DK145424B - Fremgangsmaade til fremstilling af nitrogenholdige polysaccharider med antitumorigen virkning - Google Patents

Description

(19) DANMARK ( \Ry (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145^248

direktoratet for PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 1 519/77 (51) -IntCL* C 12 P 19/26 . ^ (22) Indleveringsdag 5· apr, 1977 C ,08 B 37/00 .

(24) Løbedag 5. apr. 1977 (41) Aim. tilgængelig 8. jan. 1978 . f , (44) Fremlagt 15. nov. 1982 x : (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag - r .

(85) Videreførelsesdag - (62) Sta mansøgning nr. -

(30) Prioritet 7. jul. 1976, 80665/76, JP

(71) Ansøger KUREHA KAGAKU KOGYO KABUSHIKI KAISHA, Tokyo, JP.

(72) Opfinder Saburo Ueno, JP: Chlkao Yoshikumi, JP: Furalo Hirose, JP: Yoshlo Ohmura, JP: Toshihlko WscLa, JP: tn. fl.

(74) Fuldmægtig Ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.

..... ' ' ..... I ' ' ........... " 1 - (54) Fremgangsmåde til fremstilling af nitrogenholdige polysaccha= .. >· j rider med antltumorigen virkning..

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et nitrogenholdigt polysaccharid med antitumorigen virkning ved ‘ ekstraktion af en svamp tilhørende slægten Coriolus, familien Poly-poraceae og klassen Basidiomycetes med et vandigt opløsningåniddel.

Det er velkendt, at et polysaccharid med antitumorigen virkning kan fremstilles ved at rense ekstrakten, der fås ved eks-traktion af en Basidiomycet med et vandigt opløsningsmiddel. En N sådan fremgangsmåde har imidlertid den alvorlige ulempe, at ekstrak- ^ tionseffektiviteten med hensyn til den aktive bestanddel er lav, 3" hvilket resulterer i et betydeligt tab af det værdifulde antitumori- gene stof, og følgelig har en sådan fremgangsmåde kun ringe praktisk £ anvendelighed, navnlig ud fra en betragtning over tilpasningsmuiig- □ :ib V '·. .£’··· ..................

' i ' 2 U 5424 heden til industriel fremstilling af antitumorigent stof fra svampen.

Det har nu vist sig, at der fra en svamp hørende til slægten Coriolus, familien Polyporaceae og klassen Basidiomycetes kan udvindes et nitrogenholdigt polysaccharid med antitumorigen virkning i betydeligt udbytte ved en fremgangsmåde, som er ejendommelig ved, at svampen først ekstraheres med vand eller en fortyndet vandig alkalisk opløsning og derefter yderligere ekstraheres trinvis med vandige alkaliske opløsninger af gradvis øget koncentration indenfor området under 2N ved en temperatur på 50-100°C.

"Svampen hørende til Coriolus-slægten", som benyttes som udgangsmateriale ved den foreliggende opfindelse, er en af de kendte arter som indbefatter f.eks. Coriolus versicolor (Fr.)

Quél., Coriolus hirsutus (Fr.) Quél., Coriolus consors (Berk.) Imaz., Coriolus conchifer (Schw.) Pat., Coriolus pubescens (Fr.) Quél., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. og Coriolus biformis (klotz.) Pat. (Se COLORED ILLUSTRATIONS OF FUNGI OF JAPAN af Rokuya Imazeki og Tsuguo Hongo, Bind I, 1974, og Bind II, 1975). Blandt disse svampe er Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P nr. 2414), Coriolus consors (Berk.) Imaz. (FERM-P nr. 988), Coriolus hirsutus (Fr.) Quél. (FERM-P nr. 2711) og Coriolus pargamenus (Fr.) Pat. (FERM-P nr. 2712) deponeret i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Chiba-shi, Japan), som er et statsforetagende udpeget af generaldirektøren for de japanske patentmyndigheder. Betegnelsen "svamp hørende til Coriolus-slægten", som den anvendes heri, skal forstås som refererende til frugtlegemerne og/eller mycelierne af førnævnte svampearter. Særligt foretrukket som udgangsmateriale ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er mycelium tilvejebragt fra en kultur af Coriolus versicolor (Fr.) Quel.

Til ekstraktion af det Ønskede nitrogenholdige polysaccharid fra Basidiomyceterne (udgangsmateriale) ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen underkastes udgangsmaterialet flere ekstraktionsbehandlinger (fle'rtrinsekstraktion), d.v.s. at udgangsmaterialet først ekstraheres under anvendelse af vand eller et vandigt opløsningsmiddel indeholdende en lille mængde alkali (en fortyndet alkalisk opløsning) og derefter ekstraheres yderligere i flere trin under anvendelse af de vandige opløsninger med de jævnt stigende alkalikoncentrationer. I løbet af denne ekstraktionsproces er det muligt at gentage ekstraktionen under anvendelse af en ekstraktionsopløsning med samme koncentration. "Vandigt opløsningsmiddel indeholdende en lille mængde alkali" betyder en vandig opløsning, hvori pH-værdien af den vandige fase efter blanding med svampen er ca. 7 eller derunder. En sådan specificeret definition 3 145424 er baseret på, at når rent vand eller en natriumhydroxidopløsning med en koncentration på ca. 0,,01 N blandes med. svampen, forbliver pH-værdien af denne opløsning i området fra ca. 4 til 7 som følge : . af svampens iboende puffervirkning.

De vandige alkaliske opløsninger, der benyttes ved jævnt M stigende koncentrationer ifølge den foreliggende opfindelse, har som nævnt en maksimal koncentration på 2 N. Dette , skyldes, at nedbrydning af den aktive bestanddel kunne finde sted, hvis ekstraktionen gennemføres ved en koncentration, som er højere énd ovennævnte niveau. Det til ekstraktionen af Basidiomyceterne ifølge opfindelsen anvendte vandige opløsningsmiddel benyttes i en mængde på fra 5 til 200 gange vægten af udgangsmaterialet (tørvægtsbasis) i hvert ’ ekstraktionstrin, og ekstraktionen gennemføres sædvanligvis ved 50-100°C over fra 20 minutter til 5 timer. Det bør bemærkes, at en reaktionstemperatur på under 50°C resulterer i en dårlig ekstraktionseffektivitet, medens en ekstraktions temperatur på over 100°C/$u:nne forårsage nedbrydning af slutproduktet. Antallet af ekstraktionstrin er sædvanligvis fra 2 til ca. 10, fortrinsvis fra 3 til ca. 8. For at hindre nedbryd-::, ning af den aktive bestanddel foretrækkes det, at den samlede opvarm-π ningstid under ovennævnte temperaturbetingelser er mindre end 20 timer uanset antallet af ekstraktionstrin. For at opnå tilfredsstillende ekstraktionseffektivitet anbefales det også, at den totale opvarmningstid ikke er under 1 time. Den i forbindelse med opfindelsen benyttede alkaliske forbindelse kan være natriumhydroxid, kaliumhydroxid, calcium-hydroxid eller ammoniak, og brugen af natriumhydroxid er den alminde-f ligste.

Den ovenfor angivne flertrinsekstfaktionsfremgangsmåde/- der benytter sig af vandige alkaliske opløsninger med jævnt stigende koncentrationer, giver et højere udbytte af slutproduktet, end det ér muligt at opnå under anvendelse af de sædvanlige fremgangsmåderog er følgelig af stor betydning ud fra et industrielt produktivitetsmæssigt synspunkt. Således har denne flertrinsekstraktionsproces en overraskende effekt, idet den giver et overraskende højt udbytte sammenlignet med gentagen ekstraktion under anvendelse af rent vand alene eller vandige alkaliske opløsninger med samme koncentration.

Den mekanisme, som tilvejebringer denne høje ekstraktions-_ ikke effekt, kendes endnu/præcist, men det antages, at ekstraktionsprocessen ikke blot fremkalder eluering af de opløselige bestanddele fra Basidiomyceterne men også forårsager mild nedbrydning af Basidiomyceterne til opnåelse af dannelse af den opløselige aktive bestanddel. Med andre ord antages det, at udgangsmaterialet undergår nedbrydning, hver gang 4 usm den alkaliske koncentration af den alkaliske vandige opløsning, der benyttes ved ekstraktionen, forøges, hvilket muliggør effektiv frembringelse af det aktive stof.

Hvis ekstraktionen på den anden side gennemføres under anvendelse af en stærkt koncentreret, vandig alkalisk opløsning fra begyndelsen uden indledende vandekstraktion, bliver ekstraktudbyttet ganske vist forholdsvis højt i det første ekstraktionstrin, men udbyttet falder stærkt i andet og de efterfølgende ekstraktionstrin- Dette menes at skyldes følgende. Den fraktion, som normalt skulle ekstraheres med varmt vand eller en fortyndet, alkalisk vandig opløsning, undergår for voldsom nedbrydning under de kraftige betingelser, og det højmolekylære polysaccharid reduceres formentlig til et lavmolekylært stof med en molekylvægt på under 5.000.

Ekstrakten, der er fremkommet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen på den ovenfor beskrevne måde, neutraliseres på sædvanlig vis under anvendelse af en mineralsk syre, såsom fortyndet saltsyre, og underkastes derefter en rensningsproces. I dette tilfælde kan den eks-traktopløsning, som fås ved hvert ekstraktionstrin, underkastes rensning, eller også kan de opløsninger, som fås i de respektive ekstraktionstrin, forenes og derefter underkastes rensning.

Forskellige rensningsmetoder, såsom ultrafiltrering, omvendt osmose, gelfiltrering, udsaltning og udfældning under anvendelse af et organisk opløsningsmiddel, står til rådighed, og disse metoder kan benyttes enten alene eller i kombination til udvinding af et renset nitrogenholdigt polysaccharid med antitumorigen virkning.

Elementaranalysen af det således frembragte nitrogenholdige polysaccharid viste, at det primært er sammensat af carbon, hydrogen, nitrogen og oxygen. Nitrogenindholdet i produktet varierer med nitrogenindholdet i udgangsmaterialet, men det bemærkedes, at produktet havde et nitrogenindhold på normalt over 2 vægtprocent, i de fleste tilfælde 3-5 vægtprocent.

Forskellige farvereaktionsprøver på stoffet gav de resultater, som er vist i nedenstående tabel 1.

5 U5424

Tabel 1

Farvereaktion Farve Resultater ’ a-naphthol/svovlsyre- reaktion (Molisch-prØve) Purpur Saccharider bekræftet '

Indol/svovlsyre-reaktion (Disch-prøve) Brun Saccharider bekræftet

Anthron/svovlsyrereaktion Grønblå Saccharider bekræftet

Phenol/svovlsyre- reaktion Brun Saccharider bekræftet

Tryptophan/svovlsyre- reaktion Purpurbrun Saccharider bekræftet

Iiowry-Folin-prøve Blå Peptidbindinger bekræf tet

Ninhydrin-reaktiom efter saltsyrehydrolyse Grønblå a-aminosyrer bekræftet

Resultaterne af disse farveprøver bekræfter, at slutproduktet, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er et nitrøgenW holdigt polysaccharid (indeholdende primært peptidbundet nitrogen).

Det bestemtes ved søjlechromatografi, at molekylvægten af stoffet, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ligger i området fra ca. 5.000 til 300.000, og at middelmolekylvægten målt ved en ultracentrifugeringsmetode ligger i området fra 10.000 til. 100.-0,00. Fraktionerne med lav molekylvægt (med en molekylvægt på under 5.000), som fjernes ved ovenstående rensningsbehandling, er næsten betydningsløse, hvad angår inhiberende virkning overfor alvorlige Sarcoma-1&0 tumorer i mus ved intra-peritoneal indgivelse, og de er ligeledes bitre, har en ubehagelig lugt og har bivirkninger.

Det ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tilvejebragte ni-trogenholdige polysaccharid frembringer en antitumorigen virkning i mus, ikke blot ved intraperitoneal indgivelse men også ved oral indgivelse. Med andre ord kan dette nitrogenholdige polysaccharid udgøre et særdeles godt antitumorigent middel til oral indgivelse, og denne virkning fer e usm rent faktisk blevet bekræftet i en lang række forsøg som angivet i nedenstående udførelseseksempler. Brugen af det nitrogenholdige polysac-charid er ikke begrænset til et sådant oralt antitumorigent middel. Det viser sig også effektivt med hensyn til immunitetsgenvinding i værtsorganismen. Nærmere bestemt er stoffet ikke blot virksomt til hindring af bivirkninger ved chemoterapi af cancer og stigende følsomhed ved radioterapi men også til at hindre forringelse af immunitet eller fysisk styrke af en patient efter en operation eller blodtransfusion og kontrollere eller hindre infektionssygsomme forårsaget af virus eller bakterier som resultat af forringelse i immunitet eller fysisk styrke. Det nitrogenholdige polysaccharid giver også en særdeles god virkning ved oral indgivelse med hensyn til forbedring af leverfunktion, forøgelse af appetiten, afhjælpning af tarmforstyrrelser og fremme af urinering. Det viser sig også virksomt til behandling af spedalskhed.

Den foreliggende opfindelse vil nu blive beskrevet i detaljer ved hjælp af nogle udførelseseksempler.

Eksempel 1 200 g tørt mycelium (fugtighedsindhold: 9,9%) af Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P nr. 2414), tilvejebragt fra en dyrket kultur, og 3 liter vand anbragtes i en 5-liters kolbe forsynet med omrører, og blandingen omrørtes i et kogende vandbad og blev holdt i denne tilstand med en indre temperatur på 95 + 2°C i 3 timer. Derefter blev blandingen afkølet og underkastet vakuumfiltrering under anvendelse af en Biichner-tragt for at fjerne svampen fra ekstraktopløsningen, og derefter vaskedes det tilbageværende mycelium med ca. 1 liter vand, son blandedes med ekstraktopløsningen. Den blandede opløsning var på ca. 3,5 liter. pH af ekstraktopløsningen var 5,8. Restmyceliet blandedes yderligere med 2 liter vand og vinderkastedes derefter en tilsvarende 2 timers ekstraktion og vask med 1 liter vand, hvorved der fremkom ca. 3 liter ekstraktopløsning. Den fremkomne svamperemanens blandedes igen med 2 liter 0,1 normal natriumhydroxidopløsning og ekstraheredes på lignende måde ved 95 + 2°C i 2 timer efterfulgt af afkøling, neutralisering med 2N saltsyre og vakuumfiltrering for at separere ekstraktopløsningen og svamperemanensen. Efter adskillelse vaskedes remanensen med ca. 500 ml vand/ som blandedes med ekstraktopløsningen, hvorved der fremkom 2,5 liter opløsning. Tilsvarende operationer blev gentaget under anvendelse af 2 liter af natriumhydroxidopløsninger på 0,2N, 0,3N og 0,4N og 0,5 liter vaskevand, hvorved der fra hver proces fremkom ca. 2,5 liter ekstraktopløsning.

7 145424

De seks tilberedninger af ekstraktopløsning (ialt 16,5 liter) sammenbragtes og koncentreredes ved hjælp af en vakuumkoncencrator (rotationsinddamper) ved 60°C til 700 ml og blev derefter anbragt i et cellulosedialyserør (Visking Tube fra Union Carbide Corp.) for at gen-, nemføre løbende dialyse ved 5°C i 72 timer, og det fremkomne dialysat koncentreredes yderligere og underkastedes frysetørring for at tilvejer-bringe 60 g leverbrunt pulver med et fugtighedsindhold på 7% (udbytte? 31,1%). Elementaranalyse af dette pulver gav 40,3% carbon, 6,2% hydrogen, 2,9% nitrogen og 50,6% oxygen. Molekylvægten af dette stof målt ved søjlechromatografi var fra ca. 10.000 til 250.000, og middelmolekylvægten målt ved en ultracentrlfugeringsmetode under anvendelse af vand som opløsningsmiddel var 94.000. (Det ovenfor angivne oxygenindhold er den værdi, som fås ved at subtrahere det samlede procentiske indhold af de øvrige grundstoffer fra 100).

Forskellige farvereaktionsprøver Udført på dette pulver efter opløsning i vand gav samme resultater som vist i Tabel 1, og det bekræftedes således, at dette pulveragtige stof var et nitrogenholdigt polysaccharid. Stoffets inhiberingsforhold overfor alvorlige Sarcoma-180 tumorer i mus var så højt som 90% ved intraperitoneal indgivelse og 70% ved oral indgivelse.

Den antitumorigene virkning af stoffet måltes ved en sædvanlig fremgangsmåde, som er kortfattet beskrevet i det følgende.

Sarcana-180 tumorceller transplanteredes ind i bughulen hos mus, og efter tilstrækkelig celleformering i 7 dage transplanteredes 10^ af cellerne ind under huden af axilla hos andre mus under dannelse af kraftige tumorer. Indgivelse af stoffet, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, påbegyndtes fra den 24. time efter transplantation på én af to måder,, enten ved intraperitoneal eller oral indgivelse af en fysiologisk saltvandsopløsning indeholdende 1 mg af stoffet pr. ml opløsning. Ved den intraperitoneale indgivelse blev der indgivet en dosis på 10 mg/kg legemsvægt én gang hver anden dag i 20 på hinanden følgende dage, og for en mus med en legemsvægt på 20 g var den indgivne dosis således 0,2 mg stof (svarende til 0,2 ml injiceret opløsning) og døn samlede indgivne stofmængde i behandlingsperioden 2 mg (svarende til 2 ml injiceret opløsning)· - Ved oral indgivelse blev stoffet indgivet i en dosis på 1000 icq/kq legsnsvægt^ dagligt i 20 på hinanden følgende dage, og for en mus med en legemsvægt på 20 g var den indgivne dosis således 20 mg stof dagligt (svarende til 20 ml opløsning) og den samlede indgivne stofmængde i behandlingsperioden 400 mg (svarende til , 400 ml opløsning).

Resultaterne af tilsvarende ekstraktionsforsøg gennemført under anvendelse af udelukkende vand som opløsningsmiddel er vist i nedenstående Tabel 2. Ved disse forsøg gennemførtes alle ekstraktions-og vasketrin under anvendelse af vand i samme mængde som det ved oven-nævnte behandlinger anvendte opløsningsmiddel. I dette tilfælde under- 8 U5424 kastedes ekstraktopløsningen (blandet med vaskevand) vakuumkoncentration, dialyse, afkøling og tørring for at bestemme udbyttet i hvert ekstraktionstrin, og resultatet var som vist i tabellen. Som det fremgår af tabellen falder ekstraktionsudbyttet stærkt fra det andet og efterfølgende ekstraktionstrin, og det er næppe muligt at tilvejebringe det ønskede stof i højt udbytte ved gentagne ekstraktionstrin.

Tabel 2

Ekstraktionstrin Ekstrakt- Vaskeopløs- Udbytte af tørt nr. opløsning (1) ning (1) pulver (vægtprocent) 1 3 1 7,0 2 2 0,5 2,1 3 2 0,5 0,8 4 2 0,5 0,3 5 2 0,5 0,1 6 2 0,5 0,1

Ialt 13 3,5 10,4 Mængde mycelium anvendt som udgangsmateriale: 200 g Ekstraktionstemperatur: 95 + 2°C.

Eksempel 2

Under anvendelse af samme apparatur, som benyttedes i Eksempel 1, ekstraheredes 200 g tørt mycelium (fugtighedsindhold: 8,8%) af Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P nr. 2414) under successiv anvendelse af 2 liter af natriumhydroxidopløsninger på 0,05N, 0,1N, 0,2N og 0,4N. Ekstraktionstemperaturen var 90-95°C, og ekstraktionstiden var 2 timer i' hvert ekstraktionstrin, og efter hvert ekstraktionstrin afkøledes blandingen, neutraliseredes med 2N saltsyreopløsning og underkastedes derefter vakuumfiltrering for at adskille svamperemanensen og ekstraktopløsningen. Remanensen vaskedes med 500 ml vand efter hvert ekstraktionstrin, og vaskeopløsningen blandedes med den tilsvarende ekstraktopløsning .

9 US424

Ekstraktopløsningen i hvert ekstraktionstrin underkastedes vakuumkoncentration, dialyse, koncentration og frysetørring på samme måde som i Eksempel 1, hvorved der fremkom et leverbrunt pulver.

Resultaterne af prøverne på produkterne fra de respektive ekstraktionstrin er vist i nedenstående Tabel 3. —

Tabel 3

Udbytte af

Ekstraktionstrin Natriumhydroxid- pH på ekstrak- tørt pulver nr. koncentration tionstidspunktet (vægtprocent) 1 0,05N 9,0 10,1 2 0, IN 11,5 3,5 3 0,2N 12,5 6,8 4 0,4N 13,0 6,6

Det samlede.udbytte var 27%, og en elementaranalyse af hvert produkt gav følgende resultater: Carbon: 41,0%, hydrogen: 6,3%, nitrogen: 3,7%, oxygen: 49,0%.

Ved samme prøver, som gennemførtes i Eksempel 1, bekræftedes det, at ovennævnte pulver er et nitrogenholdlgt polysaccharid med en molekylvægt på fra 10.000 til 250.000 og en middelmolekylvægt på 100.000. Inhiberingsforholdet overfor alvorlig Sarcoma-180 tumor i mus var 93% for såvidt angår intraperitoneal indgivelse og 73% for såvidt angår oral indgivelse.

Til samænligning af ekstraktionsudbyttet gennemførtes samme forsøg som i Eksempel 1 under anvendelse af IN og 0,4N natriumhydroxidopløsninger, hvorved de i nedenstående Tabel 4 viste resultater fremkom. Som det bemærkes af tabellen faldt udbyttet, når ekstraktionsoperationen blev gentaget under anvendelse af ekstraktionsopløsningen med samme koncentration, og det viste sig at være vanskeligt at opnå et sådant højt udbytte, som fremkom ved flertrinsekstraktionen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

10 145424

Tabel 4

Ekstraktionstrin Udbytte (vægtprocent) Udbytte (vægtprocent) nr. af ønsket materiale ved af ønsket materiale ved

ekstraktion med IN NaOH ekstraktion med 0,4N NaOH

1 10,5 13,8 2 2,4 2,9 3 1,1 2,0 4 0,5 1,5

Ialt 14,5 20,2

Eksempel 3

Under anvendelse af samme apparat, som benyttes i Eksempel 1, ekstraheredes 200 g tørt mycelium (fugtighedsindhold: 9,9%) af Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P nr. 2414), først med 3 liter vand ved 95 - 2°C i 3 timer pg blev derefter, efter afkøling, underkastet vakuumfiltrering til adskillelse af restmyceliet og ekstrakt-opløsningen, og restmyceliet blev yderligere vasket med 1 liter vand og blev derefter blandet med ekstraktopløsningen, hvorved der fremkom ca. 3,5 liter ekstraktopløsning.

Derefter tilsattes restmyceliet 2 liter IN natriumhydroxidopløsning til ekstraktion ved 90-95°C i 0,5 timer og blev efterfulgt af afkøling, neutralisation med 2N saltsyre, vakuumfiltrering og vask iried 1 liter vand, hvorved 3 liter ekstraktopløsning adskiltes fra svamperesten.

Alle de fremkomne ekstraktopløsninger sammenbragtes og underkastedes vakuumkoncentration, dialyse, yderligere koncentration og frysetørring ved fremgangsmåden ifølge Eksempel 1, hvorved der fremkom 33 g leverbrunt pulver med et fugtighedsindhold på 7,0% (udbytte: 21,0%). Resultatet af en elementaranalyse på dette pulver viste, at det er sammensat af 41,7% carbon, 6,4% hydrogen, 3,9% nitrogen og 48,0% oxygen.

Det bekræftedes også af de samme prøver, som gennemførtes i Eksempel 1, at dette stof er et nitrogenholdigfcpolysaccharid med en molekylvægt på 10.000-300.000 og en middelmolekylvægt på 98.000.

11 1Λ5Λ2Λ

Inhiberingsforholdet for dette stof overfor alvorlige Sarcoma-180 tumorer i mus var så højt som 94% ved Intraperitoneal indgivelse og 68% ved oral indgivelse.

Eksempel 4

Under anvendelse af apparatet ifølge Eksempel 1 ekstrahere-des 200 g tørre frugtlegemer af Coriolus versicolor (Fr.) Quél. (FERM-P nr. 2414) med et fugtighedsindhold på 8,7%, først med 2,4 liter vand ved 95 + 2°C i 3 timer, og produktet underkastedes efter afkøling vakuumfiltrering for at skille remanensen fra ekstraktopløsningen, og rema-nensen vaskedes yderligere med 500 cm vand og blandedes med ekstraktopløsningen, hvorved der fremkom ca. 2,5 liter ekstraktopløsning.

Remanensen blandedes derefter med 2 liter 0,4N natriumhydroxidopløsning og ekstraheredes ved 90 + 2°C i 1 time efterfulgt af afkøling, neutralisation med 2N saltsyre, vakuumfiltrering og vask med 500 cm vand for at adskille 2,5 liter ekstraktopløsning og remanens.

En tilsvarende ekstraktionsoperation gennemførtes igen med 2 liter IN natriumhydroxidopløsning ved 80 + 2°C i 1 time, hvorved der fremkom 2,5 liter ekstraktopløsning.

Alle ekstraktopløsningeme sammenbragtes og underkastedes vakuumkoncentration, dialyse, koncentration og frysetørring på samme måde som i Eksempel 1, hvorved der fremkom 43,4 g af et leverbrunt pulver med et fugtighedsindhold på 7,5% (udbytte: 22%). Resultatet af en elementaranalyse af dette pulver viste 42,3% carbon, 6,5% hydrogen, 2,2% nitrogen og 49,0% oxygen. Det bekræftedes også af samme prøver som i Eksempel 1, at stoffet er et nitrogenholdigt polysaccharid med en molekylvægt på 10.000-300.000 og en middelmolekylvægt på 110.000.

Inhiberingsforholdet for dette stof overfor alvorlige Sarcoma-180 tumorer i mus var så højt som 961 ved intraperitoneal indgivelse og 75% ved oral indgivelse.

For at sammenligne ekstraktionsudbyttet gennemførtes en tilsvarende ekstraktionsproces under anvendelse af vand udelukkende som ekstraktionsopløsningsmiddel. Udbyttet af det ønskede stof var kun 7,6%.

12 U5424

Eksempel 5 200 g tørt mycelium (fugtighedsindhold: 9,9%) af hver af de arter af slægten Coriolus, der er anført i omstående tabel 5, og som var indvundet fra en artificiel kultur, blev sammen med 3 liter vand anbragt i en 4-liters kolbe, som var forsynet med en omrører. Blandingen blev omrørt i et kogende vandbad og blev holdt i denne til-stand ved en indre temperatur på 95 + 2 C i 3 timer. Blandingen blev derpå afkølet og underkastet sugefiltrering under anvendelse af en Buchner-tragt til adskillelse af svampen og ekstraktopløsningen, og det tilbageblivende mycelium blev vasket med ca. 1 liter vand, som blev blandet med ekstraktopløsningen. Den blandede opløsning udgjorde ca. 3,5 liter, og dens pH var 5,8. Det tilbageblevne mycelium blev yderligere blandet med 2 liter vand og derpå underkastet 2 timers tilsvarende ekstraktion og vask med 1 liter vand til opnåelse af ca. 3 liter ekstraktopløsning. Den resulterende svamperemanens blev blandet med 2 liter 0,1N natriumhydroxidopløsning og ekstraheret tilsvarende ved 95 + 2°C i 2 timer efterfulgt af afkøling, neutralisering med 2N saltsyre og sugefiltrering til adskillelse af ekstraktopløsning og svamperemanens. Efter adskillelsen blev remanensen vasket med ca. 500 ml vand, som blev blandet med ekstraktopløsningen til opnåelse af 2,5 liter opløsning. Tilsvarende operationer blev udført under anvendelse af 2 liter 0,2N, 0,3N og 0,4N natriumhydroxidopløsning og 0,5 liter vaskevand til opnåelse af ca. 2,5 liter ekstraktopløsning fra hver proces.

De således fremstillede seks ekstraktionsopløsninger (ialt 16,5 liter) blev sammenblandet og koncentreret med en vakuumkoncentra-tor (rotationsfordamper) ved 60°C til 700 ml og blev derpå anbragt i en cellulose-dialyseslange (Visking Tube fremstillet af Union Carbide Corp.) til frembringelse af strømningsdialyse ved 5°C i 72 timer, hvorefter hver af de opnåede dialysater blev yderligere koncentreret og underkastet frysetørring til opnåelse af respektive leverbrune pulvere.

Egenskaberne af pulverprodukterne fra de respektive myce-lia af arter af slægten Coriolus blev bestemt ved de samme procedurer som dem, der er beskrevet i eksempel 1, og de er anført i den efterfølgende tabel 5.

13 145424

Tabel 5

Egenskaber af produkter opnået fra forskellige arter af slægten Coriolus.

; £ £> r

Nr. og art Udbytte Grundstofsammen- Gennem- I.P

sætning f sn.

C(%) H (%) N{%) Mol* (%) 1. C. hirsutus (Fr.)

Quél 29,0 40,2 6,0 5,0 100.000 91 (FERM-P nr. 2711) 2. C. consors (Berk)

Imaz. 30,2 38,6 5,9 4,6 " 74 (FERM-P nr. 988) 3. C. conchifer (Schw)

Pat. 29,5 39,8 5,9 5,0 " 75 4. C. pubescence (Fr.)

Quél 30,8 39,0 5,5 3,9 " 85 5. C. pargamenus (Fr.)

Pat. 27,0 39,5 5,9 4,3 " 83 (FERM-P nr. 2712) 6. C. biformis (Klotz)

Pat. 29,3 42,0 6,4 5,5 " 80 *

Gennemsnitlig molekylvægt.

* *

Inhiberingsforhold overfor transplanterede sarcoma 180-celler i mus.