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Verfahren zur Anreicherung gonadotroper Wirkstoffe Es wurde gefunden,
daß es gelingt, gonadotrope Wirkstoffe anzureichern, wenn man die Anreicherung dieser
Wirkstoffe durch- Messung des Zuckergehaltes kontrolliert und dabei die Fraktionen
mit steigendem Zuckergehalt weiterverarbeitet.
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Als Ausgangsstoffe können sowohl Trokkenpräparate wie auch Flüssigkeiten,
wie z. B. Körperflüssigkeiten, Organextrakte oder Preßsäfte, welche gonadotropes
Hormon enthalten, wie z.'B. Hypophysenvorderlappen, Schwangerenharn, oder auch Blutserum
schwangerer Individuen, Verwendung finden. Für'die Aufarbeitung kommen z. B. die
Methoden der Adsorption, der Aussalzung, der Fällung oder der Dialys#e in Frage.
Diese Methoden können beliebig oft wiederholt oder miteinander beliebig kombiniert
werden.
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- Wie gefunden wurde, weisen die gonadotrop wirksamen Präparate
einen verhältnismäßig hohen Zuckergehalt auf. Die physiologische Wirksamkeit steigt
mit zunehmendem Zuckergehalt. Der Zuckergehalt wird verfahrensgemäß z. B. kolorimetrisch
bestimmt. Wie festgestellt wurde, handelt es sich um Mannose bzw. um ein mannosehaltiges
Polysaccharid im Falle der Verwrndung von Hypophysenvorderlappen als Ausgangsstoff.
Da der vorhandene Zuck-er nicht dialysierbar und auchnach den üblichen Methoden
nicht ohne Vernichtung der physiologischen Wirksamkeit abspaltbar ist, muß angenommen
werden, daß dieser Zucker ein Bestandteil des gonadotrop wirksamen Proteins ist.
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Bereits Fischer und Ertel (Zeitschr. physiol. Chem. 202, 92ff- [1931])
haben den Zuckergehalt von Zubereitungen des gonadotropen Hormons aus Schwangerenharn
mit Hilfe eines Reduktionsverfahrens bestimmt, welches sich nach dem heutigen Stande
des Wissens jedoch als - unzulänglich erweist. Auf Grund ihrer Ergebnisse kommen
diese Forscher zum Schluß, daß sich in den untersuchten Präparaten zwischen Reduktionswerte
und gonadotroper Wirksamkeit keine
einfache Beziehung erkennen läßt.
Der Erfinderin ist der Nachweis, daß der Zuckergehalt in einfacher Beziehung zum
Hormongehalt steht, erstmals gelungen. Dies ist im Hinblick auf die gegenteiligen
Befunde von Fischer und Ertel völlig überraschend. Das vorliegende Verfahren zur
Anreicherung gonadotroper Wirkstoffe durch Kontrolle des Zuckergehaltes und Verarbeitung
der Fraktionen mit steigendem Zuck-ergebalt ist somit neu und überraschend.
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Beispiel i Eine wässerige Lösung eines gonadotrop wirksamen Hypophysenvorderlappenpräparates-,
hergestellt durch alkalische Extraktion von Drüsentrockenpulver, wird bei niedriger
Temperatur mehrere Tage gegen destilliertes Wasser dialysiert und hierauf die von
dialysierbaren Stoffen befreite Hormonlösung vorsichtig im Vakuum zur Trockne verdampft.
Der Mannosegehalt des Trockenrückstandes beträgt i,60,lo. Dieses Präparat wird in
der 2ofachen Menge Wasser gelöst, die wässerige Lösung mit einigen Tropfen Natriumacetatlösung
versetzt und hierauf der Wirkstoff durch Zusatz "von 5 Volumen Alkohol ausgefällt.
Der entstehende Niederschlag wird wieder in Wasser gelöst und die Fällung mit Alkohol
in gleicher Weise wiederholt. Der getrocknete Niederschlag stellt ein in Wasser
leicht lösliches weißes Pulver dar, dessen Mannosegehalt 4,6% beträgt und das eine
Wirksamkeit von 25ooRE/,- (Ratteneinheiten pro Gramm) aufweist.
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Beispiel 2 Aus Schwangerenharn erhält man durch alkoholische Fällungg
und durch mehrtägige Dialyse ein Präparat mit einer gonadotropen Wirksamkeit von
33ooRE,g und einem Zukkergehalt von 4,00,10 (als Mannose bestimmt). 5
g eines solchen Präparates werden in iooccm Wasser gelöst und die Lösungdurch
Zugabe von verdünnter Essigsäure auf Pii 4,5 eingestellt. Man fÜgt 20
- Kaolin hinzu, rührt während 1/2 Stunde und trennt hierauf das Kaolin durch
Schleudern ab. Der an Kaolin adsorbierte Wirkstoff wird durch zweimaliges Behandeln
mit je So ccin io%iger Ammonphosphatlösung eluiert; die vereinigten Eluate dialysiert
man 24 Stunden gegen destilliertes Wasser und dampft hierauf die salzfreie Hormonlösung
bei niedriger Temperatur im Vakuum zur Trockne ein. Man erhält iß g
eines
Präparates, welches einen Zuckergehalt von 17,5 Oilo (auf Mannose berechnet)
aufweist und im Tierversuch eine Wirksamkeit von etwa i2oooRE/g besitzt.
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Beispiel 3
Ein Rohextrakt aus Schafshypophysen, der, auf den
Trockenrückstand berechnet, einen kolorimetrisch bestimmten Mannosegehalt von weniger
als o,5o,o und eine biologische Wirksamkeit von 25oRE je Gramm Trokkenpulver
aufweist, wird unter ständigem Umrühren mit pulverisiertem Ammonsulfat versetzt.
bis der Sättigungsgrad des Salzes in der Lösung 400/0 beträgt. Man trennt den ausfallenden
Niederschlag durch Schleudern ab; er ist frei von Mannose und hat keine Wirkung
auf die Ovarien juveniler Ratten. Die überstehende, Ammonsulfat enthaltende Lösung
wird durch weiteren Zusatz des Salzes auf einen Sättigungs- rad voll 7
5 #f0 gebracht, wobei wiederum eine Fällung entsteht, die nunmehr die
ganze gonadotrope C ZD Wirksamkeit des Ausgangsextraktes enthält, eine Aktivität
von i RE je mg Trokkenpräparat und einen Mannosegehalt von annähernd dem
fünffachen Wert des Aus-,gangsmaterials.
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Beispiel 4 Der nach Beispie13 durch fraktionierte Aussalzung von großen
Mengen unwirksamen Begleitstoffen befreite, gonadotrop wirksame Niederschlag wird
einer weiteren Reinigung durch Adsorption an Kaolin in saurer Lösung, gemäß Beispiel
2, unterworfen. Nach zweimaliger Elution des Adsorbates mit je der fünffachen
Menge o,oi n-Natronlauge fällt man die wirksame Substanz aus dem mit Essigsäure
schwach angesäuerten Eluat durch Zugabe des fünffachen Volumens Alkohol aus. Der
ausgefallene Niederschlag stellt nach dem Waschen mit Alkohol und Äther ein fast
weißes, in Wasser leicht lösliches Pulver dar, das eine Wirksamkeit von etwa
6 RE je mg aufweist und dessen kolorimetrische Prüfung einen Mannosegehalt
von 8,50i'o ergibt.