DK147409B - METHOD FOR HYDROLYZING INULIN USING AN ASPERGILLUS FICUUM INULINASE PREPARATION - Google Patents

Description

1 1474091 147409

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til hydrolysering af inulin, der er egnet til anvendelse i en industriel proces til fructosefremstilling.The invention relates to a particular process for hydrolyzing inulin suitable for use in an industrial fructose preparation process.

Fructose er det naturligt forekommende ernærings-5 sukker med størst sødeevne, idet det har en sødeevne på ca.Fructose is the naturally occurring nutritional 5 sugar with the highest sweetness, having a sweetness of approx.

1,4 gange sucroses sødeevne. Det er letopløseligt i vand og har en højere opløselighed end sucrose. Det kunne finde en udstrakt anvendelse inden for levnedsmiddelindustrien, f.eks. i alkoholfri drikke, hvis produktionsomkostningerne 10 kan reduceres væsentligt.1.4 times the sweetness of sucrose. It is readily soluble in water and has a higher solubility than sucrose. It could find widespread use in the food industry, e.g. in non-alcoholic beverages if the production cost 10 can be substantially reduced.

Fructose findes i et stort antal frugter og i honning. Fructose udgør 50% af sucrose og kan fremstilles ud fra sucrose ved hjælp af syre- eller enzymatisk hydrolyse efterfulgt af separation. Imidlertid er en separation af 15 lige store mængder af glucose og fructose, der kan udføres ved specielle krystallisationsteknikker eller ved kromatografisk separation, kostbar og er en af årsagerne til, at omkostningerne ved fructoseproduktion indtil nu har været betydeligt højere end for sucrose.Fructose is found in a large number of fruits and in honey. Fructose represents 50% of sucrose and can be prepared from sucrose by acid or enzymatic hydrolysis followed by separation. However, separation of 15 equal amounts of glucose and fructose, which can be accomplished by special crystallization techniques or by chromatographic separation, is costly and is one of the reasons that the costs of fructose production have so far been significantly higher than that of sucrose.

20 Fructose fremstilles også i store mængder ved enzymatisk isomerisering af glucosesirupper til fremstilling af sirupper, der har en sødeevne, der er sammenlignelig med sucroses. Ved isomeriseringen af sirupper er imidlertid fructoseindholdet begrænset til ca. 42% på grund af isomeri-25 seringsligevægten mellem glucose og fructose. Sirupper med højere fructoseindhold, f.eks. 55% ellér 90%, fremstilles ved hjælp af kromatografisk separationsteknik på isomerise-rede sirupper.Fructose is also produced in large quantities by enzymatic isomerization of glucose syrups to produce syrups having a sweetness comparable to sucrose. However, in the isomerization of syrups, the fructose content is limited to ca. 42% due to the isomerization equilibrium between glucose and fructose. Syrups with higher fructose content, e.g. 55% or 90%, is prepared by chromatographic separation technique on isomerized syrups.

En alternativ måde til at forøge fructoseindholdet 30 i isomeriserede sirupper ville være at blande dem med rene eller næsten rene fructosesirupper.An alternative way to increase the fructose content 30 in isomerized syrups would be to mix them with pure or almost pure fructose syrups.

En potentiel kilde for fructose er inulin. Inulin er en ikke-forgrenet fructosepolymer, der i naturlig form består af ca. 35 beta-fructosefuranoserester afsluttet af et 35 glucosemolekyle bundet til fructose via en alfa-1, beta-2-binding som i sucrose.One potential source of fructose is inulin. Inulin is a non-branched fructose polymer which in natural form consists of approx. 35 beta-fructosefuranose residues terminated by a 35 glucose molecule bound to fructose via an alpha-1, beta-2 bond as in sucrose.

2 U74092 U7409

Inulin forekommer som oplagsnæring i forskellige planter, især i sådanne, der hører til familien Compositae, idet gode kilder er jordskokrodknolde, dahliarodknolde, cikorierødder og mælkebøtterødder. Inulin er næsten uopløse-5 lig i koldt vand, men kan opløses i varmt vand. (Jf.Inulin is found as a nutrient in various plants, especially in those belonging to the Compositae family, with good sources being groundnut tubers, dahliarod tubers, chicory roots and dandelions. Inulin is almost insoluble in cold water, but can be dissolved in hot water. (See.

Yanousuy et al., J.A.C.S. 55, (1933) 3658 - 3663).Yanousuy et al., J.A.C.S. 55, (1933) 3658 - 3663).

Inulin kan ekstraheres med varmt vand fra vegetabilsk materiale på velkendt måde, f.eks. ved modstrømsdiffusion af snittede plantedele ved forøget temperatur eller ved 10 at presse saften ud. Den rå saft renses ved filtrering gennem aktivt kul eller alternativt ved behandling med kalk, som ved sukkerroebearbejdningen, og affarvning med kul.Inulin can be extracted with hot water from vegetable matter in a well known manner, e.g. by countercurrent diffusion of cut plant parts at elevated temperature or by squeezing the juice. The raw juice is purified by filtration through activated charcoal or alternatively by treatment with lime, as in beet processing, and decolorization with coal.

Foruden inulin kan ekstrakten indeholde polymerer med lavere kædelængde, f.eks. fructosepolymerer og fructose-15 polymerer afsluttet med glucose. Middelkædelængden af sådanne polymerer kan variere med plantekilden og dyrknings-, høstnings- og opbevaringsbetingelser, men vil ofte ligge mellem DP^ til DP^j. (DP = polymerisationsgraden) .In addition to inulin, the extract may contain lower chain length polymers, e.g. fructose polymers and fructose polymers terminated with glucose. The average chain length of such polymers may vary with the plant source and cultivation, harvesting and storage conditions, but will often be between DP ^ to DP ^ j. (DP = degree of polymerization).

Inulin kan hydrolyseres med syre under forholdsvis 20 milde betingelser, pH-værdi 1-2, 1-2 timer ved 80 - 90°C. Imidlertid giver syrehydrolyse anledning til farve- og biproduktdannelse, f.eks. af ca. 5% difructosedianhydrider, der reducerer udbyttet tilsvarende. (Whistler et al., "Poly-saccharide Chemistry" Academic Press, Inc., N.Y. 1953, side 25 287) .Inulin can be hydrolyzed with acid under relatively mild conditions, pH 1-2, 1-2 hours at 80 - 90 ° C. However, acid hydrolysis gives rise to color and by-product formation, e.g. of approx. 5% difructose dianhydrides which reduce the yield accordingly. (Whistler et al., "Poly-saccharide Chemistry" Academic Press, Inc., N.Y. 1953, page 25,287).

Da fructose i opløsning synes at være mest stabil inden for et pH-område på 4 - 6, antages en fremgangsmåde til hydrolysering af inulin udført inden for dette område at være fordelagtig for at undgå biproduktdannelse og isomeri-3 0 sering.As fructose in solution appears to be most stable within a pH range of 4 to 6, a method of hydrolyzing inulin carried out within this range is believed to be advantageous in order to avoid by-product formation and isomerization.

Enzymer, der er i stand til at hydrolysere inulin, er beskrevet i litteraturen som værende tilgængelige fra vegetabilske materialekilder (inulinholdige rødder og rodknolde) og fra mikroorganismer. De mikrobielle enzymer kan 35 opnås fra gær, f.eks. Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotrophicalis eller kefyr, samt fra svampe, såsom Aspergillus-, Fusarium- og Penicillium-arter.Enzymes capable of hydrolyzing inulin have been described in the literature as being available from vegetable sources (inulin-containing roots and tubers) and from microorganisms. The microbial enzymes can be obtained from yeast, e.g. Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotrophicalis or kefyr, as well as from fungi such as Aspergillus, Fusarium and Penicillium species.

3 1474093 147409

De mikrobielle enzymer beskrives at have pH-optima i området fra pH 3,5 - 5,5 og temperaturoptima mellem 45°C og 55°C. Enzymerne angives hurtigt at tabe aktiviteten ved 60°C.The microbial enzymes are described to have pH optima in the range of pH 3.5 - 5.5 and temperature optima between 45 ° C and 55 ° C. The enzymes are reported to rapidly lose activity at 60 ° C.

5 De mikrobielle inulinaser fremstilles både intra- og ekstracellulært. Enzymernes evne til at hydrolysere både inulin og sucrose er i nogle tilfælde (Kluyveromyces fragilis) tilskrevet et enzym med to aktiviteter. (Nahm et al., "Purification and Characterization of Inulase from 10 Kluyveromyces fragilis", Korean Biochem. J., Vol. 10 (2), side 95 - 108, 1977).The microbial inulinases are prepared both intra- and extracellularly. The ability of the enzymes to hydrolyze both inulin and sucrose has in some cases (Kluyveromyces fragilis) been attributed to an enzyme with two activities. (Nahm et al., "Purification and Characterization of Inulase from 10 Kluyveromyces fragilis", Korean Biochem. J., Vol. 10 (2), pages 95 - 108, 1977).

Både endo- og exo-inulinase er blevet renset fra Aspergillus niger. Endokomponenten har sin maksimumsaktivitet ved pH 5,3 og 45°C. Exokomponenten har sin maksimumsak-15 tivitet ved pH 5,0 og 55°C. (Nakamura et al., "Studies on Microbial Inulase part IV," Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol.Both endo and exo-inulinase have been purified from Aspergillus niger. The endocomponent has its maximum activity at pH 5.3 and 45 ° C. The exocomponent has its maximum activity at pH 5.0 and 55 ° C. (Nakamura et al., "Studies on Microbial Inulase Part IV," Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol.

52 (4), side 159 - 166, 1978 og Nakamura et al., "Studies on Microbial Inulase Part V", N.N.K., Vol. 52 (12), side 581 -587, 1978).52 (4), pages 159 - 166, 1978 and Nakamura et al., "Studies on Microbial Inulase Part V", N.N.K., Vol. 52 (12), pages 581-587, 1978).

20 På grund af den forholdsvis begrænsede opløselig hed af inulin skal en hydrolyse af inulin udføres i forholdsvis fortyndede opløsninger, og som det allerede er blevet understreget fortrinsvis inden for et pH-område på ca. 4 - 6. En 20% vægt/vægt opløsning af ren inulin ud fra 25 dahliarødder fremstilles ved 60°C, men en sådan opløsning er overmættet og udfælder ved henstand. Den maksimale mængde af inulin, der er opløselig i vand ved 50 - 60°C, vil naturligvis afhænge af polymeriseringsgraden af fructosepolymeren.Due to the relatively limited solubility of inulin, a hydrolysis of inulin must be carried out in relatively dilute solutions, and as has already been emphasized preferably within a pH range of approx. 4 - 6. A 20% w / w solution of pure inulin from 25 dahlias roots is prepared at 60 ° C, but such a solution is supersaturated and precipitates upon standing. The maximum amount of inulin soluble in water at 50-60 ° C will, of course, depend on the degree of polymerization of the fructose polymer.

Desto lavere procestemperaturen er, desto lavere er natur-30 ligvis opløseligheden af inulin, og desto mere fortyndet vil inulinopløsningen være.The lower the process temperature, the lower the solubility of inulin, of course, and the more diluted the inulin solution will be.

For at undgå mikrobielle infektioner af de forholdsvis fortyndede inulinopløsninger bør den industrielle procestemperatur være mindst ca. 60°C og fortrinsvis 60 -35 65°C. Dette temperaturniveau er sædvanlig praksis inden for stivelsesindustrien, hvor f.eks. forsukringsprocessen sædvanligvis udføres ved 60°C og 30% vægt/vægt DS i 2 - 5 dage.In order to avoid microbial infections of the relatively dilute inulin solutions, the industrial process temperature should be at least approx. 60 ° C and preferably 60 ° -35 ° C. This temperature level is common practice in the starch industry, where e.g. the suctioning process is usually carried out at 60 ° C and 30% w / w DS for 2-5 days.

4 1474094 147409

Uheldigvis er de enzymer, der er beskrevet i den kendte teknik, dårligt egnede til kommerciel anvendelse ved 60°C, idet de deaktiveres for hurtigt. Ikke desto mindre er af praktiske årsager 60°C det laveste, fornuftige hydrolyse-5 temperaturniveau både på grund af inulins opløselighed og for at undgå mikrobiel kontaminering.Unfortunately, the enzymes described in the prior art are poorly suited for commercial use at 60 ° C, being deactivated too quickly. Nevertheless, for practical reasons, 60 ° C is the lowest sensible hydrolysis temperature level, both because of the solubility of inulin and to avoid microbial contamination.

Der eksisterer derfor et behov for et effektivt inulinasepræparat, der er tilstrækkeligt termostabilt til at kunne anvendes ved 60 - 65°C i forøgede perioder, f.eks. 1 -10 5 dage, for at tillade hydrolyse af inulin på en økonomisk måde. Hidtil er der ikke ifølge opfindernes viden blevet beskrevet et inulinasepræparat, der har disse egenskaber.Therefore, there is a need for an effective inulinase preparation sufficiently thermostable to be used at 60-65 ° C for extended periods, e.g. 1 to 10 days to allow inulin hydrolysis in an economical manner. So far, according to the inventors' knowledge, no inulinase preparation having these properties has been described.

Da den foreliggende opfindelse beskæftiger sig med kommerciel anvendelighed, skal et enzymatisk fremstillet 15 hydrolyseprodukt være meget overlegent hvad angår omkostninger og kvalitet i forhold til et syrehydrolyseret produkt, da fructose af høj kvalitet er tilgængelig enten fra inversion af sucrose eller fra fraktioneret separation af isosi-rupper. Inulinhydrolysatet bør således indeholde over 98 20 vægt% monosaccharid i forhold til tørstofindholdet. Udtrykket "fuldstændig hydrolyse", som det anvendes i det følgende, refererer til fremstillingen af et inulinhydrolysat, der indeholder over 98 vægt% glucose + fructose på basis af tørre, faste bestanddele.Since the present invention is concerned with commercial utility, an enzymatically prepared hydrolysis product must be very superior in cost and quality to an acid hydrolyzed product, as high-quality fructose is available either from the inversion of sucrose or from the fractional separation of isosceles. syrups. Thus, the inulin hydrolyzate should contain over 98% by weight of monosaccharide relative to the dry matter content. The term "complete hydrolysis" as used hereinafter refers to the preparation of an inulin hydrolyzate containing over 98% by weight glucose + fructose on the basis of dry solids.

25 Den foreliggende opfindelse bygger på den overras kende erkendelse, at inulin hydrolyseres mest effektivt, når inulinasepræparatet indeholder både endo- og exokomponenten, og når forholdet mellem disse komponenter ligger inden for et bestemt område, samt at et inulinasepræparat med det 30 korrekte forhold og desuden en forbedret termostabilitet kan fås ved dyrkning af Aspergillus ficuum - stammer.The present invention is based on the surprising realization that inulin is most effectively hydrolyzed when the inulinase composition contains both the endo and exocomponent and when the ratio of these components is within a certain range, and that an inulinase composition having the correct ratio and in addition improved thermostability can be obtained by growing Aspergillus ficuum strains.

Inulinaseenzympræparatet , der anvendes ifølge opfindelsen, har sit temperaturoptimum ved 60°C, men kan anvendes ved 65°C ved pH-værdier mellem 3,5 og 7, fortrins-35 vis mellem 4 og 6, og især ved en pH-værdi mellem 4,5 og 5,0. Det bevarer mindst 50% af sin oprindelige aktivitet ved 60 °C i 20% inulin vægt/vægt efter 48 timer.The inulinase enzyme preparation used according to the invention has its temperature optimum at 60 ° C, but can be used at 65 ° C at pH values between 3.5 and 7, preferably between 4 and 6, and especially at a pH between 4.5 and 5.0. It retains at least 50% of its original activity at 60 ° C in 20% inulin w / w after 48 hours.

5 1474095 147409

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til hydrolyse af inulin, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en opløsning af inulin ved en pH-værdi i området fra 3,5 til 7 ved en temperatur i området fra 60 5 til 65°C underkastes en enzymatisk fuldstændig hydrolyse i nærværelse af et mikrobielt inulinasepræparat, der har et forhold mellem endo-inulinase og exo-inulinase i området fra 1:10 til 10:1 på vægtbasis, hvilket inulinasepræparat stammer fra en Aspergillus ficuum-stamme.Thus, the present invention relates to a process for hydrolyzing inulin and this process is characterized in that a solution of inulin at a pH in the range of 3.5 to 7 at a temperature in the range of 60 to 65 ° C is subjected. an enzymatic complete hydrolysis in the presence of a microbial inulinase preparation having a ratio of endo-inulinase to exo-inulinase in the range of 1:10 to 10: 1 by weight, which inulinase preparation originates from an Aspergillus ficuum strain.

10 Ved en industriel proces vil substratet for hydro lysen enten være en ekstrakt af inulinholdige planter, f.eks. cikorie, jordskok eller dahlia, eller en suspension af snittet plantemateriale i vand. Ekstrakten fremstilles på velkendt måde, og kan renses ved kalkbehandling, kulbe-15 handling eller ionbytning, før hydrolysen udføres.In an industrial process, the substrate for the hydrolysis will either be an extract of inulin-containing plants, e.g. chicory, earth shake or dahlia, or a suspension of cut plant material in water. The extract is prepared in a well-known manner and can be purified by lime treatment, coal treatment or ion exchange before the hydrolysis is carried out.

Inulinhydrolysen kan udføres som en batchproces i et konventionelt (dextrin) forsukringsudstyr. Fuldstændig hydrolyse af inulin (d.v.s. 98% eller mere glucose + fructo-se) opnås ved processen. Reaktionstiden afhænger af enzymdo-20 seringen og kan udstrække sig til 2-4 dage for mere effektiv anvendelse af enzymet uden biprodukt- eller farvedannel-se. Den totale inulasedosering (exo og endo kombineret) er af størrelsesordenen 0,25 - 10 Somogyi-enheder pr. g inulin, fortrinsvis 1-5 Somogyi-enheder.The inulin hydrolysis can be carried out as a batch process in a conventional (dextrin) suction equipment. Complete hydrolysis of inulin (i.e., 98% or more glucose + fructose) is achieved by the process. The reaction time depends on the enzyme dosage and may extend to 2-4 days for more efficient use of the enzyme without by-product or color formation. The total inulase dosage (exo and endo combined) is of the order of 0.25 - 10 Somogyi units per g inulin, preferably 1-5 Somogyi units.

25 Både i laboratorieskala og i industriel skala vil inulinekstrakterne ofte være forholdsvis fortyndede, f.eks.Both in laboratory and industrial scale, the inulin extracts will often be relatively diluted, e.g.

5 - 25% tørstof. Inulinekstrakten kan koncentreres til grænseværdien for opløseligheden af inulin eller fructosepolyme-rerne deri ved procestemperaturen. Som det allerede er ble-30 vet understreget vil inulinopløsninger være ømfindtlig overfor mikrobiel infektion, hvis reaktionstemperaturen ikke er tilstrækkelig høj til at undgå mikrobiel vækst. Konserveringsmidler kan naturligvis anvendes, men dette vil forøge procesomkostningerne både hvad angår udgifter til konserve-35 ringsmiddel og til dets fjernelse efter bearbejdningen.5 - 25% dry matter. The inulin extract can be concentrated to the limit value of the solubility of inulin or the fructose polymers therein at the process temperature. As has already been emphasized, inulin solutions will be sensitive to microbial infection if the reaction temperature is not high enough to avoid microbial growth. Preservatives can, of course, be used, but this will increase the cost of the process both in terms of the cost of preservative and its removal after processing.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for den foreliggende opfindelse ligger forholdet mellem endo- og exokom- 6 147409 ponenten fortrinsvis i området fra 7:1 til 1:7 og mest foretrukket i området fra 1:2 til 4:1.According to a preferred embodiment of the present invention, the ratio of the endo and exocomponent preferably ranges from 7: 1 to 1: 7 and most preferably in the range of 1: 2 to 4: 1.

Det hidtil ukendte inulinasepræparat, der anvendes ifølge opfindelsen, fremstilles ved dyrkning af Aspergillus 5 ficuum-stammer. Disse hidtil ukendte inulinaser er tilstrækkelig termostabile til at kunne udøve opfindelsen. Deres pH-optimum er egnet til udøvelse af opfindelsen. De ovennævnte mikroorganismer producerer både endo- og exoinulina-ser. Imidlertid har forholdet mellem endo- og exo-inulinase-10 aktiviteten af inulinasen fremstillet af Aspergillus ficuum vist sig at være stammespecifikke. Det har således vist sig, at inulinaseenzymet fremstillet ud fra Aspergillus ficuum, stamme CBS 55565, der er identisk med ATCC 16882, indeholder endo- og exokomponenten i det optimale forhold til udøvelsen 15 af opfindelsen, hvorfor dens anvendelse til fremstilling af inulinasepræparatet foretrækkes.The novel inulinase composition used according to the invention is prepared by growing Aspergillus 5 ficuum strains. These novel inulinases are sufficiently thermostable to carry out the invention. Their pH optimum is suitable for practicing the invention. The above microorganisms produce both endo- and exoinulins. However, the ratio of the endo and exo-inulinase activity of the inulinase produced by Aspergillus ficuum has been found to be strain specific. Thus, it has been found that the inulinase enzyme prepared from Aspergillus ficuum strain CBS 55565 identical to ATCC 16882 contains the endo and exocomponent in the optimum relation to the practice of the invention, therefore its use in preparing the inulinase preparation is preferred.

Opfindelsen skal forklares nærmere under henvisning til tegningen, som viser kromatogrammer, der illustrerer den forskellige enzymatiske virkning af endo- og exo-20 inulinasekomponenterne fra A. Ficuum A-524 (ATCC 16882).The invention will be explained in more detail with reference to the drawing which shows chromatograms illustrating the various enzymatic action of the endo and exo-inulinase components of A. Ficuum A-524 (ATCC 16882).

Endo- og exoenzymet kan adskilles ved ionbytning på CM-sepharose CL-6B, der er en kationisk ionbytter, der leveres som en gel, se "Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods", udgivet af Pharmacia Fine Chemicals, 25 side 18. Endoaktiviteten bevæger sig ved pH 4,1 i 0,01 M acetatpuffer, mens exoaktiviteten bindes til ionbytteren, hvorefter exoaktiviteten kan elueres ved hjælp af en saltgradient i pufferen (NaCl 0 M - 0,3 M). Ved hjælp af efterfølgende gelfiltrering på Sephacryl S-200 (fremstillet ved 30 covalent tværbinding af allyldextran med N,N'-methylenbis-acrylamid, jfr. "Gel Filtration, Theory and Practice," udgivet af Pharmacia Fine Chemicals, side 12), fremstilles praktisk taget ren exoaktivitet. Endoaktivitetsfrontfraktionen blev ultrafiltreret og pufferen blev ændret til en 0,01 M 35 fosfatpuffer med pH 7,0. Denne endoenzymopløsning blev ionbyttet på en anionisk ionbytter DEAE-Sepharose CL-6B, se "Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods", udgivet af Pharmacia Fine Chemicals, side 18. Under disse ændre 7 147409 de betingelser fikseres endoenzymet på ionbytteren, og det elueres derpå ved hjælp af en saltgradient i pufferen (NaCl, 0 M - 0,3 M). Endoenzymet blev yderligere renset ved adsorptionskromatografi på hydroxyapatitagarosegel (HA-Ultrogel).The endo and exoenzyme can be separated by ion exchange on CM-Sepharose CL-6B, a cationic ion exchanger delivered as a gel, see "Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods" published by Pharmacia Fine Chemicals, page 18. The endoactivity moves at pH 4.1 in 0.01 M acetate buffer, while the exoactivity binds to the ion exchanger, after which the exoactivity can be eluted by a salt gradient in the buffer (NaCl 0 M - 0.3 M). Subsequent gel filtration on Sephacryl S-200 (prepared by covalent cross-linking of allyl dextran with N, N'-methylenebis acrylamide, cf. "Gel Filtration, Theory and Practice," published by Pharmacia Fine Chemicals, page 12) is prepared practically pure exoactivity. The endoactivity front fraction was ultrafiltered and the buffer changed to a 0.01 M phosphate buffer with pH 7.0. This endoenzyme solution was ion exchanged on an anionic ion exchanger DEAE-Sepharose CL-6B, see "Ion-Exchange Chromatography, Principles and Methods" published by Pharmacia Fine Chemicals, page 18. Under these conditions, the endoenzyme is fixed to the ion exchanger and the is then eluted using a salt gradient in the buffer (NaCl, 0 M - 0.3 M). The endoenzyme was further purified by adsorption chromatography on hydroxyapatite agarose gel (HA-Ultrogel).

5 På denne måde blev der fremstillet meget rene endo- og exo-komponenter.In this way, very pure endo and exo components were prepared.

Ved hjælp af de rene endo- og exoaktiviteter blev specifikke antisera fremstillet ved immunisering af kaniner.Using the pure endo and exo activities, specific antisera were prepared by immunizing rabbits.

På basis af disse antisera kunne der udføres en kvantitativ 10 analyse på endo- og exokomponenterne ved hjælp af raketim-munelektroforese som beskrevet i N.H. Axelsen et al., "A Manual of Quantitative Immunoelektrophoresis," 1977, side 37. Ved hjælp af raketimmunelektroforese af opløsningerne af endo- og exokomponenterne med kendt koncentration (fortyn-15 dingsserier) har det vist sig, at der eksisterer en næsten lineær sammenhæng mellem logaritmen af koncentrationen og arealet under raketten. På basis af de tilsvarende standardkurver kan det ovenfor angivne område mellem endo- og exo-komponenten beregnes for et inulinasepræparat. Det har vist 20 sig, at den maksimalt opnåelige inulinomdannelse (ca. 99%) opnås i løbet af forholdsvis kort tid, når der anvendes inulinasepræparater med de ovenfor angivne forhold mellem endo- og exokomponenterne.On the basis of these antisera, a quantitative assay on the endo and exocomponents could be performed by rocket hour electrophoresis as described in N.H. Axelsen et al., "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis," 1977, page 37. Using rocket immuno-electrophoresis of the solutions of the endo and exocomponents of known concentration (dilution series), it has been found that an almost linear relationship exists between the logarithm of the concentration and the area under the rocket. On the basis of the corresponding standard curves, the above range between the endo and exo component can be calculated for an inulinase preparation. It has been found that the maximum achievable inulin conversion (about 99%) is achieved in a relatively short time when using inulinase preparations having the above ratios of the endo and exocomponents.

På grund af det faktum, at raketimmunelektrofore-25 seanalysen ikke nødvendigvis skelner mellem aktiv og inaktiv inulinase, bestemmes imidlertid inulinaseaktiviteten og invertaseaktiviteten af inulinasepræparaterne, der anvendes ifølge opfindelsen, yderligere ved hjælp af de nedenfor angivne enzymaktivitetsbestemmelser. Inulinaseaktiviteten 30 (dækkende både endo- og exoaktivitet) bestemmes på følgende måde:However, due to the fact that the rocket immune electrophoresis assay does not necessarily differentiate between active and inactive inulinase, the inulinase activity and invertase activity of the inulinase compositions used according to the invention are further determined by the enzyme activity assays set forth below. The inulinase activity 30 (covering both endo and exoactivity) is determined as follows:

Substrat: 5% inulin i acetatpuffer (0,1 M) pHSubstrate: 5% inulin in acetate buffer (0.1 M) pH

4,74.7

Inkubation: 1 ml substrat + 1 ml enzym 20 min.,Incubation: 1 ml substrate + 1 ml enzyme 20 min,

35 50°C35 ° C

Stopreagens: 4 ml 0,5 N NaOHStop reagent: 4 ml of 0.5 N NaOH

Det frigjorte reducerende sukker (fructose og små mængder glucose) bestemmes kvantitativt ved hjælp af Somo- 8 147409 gyi-Nelson metoden, se Journal of Biological Chemistry, Vol.The released reducing sugar (fructose and small amounts of glucose) is determined quantitatively by the Somo-Nelson method, see Journal of Biological Chemistry, Vol.

153, side 375 - 380, 1944.153, pages 375 - 380, 1944.

En inulaseaktivitetsenhed defineres som mængden af enzym, der er i stand til at danne et micromol reducerende 5 sukker pr. minut under de ovenfor angivne betingelser.An inulase activity unit is defined as the amount of enzyme capable of forming one micromole of reducing 5 sugars per day. per minute under the above conditions.

Invertaseaktiviteten (hovedsagelig dækkende exoak-tiviteten) bestemmes på følgende måde:The invertase activity (mainly covering the exoactivity) is determined as follows:

Substrat: 10% sucrose i acetatpuffer (0,1 M) pH 4,7 10 Inkubation: 1 ml substrat + 1 ml enzym 20 min.,Substrate: 10% sucrose in acetate buffer (0.1 M) pH 4.7 Incubation: 1 ml substrate + 1 ml enzyme 20 min.

50°C50 ° C

Stopreagens: 1 ml 0,1 N NaOHStop reagent: 1 ml 0.1 N NaOH

Den frigjorte glucose bestemmes kvantitativt ved hjælp af GOD-PERID metoden, se Instruction Sheets for Manual 15 Assays '77, Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica, Sheet 277.439.6 (1).The glucose released is determined quantitatively by the GOD-PERID method, see Instruction Sheets for Manual 15 Assays '77, Boehringer Mannheim GmbH Diagnostica, Sheet 277.439.6 (1).

Sammenfattet hydrolyseres inulin ved 60 - 65°C, og hydrolysen er mest effektiv, når forholdet mellem endo- og exokomponenterne i inulinasen ligger inden for det ovenfor 20 beskrevne foretrukne område på 1 - 7 og 7 - 1. Der dannes næsten ingen biprodukter under hydrolyseprocessen. Den dannede fructosesirup kan koncentreres og renses på konventionel måde til blandingsformål. Alternativt krystalliseres fructose eventuelt efter adskillelse fra glucose til frem-25 stilling af krystallinsk fructose.In summary, inulin is hydrolyzed at 60 - 65 ° C, and the hydrolysis is most effective when the ratio of the endo and exocomponents of the inulinase is within the preferred range described above of 1 - 7 and 7 - 1. Almost no by-products are formed during the hydrolysis process. . The fructose syrup formed can be concentrated and purified by conventional means for mixing purposes. Alternatively, fructose is optionally crystallized after separation from glucose to produce crystalline fructose.

Den foreliggende opfindelse skal yderligere illustreres ved hjælp af de efterfølgende eksempler.The present invention is further illustrated by the following Examples.

Eksempel 1Example 1

Dyrkning af en inulinaseproducerende mikroorganisme 30 Aspergillus ficuum ATCC 16882 (A 524) blev dyrket på følgende måde:Culture of an inulinase-producing microorganism Aspergillus ficuum ATCC 16882 (A 524) was grown as follows:

Dyrkning af podestofCultivation of seed

Podekulturen blev dyrket på skråagar ved 37°C i 7 dage på en agar med følgende sammensætning: 147409 g/liter Gærekstrakt (Difco) 4 k2hpo4 1The seed culture was grown on sloping agar at 37 ° C for 7 days on an agar of the following composition: 147409 g / liter Yeast extract (Difco) 4 k2hpo4 1

MgS04,7H20 0,5 5 Glucose 15MgSO4.7H2O 0.5 5 Glucose 15

Agar (Difco) 15 Η,,Ο op til 1000 mlAgar (Difco) 15 Η ,, Ο up to 1000 ml

Podning af rysteflaskenGrafting of the shake bottle

Dyrkningen af den inulinaseproducerende mikroorga-10 nisme blev udført i 500 ml Erlenmeyerkolber udstyret med en not og en podegummiåbning.The cultivation of the inulinase-producing microorganism was carried out in 500 ml Erlenmeyer flasks equipped with a groove and a gum opening.

Podematerialet fra en agarskråkultur blev fremstillet ved at hælde 9 ml sterilt vand indeholdende 0,1% polyoxyethylen-sorbitan-monooleat "Tween 80" over en agar-15 skråkultur med efterfølgende rystning på en Whirlingblander.The seed material from an agar slurry culture was prepared by pouring 9 ml of sterile water containing 0.1% polyoxyethylene sorbitan monooleate "Tween 80" over an agar slurry culture with subsequent shaking on a Whirling mixer.

Den totale suspension blev anvendt til podning af én rysteflaske.The total suspension was used to inoculate one shake flask.

DyrkningCulture

Dyrkning i rysteflasker udførtes ved 37°C i 7 dage 20 under anvendelse af 100 ml af et substrat med følgende sammensætning: g/literCultivation in shake flasks was carried out at 37 ° C for 7 days using 100 ml of a substrate of the following composition: g / liter

Maj s s tøbevand 2 0 NH4H2P04 12 25 KC1 0,7May s s tap water 2 0 NH4H2P04 12 25 KC1 0.7

MgS04,7H20 0,5 k2hpo4 10,0MgSO4.7H2O 0.5 k2hpo4 10.0

FeS04,7H20 0,1FeSO4.7H2O 0.1

Sucrose 25 30 CaC03 0,05Sucrose 25 CaCO3 0.05

Pluronic 0,1 (overfladeaktivt stof af typen polyoxypropylen-polyoxyethylen) 10 1Λ 740 9 Før autoklavering blev pH-værdien af substratet indstillet til 4,5. Følgende udbytter blev opnået:Pluronic 0.1 (polyoxypropylene-polyoxyethylene surfactant) 10 1Λ 740 9 Prior to autoclaving, the pH of the substrate was adjusted to 4.5. The following yields were obtained:

Inulinaseaktivitet Invertaseaktivitet enheder/ml enheder/ml 5 _ A. ficuum A 524 3 19Inulinase activity Invertase activity units / ml units / ml 5 _ A. ficuum A 524 3 19

Eksempel 2Example 2

Virkemåde af de to inulinasekomponenter 90 g inulin fra dahliarødder Sigma nr. 1-3754, 10 herefter betegnet som Sigmainulin, blev opløst i varmt vand til en totalvægt på 450 g. pH-værdien blev ved 60°C indstillet til 4,5, og to kolber blev hver fyldt med 150 g af opløsningen. Kolberne blev udstyret med en magnetisk omrører og anbragt i et vandbad ved 60°C. Til den første kolbe blev 15 der sat 0,175 ml ren exoinulinasekomponent svarende til 2,2 inulinaseenheder pr. g inulin. Til den anden kolbe blev der sat 0,7 ml ren endokomponent svarende til 1,4 enheder pr.g inulin.Mode of action of the two inulinase components 90 g of inulin from dahlia roots Sigma No. 1-3754, hereinafter referred to as Sigmainulin, was dissolved in hot water to a total weight of 450 g. The pH was adjusted to 4.5 at 60 ° C and two flasks were each filled with 150 g of the solution. The flasks were equipped with a magnetic stirrer and placed in a water bath at 60 ° C. To the first flask was added 0.175 ml of pure exoinulinase component corresponding to 2.2 units of inulinase per ml. g inulin. To the second flask was added 0.7 ml of pure endocomponent corresponding to 1.4 units per inulin.

Exo- og endoenzymerne blev fremstillet ud fra A.The exo and endoenzymes were prepared from A.

20 ficuum A 524 dyrket som beskrevet i eksempel 1 og adskilt som beskrevet ovenfor.20 ficuum A 524 grown as described in Example 1 and separated as described above.

Prøver blev udtaget med faste intervaller og opvarmet i et kogende vandbad i 10 minutter til inaktivering af enzymerne. Efter afkøling blev prøverne filtreret og 25 derpå opvarmet med en "mixed bed" ionbytterharpiks (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) til fjernelse af aske og opløselig N før de blev analyseret ved hjælp af gelkromatografi.Samples were taken at regular intervals and heated in a boiling water bath for 10 minutes to inactivate the enzymes. After cooling, the samples were filtered and then heated with a "mixed bed" ion exchange resin (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) to remove ash and soluble N before being analyzed by gel chromatography.

Kromatogrammerne efter 4 og 48 timers reaktion er afbildet på tegningen. Det fremgår, at virkemåden af de to 30 enzymer er helt forskellig.The chromatograms after 4 and 48 hours reaction are depicted in the drawing. It appears that the functioning of the two 30 enzymes is quite different.

Exoenzymet danner hovedsagelig DP^ og kun små toppe mellem DP2 og DP14 ses. Dette indicerer en virkemåde, hvor inulinmolekylet nedbrydes trinvis til fructose og glu-cose fra fructoseenheden. I modsætning hertil giver endoen- il 147409 zymet anledning til dannelse af hovedsagelig DP^ og DPg og kun mindre toppe af DP^ og DP2· Dette er et typisk endoan-grebsmønster. Med dette endoinulinase kan imidlertid øjensynlig også DP^- og DP2~grupper fraspaltes, men med en meget 5 langsommere hastighed end det ses ved exoenzymet.The exoenzyme forms mainly DP ^ and only small peaks between DP2 and DP14 are seen. This indicates a mode in which the inulin molecule is degraded stepwise to fructose and glucose from the fructose unit. In contrast, the endonyl 147409 causes the zymet to form mainly DP ^ and DPg and only smaller peaks of DP ^ and DP2. This is a typical endoan grip pattern. However, with this endoinulinase, DP1 and DP2 groups can also apparently be cleaved off, but at a much slower rate than seen by the exoenzyme.

Eksempel 3Example 3

Blanding af exo- og endokomponenterne 160 g Sigmainulin blev opløst i varmt vand til en totalvægt på 800 g. pH-værdien blev ved ca. 60°C indstillet 10 til 4,5. 7 kolber blev hver fyldt med 100 g af opløsningen og udstyret med magnetiske omrørere og derpå anbragt i et vandbad ved 60°C.Mixture of the exo and endocomponents 160 g of Sigmainulin were dissolved in hot water to a total weight of 800 g. 60 ° C set 10 to 4.5. 7 flasks were each filled with 100 g of the solution and equipped with magnetic stirrer and then placed in a water bath at 60 ° C.

Endo- og exokomponenterne blev sat til kolberne, idet den totale enzymmængde på proteinbasis blev holdt kon-15 stant, men under variation af forholdet mellem endo- og exoenzymet ifølge følgende skema:The endo and exocomponents were added to the flasks, keeping the total amount of enzyme on a protein basis constant, but varying the ratio of the endo to exoenzyme according to the following scheme:

Endo/exo- ml ml Total aktivitet/g inulin _forhold Endo Exo_Somogyi-enheder 1 00 0,192 0 0,54 20 2 7 0,168 0,024 0,92 3 3 0,144 0,048 1,3 4 1 0,096 0,096 2,1 5 3/1 0,048 0,144 2,8 6 1/7 0,024 0,168 3,2 25 7 00 0,192 3,6 1 ml endoenzym og 1 ml exoenzym indeholder den samme mængde enzym på proteinbasis.Endo / exo ml ml Total activity / g inulin ratio Endo Exo_Somogyi units 1 00 0.192 0 0.54 20 2 7 0.168 0.024 0.92 3 3 0.144 0.048 1.3 4 1 0.096 0.096 2.1 5 3/1 0.048 0.144 2.8 6 1/7 0.024 0.168 3.2 25 7 00 0.192 3.6 1 ml of endoenzyme and 1 ml of exoenzyme contain the same amount of enzyme on a protein basis.

Med faste intervaller blev prøver udtaget og opvarmet i kogende vandbad i 10 minutter for at inaktivere 30 enzymaktiviteten. Efter afkøling blev prøverne filtreret og derefter behandlet med en "mixed bed" ionbytterhapiks (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) til fjernelse af aske og N før analyse 12 147409 med HPLC. Resultaterne er angivet i tabelform i det følgende.At regular intervals, samples were taken and heated in the boiling water bath for 10 minutes to inactivate the enzyme activity. After cooling, the samples were filtered and then treated with a "mixed bed" ion exchange resin (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) to remove ash and N prior to analysis by HPLC. The results are tabulated below.

På kromatogrammet kan glucose i alle tilfælde adskilles fra en anden top, sandsynligvis difructose. Større 5 mængder af denne forbindelse afspejler sig i en lille ændring af retentionstiden for glucose. DP^ omfatter saccharider med kædelængde på 4 eller mere.On the chromatogram, glucose can in all cases be separated from another peak, probably difructose. Larger 5 amounts of this compound are reflected in a slight change in the retention time of glucose. DP ^ comprises chain length saccharides of 4 or more.

DP.^ - DP^ er saccharider med kædelængde fra 1 (undtagen glucose og fructose) til 4.DP. ^ - DP ^ are chain length saccharides from 1 (except glucose and fructose) to 4.

10 Eksemplet illustrerer, at den mest effektive hydrolyse opnås, når endo/exo-forholdet er ca. 1.The example illustrates that the most effective hydrolysis is achieved when the endo / exo ratio is about First

13 14740913 147409

Endo/exo- forhold_24 timer 48 timer 72 timerEndo / exo ratio_24 hours 48 hours 72 hours

Fructose 14,3 29,1 47,3Fructose 14.3 29.1 47.3

Glucose 9,3 12,5 12,6 5 DP4+ 31,9 19,8 11,8 _DP1-DP3 44,6_38,5_28,4 7 Fructose 62,2 83,6 89,3Glucose 9.3 12.5 12.6 5 DP4 + 31.9 19.8 11.8 _DP1-DP3 44.6_38.5_28.4 7 Fructose 62.2 83.6 89.3

Glucose 10,1 7,0 5,2 DP4+ 13,8 3,2 1,2 10 _PP1-PP3_14,0_¢/2_4,4 3 Fructose 84,8 90,4 91,2Glucose 10.1 7.0 5.2 DP4 + 13.8 3.2 1.2 10 _PP1-PP3_14.0_ ¢ / 2_4.4 3 Fructose 84.8 90.4 91.2

Glucose 4,8 5,5 5,8 DP4+ 6,2 1,5 0,9 _DP-l-DP3_4/2_2/5_2,1 15 1 Fructose 93,3 94,3 93,7Glucose 4.8 5.5 5.8 DP4 + 6.2 1.5 0.9 _DP-1-DP3_4 / 2_2 / 5_2.1 15 1 Fructose 93.3 94.3 93.7

Glucose 3,8 4,7 5,4 DP4+ 1,9 0,6 0,4 _PP1-PP3_1/)_(/4_0,4 1/3 Fructose 91,1 93,8 94,3 20 Glucose 3,9 4,8 4,8 DP4+ 4,1 1,0 0,5 _DP1-DP3_0_i9_0/5_0,4 1/7 Fructose 90,0 93,5 94,4Glucose 3.8 4.7 5.4 DP4 + 1.9 0.6 0.4 _PP1-PP3_1 /) _ (/ 4_0.4 1/3 Fructose 91.1 93.8 94.3 20 Glucose 3.9 4 , 8 4.8 DP4 + 4.1 1.0 0.5 _DP1-DP3_0_i9_0 / 5_0.4 1/7 Fructose 90.0 93.5 94.4

Glucose 3,9 4,6 4,3 25 DP4+ 5,3 1,5 0,8 __0/3__0,4 0 Fructose 84,8 89,6 90,4Glucose 3.9 4.6 4.3 DP4 + 5.3 1.5 0.8 __0 / 3__0.4 0 Fructose 84.8 89.6 90.4

Glucose 3,4 4,1 5,0 DP4+ 11,3 5,7 3,4 30 _DPj^-DP,_0/5_0_/3_1,3Glucose 3.4 4.1 5.0 DP4 + 11.3 5.7 3.4 _DPj ^ -DP, _0 / 5_0_ / 3_1.3

Eksempel 4Example 4

Hydrolyse af inulinekstrakt under anvendelse af forskellige endo-exo-komponentforhold Fremstilling af substrat 35 22,8 kg tørrede snittede cikorierødder blev ekstraheret med 227 kg vand ved 75°C i ca. 1 time ved natur- 14 147409 ligt pH 5,3. Blandingen blev filtreret, og de våde rødder ekstraheredes igen med 150 kg vand ved 75°C i 30 minutter.Hydrolysis of inulin extract using different endo-exo component ratios Preparation of substrate 35 22.8 kg of dried cut chicory roots were extracted with 227 kg of water at 75 ° C for approx. 1 hour at natural pH is 5.3. The mixture was filtered and the wet roots were extracted again with 150 kg of water at 75 ° C for 30 minutes.

De to ekstrakter gav totalt 295 liter ekstrakt med et tørstofindhold målt til 3,5 °Brix.The two extracts gave a total of 295 liters of extract with a dry matter content measured at 3.5 ° Brix.

5 Ekstrakten blev renset ved kalkbehandling. To portioner på hver 687 g CaiOH^ tilsattes lidt efter lidt ved en temperatur på 35 - 40°C. Filtrering udførtes ved 40 -45°C. CO2 sattes til filtratet, hvorved pH-værdien faldt til ca. 7. Der sås intet bundfald. Opløsningen blev behand-10 let med aktivt kul (2% kul på basis af tørrede rødder) ved 75°C i 30 minutter. Kullet fjernedes ved filtrering, og opløsningen blev inddampet under vacuum til et tørstofindhold på ca. 24 °Brix. Den resulterende inulinopløsning havde en brunlig farve.The extract was purified by lime treatment. Two portions of 687 g CaiOH each were added gradually at a temperature of 35-40 ° C. Filtration was performed at 40 -45 ° C. CO 2 was added to the filtrate, whereby the pH dropped to approx. 7. There was no precipitate. The solution was treated with activated charcoal (2% dried root coal) at 75 ° C for 30 minutes. The charcoal was removed by filtration and the solution was evaporated under vacuum to a dry matter content of ca. 24 ° Brix. The resulting inulin solution had a brownish color.

15 Hydrolyse af inulinekstraktenHydrolysis of the inulin extract

Ca. 800 ml af den ovennævnte inulinopløsning blev fortyndet til en Brix-værdi på 20°, pH-værdien blev indstillet til 4,5, og opløsningen deltes i 7 kolber med 100 g opløsning i hver. Kolberne blev udstyret med en magnetisk 20 omrører og anbragtes i et vandbad i 60°C.Ca. 800 ml of the above inulin solution was diluted to a Brix value of 20 °, the pH was adjusted to 4.5 and the solution was divided into 7 flasks with 100 g of solution in each. The flasks were equipped with a magnetic stirrer and placed in a water bath at 60 ° C.

Endo- og exoenzymerne sattes til kolberne, idet den totale enzymmængde på proteinbasis blev holdt konstant, men idet endo-exokomponentforholdet varieredes efter følgende tabel:The endo and exoenzymes were added to the flasks keeping the total amount of enzyme on a protein basis constant, but the endo-exocomponent ratio varied according to the following table:

25 Endo/exo- ml ml Total aktivitet/°Brix DS25 Endo / exo-ml ml Total activity / ° Brix DS

_forhold Exo Endo_Somogyi-enheder_ 00 0 0,096 0,27 7 0,012 0,084 0,46 3 0,024 0,072 0,65 30 1 0,048 0,048 1,05 1/3 0,072 0,024 1,4 1/7 0,084 0,012 1,6 0 0,096 0 1,8 1 ml endoenzym og 1 ml exoenzym indeholder på 35 proteinbasis omtrent den samme mængde enzymkomponent.Ratio Exo Endo_Somogyi Units_ 00 0 0.096 0.27 7 0.012 0.084 0.46 3 0.024 0.072 0.65 30 1 0.048 0.048 1.05 1/3 0.072 0.024 1.4 1/7 0.084 0.012 1.6 0 0.096 0 1 , 8 1 ml of endoenzyme and 1 ml of exoenzyme, on a protein basis, contain approximately the same amount of enzyme component.

15 14740915 147409

Med faste intervaller blev prøver udtaget og opvarmet i kogende vand i 10 minutter til inaktivering af enzymaktivitet. Efter afkøling blev prøverne, omfattende en prøve af substrat uden tilsat enzym, filtreret og derpå 5 behandlet med en "mixed-bed"-ionbytterharpiks (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) til fjernelse af aske og opløselig N før HPLC analyse. Resultaterne er angivet i tabellerne III og IV.At regular intervals, samples were taken and heated in boiling water for 10 minutes to inactivate enzyme activity. After cooling, the samples, comprising a sample of substrate without added enzyme, were filtered and then treated with a mixed-bed ion exchange resin (Bio-Rad AG 501-X8 (D)) to remove ash and soluble N before HPLC analysis . The results are given in Tables III and IV.

"Glucose" er de kombinerede mængder af glucose og en anden komponent, muligvis difructose, der ikke er adskilt 10 på kromatogrammerne. DP4+ omfatter saccharider med en kædelængde på 4 eller mere samt urenheder i denne prøve, f.eks. salt og protein."Glucose" is the combined amounts of glucose and another component, possibly difructose not separated on the chromatograms. DP4 + comprises saccharides having a chain length of 4 or more as well as impurities in this sample, e.g. salt and protein.

DP^-DP^ er saccharider med en kædelængde på fra 1 til 4, undtaget glucose og fructose.DP ^ -DP ^ are saccharides having a chain length of 1 to 4, excluding glucose and fructose.

15 Det endelige glucoseudbytte i dette forsøg er ret højt, hvilket viser en lav middelkædelængde af fructosepoly-mererne.The final glucose yield in this experiment is quite high, showing a low average chain length of the fructose polymers.

Her ses det imidlertid også, at den mest effektive hydrolyse udføres, når endo/exoenzymforholdet er tæt på 1.However, it is also seen here that the most efficient hydrolysis is performed when the endo / exoenzyme ratio is close to 1.

16 14740916 147409

Tabel IIITable III

Sammensætning af inulinsubstratComposition of inulin substrate

Fructose 0,7%Fructose 0.7%

Glucose 0,2% 5 Sucrose 5,5% DP4+ 90,4% DP1-DP3 3,2%Glucose 0.2% Sucrose 5.5% DP4 + 90.4% DP1-DP3 3.2%

Tabel IVTable IV

Endo/exo- 24 48 10 forhold_timer_timer ^ Fructose 12,7 21,5 "Glucose" 7,1 9,2 DP.+ 42,7 31,8 _DP^-DP.,_37,6_37,5 15 7 Fructose 49,6 71,2 "Glucose" 10,9 11,0 DP.+ 18,4 4,9 _DP^-DP-_21,1_12,9 3 Fructose 68,9 82,2 20 "Glucose" 11,4 12,3 DP + 8,2 2,4 _DP-T-pP_11,6_3,2 1 Fructose 81,5 84,0 "Glucose" 12,2 13,0 25 DP.+ 4,1 1,8 DP .f -DP 0 2,2 1,2 1/3 Fructose 79,5 83,7 "Glucose" 12,8 13,1 DP.+ 4,5 2,0 30 _DP^-DP-,_3j2_1,1 1/7 Fructose 79,0 83,6 "Glucose" 12,5 12,8 DP.+ 5,6 2,5 _DP.T-DP _2_j_9_1,1 35 0 Fructose 79,4 83,4 "Glucose" 12,5 12,2 DP-+ 6,5 3,0 DP^-DP3 1,5 1,4 η 147409Endo / exo- 24 48 10 ratio_timer_timer ^ Fructose 12.7 21.5 "Glucose" 7.1 9.2 DP. + 42.7 31.8 _DP ^ -DP., _ 37.6_37.5 15 7 Fructose 49, 6 71.2 "Glucose" 10.9 11.0 DP. + 18.4 4.9 _DP ^ -DP-_21.1_12.9 3 Fructose 68.9 82.2 20 "Glucose" 11.4 12.3 DP + 8.2 2.4 _DP-T-pP_11.6_3.2 1 Fructose 81.5 84.0 "Glucose" 12.2 13.0 25 DP. + 4.1 1.8 DP .f -DP 0 2.2 1.2 1/3 Fructose 79.5 83.7 "Glucose" 12.8 13.1 DP. + 4.5 2.0 30 _DP ^ -DP -, _ 3 0 83.6 "Glucose" 12.5 12.8 DP. + 5.6 2.5 _DP.T-DP _2_j_9_1.1 35 0 Fructose 79.4 83.4 "Glucose" 12.5 12.2 DP + 6.5 3.0 DP ^ -DP3 1.5 1.4 η 147409

Eksempel 5Example 5

Hydrolyse af inulin under anvendelse af forskellige endo/exokomponentforhold 6 kolber, der hver indeholdt 100 g af en 20% 5 Sigmainulinopløsning ved pH 4,5, blev fremstillet. Kolberne blev udstyret med en magnetisk omrører og anbragt i et vandbad ved 60°C.Hydrolysis of inulin using different endo / exocomponent ratios 6 flasks, each containing 100 g of a 20% 5 Sigma insulin solution at pH 4.5, were prepared. The flasks were equipped with a magnetic stirrer and placed in a water bath at 60 ° C.

Endo- og exo-inulinaseenzymerne blev tilsat til kolberne, idet enzymaktiviteten blev holdt inden for et mere 10 snævert område end i eksempel 3, men igen ved at variere forholdet mellem endo- og exoenzymerne vægtmæssigt som det fremgår af følgende tabel:The endo and exo-inulinase enzymes were added to the flasks keeping the enzyme activity within a narrower range than in Example 3, but again by varying the ratio of the endo and exoenzymes by weight as shown in the following table:

Endo/exo-forhold Endo/exo-forhold Sum af aktivite- på proteinbasis_på aktivitetsbasis ter pr. g inulin 15 e® 0,67 4,1 0,6 0,90 2,7 0,4 0,88 1,35 0,2 0,95 0,45 0,07 1,00 20 0 0 1,09Endo / exo ratio Endo / exo ratio Sum of activity on protein basis_ on activity basis per g inulin 15 e® 0.67 4.1 0.6 0.90 2.7 0.4 0.88 1.35 0.2 0.95 0.45 0.07 1.00 20 0 0 1.09

Med faste intervaller blev prøver udtaget og opvarmet i kogende vand i 10 minutter til inaktivering af enzymaktivitet. Efter afkøling blev prøverne filtreret og derpå behandlet med en "mixed-bed"-ionbytterharpiks (Bio-Rad 25 AG 501-X( (D)) til fjernelse af aske og opløselig N, før de blev analyseret ved hjælp af HPLC. Resultaterne er vist i Tabel V.At regular intervals, samples were taken and heated in boiling water for 10 minutes to inactivate enzyme activity. After cooling, the samples were filtered and then treated with a mixed-bed ion exchange resin (Bio-Rad 25 AG 501-X ((D)) to remove ash and soluble N before being analyzed by HPLC. shown in Table V.

Glucose er de kombinerede mængder af glucose og en anden komponent, muligvis difructose, der ikke kan adskilles 30 på kromatogrammet. DP^+ omfatter saccharider med en kædelængde på 4 eller mere. DP-^-DP^ er saccharider med kædelængder fra 1 til 4 undtaget glucose og fructose.Glucose is the combined amounts of glucose and another component, possibly difructose, which cannot be separated on the chromatogram. DP 2+ comprises saccharides having a chain length of 4 or more. DP - ^ - DP ^ are saccharides of chain lengths from 1 to 4 except glucose and fructose.

18 147409 1 dette forsøg findes den mest effektive hydrolyse for en dosering på ca. 1 enhed, når forholdet er 4,1, bestemt gravimetrisk.In this experiment, the most effective hydrolysis is found for a dosage of approx. 1 unit, when the ratio is 4.1, determined gravimetric.

Tabel VTable V

5 Endo/exo Komponenter 24 48 72 forhold_timer_timer_timer O® Fructose 3,7 5,6 33,8 "Glucose" 5,1 6,8 13,1 DP4+ 37,1 17,1 15,3 10 _DP1-DP3_54,2_70,5_37,9 4,1 Fructose 77,4 91,5 94,7 "Glucose" 5,5 3,8 3,3 DP4+ 10,0 2,9 1,4 _DP1-DP3_7J._1^8_0,6 15 2,7 Fructose 80,0 92,9 94,5 "Glucose" 5,4 3,3 3,4 DP4+ 9,1 2,6 1,7 _PP1-PP3_5j5_1^2_0,5 1,35 Fructose 75,9 90,0 92,8 20 "Glucose" 3,8 3,5 3,3 DP4+ 16,8 5,1 3,1 _DP1-DP3__3j5_1^5_0,8 1,45 Fructose 71,0 88,1 92,5 "Glucose" 3,1 3,7 3,4 25 DP4+ 23,8 7,3 3,5 _PP1-PP3_2j_l_0^9_0,7 0 Fructose 64,8 75,5 82,8 "Glucose" 2,3 2,9 3,2 DP4+ 31,9 20,8 13,2 30 DP1_DP3 1,0 0,8 0,85 Endo / Exo Components 24 48 72 ratio_timer_timer_timer O® Fructose 3.7 5.6 33.8 "Glucose" 5.1 6.8 13.1 DP4 + 37.1 17.1 15.3 10 _DP1-DP3_54.2_70, 5_37.9 4.1 Fructose 77.4 91.5 94.7 "Glucose" 5.5 3.8 3.3 DP4 + 10.0 2.9 1.4 _DP1-DP3_7J._1 ^ 8_0.6 15 2, 7 Fructose 80.0 92.9 94.5 "Glucose" 5.4 3.3 3.4 DP4 + 9.1 2.6 1.7 _PP1-PP3_5j5_1 ^ 2_0.5 1.35 Fructose 75.9 90.0 92.8 20 "Glucose" 3.8 3.5 3.3 DP4 + 16.8 5.1 3.1 _DP1-DP3__3j5_1 ^ 5_0.8 1.45 Fructose 71.0 88.1 92.5 "Glucose" 3 , 1 3.7 3.4 DP4 + 23.8 7.3 3.5 _PP1-PP3_2j_l_0 ^ 9_0.7 0 Fructose 64.8 75.5 82.8 "Glucose" 2.3 2.9 3.2 DP4 + 31.9 20.8 13.2 30 DP1_DP3 1.0 0.8 0.8

Eksempel 6 2 kolber hver indeholdende 100 g 20% vægt/vægt Sigmainulinopløsning ved pH 4,5 blev fremstillet. Kolberne 19 147409 blev udstyret med magnetisk omrører og anbragt i et vandbad ved henholdsvis 60 og 65°C.Example 6 2 flasks each containing 100 g of 20% w / w Sigma insulin solution at pH 4.5 were prepared. The flasks 19 147409 were equipped with magnetic stirrer and placed in a water bath at 60 and 65 ° C, respectively.

Inulinaseenzymet fra A. ficuum (A 524 = ATCC 16882) blev tilsat i en dosering på 2,8 enheder/g inulin.The A. ficuum inulinase enzyme (A 524 = ATCC 16882) was added at a dosage of 2.8 units / g inulin.

5 Inulinasen fra A. ficuum havde et endo/exoforhold på 1.The A. ficuum inulinase had an endo / exo ratio of 1.

Prøver blev udtaget med faste intervaller og behandlet som i de foregående eksempler.Samples were taken at regular intervals and treated as in the previous examples.

Følgende resultater blev opnået:The following results were obtained:

Temp. Dosering 24 48 72 96 10 °C enheder/g Komponenter timer timer timer timer _inulin_ 60 2,8 Fructose 94,0 95,5 95,3 95,1Temp. Dosage 24 48 72 96 10 ° C units / g Components hours hours hours hours _inulin_ 60 2.8 Fructose 94.0 95.5 95.3 95.1

Glucose 4,9 4,3 4,3 4,4 DP4+ 0,8 0,2 0,2 0,1 15 _DP1-DP2 0,3 0,1 0,2 0,3 65 2,8 Fructose 93,5 95,0 95,4 95,3Glucose 4.9 4.3 4.3 4.4 DP4 + 0.8 0.2 0.2 0.1 15 DP1-DP2 0.3 0.1 0.2 0.3 65 2.8 Fructose 93.5 95.0 95.4 95.3

Glucose 4,7 4,2 4,0 4,2 DP4+ 1,2 0,5 0,2 0,1 DP1-DP3 0,6 0,3 0,3 0,4 1Glucose 4.7 4.2 4.0 4.2 DP4 + 1.2 0.5 0.2 0.1 DP1-DP3 0.6 0.3 0.3 0.4 1

Det fremgår, at der opnås fuldstændig hydrolyse, fructose + "glucose"-indholdi 99%, ved begge temperaturer under anvendelse af dette enzympræparat og denne dosering.It is apparent that complete hydrolysis, fructose + "glucose" content of 99% is obtained at both temperatures using this enzyme preparation and this dosage.