DK142191B - Growth-promoting poultry feed and means for use in its preparation. - Google Patents

Description

142191 l142191 l

Den foreliggende opfindelse angår et vækstfremmende fjerkræfoder, der medfører en forøgelse af fodereffektiviteten for fjerkræ og forøgelse af fjerkræs vækst, hvilket foder er ejendommeligt ved, at det ud over sædvanlige foderbestanddele indeholder antibiotikum 5 X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt salt deraf eventuelt på en ikke- toxisk inert bærer, i hvilket foder antibiotikum X-5108 eller det fysiologisk tolerable salt deraf er til stede i en mængde på fra 0,001 til 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele.The present invention relates to a growth promoting poultry feed which results in an increase in feed efficiency for poultry and to increase poultry growth, which feed is characterized in that it contains, in addition to the usual feed ingredients, antibiotic 5 X-5108 or a physiologically tolerable salt thereof on a a toxic inert carrier in which feed antibiotic X-5108 or its physiologically tolerable salt is present in an amount of from 0.001 to 0.01 parts by weight per day. 100 parts by weight.

Til den foreliggende opfindelses formål kan anvendes antibiotikum kaldet X-5108 i ren form, i fortyndede former samt som et råt koncentrat. Det hidtil ukendte antibiotikum giver, hvadenten det forefindes i rå eller i en mere ren form, en markant vækstforøgelse hos fjerkræ.For the purposes of the present invention, antibiotics called X-5108 may be used in pure form, in dilute forms, and as a raw concentrate. The novel antibiotic, whether present in raw or in purer form, provides a marked increase in poultry growth.

1515

Det hidtil ukendte antibiotikum X-5108 produceres af en hidtil ukendt art af Streptomyces nemlig Streptomyces sp. X-5108. Den hidtil ukendte antibiotikumproducerende Streptomycet er isoleret fra en jordprøve, som blev samlet på Bermudaøeme. En levedygtig 20 kultur af organismen mærket med laboratorieangivelsen Streptomy ces sp. X-5108, underkultur 3191-2, er deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor denne kultur er indgået i ATCC-samlingen under registreringsnummeret 21386.The novel antibiotic X-5108 is produced by a new species of Streptomyces namely Streptomyces sp. X-5108th The new antibiotic-producing Streptomycet is isolated from a soil sample collected in the Bermuda Islands. A viable culture of the organism labeled with the laboratory designation Streptomy ces sp. X-5108, subculture 3191-2, is deposited in the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, where this culture is included in the ATCC collection under registration number 21386.

Den art af Streptomyces, som her betegnes Streptomyces sp. X-25 5108, indbefatter alle stammer af Streptomyces, som producerer an tibiotikum X-5108, og som ikke afviger væsentligt fra stammen ATCC 21386.The species of Streptomyces referred to herein as Streptomyces sp. X-25 5108, includes all strains of Streptomyces which produce an antibiotic X-5108 and do not differ significantly from strain ATCC 21386.

I det følgende gives en generel beskrivelse af organismen Strepto-20 myces sp. X-5108, ATCC 21386 baseret på karakteristika såsom vækst, pigment, morfologi osv. De angivne farver og farveprøvebetegnelser er sædvanligvis de, som anbefales af the International Streptomyces Project (forkortes ISP): Shirling, E.B. og D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Inti. J. Syste-25 matic Bact., 16, 313 - 340. Til tilvejebringelse af den diagnostiske karakteristik og den morfologiske beskrivelse, som angives nedenfor, er anvendt medier af den art, som er fremstillet af Difco Laboratories for ISP. Disse mediers sammensætning er angivet i tabel I.The following is a general description of the organism Strepto-myces sp. X-5108, ATCC 21386 based on characteristics such as growth, pigment, morphology, etc. The indicated colors and swatches are usually those recommended by the International Streptomyces Project (abbreviated ISP): Shirling, E.B. and D. Gottlieb, 1966, "Methods for Characterization of Streptomyces Species", Inti. J. Systematic Bact., 16, 313 - 340. To provide the diagnostic characteristics and morphological description set forth below, media of the kind manufactured by Difco Laboratories for ISP have been used. The composition of these media is given in Table I.

2 1421912 142191

Tabel ITable I

ISP-Vækstmedier.ISP-growth media.

55

Medium 1. Trypton/gærekstraktfermentationsvæske.Medium 1. Tryptone / yeast extract fermentation liquid.

Bacto-trypton (Difco) 5,0 gBacto Tryptone (Difco) 5.0 g

Bacto-gærekstrakt (Difco) 3,0 gBacto yeast extract (Difco) 3.0 g

Destilleret vand 1,0 liter 10 pH-værdien indstilles på 7,0 - 7,2 før autoklavering. 5 ml fermentationsvæske hældes i et reagensglas med en diameter på 20 mm eller mere.Distilled water 1.0 liter pH is adjusted to 7.0 - 7.2 before autoclaving. 5 ml of fermentation liquid is poured into a tube with a diameter of 20 mm or more.

Medium 2. Gærekstrakt/maltekstraktagar.Medium 2. Yeast extract / malt extract agar.

15 Bacto-gærekstrakt (Difco) 4,0 gBacto yeast extract (Difco) 4.0 g

Bacto-maltekstrakt (Difco) 10,0 gBacto malt extract (Difco) 10.0 g

Bacto-dextrose (Difco) 4,0 gBacto-dextrose (Difco) 4.0 g

Destilleret vand 1,0 liter 20 pH-værdien indstilles på 7,3, hvorefter der tilsættesDistilled water The pH of 1.0 liter is adjusted to 7.3 and then added

Bacto-agar 20,0 gBacto-agar 20.0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 25 15 - 20 minutter. Der hældes en tilstrækkelig mængde til at danne et skråsubstrat i mindst 6 reagensglas for hver kultur. Der steriliseres ved autoklavering, og reagensglassene afkøles henstillet i skrå stilling.The agar is liquefied by treatment with water vapor at 100 ° C for 15 to 20 minutes. A sufficient amount is poured to form an oblique substrate in at least 6 test tubes for each culture. It is sterilized by autoclaving and the tubes are cooled to an inclined position.

Sporsaltopløsningen, som anvendes i medierne 3, 4, 5 og 7, fremstilles af: 30The trace salt solution used in media 3, 4, 5 and 7 is prepared from: 30

FeS04.7H20 0,1 gFeSO4.7H2O 0.1 g

MnCl2.4H20 0,1 g0.1 g

ZnS04.7H20 0,1 gZnSO4.7H2O 0.1 g

Destilleret vand 100,0 ml 35 U2191 3Distilled water 100.0 ml 35 U2191 3

Medium 3. HavremelagarMedium 3. Oatmeal layers

Havremel 20 gOatmeal 20 g

Agar 18,0 g 5 20 g havremel koges eller behandles med vanddamp i 1000 ml destil leret vand i 20 minutter. Der filtreres gennem osteklæde. Der tilsættes destilleret vand, indtil rumfanget er 1000 ml. Der tilsættes 1,0 ml sporsaltopløsning.Agar 18.0 g 5 O g flour is boiled or treated with steam in 1000 ml distilled water for 20 minutes. Filter through cheese cloth. Distilled water is added until the volume is 1000 ml. 1.0 ml of trace salt solution is added.

10 pH-Værdien indstilles pa 7,2 med natriumhydroxid. Der tilsættes 18 g agar; agaren gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.The pH is adjusted to 7.2 with sodium hydroxide. 18 g of agar are added; agar is liquefied by treatment with steam at 100 ° C for 15-20 minutes.

Medium 4. Uorganiske salte/stivelsesagar.Medium 4. Inorganic salts / starch agar.

1515

En opløsning 1 fremstilles af 10,0 g opløseligt Difco stivelse. Der fremstilles en pasta af stivelsen i et lille rumfang koldt destilleret vand, og der tilsættes vand, indtil rumfanget er 500 Hil.A solution 1 is prepared from 10.0 g of soluble Difco starch. A paste of the starch is prepared in a small volume of cold distilled water and water is added until the volume is 500 HIL.

20 Opløsning 2 fremstilles af:Solution 2 is made of:

KgHPO^ (vandfrit) 1,0 gKgHPO ^ (anhydrous) 1.0 g

MgS04.7H20 1,0 gMgSO4.7H2O 1.0 g

NaCl 1,0 g 25 (NH4)2S04 2,0 gNaCl 1.0 g (NH 4) 2 SO 4 2.0 g

CaCOg 2,0 gCaCOg 2.0 g

Destilleret vand 500 mlDistilled water 500 ml

Sporsaltopløsning 1,0 ml 30 pH-værdien indstilles pi 7,0 - 7,4, hvis pH-værdien ikke allerede er inden for dette interval. Opløsningerne 1 og 2 blandes. Der tilsættesTrace salt solution 1.0 ml of pH is adjusted to 7.0 - 7.4 if the pH is not already within this range. The solutions 1 and 2 are mixed. There is added

Agar (Difco) 20,0 g 35 agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 - 20 minutter.Agar (Difco) 20.0 g The agar is liquefied by treatment with water vapor at 100 ° C for 15-20 minutes.

142191 4142191 4

Medium 5. Glycerol/asparaginagar, L-Asparagin (vandfrit) 1,0 gMedium 5. Glycerol / asparagine agar, L-Asparagine (anhydrous) 1.0 g

Glycerol 10,0 gGlycerol 10.0 g

KgHPO^ (vandfrit) 1,0 g 5 Destilleret vand 1,0 literKg HPO 4 (anhydrous) 1.0 g 5 Distilled water 1.0 liter

Spors altopløsning 1,0 ml pH-værdien indstilles på 7,0 - 7,4, hvis den ikke allerede er inden for dette område.Trace's total solution 1.0 ml pH is adjusted to 7.0 - 7.4 if it is not already in this range.

1010

Agar 20,0 gAgar 20.0 g

Agaren gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.The agar is liquefied by treatment with steam at 100 ° C for 15 - 20 minutes.

1515

Medium 6. Pep ton/gærekstrakt-jemagar.Medium 6. Pep ton / yeast extract jamagar.

Bacto-pepton jemagar, de-hydratiseret (Difco) 36,0 gBacto-peptone jemagar, dehydrated (Difco) 36.0 g

Bacto-gærekstrakt (Difco) 1,0 g 20 Destilleret vand 1,0 liter pH-værdien skal være 7,0 - 7,2 før autoklavering og indstilles om nødvendigt. Agaren gøres flydende ved behandling med vanddamp ved 100°C i 15 - 20 minutter.Bacto yeast extract (Difco) 1.0 g 20 Distilled water The 1.0 liter pH must be 7.0 - 7.2 before autoclaving and adjust if necessary. The agar is liquefied by treatment with water vapor at 100 ° C for 15 - 20 minutes.

2525

Medium 7. Tyrosinagar. ;Medium 7. Tyrosine agar. ;

Glycerol 15,0 g ' L-Tyrosin (Difco) 0,5 g ' L-asparagin (Difco) 1,0 g 30 K2HP04 (vandfrit) 0,5 gGlycerol 15.0 g of L-Tyrosine (Difco) 0.5 g of L-asparagine (Difco) 1.0 g of K2HPO4 (anhydrous) 0.5 g

MgS04.7H20 0,5 gMgSO4.7H2O 0.5 g

NaCl 0,5 gNaCl 0.5 g

FeS04.7H20 0,01 gFeSO4.7H2 O 0.01 g

Destilleret vand 1,0 liter 35 Sporsaltopløsning 1,0 ml i j i pH-værdien indstilles på 7,2 - 7,4. Der tilsættes i i Λ 0Distilled water 1.0 liter 35 Trace salt solution 1.0 ml in j in pH is adjusted to 7.2 - 7.4. Add in i Λ 0

-J-J

i Λ U2191 5i Λ U2191 5

Bacto-agar 20,0 g som gøres flydende ved behandling med damp ved 100°C i 15 - 20 minutter.Bacto-agar 20.0 g which is liquefied by treatment with steam at 100 ° C for 15-20 minutes.

55

Tomatpastaagar (Berger)Tomato pasta days (Berger)

Glucose 10,0 gGlucose 10.0 g

KgHPC^ 1,0 g 10 Tomatpasta 20,0 gKgHPC ^ 1.0 g 10 Tomato paste 20.0 g

Wilson's pepton 1,0 gWilson's peptone 1.0 g

CaCOg 2,0 gCaCOg 2.0 g

Agar 15,0 gAgar 15.0 g

Ledningsvand 1000,0 ml.Tap water 1000.0 ml.

1515

Der steriliseredes ved et tryk på 6,8 kg i 30 minutter, hvorefter pH-værdien indstilles på 6,9.Sterilized at a pressure of 6.8 kg for 30 minutes, after which the pH was adjusted to 6.9.

Karakteriseringen af farverne er taget fra følgende fire kilder: 20 ISCC-NBS U.S. Department of Commerce 1955, "The ISCC-NBS method of designating colors and a dictionary of color names",The characterization of the colors is taken from the following four sources: 20 ISCC-NBS U.S. Department of Commerce 1955, "The ISCC-NBS method of designing colors and a dictionary of color names",

National Bureau of Standards Circular 553, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.; Tresner, N.D. og E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomycete taxonomy," Appl.National Bureau of Standards Circular 553, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.; Tresner, N.D. and E.J. Backus, 1963, "System of color wheels for streptomycete taxonomy," Appl.

25 Microb., 11: 335 - 338; Eckerstrom, R. og C.E. Foss, 1958, Color Harmony Manual, 4. udgave, Container Corporation of America,Microb., 11: 335 - 338; Eckerstrom, R. and C.E. Foss, 1958, Color Harmony Manual, 4th Edition, Container Corporation of America,

Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Colour Codes for Exact Description of Colours of Streptomycetes", Z. Allg. Mikrobiologie, 4 (1): 95 - 98.Chicago, Illinois; H. Prauser, 1964. "Aptness and Application of Color Codes for Exact Description of Colors of Streptomycetes", Z. Allg. Microbiology, 4 (1): 95 - 98.

30 Vækst.30 Growth.

Kulturen danner på mange medier et veludviklet og forgrenet mycelium og et karakteristisk luftmycelium. Den submerse vækst er for-35 højet, hård og grov, og afhængigt af det anvendte næringsmedium fremtræder væksten farveløs, gul, gulbrun eller olivenbrun. Der er sortbrune pletter i randene af væksten på gær/maltekstraktagar (ISP-medium 2).The culture forms on many media a well-developed and branched mycelium and a characteristic air mycelium. The submerse growth is elevated, hard and coarse, and depending on the nutrient used, the growth appears colorless, yellow, tan or olive. There are blackish brown spots at the edges of the growth of yeast / malt extract agar (ISP medium 2).

6 1421916 142191

Luftmycelium og/eller en masse-sporefarve.Air mycelium and / or a mass spore color.

Luftmyceliet er moderat udviklet med fløjlsstruktur, og pigmentet er lyst gråhvidt (d), mellemgråt (2 fe) og gulgråt (2 dc) med en 5 svag hvid rand i tidlige vækststadier. Luftmassens farve er ifølge den af Tresner og Backus angivne "color wheel serie" Gy på ISP-me-dium 2 til W-gy på ISP-medierne 4 og 5. Der produceres koncentriske ringe, og koloniopdeling forekommer hyppigt. Farveegenskaberne medfører, at kulturen rubriceres i Gray-serien (Pridham). I tabel 10 II er der angivet en sammenligning af egenskaberne af Strepto- myces sp. X-5108 sammenlignet med andre medlemmer af Gray-serien.The aerial mycelium is moderately developed with velvet structure, and the pigment is light gray-white (d), medium-gray (2 fairy) and yellowish-gray (2 dc) with a 5 faint white border in early growth stages. The color of the air mass is according to the color wheel series Gy stated by Tresner and Backus Gy on ISP medium 2 to W-gy on ISP media 4 and 5. Concentric rings are produced and colony division occurs frequently. The color properties cause the culture to be classified in the Gray series (Pridham). Table 10 II gives a comparison of the properties of Streptomyces sp. X-5108 compared to other members of the Gray series.

142191 7 * $ ♦ •PH ft ρ,-ρ ΜΗ -P 0> ,142191 7 * $ ♦ • PH ft ρ, -ρ ΜΗ -P 0>,

10 0 0) 0 β S10 0 0) 0 β S

. H "ø d M Si £? + CO H +I + I + III+ + co øi il· d i o β H b 0 xi 2 •H H ra Cd §J ij S ti -P d ? ^ ^ £ & . HH + ί I I + I I I I + r · cd. H "ø d M Si £? + CO H + I + I + III + + co øi il · dio β H b 0 xi 2 • HH ra Cd §J ij S ti -P d? ^ ^ £ &. HH + ί II + IIII + r · cd

f>5 CO <Hf> 5 CO <H

ti ,ti,

£_, I I£ _, I I

C5 ° H 2 = 0) d 0 d H d <H d I 2 cd q d -P h d E7 H> 3 cd -p o Φ lio 2| é? + <3 o + + +IIIIII + a ωρί S «dø Φ CO H !sC5 ° H 2 = 0) d 0 d H d <H d I 2 cd q d -P h d E7 H> 3 cd -p o Φ lio 2 | é? + <3 o + + + IIIIII + a ωρί S «die Φ CO H! S

HH

Hl LHl L

φ o aφ o a

gø Hbark H

m cd o ø H to ? ® .m cd o island H two? ®.

d β d cd -P mdd β d cd -P md

♦c) ao ø N 0 HH♦ c) ao ø N 0 HH

§ · 3 § bo Si é? i o -P ++I1 + I + II + bO , β O I I "i§ · 3 § bo Si é? i o -P ++ I1 + I + II + bO, β O I I „i

O ØHO UH

CO 0 cq ø -P OCO 0 or ø -P O

Η O β d Η % βΗ O β d Η% β

HH pØPH -P OOHH pØPH -P OO

LA ΜΗ Øh 0 HØLA ΜΗ Eh 0 HI

Hl O H ca H<!!>j H d Η X *øøl hO 2 C5 I OH + + +I + IIII +Hl O H ca H <!!> j H d Η X * beer hO 2 C5 I OH + + + I + IIII +

3 COHHC3 COHHC

<ς ra ^<ς ra ^

eh ø ø Seh ø ø S

O d Η HO d Η H

{>J o I O{> J o I O

a h ^ band h ^ b

o -p oo So -p oo S

-P OH O-P OH O

Pt Η ΙΑ HPt Η ΙΑ H

0 PH β d Η -P ro0 PH β d Η -P ro

-P -P d ø O-P -P d ø O

W b() ff! ti + O + + + + +I + II +W b () ff! ti + O + + + + + I + II +

Η HΗ H

0 · <H0 · <H

» Mt“ -g"Mt" -g

g S Bg S B

ø o y ø & ω aø o y ø & ω a

M O OM O O

cd *P CO *P H Scd * P CO * P H S

d ft° ø ^ L ^ g bO d la bO K O + !*! · + + + + + + + + H + 0 -P I CO ><!d ft ° ø ^ L ^ g bO d la bO K O +! *! · + + + + + + + + H + 0 -P I CO> <!

HH

ø‘island'

hO IhO I

.S -S i ø 0 0.S -S in ø 0 0

3 c. 2 J3 π raøøwHH3 c. 2 J3 π raøøwHH

S 0 M 0 h ø η η o ω co o o o oS 0 M 0 h ø η η o ω co o o o o

Η H ØH bO Π d -P 0 H ØdOOd-P-P MΗ H ØH bO Π d -P 0 H ØdOOd-P-P M

H 0 d cd O dø o W pH ØWHd-PHHHdOH 0 d cd O die o W pH ØWHd-PHHHdO

d Μ β Η Η Η O Η Η P m °, θ 1 2 S 2 '3 o ø ra øcHOøddrQø o ØHøødHdooo a d ββΗ{>0ΗΗβ <° ° ^ b 5 ^ 5 w Ίd Μ β Η Η Η O Η Η P m °, θ 1 2 S 2 '3 o öra øcHOøddrQø o ØHøødHdooo a d ββΗ {> 0ΗΗβ <° ° ^ b 5 ^ 5 w Ί

1 0 oØddHO-PC β P^iiSfeffiSHHH1 0 oØddHO-PC β P ^ iiSfeffiSHHH

ø bO Q<i>OØØddro ø Η I I I I I I i ro roø bO Q <i> OØØdrro ø Η I I I I I I i ro ro

CO W WO g fri p, <| Π O ΟΗΗΗΗΠΗΗ C0OCO W WO g free p, <| Π O ΟΗΗΗΗΠΗΗ C0O

8 14219 18 14219 1

Til tabellen skal følgende bemærkes: De data, som ikke angår Strep-tomyces X-5108, er taget fra litteraturen. Sporernes overflade er bestemt i elektronmikroskop. RA betegner retinaculum-apertum.For the table, note the following: The data not related to Strep-tomyces X-5108 were taken from the literature. The surface of the spores is determined by electron microscope. RA denotes retinaculum apertum.

+ betegner, at der er vækst, og - betegner, at stoffet ikke udnyt-5 tes. Gy betegner "Gray"-serien.+ denotes growth, and - denotes that the substance is not utilized. Gy denotes the "Gray" series.

Morfologi.Morphology.

Sporekæderne, som produceres på luftmyceliet, udstrækker sig, 10 én- eller flerakset, danner lige kæder, løkker, kroge eller udstrakte og uregelmæssige spiraler med 3-4 omdrejninger og forekommer også i en kosteformet orden. Kæderne er såvel lange som korte men sædvanligvis med mere end 10 sporer. Hvileknolde er iagttaget på de fleste medier. Sporerne er oval-aflange og cylinderformede (phalangi-15 form, Tresner). Sporeoverfladen er glat uden ornamentering i henhold til bestemmelse med elektronmikroskop (tomatpastaagar, 10 døgn . ved 28°C).The spore chains produced on the aerial mycelium extend, 10 single or multiple axis, forming straight chains, loops, hooks or stretched and irregular spirals of 3-4 turns and also occur in a dietary order. The chains are both long and short but usually with more than 10 spores. Which tubers are observed on most media. The grooves are oval-oblong and cylindrical (phalangi-shaped, Tresner). The spore surface is smooth without ornamentation as determined by electron microscope (tomato paste agar, 10 days at 28 ° C).

Fysiologi.Physiology.

2020

Opløseligt pigment.Soluble pigment.

Der dannes spor af brunt pigment på gærekstrakt/maltekstraktagar (ISP-medium 2) men ikke på ISP-medierne 3, 4 og 5.Traces of brown pigment are formed on yeast extract / malt extract agar (ISP medium 2) but not on ISP media 3, 4 and 5.

2525

Bagsidefarve.Back Color.

Gul til gulbrun plus grøn farve dannes ved fra 7 til 21 dage på ISP-medieme 2, 4 og 5. Refererende til Dr. Prausers farvevejled-30 ning dannes følgende bagsidefarve på 7 dage: C 004b, Co 5m, med farveløse rande (medium 2) og Co 5a, Co 5b (medierne 4 og 5). En tilsætning af base eller syre ændrer ikke bagsidefarven. jYellow to amber plus green color are formed by from 7 to 21 days on ISP media 2, 4 and 5. Referring to Dr. Prauser's color guide produces the following 7-day backing color: C 004b, Co 5m, with colorless edges (medium 2) and Co 5a, Co 5b (media 4 and 5). Adding base or acid does not change the backing color. j

Forskellige fysiologiske reaktioner.Various physiological reactions.

3535

Kulturen er pigmentdannende (danner melanin) på pepton/jernagar, tyrosinagar samt på trypton/gærekstraktfermentationsvæske. En sam- j i i i 9 U2191 menfatning af visse af de kulturmæssige karakteristika for Strepto-myces sp. X-5108 er angivet i tabel III. Nitrat reduceres ikke i organisk nitratfermentations væske. Stivelse hydrolyseres aktivt, og gelatine forflydes i løbet af 14 døgn kun meget svagt. Nogle 5 yderligere fysiologiske reaktioner for Streptomyceten er angivet i tabel IV. Carbonkildeudnyttelse ifølge Pridham og Gottlieb (J. Bact., 56, 107 - 114, 1948) er følgende (11 døgn ved 28°C): god udnyttelse af 1-arabinose, d-fructose, d-mannitol, 1-rhamnose, d-raffinose og sucrose; dårlig udnyttelse af d-xylose og i-inositol og ingen ud-10 nyttelse af cellulose. Yderligere oplysninger om Strep tom ycetens udnyttelse af carbon- og nitrogenkilder er angivet i tabel V. Kulturerne vokser godt ved 24 og 37°C men ikke ved 42 eller 50°C.The culture is pigmented (forming melanin) on peptone / iron agar, tyrosine agar as well as on tryptone / yeast extract fermentation liquid. A comparison of some of the cultural characteristics of Strepto-myces sp. X-5108 is given in Table III. Nitrate is not reduced in organic nitrate fermentation liquid. Starch is actively hydrolyzed and gelatin flows only very weakly within 14 days. Some 5 additional physiological reactions for the Streptomycetene are listed in Table IV. Carbon source utilization according to Pridham and Gottlieb (J. Bact., 56, 107 - 114, 1948) is as follows (11 days at 28 ° C): good utilization of 1-arabinose, d-fructose, d-mannitol, 1-rhamnose, d raffinose and sucrose; poor utilization of d-xylose and i-inositol and no utilization of cellulose. Further information on Strep tom ycet utilization of carbon and nitrogen sources is given in Table V. The cultures grow well at 24 and 37 ° C but not at 42 or 50 ° C.

Tabel III 15Table III 15

Karakteristiske egenskaber af kulturen af Streptomyces sp. X-5108. Inkubation foretaget i 14 døgn ved 28°C.Characteristic properties of the culture of Streptomyces sp. X-5108th Incubation for 14 days at 28 ° C.

Fast medium Vækst Luftmycelium Opløseligt Underfarve 2q og/eller sporer pigmentSolid Medium Growth Aerial Mycelium Soluble Sub-color 2q and / or traces pigment

Czapek's hvidligt luftmyc.; svagt mør- svag gul saccharose- sporer, gode, kebrunt agar god hvide ΘCzapek's whitish airmyc .; slight dark yellow yellow sucrose spores, good, brownish agar good white Θ

Asparagin/- god luftmyc. dunet til intet orange til 25 dextrose- pulveragtigt, lys gul 0,25% hvidt, får sløret grå sporulationAsparagine / - good airmyc. down to nothing orange to 25 dextrose powdery, light yellow 0.25% white, blurred gray sporulation

Tomatpasta/- god luftmyc. hvidt intet orange peptonagar til lysegråt, spo rer gode, grå 30Tomato paste / - good airmyc. white no orange peptone agar for light gray, traces good, gray 30

Stivelsesagar god sporulation ξod, intet orangegul bliver røggra, hvide randeStarch agar good sporulation ξod, no orange yellow turns gray, white stripes

Krainsky's god luftmyc. hvidt; intet citrongul glucoseagar sporulation god, bliver røggrå 35Krainsky's good airmyc. white; no lemon yellow glucose agar sporulation good, turns gray 35

Mycophilagar god ingen sporulation svagt mørkt svag gul (BBL)Mycophilagar good no sporulation faint dark faint yellow (BBL)

Tabel III fortsat U2191 10 Gærekstrakt- god ingen sporulation mørkt grå til gulbrun næringsagarTable III continued U2191 10 Yeast extract good no sporulation dark gray to tan nutrient agar

Glycerolagar jævnt fugtigt, fløde- intet svag gul 5 god til farvet god (10 døgn)Glycerol agar evenly moist, cream - no pale yellow 5 good to colored good (10 days)

Kartoffel- god ingen sporulation sort stykker ^ Gulerods- god ingen sporulation -stykker Λ angiver, at der er god vækst i 8 døgn på dette medium ved temperaturerne 24, 28, 32 og 37°C, men ikke ved 42°C.Potato good no sporulation black pieces ^ Carrot good no sporulation pieces Λ indicate that there is good growth for 8 days on this medium at temperatures 24, 28, 32 and 37 ° C, but not at 42 ° C.

1515

Til tabellen skal følgende bemærkes: Mycelium er forkortet "myc.".For the table, note the following: Mycelium is abbreviated as "myc."

Der er også god vækst på de følgende medier: Tryptonfermentations-væske (mørkt opløseligt pigment, negativ indol 3 døgn). FDA-næ-ringsfermentationvæske, Czapek saecharose-fermentationsvæske, 20There is also good growth on the following media: Trypton fermentation fluid (dark soluble pigment, negative indole 3 days). FDA Nutrient Fermentation Fluid, Czapek sucrose fermentation fluid, 20

Krainsky glucose-fermentationsvæske og calciumcitrat/glycerolfermen-tationsvæske.Krainsky glucose fermentation fluid and calcium citrate / glycerol fermentation fluid.

Tabel IVTable IV

25 Fysiologiske reaktioner af Streptomyces sp. X-5108.25 Physiological responses of Streptomyces sp. X-5108th

Medium Inkuba- Vækst Fysiologisk reaktion tion i døgnMedium Incuba- Growth Physiological reaction in 24 hours

Organisk nitrat- 8 moderat, sporulerer ingen nitratreduk-30 fermentations- ikke tion, ingen luftvæske udviklingOrganic nitrate-8 moderate, no nitrate reduction-30 fermentation, no air-liquid development

Organisk nitrat- 13 god; mørk pigment ingen nitratreduk- fermentations- tion, ingen luftud- væske vikling 25 Gelatine (15%) 5 jævnt god; mørk, ingen gelatinesmeltning ved 18°C opløseligt pigmentOrganic nitrate 13 good; dark pigment no nitrate reduction fermentation, no aqueous liquid winding 25 Gelatin (15%) 5 evenly good; dark, no gelatin melting at 18 ° C soluble pigment

Gelatine (15%) 12 jævnt god til god svag smeltning ved 18°C vækst; brunt pig ment, ingen sporulation 11Gelatin (15%) 12 evenly to good weak melt at 18 ° C growth; brown pig ment, no sporulation 11

Tabel IV fortsat 142191Table IV continued 142191

Pepton/jemagar 14 god; meget svag pigmentdannende sporulation (danner melanin)Pepton / jemagar 14 good; very weak pigment-forming sporulation (forming melanin)

Lakmusmælk 6 jævnt god overfla- lakmusfarven uændret; 5 devækst ingen sammenløbning eller klaringLitmus milk 6 evenly good surface mouse color unchanged; 5 no growth or clearance

Lakmusmælk 13 jævnt svag overfla- farven svagt brun; devækst, ingen spo- ingen sammenløbning rulation eller uklarhed 1Q "Dorset" ægagar 3 god; svag hvid sporulation "Dorset" ægagar 10 meget god vækst; svagt mørk pigment· overvejende sporula-leret, lysegråLicorice milk 13 evenly pale surface color pale brown; dew growth, no spongy confluence rulation or turbulence 1Q "Dorset" egg agar 3 good; weak white sporulation "Dorset" egg agar 10 very good growth; slightly dark pigment · predominantly sporulated, light gray

15 Tabel VTable V

Carbon- og nitrogenkilder, som kan udnyttes af Streptomyces sp.Carbon and nitrogen sources that can be exploited by Streptomyces sp.

X-5108.X-5108th

^ Inkubation foretaget i 14 døgn ved en temperatur på 28°C.^ Incubation for 14 days at a temperature of 28 ° C.

0 00 0

Carbonkilde Udnyttelse Carbonkilde Udnyttelse 25 l-Arabinose 1 Acetat 3 1-Rhamnose 3 Citrat 2 d-Xylose 3 Malat 2 d-Mannitol 3 Oxalat 1 i-Inositol 3 Salicylat 0 30Carbon Source Utilization Carbon Source Utilization 25 l-Arabinose 1 Acetate 3 1-Rhamnose 3 Citrate 2 d-Xylose 3 Malate 2 d-Mannitol 3 Oxalate 1 i-Inositol 3 Salicylate 0 30

Glucose 3 Succinat 2Glucose 3 Succinate 2

Fructose 3 Tartrat 0Fructose 3 Tartrate 0

Saccharose 3 Phenol (0,1%) 0Sucrose 3 Phenol (0.1%) 0

Raffinose 3 Negativ kontrol 0Raffinose 3 Negative Control 0

Stivelse 0-1 (intet carbon)_ d-Ribose 3 Nitrogenkilde Udnyttelse^ d-Galactose 3 d-Mannose 3 (NH^SO^ 1Starch 0-1 (no carbon) _ d-Ribose 3 Nitrogen Source Utilization ^ d-Galactose 3 d-Mannose 3 (NH

Cellobiose 3 NaNOg 1 12 142191Cellobiose 3 NaNOg 1 12 142191

Tabel V fortsatTable V continued

Lactose 3 Na-nitrit 1Lactose 3 Na-nitrite 1

Maltose 3 Acetamid 1 5 Dextrin 0 Asparagin 3Maltose 3 Acetamide 1 5 Dextrin 0 Asparagine 3

Dulcitol 0 Tyrosin 3Dulcitol 0 Tyrosine 3

Erythritol 0 dl-Tryptophan 2Erythritol 0 dl-Tryptophan 2

Sorbitol 1 Negativ kontrol 0-1Sorbitol 1 Negative Control 0-1

Glycerol 0-1 (intet nitrogen) 10 _ ΘGlycerol 0-1 (no nitrogen) 10 _ Θ

Tallet 3 betegner god udnyttelse, tallet 2 betegner jævnt god udnyttelse, tallet 1 betegner dårlig udnyttelse, og tallet 0 betegner ingen udnyttelse.The number 3 denotes good utilization, the number 2 denotes even good utilization, the number 1 denotes poor utilization, and the number 0 denotes no exploitation.

1515

Til inokulering benyttes en sporesuspension i destilleret vand; sporerne er fremstillet i tomatagar på skråglas. Udnyttelsen af carbon- og nitrogenforbindelserne bestemmes på følgende grundmedium: 20 KH2P04 2,38 g MnCl2.4H20 0,0079 g K2HP04 5,65 g ZnS04.7H20 0,0015 gFor inoculation, a spore suspension is used in distilled water; the spores are made in tomato glass on oblique glass. The utilization of the carbon and nitrogen compounds is determined on the following basic medium: 20 KH2 PO4 2.38 g MnCl2.4H20 0.0079 g K2HPO0 5.65 g ZnSO4.7H20 0.0015 g

MgS04.7H20 1,00 g agar 15 g 25 CuS04.5H20 0,0064 g destilleret vand 1 literMgSO4.7H20 1.00 g agar 15 g 25 CuSO4.5H20 0.0064 g distilled water 1 liter

FeS04-7H20 0,0011 g mediet indstilles på en pH-værdi på 6,8 - 7,0.FeSO4-7H2O 0.0011 g of medium is adjusted to a pH of 6.8 - 7.0.

Til bestemmelse af carbonkilderne på dette grundmedium tilsættes 30 der 2,64 g (NH4)2S04 pr. liter som den fælles nitrogenkilde. Carbon-kilden, der skal undersøges, tilsættes i en koncentration på 1% med undtagelse af natriumsaltene af de organiske syrer, som tilsættes i en koncentration på 0,15%. Til undersøgelse af nitrogenkilderne anvendes grundmediet, som tilsættes 1% stivelse og nitrogenkilden i 35 en koncentration på 0,1 g nitrogen pr. liter.To determine the carbon sources of this basic medium, 2.64 g (NH 4) 2 SO liter as the common nitrogen source. The carbon source to be investigated is added at a concentration of 1% with the exception of the sodium salts of the organic acids which are added at a concentration of 0.15%. For the study of the nitrogen sources, the basic medium is used, which is added 1% starch and the nitrogen source at a concentration of 0.1 g nitrogen per liter. liter.

13 14219113 142191

Pi grundlag af sporernes ornamentering og generelle morfologi og forgreningerne af det sporebærende organ, farverne en masse på forskellige medier og visse biokemiske og fysiologiske reaktioner konkluderes det, at Streptomyces sp. X-5108 er forskellig fra en 5 hvilken som helst af kulturerne i den Gray-serie, som er beskrevet i litteraturen.Based on the ornamentation and general morphology of the spores and the branching of the spore-bearing organ, the colors en masse on various media and certain biochemical and physiological reactions, it is concluded that Streptomyces sp. X-5108 is different from any of the cultures of the Gray series described in the literature.

Dyrkning af organismen Streptomyces sp. X-5108 til dannelse af antibiotikum X-5108 kan udføres under anvendelse af et stort antal 10 fermentationsmetoder. Sædvanligvis kan den følgende grundlæggende metode anvendes ved fremstilling både i kolber og tanke. Ved fermentering i kolber sættes en trådøjefuld sporer fra en agarskrå-kultur til 100 ml næringsmedium i en 500 ml's Erlenmeyer-kolbe og inkuberes ved ca. 28°C i et roterende rysteapparat i indtil 7 døgn.Cultivation of the organism Streptomyces sp. X-5108 to Generate Antibiotic X-5108 can be performed using a large number of 10 fermentation methods. Usually, the following basic method can be used in manufacturing both in flasks and tanks. When fermented in flasks, a wire-eyed spore from an agar slant culture is added to 100 ml of nutrient medium in a 500 ml Erlenmeyer flask and incubated at ca. 28 ° C in a rotary shaker for up to 7 days.

15 Der udtages aseptisk prøver af hele fermentations væsken til in vitro undersøgelser det 3., 5. og 7. døgn. På tilsvarende måde fremstilles til fremstilling af større rumfang af fermentationsvæske først podekultur i 6 liters Erlenmeyer-rystekolber eller i 20 liters pyrexkolber, som er egnede til luftning, prøveudtagning osv. Denne fermentations væske 20 overføres derefter til en fermentationstank. Luftningen i kolberne og tankene udføres ved at presse steril luft gennem fermentations -mediet. I tankene foretages yderligere omrøring med mekaniske om-rørere. Der tilsættes skumdæmpningsmidler såsom lardolie, sojabønneolie og lignende efter behov til nedsættelse af skumdannelsen.Aseptic samples of the entire fermentation fluid are taken for in vitro studies on the 3rd, 5th and 7th day. Similarly, to make larger volumes of fermentation liquid, seed graft is first prepared in 6 liter Erlenmeyer shake flasks or in 20 liter pyrex flasks suitable for aeration, sampling, etc. This fermentation liquid 20 is then transferred to a fermentation tank. The aeration in the flasks and tanks is accomplished by pressing sterile air through the fermentation medium. In the tanks, further agitation is carried out with mechanical agitators. Anti-foaming agents such as lard oil, soybean oil and the like are added as needed to reduce foaming.

2525

Streptomyces sp. X-5108 kan dyrkes på et stort antal væskeformede kulturmedier. Medier, som er særlig anvendelige til fremstilling af det hidtil ukendte antibiotikum, indeholder en assimilerbar carbon-kilde såsom stivelse, glucose, melasse og lignende og en assimiler-30 bar nitrogenkilde såsom protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer, majsstøbevand og ammoniumsalte og uorganiske kationer og anioner såsom kalium, natrium, calcium, magnesium, sulfat, phos-phat, chlorid og lignende. Sporstoffer såsom cobolt, kobber, jern, molybdæn, bor og lignende forefindes som urenheder i andre af de 35 til mediet satte stoffer.Streptomyces sp. X-5108 can be grown on a large number of liquid culture media. Media particularly useful in the preparation of the novel antibiotic contain an assimilable carbon source such as starch, glucose, molasses and the like and an assimilable nitrogen source such as protein, protein hydrolyzate, polypeptides, amino acids, maize cast water and ammonium salts and inorganic cations. and anions such as potassium, sodium, calcium, magnesium, sulfate, phosphate, chloride and the like. Tracers such as cobalt, copper, iron, molybdenum, boron and the like are present as impurities in other substances added to the medium.

142191 14142191 14

Aktiviteten af antibiotikum X-5108 kan bestemmes in vitro ved dets inhiberingszone med den grampositive bakterie Bacillus E. ved den sædvanligvis anvendte "cup-plate"-agardiffusionsmetode, hvor prøven f.eks. kan anbringes i en beholder (eventuelt cylinderformet) 5 eller på et stykke væskeabsorberende materiale. Alternativt kan den grampositive bakterie Bacillus simplex anvendes. Bagge bakterierne giver en inhiberingszone på ca. 20 mm med en arbitrært defineret opløsning indeholdende 1 enhed pr. ml opløsning. Ved denne bestemmelse dyrkes en kultur af prøveorganismen på et næringsmedium, 10 f.eks. "Trypticase Soy Broth", i 24 til 42 timer ved 28°C i et roterende rysteapparat, idet der anvendes 100 ml medium pr. 500 ml's Erlenmeyer-kolbe. Der anvendes en inokulumkoncentration på 0,25 - 0,5% til inokulering af 4 ml podelag, som hældes oven på et forud hærdet 20 ml basislag af næringsagar på en 100 ml's Petri-skål af 15 glas eller éngangsplastic. Pladerne køles i mindst 2 timer, inden der anbringes de ovenfor angivne beholdere, som derefter fyldes med prøveopløsningen indeholdende antibiotikum. Pladerne inkuberes derefter ved 35°C i 18 timer, og zonediametrene måles derefter med en nøjagtighed på 0,5 mm. Bestemmelse af aktiviteten 20 i enheder pr. ml foretages derefter ved hjælp af en standardkurve.The activity of antibiotic X-5108 can be determined in vitro at its zone of inhibition with the gram-positive bacterium Bacillus E. by the commonly used "cup-plate" agar diffusion method. may be placed in a container (optionally cylindrical) 5 or on a piece of liquid absorbing material. Alternatively, the gram-positive bacterium Bacillus simplex can be used. The bagging bacteria provide an inhibition zone of approx. 20 mm with an arbitrarily defined solution containing 1 unit per unit. ml of solution. By this assay, a culture is grown by the sample organism on a nutrient medium, e.g. Trypticase Soy Broth, for 24 to 42 hours at 28 ° C in a rotary shaker, using 100 ml of medium per ml. 500 ml Erlenmeyer flask. An inoculum concentration of 0.25 - 0.5% is used to inoculate 4 ml of seed layers which are poured on top of a pre-cured 20 ml base layer of nutrient agar on a 100 ml Petri dish of 15 glass or disposable plastic. The plates are refrigerated for at least 2 hours before placing the containers listed above, which are then filled with the sample solution containing antibiotic. The plates are then incubated at 35 ° C for 18 hours and the zone diameters are then measured to an accuracy of 0.5 mm. Determination of activity 20 in units per unit. ml is then made using a standard curve.

Eksempler på de fortrinsvis anvendte medier og de fremkomne antibiotikumudbytter i kolber og i fermentationstanke med luftning er angivet i tabellerne VI - IX. Af de i disse tabeller angivne data 25 vil det ses, at complexe nitrogenforbindelser fra adskillige kilder, f.eks. plantematerialer såsom sojabønnemel, bomuldsfrømel, havre-mel, fast tomatpresserest, opløsninger fra fermentering af korn, animalske produkter såsom fiskemel, digereret kødmel og aminosyre-hydrolysat samt mikrobe celler såsom Torula-gær, vil medføre anti-30 biotikaproduktion.Examples of the preferred media used and the resulting antibiotic yields in flasks and in aeration fermentation tanks are given in Tables VI - IX. From the data 25 given in these tables, it will be seen that complex nitrogen compounds from several sources, e.g. plant materials such as soybean meal, cotton seed meal, oatmeal, solid tomato squeeze residue, grain fermentation solutions, animal products such as fish meal, digested meat meal and amino acid hydrolyzate as well as microbial cells such as Torula yeast will lead to antibiotic production.

Tabel VITable VI

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum-35 produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.The effect obtained by variation of the nutrient medium on antibiotic production of Streptomyces sp. X-5108 in shake flasks.

15 14219115 142191

Alle medierne indeholder 1% dextrin, 0,1% K^HPO^ og 0,1% CaCO^.All media contains 1% dextrin, 0.1% K 2 HPO 2 and 0.1% CaCO 2.

Der inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium. Alle nitrogenkilderne tilsættes i en koncentration på 1% undtagen i forsøgene 17 og 23, hvor der anvendes 2%.1 ml of spore suspension of Streptomyces sp. X-5108 to each 100 ml medium. All the nitrogen sources are added at a concentration of 1% except in experiments 17 and 23, where 2% is used.

5 Den antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enheder pr. ml.5 Antibiotic activity is indicated in B. simplex units per ml.

Forsøg Nitrogenkilde Tid i døgn Enheder pr. ml 10 1 Digereret kødmel 6 50 2 BY-100 (Commercial SolventsExperiment Nitrogen Source Time of day Units per day. ml 10 1 Digitized Meat Flour 6 50 2 BY-100 (Commercial Solvents

Corp.) 5 45 3 Proflo (affedtet bomuldsfrøprodukt fra Traders Oil Mill 15 Co., Forth Worth, Texas) 5 23 4 Havremel (Quaker Oats Co.) 5 32 5 Affedtet sojabønnemel (soja- lose) 5 30 8 Jordnøddeproteinmel 5 41 20 9 Kokosnøddeproteinmel 5 50 10 Tomatpresserest, fast 5 57 11 Hørfrøoliemel 5 37 12 Majsmel 5 33 13 "Corn distiller's dried grain 25 with solubles" (H. Walker) 5 74 14 "Soludri" (Schenley Destillers) 5 51 15 Fiskemel (Gorton's) 5 25 16 Fiskerester (Wilkinson) 5 16 17 Lactose/albumin-blanding 5 50 30 19 Tørret Torula-gaer 5 38 20 Gærautolysat (National) 5 16 21 Sojaenzymhydrolysat 5 33 22 Hvedeprotein, surt hydrolysat (Huron Mills) 5 12 35 23 Homogeniseret kondenseret fisk 5 27 24 "Pro topep ton nr. 366" (WilsonCorp.) 5 45 3 Proflo (degreased cotton seed product from Traders Oil Mill 15 Co., Forth Worth, Texas) 5 23 4 Oatmeal (Quaker Oats Co.) 5 32 5 Defatted soybean meal (soybean) 5 30 8 Peanut protein flour 5 41 20 9 Coconut protein flour 5 50 10 Tomato squeeze residue, solid 5 57 11 Flax seed oil 5 37 12 Corn flour 5 33 13 "Corn distiller's dried grain 25 with solubles" (H. Walker) 5 74 14 "Soludri" (Schenley Distillers) 5 51 15 Fish flour (Gorton's) 5 25 16 Fish residues (Wilkinson) 5 16 17 Lactose / albumin mixture 5 50 30 19 Dried Torula yeast 5 38 20 Yeast autolysate (National) 5 16 21 Soy enzyme hydrolyzate 5 33 22 Wheat protein, acid hydrolyzate (Huron Mills) 5 12 35 23 Homogenized condensed fish 5 27 24 "Pro topep ton # 366" (Wilson

Labs.) 5 18 25 Tørret majsstøbevand 5 26Labs.) 5 18 25 Dried corn mold water 5 26

Tabel VIITable VII

16 14219116 142191

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikum-produktion af Streptomyces sp. X-5108 i rystekolber.The effect obtained by variation of the nutrient medium on antibiotic production of Streptomyces sp. X-5108 in shake flasks.

55

Hvert medium indeholder 0,1% KgHPO^ og 0,1% CaCOg, med mindre andet angives. Der inokuleres 1 ml sporesuspension af Streptomyces sp. X-5108 til hver 100 ml medium. Den antibiotiske aktivitet angives i B. simplex-enheder pr. ml.Each medium contains 0.1% KgHPO ^ and 0.1% CaCOg unless otherwise indicated. 1 ml of spore suspension of Streptomyces sp. X-5108 to each 100 ml medium. Antibiotic activity is indicated in B. simplex units per ml.

1010

Forsøg Mediets sammensætning tid i enheder døgn pr. ml 1 1% digereret kødmel og 1% dextrin 4 40 15 2 1% kornremanens fra fermentering (BY-100) og 1% dextrin 4 67 3 1% affedtet bomuldsfrømel (Proflo) og 1% dextrin 4 52 4 1% fiskerester 4 40 20 5 1% kom "corn distiller's dried grains with solubles" (H. Walker) og 1% dextrin 6 138 6 som forsøg 3, men uden CaCOg 4 19 7 som forsøg 3, men uden CaCOg og 25 K2HP04 . 4 34 8 som forsøg 7, men med 0,25% Proflo 4 12 9 som forsøg 7, men med 2,0% Proflo 4 47 10 1% Proflo og 1% glucose 6 21 11 1% Proflo og 1% stivelse 6 21 30 12 1% Proflo og 1% glycerol 4 35 13 1% Proflo og 1% puddersukker 4 14 14 1% Proflo og 1% maltose 4 22 15 1% Proflo og 1% lactose 4 26 16 1% Proflo og 1% mannitol 6 25 35Experiment The composition of the media time in units per day. ml 1 1% digested meal and 1% dextrin 4 40 15 2 1% fermentation grain residue (BY-100) and 1% dextrin 4 67 3 1% degreased cotton flour (Proflo) and 1% dextrin 4 52 4 1% fish residues 4 40 20 5 1% came "corn distiller's dried grains with solubles" (H. Walker) and 1% dextrin 6 138 6 as Experiment 3, but without CaCOg 4 19 7 as Experiment 3, but without CaCOg and 25 K2HPO4. 4 34 8 as trial 7 but with 0.25% Proflo 4 12 9 as trial 7 but with 2.0% Proflo 4 47 10 1% Proflo and 1% glucose 6 21 11 1% Proflo and 1% starch 6 21 30 12 1% Proflo and 1% glycerol 4 35 13 1% Proflo and 1% powdered sugar 4 14 14 1% Proflo and 1% maltose 4 22 15 1% Proflo and 1% lactose 4 26 16 1% Proflo and 1% mannitol 6 25 35

Tabel VIIITable VIII

17 14219117 142191

Den ved variation af næringsmediet opnåede effekt på antibiotikumproduktion af Streptomyces X-5108 i rystekolber eller tanke med gen-5 nemluftning. Hvert medium indeholder 0,5% CaCOg og 0,1% KgHPO^, med mindre andet er angivet. Udbyttet af antibiotikum er angivet i B.simplex enheder pr. ml. Alle forsøgene i tank er udført to gange bortset fra nr. 7, som er udført én gang. Alle forsøg i kolber varede 7 døgn, og alle forsøg i tanke varede 6 døgn, idet dog nr. 7 10 varede 4 døgn.The effect of variation of the nutrient medium on antibiotic production of Streptomyces X-5108 in shake flasks or tanks with permeate aeration. Each medium contains 0.5% CaCOg and 0.1% KgHPO4, unless otherwise indicated. The yield of antibiotic is indicated in B.simplex units per ml. All of the tank tests were performed twice except for # 7, which was performed once. All experiments in flasks lasted 7 days, and all experiments in tanks lasted 6 days, however, No. 7 10 lasted 4 days.

Nr. Mediets sammensætning i procent Udbytte, enheder/ml 15 Tomat- "Distiller's Majs- Glucose Kolber Tanke presse solubles" stirest, velse fast 1 1 1 1 0,5 150 100, 120 20 2 2 0 1 0,5 100 71, 46 3 0 2 1 0,5 91 88, 119 4 1 1 1,5 0 140 150, 124 51 1 0 1,5 180 125, 126 6 1 1 0 0 54 ikke udført 25 Proflo Stivelse CaCOg KgHPO^ 71 1 0,1 0,1 94 97No. Composition of the media as a percentage Yield, units / ml 15 Tomato "Distiller's Corn Glucose Flasher Tanks squeeze solubles" stir, firm 1 1 1 1 0.5 150 100, 120 20 2 2 0 1 0.5 100 71, 46 3 0 2 1 0.5 91 88, 119 4 1 1 1.5 0 140 150, 124 51 1 0 1.5 180 125, 126 6 1 1 0 0 54 not performed 25 Proflo Starch CaCOg KgHPO ^ 71 1 0.1 0.1 94 97

Tabel IX 30Table IX 30

Fermentationer i tanke med forskellige medier.Fermentations in tanks with different media.

Fermentor Mediets sammensætning Tid i Aktivitet i enhe- døgn der pr. ml 35 _____ K12 1% "Distiller's dried solubles", 1% 6 67 dextrin 0,1% KgHPO^ og 0,1%Composition of the Fermentor Media Time in Activity in Units per day. ml 35 _____ K12 1% "Distiller's dried solubles", 1% 6 67 dextrin 0.1% Kg HPO 3 and 0.1%

CaCOgCaCOg

Tabel IX fortsat 18 142191 K13 1% Na-l-glutamat, 1% dextrin, 0,1% 5 100 majsstøbevand-faststof, 0,15% 5 K2HP04 og 0,05% MgS04Table IX Continued 18 142191 K13 1% Na-1-glutamate, 1% dextrin, 0.1% 5 100 maize cast water solids, 0.15% 5 K2HPO4 and 0.05% MgSO4

Kil 1% Tomatpresserest, fast, 1% "Distil- 7 200 ler's dried solubles", 1% majsstivelse, 0,5% glucose, 0,5% CaCOg og 0,1% Κ2ΗΡ04 10 K4 0,5% Proflo, 0,5% "Distiller's dried 4 91 solubles", 0,5% tomatpresserest, fast 0,5% kødekstraktpasta (protopeptone No. 366), 1% stivelse, 0,1% CaCOg og 0,1% k2hpo4 15 K16 1,0% Proflo, 0,5% majsstøbevand, 4 260 1,0% majsstivelse, 0,1% CaCOg og 0,1% k2hpo4 20 Fermentorerne Kil, K12 og K13 er af rustfrit stål med rumfanget 400 liter, som sædvanligvis fyldes med 260 liter medium. K16 er en rustfri stålfermentor på 3000 liter, som fyldes med 2000 liter medium, og K4 er en rustfri stålfermentor på 16800 liter, som fyldes med 12800 liter medium.Kilo 1% Tomato Press Residue, Solid, 1% "Distilled 7,200 ler's dried solubles", 1% corn starch, 0.5% glucose, 0.5% CaCOg and 0.1% ΗΡ2ΗΡ04 10 K4 0.5% Proflo, 0, 5% "Distiller's dried 4 91 solubles", 0.5% tomato squeeze residue, solid 0.5% meat extract paste (protopeptone No. 366), 1% starch, 0.1% CaCOg and 0.1% k2hpo4 K16 1.0% Proflo, 0.5% corn cast water, 4 260 1.0% corn starch, 0.1% CaCOg and 0.1% k2hpo4 20 The fermentors Kil, K12 and K13 are of stainless steel with a volume of 400 liters, usually filled with 260 liters of medium . K16 is a 3000 liter stainless steel fermenter loaded with 2000 liters of medium and K4 is a 16800 liter stainless steel fermenter loaded with 12800 liters of medium.

2525

Et stort antal carbonkilder medfører god vækst og antibiotikumproduktion, f.eks. glucose, glycerol, dextrin og majsstivelse. Foruden de uorganiske salte, som forefindes i naturlige medier, kan en tilsætning af salte såsom kaliumphosphat, calciumcarbonat, magnesiumsulfat 30 og sporstoffer undertiden give forøget vækst og antibiotikumudbytte, afhængigt af de stoffer, som findes i grundmediet. Et af de foretrukne medier til fremstilling af antibiotikum X-5108 i store fermentorer indeholder 1% affedtet bomuldsfrømel, 1% majsstivelse, 0,5% koncentreret majsstøbevand, 0,1% K2HP04 og 0,1% calciumcarbonat.A large number of carbon sources lead to good growth and antibiotic production, e.g. glucose, glycerol, dextrin and corn starch. In addition to the inorganic salts found in natural media, an addition of salts such as potassium phosphate, calcium carbonate, magnesium sulfate 30 and trace elements can sometimes produce increased growth and antibiotic yield, depending on the substances contained in the basic medium. One of the preferred media for the preparation of antibiotic X-5108 in large fermenters contains 1% defatted cotton flour, 1% corn starch, 0.5% concentrated maize cast water, 0.1% K2 HPO4 and 0.1% calcium carbonate.

35 19 14219135 19 142191

Streptomyces X-5108 vokser også godt og producerer antibiotikum på nogle kemiske definerede syntetiske medier indeholdende ammoniumsalte, nitrat eller aminosyrer såsom glutamat, arginin og glycin som nitrogenkilde sammen med glucose, dextrin, stivelse, citrat, 5 acetat og lignende som carbonkilde tilsat salte såsom kaliumphosphat, calciumcarbonat og magnesiumsulfat og sporstoffer såsom Fe , Cu ,Streptomyces X-5108 also grows well and produces antibiotic on some chemically defined synthetic media containing ammonium salts, nitrates or amino acids such as glutamate, arginine and glycine as nitrogen source together with glucose, dextrin, starch, citrate, acetate and the like as carbon source added salts such as potassium phosphate calcium carbonate and magnesium sulfate and trace elements such as Fe, Cu,

Mn++, Co++ og Zn++. Resultatet af fermentering af Strep tomyces sp. X-5108 på forskellige syntetiske medier er angivet i tabel X. Sædvanligvis er antibiotikumudbyttet på de syntetiske medier, der 10 er angivet i tabel X, ikke så stort som ved anvendelse af complexe nitrogenmedier.Mn ++, Co ++ and Zn ++. The result of fermentation of Strep tomyces sp. X-5108 on various synthetic media is listed in Table X. Usually, the antibiotic yield on the synthetic media listed in Table X is not as great as using complex nitrogen media.

Tabel XTable X

15 Antibiotikumproduktionen af Strep tomyces X-5108 på syntetiske medier.15 Antibiotic Production of Strep tomyces X-5108 on Synthetic Media.

Mediets sammensætning Tid i døgn Antibiotisk ak tivitet i enheder pr. ml 20 _____ 1,0% Na-glutamat, 1% dextrin, 0,1% K2HP04 og 0,05% MgS04 5 7,6 1,0% aminosyreblanding, 1% dextrin, 25 0,1% K2HP04 og 0,1% USP salte nr. 1 5 11,5 BBL Czapek-Dox fermentations væske 5 4,4 1,0% Arginin, 1,0% dextrin, 0,1% K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,05% MgS04 6 0,8 1,0% dl-Aspartinsyre, 1,0% dextrin, 0,1% 30 K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,05% MgS04 6 0,8 0,1% Na-glutamat, 0,6% (NH4)2HP04, 1% glucose, 1% dextrin, 0,1% Κ2ΗΡ04, 0,1%Composition of the medium Time of day Antibiotic activity in units per day. ml 20 _____ 1.0% Na-glutamate, 1% dextrin, 0.1% K2HPO4 and 0.05% MgSO4 7.6 7.6% amino acid mixture, 1% dextrin, 0.1% K2HPO4 and 0.1% % USP salts # 1 5 11.5 BBL Czapek-Dox fermentation liquid 4.4 4.4% Arginine, 1.0% Dextrin, 0.1% K2HPO4, 0.1% CaCOg and 0.05% MgSO4 6 0.8 1.0% dl-Aspartic acid, 1.0% dextrin, 0.1% K2HPO4, 0.1% CaCOg and 0.05% MgSO4 6 0.8 0.1% Na-glutamate, 0.6 % (NH4) 2HPO4, 1% glucose, 1% dextrin, 0.1% ΗΡ2ΗΡ04, 0.1%

CaCOg, 0,1% KC1 og 0,05% MgS04 5 6,6 0,33% (NH4)2S04, 1,5% glucose, 0,1% 35 Na-citrat, 0,05% Na-acetat, 0,5% NaCl, 0,025% MgS04.7H20, 0,01% KgHPO^ 0,01% KH2P04, 0,3% CaCOg, 0,001%CaCOg, 0.1% KCl and 0.05% MgSO4 6.6 6.6 0.33% (NH4) 2 SO4, 1.5% glucose, 0.1% Na citrate, 0.05% Na acetate, 0 , 5% NaCl, 0.025% MgSO4.7H2O, 0.01% KgHPOPO 0.01% KH2PO4, 0.3% CaCOg, 0.001%

Tabel X fortsat 20 142191Table X continued 20 142191

MnS04.4H„0, 0,004% ZnSC>4.7H20 og 1,6 x 10-¾ K2Cr20? 7 20 5MnSO4.4H2.0, 0.004% ZnSC> 4.7H2O and 1.6 x 10-¾ K2Cr2O? 7 20 5

Aminosyreblandingen er Staley's Sta-Mino B. BBL Czapek-Dox-fermen-tationsvæske indeholder 3% saccharose, 0,3% NaNO^, 0,1% K2HP04, 0,05% MgS04, 0,05% KC1 og 0,001% FeSC>4, og forhandles af Baltimore 10 Biological Laboratories.The amino acid mixture is Staley's Sta-Mino B. BBL Czapek-Dox fermentation fluid contains 3% sucrose, 0.3% NaNO4, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4, 0.05% KCl and 0.001% FeSC> 4, and negotiated by Baltimore 10 Biological Laboratories.

Dannelsen af antibiotikum X-5108 forøges ved kraftig luftning af fermentationsmediet. Fremstillingen af antibiotikum X-5108 kan udføres ved en hvilken som helst temperatur, som medfører tilfredsstillende vækst 15 af mikroorganismen. F.eks. dyrkes Streptomyces X-5108 i rystekolber, som inkuberes ved temperaturerne 24, 28 , 30 og 32°C. Antibiotikumstyrkebestemmelser efter 3, 4, 5 og 6 døgn viser, at der kan fås samme maksimale udbytte ved en hvilken som helst temperatur mellem 24 og 32°C. Imidlertid fremkommer topudbyttet ved 3-4 døgn ved 20 30 og 32°C, hvorimod det tager 4 døgn ved 28°C og 5 - 6 døgn ved 24°C. Sædvanligvis opnås optimal dannelse af antibiotikum X-5108 efter 2-10 døgn. Fermentationsmediet forbliver sædvanligvis ret nær ved neutral reaktion eller på den sure side under fermentationen. Den endelige pH-værdi afhænger dels af den mængde puffer 25 der er til stede og dels af den oprindelige pH-værdi af mediet, som sædvanligvis er tæt ved neutral før steriliseringen.The formation of antibiotic X-5108 is enhanced by vigorous aeration of the fermentation medium. The preparation of antibiotic X-5108 can be carried out at any temperature which results in satisfactory growth of the microorganism. Eg. Streptomyces X-5108 is grown in shake flasks which are incubated at temperatures 24, 28, 30 and 32 ° C. Antibiotic strength determinations after 3, 4, 5 and 6 days show that the same maximum yield can be obtained at any temperature between 24 and 32 ° C. However, the peak yield occurs at 3-4 days at 30 and 32 ° C, whereas it takes 4 days at 28 ° C and 5-6 days at 24 ° C. Usually, optimal formation of antibiotic X-5108 is achieved after 2-10 days. The fermentation medium usually stays fairly close to neutral reaction or on the acidic side during the fermentation. The final pH value depends partly on the amount of buffer 25 present and partly on the initial pH of the medium, which is usually close to neutral prior to sterilization.

Efter afslutning af fermentationen kan der anvendes forskellige metoder til isolering og rensning af antibiotikum X-5108. Anvendelige 30 isolerings- og rensningsmetoder indbefatter ekstraktion med opløsningsmiddel såsom chargevis ekstraktion eller anvendelse af kontinuerligt virkende modstrøms væske/væske-ekstraktionskolonner og gelpermeationschromatografi i et ikke-vandigt system.After completion of the fermentation, various methods can be used to isolate and purify antibiotic X-5108. Applicable isolation and purification methods include solvent extraction such as batch extraction or the use of continuously acting countercurrent liquid / liquid extraction columns and gel permeation chromatography in a non-aqueous system.

35 21 14219135 21 142191

Ved en foretrukken arbejdsmåde udvindes antibiotikum X-5108 fra kulturmediet ved adskillelse fra myceliet og eventuelle uopløste bestanddele fra fermentationsvæsken ved sædvanlige metoder såsom filtrering eller centrifugering. Antibiotikum X-5108 ekstraheres der-5 efter fra den filtrerede eller centrifugerede fermentationsvæske un der anvendelse af enten chargevis ekstraktion eller modstrømsfordelingsekstraktion. Ekstraktionen med opløsningsmiddel kan udføres under anvendelse af en pH-værdi fra ca. 3 til ca. 7,5 o g under anvendelse af sådanne opløsningsmidler som ikke-vandblandbare 10 estere såsom ethylacetat, amylacetat, butylacetat og lignende ali- phatiske estere; butylacetat foretrækkes. Et foretrukket opløsningsmiddelsystem til anvendelse ved rensning ved modstrømsfordelings-teknikken er en blanding af ethylacetat, isopropanol og 0,1M vandig sek.natriumphosphatopløsning.In a preferred mode of action, antibiotic X-5108 is recovered from the culture medium by separation from the mycelium and any undissolved constituents from the fermentation liquid by conventional methods such as filtration or centrifugation. Antibiotic X-5108 is then extracted from the filtered or centrifuged fermentation fluid using either batch-wise extraction or countercurrent distribution extraction. The solvent extraction can be carried out using a pH value of approx. 3 to approx. 7.5 µg using such solvents as non-water miscible esters such as ethyl acetate, amyl acetate, butyl acetate and similar aliphatic esters; butyl acetate is preferred. A preferred solvent system for use in purification by the countercurrent distribution technique is a mixture of ethyl acetate, isopropanol and 0.1M aqueous sec sodium sodium phosphate solution.

1515

Den endelige rensning af antibiotikum X-5108 kan udføres ved gelper-meationschromatografi. Denne rensningsteknik udføres ved adsorption af forud rensede prøver af antibiotikum, hvilken forudgående rensning f.eks. er udført ved ekstraktion med opløsningsmiddel, 20 på tværbundne eller polymeriserede dextrangeler. Ved en foretrukken måde til endelig rensning chromatograferes det forud rensede antibiotikum på Sephadex LH-20, idet der elueres med alkohol.The final purification of antibiotic X-5108 can be performed by gel permeation chromatography. This purification technique is carried out by adsorption of pre-purified samples of antibiotic. is performed by solvent extraction, 20 on crosslinked or polymerized dextrangels. In a preferred method of final purification, the pre-purified antibiotic is chromatographed on Sephadex LH-20, eluting with alcohol.

Efter filtrering eller centrifugering af fermentationsmediet kan an-25 vendes tyndtlags- eller papirchromatografi til analyse til bestemmelse af antibiotikum X-5108. På grund af antibiotikets farveegenskaber kan til synliggørelse af pletterne anvendes fluorescensindikatorme-toden, og yderligere kan med fordel anvendes bioautografi. Chroma-tograferingen kan udføres på papir, men udføres dog sædvanligvis 30 på silicagel-glasplader. Det til udførelsen af tyndtlagschromatografe-ringen anvendte opløsningssystem består af chloroform, methanol og vandigt ammoniumhydroxid.After filtration or centrifugation of the fermentation medium, thin layer or paper chromatography can be used for analysis to determine antibiotic X-5108. Due to the color properties of the antibiotic, the fluorescence indicator method can be used to make the spots visible, and bioautography can further be advantageously used. The chroma train engraving can be carried out on paper, but is usually performed on silica gel glass sheets. The solution system used to carry out the thin layer chromatography consists of chloroform, methanol and aqueous ammonium hydroxide.

Det hidtil ukendte antibiotikum X-5108 foreligger efter rensning 35 som et gult amorft stof. Der kan fremstilles kationiske salte af anti-biotiket under anvendelse af antibiotikum X-5108 og en farmaceutisk tolerabel uorganisk eller organisk base. Blandt de salte af antibiotikum X-5108, som kan fremstilles, kan nævnes alkalimetalsalte så- 142191 22 som natrium- og kaliumsalte og· jordalkalimetalsalte såsom calciumsaltet.The novel antibiotic X-5108 is present after purification 35 as a yellow amorphous substance. Cationic salts of the antibiotic can be prepared using antibiotic X-5108 and a pharmaceutically tolerable inorganic or organic base. Among the salts of antibiotic X-5108 which can be prepared are mentioned alkali metal salts such as sodium and potassium salts and alkaline earth metal salts such as the calcium salt.

Disse salte kan f.eks. fremstilles under anvendelse af vandige opløs-5 ninger af alkalimetal- og jordalkalimetalhydroxider. Således danner opløsningen af antibiotikum X-5108 i vandigt natriumhydroxid, vandigt kaliumhydroxid eller vandigt calciumhydroxid natrium-, kaliumeller calciumsalt. Disse salte kan anvendes til de samme biologiske formål som antibiotiket. Da opløsninger af salte af antibiotikum ΧΙΟ 5108, især natriumsaltet, er betydelig mere stabile end opløsninger af antibiotiket i ikke-saltform, foretrækkes det at anvende svagt basiske puffere til rensning ved modstrømsfordeling og ammoniakal-ske opløsningsmiddelblandinger til tyndtlagschromatografi, hvilket formindsker koncentrationen af antibiotikum i opløsningen.These salts may e.g. are prepared using aqueous solutions of alkali metal and alkaline earth metal hydroxides. Thus, the solution of antibiotic X-5108 in aqueous sodium hydroxide, aqueous potassium hydroxide or aqueous calcium hydroxide forms sodium, potassium or calcium salt. These salts can be used for the same biological purposes as the antibiotic. Since solutions of antibiotic salts ΧΙΟ 5108, especially the sodium salt, are significantly more stable than solutions of the antibiotic in non-salt form, it is preferable to use weakly basic buffers for purification by countercurrent distribution and ammonia-solvent mixtures for thin layer chromatography, solution.

1515

Antibiotiket indeholder grundstofferne carbon, hydrogen, oxygen og nitrogen i i det væsentlige de nedenfor angivne vægtprocentmængder .The antibiotic contains the elements carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen in essentially the weight percentages given below.

2020

Grundstof Antibiotikum X-5108 Natriumsalt deraf C 63,63 61,48 H 7,81 7,81 25 N 3,48 3,32 O (taget som differens) 25,08 24,45Elemental Antibiotic X-5108 Sodium Salt thereof C 63.63 61.48 H 7.81 7.81 25 N 3.48 3.32 O (taken as difference) 25.08 24.45

Na - 2,94Na - 2.94

Antibiotikum X-5108 er opløseligt i alkoholer, f.eks. methanol, ethanol, 30 1- og 2-propanol og tert.butylalkohol, ikke-vandblandbare estere, f.eks. ethylacetat, amylacetat, bu tylacetat og lignende aliphatiske estere, samt chloroform. Antibiotiket er uopløseligt i vand. Natriumsaltet af antibiotikum X-5108 er opløseligt i vand, lavere alkoholer såsom methanol, ethanol, isopropanol, butanol og Ν,Ν-dimethylfor-35 mamid. Det er tungtopløseligt i amylalkohol, tetrahydrofuran og dioxan og meget tungtopløseligt i acetone, amylacetat, butylacetat og ethylacetat. Det er uopløseligt i benzen, chloroform og ethylether.Antibiotic X-5108 is soluble in alcohols, e.g. methanol, ethanol, 1- and 2-propanol and tert-butyl alcohol, non-water miscible esters, e.g. ethyl acetate, amyl acetate, butyl acetate and similar aliphatic esters, as well as chloroform. The antibiotic is insoluble in water. The sodium salt of antibiotic X-5108 is soluble in water, lower alcohols such as methanol, ethanol, isopropanol, butanol and Ν, Ν-dimethylformamide. It is highly soluble in amyl alcohol, tetrahydrofuran and dioxane and highly soluble in acetone, amyl acetate, butyl acetate and ethyl acetate. It is insoluble in benzene, chloroform and ethyl ether.

23 142191 I det følgende angives forskellige fysiske karakteristika for antibiotikum X-5108 og dets natriumsalt.In the following, various physical characteristics of antibiotic X-5108 and its sodium salt are stated.

Den optiske drejning af natriumsaltet af antiobikum X-5108 er 5 = "82,8 (ethanol, c = 0,52).The optical rotation of the sodium salt of Antiobic X-5108 is 5 = "82.8 (ethanol, c = 0.52).

IR-Spektret af antibiotikum X-5108 i en KBr-tablet er vist i fig. 1. Antibiotiket udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved de følgende bølgelængder, som er angivet i reciprokke 10 cm:The IR spectrum of antibiotic X-5108 in a KBr tablet is shown in FIG. 1. The antibiotic exhibits characteristic absorption in the IR region of the spectrum at the following wavelengths indicated in reciprocal 10 cm:

Brede bånd ved 3400 og 1580 cm-1, stærkt bånd ved 1660 cm * og fremtrædende bånd ved 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 og 995 cm"1.Wide bands at 3400 and 1580 cm-1, strong bands at 1660 cm * and prominent bands at 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 and 995 cm "1.

15 IR-Spektret af natriumsaltet af antibiotikum X-5108 i en KBr-tablet er vist i fig. 2. Natriumsaltet udviser karakteristisk absorption i IR-området af spektret ved følgende bølgelængder:The IR spectrum of the sodium salt of antibiotic X-5108 in a KBr tablet is shown in FIG. 2. The sodium salt exhibits characteristic absorption in the IR region of the spectrum at the following wavelengths:

Bredt bånd ved 3400cm 1 og fremtrædende bånd ved 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 og 1000 cm 20 UV-Absorptionsspektret af antibiotikum X-5108 ved forskellige pH-vær-dier er vist i fig. 3. Der er UV-maksima ved: 0,IN HC1: w 334 mn (E«^ = 403) 25 ift λ. 233 run (E, = 610) max 1 cm λ 206 nm (e}%_ = 500) max v 1 cm pH-Værdi 7, puffer: λω3χ 327 mn = 423) 30 (isopropanol/K2HP04) ' \max 231 mn (eJ*^ = 660) 0,W KOH: λΜχ 327 mn (eJ^ = 416)Wide band at 3400 cm 1 and prominent band at 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 and 1000 cm 20 UV-absorption spectrum of antibiotic X-5108 at various pH values are shown in FIG. 3. There are UV maxima at: 0, IN HC1: w 334 mn (E + = 403) 25 ift λ. 233 run (E, = 610) max 1 cm λ 206 nm (e}% _ = 500) max v 1 cm pH 7, buffer: λω3χ 327 mn = 423) 30 (isopropanol / K2HPO4) \ max 231 mn (eJ + = 660) 0, W KOH: λΜχ 327 mn (eJ + = 416)

Xnax 231 mn (e}^ = 647).Xnax 231 mn (e} ^ = 647).

35 Det kernemagnetiske resonansspektrum af antibiotikum X-5108 er vist i fig. 4. NMR-Spektret er optaget under anvendelse af CDClg som opløsningsmiddel og tetramethylsilan som intern standard. NMR-Spektret viser fremtrædende signaler ved 0,926, i området mellem 1,666 og 2,036, ved 3,166 og 3,436 og i det olefiniske område.35 The nuclear magnetic resonance spectrum of antibiotic X-5108 is shown in FIG. 4. The NMR spectrum is recorded using CDCl 3 as the solvent and tetramethylsilane as the internal standard. The NMR spectrum shows prominent signals at 0.926, in the range between 1.666 and 2.036, at 3.166 and 3.436, and in the olefinic range.

142191 24142191 24

Antibiotikum X-5108 har en lav oral og parenteral toxicitet.Antibiotic X-5108 has a low oral and parenteral toxicity.

Antibiotikum X-5108 har virkning som vækstfremmende middel til fjerkræ og medfører forøget fodereffektivitet hos dyrene. Således kan 5 antibiotikum X-5108 anvendes som den aktive bestanddel i hidtil ukendte fjerkræfodere, som ved oral indgivelse til fjerkræ resulterer i forøget væksthastighed og en forøget fodereffektivitet hos dyrene. Indgivelse af disse fodere kan opnås ved fremstilling af et ernæringsrigtigt fjerkræfoder som tilfredsstiller dyrenes ernæringsmæssige 10 behov og yderligere tilfører det aktive vækstfremmende antibiotikum X-5108.Antibiotic X-5108 acts as a growth promoter for poultry and leads to increased animal feed efficiency. Thus, antibiotic X-5108 can be used as the active ingredient in novel poultry feeders, which upon oral administration to poultry results in increased growth rate and increased feed efficiency in the animals. Administration of these feeds can be achieved by preparing a nutritious poultry feed that satisfies the nutritional needs of the animals and further feeds the active growth-promoting antibiotic X-5108.

Når antibiotikum X-5108 anvendes til fremstilling af det vækstfremmende foder, er antibiotikumbestanddelen antibiotiket eller et hvilket som 15 helst fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf, fortrinsvis natriumsaltet.When antibiotic X-5108 is used to prepare the growth-promoting feed, the antibiotic component is the antibiotic or any physiologically tolerable cationic salt thereof, preferably the sodium salt.

I det følgende angiver betegnelsen "antibiotikum X-5108" såvel antibiotikum X-5108 som et hvilket som helst fysiologisk tolerabelt kationisk salt deraf.In the following, the term "antibiotic X-5108" denotes both antibiotic X-5108 and any physiologically tolerable cationic salt thereof.

20 Et vækstfremmende foder ifølge opfindelsen indeholdende antibiotikum X-5108 som den aktive bestanddel kan fremstilles på adskillige måder.A growth-promoting feed according to the invention containing antibiotic X-5108 as the active ingredient can be prepared in several ways.

Ved en af disse metoder sættes antibiotiket direkte til et fortærbart ikke-toxisk bæremateriale. Det foretrækkes, at bærematerialet har næringsværdi for fjerkræ, idet der især foretrækkes et bæremateriale 25 med høj foderenergi for fjerkræ. I de tilfælde, hvor antibiotiket sættes direkte til foderet, kan blandingstrinnet udføres under anvendelse af kendte metoder. F.eks. sættes næringsmaterialerne, som udgør fjerkræfoderet, enten hver for sig eller samlet til en chargevis virkende blander, og derefter tilsættes antibiotiket. Blanding fortsæt-30 tes, indtil produktet helt igennem indeholder en ensartet fordeling af bestanddelene.In one of these methods, the antibiotic is added directly to a consumable non-toxic carrier. It is preferred that the carrier material has nutritional value for poultry, particularly a carrier material 25 with high feed energy for poultry. In cases where the antibiotic is added directly to the feed, the mixing step can be carried out using known methods. Eg. the nutrients constituting the poultry feed are either individually or combined into a batch-mixing mixer and then the antibiotic is added. Mixing is continued until the product throughout contains a uniform distribution of the ingredients.

De næringsmaterialer, der anvendes som fjerkræfoder og til den foreliggende opfindelses formål som bæremateriale for antibiotikum 35 X-5108, kan varieres inden for et vist område afhængigt af det spe cielle behov hos den type fjerkræ, som skal fodres, og afhængigt af hvad dyrene senere skal anvendes til. Imidlertid indeholder foderet i de fleste tilfælde proteinkilder såsom fiskemel, sojabønnemel, 25 142191 majs- og jordnøddeprodukter og lignende, carbonkilder såsom korn, mel, sukker, og lignende. Yderligere kan mineral- og vitaminbalancen for dyrene være opretholdt ved til foderet at sætte de nødvendige mineraler, f.eks. natrium-, kalium-, magnesium- og calciumcarbonat, 5 og vitaminer, f.eks. A vitamin, B^ vitamin, D vitamin og thiamin.The nutritional materials used as poultry feed and for the purpose of the present invention as carrier material for antibiotic 35 X-5108 may be varied within a certain range depending on the special needs of the type of poultry to be fed and depending on what the animals subsequently are. must be used for. However, in most cases, the feed contains protein sources such as fish meal, soybean meal, corn and peanut products and the like, carbon sources such as cereals, flour, sugar, and the like. Further, the mineral and vitamin balance of the animals may be maintained by adding to the feed the necessary minerals, e.g. sodium, potassium, magnesium and calcium carbonate, and vitamins, e.g. Vitamin A, vitamin B, vitamin D and thiamine.

Foderet kan naturligvis også indeholde andre sædvanligt anvendte tilsætninger.Of course, the feed may also contain other commonly used additives.

Det foretrækkes, at antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt 10 salt deraf som aktiv bestanddel inkorporeres i en koncentreret foder blanding, som derefter kan tilsættes fjerkræfoderet. Et aspekt af opfindelsen angår derfor et middel til anvendelse ved fremstilling af det ovenfor beskrevne fjerkræfoder, hvilket middel er ejendommeligt ved, at det består af antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk 15 tolerabelt salt deraf og en ikke-toxisk inert bestanddel. Ved fremstilling af en fast forblanding, som indeholder antibiotikum X-5108, kan et hvilket som helst bæremateriale eller fyldstof anvendes som inert bestanddel, når blot det er inert over for det tilsatte antibiotikum og ikke-toxisk over for det fjerkræ, som skal indtage præpa-20 ratet. Adskillige faste materialer tilfredsstiller disse betingelser og kan derfor med godt resultat anvendes til den foreliggende opfindelses formål. Blandt sådanne faste materialer kan nævnes mineralkilder såsom formalede østersskaller, spiselige kornsorter og vegetabilske, marine eller animalske materialer, som findes i sædvanligt anvendt 25 animalsk foder, såsom majsmel, citrusmel, sojabønnemel, fiskemel, kødaffald, tørret fermentationsremanens og lignende.It is preferred that antibiotic X-5108 or a physiologically tolerable salt thereof as an active ingredient be incorporated into a concentrated feed mixture which may then be added to the poultry feed. Therefore, one aspect of the invention relates to an agent for use in preparing the above-described poultry feed, which is characterized in that it consists of antibiotic X-5108 or a physiologically tolerable salt thereof and a non-toxic inert ingredient. In the preparation of a solid premix containing antibiotic X-5108, any carrier or filler can be used as an inert ingredient, provided it is inert to the added antibiotic and non-toxic to the poultry to be consumed. -20 steering wheel. Several solid materials satisfy these conditions and can therefore be successfully used for the purposes of the present invention. Among such solid materials are mineral sources such as ground oyster shells, edible cereals and vegetable, marine or animal materials found in commonly used animal feed such as cornmeal, citrus flour, soybean meal, fishmeal, meat waste, dried fermentation residue and the like.

Antibiotikum X-5108 kan blandes med ét eller flere af de ovenfor angivne anvendelige faste stoffer til en mask, pille eller en hvilken 30 som helst foretrukken form på en sædvanlig måde. F.eks. kan præparatet fremstilles ved findeling eller pulverisering af den aktive bestanddel og de inerte bestanddele under anvendelse af en hvilken som helst kommerciel mølle. Hvis fodermaterialet ikke er til stede, når der formales eller pulveriseres, kan det resulterende præparat 35 fordeles i et hvilket som helst kommercielt fodermateriale.Antibiotic X-5108 can be mixed with one or more of the above-mentioned usable solids for a mask, pill or any preferred form in a conventional manner. Eg. For example, the composition can be prepared by comminuting or pulverizing the active ingredient and the inert ingredients using any commercial mill. If the feed material is not present when milling or pulverizing, the resultant composition 35 can be distributed into any commercial feed material.

Den mængde antibiotikum X-5108, som er nødvendig til opnåelse af den ønskede stimulering af væksthastigheden og forøgelse af foder- 142191 26 effektiviteten, er kritisk, men kan variere inden for et foreskrevet område. Det foretrækkes pr. 100 vægtdele foder at anvende fra 0,0001 vægtdel til 0,01 vægtdel af det aktive materiale, som er antibiotikum X-5108 eller et farmaceutisk tolerabelt salt deraf. Større 5 koncentrationer af antibiotikum X-5108 end 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele foder giver sædvanligvis ikke bedre resultater end 0,01 vægtdel pr. 100 vægtdele. Det er således ikke fordelagtigt at anvende mængder, som er større end 0,01 vægtdel aktiv bestanddel pr. 100 vægtdele foder. Ifølge en foretrukket udformning for den forelig-10 gende opfindelse er den vækstfremmende foderblanding et fjerkræ-suppleringsfoder, som pr. 100 vægtdele foder indeholder fra 0,0005 vægtdel til 0,0025 vægtdel af den aktive bestanddel antibiotikum X-5108.The amount of antibiotic X-5108 needed to achieve the desired rate of growth rate and increase feed efficiency is critical but may vary within a prescribed range. It is preferred per 100 parts by weight feed to use from 0.0001 parts by weight to 0.01 parts by weight of the active material which is antibiotic X-5108 or a pharmaceutically tolerable salt thereof. Greater 5 concentrations of antibiotic X-5108 than 0.01 parts by weight per day. 100 parts by weight of feed usually does not produce better results than 0.01 parts by weight per day. 100 parts by weight. Thus, it is not advantageous to use amounts greater than 0.01 parts by weight of active ingredient per day. 100 parts by weight of feed. According to a preferred embodiment of the present invention, the growth-promoting compound feed is a poultry supplement feed which per 100 parts by weight of feed contains from 0.0005 parts by weight to 0.0025 parts by weight of the active ingredient antibiotic X-5108.

15 En forblanding, som senere kan sættes til foderet, er som ovenfor nævnt en hensigtsmæssig anvendelse af det vækstfremmende stof og sikrer en god fordeling af den aktive bestanddel igennem foderet.15 A premix which can be added to the feed later is, as mentioned above, an appropriate use of the growth promoter and ensures a good distribution of the active ingredient throughout the feed.

Den mængde antibiotikum X-5108, der findes i forblandingen, er ikke kritisk. Uden hensyn til mængden af antibiotikum X-5108 i for-20 blandingen opnås det ønskede formål ved anvendelse af en sådan mængde af forblandingen, som er i stand til at give et færdigt foder, der indeholder den ovenfor angivne effektive mængde antibiotikum X-5108. Forblandingen er en bekvem form til levering til foderfabrikanten eller fjerkræopdrætteren, som så kan blande en passende 25 mængde af forblandingen med tilgængeligt fjerkræfoder til fremstilling af et færdigt foder, som indeholder en effektiv mængde antibiotikum X-5108.The amount of antibiotic X-5108 contained in the premix is not critical. Irrespective of the amount of antibiotic X-5108 in the premix, the desired purpose is achieved by using such amount of premix that is capable of providing a finished feed containing the above-mentioned effective amount of antibiotic X-5108. The premix is a convenient form for delivery to the feed manufacturer or poultry breeder, who can then mix an appropriate amount of the premix with available poultry feed to prepare a finished feed containing an effective amount of antibiotic X-5108.

Opfindelsen belyses nærmere ved de følgende eksempler, hvor dele 30 er vægtdele, med mindre andet er angivet:The invention is further illustrated by the following examples, wherein parts 30 are parts by weight, unless otherwise stated:

Eksempel 1.Example 1.

35 Fermentation af Streptomyces sp. X-5108.35 Fermentation of Streptomyces sp. X-5108th

En suspension af sporer af Streptomyces sp. X-5108 fra en næringsagar, som var fyldt skråt i et reagensglas, podes til en 20 liters 27 142191A suspension of spores by Streptomyces sp. X-5108 from a nutrient agar filled into a test tube is seeded to a 20 liter 27 142191

Pyrexkolbe, som indeholder 15 liter gennemluftet medium med følgende sammensætning: 1% sojabønnemel, 1% puddersukker, 0,25% majsstøbevand, 0,1% K2HP04, 0,1% CaCOg og 0,5% lardolie (som skumdæmpningsmiddel). Efter 4 døgns vækst under gennemluftning 5 ved 28°C overføres den tridagtige vækst til en 400 liters rustfri stålf ermen tor, som indeholder 240 liter medium med følgende sammensætning: 1% affedtet bomuldsfrømel (Proflo), 1% majsstivelse, 0,25% majsstøbevand-faststof, 0,1% CaCOg, 0,1% KgHPO^ samt lardolie som skumdæmpningsmiddel. Før inokulering indstilles mediets pH-værdi 10 på 6,8. Fermentoren gennemluftes, og væksten fortsættes i 5 døgn. Fermentorens indhold filtreres derefter ved hjælp af diatoméjord ("Hyflo Filter Cell")· Filtratets pH-værdi indstilles på 3,5, og filtratet ekstraheres med et halvt så stort rumfang butylacetat.Pyrex flask containing 15 liters of aerated medium with the following composition: 1% soybean flour, 1% powdered sugar, 0.25% corn cast water, 0.1% K2HPO4, 0.1% CaCOg and 0.5% lard oil (as a foam suppressant). After 4 days of growth under aeration 5 at 28 ° C, the tragic growth is transferred to a 400 liter stainless steel fermenter containing 240 liters of medium with the following composition: 1% degreased cotton flour (Proflo), 1% corn starch, 0.25% corn cast water solid, 0.1% CaCOg, 0.1% KgHPO4, and lard oil as antifoam. Prior to inoculation, the pH of the medium 10 is set to 6.8. The fermentor is aerated and growth is continued for 5 days. The fermentor content is then filtered using diatomaceous earth ("Hyflo Filter Cell") · The pH of the filtrate is adjusted to 3.5 and the filtrate is extracted with half the volume of butyl acetate.

Den klarede ekstrakt koncentreres under reduceret tryk ved en 15 temperatur under 40°C til en brun sirup, som efter triturering med petroleumsether giver et fast stof, nemlig antibiotikum X-5108, som har en aktivitet på 120 enheder Bacillus E pr. mg.The clarified extract is concentrated under reduced pressure at a temperature below 40 ° C to a brown syrup, which after trituration with petroleum ether gives a solid, namely antibiotic X-5108, which has an activity of 120 units of Bacillus E per day. mg.

20 Eksempel 2.Example 2.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chargevis ekstraktion med et opløsningsmiddel.Purification of Antibiotic X-5108 by Charge-Extraction with a Solvent.

25 Den chargevise ekstraktion med et opløsningsmiddel udføres med 12.000 liters fermentationscharger, som har en aktivitet in vitro på ca. 130 enheder pr. ml over for B. simplex. Den filtrerede fermentationsvæske ekstraheres med butylacetat ved en pH-værdi på 7,5. Den organiske ekstrakt vaskes med vand og destilleres hurtigt 30 ved en temperatur under 50°C, og den resulterende vandfri opløsning tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til indstilling af pH-værdien på 9,0. Det gule bundfald, som dannes, frafiltreres og vaskes med butylacetat. Det fordeles derefter mellem vand og butylacetat, og pH-værdien indstilles på 4. Den organiske fase fraskilles og behand-35 les som ovenfor angivet med den undtagelse, at der tilsættes na triumdiethylmalonatreagens indtil en pH-værdi på 8,5. Det resulterende bundfald gøres surt og ekstraheres med frisk butylacetat.The solvent extraction with a solvent is carried out with 12,000 liters of fermentation batches having an in vitro activity of approx. 130 units per ml against B. simplex. The filtered fermentation liquid is extracted with butyl acetate at a pH of 7.5. The organic extract is washed with water and rapidly distilled at a temperature below 50 ° C, and the resulting anhydrous solution is added sodium diethylmalonate reagent to adjust the pH to 9.0. The yellow precipitate which is formed is filtered off and washed with butyl acetate. It is then partitioned between water and butyl acetate and the pH is adjusted to 4. The organic phase is separated and treated as indicated above except that sodium tri diethylmalonate reagent is added up to a pH of 8.5. The resulting precipitate is acidified and extracted with fresh butyl acetate.

142191 28142191 28

Ekstrakten behandles med "Darco G 60", og natriumsaltet af antibiotikum X-5108 udfælder ved tilsætning af natriumdiethylmalonat til en pH-værdi på 8,0. Det på denne måde vundne gule natriumsalt vaskes og tørres, hvorefter det har en aktivitet in vitro på ca.The extract is treated with "Darco G 60" and the sodium salt of antibiotic X-5108 precipitates by adding sodium diethyl malonate to a pH of 8.0. The yellow sodium salt thus obtained is washed and dried, after which it has an in vitro activity of approx.

5 430 enheder pr. mg over for B. simplex. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan angives ved følgende forenklede flow sheet:5 430 units per unit. mg to B. simplex. The procedure described above can be indicated by the following simplified flow sheet:

Flow sheet for isolering af antibiotikum X-5108.Flow sheet for isolation of antibiotic X-5108.

10 _12000 liter fermentationsvæske, høstet efter 5-6 døgn _10400 liter filtreret fermentationsvæske, pH-værdi 7,5 trin 2 (om nødvendigt indstilles pH-værdien med H^PO^) 15 ekstraheres med 2400 liter butylacetat _2320 liter "1. butylacetat" trin 3 vaskes to gange med 100 liter vand, koncentreres hurtigt v 20 _320 liter "1. butylacetat-koncentrat" trin 4 der tilsættes natriumdiethylmalonatreagens til en pH-værdi på 9 (ca. 1 - 1,5 liter 1,7N), bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat10 _12000 liters of fermentation liquid, harvested after 5-6 days _10400 liters of filtered fermentation liquid, pH 7.5 stage 2 (if necessary adjust the pH with H 2 PO 2) 15 extracted with 2400 liters of butyl acetate _2320 liters of "1. butyl acetate" step 3 is washed twice with 100 liters of water, quickly concentrated to 20-320 liters of "1. butyl acetate concentrate" step 4, added sodium diethylmalonate reagent to a pH of 9 (about 1 - 1.5 liters of 1.7N), the precipitate filtered off and washed with 4 liters of butyl acetate

YY

25 _"1. bundfald" trin 5 opløses i 100 liter vand, pH-værdien indstilles på 4 med 15% HgPO^. Der ekstraheres to gange med butylacetat (80 og 40 liter)Step 5 is dissolved in 100 liters of water, the pH is adjusted to 4 with 15% HgPO 2. Extract twice with butyl acetate (80 and 40 liters)

YY

30 _112 liter "2. butylacetat" trin 6 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt _16 liter 22. butylacetat-koncentrat" trin 7 pH-værdien indstilles på 8,5 med natrium die thylmalonat-35 reagens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter >/ butylacetat 29 14219130 _112 liters of "2nd butyl acetate" step 6 is washed twice with 8 liters of water. Concentrate quickly _ 16 liters 22. butyl acetate concentrate "Step 7 The pH is adjusted to 8.5 with sodium die thylmalonate reagent. The precipitate is filtered off and washed with 4 liters / butyl acetate 29 142191

Flow sheet fortsat _”2. bundfald11 trin 8 opløses i 80 liter vand, pH-værdien indstilles på 5 med 5 15% HgPO^. Der ekstraheres to gange med butylacetat \f (60 og 30 liter) _84 liter "3. butylacetat" trin 9 vaskes to gange med 8 liter vand. Koncentreres hurtigt 10 v __16 liter "3. butylacetat-koncentrat" trin 10 omrøres med 50 g "Darco G 60" i 1 time ved stuetemperatur filtreres og koncentreres hurtigt 15 _8 liter "4. butylacetat" trin 11 pH-værdien indstilles på 3,0 med natriumdiethylmalonat- reagens. Bundfaldet frafiltreres og vaskes med 4 liter butylacetat og derefter med 4 liter petroleumsether (30 - 60°C) ^og tørres ved 56°C og 0,5 mm Hg i 36 timer 20 natriumsaltet af antibiotikum X-5108 hvilket er et gult amorft fast stof.Flow sheet continued _ ”2. precipitate11 step 8 is dissolved in 80 liters of water, the pH is adjusted to 5 with 5 15% HgPO 2. Extract twice with butyl acetate \ f (60 and 30 liters) _84 liters of "3. butyl acetate" step 9 wash twice with 8 liters of water. Concentrate rapidly 10 v 16 16 liters of "3. butyl acetate concentrate" step 10 is stirred with 50 g of "Darco G 60" for 1 hour at room temperature, filter and quickly concentrate 15 _8 liters of "4. butyl acetate" step 11 pH is adjusted to 3, 0 with sodium diethyl malonate reagent. The precipitate is filtered off and washed with 4 liters of butyl acetate and then with 4 liters of petroleum ether (30 - 60 ° C) and dried at 56 ° C and 0.5 mm Hg for 36 hours in the sodium salt of antibiotic X-5108 which is a yellow amorphous solid. fabric.

25 Eksempel 3.Example 3.

Rensning af antibiotikum X-5108 ved modstrømsfordeling.Purification of antibiotic X-5108 by countercurrent distribution.

Der anvendes 200 glas, rumfanget af den øvre fase er 40 ml, og 30 rumfanget af den nedre fase er 40 ml. Chargen er på 5 g antibiotikum X-5108, fremstillet ved ekstraktion med et opløsningsmiddel af den rå fermentationsvæske, opløst i 40 ml af den øvre fase.200 glasses are used, the volume of the upper phase is 40 ml and the volume of the lower phase is 40 ml. The charge is on 5 g of antibiotic X-5108, prepared by extraction with a solvent of the crude fermentation solution, dissolved in 40 ml of the upper phase.

Der benyttes en opløsningsmiddelblanding bestående af ethylacetat, isopropanol, vandig 0,1M sekundært natriumphosphatopløsning i 33 rumfangsforholdet 12:9:20. Der udføres 200 overføringer, hvor der er "top" ved 159 overføringer. Fordelingsforholdet er 3,88.A solvent mixture consisting of ethyl acetate, isopropanol, aqueous 0.1M secondary sodium phosphate solution in the 33: 12: 9: 20 ratio is used. 200 transfers are performed, which are "top" at 159 transfers. The ratio of ratio is 3.88.

30 14219130 142191

Fordelingen udføres på følgende måde:The distribution is carried out as follows:

Fraktionerne 150 - 170 blandes og tilsættes 1-butanol til ekstraktion af antibiotiket til den organiske fase. Den vandige fase fraskilles, 5 og den organiske fase vaskes fire gange med vand. Derefter fjernes vandet fra den organiske fase ved azeotropisk destillation, og bundfaldet udfældes ved tilsætning af petroleumsether. Der vindes 3 g antibiotikum, som har en biologisk aktivitet på ca. det dobbelte af udgangsmaterialet.Fractions 150 - 170 are mixed and 1-butanol is added to extract the antibiotic to the organic phase. The aqueous phase is separated, and the organic phase is washed four times with water. Then the water is removed from the organic phase by azeotropic distillation and the precipitate is precipitated by the addition of petroleum ether. 3 g of antibiotic are obtained which have a biological activity of approx. twice the starting material.

1010

Eksempel 4.Example 4

Rensning af antibiotikum X-5108 ved chromatografi på Sephadex 15 LH-20.Purification of antibiotic X-5108 by chromatography on Sephadex 15 LH-20.

En ethanolisk opløsning af 300 mg af den ved modstrømsfordeling på den ovenfor angivne måde rensede prøve af antibiotikum X-5108 indstilles på én pH-værdi på 8 - 9 med natriummethoxidopløsning 20 (i henhold til vådt indikatorpapir) og sættes på en Sephadex LH-20-kolonne (290 mm x 41 mm), som er ækvilibreret med 3A alkohol.An ethanolic solution of 300 mg of the sample purified by antibiotic X-5108 purified by countercurrent distribution is adjusted to one pH of 8-9 with sodium methoxide solution 20 (according to wet indicator paper) and applied to a Sephadex LH-20 column (290 mm x 41 mm) equilibrated with 3A alcohol.

Kolonnen fremkaldes med 3A alkohol, og det meste af antibiotikumzonen kommer frem ved et effluentrumfang på 950 - 1200 ml. De følgende fraktioner indeholder en del farvede zoner med ubetydelig 25 biologisk aktivitet. De aktive fraktioner samles og inddampes til et lille rumfang, hvortil der sættes ether og petroleumsether til udfældning af antibiotiket. Det resulterende gule faste stof er natriumsaltet af antibiotikum X-5108, som kun giver én plet i henhold til tyndtlagschromatografisk analyse.The column is developed with 3A alcohol and most of the antibiotic zone appears at an effluent volume of 950 - 1200 ml. The following fractions contain some colored zones with negligible biological activity. The active fractions are pooled and evaporated to a small volume to which ether and petroleum ether are added to precipitate the antibiotic. The resulting yellow solid is the sodium salt of antibiotic X-5108, which provides only one spot according to thin-layer chromatographic analysis.

30 = 0,19 (silicagel F-254, fremkaldt med UV-lys) og = 0,29 (silicagel/kiselgur, fremkaldt bioautografisk).30 = 0.19 (silica gel F-254, developed with UV light) and = 0.29 (silica gel / diatomaceous earth, bioautographed).

35 31 14219135 31 142191

Eksempel 5.Example 5

Fremstilling af antibiotikum X-5108 ud fra dets natriumsalt.Preparation of antibiotic X-5108 from its sodium salt.

5 0,464 g natriumsalt af antibiotikum X-5108, fremstillet ved chroma- tografi på Sephadex LH-20, opløses i 4,6 ml isvand, og der tilsættes 10 ml ethylacetat til dannelse af et tofasesystem. Til denne blanding, som haves i en skilletragt, sættes 1 ml opløsning af primært natriumphosphat (50 g NaHgPO^.HgO i 100 ml vand). Det op-10 rindeligt dannede bundfald opløses ved omrystning. Den vandige fase fraskilles, og den organiske fase vaskes fire gange med isvand, hver gang med ét rumfang, og dehydratiseres derefter ved azeotropisk destillation med ethanol. Koncentratet på 2 ml fortyndes med to rumfang ethylacetat, og der tilsættes dråbevis diethylether 15 indtil uklarhed og derefter 30 ml petroleumsether. Det resulterende bundfald fraskilles ved filtrering og tørres ved stuetemperatur, hvorved fås antibiotikum X-5108.Dissolve 0.464 g of sodium salt of antibiotic X-5108, prepared by chromatography on Sephadex LH-20, in 4.6 ml of ice water and add 10 ml of ethyl acetate to form a two-phase system. To this mixture, which is kept in a separatory funnel, is added 1 ml of solution of primary sodium phosphate (50 g NaHgPO 2 .HgO in 100 ml water). The initially formed precipitate is dissolved by shaking. The aqueous phase is separated and the organic phase is washed four times with ice water, each one volume, and then dehydrated by azeotropic distillation with ethanol. Dilute the 2 ml concentrate with two volumes of ethyl acetate and drop by drop diethyl ether 15 until cloudy and then 30 ml petroleum ether. The resulting precipitate is separated by filtration and dried at room temperature to give antibiotic X-5108.

20 Eksempel 6.Example 6

Bestemmelse af den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108.Determination of the Growth Stimulating Effect of Antibiotic X-5108.

Der fremstilles en grundfoderblanding med følgende sammensætning: 25A basic feed mixture is prepared having the following composition:

Bestanddele VægtprocentIngredients Weight percent

Formalet gul majs 56,075 Kød og benmel (50% protein) 4,000 30 Fiskemel (60% protein) 4,000Ground yellow corn 56,075 Meat and bone meal (50% protein) 4,000 30 Fish meal (60% protein) 4,000

Sojabønnemel (50% protein) 28,000Soybean meal (50% protein) 28,000

Dehydratiseret alfalfa-mel 1,000Dehydrated alfalfa flour 1,000

Animalsk fedt 4,000Animal fat 4,000

Methionin 0,200 35 Fosf orit 0,250Methionine 0.200 Phosphorus or 0.250

Calciumcarbonat 1,200 lodsalt 0,250Calcium carbonate 1,200 solder 0.250

Vitaminsupplement 1,000Vitamin Supplement 1,000

Spormineralsupplement 0,025.Trace Mineral Supplement 0.025.

14219 1 3214219 1 32

Der sættes til denne foderblanding 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foderblanding.To this feed mixture 50 mg of antibiotic X-5108 is added per day. kg of compound feed.

Den vækststimulerende effekt af antibiotikum X-5108 bestemmes 5 ved at lade fjerkræ æde ad libitum af den ovenfor angivne foderblanding, med den angivne tilsætning af antibiotikum X-5108. Forsøget udføres med én dag gamle "Comish Cross Sexed Broiler" kyllinger.The growth-stimulating effect of antibiotic X-5108 is determined by letting poultry eat ad libitum of the above feed mix, with the indicated addition of antibiotic X-5108. The experiment is performed with one day old "Comish Cross Sexed Broiler" chickens.

10 Der anvendes en gruppe pi 10 kyllinger til hvert forsøg (5 hanner og 5 hunner). De forskellige grupper har adgang til den foderblanding, som er tilsat antibiotikum. Der foretages randomiseret fordeling af forsøgene for at udligne faktorer såsom varme, lys og placering. Fuglene observeres i en periode på 2 uger, idet grup-15 pernes vægt bestemmes flere gange i perioden, og de individuelle vægte bestemmes efter 14 døgns forløb. Det registreres også, hvor meget foderblanding, der indtages, og forbedringen i foderblandingens effektivitet beregnes, sammenlignet med kontrolgruppen.10 A group of 10 chickens is used for each experiment (5 males and 5 females). The various groups have access to the compound feed that is added to the antibiotic. Randomized trials are performed to offset factors such as heat, light and location. The birds are observed for a period of 2 weeks, the weight of the groups being determined several times during the period, and the individual weights determined after 14 days. It is also recorded how much feed mix is consumed and the improvement in feed mix efficiency is calculated, compared to the control group.

20 Der udføres samtidig forsøg med kontrolgrupper på ovenfor angivne måde med den undtagelse, at kyllingerne, som anvendes i kontrolgrupperne, spiser ad libitum af en foderblanding, som, bortset fra, at den ikke indeholder antibiotikum X-5108, indeholder de samme næringsbestanddele, som angivet ovenfor.At the same time, experiments with control groups are carried out in the above manner except that the chickens used in the control groups eat ad libitum of a compound feed which, apart from not containing antibiotic X-5108, contains the same nutritional ingredients which stated above.

2525

Den gennemsnitlige vægtforøgelse ved hver gruppe divideres med den gennemsnitlige vægtforøgelse ved kontrolgruppen, og kvotienten multipliceres med 100, hvilket giver den gennemsnitlige procentvise vægtforøgelse. Forøgelsen beregnes ved fra kyllingernes vægt efter 30 2 ugers forløb at subtrahere kyllingernes vægt på den første leve dag. Følgende formel kan opstilles:The average weight gain in each group is divided by the average weight gain of the control group, and the quotient is multiplied by 100, giving the average percentage weight gain. The increase is calculated by subtracting the chickens weight after 30 2 weeks over the chickens weight on the first day of life. The following formula can be set:

Forsøgsgrs. gensnt. slutvægt - forsøgsgrs. gensnt. begyndelses vægt _ Kontrolgrs. gensnt. slutvægt - kontrolgrs. gensnt. begyndelsesvægt 35 den procentvise vægtforøgelse 100 ("gruppens" er forkortet til "grs.", og "gennemsnitlig" til "gensnt.").Forsøgsgrs. gensnt. final weight - trial limit. gensnt. initial weight _ Control Grs. gensnt. final weight - control grs. gensnt. initial weight 35 is the percentage weight gain 100 ("group" is shortened to "grs." and "average" to "average.").

33 14219133 142191

Resultatet af forsøget fremgår af tabel XII.The results of the experiment are shown in Table XII.

Tabel XIITable XII

5 Forsøg med Kontrolgruppe Gruppe, som får5 Experiment with Control Group Group, which gets

Antibiotikum X-5108Antibiotic X-5108

Tilsætning af antibiotikum i 0 50 10 mg pr. kg foder Vægtforøgelse efter 2 ugers forløb, gennemsnit for 40 kyllinger, vægtforøgelse ± 15 standardafvigelse 154 ± 8 185 ± 12Addition of antibiotic in 0 50 10 mg per kg of feed Weight gain after 2 weeks, average for 40 chickens, weight increase ± 15 standard deviation 154 ± 8 185 ± 12

Procentvis vægtforøgelse 100 120Percentage weight gain 100 120

Fodereffektivitet 1,55 1,39 20Feed efficiency 1.55 1.39 20

Procentvis forbedret fodereffektivitet - +12Percentage improved feed efficiency - +12

Det fremgår af tabel XII, at kyllinger, der fodres med en foder-25 blanding, som er tilsat 50 mg antibiotikum X-5108 pr. kg foder, udviser en forøget væksthastighed sammenlignet med en kontrolgruppe. Samtidig udnytter kyllingerne foderet mere effektivt, således som det fremgår af den 10%'s forbedring af fodereffektiviteten.It appears from Table XII that chickens fed a feed mixture added 50 mg of antibiotic X-5108 per kg of feed, exhibits an increased growth rate compared to a control group. At the same time, the chicks utilize the feed more efficiently, as evidenced by the 10% improvement in feed efficiency.

3030

Eksempel 7.Example 7

Det i eksempel 6 angivne forsøg gentages flere gange med anven-35 delse af den samme grundfoderblanding som angivet i eksempel 6, idet dog indholdet af antibiotikum X-5108 varieres i de forskellige forsøg. Forsøgskyllingerne indgives en foderblanding indeholdendeThe experiment set forth in Example 6 is repeated several times using the same basic feed mixture as set forth in Example 6, although the content of antibiotic X-5108 is varied in the different experiments. The test chickens are fed a feed mixture containing

Claims (4)

142191 5, 10 , 25 , 50 og 100 mg aktiv bestanddel pr. kg foderblanding. Forsøgene gentages for at bekræfte resultaterne. Der foretages fire forsøg med kontrolgrupper på 10 fugle, som indgives foderblandingen uden indhold af antibiotikum. Ved alle forsøgene bestemmes 5 væksthastigheden i løbet af en periode på 2 uger sammenlignet med en kontrolgruppe. Det bestemmes, hvor meget foder fuglene indtager, og forbedringen i fodereffektiviteten sammenlignet med kontrolgruppen beregnes. Resultaterne fremgår af tabel XIII. 10. tabel XIII er for de yderligere forsøg angivet de til tabel XII svarende værdier, idet dog standardafvigelsen ikke er angivet i tabel XIII, og der i tabel XIII er angivet, for mange fugle forsøgene omfatter.5, 10, 25, 50 and 100 mg of active ingredient per ml. kg of compound feed. The experiments are repeated to confirm the results. Four experiments were performed with control groups of 10 birds, which were administered the feed mixture without antibiotic content. In all experiments, the growth rate is determined over a 2-week period compared to a control group. It is determined how much feed the birds consume and the improvement in feed efficiency compared to the control group is calculated. The results are shown in Table XIII. 10. Table XIII for the further experiments is given the values corresponding to Table XII, although the standard deviation is not given in Table XIII, and Table XIII indicates too many birds the experiments include. 15 Tabel XIII Mg an ti- Antal Vægt- Vægt- Foder- Forbed- biotikum fugle forø- forø- effekti- ring i pr. kg gelse gelse vitet % foder efter 2 i % uger 20------—- Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 Antibiotikum X-5108 50 24 175 117 1,37 +12 Kontrolgruppe 0 30 152 100 1,47 Antibiotikum X-5108 50 18 173 114 1,38 +715 Table XIII Mg an ti- Number Weight- Weight- Feed- Improve- biotic birds feed- feed efficiency in per. kg feed yield white% feed after 2 for% weeks 20 --------- Control group 0 48 149 100 1.54 Antibiotic X-5108 50 24 175 117 1.37 +12 Control group 0 30 152 100 1.47 Antibiotic X-5108 50 18 173 114 1.38 +7 25 Kontrolgruppe 0 30 146 100 1,59 Antibiotikum X-5108 25 18 180 123 1,37 +16 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,51 Antibiotikum X-5108 5 18 183 123 1,39 +9 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 2Q Antibiotikum X-5108 10 18 185 124 1,41 +13 Kontrolgruppe 0 48 149 100 1,54 Antibiotikum X-5108 100 18 182 122 1,33 +14 Patentkrav. 3525 Control Group 0 30 146 100 1.59 Antibiotic X-5108 25 18 180 123 1.37 +16 Control Group 0 48 149 100 1.51 Antibiotic X-5108 5 18 183 123 1.39 +9 Control Group 0 48 149 100 1, 54 2Q Antibiotic X-5108 10 18 185 124 1.41 +13 Control Group 0 48 149 100 1.54 Antibiotic X-5108 100 18 182 122 1.33 +14 Patent Claims. 35 1. Vækstfremmende fjerkræfoder, kendetegnet ved, at det ud over sædvanlige foderbestand-dele indeholder antibiotikum X-5108 eller et fysiologisk tolerabelt salt1. Growth-promoting poultry feed, characterized in that it contains, in addition to the usual feed ingredients, antibiotic X-5108 or a physiologically tolerable salt