsning: detergent B**), 3,25 g/1, 10°dH vand detergent C***), 1 g/1, 10°dH vand Vaskemaskine: Launder-O-Meter

Vaskeprogram: opvarmning fra 15°C til 40°C, opvarmningstid 37 minutter, vask ved 40°C i 12 minutter 20 Antal lapper: 3/300 ml vaskeflotte

Lipase: Fusarium oxysporum DSM 2672 lipase

Mucor miehei, SP 225 C. cylindracea, Sigma Pancreaslipase, Sigma 25 Lipasekoncentration: varierende værdier

Aktivitetsenhederne af Fusarium oxysporum DSM 2672 lipasen blev indført som passende mængder af et frysetørret pulver, som blev fremstillet på følgende måde. Man gennemførte en gæring i en 1 liter laboratoriebeholder på stort samme måde som 30 angivet i eksempel 1. Kulturvæsken blev centrifugeret, koncentreret ved ultrafiltrering og frysetørret.

22 DK 152220 B

**) detergent B havde følgende sammensætning:

Lineært alkyl-benzen-sulphonat (LAS, anionisk overfladeaktivt middel) 34%

Nonyl-phenol-ethoxylat, EO = 12 5 (ikke ionisk overfladeaktivt middel) ' 3%

Natr iumtripolyphosphat (STPP) 62%

Carboxymethylcellulose (CMC) 1% ***) detergent C er 100% nonyl-phenol-ethoxylat, EO = 12 (ikke ionisk overfladeaktivt middel).

10 Vaskeeffektiviteten udtrykkes som R = Remissionsværdi, målt ved hjælp af Elrepho photometeret, filter R 46, den gennemsnitlige værdi af to aflæsninger på tre lapper.

I tabellerne har Rq og samme betydning som angivet i eksempel 24.

15 Aktiv bestanddel i det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen.

Detergent B Detergent C

Forsøgs- Lipasekoncentration, LU/1 Lipasekoncentration, LU/1 materiale 0 84 167 333 1000 0 84 167 333 1000

20 Rq AR ar AR Ar Rq ar AR ar AR

bomuld 32,2 2,8 6,7 7,9 10,7 27,9 4,9 4,7 7,9 11,4 polyester /bomuld 44,8 2,9 3,5 3,9 3,6 31,6 4,4 5,0 4,6 5,2 25 acrylisk materiale . 56,7 3,9 5,6 7,0 6,7.33,7 5,8 10,5 11,0 10,2

DK 152220 B

23

Mucor miehei lipase

Detergent B Detergent C

Forsøgs- Lipasekoncentration LU/1 Lipasekoncentration, LU/1 materiale 0 750 3000 6000 10000 0 750 3000 6000 10000 5 RQ AR AR AR Rq AR 4R AR Ar bomuld 35,3 4,1 4,8 7,5 8,8 25,4 1,9 2,0 4,3 4,9 polyes- ter/bom- uld 44,3 2,3 3,1 3,7 1,6 31,4 1,8 2,0 1,8 1,0 10 acrylisk materiale 54,4 3,6 4,4 5,7 5,7 33,8 4,4 5,8 6,5 6,3 C. cylindracea, pancreaslipase Forsøgsmateriale: bomuld C. cylindracea lipase Pancreaslipase

Detergent Lipasekoncentration, LU/1 Lipasekoncentration, LU/1 15 0 250 500 750 3000 0 750 3000 6000 10000

Rq AR AR AR Ar Rq AR AR Ar 4r B 36,4 0,0 0,0 1,1 0,0 34,5 2,7 2,2 3,0 3,8 C 26,0 0,0 0,0 0,4 0,5 24,4 3,4 3,8 3,5 3,6

Eksempel 26 20 Dette eksempel viser forligeligheden af et proteolytisk enzym og lipasen i det enzymatiske detergentadditiv ifølge opfindelsen. Forsøgsmaterialet'var bomuld, der var tilsmudset som angivet i eksempel 25.

DK 152220B

Vaskebetingelser

Forsøgsmateriale: Bomuld tilsmudset som før angivet

Detergentopløsning: Detergent B, 3,25 g/1, 10° dH vand

DetergentjC, 1,0 g/1, 10° dH vand 5 Vaskemaskine: Launder-O-Meter

Vaskeprogram: Opvarmning fra 15°C til 40°C, opvarm ningstid 37 minutter, vask ved 40°C i 12 minutter.

Antal lapper: 3/300 ml vas.keflotte 10 Enzymer: Fusarium oxysporum DSM 2672 lipase

Alcalase 2,0 T

Lipasekoncentration: 0; 250; 500; 750; 3000 LU/1

Proteolytisk koncentration: 0; 0,06 eller 0,01; 0,02; 0,04; 0,08 15 AU/1

Aktivitetsenhederne af Fusarium oxysporum DSM 2672 lipasen blev indført som passende volumina af supernatanten fra centrifugeringen af den kulturvæske, hvis fremstilling er beskrevet i eksempel 1.

20 Den proteolytiske aktivitet måles i Ansonenheder/1 (AU/1) og bestemmes i henhold til den modificerede Ansonmetode, der er beskrevet i NOVO ENZYME INFORMATION IB nr. 058 e-GB (den oprindelige Ansonmetode er beskrevet i J.Gen.Physiol., 22, 79 -89 (1939)).

25 Vaskeeffektiviteten udtrykkes som angivet i eksempel 25.

Betydningen af symbolerne i tabellen er den samme som angivet i eksempel 24.

Resultaterne fremgår af den følgende tabel.

25 DK 152220 B

Lipase- Proteinase- Remissions- Detergent Detergent koncen- koncentra- værdi B C

tration tion AU/1 LU/1 5 0 0 Ro 35,1 27,0 250 0 AR 3,5 2,7 500 0 AR 3,8 3,2 750 0 AR 5,0 3,5 3000 0 ^R 7,5 6,5 10 250 0,06 ΔΚ 2,8 3,5 500 0,06 4R 3,4 5,1 750 0,06 4R 3,8 5,6 3000 0,06 ^R 5,4 6,4 0 0,01 4R 1,5 1,9 15 0 0,02 AR 1,2 2,4 0 0,04 &R 1,1 1,4 0 0,08 : &R 1,8 1,5

Eksempel 27

Dette eksempel illustrerer de overlegne vaskeegenskaber 20 af det lipolytiske detergentadditiv ifølge opfindelsen i sammenligning med kendte lipolytiske detergentadditiver.

Man anvendte to sæt vaskebetingelser: 1: 0 - 3000 LU/1, EMPA 101

Terg-O-Tometer: 40°C i 20 minutter 25 Detergent ALL + Na2SO^: 3,75 + 1,25 g/1, 10° dH, pH = 9,5 2: 0 - 3000 LU/1, 10% olivenolie/bomuld

Launder-O-Meter: europæisk vask 40°C Berol wasc (et ikke-ionisk tensid) 1,0 g/1; NOVO 30 detergent 3,25 g/1, 10° dH, pH 8,5/9,5

De 3,25 g NOVO detergent består af 1 g LAS, 2 g STPP, 0,05 g CMCog 0,1 g Berol wasc.

26 DK 152220 B

Den følgende tabel viser vaskeeffekten som &R-værdier for forskellige kendte lipolytiske detergentadditiver i sammenligning med det lipolytiske detergentadditiv ifølge opfindelsen. Mere end én værdi med en skråstreg mellem værdierne angiver, at 5 der blev foretaget to målinger.

Mikroorganisme Firma eller kom- Vaskebetingelser eller oprindelse mercielt navn 1 2 NOVO 3 A. niger Lipase A 0 10 AMANO AP G 5

Rhizopus rhizo- podiformis NOVO 0 SIGMA 0 0/0 C. cylindracea Lipase MY 0 15 Lipase OF 0/0 M. miehei NOVO 8 5/8 M. javanicus AMANO MAP-10 0 2/3 F. oxysporum NOVO 10 10/8 DSM 2672 20 B. circulans NOVO 6/5 (100 LU/1)

Geotrichum sp. NOVO 0

Pancreatin SIGMA 4/4

Overlegenheden af det lipolytiske detergentadditiv baseret på Fusarium oxysporum DSM 2672 i sammenligning med de 25 kendte lipolytiske detergentadditiver fremgår tydeligt af tabellen.

27 DK 152220 B

Eksempel 28

Dette eksempel illustrerer vaskeegenskaberne af lipaser fra forskellige lipaseproducerende Fusarium oxysporum stammer.

Forsøgsmaterialet var acrylisk tekstilmateriale 5 tilsmudset på følgende måde.

Forsøgstilsmudsning: 3% olivenolie 1,5% emulgeringsmiddel 0,4% jordfarve 0,3% tusch 10 87,8% vand

Opløsningen blev emulgeret i en Rannie-homogenisator. Stykker af acrylisk materiale blev nedsænket i den homogeniserede opløsning. Overskudet af besmudsning blev vredet af, og klædestykkerne blev tørret i en rotationstørrer i 30 minutter.

15 Forsøg I

Forudgående iblødsætning: 5 lapper (5 x 10 cm) iblød-sættes i 2 timer ved stuetemperatur i en flotte, der indeholder 50 ml fortyndet gæringsvæske og 5 ml opløsning A. Opløsning A: 20 Berol wasc (nonyl-phenol-ethoxylat) i 10°dH vand (0,00603% MgCl2 6H20, 0,0165% CaCl2 og 0,035% NaHCO^ i afioniseret vand).

Vask: Lapperne skylles i 10 minutter efter iblødsætning og vaskes i et Terg-O-Tometer ved 30°C i 10 minutter i en detergentflotte indeholdende 1,33 g TOP/liter vand med 10° dH.

25 Lapperne skylles i vandværksvand i 10 minutter efter at vasken er afsluttet og tørres.

Vaskeevnen udtrykkes som A R.

28 DK 152220B

Resultater

R0 AR

Enzymdosis LU/1 flotte svarende til den forudgå- 0 750 1500 3000 4500 9000 5 ende iblødsætning DSM 2672 5,7 6,2 6,7 8,4 8,4 30,9 ATCC 7808 3,9 5,1 6,0 6,7

Forsøg II 10 =========

Man anvendte en metode af lignende art som den, der er beskrevet i det foregående (forsøg I) til undersøgelse af kulturvæske fra nogle flere lipaseproducerende Fusarium oxysporum stammer.

15 Resultater

Rq

Enzymdosis LU/1 flotte svarende til den forudgå- 0 750 1500 3000 4500 9000 ende iblødsætning 20 DSM 2672 0,9 3,2 3,7 4,9 ATCC 7808 2,1 3,6 3,3 5,1 CBS 620.72 36,8 3,5 2,8 3,1 5,4 CBS 645.78 3,0 4,7 4,7 6,1 CBS 794.70 2,0 3,7 5,3 5,9 25 Eksempel 29

Dette eksempel illustrerer det forhold, at nogle Fusarium oxysporum stammer er lipaseproducenter i henhold til den definition, som er fremsat i denne beskrivelse, hvorimod andre Fusarium oxysporum stammer ikke er lipaseproducenter ifølge den 30 definition, der er fremsat i denne beskrivelse.

29 DK 152220B

Substratet til lipaseproduktion består af følgende bestanddele i g/1:

Sojabønnemel 45

Glucose 70 5 KH2P04 2

Na2HP04 3

Sojaolie 5

Sterilisering fandt sted ved 121°C i 40 minutter.

Elleve 500 ml Erlenmeyer beholdere, hver med 100 ml substrat, 10 blev podet med 10 sporer fra skråagarglas, som tidligere var blevet podet med elleve Fusarium arter. Kolberne blev rystet med 230 omdrejninger/minut og ved 30°C i 5 dage. Udbytterne er som vist i den følgende tabel:

Taksonomisk identificerende Intern identi- Officiel iden- Udbytte 15 betegnelse for stammen fikation tifikation LU/ml

Fusarium oxysporum Schlecht. C 597 DSM 2672 122,5 f.sp. vasinfectum A 1714 ATCC 7808 18,5 f.sp. chrysanthemi CBS 127.81 1,8 f.sp. cyclaminis CBS 159.57 5,1 20 - f.sp. gladioli A 1755 CBS 620,72 15,2 f.sp. lycopersici A 1756 CBS 645,78 14,6 f.sp. narcissi CBS 196,65 7,6 f.sp. opunciarum CBS 743.79 3,3 f.sp. passiflora CBS 744,79 7,9 25 - f.sp. perniciosum A 1760 CBS 794,70 10,9 f.sp. lini ATCC 109.60 1,3

Alle de stammer, der er angivet i denne beskrivelse, er almindeligt tilgængelige.

Claims (10)

1. Enzymatisk detergentadditiv, hvis aktive bestanddel er en mikrobielt produceret lipase, kendetegnet ved, at lipasen er identisk med den lipase, der produceres ved hjælp af

2. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1, kendetegnet ved, at additivet foreligger som et ikke-støvende granulat.

3. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1, kende tegnet ved, at additivet foreligger som en væske med et stabiliserende middel for enzymet.

4. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 2 og 3, kendetegnet ved, at lipaseaktiviteten ligger mellem ca. 15 20.000 og ca. 100.000 LU/g additiv.

5. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 1 til 4, kendetegnet ved, at additivet ved siden af lipasen indeholder et proteolytisk enzym.

5 Fusarium oxysporum DSM 2672, ATCC 7808, CBS 620.72, CBS 645.78 eller CBS 794.70.

6. Enzymatisk detergentadditiv ifølge krav 5, kende-20tegnet ved, at den proteolytiske aktivitet ligger mellem ca. 0,5 og ca. 3,0 Ansonenheder/g additiv.

7. Detergent indeholdende et enzymatisk additiv, hvis aktive komponent er en ad mikrobiel vej produceret lipase, kendetegnet ved, at det enzymatiske detergentadditiv er det 25 enzymatiske additiv ifølge krav 1 til 6.

31 DK 152220 B

8. Detergent ifølge krav 7, kendetegnet ved, at detergentet indeholder det enzymatiske detergentadditiv ifølge krav 1 i en mængde af mellem 0,2 og 2% w/w.

9. Fremgangsmåde til vask af tekstiler, kendete g- 5. e t ved, at den foretages ved en pH-værdi, der ligger mellem 7 og 11, at temperaturen er under 60°C, og at detergentet ifølge krav 7 eller 8 anvendes som detergent.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at vaskeflotten indeholder detergentet i en mængde på mellem 10. og 5 g pr. liter vaskeflotte.