-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Die
Erfindung betrifft die Formulierungen für die kontrollierte Verabreichung
von Wachstumsfaktoren. In spezifischen Ausführungsformen betrifft die Erfindung
die kontrollierte Freigabe von angiogenen Wachstumsfaktoren für die Behandlung
eines ischämischen
Gewebes und/oder für
die Wundheilung.
-
Polypeptid-Wachstumsfaktoren
regulieren das Wachstum und die Vermehrung von Zellen. Eine Anzahl
von menschlichen Wachstumsfaktoren wurden identifiziert und charakterisiert.
Diese schließen
nur beispielhaft den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), den sauren Fibroblasten-Wachstumsfaktor (aFGF),
den vaskulären
endothelialen Zellwachstumsfaktor (VEGF), den Thrombocyten-Wachstumsfaktor (PDGF),
die Insulin-ähnlichen
Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II),
den Nervenwachstumsfaktor (NGF), den epidermalen Wachstumsfaktor
(EGF) und den Heparin-bindenden EGF-ähnlichen Wachstumsfaktor (HBEGF) ein.
Aufgrund ihrer Fähigkeit,
das Zellwachstum und die Zellvermehrung zu stimulieren, wurden Wachstumsfaktoren
als Wundheilungsmittel verwendet. Einige Wachstumsfaktoren wie z.B.
bFGF und VEGF zeigen starke angiogene Wirkungen, das heißt, sie
stimulieren das Wachstum von neuen kapillaren Gefäßen. Diese
angiogenen Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um Erkrankungen zu
behandeln, die mit Ischämie
assoziiert sind, wie z.B. eine Erkrankung der Koronararterie und
eine Erkrankung der peripheren Gefäße. Durch die Behandlung von
ischämischem
Gewebe mit einem angiogenetischen Wachstumsfaktor werden neue Blutgefäße hergestellt,
die in der Lage sind, verschlossene Abschnitte von Arterien zu umgehen,
wodurch der Blutfluss zu dem betroffenen Gewebe wiederhergestellt
wird (ein Verfahren, das manchmal als ein "Bio-Bypass" bezeichnet wird). Angiogenetische Wachstumsfaktoren
wurden ebenfalls verwendet, um Wundheilung zu fördern.
-
Yakehe
Hakhoechi, 25(3), 177-188 (1995) (Chemical Abstracts: 124:211858)
offenbart eine wässrige topische
Herstellung von EGF zur Behandlung von offenen Wunden und Verbrennungen,
die das Poloxamer 407 als eine Gelbasis in Kochsalzlösung und
Gelatine oder Amastatin als einen Proteasehemmstoff umfasst.
-
EP-A-O 312 208 offenbart
Gel-Formulierungen von Polypeptid-Wachstumsfaktoren, die ein wasserlösliches
oder wasserquellbares, pharmazeutisch verträgliches Polymer enthalten,
um bei Raumtemperatur eine Viskosität im Bereich von 1.000 bis
12.000.000 cps zur Verfügung
zu stellen.
-
Eine
große
Herausforderung bei der Verwendung von Wachstumsfaktoren ist die
Entwicklung eines Vehikels zur Verabreichung, welches das geeignete
Maß der
biologischen Verfügbarkeit
des Arzneistoffs an dem betroffenen Gebiet zur Verfügung stellt,
um ein erwünschtes
klinisches Ergebnis zu erzielen. Das
US-Patent
Nr. 5,457,093 offenbart daher die Verwendung von verschiedenen
Mitteln zur Herstellung von Hydrogelen mit einer relativ hohen Viskosität, die Wachstumsfaktoren
enthalten. Wir haben jedoch gezeigt, dass die Verwendung eines Hydrogels,
das bFGF und Hydroxyethylcellulose enthält, nicht das gewünschte Ergebnis
in einer klinischen Humanstudie erzielte, die auf eine topische
Wundheilung gerichtet war, obwohl bFGF ein starker angiogenetischer
Wirkstoff ist und andere biologische Aktivitäten besitzt, die in einem Wundheilungsmittel
erwünscht
sind. Zusätzlich
haben wir gezeigt, dass die Verwendung eines Hydrogels, das bFGF
und ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer (Pluronic)
enthält,
in einem Tiermodel der Angiogenese nicht eine erwünschte angiogene
Antwort hervorruft.
-
Ein
anderes Problem, auf das bei der Herstellung von Formulierungen
zur kontrollierten Freisetzung von Polypeptid-Wachstumsfaktoren
gestoßen
wird, besteht darin, dass die zur Verleihung von Eigenschaften der
kontrollierten Freisetzung verwendeten Excipienten die Herstellung
einer homogenen Dispersion des Wachstumsfaktors durch einfache Mischtechniken
erschweren können.
Eine topische Formulierung von PDGF wurde zum Beispiel kommerziell
hergestellt, wobei mehr als 1 % Carboxymethylcellulose verwendet
wurde. Bei solchen Konzentrationen ist die Erzielung einer homogenen
Dispersion des Polypeptids schwierig.
-
Es
ist eine Aufgabe der Erfindung, eine Formulierung für die kontrollierte
Freigabe von Polypeptid-Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu
stellen, die den Wachstumsfaktor mit einer Geschwindigkeit freisetzt, die
eine Angiogenese und/oder eine Wundheilung fördert.
-
Es
ist eine andere Aufgabe der Erfindung, Verfahren zur Verabreichung
von Wachstumsfaktoren bei kontrollierten Geschwindigkeiten zur Verfügung zu
stellen, welche die Wundheilung und/oder die Angiogenese in einem
Patienten fördert,
der eine solche Behandlung benötigt.
-
Es
ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, Formulierungen für die kontrollierte
Freisetzung von Polypeptid-Wachstumsfaktoren zur Verfügung zu
stellen, die als homogene Zusammensetzungen durch einfache Mischtechniken
hergestellt werden können.
-
Andere
Aufgaben der Erfindung werden durch die nachfolgende Beschreibung
offensichtlich werden.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine Hydrogelzusammensetzung für die kontrollierte Freigabe eines
Polypeptid-Wachstumsfaktor zur Verfügung gestellt, umfassend:
- (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines
Polypeptid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit positiver
Ladung enthält;
- (b) ein physiologisch verträgliches
wassermischbares anionisches Polymer;
- (c) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen
polymeren Viskositätsregler;
und
- (d) Wasser.
-
Wir
haben gezeigt, dass die Verwendung eines anionischen Polymers in
Kombination mit einem nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler
eine unabhängige
Kontrolle der Freisetzungscharakteristika des Arzneistoffs und der
physikalischen Charakteristika, das heißt der Viskosität, der Formulierung
ermöglicht.
Insbesondere haben wir gezeigt, dass das wassermischbare anionische
Polymer verwendet werden kann, um eine therapeutisch wirksame Geschwindigkeit
der Freisetzung zu verleihen, wenn es in niedrigen Konzentrationen
verwendet wird. Vorzugsweise wird das wassermischbare anionische
Polymer aus Natriumcarboxymethylcellulose und Poly(acrylsäure) ausgewählt. Die
Poly(acrylsäure)
verleiht eine therapeutisch wirksame Geschwindigkeit der Freisetzung,
wenn sie einen so geringen Anteil wie 0,001 Gew.-% bis 0,01 Gew.-%
der gesamten Hydrogelzusammensetzung darstellt. Bei dieser niedrigen
Konzentration trägt
die Poly(acrylsäure) nicht
wesentlich zu einer Zunahme der Viskosität der Formulierung bei. Daher
kann die Poly(acrylsäure)
verwendet werden, um die Geschwindigkeit der Freisetzung des Wachstumsfaktors
zu optimieren, damit eine gewünschte
biologische Wirkung erzielt wird, während das physiologisch verträgliche nicht-ionische
Polymer verwendet wird, um eine gewünschte Viskosität für die Verwendung
in einer bestimmten Anwendung zu erhalten. Während ein hoch visköses Hydrogel
gemäß der Erfindung
hergestellt werden kann, haben wir gezeigt, dass eine hohe Viskosität nicht
notwendig ist, um eine gewünschte
biologische Wirkung bei der Wundheilung oder der Angiogenese zu
erhalten.
-
Dementsprechend
betrifft ein Aspekt der Erfindung eine Hydrogelzusammensetzung für die kontrollierte
Freigabe des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors, umfassend:
- (a) eine therapeutisch wirksame Menge des basischen
Fibroblasten-Wachstumsfaktors;
- (b) ein physiologisch verträgliches
wassermischbares anionisches Polymer in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-%
bis etwa 0,1 Gew.-%;
- (c) einen nicht-ionischen wassermischbaren polymeren Viskositätsregler
in einer Menge von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-%; und
- (d) Wasser.
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren für die kontrollierte
Freigabe eines Wachstumsfaktors, das die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung
an einen Patienten umfasst, der eine Behandlung mit. einem solchen
Wachstumsfaktor benötigt,
umfassend:
- (a) eine therapeutisch wirksame
Menge eines Polypeptid-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit
positiver Ladung enthält;
- (b) ein physiologisch verträgliches
wassermischbares anionisches Polymer;
- (c) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren nicht-ionischen
polymeren Viskositätsregler;
und
- (d) Wasser.
-
Ein
noch weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Förderung
der Wundheilung, welches die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung
mit einer kontrollierten Freisetzung an einen Patienten umfasst,
der eine solche Behandlung benötigt,
umfassend:
- (a) eine therapeutisch wirksame
Menge des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors;
- (b) ein physiologisch verträgliches
wassermischbares anionisches Polymer in einer Menge von etwa 0,001 Gew.-%
bis etwa 0,1 Gew.-%;
- (c) einen nicht-ionischen wassermischbaren polymeren Viskositätsregler
in einer Menge von etwa 0,5 Gew.-% bis etwa 25 Gew.-%; und
- (d) Wasser.
-
Ein
weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung
eines Wachstumsfaktors, der kontrolliert freigesetzt wird, umfassend
das Dispergieren in Wasser von:
- (a) einem physiologisch
verträglichen
wassermischbaren nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler;
- (b) einer ausreichenden Menge eines physiologisch verträglichen
wassermischbaren anionischen Polymers zur Verleihung einer kontrollierten
Freisetzung des Wachstumsfaktors aus der Zusammensetzung; und
- (c) einer therapeutisch wirksamen Menge eines Polypeptid-Wachstumsfaktors,
der mindestens eine Region mit positiver Ladung besitzt;
-
Ein
anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung
von Ischämie
durch die Verabreichung einer Hydrogelzusammensetzung mit kontrollierter
Freisetzung an eine Region eines ischämischen Gewebes in einem Patienten,
der an einem Zustand leidet, die durch Ischämie charakterisiert wird, umfassend:
- (a) eine therapeutisch wirksame Menge eines
angiogenen Polypeptid-Faktors, der mindestens eine Region mit positiver
Ladung besitzt, der vorzugsweise aus der Gruppe, bestehend aus dem
basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor
und dem vaskulären
endothelialen Zellwachstumsfaktor, ausgewählt ist;
- (b) einen physiologisch verträglichen wassermischbaren anionischen
polymeren Viskositätsregler;
und
- (c) Wasser.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 ist
eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden
Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Akkumulation von Granulationsgewebe
in einem Wundheilungsmodel eines ischämischen Kaninchenohrs.
-
2 ist
eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden
Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Akkumulation von Epithelgewebe
in einem Wundheilungsmodel eines ischämischen Kaninchenohrs.
-
3 ist
eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden
Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Spalte von Granulationsgewebe
in Wunden eines ischämischen
Kaninchenohrs.
-
4 ist
eine graphische Darstellung der Wirkung einer bFGF-enthaltenden
Hydrogelformulierung der Erfindung auf die Spalte von Epithelgewebe
in Wunden eines ischämischen
Kaninchenohrs.
-
5 stellt
die Freisetzung von bFGF aus Gelformulierungen dar, die 0,4 mg/ml
bFGF enthalten. A: 10% Pluronic® und
0,8% CMC; B: 10% Pluronic® und 0,001% Carbopol;
C: 10% Pluronic®.
-
6 stellt
die Freisetzung von bFGF aus Gelformulierungen dar, die 4,0 mg/ml
bFGF enthalten. A: 10% Pluronic® und
0,8% CMC; B: 10% Pluronic® und 0,001% Carbopol®;
C: 10% Pluronic®.
-
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung können für die kontrollierte Freigabe
eines Polypeptids-Wachstumsfaktors, der mindestens eine Region mit
einer positiven Netto-Ladung besitzt, verwendet werden. Der Ausdruck "mindestens eine Region
mit einer positiven Netto-Ladung" bedeutet,
dass der Polypeptid-Wachstumsfaktor eine gesamte positive Netto-Ladung
besitzt oder dass er mindestens eine positiv geladenen Domäne besitzt,
die in der Lage ist, mit dem anionischen Polymer in einer solchen
Weise zu interagieren, um die Freisetzung des Wachstumsfaktors aus
der Zusammensetzung zu verlangsamen. Nur beispielhaft können der
basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, einschließlich ohne
die Einschränkung
der 155-, 154- und 146-Aminosäure-Formen),
der vaskuläre
endotheliale Zellwachstumsfaktor (VEGF, einschließlich ohne die
Einschränkung
der 189-, 165-, 145-, 121- und 110-Aminosäureformnen), der Thrombocyten-Wachstumsfaktor
(PDGF), der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der Heparin-bindende
EGF-ähnliche
Wachstumsfaktor (HB-EGF) als Wachstumsfaktoren erwähnt werden,
die für
die Verwendung in der Zusammensetzung der Erfindung geeignet sind.
Die menschlichen Aminosäuresequenzen
sind für
jeden dieser Wachstumsfaktoren bekannt. VEGF und bFGF gehören zu der
Klasse von Wachstumsfaktoren, die angiogene Wirkungen zeigen, das
heißt
sie fördern
das Wachstum von neuen kapillaren Blutgefäßen. Der Prozess der Angiogenese
ist eine wichtige Komponente der Wundheilung. Zusätzlich wurden
diese Polypeptide verwendet, um Erkrankungen zu behandeln, die durch
Ischämie
gekennzeichnet sind. Die Verabreichung eines angiogenen Faktors
an ein ischämisches
Gewebe ruft die Erzeugung von neuen Kapillaren hervor, die eine
verschlosse Arterie umgehen und den Blutfluss zu dem betroffenen
Gewebe wiederherstellen können.
-
Der
Polypeptid-Wachstumsfaktor wird in einer therapeutisch wirksamen
Menge verwendet. Die spezifische Menge des Wachstumsfaktors, die
in der Zusammensetzung verwendet wird, wird in Abhängigkeit
von dem spezifischen Wachstumsfaktor, der zu behandelnden Erkrankung
und dem Dosierungsplan variieren. Der Fachmann kann eine geeignete
Menge des Wachstumsfaktors, der in der Zusammensetzung verwendet
werden soll, bestimmen. Im Allgemeinen kann die Menge von etwa 0,01
Gew.-% bis etwa 5 Gew.-% der Zusammensetzung variieren.
-
Die
Zusammensetzung der Erfindung enthält ebenfalls ein physiologisch
verträgliches
wassermischbares anionisches Polymer. Geeignete Polymere schließen zum
Beispiel Poly(acrylsäure),
Natriumcarboxymethylcellulose, Alginsäure und Hyaluronsäure ein.
Poly(acrylsäure)
und Natriumcarboxymethylcellulose sind bevorzugte anionische Polymere,
wobei Poly(acrylsäure)
am stärksten
bevorzugt wird. Das verwendete anionische Polymer kann ein Molekulargewicht
von etwa 5.000 Da bis zu etwa 5.000.000 Da besitzen.
-
Im
Allgemeinen kann das wassermischbare anionische Polymer in einer
Menge von etwa 0,001% bis etwa 1 % basierend auf dem Gesamtgewicht
der Zusammensetzung verwendet werden. Die Menge des verwendeten
wassermischbaren anionischen Polymers in der Zusammensetzung kann
teilweise in Abhängigkeit von
dem verwendeten spezifischen Polymer variieren. Weil die Ladungsdichte
des anionischen Polymers ein bestimmender Faktor bei der Geschwindigkeit
der Freisetzung ist, können
anionische Polymere, die eine relativ hohe Ladungsdichte (und eine
dementsprechende stärkere
Wechselwirkung mit dem Polypeptid-Wachstumsfaktor) haben, in niedrigeren
Konzentrationen in der Formulierung verwendet werden und noch immer eine
wirksame Kontrolle über
die Geschwindigkeit der Freisetzung haben. Natriumcarboxymethylcellulose
zum Beispiel besitzt eine niedrigere Dichte der negativen Ladung
als Poly(acrylsäure).
Dementsprechend kann Poly(acrylsäure)
bei deutlich niedrigeren Konzentrationen als Natriumcarboxymethylcellulose
wirksam verwendet werden.
-
Wenn
Poly(acrylsäure)
als das wassermischbare anionische Polymer verwendet wird, wird
die Verwendung der Poly(acrylsäure)
in niedrigen Konzentrationen bevorzugt, das heißt von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa
0,1 Gew.-% der Zusammensetzung. Erstaunlicherweise haben wir gezeigt,
dass die Poly(acrylsäure)
in diesen niedrigen Konzentrationen in der Lage ist, die Freisetzung
mit einer Geschwindigkeit zu bewirken, die eine gewünschte biologische
Antwort fördert.
Es wurde gezeigt, dass höhere
Konzentrationen von Poly(acrylsäure),
das heißt,
so hoch wie z.B. etwa 1,0%, die ebenfalls eine positive biologische
Antwort hervorrufen, mit einer Entzündungsantwort assoziiert sind.
Des weiteren kann Poly(acrylsäure)
in höheren
Konzentrationen zu der Viskosität
der Zusammensetzung beitragen.
-
Aufgrund
seiner niedrigeren Ladungsdichte wird Natriumcarboxymethylcellulose
vorzugsweise bei einer etwas höheren
Konzentration verwendet, das heißt von etwa 0,1% bis etwa 1%
basierend auf dem Gesamtgewicht der Zusammensetzung.
-
Die
Zusammensetzung der Erfindung enthält ebenfalls einen physiologisch
verträglichen
nicht-ionischen polymeren Viskositätsregler. Der nicht-ionische
polymere Viskositätsregler
kann ein Molekulargewicht von etwa 5.000 Da bis etwa 15.000 Da besitzen.
-
Ein
bevorzugter nicht-ionischer polymerer Viskositätsregler ist ein Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer.
Solche Copolymere bestehen aus Segmenten oder Blöcken aus polymerisierten Ethylenoxid-Einheiten
und Segmenten oder Blöcken
aus polymerisierten Propylenoxid-Einheiten. Sie sind kommerziell erhältlich in
einem Bereich von Molekulargewichten, der für die Verwendung in den Zusammensetzungen der
Erfindungen geeignet ist. Wir haben zum Beispiel ein Block-Copolymer
des A-B-A-Typs (Polyethylenoxid-Polypropylenoxid-Polyethylenoxid) verwendet, das ein
Molekulargewicht von etwa 12.600 besitzt, das kommerziell unter
dem Markennamen Pluronic® F-127 erhältlich ist.
Bei einem solchen Copolymer ist es von Vorteil, dass sich seine
Viskosität
mit der Temperatur erhöht.
Dementsprechend kann eine Zusammensetzung der Erfindung hergestellt
werden, die bei Raumtemperatur relativ dünnflüssig ist und leicht durch Mischen
hergestellt wird, deren Viskosität
sich aber erhöht,
wenn sie Körpertemperatur
ausgesetzt wird, wodurch verhindert wird, dass die Zusammensetzung
von dem gewünschten
Gebiet der Anwendung hinwegfließt.
-
Die
Menge des verwendeten polymeren Viskositätsreglers kann in Abhängigkeit
von der gewünschten Viskosität für eine bestimmt
Anwendung deutlich variieren. Wir haben gezeigt, dass das Erzielen
einer zufriedenstellend kontrollierten Freisetzung des Wachstumsfaktors
nicht von der Viskosität
der Zusammensetzung abhängig
ist (obwohl eine erhöhte
Viskosität
die Geschwindigkeit. der Freisetzung verlangsamen kann). Die Zusammensetzungen
der Erfindung können
in einem Bereich von dünnflüssigen Flüssigkeiten
bis zu viskösen Gelen
bei Raumtemperatur liegen. Der polymere Viskositätsregler kann von etwa 0,5
Gew.-% bis etwa 25 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung vorliegen,
vorzugsweise von 5 bis zu 20%. Für
einige Anwendungen wie z.B. die topische Wundheilung kann eine relativ
hohe Viskosität
erwünscht
sein, um eine Wanderung des Wachstumsfaktors aus dem Behandlungsgebiet
zu vermeiden. Für
solche Anwendungen würde
eine ausreichende Menge des nicht-ionischen polymeren Viskositätsreglers
verwendet werden, so dass die Zusammensetzung an der Stelle des
Orts der Anwendungen verbleibt.
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung können ebenfalls andere konventionelle
pharmazeutische Excipienten und Zusätze in den üblichen wirksamen Mengen enthalten.
Diese können
zum Beispiel Konservierungsmittel, antimikrobielle Wirkstoffe, Pufferstoffe,
tonisierende Mittel, grenzflächenaktive
Mittel, Antioxidationsmittel, chelatbildende Verbindungen und Proteinstabilisatoren
(z.B. Zucker) einschließen.
-
Die
Formulierungen der Erfindung können
durch Mischen der Bestandteile hergestellt werden. Es ist vorteilhaft,
dass ein Vorratsgel durch Mischen des nicht-ionischen polymeren Viskositätsreglers
in der geeigneten Konzentration durch ein einfaches Mischen hergestellt
werden kann. Das anionische Polymer wird anschließend in
der Vorratsgellösung
gelöst
und eine wässrige
Lösung
des Wachstumsfaktors wird anschließend im Gel gelöst und/oder
das Gel kann verwendet werden, um ein gefriergetrocknetes Pulver,
das den Wachstumsfaktor enthält,
zu rekonstituieren.
-
Die
Zusammensetzungen der Erfindung sind für die Förderung der Wundheilung in
einem Individuum wie z.B. einem Menschen oder einem anderen Säuger nützlich.
Die Wunden, die mit den Zusammensetzungen der Erfindung behandelt
werden können,
schließen
jede Wunde ein, die durch eine zufällige Verletzung, durch eine
chirurgische Verletzung oder durch Krankheitsgeschehnisse hervorgerufen
wird. Diese schließen
Hautverletzungen wie z.B. Verbrennungen, Schnittwunden, Wunden an
Spenderstellen von Hauttransplantationen, Geschwüre einschließlich Druckwunden,
Geschwüre
durch Venenstauung und diabetische Geschwüre; Augenwunden wie z.B. korneale
Geschwüre,
radiäre
Keratotomie, korneales Transplantat, Epikeratophakia und andere
chirurgisch hervorgerufene Augenverletzungen; und innere Wunden
wie z.B. innere chirurgische Verletzungen und Geschwüre ein.
-
Die
Anwendung der Zusammensetzung an dem Ort der Verletzung kann in
Abhängigkeit
von der Art der Wunde und der Konsistenz der Zusammensetzung durch
eine Vielfalt von Möglichkeiten
durchgeführt
werden. Im Fall von einer relativ viskosen Zusammensetzung kann
die Zusammensetzung als Salbe oder Wundsalbe aufgetragen werden.
Im Fall von einer dünnflüssigeren
Zusammensetzung kann die Zusammensetzung auch durch Injektion oder
als Tropfen wie z.B. Augentropfen verabreicht werden. Die Zusammensetzung
kann ebenfalls verwendet werden, um im Fall einer topischen Anwendung
Verbandmaterial oder im Fall einer Anwendung für eine innere Wundheilung ein
Implantationsmaterial, vorzugsweise als ein biologisch abbaubares Implantationsmaterial,
zu imprägnieren.
Die Zusammensetzung kann als eine einzelne Anwendung oder in vielfachen
Anwendungen verabreicht werden, wie es zur Verabreichung einer therapeutischen
Dosis nötig
ist, wie durch die Antwort der Wundheilung bestimmt wird.
-
Zusammensetzungen
der Erfindung, die angiogene Wachstumsfaktoren wie z.B. bFGF oder
VEGF enthalten, können
verwendet werden, um Zustände
zu behandeln, die durch eine Ischämie gekennzeichnet sind, um
den Blutfluss in dem betroffenen Gebiet wiederherzustellen. Solche
Zustände
schließen
eine Erkrankung der Koronararterie und eine Erkrankung der peripheren
Gefäße ein.
Die Zusammensetzung wird dem betroffenen Gewebe zum Beispiel durch
eine Injektion in das gewünschte
Gebiet oder durch die Verwendung eines Implantats, in einer einzelnen
Anwendung oder in mehrfachen Anwendungen, wie es benötigt wird,
verabreicht, um eine therapeutische Dosis zu erzielen, wie durch
die angiogene Antwort bestimmt wird.
-
BEISPIELE
-
In
den nachfolgenden Beispielen hatte die verwendete Natriumcarboxymethylcellulose
(CMC) ein Molekulargewicht von 70.000 Da. Die Poly(acrylsäure) hatte
ein Molekulargewicht von 3.000.000 Da (im Handel unter dem Markennamen
Carbopol® erhältlich).
Das als ein Copolymer des A-B-A-Typs (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Polyoxyethylen)
verwendete Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymer
hatte ein Molekulargewicht von 12.600 (im Handel unter dem Markennamen
Pluronic® 127
erhältlich).
Der verwendete basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) wurde
rekombinant als der menschliche basische Fibroblasten-Wachstumsfaktor,
das Expressionsprodukt eines Gens, das die 155-Aminosäure-Form
des Proteins codiert, hergestellt.
-
BEISPIEL 1: Herstellung der Gelformulierung
-
1. Herstellung einer 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratslösung
-
In
einer Flasche mit einem Volumen von 250 ml wurden 28,125 g Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
in 20 mM Citrat-Puffer mit 1 μM
EDTA (pH-Wert 6,0) gelöst.
Die Lösung
wurde durch Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank bei 4°C bis zur
vollständigen
Auflösung
des Polymers aufgehoben.
-
2. Herstellung einer 0,9% CMC- und 11,25%
Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung
-
In
einer Glasflasche wurden 0,9 g Natriumcarboxymethylcellulose in
100 ml der 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung gelöst, die,
wie vorstehend beschrieben wurde, hergestellt wurde. Die Lösung wurde
durch Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank bei 4°C aufgehoben.
-
3. Herstellung einer 0,001% Poly(acrylsäure)- und
11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung
-
In
einer Glasflasche wurde 1 mg Poly(acrylsäure) in 100 ml der 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Vorratsgellösung gelöst, die,
wie vorstehend beschrieben wurde, hergestellt wurde. Die Lösung wurde durch
Bewegung gemischt und in einem Kühlschrank
bei 4°C
aufgehoben.
-
4. Herstellung einer 4,0 mg/ml bFGF-Gelformulierung
in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% Natriumcarboxymethylcellulose
-
Ein
Reaktionsgefäß des gefriergetrockneten
bFGF (7,2 mg/Reaktionsgefäß) wurde
mit 1,6 ml (Gesamtvolumen 1,8 ml) der Vorratsgellösung (0,9%
CMC und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen) rekonstruiert, um
eine Gelformulierung mit 4,0 mg/ml bFGF, 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
und 0,8% CMC zu erhalten.
-
Die
Formulierung wurde durch Bewegung gemischt, bis das Pulver vollständig gelöst war.
-
5. Herstellung einer 0,4 mg/ml bFGF-Gelformulierung
in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8% CMC
-
Ein
Reaktionsgefäß des gefriergetrockneten
bFGF (7,2 mg/Reaktionsgefäß) wurde
mit 1,8 ml (Gesamtvolumen 2,0 ml) Wasser rekonstruiert. Ein ml der
rekonstruierten bFGF-Lösung
wurde zu 8,0 ml der Vorratsgellösung
(0,9% CMC und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen) zugegeben,
um eine Gelformulierung mit 0,4 mg/ml bFGF, 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
und 0,8% CMC zu erhalten. Die Gelformulierung wurde durch Rühren gemischt,
bis das Pulver vollständig
gelöst
war.
-
6. Herstellung eines 4,0 mg/ml bFGF-Gels
in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
und 0,01% Poly(acrylsäure)
-
Das
Herstellungsverfahren war das gleiche wie für die Herstellung der 0,4 mg/ml
bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8%
CMC, mit der Ausnahme dass die Vorratsgelformulierung aus 0,01%
Poly(acrylsäure)
und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen bestand.
-
7. Herstellung eines 0,4 mg/ml bFGF-Gels
in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
und 0,01% Poly(acrylsäure)
-
Das
Herstellungsverfahren war das gleiche wie für die Herstellung der 0,4 mg/ml
bFGF-Gelformulierung in 10% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen und 0,8%
CMC, mit der Ausnahme dass die Vorratsgelformulierung aus 0,01%
Poly(acrylsäure)
und 11,25% Polyoxyethylen-Polyoxypropylen bestand.
-
Unter
Verwendung der in BEISPIEL 1 beschriebenen Verfahren können Formulierungen
der Erfindung hergestellt werden, die variierende Mengen des Wachstumsfaktors,
des wassermischbaren anionischen Polymers und des wassermischbaren
nicht-ionischen Polymers enthalten.
-
BEISPIEL 2: Förderung der Angiogenese
-
Männliche
und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (225-425 g Körpergewicht) wurden kurz durch
das Einatmen von Isofluran betäubt.
Der Unterleib wurde rasiert und mit 70% Ethanol gereinigt. Unter
Verwendung einer 18- oder 25-Gauge-Nadel wurden Gelformulierungen,
die variierende Dosen von bFGF enthielten und die durch, die in
Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, hergestellt wurden, sowie Kontroll-Gelformulierungen, die
kein bFGF enthielten, subkutan entlang der Mittellinie des Unterleibs
injiziert. Die Tiere waren fast sofort, nachdem das Einatmen von
Isofluran abgebrochen wurde, wach und beweglich.
-
Fünf Tage
nach der Injektion wurden die Tiere durch das Einatmen von Kohlendioxid
oder durch eine Überdosis
von Phenobarbital getötet.
Das Körpergewicht
wurde aufgezeichnet und die Haut des Unterleibs wurde vorsichtig
aufgeschnitten und zurückgebogen,
um die Unterleibsmuskeln freizulegen. Das Gewebe, das die Injektionsstelle
direkt umgab, wurde auf Anzeichen für Angiogenese sowie auf das
Vorhandensein oder das Fehlen von Entzündungen beurteilt. Das Bewertungssystem
war, wie nachfolgend beschrieben wird.
-
- ++++ deutliche Angiogenese
- +++ moderate Angiogenese
- ++ leichte Angiogenese
- + sehr leichte Angiogenese
- – keine
Angiogenese
- I Entzündung
-
Die
Ergebnisse der 5-Tage dauernden Angiogenesetests sind in der nachfolgenden
Tabelle dargestellt. Ergebnis der Angiogenese der bFGF-Gelformulierungen
(5-Tage-Test)
| bFGF
(mg/ml) | Polyoxyethylen-Polyoxypropylen
(Pluronic
127) | anionisches
Polymer | Ergebnis |
| 0.4 | 17% | | – |
| 4.0 | 10% | 0.80%
CMC | +
+ + + |
| 0.4 | 10% | 0.80%
CMC | +
+ + |
| 0.04 | 10% | 0.80%
CMC | +
+ |
| 0 | 10% | 0.80%
CMC | – |
| 0.4 | 15% | 0.50%
PAA | +
+ + +, I |
| 0.4 | 10% | 0.78%
PAA | +
+ + +, I |
| 4.0 | 10% | 0.80%
PAA | +
+ + + +, I |
| 0.4 | 10% | 0.80%
PAA | +
+ + +, I |
| 0.04 | 10% | 0.80%
PAA | +
+ + +, I |
| 0 | 10% | 0.80%
PAA | +,
I |
| 0.4 | 10% | 0.25%
PAA | +
+ +, I |
| 0.4 | 10% | 0.10%
PAA | +
+ +, I |
| 0 | 10% | 0.25%
PAA | +,
I |
| 0 | 10% | 0.10%
PAA | +,
I |
| 0.4 | 10% | 0.0
1% PAA | +
+ + |
| 0.4 | 10% | 0.001%
PAA | +
+ + |
| 0 | 10% | 0.01%
PAA | – |
| 0 | 10% | 0.001%
PAA | – |
-
- PAA = Poly(acrylsaure)
- CMC = Natriumcarboxymethylcellulose
-
BEISPIEL 3: Förderung der Wundheilung
-
Dr.
Thomas Mustoe (Division of Plastic Surgery and Departments of Surgery
and Pathology, Northwestern University Medical School, Chicago)
zeigte, dass Ischämie
im Kaninchenohr, die durch eine chirurgische Durchtrennung von zwei
der drei Hauptohrarterien hervorgerufen wurde, zu einer beeinträchtigten
Heilung von Vollhautwunden führte
(Ahn und Mustoe, Ann Plast Surg 24:17-23 (1990)). Weil die Wunde
durch den darunter liegenden, intakten Knorpel des Ohrs geschient
ist, erfolgt der Wundverschluss durch die zelluläre Infiltration und nicht durch
physikalische Kontraktion. Veröffentliche
Studien haben gezeigt, dass bFGF, das in Kochsalzlösung in
Dosen bis zu 30 μg/Wunde
verabreicht wurde, bei der Stimulation der Akkumulation des Granulationsgewebes
oder des Epithelgewebes in diesen Wunden unwirksam ist (Wu et al.,
Growth Factors 12:29-35 (1995)). Die Wirkungen von bFGF, das in
einer Depot-Gelformulierung verabreicht wurde, wurde in diesem Model
getestet.
-
Zwei
Dosierungsformen von bFGF (0,4 mg/ml und 4,0 mg/ml), die mit 10%
Polyoxyethylen-Polyoxypropylen (Pluronic® 127)
plus 0,001% Poly(acrylsäure)
formuliert wurden, wurden mit Placebokontrollen (Formulierungen
ohne bFGF) in einer Blindstudie getestet. Jede Dosierungsform wurde
mit 10 μl
pro Wunde (4 und 40 μg/Wunde
bFGF) verabreicht. Die Testproben wurden einmal an dem Tag verabreicht,
an dem die Wunde eingeführt
wurde. Eine histologische Auswertung, die nach einer Erholungszeit
von 7 Tagen durchgeführt
wurde, schloss die Quantifizierung der Akkumulation von Granulationsgewebe
und Epithelgewebe ein (Wu et al., 1995). Es wurde eine deutliche
Akkumulation von Granulationsgewebe (dargestellt in 1)
und Epithelgewebe (dargestellt in 2) in dem
Bereich der Wunde als Antwort auf bFGF festgestellt. Zusätzlich war
die Größe der Wunde,
gemessen als Hohlraum mit Granulationsgewebe (dargestellt in 3)
und Hohlraum mit Epithelgewebe (dargestellt in 4),
in einer statistisch signifikanten Weise durch die Behandlung mit
bFGF vermindert, wobei die Formulierung der Erfindung verwendet
wurde. Die P-Werte, die in 1–4 angezeigt
werden, wurde in einem zweiseitigen ungepaarten t-Test ermittelt.
Eine frühere
Arbeit zeigte, dass Dosen von bFGF bis zu 30 μg/Wunde, die in Kochsalzlösung formuliert
wurden, in diesem Model unwirksam waren.
-
BEISPIEL 4: In-vitro-Freisetzung von bFGF
-
Die
in-vitro-Freisetzung von bFGF von verschiedenen Gelformulierungen
wurde unter Verwendung von Franz-Diffusionszellen (Model FDC40015FG,
Crown Bioscientific, Inc., NJ) bei 32°C beurteilt. Jede Zelle besteht
aus einer Spender- und einer Empfängerkammer. Eine hydrophile
Membran (Nucleopore Track-Etch Membrane, Corning Separation Division,
Nr. 110609) wurde zwischen den Spender- und den Empfängerkammern aufgebaut. Die
Membran wurde so ausgewählt,
dass bFGF, nicht aber deutliche Mengen von Pluronic®, Carbopol® oder
Natrium-CMC in die Empfängerkammer übertreten
konnten. Die Gelformulierungen wurden in die Spenderkammer platziert
und eine Pufferlösung
(100 g/ml Heparin in HBS-EP-Puffer [BIA geprüft, BIAcore AB, Uppsala, Schweden,
enthaltend 0,01 M HEPES mit einem pH-Wert von 7,4; 0,15 M NaCl,
3 mM EDTA und 0,05% Polysorbat 20]) wurde in die Empfängerkammer
platziert. Proben wurden aus der Empfängerkammer zu verschiedenen
Zeitpunkten entnommen und die Konzentrationen von bFGF wurden unter
Verwendung eines BiaCore 2000-Instruments (Biacore AB, Uppsala,
Schweden) bestimmt. Die Gesamtmenge und Gesamtfreisetzung in Prozent
wurden anschließend
berechnet und die Ergebnisse werden in den 5 beziehungsweise
6 gezeigt.