DE69936539T2

DE69936539T2 - Auswahl von tieren nach parental geprägten merkmalen

Info

Publication number: DE69936539T2
Application number: DE69936539T
Authority: DE
Inventors: Leif Andersson; Michel Georges; Geert Spincemaille; Carine Danielle Nezer
Original assignee: Universite de Liege; SEGHERSgentec NV; Melica
Current assignee: Universite de Liege; SEGHERSgentec NV; Melica
Priority date: 1998-12-16
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2008-02-14
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: US7255987B1; US7892736B2; MXPA01006130A; CA2355897C; DK1141418T3; EP1141418B1; PL349521A1; NZ512721A; ES2291048T3; AU779393B2; BR9916362B1; EP1141418A2; RU2262229C2; CA2355897A1; HUP0104603A2; CZ20012159A3; WO2000036143A2; BG105636A; BR9916362A; DE69936539D1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Auswahl von Zuchttieren oder Tieren, die für die Schlachtung vorgesehen sind, so daß diese gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweisen, insbesondere solche, die mit der Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung in Beziehung stehen. Zuchtpläne für Nutztiere haben sich bislang auf landwirtschaftliche Leistungsmerkmale und Schlachtkörperqualität konzentriert. Dies führte zu erheblichen Verbesserungen bei Merkmalen („Traits"), wie Reproduktionserfolg, Milchproduktion, Mager/Fettverhältnis, Fruchtbarkeit, Wachstumsrate und Futtereffizienz. Relativ einfache Leistungstestdaten haben die Basis für diese Verbesserungen gebildet und von ausgewählten Merkmalen wurde angenommen, daß sie durch eine große Anzahl von Genen beeinflußt werden, wobei jedes einen kleinen Effekt hat (das infinitesimale Genmodell). Es gibt nun einige wichtige Änderungen, die in diesem Gebiet auftreten. Erstens wurde damit begonnen, in das Zuchtziel einiger Zuchtorganisationen Fleischqualitätsattribute zusätzlich zu den „traditionellen" Produktionsmerkmalen aufzunehmen. Zweitens häufen sich die Hinweise, daß derzeitige und neue Zuchtzielmerkmale relativ große Effekte einschließen können (bekannt als Haupt-Gene), im Gegensatz zu dem infinitesimalen Modell, auf das sich bis jetzt gestützt wurde.
Moderne DNA-Technologien bieten die Möglichkeit, diese Haupt-Gene auszunutzen, und dieser Ansatz ist ein sehr vielversprechender Weg für die Verbesserung der Fleischqualität, insbesondere, da eine direkte Fleischqualitätsbeurteilung für potentielle Zuchttiere nicht praktikabel ist. Moderne DNA-Technologie kann ebenfalls für andere Merkmale („Traits"), wie beispielsweise das Mager/Fettverhältnis, die Wachstumsrate und die Fütterungseffizienz sehr wirksam sein. Diese Traits sind ebenfalls nicht immer leicht in dem lebenden Tier zu messen.
Die Hinweise für mehrere der Haupt-Gene wurden ursprünglich unter Verwendung von Segregationsanalysen, das heißt ohne jegliche DNA-Marker Information, erhalten. Später wurden molekulare Studien durchgeführt, um die Position dieser Gene in der genetischen Karte aufzuklären. In der Praxis sind mit Ausnahme für Allele mit sehr großem Effekt DNA Studien erforderlich, um die genetische Natur der meisten Merkmale von ökonomischer Wichtigkeit zu analysieren. DNA Marker können verwendet werden, um Gene oder Allele zu lokalisieren, die für qualitative Traits, wie beispielsweise Fellfarbe, verantwortlich sind, und sie können ebenfalls verwendet werden, um Gene oder Allele mit erheblichen Effekten auf quantitative Traits wie Wachstumsrate, IMF etc. nachzuweisen. In diesem Fall wird die Methode als QTL (Quantitative Trait Locus) Kartierung bezeichnet, wobei ein QTL mindestens einen Teil des Nukleinsäuregenoms eines Tieres umfaßt, auf dem genetische Information lokalisiert ist, die fähig ist, den quantitativen Trait (in dem Tier oder seinen Nachkommen) zu beeinflussen. Informationen auf DNA Ebene können nicht nur helfen, ein spezifisches Haupt-Gen in einer Population zu bestimmen, sondern unterstützen ebenfalls bei der Auswahl eines quantitativen Trait, nach dem bereits ausgewählt wurde. Molekulare Information kann zusätzlich zu phänotypischen Daten die Genauigkeit der Auswahl und dadurch der Auswahl-Antwort steigern.
Die Verbesserung der Fleischqualität oder Schlachtkörperqualität betrifft nicht nur die Änderung der Niveaus von Traits wie Zartheit oder Marmorierung, sondern betrifft ebenfalls die Steigerung der Gleichmäßigkeit. Die Existenz von Haupt-Genen bietet exzellente Möglichkeiten zur Verbesserung der Fleischqualität, da sie es erlaubt, daß große Schritte in die gewünschte Richtung gemacht werden. Zweitens wird es dabei helfen, die Abweichung zu reduzieren, da wir relevante Gene in unseren Produkten festlegen können. Ein anderer Aspekt ist, daß die Auswahl nach Haupt-Genen die Differenzierung für be stimmte Absatzgebiete erlaubt. Studien werden in verschiedenen Spezies durchgeführt, insbesondere in Schweinen, Schafen, Hirschen und Schlachtrindern.
Insbesondere hat die starke Auswahl bezüglich der Fleischproduktion zu Tieren mit extremer Muskelkraft und Magerkeit in mehreren Viehspezies geführt. In den letzen Jahren ist es möglich geworden, mehrere der Gene zu kartieren und zu klonieren, die diese Phänotypen verursachen, was den Weg zu einer effizienteren Marker-unterstützten Auswahl, gerichteten Wirkstoffentwicklung (leistungssteigernde Produkte) und Transgenese ebnet. Von Mutationen in dem Ryanodin Rezeptor (Fuji et al, 1991; MacLennan und Phillips, 1993) und Myostatin (Grobet et al, 1997; Kambadur et al, 1997; McPherron und Lee, 1997) wurde gezeigt, daß sie muskuläre Hypertrophien in Schweinen bzw. Rindern verursachen, während Gene mit Haupteffekten auf Muskelkraft und/oder Fetteinlagerung beispielsweise auf dem Schweinechromosom 4 (Andersson et al, 1994) und dem Schafchromosom 18 (Cocket et al, 1996) kartiert wurden.
Obwohl es Erfolge bei der Identifizierung von QTLs gab, ist die Information derzeit jedoch von begrenztem Nutzen innerhalb kommerzieller Zuchtprogramme. Viele, die auf diesem Gebiet arbeiten, schlußfolgern, daß es notwendig ist, die spezifischen Gene zu identifizieren, die dem QTL zu Grunde liegen. Dies ist eine beträchtliche Aufgabe, da die QTL Region normalerweise relativ groß ist und viele Gene enthalten kann. Die Identifizierung der relevanten Gene aus den vielen, die umfaßt sein können, bleibt damit ein signifikantes Hindernis bei Farmtieren.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Auswählen eines Nutztieres bereit, so daß dieses gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist, bei dem man das Tier auf das Vorhandensein eines elterlich geprägten qualita tiven oder quantitativen Trait Locus (QTL) testet. Ein Nutztier wird hier als ein Tier definiert, das ausgewählt oder von einem Tier abgeleitet worden ist, welches daraufhin ausgewählt wurde, daß es gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist.
Nutztiere stellen eine reichhaltige Quelle genetischer und phänotypischer Variation bereit, wobei die herkömmliche Domestikation die Auswahl eines Tieres oder seiner Nachkommen umfaßt, so daß dieses/diese gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist/aufweisen. Dieser Auswahlprozeß wurde im letzten Jahrhundert durch das wachsende Verständnis und die Nutzbarmachung der Regeln der Vererbung nach Mendel unterstützt. Eines der Hauptprobleme in Zuchtprogrammen von Nutztieren ist die negative genetische Korrelation zwischen reproduktiver Kapazität und Produktionsmerkmalen. Dies ist beispielsweise der Fall bei Rindern (eine hohe Milchproduktion führt normalerweise zu dünnen Kühen und Bullen), bei Geflügel, Hähnchenlinien haben ein geringes Niveau der Eiproduktion und Legehennen haben normalerweise ein sehr geringes Muskelwachstum), bei Schweinen (sehr fruchtbare Säue sind im allgemeinen fett und haben verhältnismäßig wenig Fleisch) oder bei Schafen (stark fruchtbare Zuchten haben eine geringe Schlachtkörperqualität und umgekehrt). Die Erfindung zeigt nun, daß die Kenntnis des elterlich geprägten Charakters verschiedener Traits es erlaubt, beispielsweise Vatertierlinien auszuwählen, die homozygot für einen väterlich geprägten QTL sind, der beispielsweise mit der Muskelproduktion oder dem Wachstum in Verbindung steht; die Auswahl nach solchen Traits kann daher in Muttertierlinien weniger streng erfolgen, was die reproduktive Qualität begünstigt. Das Phänomen der genetischen oder elterlichen Prägung ist für die Auswahl von Nutztieren niemals verwendet worden, es wurde niemals als praktikabel angesehen, diese schwer faßbare genetische Eigenschaft in praktischen Zuchtprogrammen einzusetzen. Die Erfindung stellt ein Zuchtprogramm bereit, bei dem die Kenntnis der elterlich geprägten Eigenschaft eines gewünschten Traits, wie hier gezeigt, zu einem Zuchtprogramm mit einem modifizierten Tiermodell führt, beispielsweise in einem BLUP Programm. Dies steigert die Genauigkeit der Zuchtwerteinschätzung und beschleunigt die Auswahl verglichen mit herkömmlichen Zuchtprogrammen. Bis jetzt wurde die Auswirkung eines elterlich geprägten Traits bei der Beurteilung eines herkömmlichen BLUP Programmes vernachlässigt; verwenden und verstehen der elterlichen Eigenschaft des gewünschten Traits, wie von der Erfindung bereitgestellt, ermöglicht die Auswahl basierend auf elterlicher Prägung, selbst ohne das Testen von DNA. Beispielsweise wird das Auswählen von Genen, die durch eine väterliche Prägung charakterisiert sind, bereitgestellt, um zu helfen, die Einheitlichkeit zu steigern; ein „terminales" Elternteil, das homozygot für die „guten oder gewollten" Allele ist, wird sie an alle Nachkommen weitergeben, unabhängig von den Allelen des anderen Elternteils, und die Nachkommen werden alle die gewünschten Allele des Elternteils exprimieren. Dies führt zu mehr einheitlichen Nachkommen. Allele, die von der mütterlichen Seite interessant oder bevorzugt sind, sind häufig diejenigen, die entgegengesetzte Effekte zu den Allelen der väterlichen Seite haben. Zum Beispiel könnten in Fleischtieren, wie beispielsweise Schweinen, in den Muttertierlinien Allele, die mit Fleischqualitätsmerkmalen wie beispielsweise intramuskulärer Fett- oder Muskelmasse in Verbindung stehen, festgelegt werden, während Allele, die mit reduziertem Rückenfett in Verbindung stehen, in den Vatertierlinien festgelegt werden könnten. Andere wünschenswerte Kombinationen sind beispielsweise Fruchtbarkeit und/oder Milchausbeute in der weiblichen Linie mit Wachstumsraten und/oder Muskelmasse in den männlichen Linien.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines Nutztieres bereit, so daß dieses gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist, bei dem man eine Nukleinsäureprobe des Tieres auf die Anwesenheit eines elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL) testet. Eine Nukleinsäureprobe kann im allgemeinen aus verschiedenen Teilen des Körpers des Tieres durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden. Herkömmliche Proben für den Zweck des Nukleinsäure Testens sind Blutproben oder Haut- oder Schleimhautoberflächenproben, aber Proben aus anderen Geweben können genauso verwendet werden, insbesondere können Spermienproben, Eizellen- oder Embryoproben verwendet werden. In solch einer Probe kann die Anwesenheit und/oder Sequenz einer spezifischen Nukleinsäure, sei es DNA oder RNA, mit Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, wie beispielsweise Hybridisierung oder Nukleinsäureamplifikation oder Sequenzierungstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind. Die Erfindung stellt das Testen solch einer Probe auf die Anwesenheit einer Nukleinsäure bereit, wobei ein QTL oder Allel, das damit assoziiert ist, mit dem Phänomen der elterlichen Prägung in Verbindung steht, beispielsweise wo bestimmt wird, ob ein väterliches oder ein mütterliches Allel des QTL fähig ist, überwiegend in dem Tier exprimiert zu werden.
Der Zweck von Zuchtprogrammen bei Viehbeständen ist, die Leistungen der Tiere durch Verbesserung ihrer genetischen Zusammensetzung zu steigern. Im wesentlichen entsteht diese Verbesserung durch Steigerung der Frequenz der günstigsten Allele für die Gene, die die interessierenden Leistungseigenschaften beeinflussen. Diese Gene werden als QTL bezeichnet. Bis zum Beginn der neunziger Jahre, wurde eine genetische Verbesserung durch die Verwendung von biometrischen Verfahren erreicht, aber ohne molekulare Kenntnis des zugrundeliegenden QTL.
Seit Beginn der neunziger Jahre und als Folge der neuesten Entwicklungen in der Genomik ist es vorstellbar, den QTL, der einem interessierenden Trait zugrunde liegt, zu identifizieren. Die Erfindung bietet jetzt die Identifizierung und Verwendung von elterlich geprägten QTLs, die nützlich für die Auswahl von Tieren sind, durch Kartierung von quantitativen Trait Loci. Es wird noch einmal betont, daß das Phänomen der genetischen oder väterlichen Prägung bei der Auswahl von Nutztieren niemals verwendet wurde, es wurde niemals als geeignet angesehen, diese schwer faßbare genetische Eigenschaft in praktischen Zuchtprogrammen einzusetzen. Beispielsweise fanden Kovacs und Kloting (Biochem. Mol. Biol. Int. 44:399-405, 1998), bei denen elterliche Prägung nicht erwähnt und nicht angedeutet wird, eine Verknüpfung eines Traits in weiblichen Ratten, aber nicht in männlichen, was eine mögliche geschlechtsspezifische Assoziierung mit einer chromosomalen Region nahelegt, welche selbstverständlich eine elterliche Prägung ausschließt, ein Phänomen, bei dem der geprägte Trait eines Elternteils bevorzugt ist, aber geschlechtsspezifisch in seinen oder ihren Nachkommen exprimiert wird.
Die Erfindung bietet die anfängliche Lokalisierung eines elterlich geprägten QTL auf dem Genom durch Verknüpfungsanalyse mit genetischen Markern, und die tatsächliche Identifizierung des/der elterlich geprägten Gens/Gene und kausaler Mutationen darin. Die molekulare Kenntnis eines solchen elterlich geprägten QTL erlaubt effizientere Zuchtformen, die hiermit zur Verfügung gestellt werden. Anwendungen von molekularer Kenntnis elterlich geprägter QTLs in Zuchtprogrammen schließt ein: Marker-unterstützte Segregationsanalyse, um die Segregation von funktionell unterschiedlichen elterlich geprägten QTL Allelen in den interessierenden Populationen zu identifizieren, Marker-unterstützte Selektion (MAS), die innerhalb von Linien durchgeführt wird, um die genetische Antwort durch Steigerung der Selektionsgenauigkeit, Selektionsintensität oder durch Reduzierung des Generationsintervalls unter Verwendung des Verstehens des Phänomens der elterlichen Prägung zu erhöhen, Mar ker-unterstützte Introgression (MAI), um günstige elterlich geprägte QTL Allele von einem Donor auf eine Empfängerpopulation zu übertragen, genetisches Engineering des identifizierten elterlichen QTL und genetische Modifikation des Zuchtbestands unter Verwendung von transgenen Technologien, Entwicklungen von leistungssteigernden Produkten unter Verwendung von gerichteter Wirkstoffentwicklung, wobei die molekulare Kenntnis des QTL ausgenutzt wird.
Die Erfinder unternahmen zwei unabhängige Experimente, um die praktische Verwendbarkeit der elterlichen Prägung eines QTL zu bestimmen.
In einem ersten Experiment, das in einer zuvor beschriebenen Piétrain x Large White Zwischenkreuzung („intercross") durchgeführt wurde, wurde die Wahrscheinlichkeit der Daten unter einem Modell von väterlicher (nur das väterliche Allel wurde exprimiert) und mütterlicher (nur das mütterliche Allel wurde exprimiert) Prägung berechnet und mit der Wahrscheinlichkeit der Daten unter einem Modell eines herkömmlichen „Mendelschen" QTL verglichen. Die Ergebnisse zeigten auffallend, daß der QTL tatsächlich väterlich exprimiert wurde, das QTL Allel (Piétrain oder Large White), das von der F1 Sau geerbt wurde, hatte keine Auswirkungen auf die Schlachtkörperqualität und die Quantität der F₂ Nachkommen. Es wurde beobachtet, daß sehr signifikante lod-Werte erhalten wurden, wenn auf die Anwesenheit eines väterlich exprimierten QTL getestet wurde, während es überhaupt keine Hinweise für die Segregation eines QTL gab, wenn die Chromosomen, die von den Säuen übertragen wurden, untersucht wurden. Die selbe Tendenz wurde für alle Traits beobachtet, was zeigt, daß das selbe geprägte Gen verantwortlich für die Effekte ist, die für die verschiedenen Traits beobachtet wurden. Tabelle 1 zeigt die maximale Wahrscheinlichkeit („maximum likelihood” (ML)) phänotypischen Mittelwerte für die F₂ Nachkommen, sortiert nach vererbten väterlichen QTL Allelen.
In einem zweiten Experiment, das in der Wild Boar X Large White Zwischenkreuzungen durchgeführt wurde, wurden QTL Analysen der Körperzusammensetzung, Fettigkeit, Fleischqualität und Wachstum Traits mit der Chromosom 2 Karte durchgeführt, unter Verwendung eines statistischen Modells, das auf die Anwesenheit eines geprägten Effektes testet. Ein eindeutiger Hinweis für einen väterlich exprimierten QTL, der an der sehr distalen Spitze des 2p lokalisiert ist, wurde erhalten (2; Tabelle 1). Die deutliche väterliche Expression eines QTL wird durch die „least squares means" (kleinste Durchschnitts-Quadrate) gezeigt, die in zwei Klassen fielen, welche dem Populationsursprung des väterlich geprägten Allels folgten (Tabelle 1). Für einen gegebenen väterlich geprägten QTL, kann die Implementierung von Marker-unterstützer Segregationsanalyse, Selektion (MAS) und Introgression (MAI) unter Verwendung genetischer Marker durchgeführt werden, die mit dem QTL in Verbindung stehen, genetischer Marker, die in einem Verknüpfungsungleichgewicht mit dem QTL stehen, oder Verwendung der tatsächlichen kausalen Mutationen innerhalb des QTL. Ein Verständnis des Eltern-Ursprungs („parent-of-origin") Effektes, welcher einen QTL charakterisiert, erlaubt seine optimale Verwendung in Zuchtprogrammen. Tatsächlich führen Markerunterstützte Segregationsanalysen unter einem Modell der elterlichen Prägung zu besseren Einschätzungen von QTL Alleleffekten. Des weiteren erlaubt es die Anwendung spezifischer Zuchtpläne, einen QTL optimal auszunutzen. In einer Ausführungsform der Erfindung würden die günstigsten QTL Allele in Zuchttierlinien festgelegt werden und beispielsweise verwendet werden, um kommerzielle, gekreuzte Männchen durch Markerunterstützte Selektion (MAS, innerhalb der Linien) und Markerunterstützte Introgression (MAI, zwischen den Linien) zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform würden die ungünstigsten QTL Allele in den Tierlinien festgelegt werden, die verwendet werden, um kommerziell gekreuzte Weibchen durch MAS (innerhalb der Linien) und MAI (zwischen den Linien) zu erzeugen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Tier ein Schwein. Es ist beispielsweise anzumerken, daß die Erfindung die Erkenntnis zur Verfügung stellt, daß heutzutage die Hälfte der Nachkommen von kommerziell populären Piétrain_x Large White Kreuzungsebern einen ungünstigen Large White Muskelmasse QTL vererben, wie von der Erfindung gezeigt wird, was beträchtliche Verluste verursacht, und die Erfindung bietet jetzt beispielsweise die Möglichkeit, die bessere Hälfte der Population in dieser Hinsicht auszuwählen. Es ist jedoch ebenfalls möglich, kommerzielle Saulinien auszuwählen, die mit den in den Ebern ungünstigen Allelen angereichert sind, was es erlaubt, die Säue mit anderen Allelen auszustatten, die beispielsweise für reproduktive Zwecke wünschenswerter sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform eines Verfahrens, das von der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, ist der QTL an einer Position lokalisiert, die einem QTL entspricht, der auf Chromosom 2 im Schwein lokalisiert ist. Es ist beispielsweise aus vergleichenden Kartierungsdaten zwischen Schwein und Mensch, einschließlich bidirektionalen Chromosomfärbungen, bekannt, daß SSC2p homolog zu HSA11pter-q13^11,12 ist. Von HSA11pter-q13^- ist bekannt, daß es einen Cluster von geprägten Genen enthält: IGF2, INS2, H19, MAH2, P57^KIP2, K_vLQTL1, Tapa1,/CD81, Orctl2, Impt1 und Ip1. Der Cluster geprägter Gene, der in HSA11pter-q13 lokalisiert ist, ist durch die 8 mütterlich exprimierten Gene H19, MASH2, P57^KIP2, K_vLQTL1, TAPA1/CD81, ORCTL2, IMPT1 und IP1 und zwei väterlich exprimierte Gene: IGF2 und INS charakterisiert. Johanson et al (Genomics 25:682-690, 1995) und Reik et al (Trends in Genetics, 13:330-334, 1997) zeigen jedoch, daß die Aufenthaltsorte dieser Loci in verschiedenen Tieren nicht klar sind. Beispielsweise stimmen die HSA11 und MMU7 Loci untereinander nicht überein, die MMU7 und SSC2 Loci stimmen nicht überein, wohingegen die HSA11 und SSC2 Loci übereinzustimmen scheinen und es wird keine Leitlinie gegeben, wo ein oder mehrere der beispielsweise oben identifizierten elterlich exprimierten individuellen Genen auf den drei Spezies Chromosomen lokalisiert sind.
Andere Nutztiere wie beispielsweise Rinder, Schafe, Geflügel und Fisch haben ähnliche Regionen in ihrem Genom, die solch einen Cluster von geprägten Genen oder QTLs enthalten, und die Erfindung stellt hiermit die Verwendung dieser orthologen Regionen anderer Nutztiere bei der Anwendung des Phänomens der elterlichen Prägung in Zuchtprogrammen bereit. In Schweinen ist dieser Cluster um die Position 2p1.7 auf Chromosom 2 kartiert, jedoch werden in einem Verfahren, wie es von der Erfindung bereit gestellt wird, (Fragmente von) den mütterlich oder väterlich exprimierten orthologen oder homologen Genen oder QTLs vorteilhafterweise in anderen Tieren genauso für Zucht- und Auswahlzwecke verwendet. Beispielsweise wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem der QTL mit der potentiellen Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung in Beziehung steht, vorzugsweise mit geringen Effekten auf andere Merkmale/Traits wie beispielsweise Fleischqualität und tägliche Zunahme des Tieres oder bei dem der QTL mindestens einen Teil eines Insulinähnlichen Wachstumsfaktor-2 (IGF2) Allels umfaßt. Reik et al (Trends in Genetics, 13:330-334, 1997) erklärt, daß dieses Gen in Menschen mit dem Beckwith-Wiedemann Syndrom in Beziehung steht, ein offensichtlich elterlich geprägtes Krankheitssyndrom, das am häufigsten in menschlichen Föten gesehen wird, wo das Gen eine wichtige Rolle in der pränatalen Entwicklung spielt. Es wird kein Zusammenhang gezeigt oder nahegelegt, daß die postnatale Entwicklung mit der Muskelentwicklung oder Fettigkeit in (Nutz-) Tieren in Verbindung steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines Schweines bereit, so daß dieses gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist, bei dem man eine Probe des Schweins auf die Anwesenheit eines Quantitativen Trait Locus (QTL) testet, der auf einer Sus scrofa Chromosom 2 Kartierung an Position 2p1.7 lokalisiert ist. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung genetischer Marker für das telomere Ende des Schweinechromosom 2p in einer Markerselektion (MAS) eines elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL), der die Schlachtkörperausbeute und Qualität in Schweinen beeinflußt. Des weiteren bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung genetischer Marker, die mit dem IGF2 Locus in MAS in Schweinen assoziiert sind, wie beispielsweise Polymorphismen und Mikrosatelliten und andere charakterisierende Nukleinsäuresequenzen, die hier gezeigt sind, wie beispielsweise in den 4 bis 10 gezeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung einen QTL bereit, der an der distalen Spitze des Sus scrofa Chromosom 2 lokalisiert ist und Effekte auf verschiedene Messungen der Schlachtkörperqualität und Quantität, insbesondere Muskelmasse und Fetteinlagerung hat.
In einem ersten Experiment wurde eine QTL Kartierungsanalyse in einer Wild Boar X Large White Zwischenkreuzung durchgeführt, wobei 200 F₂ Individuen gezählt wurden. Die F₂ Tiere wurden bei einem Lebendgewicht von mindestens 80 Kilogramm oder einem maximalen Alter von 190 Tagen getötet. Phänotypische Daten bezüglich des Geburtsgewichtes, Wachstums, Fetteinlagerung, Körperzusammensetzung, Gewicht der internen Organe und Fleischqualität wurden gesammelt; eine detaillierte Beschreibung der phänotypischen Traits wird von Anderson et al¹ und Anderson-Eklund et al⁴ bereitgestellt.
Ein QTL (ohne jeden signifikanten Effekt auf die Rückenfettdicke) an einem unspezifizierten Locus am proximalen Ende des Chromosoms 2 mit moderatem Effekt auf die Muskelmasse und ungefähr 30cM entfernt von dem elterlich geprägten QTL, der hier berichtet wird, lokalisiert, wurde zuvor von den Erfindern berichtet; wo hingegen der QTL, wie er jetzt zur Verfügung gestellt wird, eine sehr große Wirkung aufweist, was die mindestens 20-30% Varianz erklärt, und was den QTL der vorliegenden Erfindung kommerziell sehr attraktiv macht, was um so mehr gilt, da der vorliegende QTL elterlich geprägt ist. Die Markerkarte des Chromosoms 2p wurde als Teil dieser Erfindung durch Hinzufügung von Mikrosatellitenmarkern verbessert, um den gesamten Chromosomenarm abzudecken. Die folgenden Mikrosatellitenmarker wurden verwendet: Swc9, Sw2443, Sw2623, Swr2516, alle vom distalen Ende des 2p⁷. QTL Analysen der Körperzusammensetzung, Fettigkeit, Fleischqualität und Wachstum Traits wurden mit der neuen Chromosom 2 Karte durchgeführt. Eindeutige Hinweise auf einen QTL, der an der distalen Spitze des 2p lokalisiert ist, wurden erhalten, (1; Tabelle 1). Der QTL hatte sehr große Auswirkungen auf den Magerfleischgehalt in dem Speck und erklärte einen erstaunlichen 30% Anteil der Rest-Phänotyp Varianz in der F₂ Population. Starke Auswirkungen auf die Fläche des Longissimus dorsi Muskels, auf das Gewicht des Herzens und die Rückenfettdicke (subkutanes Fett) wurden ebenfalls festgestellt. Ein gemäßigter Effekt auf ein Fleischqualitätstrait, Reflexionswert, wurde gezeigt. Der QTL hatte keine signifikante Auswirkung auf das abdominale Fett, das Geburtsgewicht, das Wachstum, das Gewicht der Leber, Niere oder Milz (Daten nicht gezeigt). Das Large White Allel an diesem QTL war mit größerer Muskelmasse und reduzierter Rückenfettdicke assoziiert, was in Übereinstimmung mit dem Unterschied zwischen dieser Zucht und der Wild Boar Population steht.
In einem zweiten Experiment wurde eine QTL Kartierung in einer Piétrain X Large White Zwischenkreuzung, die 1125 F₂ Nachkommen umfaßte, durchgeführt. Die elterlichen Large White und Piétrain Zuchten unterscheiden sich in einer Anzahl von ökonomisch wichtigen Phänotypen. Piétrains sind berühmt für ihre außergewöhnliche Muskelkraft und Magerkeit¹⁰ (2), während Large Whites eine ausgezeichnete Wachstumsleistung zeigen. Einundzwanzig verschiedene Phänotypen, die die Wachstumsleistung (5), Muskelkraft (6), Fetteinlagerung (6) und Fleischqualität (4) messen, wurden für alle F₂ Nachkommen aufgezeichnet. Um den QTL, der den genetischen Unterschieden zwischen diesen Zuchten zugrunde liegt, zu kartieren, führten die Erfinder einen Gesamtgenomscan unter Verwendung von Mikrosatellitenmarkern auf einer anfänglichen Probe von 677 F₂ Individuen durch. Die folgende Mikrosatellitenmarkerkarte wurde verwendet, um Chromosom 2 zu analysieren: SW2443, SWC9 und SW2623, SWR2516-(0,20)-SWR783-(0,29)-SW240-(0,20)-SW776(0,08)-S0010-(0,04)-SW1695-(0,36)-SWR308. Eine Analyse des Schweinechromosom 2 unter Verwendung eines Maximum Likelihood Multipunkt Algorithmus ergab hoch signifikante Iod-Werte (bis zu 20) für drei der sechs Phänotypen, die die Muskelkraft messen (% Magerschnitte, % Schinken, % Lende) und drei der sechs Phänotypen, die die Fetteinlagerung messen (Rücken-Fettdicke (BFT), % Rückenfett, % Fettschnitte), an dem distalen Ende des kurzen Arms des Chromosoms 2 (1). Positive Iod-Werte wurden in der entsprechenden Chromosomenregion für die verbliebenen sechs Muskelkrafts- und Fettphänotypen erhalten, wobei sie jedoch nicht die experimentartigen Signifikanzschwellenwerte erreichten (α = 5%). Es gab keinen Hinweis auf eine Auswirkung des entsprechenden QTL auf die Wachstumsleistung (einschließlich Geburtsgewicht) oder aufgezeichnete Fleischqualitätsmessungen (Daten nicht gezeigt). Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde die übrige Probe von 355 F₂ Nachkommen für die vier am meisten distal gelegenen 2p Marker genotypisiert und QTL Analyse wurde für die Traits durchgeführt, die die höchsten Iod-Werte in der ersten Analyse ergaben. Iod-Werte reichten von 2,1 bis 7,7, was eindeutig das Vorhandensein eines Haupt QTL in dieser Region bestätigt. Die Tabelle 2 zeigt die entsprechenden ML Einschätzungen für die drei genotypischen Mittel, genauso wie die Rest-Varianz. Hinweise, die auf einer Marker-unterstützten Se gregationsanalyse basierten, wiesen auf eine Rest-Segregation an diesem Locus innerhalb der Piétrian Population hin.
Diese Experimente zeigen daher eindeutig die Existenz eines QTL mit einem Haupteffekt auf die Schlachtkörperqualität und Quantität am telomeren Ende des Schweinechromosomenarms 2p; die wahrscheinliche Existenz einer allelischen Serie an diesem QTL mit mindestens drei Allelen: Wild-Boar < Large White < Piétrain, und möglicherweise mehr angesichts der beobachteten Segregation innerhalb der Piétrain Zucht.
Die Auswirkungen des identifizierten QTL auf die Muskelmasse und Fetteinlagerung sind in der Tat groß, wobei sie in der selben Größenordnung wie die liegen, die für den CRC Locus beschrieben wurden, jedoch augenscheinlich ohne die schädlichen Auswirkungen auf die Fleischqualität. Wir nehmen an, daß beide Loci gemeinsam bis zu 50% des Piétrain gegenüber des Large White Zucht Unterschieds für Muskelkraft und Magerkeit erklären. Der QTL hatte sehr starke Auswirkungen auf den Magerfleischanteil im Schinken und erklärte erstaunliche 30% der Rest-phänotypischen Varianz in der F₂ Population. Große Auswirkungen auf die Fläche des Longissimus dorsi Muskels, auf das Gewicht des Herzens und auf die Rückenfettdicke (subkutanes Fett) wurden ebenfalls festgestellt. Ein gemäßigter Effekt auf ein Fleischqualitätstrait, Reflexionswert, wurde gezeigt. Der QTL hatte keine signifikante Auswirkung auf abdominales Fett, Geburtsgewicht, Wachstum, Gewicht der Leber, Niere oder Milz (Daten nicht gezeigt). Das Large White Allel an diesem QTL war, wenn es mit dem Wild Boar Allel verglichen wurde, mit einer größeren Muskelmasse und reduzierter Rückenfettdicke assoziiert, was in Übereinstimmung mit dem Unterschied zwischen dieser Zucht und der Wild Boar Population ist. Der stark prägende Effekt, der für alle betroffenen Merkmale beobachtet wurde, zeigt, daß ein einziger ursächlicher Locus beteiligt ist. Die pleiotropen Effekte auf die Skelettmuskulaturmasse und die Größe des Herzens scheinen von einem physiologischen Standpunkt aus adaptiv zu sein, da eine größere Muskelmasse einen größeren Herzausstoß erfordert.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines Schweines bereit, so daß es gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist, bei dem man eine Probe des Schweins auf die Anwesenheit eines Quantitativen Trait Locus (QTL), der auf einer Sus scrofa Chromosom 2 Kartierung an Position 2p1.7 lokalisiert ist, testet, wobei der QTL mindestens einen Teil des Sus scrofa Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-2 (IGF2) Allels oder ein genomisches Gebiet, das nah dazu benachbart ist, umfaßt, wie beispielsweise Polymorphismen und Mikrosatelliten und andere charakterisierende Nukleinsäuresequenzen, die hier gezeigt sind, wie beispielsweise in 4 bis 10 gezeigt. Die wichtige Rolle des IFG2 für die pränatale Entwicklung ist sowohl von Knockout Mäusen genauso wie von dessen ursprünglicher Rolle beim humanen Beckwith-Wiedemann Syndrom gut dokumentiert. Diese Erfindung zeigt eine wichtige Rolle der IFG2-Region ebenfalls für die postnatale Entwicklung.
Um die Rolle des Ifg2 zu zeigen, führten die Erfinder folgende drei Experimente durch:
Ein genomischer IGF2 Klon wurde durch Screenen einer Schweine BAC Bibliothek isoliert. FISH Analysen mit diesem BAC Klon gaben ein stark übereinstimmendes Signal auf dem terminalen Teil des Chromosoms 2p.
Ein polymorphor Mikrosatellit ist in der 3'UTR des IGF2 in Mäusen (Genbank U71085), Menschen (Genbank S62623), und Pferd (Genbank AF020598) lokalisiert. Die mögliche Anwesenheit eines entsprechenden porcinen Mikrosatelliten wurde durch direkte Sequenzierung der IFG2 3'UTR unter Verwendung des BAC Klons untersucht. Ein komplexer Mikrosatellit wurde ungefähr 800bp strangabwärts von dem Stopkodon identifiziert; ein Sequenzvergleich ergab, daß dieser Mikrosatellit identisch zu einem zuvor beschriebenen anonymen Mikrosatelliten, Swc9⁶ war. Dieser Marker wurde in den anfänglichen QTL Kartierungsexperimenten verwendet und seine Lage auf der genetischen Karte stimmte mit der am meisten wahrscheinlichen Position des QTLs sowohl in dem Piétrain x Large White und in dem Large White x Wild Boar Stammbaum überein.
Die Analyse der Skelettmuskulatur und Leber cDNA aus 10 Wochen alten Föten, die heterozygot für eine nt241 (G-A) Transversion im zweiten Exon des porcinen IGFII Gens und SWC9 waren, zeigte, daß das IGFII Gen beim Schwein ebenfalls in diesen Geweben geprägt ist und nur von dem väterlichen Allel exprimiert wird.
Basierend auf einer publizierten cDNA Sequenz¹⁶ einer porcinen erwachsenen Leber entwarfen die Erfinder Primer Paare, die es erlaubten, die gesamte IgfII kodierende Sequenz mit 222bp einer Leader und 280bp einer Trailor Sequenz aus adulter Skelettmuskel cDNA zu amplifizieren. Piétrain und Large White RT-PCR Produkte wurden sequenziert, was zeigte, daß die kodierenden Sequenzen in beiden Zuchten und mit der publizierten Sequenz identisch sind. Es wurde jedoch eine G zu A Transition in der Leader Sequenz, die dem Exon 2 im Menschen entspricht, gefunden. Der herkömmlichen Nomenklatur folgend, wird dieser Polymorphismus als nt241 (G-A) bezeichnet. Wir entwickelten einen Screening Test für diesen einzelnen Nukleotidpolymorphismus 9(SNP) basierend auf der Ligations Amplifikations Reaktion (LAR), was uns erlaubte, den Genotyp unseres Herkunftmaterials zu bestimmen. Basierend auf diesen Daten wurde von IgfII gezeigt, daß es mit dem SWC9 Mikrosatellitenmarker co-lokalisiert (θ = 0%) und sich damit nahezu mit der am meisten wahrscheinlichen Position des QTL deckte und gut innerhalb des 95% Unterstützungsintervalls für den QTL liegt. Nachfolgende Sequenzanalyse zeigte, daß der Mikrosatellitenmarker SWC9 tatsächlich innerhalb der 3'UTR des IgfII Gens lokalisiert ist.
Wie zuvor erwähnt, stellt die Kenntnis dieses QTL ein Verfahren für die Auswahl von Tieren, wie beispielsweise Schweinen mit verbessertem Schlachtkörperwert, bereit. Verschiedene Ausführungsformen der Erfindung sind vorgesehen, einschließlich:
Marker-unterstützte Segregationsanalyse, um die Segregation funktionell unterschiedlicher QTL Allele in den interessierenden Populationen zu identifizieren; Marker-unterstützte Selektion (MAS); die innerhalb der Linien durchgeführt wird, um die genetische Antwort durch Steigerung der Selektionsgenauigkeit, Selektionsintensität oder durch Reduzierung des Generationsintervalls zu erhöhen; Marker-unterstützte Introgression (MAI), um günstige QTL Allele effizient von einem Donor auf eine Empfängerpopulation zu übertragen, wodurch die genetische Anwort in der Empfängerpopulation gesteigert wird. Die Implementierung der Ausführungsformen Marker-unterstützte Segregationsanalyse, Selektion (MAS) und Introgression (MAI) kann unter Verwendung von genetischen Markern durchgeführt werden, die mit dem QTL in Verbindung stehen; genetischen Markern, die in einem Verknüpfungsungleichgewicht mit dem QTL stehen, den tatsächlich kausalen Mutationen innerhalb des QTL.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auswahl eines Schweines bereit, so daß es gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist, bei dem man eine Probe des Schweins auf das Vorhandensein eines Quantitativen Trait Locus (QTL), der auf einer Sus scrofa Chromosom 2 Kartierung an Position 2p1.7 lokalisiert ist, testet, wobei der QTL väterlich exprimiert wird, das heißt von dem väterlichen Allel exprimiert wird. Bei Mensch und Maus ist von Igf2 bekannt, geprägt zu sein und ausschließlich vom väterlichen Allel in verschiedenen Geweben exprimiert zu werden. Die Analyse von Skelettmuskel cDNA aus Schweinen, die heterozygot für den SNP und/oder SWC9 sind, zeigt, daß die selbe Prägung ebenfalls im Schwein vorliegt. Das Verständnis des Eltern-Ursprung Effekts, der den QTL, wie von der Erfindung bereit gestellt, charakterisiert, erlaubt nun die optimale Verwendung in Zuchtprogrammen. Tatsächlich erben heute die Hälfte der Nachkommen von kommerziell populären Piétrain x Large White gekreuzten Ebern das ungünstige Large White Allel, was zu merklichen Verlusten führt. Die Verwendung eines Verfahrens, wie es von der Erfindung zu Verfügung gestellt wird, vermeidet dieses Problem.
Die Erfindung stellt des weiteren eine isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäure oder ein funktionales Fragment, das davon abgeleitet wurde, bereit, die/das einen elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL) oder ein Fragment davon, das fähig ist, von einem elterlichen Allel vorherrschend exprimiert zu werden, umfaßt. Eine solche Nukleinsäure, wie sie von der Erfindung zu Verfügung gestellt wird, verfügbar zu haben, erlaubt das Erzeugen transgener Tiere, wobei günstige Gene in der Lage sind ausschließlich oder vorherrschend von einem elterlichen Allel exprimiert zu werden, wodurch die Nachkommen dieses Tieres homozygot für einen gewünschten Trait mit gewünschten Eigenschaften, die mit dem elterlichen Allel, das exprimiert wird, in Verbindung stehen, ausgestattet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung eine isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäure oder ein Fragment, das davon erhalten wird, bereit, die/das einen synthetischen elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL) oder ein funktionales Fragment davon umfaßt, der/das mindestens von einem Chromosom abgeleitet wurde. Synthetisch beschreibt hier einen elterlich exprimierten QTL, wobei verschiedene Elemente kombiniert sind, die aus verschiedenen Positionen des Genoms von einem oder mehreren Tieren stammen. Die Erfindung stellt rekombinante Nukleinsäure zur Verfügung, wobei Sequenzen, die mit elterlicher Prägung eines QTL in Beziehung stehen, mit Sequenzen kombiniert werden, die sich auf Gene oder günstige Allele eines zweiten QTL beziehen. Solch ein Genkonstrukt wird vorzugsweise verwendet, um transgene Tiere zu erhalten, wobei der zweite QTL mit väterlicher Prägung ausgestattet wurde, im Gegensatz zu dem Vererbungsmuster in dem nativen Tier, aus dem der zweite QTL abgeleitet ist. Solch ein zweiter QTL kann beispielsweise aus dem selben Chromosom abgeleitet sein, in dem die elterliche Prägeregion lokalisiert ist, aber es kann ebenfalls von einem anderen Chromosom derselben oder selbst einer unterschiedlichen Spezies abgeleitet sein. Im Schwein kann solch ein zweiter QTL sich beispielsweise auf ein Östrogen Rezeptor (ESR)-Gen (Rothschild et al, PNAS, 93, 201-201, 1996) oder einen FAT-QTL (Andersson, Science, 263, 1771-1774, 1994) beziehen, der beispielsweise aus einem anderem Schweinechromosom, wie beispielsweise Chromosom 4, abgeleitet wurde. Ein zweiter oder weiterer QTL kann ebenfalls aus einem anderen (Nutz-) Tier oder einem Menschen abgeleitet sein.
Die Erfindung stellt des weiteren eine isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäure oder ein funktionelles Fragment, das davon abgeleitet wurde und zumindest teilweise einem QTL des Schweins entspricht, der auf einer Sus scrofa Chromosom 2 Kartierung an Position 2p1.7 lokalisiert ist, bereit, wobei der QTL mit der potentiellen Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung des Schweins in Beziehung steht und/oder wobei der QTL mindestens einen Teil eines Sus scrofa Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-2 (IGF2) Allels umfaßt, vorzugsweise mindestens eine Region zwischen INS und H19 umfassend oder vorzugsweise von einem domestizierten Schwein abgeleitet ist, wie beispielsweise einem Piétrain, Meishan, Duroc, Landrace oder Large White, oder von einem Wild Boar. Zum Beispiel wurde ein genomischer IGF2 Klon durch Screenen einer porcinen BAC Bibliothek isoliert. FISH Analyse mit diesem BAC Klon gab ein stark überein stimmendes Signal am terminalen Teil des Chromosoms 2p. Ein polymorpher Mikrosatellit ist in der 3'UTR des IGF2 in Mäusen (Genbank U71085), Menschen (Genbank 562623) und Pferd (Genbank AF0205989) lokalisiert. Das mögliche Vorhandensein eines entsprechenden porcinen Mikrosatelliten wurde durch direkte Sequenzierung der IGF2 3'UTR unter Verwendung des BAC Klons untersucht. Ein komplexer Mikrosatellit wurde ungefähr 800bp strangabwärts von dem Stop Codon identifiziert; ein Sequenzvergleich ergab, daß dieser Mikrosatellit identisch zu einem zuvor beschriebenen anonymen Mikrosatelliten, Swc9, ist. PCR Primer wurden entworfen und es wurde gefunden, daß der Mikrosatellit (IGf2ms) hoch polymorph zu den drei verschiedenen Allelen unter den zwei Wild Boar Gründern und weitere zwei unter den acht Large White Gründern war. IGF2ms war vollständig aussagekräftig in der Zwischenkreuzung, da die Ursprungszucht genauso wie der Eltern-Ursprung mit einer Konfidenz für jedes Allel mit jedem F₂ Tier bestimmt werden konnte.
Eine Verknüpfungsanalyse unter Verwendung des Zwischenkreuzungsstammbaums wurde mit IGF2ms und den Mikrosatelliten Sw2443, Sw2623 und Swr2516, die alle vom distalen Ende des 2p⁷ stammen, durchgeführt. IGF2 wurde durch hochsignifikante Iod-Werte (z.B. Z = 89,0, 0 = 0,003 gegenüber Swr2516) eindeutig 2p zugeordnet. Multipunktanalysen, einschließlich zuvor typisierter Chromosom 2 Marker, ergaben die folgende Reihenfolge der Loci (Geschlechts-Durchschnnitt Kartenabstände in Kosambi cM): Sw2443/Swr2516-0,3-IGF2-14,9-Sw2623-10,3-Sw256. Zwischen Sw2443 und Swr2516 wurde keine Rekombinante beobachtet und die vorgeschlagene proximale Lage des IGF2 in Bezug auf diese Loci basiert auf einer einzigen Rekombinanten, was eine Iod-Wert Unterstützung von 0,8 für die berichtete Reihenfolge ergibt. Der am meisten distal gelegene Marker in unserer vorherigen QTL Studie, Sw256, ist ungefähr 25 cM vom distalen Ende der Verknüpfungsgruppe lokalisiert.
Die Erfindung stellt des weiteren die Verwendung einer Nukleinsäure oder eines funktionellen Fragments, das davon erhalten wurde, gemäß der Erfindung in einem Verfahren gemäß der Erfindung bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Verwendung eines Verfahrens gemäß der Erfindung bereitgestellt, um eine Zuchttier oder ein Tier, das für die Schlachtung vorgesehen ist, oder Embryonen oder Samen, die von diesen Tieren erhalten wurden, auszuwählen, so daß diese gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweisen. Insbesondere stellt die Erfindung solch eine Verwendung zur Verfügung, bei der die Eigenschaften in Beziehung zur Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung stehen. Der QTL, wie er von der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, kann ausgenutzt oder verwendet werden, um zum Beispiel den Magerfleischanteil oder die Rückenfettdicke durch Marker-unterstützte Selektion innerhalb von Populationen oder durch Marker-unterstützte Introgression günstiger Allele aus einer Population zu einer anderen zu verbessern. Beispiele für die Marker-unterstützte Selektion unter Verwendung des QTL, wie er von der Erfindung zur Verfügung gestellt wird, sind die Verwendung von Markerunterstützer Segregationsanalyse mit verknüpften Markern oder mit Markern in einem Ungleichgewicht, um funktionell verschiedene QTL Allele zu identifizieren. Des weiteren ist jetzt die Identifizierung einer ursächlichen Mutation in dem QTL möglich, was wiederum dazu führt, funktionell verschiedene QTL Allele zu identifizieren. Solche funktionell verschiedenen QTL Allele, die an der distalen Spitze des Chromosoms 2p lokalisiert sind und große Effekte auf die Skelettmuskelmasse, die Größe des Herzens, und auf die Rückenfettdicke haben, werden ebenfalls von der Erfindung zur Verfügung gestellt. Die Beobachtung eines ähnlichen QTL Effekts in einer Large White x Wild Boar, genauso wie in einer Piétrain x Large White Zwischenkreuzung bietet einen Beweis für die Existenz einer Serie von mindestens drei verschiedenen funktionalen Allelen. Mehr noch deuten vorläufige Beweise, die auf einer Marker unterstützten Segregationsanalyse basieren, auf eine Rest-Segregation an diesem Locus innerhalb der Piétrain Population hin (Daten nicht gezeigt). Das Auftreten einer allelischen Serie, wie sie von der Erfindung bereitgestellt wird, erlaubt die Identifizierung ursächlicher Polymorphismen, von welchen – basierend auf der quantitativen Natur des beobachteten Effekts- es unwahrscheinlich ist, daß sie grobe Genänderungen, sondern vielmehr feine regulatorische Mutationen sind. Die Auswirkungen auf die Muskelmasse der drei Allele liegen in der selben Reihenfolge wie die Züchtungen, in denen sie gefunden werden, das heißt Piétrain Schweine sind muskulöser als Large White Schweine, die wiederum einen höheren Magerfleischanteil als Wild Boars haben. Die Erfindung stellt des weiteren die Verwendung von den Allelen, wie sie von der Erfindung bereit gestellt werden, für in-Linien Auswahl oder für Markerunterstützte Introgression unter Verwendung von verknüpften Markern, Markern im Ungleichgewicht oder Allele, die ursächliche Mutationen umfassen, bereit.
Die Erfindung stellt des weiteren ein Tier zu Verfügung, das durch Verwendung eines Verfahrens gemäß der Erfindung ausgewählt wurde. Zum Beispiel kann nun ein Schwein ausgewählt werden, das dadurch charakterisiert ist, daß es homozygot für ein Allel in einem QTL ist, der auf einer Sus scrofa Chromosom 2 Kartierung an Position 2p1.7 lokalisiert ist, und dieses wird somit von der Erfindung zur Verfügung gestellt. Da der QTL mit der potentiellen Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung des Schweins in Beziehung steht und/oder der QTL mindestens einen Teil eines Sus scrofa Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF2) Allels umfaßt, ist es möglich, vielversprechende Schweine auszuwählen, die für die Zucht oder für die Schlachtung verwendet werden können. Insbesondere wird ein Tier gemäß der Erfindung bereitgestellt, das ein männliches Tier ist. Solch ein männliches Tier, oder seine Spermien oder ein Embryo, der davon erhalten wurde, kann vorteilhafterweise bei der Zucht von Tieren verwendet werden, um Zuchtlinien zu erzeugen oder für endgültige Zuchttiere, die für die Schlachtung vorgesehen sind. In einer bevorzugten Ausführungsform einer solchen Verwendung, wie sie von der Erfindung bereit gestellt wird, wird ein männliches Tier oder seine Spermien, das absichtlich so ausgewählt wurde, daß es homozygot für ein Allel ist, welches die extreme muskuläre Hyperthrophie und Magerkeit verursacht, verwendet, um Nachkommen zu erzeugen, die heterozygot für solch ein Allel sind. Als Folge der väterlichen Allelexpression werden die Nachkommen ebenfalls die günstigen Traits, die zum Beispiel mit der Muskelmasse in Beziehung stehen, zeigen, selbst wenn das weibliche Elternteil einen anderen genetischen Hintergrund hat. Des weiteren ist es nun möglich, das/die weibliche(n) Tier(e) so auszuwählen, daß sie verschiedene Traits aufweisen, zum Beispiel bezüglich der Fruchtbarkeit, ohne einen negativen Effekt auf den Muskelmassen-Trait zu haben, der von dem Allel des ausgewählten männlichen Tieres vererbt wird. Zum Beispiel konnten solche männlichen Tiere früher gelegentlich bei Piétrain Schweinen gesehen werden, aber es war genetisch nicht verstanden, wie diese Traits in Zuchtprogrammen am meisten profitabel verwendet werden konnten.
Des weiteren stellt die Erfindung ein transgenes Tier, Spermien und einen Embryo, der davon abgeleitet wurde, bereit, welche einen synthetischen elterlich geprägten QTL oder ein funktionales Fragment davon, wie von der Erfindung zu Verfügung gestellt, umfassen, das heißt es wird von der Erfindung bereitgestellt, um ein günstiges rekombinantes Allel einzufügen; zum Beispiel den Östrogen Rezeptor-Locus einzufügen, der mit einer gesteigerten Wurfgröße eines Tieres, das homozygot für eine elterlich geprägte Region eines Großelterntieres ist (zum Beispiel der Vater einer hybriden Sau, wenn die Region väterlich geprägt war und der Großvater ein Eber war), in Verbindung steht; ein günstiges mit Fett in Beziehung stehendes Al lel oder mit der Muskelmasse in Beziehung stehendes rekombinantes Allel in eine väterlich geprägte Region einzufügen, und so weiter. Rekombinante Allele, die von der mütterlichen Seite interessierend oder günstig sind, oder häufig diejenigen, die entgegengesetzte Effekte zu Allelen von der väterlichen Seite haben. Zum Beispiel können in Fleischtieren wie beispielsweise Schweinen rekombinante Allele, die mit Fleischqualitätsmerkmalen in Verbindung stehen, wie beispielsweise intra-muskulärem Fett oder Muskelmasse in den Muttertierlinien festgelegt werden, während rekombinante Allele, die mit reduziertem Rückenfett in Verbindung stehen, in den Vatertierlinien festgelegt werden können. Andere wünschenswerte Kombinationen sind beispielsweise Fruchtbarkeit und/oder Milchausbeute in der weiblichen Linie mit Wachstumsraten und/oder Muskelmasse in männlichen Linien.
Die Erfindung wird in der detaillierten Beschreibung weiter erläutert, ohne die Erfindung zu begrenzen.
Detaillierte Beschreibung.
Beispiel 1: Wild Boar x Large White Zwischenkreuzungen Verfahren
Isolierung eines IGF2 BAC Klons und Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). IGF2 Primer (F: 5'-GGCAAGTTCTTCCGCTAATGA-3' und R: 5'-GCACCGCAGAATTACGACAA-3') für die PCR Amplifikation eines Teils des letzten Exons und der 3'UTR wurden auf Basis einer porcinen IGF2 cDNA Sequenz (Genbank X56094) entworfen. Die Primer wurden verwendet, um eine porcine BAC Bibliothek zu screenen und der Klon 253G10 wurde isoliert. Grobe BAC DNA wurde wie beschrieben hergestellt²⁴. Die BAC DNA wurde mit EcoRV linearisiert und mit QIAEXII (QIAGEN GmbH, Deutschland) aufgereinigt. Der Klon wurde mit Biotin-14-dATP unter Verwendung des GIBCO-BRL Bionick Markierungssystems (BRL18246-015) markiert. Porcine Methaphasen-Chromosomen wurden unter Verwendung von Standardtechniken aus Lymphozyten gewonnen, die mit Kermesbeere (Seromed) stimuliert wurden. Die Objektträger wurden für zwei Tage bei Raumtemperatur angezogen und dann bei -20° Celsius bis zur Verwendung aufbewahrt. FISH Analysen wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt²⁵. Die Endkonzentration der Sonde in der Hybridisierungsmischung war 10 ng/μl. Repetitive Sequenzen wurden mit Standardkonzentrationen porciner genomischer DNA unterdrückt. Nach einem Posthybridisierungs-Waschschritt wurde die biotinylierte Sonde mit zwei Schichten von Avidin-FITC (Vector A-2011) nachgewiesen. Die Chromosomen wurden mit 0,3 mg/ml DAPI (4,6-Diamino-2-Phenylindol; Sigma D9542) gegengefärbt, was ein G-bandierungsähnliches Muster erzeugte. Eine Posthybridisierungsbandierung war nicht erforderlich, da das Chromosom 2 leicht ohne Bandierung erkannt werden kann. Eine Gesamtanzahl von 20 Methaphase Ausbreitungen („spreads") wurde unter einem Olympus BX-60 Fluoreszenzmikroskop, das mit einer IMAC-CCD S30 Videokamera verbunden und mit einer ISIS 1,65 (Metasystems) Software ausgerüstet war, untersucht.
Sequenz-, Mikrosatellit- und Verknüpfungsanalysen.
Ungefähr zwei μg einer linearisierten und aufgereinigten BAC DNA wurde für die direkte Sequenzierung mit 20 pmol der Primer und BigDye Terminator Chemikalie (Perkin Elmer, USA) verwendet. Die DNA Sequenzierung erfolgte vom 3'Ende des letzten Exons zum 3'Ende der UTR, bis ein Mikrosatellit nachgewiesen wurde. Ein Primerset (F: 5'-GTTTCTCCTGTACCCACACGCATCCC-3' und R: 5'-Fluorescein-CTACAAGCTGGGCTCAGGG-3') wurde für die Amplifikation des IGF2 Mikrosatelliten, der ungefähr 250 Basenpaare lang ist und ungefähr 800 Basenpaare strangabwärts vom Stop Codon lokalisiert ist, entworfen. Der Mikrosatellit wurde mit PCR unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern amplifiziert und die Genotypisierung wurde unter Verwendung eines ABI 377 Sequenzierers und der GeneScan/Genotyper Software (Perkin Elmer, USA) durchgeführt. Zweipunkt und Multipunktverknüpfungsanalysen wurden mit der Cri-Map Software²⁶ durchgeführt.
Tiere und phänotypische Daten.
Der Zwischenkreuzungsstammbaum umfaßte zwei europäische Wild Boar Männchen und acht Large White Weibchen, 4 F₁ Männchen und 22 F₁ Weibchen, und 200 F₂ Nachkommen¹. Die F₂ Tiere wurden bei einem Lebendgewicht von mindestens 80 Kilogramm oder bei einem maximalen Alter von 190 Tage getötet. Phänotypische Daten bezüglich des Geburtsgewichtes, Wachstums, der Fetteinlagerung, Körperzusammensetzung, des Gewichts interner Organe und der Fleischqualität wurden gesammelt; eine detaillierte Beschreibung der phänotypischen Merkmale wird von Andersson et al.¹ und Andersson-Eklund et al⁴ zu Verfügung gestellt.
Statistische Analysen.
Intervallkartierungen auf die Anwesenheit von QTLs wurden mit einem „kleinste Quadrate" Verfahren durchgeführt, welches für die Analyse von Kreuzungen zwischen herausgezüchteten Linien entwickelt wurde²⁷. Das Verfahren basiert auf der Annahme, daß die zwei divergierenden Linien für Alternative QTL Allele festgelegt sind. Es gibt vier mögliche Genotypen in der F₂ Generation, wenn es den großelterlichen Ursprung der Allele an jedem Locus betrifft. Dies macht es möglich, drei Effekte anzupassen: additiv, Dominanz und Prägung². Letzteres wird als die Differenz zwischen den zwei Arten von Heterozygoten, nämlich dem, der das Wild Boar Allel durch ein F₁ Vatertier erhalten hat und demjenigen, der es von einem F₁ Muttertier erhalten hat, berechnet. Ein F-Verhältnis wurde unter Verwendung des Modells (mit 3 d.f.) gegenüber einem reduziertem Modell ohne einen QTL Effekt für jedes CM des Chromosom 2 berechnet. Die am meisten wahrscheinliche Position eines QTL wurde als die Position erhalten, die das höchste F-Verhältnis ergab. Genomartige Signifikanzschwellenwerte wurden empirisch durch einen Permutationstest²⁸ wie beschrieben erhalten. Das QTL Modell, das einen Prägungseffekt einschließt, wurde mit einem Modell ohne Prägung (mit 1 d.f.) verglichen, um zu testen, ob der Prägungseffekt signifikant war.
Die statistischen Modelle schlossen ebenfalls die festgelegten Effekte und Covariaten ein, die für die entsprechenden Traits relevant waren; siehe Andersson-Eklund et al.⁴ für eine detailliertere Beschreibung des verwendeten statistischen Modells. Die Familie wurde einbezogen, um hintergrundgenetischen Effekten und mütterlichen Effekten Rechnung zu tragen. Das Schlachtkörpergewicht wurde als eine Covariate eingeschlossen, um Effekte mit korrelierten Traits zu erkennen, was bedeutet, daß alle Ergebnisse, die die Körperzusammensetzung betrafen, bei gleichen Gewichten verglichen wurden. „Kleinste-Quadrate-Mittelwerte" wurden für jede Genotypklasse am IGF2 Locus mit einer Einzelpunktanalyse unter Verwendung des GLM Verfahrens von SAS²⁹ berechnet; das Modell schloß die selben festgelegten Effekte und Covariaten ein, die in den Intervall-Kartierungs-Analysen verwendet wurden. Der QTL zeigt eine deutliche Eltern-Ursprung spezifische Expression und die Kartenposition stimmt mit der des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 Gens (IGF2) überein, was IGF2 als das ursächliche Gen anzeigt. Eine hochsignifikante Segregationsstörung (Überschuß von Wild Boarabgeleiteten Allelen) wurde an diesem Locus ebenfalls beobachtet. Die Ergebnisse zeigen einen wichtigen Effekt der IGF2 Region auf die postnatale Entwicklung und es ist möglich, daß das Vorhandensein eines väterlich exprimierten IGF2-verknüpften QTL in Menschen und in Nager-Modellorganismen als Folge des experimentellen Designs oder der statistischen Be handlung der Daten bis jetzt übersehen wurde. Die Studie hat ebenfalls wichtige Auswirkungen auf quantitative Genetiktheorien und praktische Schweinezüchtung.
IFG2 wurde wegen der beobachteten Ähnlichkeit zwischen dem Schweinechromosom 2p und dem menschlichen Chromosom 11p als positionelles Kandidatengen für diesen QTL identifiziert. Ein genomischer IGF2 Klon wurde durch das Screenen einer porcinen BAC Bibliothek isoliert. FISH Analyse mit diesem BAC Klon ergab ein stark konsistentes Signal auf dem terminalen Teil des Chromosoms 2p (1). Ein polymorpher Mikrosatellit befindet sich in der 3'UTR des IGF2 in Mäusen (Genbank U71085), Menschen (Genbank S62623) und Pferd (Genbank AF020598). Das mögliche Vorhandensein eines entsprechenden porcinen Mikrosatelliten wurde durch direkte Sequenzierung der IGF2 3'UTR unter Verwendung des BAC Klons untersucht. Ein komplexer Mikrosatellit wurde ungefähr 800bp strangabwärts des Stop Codons identifiziert; ein Sequenzvergleich ergab, daß dieser Mikrosatellit identisch zu dem zuvor beschriebenen anonymen Mikrosatelliten, Swc9⁶ ist. PCR Primer wurden entworfen und es wurde herausgefunden, daß der Mikrosatellit (IGF2ms) hoch polymorph zu drei verschiedenen Allelen unter den zwei Wild Boar Gründern und zwei weiteren unter den acht Large White Gründern ist. IGF2ms war vollständig aussagekräftig in der Zwischenkreuzung, da sowohl der Zuchtursprung („breed of origin") genauso wie der Eltern-Ursprung („parent of origin") mit Konfidenz für jedes Allel in jedem F₂ Tier bestimmt werden konnte.
Eine Verknüpfungsanalyse unter Verwendung des Zwischenkreuzungsstammbaums wurde mit IGF2ms und den Mikrosatelliten Sw2443, Sw2623, und Swr2516, die alle vom distalen Ende des 2p stammen, durchgeführt⁷. IGF2 wurde durch hoch signifikante Iod-Werte (z.B. Z = 89,0, 0 = 0,003 gegen Swr2516) fest dem 2p zugeordnet. Multipunktanalysen, einschließlich zuvor typisierter Chromosom 2 Marker⁸, ergaben die folgende Reihenfolge von Loci (Gechlechts-durchschnittliche Kartendistanzen in Kosambi cM): Sw2443/Swr2516-0,3-IGF2-14,9-Sw2623-10,3-Sw256. Es wurde keine Rekombinante zwischen Sw2443 und Swr2516 beobachtet und die vorgeschlagene proximale Lokalisierung von IGF2 in Relation zu diesen Loci basiert auf einer einzigen Rekombinanten, die eine Iod-Wert-Unterstützung von 0,8 für die berichtete Reihenfolge ergibt. Der am meisten distal gelegene Marker in unserer vorherigen QTL Studie, Sw256, ist ungefähr 25 CM vom distalen Ende der Verknüpfungsgruppe positioniert.
QTL Analysen der Körperzusammensetzung, Fettigkeit, Fleischqualität und Wachstum Traits wurde mit der neuen Chromosom 2 Karte unter Verwendung eines statistischen Modells, das auf das mögliche Vorhandensein eines prägenden Effekts wie für IGF2 erwartet, testet, durchgeführt. Es wurde ein eindeutiger Hinweis auf einen väterlich exprimierten QTL erhalten, der an der sehr distalen Spitze von 2p lokalisiert ist (2; Tabelle 1). Der QTL hatte sehr starke Auswirkungen auf den Magerfleischanteil in Schinken und erklärte die erstaunlicherweise auftretenden 30% der Rest-phänotypischen Varianz in der F₂ Population. Große Effekte auf das Gebiet des Longissimus dorsi Muskels, auf das Gewicht des Herzens und auf die Rückenfettdicke (subkutanes Fett) wurden ebenfalls bemerkt. Ein gemäßigter Effekt auf einen Fleischqualität Trait, Reflexionswert, wurde gezeigt. Der QTL hatte keinen signifikanten Effekt auf abdominales Fett, Geburtsgewicht, Wachstum, Gewicht der Leber, Niere oder Milz (Daten nicht gezeigt). Das Large White Allel an diesem QTL war mit größerer Muskelmasse und reduzierter Rückenfettdicke assoziiert, was in Übereinstimmung mit dem Unterschied zwischen dieser Zucht und der Wild Boar Population ist. Der stark prägende Effekt, der für alle beeinflußten Traits beobachtet wurde, legt sehr stark einen einzigen ursächlichen Locus nahe. Die pleiotropen Effekte auf die Skelettmuskelmasse und die Größe des Herzens scheinen von einem physiologischen Standpunkt aus adaptiv zu sein, da eine größe re Muskelmasse einen größeren Herzausstoß erfordert. Die eindeutig väterliche Expression dieses QTL wird durch die „kleinste Quadrate Mittelwerte" gezeigt, die dem Populationsursprung des väterlich vererbten Allels (Tabelle 1) folgend in zwei Klassen fallen. Dies ist bemerkenswert obgleich es einen nicht-signifikanten Trend zu weniger extremen Werten für die zwei heterozygoten Klassen, insbesondere für den geschätzten Effekt auf das Gebiet des Longissimus dorsi, gab. Dies könnte auf einem Zufall beruhen, aber könnte ebenfalls eine biologische Erklärung haben, z.B. daß es etwas Expression des mütterlich vererbten Allels gibt, oder daß es einen verknüpften, nicht-geprägten QTL mit kleineren Effekten auf die fraglichen Traits gibt.
Der IGF2-verknüpfte QTL und der FAT1 QTL auf Chromosom 4^1,9 sind die zwei Loci mit dem bei weitem größten Effekt auf die Körperzusammensetzung und Fettigkeit, die in dieser Wild Boar Zwischenkreuzung segregieren. Der IGF2 QTL kontrolliert hauptsächlich die Muskelmasse, während FAT1 große Auswirkungen auf die Fetteinlagerung einschließlich abdominales Fett hat, einen Trait, der von dem IGF2 QTL nicht beeinflußt wurde (2). Es wurde keine signifikante Interaktion zwischen den zwei Loci gezeigt und sie kontrollieren einen sehr großen Anteil der Rest-phänotypischen Varianz in der F₂ Generation. Ein Modell, das beide QTLs einschließt, erklärt 33,1% der Varianz für den Prozentsatz des Magerfleisch in Schinken, 31,3% für den Prozentsatz des Magerfleisch plus Knochen im Rücken und 26,2% für die durchschnittliche Rückenfettiefe (Verglichen mit einem Modell, das nur Chromosom 2 Effekte einschließt, Tabelle 1). Die zwei QTLs mußten eine Hauptrolle bei der Antwort während der Auswahl für Magerwachstum und Muskelmasse in dem Large White Hausschwein gespielt haben.
Eine hochsignifikante Segregationsstörung wurde in der IGF2 Region beobachtet (Überschuß von Wild Boar-abgeleiteten Alle len) wie in Tabelle 1 gezeigt (χ2 = 11,7, d.f. = 2; P = 0,003). Die Frequenz des Wild Boar-abgeleiteten IGF2 Allels war 59% im Gegensatz zu den erwarteten 50% und es waren zweimal so viele „Wild Boar" wie „Large White" Homozygote. Diese Abweichung wurde bei allen drei Loci an der distalen Spitze beobachtet und ist somit nicht die Folge von Typisierungsfehlern. Der Effekt wurde ebenfalls bei anderen Loci beobachtet, aber der Grad der Störung nahm als eine Funktion der Distanz zur distalen Spitze des Chromosoms ab. Blutproben für die DNA Präparation wurden im Alter von 12 Wochen gesammelt und wir sind davon überzeugt, daß die Abweichung von den erwarteten Mendelschen Verhältnissen bei der Geburt vorhanden war, da die Anzahl der Tiere, die vor der Blutsammlung verloren wurden, nicht ausreichend war, eine Abweichung dieser Größenordnung zu verursachen. Kein anderer der mehr als 250 Loci, die in diesem Stammbaum analysiert wurden, zeigt solch eine merkliche Segregationsstörung (L. Andersson, unveröffentlicht). Die Segregationsstörung zeigt keinen Prägungseffekt, da die Frequenzen der zwei reziproken Arten von Heterozygoten identisch waren (Tabelle 1). Dies schließt die Möglichkeit nicht aus, daß die QTL Effekte und die Segregationsstörung vom selben Locus kontrolliert werden. Die Segregationsstörung könnte eine Folge der meiotischen Steuerung („meiotic drive") sein, die das väterliche Allel während der Gametogenese favorisiert, da die F₁ Eltern von Wild Boar Männchen gezeugt wurden. Eine andere Möglichkeit ist, daß die Segregationsstörung eine Folge der co-dominanten Expression des mütterlichen und väterlichen Allels in einigen Geweben und/oder während einer kritischen Phase der Embryoentwicklung sein könnte. Es wurde berichtet, daß eine biallelische IGF2 Expression in einem gewissen Ausmaß während der menschlichen Entwicklung auftritt^10,11 und interessanterweise wurde kürzlich ein starker Einfluß des elterlichen Spezieshintergrunds auf die IGF2 Expression in einer Kreuzung zwischen Mus musculus und Mus spretus gefunden¹². Es ist ebenfalls interessant, daß ein VNTR Polymorphismus beim Insulin-Gen, der sehr nah mit IGF2 verknüpft ist, mit der Größe bei der Geburt bei Menschen assoziiert ist¹³. Es ist möglich, daß der IGF2-verknüpfte QTL in Schweinen einen geringeren Effekt auf das Geburtsgewicht hat, aber in unseren Daten war es bei weitem nicht signifikant (2) und es gab keinen Hinweis auf einen prägenden Effekt.
Diese Studie ist ein Fortschritt für das allgemeine Wissen, betreffend die biologische Wichtigkeit des IGF2 Locus. Die wichtige Rolle des IGF2 für die pränatale Entwicklung ist von Knock-out Mäusen¹⁴ gut dokumentiert, genauso wie von seiner ursächlichen Rolle beim humanen Beckwith-Wiedemann Syndrom¹⁵. Diese Studie demonstriert ebenfalls eine wichtige Rolle der IGF2-Region für die postnatale Entwicklung. Es sollte betont werden, daß unsere Zwischenkreuzung zwischen herausgezüchteten Populationen insbesondere leistungsstark ist, um einen QTL mit einem Eltern-Ursprung-spezifischen Effekt auf einen multifaktoriellen Trait nachzuweisen. Dies gilt, da multiple Allele (oder Haplotypen) segregierend sind und wir konnten herleiten, ob ein heterozygotes F₂ Tier das White Boar Allel von dem F₁ Männchen oder Weibchen erhielt. Es ist gut möglich, daß die Segregation eines väterlich exprimierten IGF2-verknüpften QTL, der ein Merkmal wie Fettleibigkeit beeinflußt, in humanen Studien übersehen wurde oder in Zwischenkreuzungen zwischen durch Inzucht erzeugten Nagerpopulationen aufgrund des experimentellen Designs oder der statistischen Behandlung der Daten übersehen wurde. Ein prägender Effekt kann in einer Zwischenkreuzung zwischen zwei durch Inzucht erzeugten Linien nicht nachgewiesen werden, da nur zwei Allele an jedem Locus segregierend sind. Unser Ergebnis hat daher signifikante Einflüsse auf die zukünftige Analyse der Assoziierung zwischen genetischem Polymorphismus in der Insulin-IGF2 Region und Typ 1 Diabetes¹⁶, Fettleibigkeit¹⁷ und Abweichungen beim Geburtsgewicht bei Menschen¹³, genauso wie für die genetische Analyse komplexer Traits unter Verwendung von durch Inzucht erzeugten Nagermo dellen. Ein Hauptanstoß für die Erzeugung einer Zwischenkreuzung zwischen dem Hausschwein und seinem wilden Vorfahren war, die Möglichkeiten zu untersuchen, Hauptloci zu kartieren und zu identifizieren, die auf eine Selektion reagiert haben. Wir haben nun gezeigt, daß zwei einzelne QTLs auf Chromosom 2 (diese Studie) und 4^1,2 ein Drittel der phänotypischen Varianz für den Magerfleischanteil in der F₂ Generation erklären. Dies ist eine starke Abweichung von der zugrundeliegenden Annahme in dem klassischen infinitesimalen Modell der quantitativen Genetiktheorie, nämlich daß quantitative Traits durch eine unbegrenzte Anzahl von Loci kontrolliert werden, wobei jeder einen winzigen Effekt hat. Wenn ein großer Anteil des genetischen Unterschieds zwischen zwei divergierenden Populationen (z.B. Wild Boar und Large White) durch wenige Loci kontrolliert wird, könnte man annehmen, daß die Selektion schnell QTL Allele mit großen Effekten festlegen würde, was zu einem Selektionsplateau führen würde. Dies ist jedoch nicht die Erfahrung in Tierzuchtprogrammen oder Selektionsexperimenten, wo gut persistente langfristige Selektionsantworten allgemein erhalten werden, vorausgesetzt, daß die effektive Populationsgröße halbwegs groß ist¹⁸. Eine mögliche Erklärung für dieses Paradoxon ist, daß QTL Allele, die einen großen Anteil der genetischen Unterschiede zwischen zwei Populationen kontrollieren, die Folge mehrerer aufeinanderfolgender Mutationen sind; dies können Mutationen im selben Gen oder bei mehreren eng verknüpften Genen sein, die den selben Trait beeinflussen. Es wurde argumentiert, daß neue Mutationen wesentlich zu langfristigen Selektionsantworten beitragen¹⁹, aber die genomische Verteilung solcher Mutationen ist unbekannt.
Die Suche nach einer einzelnen ursächlichen Mutation ist das Modell in Bezug auf die Analyse genetischer Defekte in Mäusen und monogenen Erkrankungen in Menschen. Wir schlagen vor, daß dies für Loci nicht der Fall ist, die für eine große Anzahl von Generationen bei Nutztieren, Saaten oder natürlichen Popu lationen unter Selektion standen. Diese Hypothese sagt das Vorhandensein multipler Allele bei einem Haupt-QTL voraus. Sie erhält einige Unterstützung von unserer kürzlichen Charakterisierung der porcinen Fellfarbvariation. Wir haben herausgefunden, daß sich sowohl die Allele für die dominante weiße Farbe und für schwarz-gepunktet von den entsprechenden Wildtyp Allelen durch mindestens zwei aufeinanderfolgende Mutationen mit phänotypischen Effekten an den KIT bzw. MC1R Loci unterscheiden^20,21. In diesem Zusammenhang ist es höchst interessant, daß wir in dem beigefügten Beispiel ein drittes Allel bei dem IGF2-verknüpften QTL identifiziert haben. Die Effekte auf die Muskelmasse der drei Allele ordnen sich in die selbe Reihenfolge ein, wie die Zuchten, in denen sie gefunden werden, das heißt Piétrain Schweine sind muskulöser als Large White Schweine, die wiederum einen höheren Magerfleischanteil als Wild Boars aufweisen.
Es gibt gute Gründe, zu entscheiden, daß IGF2 das ursächliche Gen für den jetzt berichteten QTL ist. Erstens gibt es eine perfekte Übereinstimmung bei der Kartenlokalisation (2). Zweitens wurde gezeigt, daß IGF2 in Mäusen, Menschen, und jetzt in Schweinen väterlich exprimiert wird, wie der QTL. Es gibt mehrere andere geprägte Gene in der näheren Umgebung des IGF2 in Mäusen und Menschen (Mash2, INS2, H19, KVLQT1, TAPA1/CD81 und CDKN1C/p57^KIP2), aber nur IGF2 wird in erwachsenen Geweben väterlich exprimiert²². Wir glauben, daß dieser Locus eine einzigartige Möglichkeit für die molekulare Charakterisierung eines QTL bietet. Die deutliche väterliche Expression kann verwendet werden, um Gene auszuschließen, die diese Art der Vererbung nicht zeigen. Darüber hinaus sollte das Vorhandensein einer allelischen Serie die schwierige Unterscheidung zwischen ursächlichen Mutationen und verknüpftem neutralen Polymorphismus erleichtern. Wir haben bereits gezeigt, daß es keinen Unterschied in der kodierenden Sequenz zwischen IGF2 Allelen aus Piétrain und Large White Schweinen gibt, was nahe legt, daß die ursächlichen Mutationen in regulatorischen Sequenzen auftreten. Es ist ein offensichtlicher Schritt, das gesamte IGF2 Gen und dessen multiple Promotoren aus den drei Populationen zu sequenzieren. Der kürzliche Bericht, daß ein VNTR Polymorphismus in der Promoterregion des Insulin (INS) Gens die IGF2 Expression²³ beeinflußt, legt nahe, daß die ursächlichen Mutationen in einer beträchtlichen Entfernung von der IGF2 kodierenden Sequenz liegen.
Die Ergebnisse haben mehrere wichtige Auswirkungen auf die Schweinezuchtindustrie. Sie zeigen, daß genetische Prägung keine esoterische akademische Frage ist, sondern bei praktischen Zuchtprogrammen berücksichtigt werden muß. Der Nachweis von drei verschiedenen Allelen bei Wild Boar, Large White und Piétrain Populationen zeigt, daß weitere Allele beim IGF2-verknüpften QTL innerhalb kommerzieller Populationen segregieren. Die väterliche Expression des QTL erleichtert seinen Nachweis unter Verwendung großer väterlicher Halbblutsverwandter Familien, da der weibliche Beitrag ignoriert werden kann. Der QTL wird ausgenutzt, um den Magerfleischanteil durch Marker-unterstützte Selektion innerhalb der Populationen oder durch Marker-unterstützte Introgression favorisierter Allele von einer Population zu anderen zu verbessern.
Beispiel 2: Piétrain x Large White Zwischenkreuzungen Verfahren
Stammbaummaterial: Das Stammbaummaterial, das verwendet wurde, um den QTL zu kartieren, wurde aus einem zuvor beschriebenen Piétrain x Large White F2 Stammbaum ausgewählt, der > 1,800 Individuen umfaßte^6,7. Um dieses F2 Material herzustellen, wurden 27 Piétrain Eber mit 20 Large White Säuen gepaart, um eine F1 Generation zu erzeugen, die 456 Individuen umfaßte. 31 F1 Eber wurden mit 82 nicht-verwandten F1 Säuen von 1984 bis 1989 gepaart, was eine Gesamtmenge von 1862 F2 Nachkommen ergab. F1 Eber wurden im Durchschnitt mit 7 Weibchen gepaart und F1 Säue mit einem Durchschnitt von 2,7 Männchen. Der durchschnittliche Nachwuchs pro Eber war 60 und pro Sau 23.
Phänotypische Informationen: (i) Datensammlung: Eine Gesamtmenge von 21 verschiedenen Phänotypen wurde in der F2 Generation aufgezeichnet^6,7. Diese schlossen ein:

– fünf Wachstum Traits: Geburtsgewicht (g), Entwöhnungsgewicht (kg), Wachstumsgewicht (kg), Endgewicht (kg) und durchschnittliche tägliche Zunahme (ADG; kg/Tag; Wachstum zur Endperiode);
– zwei Körper Proportionsmessungen: Schlachtkörperlänge (cm); und ein Konformationswert (0 bis 10 Skalierung; Referenz 6);
– zehn Messungen der Schlachtkörperzusammensetzung, die durch Analyse der abgekühlten Schlachtkörper 24 Stunden nach der Schlachtung erhalten wurden. Diese schlossen Messungen der Muskelkraft ein: Schinken (Gewicht Schinken/Schlachtkörpergewicht), % Lende (Gewicht Lende/Schlachtkörpergewicht). % Schulter (Gewicht Schulter/Schlachtkörpergewicht), % Magerschnitte (% Schinken + Lende + % Schulter); und Messungen der Fettigkeit; durchschnittliche Rückenfettdicke (BFT; cm), % Rückenfett (Gewicht Rückenfett/Schlachtkörpergewicht), % Bauch; (Gewicht Bauch/Schlachtkörpergewicht), % Blattfett (Gewicht Blattfett/Schlachtkörpergewicht, % Unterkiefer (Gewicht Unterkiefer/Schlachtkörpergewicht) und Fettschnitte" (% Rückenfett + % Bauch + % Blattfett + % Unterkiefer).
– vier Fleischqualitätsmessungen: pH_LD1 (Longissimus dorsi 1 Stunde nach Schlachtung), pH_LD24 (Longissimus dorsi 24 Stunden nach der Schlachtung), pH_G1 (Gracilis 1 Stunde nach der Schlachtung) und pH_G24 (Gracilis 24 Stunde nach der Schlachtung). (ii) Datenverarbeitung: individuelle Phänotypen wurden für festgelegte Effekte voreingestellt (Vatertier, Muttertier, CRC Genotyp, Geschlecht, Jahreszeit, Parität) und Kovariaten (Wurfgröße, Geburtsgewicht, Entwöhnungsgewicht, Wachstumsgewicht, Endgewicht) von denen sich herausgestellt hat, daß sie den entsprechenden Trait signifikant beeinflussen. Die Variablen, die in dem Modell enthalten waren, wurden durch schrittweise Regression ausgewählt.

Markergenotypisierung:
Die Primerpaare, die für die PCR Amplifikation der Mikrosatellitenmarker verwendet wurden, sind wie beschrieben¹⁹. Die Markergenotypisierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt²⁰. Die Genotypen bei den CRC und MyoD Loci wurden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren wie beschrieben durchgeführt^1,12 Der LAR Test für den Igf2 SNP wurde gemäß Baron et al.²¹ unter Verwendung eines Primerpaares für die PCR Amplifikation (5'-CCCCTGAACTTGAGGACGAGCAGCC-3'; 5'-ATCGCTGTGGGCTGGGTGGGCTGCC-3') und einem Satz von drei Primern für den LAR Schritt (5'-FAM-CGCCCCAGCTGCCCCCCAG-3'; 5'-HEX-CGCCCCAGCTGCCCCCCAA-3'; 5'-CCTGAGCTGCAGCAGGCCAG-3') entwickelt.
Kartenkonstruktion: Markerkarten wurden unter Verwendung der TWOPOINT, BUILD und CHROMPIC Optionen des CRIMAP Paketes²² erstellt. Um die Verwendung dieses Paketes zu erlauben, wurden vollständig blutsverwandte Familien, die über den Eber oder die Sau in Beziehung standen, getrennt und unabhängig behandelt. Dadurch wurden einige möglicherweise verwendbare Informationen vernachlässigt, was jedoch erwartungstreue Abschätzungen der Rekombinationsraten ergab.
QTL Kartierung: (i) Kartierung von Mendelschen QTL: herkömmliche QTL Kartierung wurde unter Verwendung einer Multipunkt Maximum likelihood Methode durchgeführt. Das eingesetzte Modell nahm einen segregierenden QTL pro Chromosom und Festlegung von wechselnden QTL Allelen in den entsprechenden elterlichen Linien, Piétrain (P) und Large White (LW), an. Ein spezifisches Analyseprogramm mußte entwickelt werden, um die fehlenden Genotypen der Elterngeneration zu berücksichtigen, was zu der Tatsache führte, daß der elterliche Ursprung der F1 Chromosomen nicht bestimmt werden konnte. Unter Verwendung einer typischen „Intervallkartierungs"-Strategie wurde ein hypothetischer QTL entlang der Markerkarte unter Verwendung von nutzerdefinierten Schritten bewegt. An jeder Position wurde die Wahrscheinlichkeit (L) („likelihood") der Stammbaumdaten berechnet als:
P oder rechtes Chromosom P), es gibt eine Gesamtmenge von 2^r Kombinationen für r F1 Eltern.
P/P, P/LW, LW/P und LW/LW
P(G|M_i, θ, φ)M_i: der Markergenotyp des i-ten F2 Nachkommen und seiner F1 Eltern, (ii): der Vektor der Rekombinationsraten zwischen benachbarten Markern und zwischen dem hypothetischen QTL und seinen flankierenden Markern, und (iii) θ die betrachtete Marker-QTL Phasenkombination der F1 Eltern.
Es wir angenommen, daß die Rekombinationsraten und Markerverknüpfungsphase der F1 Eltern bekannt ist, wenn diese Wahrscheinlichkeit berechnet wird. Beide wurden unter Verwendung von CRIMAP in der Kartenerstellungsphase (siehe oben) bestimmt.
P(y_i/G)y_i) des Nachkommen i, gegeben der QTL Genotyp unter Beobachtung. Diese Wahrscheinlichkeit wird aus der normalen Dichtefunktion berechnet:
G ist das phänotypische Mittel des betrachteten QTL Genotyps (PP, PL, LP oder LL) und σ² die Rest-Varianz σ² wurde für die vier QTL Genotypklassen als gleich angesehen. Die Werte von μ_PP, μ_PL = μ_LP, und und σ², das L maximiert, wurden unter Verwendung der GEMINI Optimisierungsroutine bestimmt²³. Die Wahrscheinlichkeit, die unter dieser alternativen H₁ Hypothese erhalten wurde, wurde mit der Wahrscheinlichkeit verglichen, die unter der Null-Hypothese H_o von keinem QTL erhalten wurde, wobei die phänotypischen Mittelwerte der vier QTL Genotypklassen als identisch vorgegeben wurden. Der Unterschied zwischen den Logarithmen der entsprechenden Wahrscheinlichkeiten ergibt einen Iod-Wert, der die Evidenz zugunsten eines QTL an der entsprechenden Kartenposition mißt.
(ii) Signifikanz Schwellenwerte: Iod-Wert-Schwellenwerte (T), die mit einem ausgewähltem Genom-artigen Signifikanzniveau assoziiert sind, wurden gemäß Lander & Botstein²⁴ berechnet, so daß: α = (C + 9,21GT)χ22 (4.6T)C entspricht der Anzahl von Chromosomen (= 19), G entspricht der Länge des Genoms in Morgan (= 29) und χ 2 / 2 (4,6T) bedeutet eins minus der kumulativen Verteilungsfunktion der Chi-Quadrat Verteilung mit 2 d.f. Es wurde angenommen, daß Einzelpunkte 2ln(LR) als eine Chi-Quadrat Verteilung mit zwei Freiheitsgraden verteilt sind, da wir sowohl eine additive und eine Domi nanz Komponente angepaßt haben. Um der Tatsache Rechnung zu tragen, daß wir multiple Traits analysiert haben, wurden die Signifikanzniveaus durch Anwendung einer Bonferoni Korrektur, die der effektiven Anzahl von unabhängigen Traits, die analysiert wurden, entspricht, angepaßt. Diese effektive Anzahl wurde gemäß dem Ansatz, der von Spelman et al.²⁵ beschrieben wurde, als 16 bestimmt. Insgesamt erlaubte uns dies, den Iod-Wert Schwellenwert, der mit einem experimentartigen Signifikanzniveau von 5 % assoziiert ist, auf 5,8 festzusetzen. Beim Versuchen, den identifizierten QTL in einer unabhängigen Probe zu bestätigen, wurde derselbe Ansatz verwendet, jedoch wurde C auf 1, G auf 25cM festgesetzt und die Analysen von 4,5 unabhängigen Traits (da nur sechs Traits in dieser Probe analysiert wurden) korrigiert. Dies ergab einen Iod-Wert Schwellenwert, der mit einem Typ I Fehler von 5% assoziiert war, von 2.
(iii). Testen auf einen geprägten QTL: Um auf einen geprägten QTL zu testen, haben wir angenommen, daß nur die QTL Allele einen Effekt auf den Phänotyp haben, die von dem Elternteil eines gegebenen Geschlechtes übertragen wurden, während die QTL Allele, die von dem anderen Elternteil übertragen wurden, „neutral" sind. Die Wahrscheinlichkeit der Stammbaumdaten unter dieser Hypothese wurde unter Verwendung der Gleichung 1 berechnet. Um P(y_i|G) zu berechnen, wurden jedoch die phänotypischen Mittelwerte der vier QTL Genotypen auf μ_PP = μ_PL = μ_P und μ_LP = μ_LL = μ_L gesetzt, um auf einen QTL zu testen, für den nur das väterliche Allel exprimiert wird, und μ_PP = = μ_P und μ_PL = μ_LL = μ_L, um auf einen QTL zu testen, für den nur das mütterliche Allel exprimiert wird. Bei dieser Notation wird angenommen, daß sich der erste Index auf das väterliche Allel und der zweite Index auf das mütterliche Allel bezieht. H₀ wurde als die Null-Hypothese für keinen QTL definiert, H₁ testet das Vorhandensein eines Mendelschen QTL; H₂ testet das Vorhandensein eines väterlich exprimierten QTL und H₃ testet das Vorhandensein eines mütterlich exprimierten QTL.
RT-PCR: Gesamt RNA wurde aus dem Skelettmuskel gemäß Chirgwin et al.²⁶ extrahiert. RT-PCR wurde unter Verwendung des Gene-Amp RNA PCR Kits (Perkin-Elmer) durchgeführt. Die PCR Produkte wurden unter Verwendung des QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) aufgereinigt und unter Verwendung der „Dye terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (Perkin Elmer) und einem ABI373 automatischem Sequenziergerät sequenziert.
In Beispiel 2 berichten wir die Identifizierung eines QTL mit einem Haupteffekt auf die Muskelmasse und Fetteinlagerung, der zum porcinen 2p1.7 kartiert. Der QTL zeigt einen eindeutigen Hinweis auf elterliche Prägung, was die Beteiligung des Igf2 Locus eindeutig nahelegt.
Eine Piétrain X Large White Zwischenkreuzung, die 1125 F₂ Nachkommen umfaßte, wurde wie beschrieben erzeugt^6,7. Die Large White und Piétrain elterlichen Zuchten unterscheiden sich in einer Anzahl von ökonomisch wichtigen Phänotypen. Piétrains sind berühmt für ihre außergewöhnliche Muskelkraft und Magerkeit⁸ (2), während Large White eine überlegene Wachstumseffizienz zeigt. Einundzwanzig verschiedene Phänotypen, die (i) die Wachstumseffizienz (5), (ii) Muskelkraft (6), (iii) Fetteinlagerung (6) und (iv) Fleischqualität (4) messen, wurden für alle F₂ Nachkommen aufgezeichnet.
Um den QTL zu kartieren, der den genetischen Unterschieden zwischen diesen Zuchten zugrunde liegt, unternahmen wir ein gesamtgenomischen Scan unter Verwendung von Mikrosatellitenmarkern mit einer anfänglichen Probe von 677 F₂ Individuen. Die Analyse des Schweinechromosoms 2 unter Verwendung eines ML Multipunkt Algorithmus ergab hoch signifikante Iod-Werte (bis zu 20) für sechs der 12 Phänotypen, die die Muskelkraft und Fetteinlagerung messen, am distalen Ende des kurzen Arms von Chromosom 2 (3a). Positive Iod-Werte wurden für die ver bliebenen sechs Phänotypen erhalten, jedoch erreichten sie nicht diesen Genom-artigen Signifikanzschwellenwert (= 5 %). Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurde die verbliebene Probe von 355 F₂ Nachkommen bezüglich der 5 am meisten distal gelegenen 2p Marker genotypisiert und QTL Analyse wurde für die Traits durchgeführt, die die höchsten Iod-Werte in der ersten Analyse ergaben. Die Iod-Werte reichten von 2,1 bis 7,7, was die Anwesenheit eines Haupt-QTL in dieser Region eindeutig bestätigt. Die Tabelle 2 stellt die entsprechenden ML Abschätzungen für die drei genotypischen Mittelwerte genauso wie die entsprechende Rest-Varianz dar.
Eine bidirektionale Chromosomenfärbung begründet eine Korrespondenz zwischen SSC2p und HSA11pter-q13^9,10. Mindestens zwei ernste Kandidatengene kartieren in dieser Region in Menschen: der myogene basische Helix-Loop-Helix Faktor, MyoD, kartiert zu HSA11p15,4, während Igf2 zu HSA11p15.5 kartiert. MyoD ist ein gut bekannter Schlüsselregulator der Myogenese und ist einer der ersten myogenen Marker, die während der Entwicklung angeschaltet werden¹¹. Es zeigte sich, daß ein zuvor beschriebener amplifizierter Sequenzpolymorphismus im porcinen MyoD Gen¹² in unserem F₂ Material segregierte, welches insgesamt für diesen Marker genotypisiert wurde. Verknüpfungsanalyse positionierte das MyoD Gen in das SW240-SW776 (Chancen („odds") > 1000) Intervall, und damit deutlich außerhalb des Iod-2 „drop off" Unterstützungsintervalls für den QTL (1). Es ist bekannt, daß Igf2 sowohl die Proliferation als auch die Differenzierung von Myoblasten in vitro¹³ fördert und eine muskuläre Hypertrophy verursacht, wenn es in vivo überexprimiert wird. Basierend auf einer veröffentlichten porcinen erwachsenen Leber cDNA Sequenz¹⁴ haben wir Primerpaare entworfen, die es uns erlaubten, die gesamte Igf2 kodierende Sequenz mit 222 Basenpaaren der Leader und 280 bp der Trailor Sequenz aus erwachsener Skelettmuskel cDNA zu amplifizieren. Piétrain und Large White RT-PCR Produkte wurden sequenziert, was zeigte, daß die kodierende Sequenz in beiden Zuchten und mit der veröffentlichten Sequenz identisch war. Eine G zu A Transition wurde jedoch in der Leader Sequenz gefunden, was dem Exon 2 im Menschen entspricht (4). Wir entwickelten einen Screening Test für diesen einzelnen Nucleotid-Polymorphismus (SNP) basierend auf der Ligations-Amplifikationsreaktion (LAR), was uns erlaubte, das Stammbaummaterial zu genotypisieren. Basierend auf diesen Daten wurde gezeigt, daß Igf2 mit dem SWC9 Mikrosatellitenmarker co-lokalisiert (= 0%) und somit ungefähr 2 Centimorgan von der wahrscheinlichsten Position des QTL und deutlich innerhalb des 95 % Unterstützungsintervalls für den QTL (1) lokalisiert ist. Die nachfolgende Sequenzanalyse zeigte, daß der Mikrosatellitenmarker SWC9 tatsächlich innerhalb der 3'UTR des Igf2 Gens lokalisiert ist. Kombiniert mit zur Verfügung stehenden komparativen Kartierungsdaten für die PGA und FSH Loci, legen diese Ergebnisse das Auftreten einer interstitiellen Inversion eines Chromosomensegments nahe, das MyoD, aber nicht Igf2 enthält, welches in beiden Spezies telomerisch geblieben ist.
Igf2 scheint daher ein starkes positionelles Allel zu sein, das den beobachteten QTL Effekt aufweist. Beim Menschen und der Maus ist es bekannt, daß Igf2 geprägt ist und ausschließlich vom väterlichen Allel in mehreren Geweben exprimiert wird¹⁵. Die Analyse der Skelettmuskel cDNA aus Schweinen, die heterozygot für den SNP und/oder SWC9 sind, zeigt, daß die selbe Prägung in diesem Gewebe beim Schwein genauso gilt (4). Daher kann man vorhersagen, daß wenn Igf2 verantwortlich für den beobachteten Effekt war und man weiß, daß nur das väterliche Igf2 Allel exprimiert wird, (i) das väterliche Allel, das von den F1 Ebern (P oder LW) übertragen wurde, einen Effekt auf den Phänotyp der F2 Nachkommen haben würde, (ii) das mütterliche Allel, das von den F1 Säuen (P oder LW) übertragen wurde, keinen Effekt auf den Phänotyp der F2 Nachkommen haben würde und (iii) die Wahrscheinlichkeit der Daten unter einem Modell einer bimodalen (1:1) F2 Population, die durch vererbte väterliche Allele sortiert wurde, verglichen zu einem herkömmlichen „Mendelschen" Modell einer trimodalen (1:2:1) F2 Population überlegen sein würde. Die QTL Kartierungsprogramme wurden angepaßt, um das Testen der entsprechenden Hypothesen zu erlauben. H₀ wurde als die Null-Hypothese von keinem QTL definiert, H₁ als Testen auf die Anwesenheit eines Mendelschen QTL, H₂ als Testen auf die Anwesenheit eines väterlich geprägten QTL und H₃ als Testen auf die Anwesenheit eines mütterlich geprägten QTL.
3 faßt die erhaltenen Ergebnisse zusammen. 3a, 3b bzw. 3c zeigt die Iod-Wertkurven, die log₁₀ (H₂/H₀), log₁₀ (H₃/H₀) und log₁₀ (H₂/H₁) entsprechen. Es ist zu erkennen, daß sehr signifikante Iod-Werte erhalten werden, wenn auf die Anwesenheit eines väterlich exprimierten QTL getestet wird, während es überhaupt keine Hinweise für die Segregation eines QTL gibt, wenn die Chromosomen untersucht werden, die von den Säuen übertragen werden. Außerdem ist die Hypothese eines väterlich exprimierten QTL signifikant wahrscheinlicher (log₁₀ (H₂/H₁) > 3) als die Hypothese eines „Mendelschen" QTLs für alle untersuchten Traits. Die Tatsache, daß die selbe Tendenz für alle Traits beobachtet wird, zeigt, daß es wahrscheinlich dasselbe geprägte Gen ist, das für die Effekte, die für die verschiedenen Traits beobachtet wurden, verantwortlich ist. Tabelle 2 stellt die ML phänotypischen Mittelwerte für die F2 Nachkommen dar, die nach dem vererbten väterlichen QTL Allel sortiert wurden. Es ist anzumerken, daß wenn die Analyse unter einem Modell eines Mendelschen QTL durchgeführt wird, es scheint, daß die Piétrain und Large White QTL Allele sich in einer additiven Art und Weise verhalten, der heterozygote Genotyp ein phänotypisches Mittel zeigt, das exakt dem Mittelpunkt zwischen den zwei homozygoten Genotypen entspricht. Dies ist exakt das, was jemand vorhersagen würde, wenn er mit einem geprägten QTL zutun hat, da von der Hälfte der heterozygoten Nachkommen erwartet wird, daß sie das P Allel von ihrem Vater geerbt haben und die andere Hälfte das LW Allel.
Diese Daten bestätigten daher unsere Hypothese der Beteiligung eines geprägten Gens, das ausschließlich vom väterlichen Allel exprimiert wird. Die Tatsache, daß das identifizierte chromosomale Segment präzise mit einer geprägten Domaine übereinstimmt, was in Mensch und Mäusen dokumentiert ist, impliziert deutlich die orthologe Region in Schweinen. Mindestens sieben geprägte Gene, die zu dieser Domaine kartiert werden, sind dokumentiert worden (Igf2, Ins2, H19, Mash2, p57^KIP2, K_vLQTL1 und TDAG51) (Ref. 15 und Andrew Feinberg, persönliche Mitteilung). Unter diesen sind nur Igf2 und Ins2 väterlich exprimiert. Während wir nicht ausschließen können, daß der beobachtete QTL Effekt eine Folge eines bis jetzt nicht identifizierten geprägten Gens in dieser Region ist, implizieren dessen berichtete Effekte auf die Myogenese in vitro und in vivo¹³ sehr stark Igf2. Insbesondere die muskuläre Hypertrophy, die in transgenen Mäusen, die Igf2 ausgehend von einem Muskelspezifischen Promotor überexprimieren, beobachtet wurde, dienen zur Unterstützung dieser Hypothese (Nadia Rosenthal, persönliche Mitteilung). Es ist anzumerken, daß von allelischen Varianten des INS VNTR kürzlich gezeigt wurde, daß sie mit der Größe bei der Geburt im Menschen¹⁶ assoziiert sind und daß von demselben VNTR gezeigt wurde, daß er das Niveau der Igf2 Expression¹⁷ beeinflußt.
Die Beobachtungen des gleichen QTL Effekts in einer Large White x Wild Boar Zwischenkreuzung weist auf die Existenz einer Serie von mindestens drei verschiedenen funktionalen Allelen hin. Außerdem zeigt ein vorläufiger Hinweis basierend auf der Marker-unterstützten Segregationsanalyse eine Rest-Segregation an diesem Locus innerhalb der Piétrian Population (Daten nicht gezeigt). Das Auftreten einer allelischen Serie könnte von unschätzbarem Wert bei der Identifizierung der ursächlichen Po lymorphismen sein, für die es – basierend auf der quantitativen Natur des beobachteten Effekts – unwahrscheinlich ist, daß sie große Genänderungen sondern eher feine regulatorische Mutationen sind.
Die Effekte des identifizierten QTL auf die Muskelmasse und Fetteinlagerung sind tatsächlich groß, und liegen in der selben Größenordnung derer, die für den CRC Locus^6,7 berichtet wurden, obwohl sie offensichtlich nicht mit den schädlichen Effekten auf die Fleischqualität assoziiert sind. Wir nehmen an, daß beide Loci insgesamt 50% der Piétrain gegenüber Large White Zucht Unterschiede bezüglich Muskelkraft und Magerkeit erklären. Ein Verständnis des Eltern-Ursprung Effektes der diesen Locus charakterisiert, wird seine optimale Verwendung in Zuchtprogrammen erlauben. Tatsächlich vererben die Hälfte der Nachkommen aus kommerziellen populären Piétrain x Large White gekreuzten Ebern das ungünstige Large White Allel, was zu einen merklichen Verlust führt.
Der QTL, der in dieser Arbeit beschrieben wird, ist das zweite Beispiel eines Gens, das die Muskelentwicklung bei Vieharten beeinflußt, und das ein nicht-Mendelsches Vererbungsmuster zeigt. Tatsächlich haben wir zuvor gezeigt, daß der „callipyge" Locus (verwandt zu dem qualitativen Trait, wobei die Muskeln verdoppelt sind) durch eine polare Überdominanz charakterisiert ist, bei der nur die heterozygoten Individuen, die die CLPG Mutation von ihren Vätern geerbt haben, den doppel-Muskel Phänotyp exprimieren⁵. Dies zeigt, daß Eltern-Ursprung Effekte, die Gene beeinflussen, die Produktions-Traits bei Vieh zugrunde liegen, relativ alltäglich sein könnten.
Beispiel 3:
Herstellung einer Referenz-Sequenz des IGF2 und flankierenden Loci im Schwein.
Die Erfindung stellt einen geprägten QTL mit einem Haupteffekt auf die Muskelmasse zur Verfügung, der zum IGF2 Locus im Schwein kartiert und die Verwendung des QTL als Werkzeug bei der Marker-unterstützten Selektion. Um dieses Werkzeug für die Marker-unterstützte Selektion genauer einzustellen, genauso wie dafür, außerdem eine ursächliche Mutation zu identifizieren, haben wir des weiteren eine Referenzsequenz erzeugt, die die gesamte porcine IGF2 Sequenz genauso wie die der flankierenden Gene umfaßt.
Um dies zu erreichen, haben wir eine porcine BAC Bibliothek mit IGF2 Sonden gescreent und zwei BACs identifiziert. Es zeigte sich, daß BAC-PIGF2-1 die INS und IGF2 Gene enthält, während es sich zeigte, daß BAC-PIGF2-2 die IGF2 und H19 Gene enthält. Die NotI Karte genauso wie die relative Position der zwei BACs ist in 5 gezeigt. BAC-PIGF2-1 wurde mittels Schrotschuß („shotgun") unter Verwendung von Standardverfahren und automatischen Sequenziergeräten sequenziert. Die resultierenden Sequenzen wurden unter Verwendung von Standardsoftware zusammengesetzt, was insgesamt 115 Contigs ergab. Die entsprechenden Sequenzen sind in 6 dargestellt. Ähnlichkeitssuchen wurden zwischen den porcinen Contigs und den orthologen Sequenzen beim Menschen durchgeführt. Signifikante Homologien wurden für 18 Contigs nachgewiesen und sind in 7 dargestellt.
Für BAC-PIGF2-2 wurde das 24 kB NotI Fragment, das in BAC-PIGF2-1 nicht vorhanden ist, subkloniert und unter Verwendung des EZ::TN Transposonansatzes und von ABI automatischen Sequenziergeräten sequenziert. Die resultierenden Sequenzen wurden unter Verwendung des Phred-Phrap-Consed Ram Programm-Paketes zusammengesetzt, was sieben verschiedene Contigs ergab (8). Die Contig Sequenzen wurden mit den entsprechenden orthologen humanen Sequenzen unter Verwendung des „compare und dotplot" Programms des GCG Paketes abgeglichen. 9 stellt die entsprechenden Ergebnisse zusammen.
Beispiel 4: Identifizierung von DNA Sequenz-Polymorphismen in dem IGF2 und flankierenden Loci.
Basierend auf der Referenzsequenz, die wie in Beispiel 1 erhalten wurde, haben wir einen Teil des IGF2 und der flankierenden Loci aus genomischer DNA, die von Piétrain, Large White und Wild Boar Individuen isoliert wurde, re-sequenziert, was die Identifizierung von DNA Sequenz Polymorphismen, wie die in 10 dargestellten, erlaubte.
Legenden zu den Figuren
1: Test Statistikkurven, die in QTL Analysen von Chromosom 2 in einer Wild Boar/Large White Zwischenkreuzung erhalten wurden. Der Graph zeichnet das F-Verhältnis, das die Hypothese eines einzelnen QTL an einer gegebenen Position testet, entlang dem Chromosom für die angezeigten Traits auf. Die Markerkarte mit den Distanzen zwischen den Markern in Kosambi centi-Morgan ist auf der x-Achse gegeben. Die horizontalen Linien stellen die Genom-artige signifikanten (p < 0,05) und sinnvollen Niveaus für den Trait Magerfleisch in Schinken dar; ähnliche Signifikanzschwellenwerte wurden für die anderen Traits erhalten.
2: Piétrain Schwein mit charakteristischer muskulärer Hypertrophy.
3: Iod-Wert Kurven, die in einer Piétrain x Large White Zwischenkreuzung auf dem Schweinechromosom 2 für sechs Phänotypen, die die Muskelmasse und Fetteinlagerung messen, erhalten wurden. Die wahrscheinlichsten Positionen der Igf2 und MyoD Gene, die durch Verknüpfungsanalyse bezüglich der Mikrosatellitenmarkerkarte bestimmt wurden, sind gezeigt. H₀ wurde als die Null-Hypothese von keinem QTL definiert, H₁ als Testen auf das Vorhandensein eines Mendelschen QTL, H₂ als Testen auf das Vorhandensein eines väterlich exprimierten QTL und H₃ als Testen auf das Vorhandensein eines mütterlich exprimierten QTL. 3a: log₁₀(H₁/H₀), 3b: log₁₀ (H₂/H₀), 3c: log₁₀ (H₃/H₀).
4: A. Struktur des humanen Igf2 Gens gemäß Ref. 17, mit der abgeglichenen porcinen erwachsenen Leber cDNA Sequenz, wie in Ref. 16 beschrieben. Die Position der nt241 (G-A) Transition und des Swc9 Mikrosatelliten sind gezeigt. B. Die entsprechenden Marker wurden verwendet, um die mono-allelische (väterliche) Expression des Igf2 in Skelettmuskel und Leber von 10 Wochen alten Föten zu demonstrieren. PCR Amplifikation des nt421 (G-A) Polymorphismus und des Swc9 Mikrosatelliten aus genomischer DNA zeigt eindeutig die Heterozygosität des Fötus, während nur das väterliche Allel in der Leber cDNA (nt421(G-A) und Swc9) und in der Muskel cDNA (Swc9) nachgewiesen wurde. Die Abwesenheit des RT-PCR Produktes für nt421 (G-A) vom fötalem Muskel weist auf die Abwesenheit der mRNA, die das Exon 2 einschließt, in diesem Gewebe hin. Der elterliche Ursprung der fötalen Allele wurde aus den Genotypen des Vatertiers und Muttertiers bestimmt (Daten nicht gezeigt).
5: Eine NotI Restriktionskarte, die die relative Position des BAC-PIGF2-1 (umfassend die INS und IGF2 Gene) und BAC-PIGF2-2 (umfassend die IGF2 und H19 Gene) zeigt.
6: Nukleinsäure Sequenzen des Contig 1 bis Contig 115, die von BAC-PIGF2-1 erhalten wurden, welcher mittels Schrotschuß unter Verwendung von Standardverfahren und automatischen Sequenziergeräten sequenziert wurde.
7: Ähnlichkeit zwischen porcinen Contigs der 6 und orthologen Sequenzen im Menschen.
8: Nukleinsäure Sequenzen des Contig 1 bis Contig 7, die von BAC-PIGF2-2 erhalten wurden, (das 24 kb NotI Fragment ist in BAC-PIG2-1 nicht vorhanden), welcher subkloniert und unter Verwendung des EZ::TN Transposonansatzes und von ABI automatischen Sequenziergeräten sequenziert wurde.
9: Ähnlichkeit zwischen porcinen Contigs der 8 und orthologen Sequenzen im Menschen.
10: DNA Sequenzpolymorphismen in dem IGF2 und flankierenden Loci von genomischer DNA, die aus Piétrain, Large White und Wild Boar Individuen isoliert wurde.
Referenzen
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Tabelle 1, fortgesetzt

¹ Nur die Traits, für die der QTL Peak in der IGF2 Region (0-10 cM) lag und die Teststatistik den nominalen Signifikanzschwellenwert von F = 3,9 erreichte, sind eingeschlossen.
² "QTL" ist die Teststatistik für das Vorhandensein eines QTL unter einem genetischen Modell mit additiven, Dominanz und prägenden Effekten (3 d. f.) während „Prägung" die Teststatistik für das Vorhandensein eines prägenden Effektes (1 d.f.) ist, wobei beides an der Position des QTL Peaks erhalten wurde. Genom-artige Signifikanzschwellenwerte, die durch Permutationen berechnet wurden, wurden für den QTL Test verwendet, während nominale Signifikanzschwellenwerte für den Prägungstest verwendet wurden.
³ In cM vom distalen Ende des 2p; IGF2 ist bei 0,3 cM lokalisiert.
⁴ Die Reduktion in der Rest-Varianz der F₂ Population, die durch Einbezug eines geprägten QTL an einer gegebenen Position hervorgerufen wurde.
⁵ Mittelwerte und Standardfehler, die am IGF2 Locus durch Klassifizierung des Genotyps gemäß der Population und dem Eltern-Ursprung jedes Allels berechnet wurden. W und L stellen Allele dar, die von Wild Boar bzw. Large White Gründern abgeleitet wurden; die oberen Indizes P und M stellen einen väterlichen bzw. mütterlichen Ursprung dar. Figuren mit verschiedenen Buchstaben (oberer Index a oder b) sind mindestens beim 5% Niveau signifikant verschieden, während die meisten von Ihnen beim 1% oder 0,1 % Niveau verschieden sind.

Tabelle 2 Maximum likelihood phänotypische Mittelwerte für die verschiedenen F2 Genotypen, die unter (i) einem Modell eines Mendelschen QTL und (ii) einem Modell, das einen geprägten QTL annimmt, berechnet wurden.

Traits	Mendelscher QTL				geprägter QTL
Traits	μ_LW/LW	μ_LW/P	μ_P/P	R	μ_PAT/LW	μ_PAT/P	R
BFT (cm)	2.98	2.84	2.64	0.27	2.94	2.70	0.27
% Schinken	21.10	21.56	22.15	0.83	21.23	21.9 5	0.83
% Lende	24.96	25.53	26.46	0.91	25.12	26.1 4	0.93
% Mager-Schnitte	65.02	65.96	67.60	1.65	65.23	67.0 5	1.67
% Rückenfett	6.56	6.02	5.33	0.85	6.43	5.56	0.85
% Fett-Schnitte	28.92	27.68	26.66	1.46	28.54	26.9 9	1.49

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Auswählen eines Nutztieres, so daß dieses gewünschte genotypische Eigenschafen aufweist, bei dem man das Tier auf das Vorhandensein eines elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL) testet.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man ferner eine Nukleinsäureprobe des Tieres auf das Vorhandensein eines elterlich geprägten Quantitativen Trait Locus (QTL) testet.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der QTL beim Schwein auf Chromosom 2 lokalisiert ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei der QTL um Position 2pl.7 kartiert.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-4, wobei der QTL mit der potentiellen Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung des Tieres in Verbindung steht.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der QTL mindestens einen Teil eines Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 2 (IGF2) Gens umfaßt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-6, wobei der QTL im Schwein einen Marker umfaßt, der als nt241(G-A) oder als Swc9 charakterisiert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei überwiegend ein väterliches Allel des QTL in dem Tier exprimiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7, wobei überwiegend ein mütterliches Allel des QTL in dem Tier exprimiert wird.
Verwendung eines Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, um ein Zuchttier oder ein Tier, das für die Schlachtung vorgesehen ist, oder Embryos oder Samen, die von diesen Tieren erhalten wurden, auszuwählen, so daß dieses/diese gewünschte genotypische oder mögliche phänotypische Eigenschaften aufweist/aufweisen.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei diese Eigenschaften mit der Muskelmasse und/oder Fetteinlagerung in Verbindung stehen.