DK149781B - Fremgangsmaade til fremstilling af et stof med bakteriostatisk virkning - Google Patents

Description

i 149781

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et stof med bakteriostatisk virkning. '

Flere europæiske svovlholdige varme kilder indeholder mikroorganismer, der, når de ophobes på et sted, 5 hvor strømmen er svag, danner et hvidt til lysegråt ge-latinøst stof, der har fået navnet "barégine" under henvisning til de varme kilder i Baréges, en fransk kuranstalt i Pyrenæerne. Barégine kan defineres som en sammenslutning af forskellige hydrogensulfidoptagende bak-10 terier, der er tilpasset høje temperaturer, og hvoraf nogle er i stand til at udskille et slimstof, hvori det hele er indesluttet. I baréginen finder man lige så mange døde som levende bestanddele.

Baréginens terapeutiske egenskaber har været aner-15 kendt i lang tid, og den er blevet anvendt meget tidligt til behandling af rheumatiske lidelser ved massage, samt til at behandle visse hudsygdomme. Den indgår i sammensætningen af kosmetiske produkter til pleje af huden.

Dens fremstilling og dens indsamling er gjort til 20 genstand for patenter, der navnlig omhandler dyrkningen under naturlige betingelser ved forskellige fremgangsmåder med overrisling med kildevandet. En lignende fremgangsmåde anvendes for nærværende i Thermes Nationaux i Aix-les-Bains i Frankrig. Anlægget består af en lod-25 ret betonmur, som på sin top er forsynet med en rende.

Det varme kildevand, der tilføres ved hjælp af et kanalsystem fra kilden lige i nærheden, løber ud i renden og risler langs med murens sidevægge. Flagerne eller totterne af barégine med dimensioner af størrelsesordenen en cm 30 hager sig fast i betonens ujævnheder. En gelatinøs film af barégine vokser ud fra de fasthængende flager og indsamles med mellemrum ved afskrabning fra muren med en hård børste. Temperaturen af vandet og det rum, hvor denne mur er opsat, er i nærheden af temperaturen ved kil-35 dens udspring, dvs. ca. 43-47°C. Produktionsudbyttet er yderst ringe. Det løber op til ca. 5 g tørvægt af bare-gine pr. m og pr. måned. Desuden er det underkastet va- 149781 2 riationer hidrørende fra forskellige faktorer afhængig af vejrbetingelserne.

Baréginen er blevet gjort til genstand for mikrobiologiske og biokemiske undersøgelser. Disse har vist 5 metabolismen af I^S og af svovlforbindelser, men har ikke klarlagt årsagen til baréginens terapeutiske egenskaber. Blandt de talrige i baréginen identificerede mikroorganismer omtales ofte Beggiatoa. De fleste af de forholdsvis sjældne isoleringer af Beggiatoa, som er kendt 10 fra publikationer, har imidlertid ikke været foretaget ud fra barégine, men ud fra slam og spildevand. Disse isoleringer har desuden vist sig at være langvarige og vanskelige, og dyrkningen af de isolerede mikroorganismer har kun givet meget ringe udbytter i betragtning af 15 blandt andet deres skørhed og deres meget store vandindhold. Som karakteristisk kan man betragte en publiceret værdi på 1,2 g friskvægt af mikroorganismer produceret på 48 timer ved 28°C, uden omrøring, pr. liter af et dyrkningsmedium indeholdende 2 g gærekstrakt, 0,1 g 20 natriumacetat, samt aktiv katalase.

Pra fransk fremlæggelsesskrift nr. 2.283.223 kendes en fremgangsmåde til isolering og dyrkning af mikroorganismer af typen Beggiatoa, hvor de fremstillede mængder af frisk biomasse er større, nemlig 150 g ud 25 fra 5 g frisk biomasse pr. liter dyrkningsmedium. Denne fremgangsmåde indebærer imidlertid en meget lang dyrkningstid på 21 dage.

Den foreliggende opfindelse skal muliggøre en rentabel produktion i industriel målestok af et stof, der 30 udviser en bakteriostatisk virkning analog med baréginens , idet der benyttes let tilgængelige stammer af typen Beggiatoa, som på kort tid giver gode udbytter af barégine.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse 35 er ejendommelig ved, at man dyrker Beggiatoa NCIB 11418, NCIB 11419, NCIB 11420, NCIB 11421, NCIB 11422, NCIB 11423, NCIB 11424 eller NCIB 11425 i et vandigt 3 T49781 næringsmedium, som indeholder 1 til 4 g gærekstrakt, 0,1 til 0,3 g calciumchlorid og 0,2 til 1 g natriumeller ammoniumacetat pr. liter vand, ved 20 til 50°C og ved en pH værdi på 6 til 8 i 5 til 36 timer og op-5 samler biomassen og/eller dyrkningsmediet.

Man har faktisk konstateret, at en biomasse af ovennævnte mikroorganismer af typen Beggiatoa og endog det medium, hvori man har produceret dem, udviser bak-teriostatisk virkning. Man har desuden konstateret, at mikro-10 organismens skørhed ikke er en hindring for dens intensive dyrkning i et kraftigt omrørt medium, og at den formerer sig, selv hvis de tråde, som den danner, itubrydes i talrige brudstykker. Det forholder sig endog således, at det er en fordel at homogenisere et inoculum af mikroorganismen 15 af typen Beggiatoa, før man poder dyrkningsmediet hermed.

Det er med forsæt, at man her og i det følgende af den foreliggende beskrivelse anvender udtrykket "mikroorganisme af typen Beggiatoa" frem for "mikroorganisme af slægten Beggiatoa". Slægten Beggiatoa hører til 20 klassen "gliding bacteria", ordenen myxobacteriales, familien Beggiatoacea (jfr. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, Waverly Press, Baltimore, U.S.A., 1974, side 112-114). Som man kan læse i dette sidste værk, der er anerkendt på dette område, er klas-25 sificeringen af mikroorganismer af denne slægt noget u-sikker i betragtning af den ringe mængde af sikre oplysninger, der står til rådighed. Det ville være ubetimeligt at begrænse sig til et så præcist videnskabeligt udtryk som "slægt", når man kender usikkerheden ved klassifice-20 ringen af de pågældende mikroorganismer. Med udtrykket "mikroorganisme af typen Beggiatoa” skal der således her forstås for svovlholdig jordbund og svovlholdigt vand karakteristiske trådformede bakterier, hvis ufarvede tråde er bevægelige ved glidning og er dannet af celler 25 i kæde, som f.eks. de i slægten Beggiatoa klassificerede bakterier.

149781 4

Ovennævnte mikroorganismer af typen Beggiatoa er blevet isoleret fra baréginen. Man gik frem på den måde, at man anbragte en prøve af barégine på et geloseholdigt næringsmedium, inkuberede 5 til 36 timer 5 ved en temperatur på 25-50°C, udskar en zone, hvor trådene af en mikroorganisme af typen Beggiatoa var fri for forurenende stoffer, anbragte denne zone‘på et med det første identisk geloseholdigt næringsmedium og gentog inkuberings-, udskærings- og ompodningsope-10 rationerne 2-3 gange.

Man har på denne måde isoleret de ovennævnte 8 stanmer,der er blevet deponeret den 12. juli 1978 ved National Collection of Industrial Bacteria (NCIB) i Aberdeen i Skotland, under numrene NCIB 11418-11425.

15 Det til isoleringen anvendte geloseholdige næ ringsmedium er fortrinsvis sammensat af 1-4 g gærekstrakt og 10-20 g agar pr. liter vand.

Tilsvarende indeholder det til dyrkningen anvendte vandige næringsmedium som allerede nævnt 1-4 g 20 gærekstrakt, 0,1-0,3 g calciumchlorid og 0,2-1 g natriumacetat eller ammoniumacetat pr. liter vand. Til beskyttelse af kulturen kan man også sætte katalase til mediet, f.eks. i en mængde på 5-20 internationale enheder (IE) pr. ml. Man dyrker som nævnt mikroorganismen ved 25 en temperatur på 20-50°C i et tidsrum på 5-36 timer ved en pH-værdi på 6-8. Ifølge opfindelsen dyrker man den fortrinsvis ved en temperatur på 30-40°C og ved neutral pH-værdi i 8 til 10 timer.

De omhandlede stammer har følgende morfologi: 30 NCIB 114 18.

På agar: Danner store isolerede kolonier, på 8 til 15 mm i diameter, med et hvidt centrum og gennemskinnelige kanter. Mikroskopisk undersøgelse (x 100): Kolonien er dannet af meget tydelige, tæt sammensnoede spiraler.

35 I flydende kultur: Homogen kultur. Mikroskopisk undersøgelse (x 400). Lange tråde på 80 x 1,8 μ undertiden-dannet af meget tydelige, korte baciller. Ingen aggregation. Meget få lysbrydende inklusioner.

149781 5 NCIB 114 19 På agar: Danner isolerede hvide kolonier på 4 til 8 mm i diameter med diffuse kanter. Tykke bånd strækker sig radialt, i stjerneform, fra koloniens centrum, men 5 når ikke kanterne. Mikroskopisk undersøgelse (x 100):

Koloniens kanter er dannet af tråde i tæt sammensnoede spiraler.

I flydende kultur: Homogen kultur. Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Meget korte isolerede tråde på 10 3,6 x 0,9 μ opdelt af meget tydelige indsnøringer. ingen lysbrydende inklusioner. Danner aggregater.

NCIB 114 20 På agar: Danner flade og opake isolerede kolonier på 2-5 mm i diameter med frynsede kanter. Mikroskopisk 15 undersøgelse (x 100): Kolonier bestående af brudstykker af tråde, som danner dårligt udviklede spiraler.

I flydende kultur: Homogen kultur. Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Ingen tråde. Lange baciller på 9 x 1,4 μ indeholdende en del lysbrydende inklusioner.

20 NCIB 114 21 På agar: Danner adskilte kolonier på 4 til 7 rom i diameter med diffuse kanter, som meget ligner kolonierne af stammen NCIB 114 19, men er hvidere. Koloniernes kanter er gennemskinnelige. Mikroskopisk undersøgel-25 se (x 100): ingen synlige spiraler.

I flydende kultur: Homogen kultur. Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Lignende billede som det af stammen NCIB 114 20 udviste. Ingen tråde, lange baciller på 18 x 1,4 μ indeholdende en del lysbrydende inklusioner.

30 ingen aggregater.

NCIB 114 22 På agar: Danner aldrig isolerede kolonier. Dækker hele overfladen med gennemskinnelige mycoide bånd. Mikroskopisk undersøgelse (x 100): Bånd dannet af flere 35 -tråde.

I flydende kultur: Homogen kultur udvisende en del små aggregater fra den sjette time. Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Lange adskilte tråde på 90 x 1,4 til 6 149781 1,8 μ- Tråde opdelt i lange enheder af tydelige indsnøringer. Meget få lysbrydende inklusioner.

NCIB 114 23 På agar: Ligner stammen NCIB 114 22. Ingen isole-5 rede kolonier.Tætte og mere synlige mycoide bånd. Mikroskopisk undersøgelse (x 100): Tydeligere bånd fordi de består af et større antal tråde.

I flydende kultur: Danner store fnug (aggregater). Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Meget kortere tråde 10 end hos stammen NCIB 114 22 og opdelt i segmenter af meget tydelige indsnøringer. Længde 9-10 x 1,8 μ. Lysbrydende inklusioner kommer meget hurtigt til syne straks efter 5 timer.

NCIB 114 24 15 På agar: Ligher stammen NCIB 114 23. Ingen isole rede kolonier. Mycoide bånd. Mikroskopisk undersøgelse (x 100): Bånd dannet af et stort antal tråde.

I flydende kultur: Danner store fnug (aggregater). Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Lange tråde på 20 140 x 1,8 μ, der danner lange bundter. Ingen synlige indsnøringer. Sen udvikling, efter 10 timer, af lysbrydende inklusioner.

NCIB 114 25 På agar: Danner opake isolerede kolonier på 2 til 25 6 mm i diameter. Mikroskopisk undersøgelse (x 100):

Kolonier bestående af tråde, der er skabt af isolerede celler og danner tæt sammensluttede spiraler.

I flydende kultur: Homogen kultur. Mikroskopisk undersøgelse (x 400): Korte homogene tråde på 4 x 1,4 μ.

30 Kun få lysbrydende inklusioner.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede stof med bakteriostatisk virkning kan anvendes f.eks. som det foreligger til hudmassagebehandlinger eller som bestanddel i et kosmetisk produkt til huden. Biomassen 35 kan bevares i tørret form. Man tørrer den fortrinsvis 7 149781 ved lyofilisering i betragtning af dens skørhed og dens ringe indhold af tørstof.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler, hvori betegnel-5 sen "Beggiatoa" anvendes systematisk i stedet for og Skal forstås i betydningen af udtrykket "mikroorganisme af typen Beggiatoa".

Eksempel 1 10 Isolering af stammerne

En flage af frisk barégine udtaget i Thermes Na-tionaux i Aix-les-Bains anbringes, i midten af en Petriskål indeholdende 20 ml geloseholdigt medium fremstillet efter følgende opskrift: 15 Gærekstrakt (Difco) 2 g

Agar (Bacto-Difco) 15 g

Filtreret varmkildevand fra Aix 100 ml

Destilleret vand 900 ml 20 Man anbringer skålen omvendt i et varmeskab ved 30°C i 30 timer. Man undersøger den derefter i et mikroskop ved ringe forstørrelse til påvisning af tilstedeværelsen af spiralformede strukturer, som er karakteristiske for Beggiatoa og resulterer i disse mikroorganismers 25 bevægelighed ved glidning. Nogle er endog synlige med det blotte øje. Den mikroskopiske undersøgelse afslører ligeledes zoner, hvori filamenterne af Beggiatoa ser ud til at være fri for forurenende stoffer. Man udskærer én af disse zoner med en steril skalpel og anbringer den på 30 en ubrugt agarplade af samme sammensætning som den første, idet man drager omsorg for at anbringe den overflade, der indeholder trådene af Beggiatoa, mod den rene overflade af den nye agarplade. Man inkuberer på ny ved 30°C i 24 timer. Man gentager udskærings-, ompodnings- og in-35 kuberingsoperationerne endnu to gange. Man opnår en ren kultur af Beggiatoa.

8 149781

Bevaring af stammerne

Man opbevarer stammerne med godt resultat på tre forskellige måder, alt efter som der er tale om kort, mellemlang eller lang tid.

5 2.1.) I kort tid: Man bevarer pladen i køleskab ved 4°C, idet man sørger for at tætne Petri-skålen. Man overfører stammen hver tiende dag, da agaren har tendens til at tørre.

2.2. ) I mellemlang tid: Man fremstiller et halv-10 flydende medium med følgende sammensætning: Gærekstrakt 2 g

CaCl2 0,1 g

Natriumacetat 0,5 g 15 Agar 2 g

Filtreret varmkildevand 1000 ml

Efter sterilisering af mediet sætter man dertil fra svampe hidrørende katalasé i en mængde på 10 IE/rol. Opløsningen af katalasé er på forhånd blevet steriliseret 20 ved filtrering i kold tilstand gennem et Millipore-filta: med mikroskopiske porer på 0,22 jj.

Man anbringer en lille terning af agar indeholdende Beggiatoa'en i et rørglas indeholdende 10 ml medium.

Man inkuberer ved 30°C. Beggiatoa'en udvikler sig i den 25 øvre del af rørglasset. Man kan lade rørglasset forblive i 3 uger ved 30°C. Man overfører derefter kulturen i en mængde på 0,1 ml pr. rørglas.

2.3. ) I lang tid: Man fremstiller en kultur på 24 timer i et omrørt medium på den nedenfor beskrevne 30 måde. Man centrifugerer den. Man vasker bundfaldet med steril Ringer-opløsning. Man fryser og lyofiliserer bundfaldet. Man bevarer det flere måneder i køleskab i en godt tillukket beholder. Straks ved rehydratisering er brudstykkerne af trådene i stand til at udvikle sig.

35 1497 81 9

Dyrkning af stammerne 3.1. Inoculum.

Man udskærer en lille terning af agar på 5 mm fra kanten af en plade opnået på den ovenfor be-5 skrevne måde. Man anbringer den i en flaske på 500 ml indeholdende 100 ml af følgende medium: Gærekstrakt 4 g

Calciumchlorid 0,2 g

Ammoniumacetat 1 g 10 Filtreret varmkildevand 1000 ml

Dette medium har en pH-værdi på 6,6. Man anbringer flasken i et rysteapparat, der roterer med 150 o/m ved en drejningsradius på 1,25 cm. Man lader den forbli- 15 ve der i 16 timer ved 30°C. Man homogeniserer den opnåede kultur ved hjælp af et Sorval-Omnimixer—blandeappa-rat i 15-30 sekunder under sterile betingelser. Den homogeniserede kultur udgør inoculet.

3.2. Dyrkning.

20 Man indfører 5 ml af det ovennævnte inoculum i en flaske på 500 ml indeholdende 100 ml af det samme medium som det til fremstilling af inoculet anvendte. Man inkuberer flasken i 24 timer ved 30°C i et rysteapparat.

Ved at gentage processen med forskellige stammer og 25 ved at variere betingelserne inden for de tilladte grænser opnår man udbytter på mellem ca. 0,5 og 2 g tør Beggiatoa pr. liter dyrkningsblanding.

Resultaterne opnået for hver af de 8 stammer fremgår af nedenstående tabel, hvori der er anført 30 den optiske tæthed for de kulturer, som man opnåede efter 5, 10 og 24 timers forløb ved at dyrke hver af disse stammer, og de efter 24 timer opnåede biomasser, samt den bakteriostatiske virkning af de efter 8 timers dyrkning opnåede biomasser over for de tre patogene 35 stammer P. aeruginosa, S. aureus og E. coli.

149781 ίο Ή Η ο O'o^'i'o’iinho

Oh^OOOMNUl

• i—ί I—I

Μ +> ^ ra Ο) σ 3 •P a Φ

•ri ·ri P

l>g3»\a»omhOri •HEiihmdiflicocoajm

+> S

MA‘ < cli

dP

__ . _ - - m o a Ή

Oioooooonr^o 3oooovor~m© S—J *—i i—1 i—Ir-! i—i Q) <0 Λ

rH

HIS

mm riminminoioiri «Οοισι<ησίΓ>·νοιηι-» tD-P VKS«.kk.<^

gOlOOOOOOOH

o p

ri -S

pq +> p cu dl g cl ^ oi © in co r~ co +ι·Ηοθι-(ο·5ΤθΓ~οοη m+Jtninr~vonromoo al »»·»*.·.·>** ^oooooooo

CM

Ό a> —=---

Λ P

PPG)

fBdlgcnHr^cM'i'cor^H

-P-P-HHcM^ococnrooo «ρ-ΡΓ-νο^^’η^Γ'-σι P4 0) .....- - >·

Dl ooooooooo •Η H +1 ft------

O P

p<Ur'~cMf'Ooior'-Lii (UgcomM'vooovor-iai 4J-HCMnHi-icMcncMn m +> - - - - - - «· 0) oooooooo in dl οοσιοΗΟΜοο^ιη

å*HHCMCMCMCMCMCM

P

•P r-i Γ—ί Γ—l I—li—IrHl—il—i CO i—I i—1 Γ-l i—I i—1 i—1 i—I i—1 149781 11 3.3. Kontrol af væksten.

Den klassiske nefelometriske metode, der anvendes til bakteriekulturer, er ikke anvendelig til Beggiatoa 5 som følge af dens væksttype i flager. Man tilpasser den til det særlige tilfælde. Man udtager prøver af kulturen hver anden time, og man homogeniserer dem i et Sorvall-Qmnimixer—blandeapparat. Man aflæser deres optiske tæthed ved 600 nm på et spektrofotometer. Den homogenisere-10 de prøve sedimenterer kun meget langsomt og muliggør en pålidelig aflæsning. Man opnår på denne måde en angivelse af væksten i direkte relation til antallet af celler.

3.4. Bestemmelse af tørvægten.

Den klassiske tørring i en ovn giver ikke reprodu-^ cerbare resultater for Beggiatoa. Dette skyldes sandsynligvis dens meget høje vandindhold. Af denne grund tørrer man for at opnå reproducerbare resultater ikke mindre end 400 ml kulturblanding ved lyofilisering.

20 3.5. Bestemmelse af den bakteriostatiske virkning.

Den klassiske metode til bedømmelse af den bakteriostatiske virkning fra Public Health Laboratory Service Committee, beskrevet i British Med. J. 408 (1965), giver ikke tilfredsstillende resultater i det specielle tilfæl-25 de, som følge af at prøven foregår i rørglas. Beggiatoa er faktisk meget strengt aerob, og den i et reagensglas herskende oxygenkoncentration er utilstrækkelig. Man tilpasser derfor metoden, og man arbejder i omrystede flasker for at forhøje oxygenoverførslen.

30 Man klargør 3 rækker af flasker på 50 ml, der hver indeholder 18 ml næringsbouillon (Nutrient Broth Difσο). Man poder flaskerne i den første og i den anden række med hver 0,4 ml af en 24 timers kultur af en pathogen stamme. Man anvender 3 pathogene stammer, nemlig 35 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Eschericia coli ATCC 11755 og Staphylococcus aureus ATCC 12600.

149781 12

Man fremstiller prøver af bakteriostatisk produkt ved at centrifugere en kultur opnået på den i punkt 3.2,beskrevne måde, men på kun 8 timer. Den centrifugerede biomasse homogeniseres og bringes i suspen-5 sion i et lige så stort rumfang fysiologisk opløsning som rumfanget af den efter centrifugeringen tilbageblevne overliggende væske. Den fysiologiske opløsning, der indeholder biomassen, og den overliggende væske deles hver i prøver på 2 ml.

10 Til flaskerne i den første række sætter man 2 ml af fysiologisk opløsning indeholdende den homogeniserede biomasse. Til flaskerne i den anden række sætter man 2 ml fysiologisk opløsning alene. Til flaskerne i den tredje række, som ikke er blevet podet’med en pathogen orga-15 nisme, sætter man 2 ml af fysiologisk opløsning indeholdende den homogeniserede biomasse.

Man inkuberer flaskerne ved 37°C i et rysteapparat. Man måler deres optiske tæthed ved 600 nra efter 16 timers forløb. Målingerne af optiske tætheder på flasker-20 ne svarende til rækkerne 1, 2 og 3 giver henholdsvis parametrene A, B og C. Forskellen A-C trukket fra B og derefter divideret med B og multipliceret med 100 giver den bakteriostatiske virkning af biomassen i % hæmning.

Man går frem på samme måde til bestemmelse af den 25 baktériostatiske virkning af den overliggende væske, i-det man til flaskerne i den første og i den tredje række sætter 2 ml overliggende væske i stedet for 2 ml fysiologisk opløsning indeholdende den homogeniserede biomasse. Resultaterne for stammen NCIB 11424 er anført i ne-30 denstående tabel:

Pathogen organisme Aktivitet af Aktivitet af overlig· biomasse gende væske (% hæmning) (% hæmning) T?. aeruginosa .57 41 35 s. aureus 80 45 E. coli 27 11