DE69935781T2

DE69935781T2 - Modifizierter hitzeschockprotein/peptidantigen komplex

Info

Publication number: DE69935781T2
Application number: DE69935781T
Authority: DE
Inventors: Eckhard R. Coconut Grove PODACK; Julie Miami SPIELMAN; Koichi Miami YAMAZAKI
Original assignee: University of Miami
Current assignee: University of Miami
Priority date: 1998-02-20
Filing date: 1999-02-19
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2019-02-20
Also published as: ES2285832T3; AU757600B2; EP2295065B1; JP5518659B2; US20140335086A1; JP2002506005A; EP1054683A1; CA2321101C; DK1829551T3; US8685384B2; WO1999042121A1; US20080026012A1; DK2295065T3; ATE359084T1; ES2355483T3; AU2773199A; EP1829551A1; JP4768122B2; EP1054683B1; EP1054683A4

Description

Diese Erfindung wurde mit staatlicher Unterstützung unter der Nummer CA57904 gemacht, die von den National Institutes of Health zugeteilt wurde. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an der Erfindung.
1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von immunogenem Material, das nützlich ist als ein Impfstoff zur Prävention und/oder Behandlung von Krebs oder Infektionserkrankungen. Der Impfstoff wird von nicht-kovalenten Komplexen von modifizierten Hitzeproteinen (Hsp), zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, hsp70, hsp90, gp96 sowie Proteindisulfidisomerase gehören, sowie antigenen Peptiden gebildet. Der Impfstoff ist in der Lage, die Immunreaktion einer Person gegen bestimmte Typen von Krebs- oder infizierten Zellen auszulösen oder zu verstärken.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
2.1. Pathobiologie von Krebs
Krebs is in erster Linie gekennzeichnet durch eine Zunahme der Zahl von anormalen Zellen, die sich von einem gegebenen normalen Gewebe ableiten. Der Krankheitsprozess beinhaltet auch die Invasion angrenzender Gewebe durch diese anormalen Zellen sowie die Ausbreitung dieser anormalen Zellen auf regionale Lymphknoten und zu entfernten Orten (Metastase) über das Zirkulationssystem. Klinische Daten und molekular-biologische Untersuchungen zeigen, das Krebs ein Mehrstufenprozess ist, der mit geringfügigen präneoplastischen Veränderungen beginnt, die sich unter bestimmten Bedingungen zu einer Neoplasie entwickeln können.
Beispiele für ein prämalignes anormales Zellwachstum ist eine Hyperplasie, Metaplasie sowie insbesondere eine Dysplasie (im Hinblick auf einen Überblick über derartige anormale Wachstumsbedingungen, siehe Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Ausgabe, W.B. Saunders Co., Philadelphia, Seiten 68-79). Hyperplasie ist eine Form einer kontrollierten Zellvermehrung, die eine Zunahme der Zellzahl bei einem Gewebe oder einem Organ beinhaltet, ohne dass es zu nennenswerten Veränderungen bezüglich der Struktur oder der Funktion kommt. Als lediglich ein Beispiel geht eine endometriale Hyperplasie häufig einem endometrialen Krebs voraus. Eine Metaplasie ist eine Form eines kontrollierten Zellwachstums, bei dem ein Typ von erwachsenen oder vollständig differenzierten Zellen einen anderen Typ erwachsener Zellen ersetzt. Eine Metaplasie kann bei Epithel- oder Bindegewebszellen auftreten. Eine atypische Metaplasie beinhaltet ein etwas ungeordnetes metaplastisches Epithel. Dysplasie ist häufig ein Vorläufer von Krebs, und wird hauptsächlich im Epithel gefunden; sie stellt die am stärksten ungeordnete Form eines nicht-neoplastischen Zellwachstums dar, an der ein Verlust der individuellen Zell-Uniformität und der architektonischen Orientierung von Zellen beteiligt ist. Dysplastische Zellen weisen häufig anormal große, tiefgefärbte Kerne auf, und zeigen eine Pleomorphie. Eine Dysplasie tritt charakteristischerweise auf, wenn eine chronische Reizung oder Entzündung existiert, und wird häufig gefunden in der Cervix, den Atemwegen, der Mundhöhle und Gallenblase.
Eine neoplastische Läsion kann sich klonal entwickeln und eine zunehmende Fähigkeit zur Invasion, zum Wachstum, Metastasenbildung und Heterogenität entwickeln, insbesondere unter Bedingungen, unter denen die neoplastischen Zellen der Überwachung durch das Immunsystem des Wirts entgehen (Roitt, I., Brostoff, J. und Male, D., 1993, Immunology, 3. Auflage, Mosby, St. Louis, Seiten 17.1-17.12).
2.2. Impfung
Die Impfung hat bestimmte Erkrankungen wie die Kinderlähmung, Tetanus, Windpocken, Masern usw. in vielen Ländern der Welt ausgerottet. Dieser Ansatz nutzt die Fähigkeit des Immunsystems aus, Infektionskrankheiten vorzubeugen. Eine derartige Impfung mit nicht-lebenden Materialien, wie beispielsweise Proteinen führt im Allgemeinen zu einer Körperreaktion oder CD4+ Helfer-T-Zellreaktion (Raychaudhuri & Morrow, 1993, Immunology Today, 14:344-348). Andererseits führt eine Impfung oder Infektion mit lebenden Materialien wie lebenden Zellen oder infektiösen Viren im Allgemeinen zu einer CD8+ cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL)-Reaktion. Eine CTL-Reaktion ist für einen Schutz gegen Krebs, infektiöse Viren und Bakterien entscheidend. Das stellt ein praktisches Problem dar, weil der einzige Weg, auf dem eine CTL-Reaktion erreicht wird, die Verwendung lebender Agentien ist, die selbst pathogen sind. Das Problem wird im Allgemeinen dadurch umgangen, dass man abgeschwächte virale und bakterielle Stämme verwendet oder indem man ganze Zellen tötet, die für eine Impfung verwendet werden können. Diese Strategien haben gut funktioniert, wobei jedoch die Verwendung von abgeschwächten Stämmen immer das Risiko beinhaltet, dass das abgeschwächte Agens genetisch mit der Wirts-DNA rekombiniert und sich in einen virulenten Stamm verwandelt. Es besteht daher ein Bedarf nach Verfahren, die durch Impfung mit nicht-lebenden Materialien wie beispielsweise Proteine auf eine spezifische Weise zu einer CD8+ CTL-Reaktion führen.
Die Ära der Tumorimmunologie begann mit Versuchen von Prehn und Main, die gezeigt haben, dass Antigene an den durch Methylcholanthren (MCA) ausgelösten Sarkomas tumorspezifisch waren, da Transplatations-Assays diese Antigene in normalem Gewebe von Mäusen nicht nachweisen konnten (Prehn et al, 1957, J. Natl. Cancer Inst. 18:769-778). Diese Feststellung wurde durch weitere Versuche bestätigt, die zeigten, dass eine tumorspezifische Resistenz gegen MCA-induzierte Tumoren in der Maus ausgelöst werden kann, in der der Tumor entstand (Klein et al., 1960, Cancer Res. 20:1561-1572).
Bei nachfolgenden Untersuchungen fand man tumorspezifische Antigene auch an Tumoren, die mit anderen chemischen oder physikalischen Karzinogenen induziert wurden oder an spontanen Tumoren (Kripke, 1974, J. Natl. Cancer Inst. 53:13333-1336; Vaage, 1968, Cancer Res. 28:2477-2483; Carswell et al., 1970, J. Natl. Cancer Inst. 44:1281-1288). Da diese Untersuchungen eine schützende Immunität gegen das Wachstum von transplantierten Tumoren als Kriterium für tumorspezifische Antigene nutzten, bezeichnet man diese Antigene auch üblicherweise als "tumorspezifische Transplantationsantigene" oder "tumorspezifische Abstoßungsantigene". Verschiedene Faktoren können die Immunogenität des Tumors stark beeinflussen, einschließlich beispielsweise des spezifischen Typs an beteiligtem Karzinogen, die Immunkompetenz des Wirts und die Latenzzeit (Old et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101:80-106; Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49:493-504).
Die meisten, wenn nicht alle, Karzinogene sind Mutagene, die eine Mutation bewirken können, die zur Expression von tumorspezifischen Antigenen führt (Ames, 1979, Science 204:587-593; Weisburger et al., 1981, Science 214:401-407). Einige Karzinogene sind immunsuppressiv (Malmgren et al., 1952, Proc, Soc. Exp. Biol. Med. 79:484-488). Experimentelle Nachweise deuten darauf hin, dass es eine konstante inverse Korrelation zwischen der Immunogenität eines Tumors und der Latenzzeit gibt (der Zeit zwischen der Einwirkung eines Karzinogens und dem Erscheinen des Tumors) (Old et al., 1962, Ann. N.Y. Acad. Sci. 101:80-106; und Bartlett, 1972, J. Natl. Cancer Inst. 49:493-504). Andere Untersuchungen haben die Existenz von tumorspezifischen Antigenen nachgewiesen, die nicht zu einer Abstoßung führen, jedoch nichtsdestoweniger potentiell spezifische Immunreaktionen stimulieren können (Roitt, I., Brostoff, J. und Male, D., 1993, Immunology, 3. Auflage, Mosby, St. Louis, Seiten 17.1-17.12).
2.3. Hitzeschockproteine
Hitzeschockproteine (Hsps) werden austauschbar auch als Stressproteine bezeichnet. Die ersten identifizierten Stressproteine waren Proteine, die von einer Zelle als Reaktion auf einen Hitzeschock synthetisiert wurden. Bis heute wurden drei Hauptfamilien von Hsp identifiziert, und zwar auf der Basis des Molekulargewichts. Die Familien wurden bezeichnet als hsp60, hsp70 und hsp90, wobei die Zahlen das ungefähre Molekulargewicht der Stressproteine in Kilodalton widerspiegeln. Für viele Glieder dieser Familien wurde später gefunden, dass sie auch als Reaktion auf andere Stressstimuli induziert werden, zu denen ein Nährstoffentzug, eine Stoffwechselunterbrechung, Sauerstoffradikale und eine Infektion mit intrazellulären Pathogenen gehören. (vgl. Welch, Mai 1993, Scientific American 56-64; Young, 1990, Annu. Rev. Immunol. 8:401-420; Craig, 1993, Science 260:1902-1903; Gething et al., 1992, Nature 355:33-45; und Lindquist et al., 1988, Annu. Rev. Genetics 22:631-677).
Die wichtigsten Hsps können sich in gestressten Zellen in sehr hohen Mengen akkumulieren, treten jedoch mit niedrigen oder mäßigen Mengen in Zellen auf, die nicht gestresst wurden. Beispielsweise ist das stark induzierbare Säugetierhsp70 bei normalen Temperaturen so gut wie nicht nachweisbar, wird jedoch bei einem Hitzeschock zu einem der am aktivsten synthetisierten Proteine in der Zelle (Welch et al., 1985, J. Cell. Biol. 101:1198-1211). Im Gegensatz dazu liegen hsp90- und hsp60-Proteine bei normalen Temperaturen in den meisten, jedoch nicht allen, Säugetierzellen in großen Mengen vor, und werden durch Hitze weiter induziert (Lai et al, 1984, Mol. Cell. Biol. 4:2802-2810; van Bergen en Henegouwen et al., 1987, Genes Dev. 1:525-531).
Hitzeschockproteine gehören zu den am stärksten konservierten existierenden Proteinen. Beispielsweise weist DnaK, das hsp70 aus E. coli, eine etwa 50%-ige Aminosäuresequenzidentität mit hsp70-Proteinen aus Abschürfungen auf (Bardwell et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:848-852). Die hsp60- und hsp90-Familien zeigen ähnlich hohe Niveaus einer intrafamilären Konservierung (Hickey et al., 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2615-2626; Jindal, 1989, Mol. Cell. Biol. 9:2279-2283). Zusätzlich wurde entdeckt, dass die hsp60-, hsp70- und hsp90-Familien von Proteinen gebildet werden, die bezüglich ihrer Sequenz mit den Stressproteinen verwandt sind, indem sie beispielsweise eine mehr als 35%-ige Aminosäureidentität aufweisen, wobei jedoch ihre Expressionsniveaus durch Stress nicht verändert werden.
Untersuchungen zur zellulären Reaktion auf Hitzeschock und andere physiologische Stressfaktoren haben gezeigt, dass die hsps nicht nur am Zellschutz gegen diese schädlichen Bedingungen beteiligt sind, sondern auch an essentiellen biochemischen und immunologischen Prozessen in nicht gestressten Zellen. Die hsps erfüllen unterschiedliche Arten von Überwachungsfunktionen. Beispielsweise sind hsp70, die im Zellcytoplasma, im Kern, in den Mitochondrien oder im endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind (Lindquist, S. et al., 1988, Ann. Rev. Genetics 22:631-677) an der Präsentation von Antigenen für Zellen des Immunsystems beteiligt, und sie sind auch am Transfer, der Faltung und der Zusammenlagerung von Proteinen in normalen Zellen beteiligt.
Es wird angenommen, dass eine Anzahl von Proteinen, für die man eine Beteiligung an Überwachungsfunktionen annimmt, sich im Lumen des endoplasmatischen Retikulums (ER) aufhalten und beispielsweise Proteindisulfidisomerase (PDI; Gething et al., 1992, Nature 355:33-45), Grp94 oder ERp99 (Sorger & Pelham, 1987, J. Mol. Biol. 194:(2) 341-4), das mit hsp90 verwandt ist, und Grp78 oder BiP, das verwandt mit hsp70 ist (Munro et al., 1986, Cell 46:291-300); Haas & Webl, 1983, Nature 306:387-389), umfassen. Für diese Proteine ist bekannt, dass sie eine Vielzahl von Mutanten, ungefalteten, unvollständig glycosylierten Proteinen binden (Machamer et al., 1990, J. Biol. Chem. 65:6879-6883; Gething et al., 1986, Cell 46:939-950). Die Lokalisierung dieser Hsps im ER wird durch ein Carboxy-terminales Tetrapeptid (lys-Asp-Glu-Leu oder KDEL) vermittelt, das für eine Retention im ER nötig ist (Munro & Pelham, 1987, Cell, 48:899-907). Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Säugetierzellen KDEL, und ist HDEL in Saccharomyces cerevisiae und ist ADE1 in Schizosaccharomyces pombe (Pidoux & Armstrong, 1992, EMBO J. 11:1583-1591).
Im Allgemeinen sind Hitzeschockproteine in der Lage, Proteine oder Peptide zu binden und die gebundenen Proteine oder Peptide in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) freizusetzen. Es wird angenommen, dass eine ATP-Hydrolyse erfolgt, wenn Hsps am Verlauf der Proteinzusammenlagerung beteiligt sind (Flynn et al., 1989, Science, 245:385-390).
2.4. Immunogenitäten von Hitzeschock-/Stressproteinen hsp70, hsp90 und gp96
Srivastava et al. demonstrierten Immunoreaktionen gegen Methylcholanthren-induzierte Sarkomas bei Inzuchtmäusen (1988, Immunol. Today 9:78-83). Bei diesen Untersuchungen wurde gefunden, dass die Moleküle, die für die individuell unterschiedliche Immunogenität dieser Tumoren verantwortlich waren, als Zelloberflächen-Glycoproteine von 96 kDa (gp96) und als intrazelluläre Proteine von 84 bis 86 kDa identifiziert wurden (Srivastava, P.K. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3407-3411; Ullrich, S.J. et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3121-3125). Eine Immunisierung von Mäusen mit gp96 oder p84/86, isoliert aus einem speziellen Tumor, machte die Mäuse gegen den speziellen Tumor immun, jedoch nicht gegenüber antigen verschiedenen Tumoren. Die Isolation und Charakterisierung von Genen, die für gp96 und p84/86 kodieren, ergaben eine signifikante Homologie zwischen diesen, und sie zeigten, dass gp96 bzw. p84/86 die endoplasmatischen, retikulären und cytosolischen Gegenstücke der gleichen Hitzeschockproteine waren (Srivastava, P.K. et al., 1988, Immunogenetics 28:205-207; Srivastava, P.K. et al., 1991, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 167:109-123). Ferner wurde für hsp70 gezeigt, dass es eine Immunität gegenüber dem Tumor hervorruft, aus dem es isoliert wurde, nicht jedoch gegenüber antigen verschiedenen Tumoren. Es wurde jedoch gefunden, dass ein von Peptide befreites hsp70 seine immunogene Aktivität verliert (Udono, M., und Srivastava, P.K., 1993, J. Exp. Med. 178:1391-1396). Diese Beobachtungen suggerieren, dass die Hitzeschockproteine nicht per se immunogen sind, sondern nicht kovalente Komplexe mit antigenen Peptiden bilden, und dass die Komplexe eine spezifische Immunität gegen die antigenen Peptide auslösen können (Srivastava, P.K., 1993, Adv. Cancer Res. 62:153-177); Udono, H. et al., 1994, J. Immunol., 152:5398-5403; Suto, R. et al, 1995, Science, 269:1585-1588).
Die Verwendung von nicht-kovalenten Komplexen aus Stressprotein und Peptid, aufgereinigt aus Krebszellen, zur Behandlung und Prävention von Krebs wurde beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen WO 96/10411, mit Datum vom 11. April 1996, und WO 97/10001, mit Datum vom 20. März 1997 (vgl. auch die anhängigen US-Patentanmeldungen mit Serial-No. 08/796 319, eingereicht am 7. Februar 1997 durch Srivastava und Chandawarkar, und Serial No. 08/796 316, eingereicht am 17. Februar 1997 durch Srivastava, wobei beide hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme inkorporiert werden).
Stressprotein-Peptid-Komplexe können auch aus pathogeninfizierten Zellen isoliert werden und zur Behandlung und Prävention einer Infektion verwendet werden, die durch das Pathogen ausgelöst wird, wie beispielsweise durch Viren und andere intrazelluläre Pathogene, einschließlich Bakterien, Protozoen, Pilzen und Parasiten. Vgl. PCT-Veröffentlichung WO 95/24923, mit Datum vom 21. September 1995.
Immunogene Stressprotein-Peptid-Komplexe können auch hergestellt werden durch in vitro-Komplexieren von Stressprotein und antigenen Peptiden, und die Verwendung derartiger Komplexe zur Behandlung und Prävention von Krebs und Infektionserkrankungen wurde beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO 97/10000, mit Datum vom 20. März 1997. Die Verwendung von Hitzeschockprotein in Kombination mit einem definierten Antigen zur Behandlung von Krebs und Infektionserkrankungen wurde auch beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO 97/06821, mit Datum vom 27. Februar 1997.
Die Verwendung von Stressprotein-Peptid-Komplexen zur Sensibilisierung von antigenpräsentierenden Zellen in vitro zur Verwendung bei der adoptiven Immuntherapie wird beschrieben in der PCT-Veröffentlichung WO 97/10002, mit Datum vom 20. März 1997.
Die Verabreichung von exprimierbaren Polynucleotiden, die für eukaryontische Hitzeschockproteine kodieren, an Säugetierzellen zur Stimulierung einer Immunreaktion sowie zur Behandlung von Infektionserkrankungen und Krebs wurde beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen WO 97/06685 und WO 97/06828, beide mit dem Datum vom 27. Februar 1997.
Die Reinigung von. Stressprotein-Peptid-Komplexen aus Zelllysaten wurde bereits früher beschrieben; vgl. beispielsweise die PCT-Veröffentlichung WO 95/24923, mit Datum vom 21. September 1995.
Zum Zwecke der Herstellung eines Impfstoffs gegen Krebs steht die Menge an immunogenem Material, das für eine Verwendung erhältlich ist, in direkter Beziehung zur Menge an Ausgangs-Krebszellen. Da aus einem Patienten nur eine geringe Zahl von Krebszellen erhalten werden kann, insbesondere dann, wenn sich der Krebs in einem frühen Stadium befindet, ist der Vorrat an Krebszellen zur Herstellung des Hsp-Peptidkomplexes häufig außerordentlich beschränkt. Für die kommerzielle Herstellung eines Impfstoffs oder therapeutischen Mittels ist eine konstante Versorgung mit großen Mengen an Hsp-Peptid-Komplexen von Vorteil. Es besteht daher ein Bedarf nach einer verläßlichen Quelle für Hsp-Peptid-Komplexe. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können dazu verwendet werden, therapeutische Hsp-Peptid-Komplexe auf eine bequeme und rasche Weise bereitzustellen, selbst wenn nur eine sehr geringe Menge an Gewebe aus einem Patienten zur Verfügung steht.
3. KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung zur Verwendung bei der Prävention und Behandlung von Krebs oder Infektionserkrankungen.
Die nach den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten immunogenen Zusammensetzungen umfassen nicht-kovalent assoziierte molekulare Komplexe aus einem modifizierten Hitzeschockprotein (Hsp) und einem antigenen (oder immunogenen) Peptid. Die modifizierten Hitzeschockproteine der vorliegenden Erfindung werden von einer Zelle sekretiert, in der sie exprimiert werden; ihnen fehlt eine endoplasmatische Retikulums-Retentionssequenz, die in dem unmodifizierten Hitzeschockprotein vorhanden ist; und sie weisen einen Peptid-Tag auf. Für ein Hsp, das sich natürlicherweise im Cytoplasma befindet, ist es so modifiziert, so dass es von einer Zelle sekretiert wird, in dem es exprimiert wird; weist einen Peptid-Tag auf; und umfasst ein Leader-Peptid, das in dem unmodifizierten Hitzeschockprotein nicht vorhanden ist. Die Modifikation stört oder beeinträchtigt das nicht-kovalente Binden von Peptiden durch ein modifiziertes Hitzeschockprotein nicht, auch nicht die Fähigkeit der nicht-kovalenten Komplexe, sich an der Antigen-Präsentation zu beteiligen. Wenn die modifizierten Hsps in rekombinanten Zellen exprimiert werden, werden sie sekretiert und können mit Hilfe des Peptid-Tags unter Anwendung einer Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Bei einer Ausführungsform liefert die Erfindung Nucleinsäuren, die Nucleotidsequenzen umfassen, die für modifizierte Hsp kodieren ("modifizierte Hsp-Gen-Sequenzen"), sowie Kloniervektoren, Expressionsvektoren und Wirtszellen, die derartige Nucleinsäuren enthalten. Im Allgemeinen umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren das Konstruieren einer Nucleotidsequenz, die für ein modifiziertes Hitzeschockprotein kodiert, das Klonieren der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in einem Expressionsvektor, das Einführen des Expressions-Genkonstrukts in Wirtszellen, das Kultivieren der Wirtszellen, so dass das modifizierte Hsp exprimiert wird, und das Reinigen des modifizierten Hsp und/oder der modifizierten Hsp-Peptid-Komplexe.
Die CDNA oder Genom-DNA, die für ein Hitzeschockprotein kodiert, kann nach herkömmlichen DNA-Klonier- und Mutageneseverfahren, durch DNA-Vervielfältigungsverfahren oder mittels synthetischer Verfahren erhalten und modifiziert werden. Im Allgemeinen wird die Sequenz, die für das Hsp kodiert, in einen Kloniervektor für Zwecke der genetischen Modifikation und Replikation vor der Expression inseriert. Die modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen werden in einen Expressionsvektor inseriert oder intrachromosonal integriert, funktionsgerecht mit einem oder mehreren Steuerelement(en), wie beispielsweise einem Promotor, verknüpft, um die kodierten modifizierten Hsp in geeigneten Wirtszellen in vitro und in vivo zu exprimieren. Die modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen werden in Wirtszellen eingeführt, wo sie durch die Wirtszellen exprimiert werden, wodurch intrazellulär nicht-kovalente Komplexe aus modifizierten Hsps und Peptiden hergestellt werden (einschließlich derjenigen Peptide, für die die Krebszellen oder das pathogene infektiöse Mittel spezifisch kodieren).
Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Reinigung von immunogenen nicht-kovalenten Komplexen von modifizierten Hsp und antigenen Peptiden in antigenen Zellen bereit, die die Einführung einer modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in die antigenen Zellen, das Kultivieren der rekombinanten antigenen Zellen zur Ermöglichung der Expression der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz, und die Gewinnung und Reinigung der Komplexe aus modifiziertem Hsp und antigenem Peptid, die aus den rekombinanten antigenen Zellen sekretiert werden, aus dem Zellkulturüberstand. Die antigenen Peptide der Komplexe sind repräsentativ für antigene Peptide, die in antigenen Zellen gefunden werden, wie beispielsweise in Krebszellen oder pathogen-infizierten Zellen. Derartige rekombinante antigene Zellen sind als Impfstoff fürtherapeutische und prophylaktische Anwendungen nützlich. Die rekombinanten Wirtszellen können ansatzweise oder kontinuierlich in einem großen Maßstab zur Herstellung von großen Mengen der immunogenen Komplexe kultiviert werden. Die Wirtszellen, die die modifizierten Hsp-Sequenzen enthalten, können für eine zukünftige Verwendung gelagert werden (z.B. durch Lyophilisieren oder Einfrieren).
Gemäß einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Reinigung von modifizierten Hsp in Zellen bereit, die die Einführung einer modifi zierten Hsp-Gen-Sequenz in die Zellen, das Kultivieren der rekombinanten Zellen zur Ermöglichung der Expression der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz, und das Gewinnen und Reinigen des modifizierten Hsp, das aus den rekombinanten Zellen sekretiert wurde, aus dem Zellkulturüberstand umfasst. Vorzugsweise wird die Reinigung dieser modifizierten Hsp durch den Peptid-Tag und Affinitätschromatographie erleichtert. Die vorliegende Erfindung macht es ferner möglich, dass die gereinigten modifizierten Hsp in vitro mit antigenen Peptiden unter Bildung von immunogenen nicht-kovalenten Komplexen für therapeutische und prophylaktische Zwecke beladen werden können.
Bei einer noch weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung und Reinigung von immunogenen nicht-kovalenten Komplexen bereit, die die Coexpression in rekombinanten Zellen einer modifizierten Hsp-Gen-Sequenz und einer Nucleotidsequenz umfasst, die für ein antigenes Peptid kodiert, und das Gewinnen und Reinigen der Komplexe aus modifiziertem Hsp-antigenem Peptid, die aus den rekombinanten Zellen sekretiert wurden, aus dem Zellkulturüberstand. Die rekombinanten Zellen können auch als Impfstoff für therapeutische und prophylaktische Verwendungen verwendet werden.
In verschiedenen Ausführungsformen können die modifizierten Hsp oder die modifizierten Komplexe Hsp-antigenes Peptid durch Affinitätschromatographie gereinigt werden und als Impfstoff für die Prävention und Behandlung von Krebs oder Infektionserkrankungen verwendet werden.
Die immunogenen Zusammensetzungen, einschließlich der Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid sowie rekombinanter Zellen, die die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid sekretieren, die gemäß den Verfahren der Erfindung hergestellt wurden, können eine Immunreaktion bei einem Patienten gegen die Krebszellen oder gegen das infektiöse Mittel auslösen, die therapeutisch oder prophylaktisch wirksam sind. Vorzugsweise ist der Patient die gleiche Person, die die Krebszellen zur Expression eines modifizierten Hsp lieferte. Alter nativ können die Krebszellen oder infizierten Zellen von einer oder mehreren Personen stammen, die sich von dem Patienten unterscheiden, jedoch einen Krebs des gleichen Gewebetyps haben (z.B. Magenkrebs, Brustkrebs, Dickdarmkrebs, Lungenkrebs usw.), oder Infektionskrankheiten, die von dem gleichen Typ von Pathogen ausgelöst werden.
Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren zur Auslösung einer Immunreaktion gegen ein Antigen in einem Individuum bereit, die das Verabreichen eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein, das nicht-kovalent mit einem Antigen oder einem Fragment davon assoziiert ist, und/oder einer rekombinanten Zelle, die einen derartigen immunogenen Komplex sekretiert, umfassen. Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einem Individuum bereit, das Krebs hat oder für das eine Krebsprävention gewünscht wird, die die Verabreichung eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein, das nicht kovalent mit einem Antigen oder einem Fragment davon, die von Krebs abgeleitet sind, assoziiert ist, umfasst, und/oder einer rekombinanten Zelle, die einen derartigen immunogenen Komplex sekretiert. Außerdem stellt die Erfindung Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Infektionserkrankung bei einer Person bereit, die eine Infektionskrankheit hat oder bei der eine Prävention gegen eine Infektionskrankheit gewünscht wird, die die Verabreichung eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein, das nicht kovalent mit einem Antigen oder einem Fragment davon, assoziiert ist, das aus einer infizierten Zelle oder einem infektiösen Mittel abgeleitet ist, umfasst, und/oder einer rekombinanten Zelle, die einen derartigen immunogenen Komplex sekretiert.
Besondere Zusammensetzungen der Erfindung und ihr Herstellungsverfahren sind in den Abschnitten und Unterabschnitten beschrieben, die folgen.
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1a-1c. Gp96-Ig-Sekretion und Charakterisierung, 1a: ELISA für murine IgG aus Überständen der gp96-Ig cDNA-transfizierten und nicht-transfizierten Kleinzell-Lungenkarzinom-Zelllinie #7 (SCLC); die Zellen wurden bei 10⁶/ml plattiert und die Überstände am Tag 3 und am Tag 6 untersucht; wobei gereinigte Maus-IgG (500 ng/ml) als Standard dienten. 1b: SDS PAGE von Protein A-gereinigtem gp96-Ig. Bande 1: Anfärbung mit Coomassieblau (1 μg Protein); Bande 2: Westernblot mit monoklonalem anti gp96 (anti Grp94, 9G10 (100 ng Protein). 1C: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE)-Analyse von gereinigtem modifiziertem gp96-Ig-Fusionsprotein (gp96-Ig), im Vergleich mit Maus IgG (mIgG), und CD30-Ig-Fusionsprotein (CD30-Ig) unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind auf der linken Seite gezeigt.
2a-2d: Sekretion und intrazelluläre Lokalisierung von gp96-Ig. 2a: Gefüllte Kreise: gp96-Ig im Kulturüberstand, offene Kreise: gp96-Ig in Zell-Lysaten. GP96-Ig wurde mittels ELISA quantifiziert, SCLS-gp96-Ig wurden zu 10⁶/ml ausplattiert. 2b: FACS-Analyse von permeabilisiertem SCLC-gp96-Ig; unterbrochene Linie Ziegenanti-Kaninchen-IgG-FITC (negative Kontrolle); durchgezogene Linie Ziegen-anti-Maus-IgG-Phycoerythrin. 2c: FACS-Analyse von nicht-permeabilisiertem SCLS; nicht-transfiziert. 2d: FACS-Analyse von nicht-permeabilisiertem SCLC; gp96-Ig-transfiziertes SCLS. Unterbrochene Linie in beiden Platten ist Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-FITC; durchgezogene Linie Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC.
3a-3b: Verminderte Tumorigenität von gp96-Ig transfizierten E.G7 (3a) und LLC (3b) (ausgefüllte Kreise), im Vergleich mit Mock-transfizierten (Dreiecke) und nicht-transfizierten Zellen (offene Kreise). Pro Parameter wurden Gruppen von sechs Mäusen verwendet.
4a-4d: Sekretorisches gp96-Ig erzeugt ein tumorspezifisches Gedächtnis. C57BL/6-Mäuse wurden zweimal in zweiwöchentlichen Intervallen mit 10⁶ gp96-Ig-transfiziertem E.G7 (volle Kreise in allen Darstellungen), immunisiert, mit 10⁶ bestrahlten EG7 (Dreiecke) und nicht-immunisiert (offene Kreise). Zwei Wochen später wurden die Mäuse (sechs Mäuse pro Gruppe) mit der Anzahl von Tumorzellen wie in den Figuren angegeben gereizt: 4a: E.G7; 4b: EL4; 4c: LLC; 4d: LLC-Ova.
5A-5H: Wirkung der Verminderung an immunokompetenten Zellen auf die Abstoßung von 10⁶ E.G7-gp96-Ig. Es werden die Tumorwachstumskurven bei einer individuellen Maus gezeigt. 5a-5d (obere Darstellungen): Verminderung von immunkompetenten Zellen zwei Tage vor der subkutanen Tumorinokulation. 5e-5h (untere Darstellungen): Verminderung von immunkompetenten Zellen drei Tage nach der subkutanen Tumorinokulation.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Anwendung rekombinanter DNA-Technologie zur Modifizierung von Hitzeschockproteinen, die an einer Antigen-Präsentation beteiligt sind, und der Herstellung von immunogenen Zusammensetzungen, die zur Prävention und Behandlung von Krebs und Infektionserkrankungen verwendet werden können.
Die "antigenen Zellen", die in der Erfindung verwendet werden, können irgendwelche antigenen Zellen sein, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, von Krebszellen, präneoplastischen Zellen, Zellen, die mit einem intrazellulären Pathogen infiziert sind, oder Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, der mit einem infektiösen Mittel infiziert wurde.
Immunogene Hsp-Peptid-Komplexe werden in Krebszellen oder Pathogen-infizierten Zellen natürlich erzeugt. Derartige Hsp-Peptid-Komplexe wurden dazu verwendet, bei einem Empfänger der Komplexe eine spezifische Immunreaktion gegen die gleiche Art von Krebszellen oder infizierten Zellen hervorzurufen, und sind daher nützlich zur Prävention und Behandlung des Krebses oder der Infektionserkrankungen. Derartige immunogene Komplexe werden jedoch im Allgemeinen von diesen Zellen nicht in großen Mengen sekretiert. Darüber hinaus ist es nicht immer möglich oder machbar, große Mengen an Krebszellen oder infizierten Zellen (antigenen Zellen) zu gewinnen, weshalb die Menge der Hsp-Peptiv-Komplexe, die aus derartigen Zellen erhältlich sind, manchmal sehr beschränkt ist. Es ist daher wünschenswert, Wege zu finden, das Problem, dass nur ein begrenzter Vorrat an immunogenen Hsp-Peptid-Komplexen zur Verfügung steht, zu überwinden. Ein Teil des Problems kann auf die Verfahren zur Reinigung von Hsp-Peptid-Komplexen zurückgeführt werden, wie sie gegenwärtig durchgeführt wird, die eine Zell-Lyse erfordern. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren bereit, gemäß denen die immunogenen Hsp-Peptid-Komplexe dazu gebracht werden, von antigenen Zellen in das Kulturmedium sekretiert zu werden. Die antigenen Zellen der Erfindung können kontinuierlich die gewünschten immunogenen Komplexe erzeugen und sekretieren, die dann in bequemer Weise aus dem Kulturmedium geerntet werden können. Verbesserte Verfahren zur Reinigung derartiger immunogener Komplexe aus dem Kulturmedium werden ebenfalls bereitgestellt. Darüberhinaus stellt die Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Immunogenität von Krebszellen und infizierten Zellen bereit, so dass diese antigenen Zellen direkt einer Person als Impfstoff verabreicht werden können, um Krebs oder Infektionskrankheiten zu verhindern oder zu behandeln.
Gemäß einer Ausführungsform umfassen die immunogenen Zusammensetzungen, die nach Verfahren der Erfindung hergestellt werden, nicht-kovalent assoziierte molekulare Komplexe, die ein modifiziertes Hitzeschockprotein (Hsp) und ein antigenes Peptid enthalten, das in einer antigenen Zelle vorhanden ist, oder einen Teil eines darin vorhandenen Proteins. Das modifizierte Hitzeschockprotein der Erfindung wird von einer Zelle sekretiert, in der es exprimiert wird; ihm fehlt eine Sequenz für die Retention im endoplasmatischen Retikulum, die bei dem unmodifizierten Hitzeschockprotein vorhanden ist; und es umfasst einen Peptid-Tag. Wenn die modifizierten Hsp in rekombinanten Zellen exprimiert werden, werden sie sekretiert und können mit Hilfe des Peptid-Tags unter Anwendung von Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform wird ein modifiziertes Hitzeschockprotein der Erfindung von einer Zelle sekretiert, in der es exprimiert wird; weist einen Peptid-Tag auf; und umfasst ein Leader-Peptid, das in dem unmodifizierten Hitzeschockprotein nicht vorhanden ist. Bei solchen Hsps, die normalerweise im Cytoplasma vorhanden sind, erleichtert das Leader-Peptid, das an den Aminoterminus angefügt ist, ihre Translokation in das ER.
Die modifizierten Hsp der vorliegenden Erfindung zeigen die gleiche qualitative biologische Aktivität wie natürlich auftretende Hsps. Die Modifikationen beeinträchtigen die Fähigkeiten der modifizierten Hsp nicht, spezifisch und nicht-kovalent an antigene Peptide zu binden, und derartige gebundene Peptide der relevanten Immunzelle im Verlauf der Antigen-Präsentation zu präsentieren. Somit können die modifizierten Hsp-Immunogene nicht-kovalente Komplexe mit antigenen Eigenschaften bilden, und zwar sowohl in vitro als auch in antigenen Zellen. Modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe, die endogen in antigenen Zellen und in vitro gebildet werden, sind beide in der Lage, eine spezifische Immunreaktion in einem Tier gegen die antigenen Zellen hervorzurufen, von denen sich die antigenen Peptide ableiten.
Insbesondere betrifft die Erfindung die Modifikation von Nucleotidsequenzen, die für Hitzeschockproteine (Hsps) kodieren, die unter natürlichen Bedingungen im endoplasmatischen Retikulum einer tierischen Zelle zurückgehalten werden. Gemäß der Erfindung wird ein Hsp-Gen-Sequenz, vorzugsweise eine DNA-Sequenz, durch Substitution oder Deletion von Teilen der Hsp-Sequenz modifiziert, die für einen Peptidzug kodieren, der das Signal für die Retention des Hsp im ER aufweist. Das Signal zur Retention eines Hsp im ER ist dafür bekannt, dass es in einem Peptidzug zu finden ist, der Xaa-Asp-Glu-Leu (XDEL, wobei X irgendeine Aminosäure sein kann) umfasst, der am Carboxyterminus angeordnet ist. Die Hsp-Gen-Sequenz ist außerdem dadurch modifiziert, dass man eine Nucleotidsequenz an die Hsp-Sequenz anfügt, die für einen Peptid-Tag kodiert. Die resultierende modifizierte Hsp-Sequenz der Erfindung kodiert für ein modifiziertes Hsp-Fusionsprotein, das sekretiert wird und nicht im ER zurückgehalten wird.
Bei einem Hsp, das natürlicherweise im Cytoplasma zu finden ist, wird seine Gen-Sequenz dadurch modifiziert, dass man nicht nur eine Nucleotidsequenz anfügt, die für einen Peptid-Tag kodiert, sondern auch eine Nucleotid-Sequenz, die für ein Leader-Peptid kodiert. Diese Sequenz wird mit dem 5'-Ende des kodierenden Abschnitts der Hsp-Gen-Sequenz verknüpft. Hsps, die ein derartiges hydrophobes Leader-Peptid tragen, werden in das ER-Lumen importiert. Das Leader-Peptid wird von einem Signalerkennungsteilchen erkannt, das die wachsende Hsp-Peptidkette zur cytosolischen Oberfläche von rohen ER-Membranen leitet. Sekretierbare Hsp werden durch die Membran vollständig in das Lumen verlagert, wo das Leader-Peptid durch Proteasen verdaut wird.
Eine Vielzahl von Peptid-Tags mit unterschiedlichen Funktionen und Affinitäten können gemäß der Erfindung verwendet werden, um die Reinigung des modifizierten Hsp oder der modifizierten Hsp-Peptid-Komplexe durch Affinitätschromatographie zu erleichtern. Ein bevorzugter Peptid-Tag umfasst die konstanten Bereiche eines Immunglobulins. In Abhängigkeit vom Peptid-Tag, der mit einem Hsp fusioniert ist, kann das modifizierte Hsp neue Eigenschaften erwerben, wie beispielsweise eine Dimerisierung, die mit Vorteil dazu genutzt werden können, um Funktion des modifizierten Hsp oder der Hsp-Peptid-Komplexe zu verstärken. Sequenzen, die für Peptid-Tags und Leader-Peptide kodieren, Verfahren zur Verknüpfung derartiger Sequenzen mit Hsp-Sequenzen werden im Abschnitt 5.1.4 beschrieben.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Nucleinsäure-Moleküle bereit, die Nucleotid-Sequenzen umfassen, die für modifizierte Hsps ("modifizierte Hsp-Gen-Sequenzen") kodieren sowie Kloniervektoren, Expressionsvektoren und rekombinante Zellen, die derartige Sequenzen enthalten. Die Erfindung umfasst auch Nucleinsäure-Moleküle, die Nucleotid-Sequenzen umfassen, die den modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen komplementär sind. Eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz kann durch Replikation in einem Kloniervektor in einer intermediären Zelle kloniert und/oder expandiert werden, bevor man sie in geeignete Wirtszellen zur Produktion von modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen einführt. Expressionskonstrukte oder Expressionsvektoren, die eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz aufweisen, können nach irgendwelchen bekannten Verfahren auf dem vorliegenden Fachgebiet konstruiert und in die Wirtszellen eingeführt werden, wie beschrieben wird in Abschnitt 5.2.1. In Abhängigkeit von den jeweiligen Bedürfnissen kann eine Vielfalt von Zellen zur Expression des modifizierten Hsp verwendet werden, einschließlich Krebszellen, pathogen-infizierten Zellen oder normalen Zellen.
Das Expressions-Gen-Konstrukt der vorliegenden Erfindung umfasst eine Nucleotid-Sequenz, die für ein modifiziertes Hsp kodiert, vorzugsweise eine komplementäre DNA (cDNA)-Sequenz, die für ein modifiziertes Hsp kodiert. Die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz ist funktionsgerecht mit wenigstens einem regulatorischen Abschnitt (z.B. einem Promotor) assoziiert, der die Expression der modifizierten Hsp-Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle kontrolliert. Alternativ dazu kann die modifizierte Hsp-Sequenz von Abschnitten flankiert werden, die die homologe Rekombination in der Wirtszelle fördern, so dass die modifizierte Hsp-Sequenz in eine intrachromosomale Position so inseriert wird, dass die modifizierte Hsp-Sequenz funktionsgerecht mit wenigstens einem regulatorischen Abschnitt assoziiert ist, der die Expression der modifizierten Hsp-Sequenz in der Wirtszelle kontrolliert. Beide Typen von Expressions-Gen-Konstrukten umfassen eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz und werden auch als ex primierbare modifizierte Hsp-Gen-Sequenz bezeichnet. Demgemäß stellt die Erfindung eine rekombinante Zelle bereit, die eine exprimierbare modifizierte Hsp-Gen-Sequenz enthält.
Sequenzen, die für Hsps kodieren und Sequenzen, die für Peptid-Tags kodieren sowie Verfahren zur Gewinnung derartiger Sequenzen sind im Einzelnen in den Abschnitten 5.1.1 und 5.1.4 beschrieben. Verfahren zur Modifizierung der Hsp-Gen-Sequenz durch Anfügen, Deletieren oder Substituieren von Nucleotiden sind beschrieben in Abschnitt 5.1.2.
Nach einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zur Reinigung von modifizierten Hsps aus Zell-Kulturen bereit, die das Kultivieren der rekombinanten Zellen umfassen, um die Expression der modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen zu erhalten, sowie das Gewinnen und die Reinigung des modifizierten Hsp, das aus den rekombinanten Zellen sekretiert wird. Im Allgemeinen wird die Reinigung der sekretierten modifizierten Hsp aus dem Kulturüberstand durch den Peptid-Tag an dem modifizierten Hsp erleichtert, indem man ein geeignetes affinitätschromatographisches Verfahren anwendet, wie beispielsweise diejenigen, die in Abschnitt 5.3. beschrieben werden. Die verbesserten Verfahren erfordern keine Lyse der Zellen, die man daher kontinuierlich wachsen lassen kann und modifizierte Hsps oder modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe produzieren lassen kann.
Da die modifizierten Hsp der Erfindung bei der Expression der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in einer rekombinanten antigenen Zelle in der Lage sind, wie die unmodifizierten Hsps Peptide zu binden, wird ein modifiziertes Hsp produziert, das mit Peptiden im ER assoziiert wird, so dass nicht-kovalente Komplexe gebildet werden. Da einige der Proteine der antigenen Zellen antigen/immunogen sind, verleihen Peptide/Proteine, die mit den modifizierten Hsp komplexieren, einem Wirt eine spezifische Immunität gegen antigene Zellen, in denen sie vorhanden sind. Derartige nicht-kovalente immunogene Komplexe werden von den rekombinanten Zellen sekretiert und sammeln sich im Kulturmedium an.
Demgemäß liefert die Erfindung auch Verfahren zur Herstellung sowie auch Reinigung von immunogenen nichtkovalenten Komplexen aus modifizierten Hsps und antigenen Peptiden in Zellen. Gemäß einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Einführung einer modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in antigene Zellen, das Kultivieren der rekombinanten antigenen Zellen, um eine Expression der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz zu erhalten, und die Gewinnung und Reinigung der Komplexe aus dem modifizierten Hsp-antigenem Peptid, die aus der rekombinanten antigenen Zelle sekretiert werden, aus dem Kulturmedium. Die antigenen Peptide der Komplexe sind representativ für antigene Peptide, die innerhalb der antigenen Zellen gefunden werden, und es besteht keine Notwendigkeit, die Antigene zu isolieren und/oder zu charakterisieren oder auch nur die Identitäten dieser Antigene zu kennen, bevor man die antigenen Peptide dazu verwendet, eine Person zu impfen. Verfahren, die für die Reinigung von modifizierten Hsp aus dem Kulturmedium anwendbar sind, wie beispielsweise diejenigen, die in Abschnitt 5.3 beschrieben werden, sind auch nützlich zur Reinigung von Komplexen aus modifiziertem Hsp-antigenem Peptid, vorausgesetzt, dass die Verfahren die nicht-kovalenten Assoziationen zwischen modifizierten Hsp und antigenen Peptiden nicht aufbrechen. Bei einer spezifischen Ausführungsform können die rekombinanten antigenen Zellen, die eine exprimierbare modifizierte Hsp-Gen-Sequenz aufweisen, in einer immunogenen Zusammensetzung für therapeutische und prophylaktische Zwecke verwendet werden. Die Immunogenität derartiger Zusammensetzungen kann nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und wie sie in Abschnitt 5.5 und Abschnitt 6 beschrieben werden, getestet werden. Zu Zwecken der Herstellung von modifiziertem Hsp, das zur Herstellung von Hsp-Peptid-Komplexen in vitro verwendbar ist, kann es erwünscht sein, Wirtszellen zu verwenden, die nicht selbst antigen sind, so dass das sekretierte modifizierte Hsp nicht mit unerwünschten antigenen Molekülen beladen wird.
Durch Kultivieren der rekombinanten Zellen auf kontinuierliche Weise oder ansatzweise in einem ausreichend großen Maßstab können modifiziertes Hsp oder modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe in großen Mengen hergestellt werden. Ein wünschenswerter immunogener Komplex, der ein modifiziertes Hsp und rekombinant hergestellte antigene Proteine/Peptide umfasst, kann aus dem Zellkulturmedium einer kontinuierlichen oder ansatzweisen Kultur der rekombinanten antigenen Zellen in großem Maßstab gereinigt werden. Eine permanente Zelllinie, die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid sekretiert, kann eine konsistente, reproduzierbare und reichliche Quelle für die nützliche immunogene Zusammensetzung darstellen. In Abhängigkeit vom jeweiligen Bedarf können rekombinante Zellen, die eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz enthalten, gepoolt werden und/oder in Teilmengen aufgeteilt werden; oder expandiert werden; oder dadurch archiviert werden, dass man sie unter flüssigem Stickstoff einfriert und aufbewahrt, so dass Ansätze der rekombinanten Wirtszellen wiedergewonnen und in Zukunft vielfach verwendet werden können.
Bei einer anderen Ausführungsform, bei der die Kodiersequenz eines antigenen Proteins oder Peptids bekannt ist, ist vorgesehen, dass eine derartige Sequenz, die für das antigene Molekül kodiert, in einem Expressions-Gen-Konstrukt kloniert und in eine rekombinante Zelle eingeführt werden kann, die eine exprimierbare modifizierte Hsp-Sequenz enthält. Das Klonieren eines antigenen Proteins oder Peptids in einem Expressionsvektor kann nach Standardtechniken durchgeführt werden, wie beispielsweise nach denjenigen, die für die Expression des modifizierten Hsp beschrieben werden (vgl. Abschnitt 5.2). Das antigene Protein oder Peptid wird mit einem modifizierten Hsp in der rekombinanten Zelle koexprimiert. Diese antigenen Proteine oder Peptide bilden nicht-kovalente Komplexe mit dem modifizierten Hsp im ER der rekombinanten Zelle. Derartige antigene Peptide können ein Fragment eines antigenen Proteins sein, das in einer Krebszelle exprimiert wird, wie beispielsweise ein Fragment eines tumorspezifischen Antigens oder eines tumorassoziierten Antigens. Die Komplexe aus modifiziertem Hsp-antigenem Peptid aus diesen Zellen werden in das Kulturmedium sekretiert, und können auf ähnliche Weise gewonnen und mittels Affinitätschromatographie gereinigt werden, wie in Abschnitt 5.3. beschrieben wird. Die rekombinanten Zellen, die sowohl eine exprimierbare Sequenz eines modifizierten Hsp als auch das Expressions-Gen-Konstrukt enthalten, das für das Antigen kodiert, können auch als immunogene Zusammensetzung für therapeutische und prophylaktische Verwendungen verwendet werden.
Die Erfindung sieht ferner vor, dass die gereinigten modifizierten Hsp mit antigenen Peptiden beladen werden können, um immunogene, nicht-kovalente Komplexe in vitro zu bilden. Derartige Komplexe sind nützlich bei der Behandlung und Prävention von Krebs oder Infektionserkrankungen. Antigene Peptide können aus zellulären Quellen gereinigt werden, oder sie können, wenn die Sequenzen der Peptide bekannt sind, nach Verfahren synthetisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Bei einer spezifischen Ausführungsform werden antigene Peptide mit modifizierten Hsps, die reversibel mit Hilfe ihres Peptid-Tags an einer Festphase immobilisiert wurden, inkubiert, so dass nicht-kovalente Komplexe aus antigenen Peptiden und modifizierten Hsp an der Festphase gebildet werden.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Komplexen aus einem modifizierten Hitzeschockprotein der vorliegenden Erfindung bereit, das nicht-kovalent mit einem Peptid in vitro assoziiert wurde, wobei das Verfahren das Inkubieren von modifizierten Hitzeschockproteinen und Peptiden für eine Zeit umfasst, die für die Bildung der Komplexe ausreicht.
Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung, die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid als auch rekombinante antigene Zellen umfassen, die nach den beanspruchten Verfahren hergestellt wurden, können die Immunkompetenz einer Person verbessern und eine spezifische Immunität sowohl gegen neoplastische Zellen als auch gegen pathogen-infizierte Zellen hervorrufen. Derartige immunogene Zusammensetzungen sind auch in der Lage, die Entwicklung von Tumoren zu verhindern und das Wachstum und die Ausbreitung von Turmorzellen zu inhibieren, sowie das Wachstum von Pathogenen oder Zellen, die mit Pathogenen infiziert sind, zu verhindern. Die immunogenen Zusammensetzungen können dazu verwendet werden, eine entzündliche Reaktion am Ort des Tumors auszulösen und schließlich eine Regression der Tumorlast bei den behandelten Krebspatienten bewirken.
Demgemäß stellt die Erfindung ein Verfahren zur Auslösung einer Immunreaktion gegen ein Antigen bei einer Person bereit, das die Verabreichung eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein der Erfindung, das nicht-kovalent mit dem Antigen oder einem Fragment davon assoziiert ist, an den Patienten umfasst. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einer Person bereit, die an Krebs leidet oder bei der eine Krebsprävention gewünscht wird, wobei das Verfahren die Verabreichung eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein der Erfindung, das nicht-kovalent mit dem Antigen oder einem Fragment davon assoziiert ist, an den Patienten umfasst. Ebenfalls von der Erfindung umfasst wird ein Verfahren zur Behandlung oder Prävention einer Infektionserkrankung bei einer Person, die an einer Infektionserkrankung leidet, oder bei der eine Prävention einer Infektionserkrankung gewünscht wird, das die Verabreichung eines immunogenen Komplexes aus einem modifizierten Hitzeschockprotein der Erfindung, das kovalent mit dem Antigen oder einem Fragment davon assoziiert ist, an die Person umfasst.
Die immunogenen Zusammensetzungen können der Person, aus der die Krebszellen oder das Gewebe erhalten wurden, autolog verabreicht werden, oder an Personen mit einem erhöhten Krebsrisiko aufgrund der Familiengeschichte oder von Umwelt-Risikofaktoren. In ähnlicher Weise können die immunogenen Zusammensetzungen der Person, aus der die patho gen-infizierten Zellen oder antigenen Zellen erhalten wurden, autolog verabreicht werden, oder an Personen, bei denen ein Risiko besteht, dass sie vom gleichen Pathogen infiziert werden.
Die Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Krebs sind ebenfalls generell auf andere Personen anwendbar, die nicht die Krebszellen zur Expression des modifizierten Hsp geliefert haben, solange sie am gleichen Krebstyp leiden wie der Lieferant der Krebszellen. Das gleiche Prinzip gilt auch für die Behandlung oder Prävention von Infektionserkrankungen insofern, dass das Verfahren auf andere Personen anwendbar ist, soweit diese eine antigene Ähnlichkeit mit dem infektiösen Mittel aufweisen, das den Lieferanten der antigenen Wirtszellen infiziert hatte. Die Verwendungen der immunogenen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention von Krebs oder Infektionserkrankungen werden in den Abschnitten 5.7 und 5.8 beschrieben.
5.1. Konstruktion von modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen
Hierin werden Verfahren zur Konstruktion eines Gen-Konstrukts beschrieben, das für ein modifiziertes Hitzeschockprotein (Hsp) kodiert, das in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen exprimiert werden kann. Spezifisch wird die Konstruktion einer Nucleotidsequenz beschrieben, die für ein modifiziertes Hsp kodiert, die Insertion der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in einen geeigneten Kloniervektor, sowie die Einführung des Expressions-Genkonstrukts in die geeignete Wirtszelle zur Herstellung von modifizierten Hsps und modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen.
Hitzeschockproteine, die hierin austauschbar als Stressproteine bezeichnet werden, die für die Behandlung und Prävention von Krebs oder Infektionskrankheiten nützlich sind, können aus irgenwelchen zellulären Proteinen ausgewählt werden, die eines der folgenden Kriterien erfüllen. Es handelt sich um ein Protein, dessen intrazelluläre Konzentration ansteigt, wenn eine Zelle Stressreizen ausgesetzt wird; das fähig ist, andere Proteine oder Peptide zu binden; und das in der Lage ist, die gebundenen Proteine oder Peptide in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) oder bei niedrigem pH freizusetzen; oder es ist ein Protein, das wenigstens 35% Homologie zu irgendeinem zellulären Protein aufweist, das irgendeine der obigen Eigenschaften aufweist. Die Hsps in den Komplexen, die gemäß der vorliegenden Erfindung modifiziert und hergestellt werden können, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein hsp70, hsp90, gp96, BiP und Proteindisulfidisomerase. Vorzugsweise sind die Hsps humane Hsps. Bevorzugte Komplexe umfassen modifiziertes humanes hsp60, hsp70, hsp90, Proteindisulfidisomerase oder BiP, die nicht-kovalent an ein Proteinantigen gebunden sind. Bei einer spezifischen Ausführungsform umfasst der Komplex eine modifizierte Form von humanem gp96, das normalerweise im endoplasmatischen Retikulum von eukaryontischen Zellen zu Hause ist.
Bisher wurden drei Hauptfamilien von Hsps, nämlich hsp60, hsp70 und hsp90 identifiziert. Zusätzlich werden Proteindisulfidisomerase und andere Proteine des endoplasmatischen Retikulums umfasst, die Thioredoxin-artige Domänen enthalten, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, ERp72 und ERp61. Es wird davon ausgegangen, dass Glieder aller dieser Hsp-Familien gemäß der Praxis der vorliegenden Erfindung modifiziert und hergestellt werden können.
Es wurde entdeckt, dass die Familien von hsp60, hsp70, hsp90 und Proteindisulfidisomerase aus Proteinen zusammengesetzt sind, die bezüglich ihrer Sequenz den Stressproteinen verwandt sind, indem sie beispielsweise eine mehr als 35%ige Aminosäureidentität aufweisen, deren Expressionsniveau durch Stress jedoch nicht verändert wird. Es ist daher beabsichtigt, dass die Definition von Stress- oder Hitzeschockproteinen, wie sie hierin verwendet wird, andere Proteine, Muteine, Analoge und Varianten davon umfasst, die eine wenigstens 35 bis 55%ige, vorzugsweise 55 bis 75%ige und besonders bevorzugt 75 bis 85 %ige Aminosäureidentität mit Gliedern dieser Familien aufweisen, deren Expressionsniveau in einer Zelle in Reaktion auf einen Stressreiz ansteigen.
Die Prozeduren, die in Standardmonographien, beispielsweise in Methods in Enzymology, 1987, Volume 154, Academic Press; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, New York; und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, beschrieben werden, können angewandt werden, um molekularbiologische Routinereaktionen durchzuführen, die bei der Konstruktion und Modifikation des Hsp-Genkonstrukts angewandt werden. Die im Einzelnen weiter unten beschriebenen Verfahren dienen nur zu Illustrationszwecken und stellen keine Einschränkung dar. Verschiedene Kloniervektoren und Expressionssysteme, die kommerziell erhältlich sind, können ebenfalls entsprechend den Hersteller-Gebrauchsanweisungen verwendet werden.
5.1.1. Isolation von Hsp-Gen-Sequenzen
Unter verschiedenen Aspekten betrifft die Erfindung Aminosäuresequenzen von modifizierten Hitzeschockproteinen (Hsps), und Fragmente und Derivate davon, die funktionell aktiv sind. "Funktionell aktive" modifizierte Hsp, wie dieser Begriff hierin verwendet wird, bezieht sich auf modifizierte Hsps, die eine oder mehrere bekannte funktionelle Aktivität(en) zeigen, die mit dem unmodifizierten Hsp assoziiert ist/sind, wie beispielsweise das Binden von antigenen Peptiden, die Freisetzung von gebundenen antigenen Peptiden in Gegenwart von Adenosintriphosphat (ATP) oder bei niedrigem pH usw. Nucleinsäuren, die für die modifizierten Hsps und Fragmente davon kodieren, die oben beschrieben werden, werden zur Verfügung gestellt, sowie Nucleinsäuren, die dazu komplementär und in der Lage sind, mit derartigen Nucleinsäuren zu hybridisieren.
Aminosäuresequenzen und Nucleotidsequenzen von natürlich auftretenden Hitzeschockproteinen sind im Allgemeinen in Sequenz-Datenbasen erhältlich, wie beispielsweise in GeneBank. Computerprogramme, wie beispielsweise Entrez, können dazu verwendet werden, die Datenbasis zu durchsuchen und irgendeine Aminosäuresequenz und genetische Sequenzdaten von Interesse anhand der Zugangsnummern zu gewinnen. Diese Datenbasen können auch für Recherchezwecke verwendet werden, um Sequenzen mit unterschiedlichen Graden von Ähnlichkeiten mit einer Fragesequenz zu identifizieren, und zwar unter Verwendung von Programmen wie beispielsweise FASTA und BLAST, die die ähnlichen Sequenzen nach Alignment-Bewertungen und Statistiken einordnen.
Die Nucleotidsequenzen von nicht-einschränkenden Beispielen von Hsps, die nach Verfahren der folgenden Erfindung modifiziert und exprimiert werden können, sind wie folgt publiziert: humanes gp96: Genebank Acession No. X15187; Maki et al., 1990, Proc. Natl. Acad Sci., 87: 5658-5562. Maus gp96: Genebank Accession No. M16370; Srivastava et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:3807-3811; Maus BiP: Genebank Accession No. U16277; Haas et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 2250-2254; human BiP: Genebank Accession No. M19645; Ting et al., 1988, DNA 7: 275-286; Maus hsp70: Genebank Accession No. M35021, Hunt et al., 1990, Gen, 87: 199-204, human hsp70, Genebank Accession No. M24743; Hunt et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 6455-6489. Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes bezeichnet der Begriff "Hsp-Gen-Sequenz" nicht nur die natürlich auftretende Nucleotidsequenz, sondern umfasst auch alle anderen degenerierten DNA-Sequenzen, die für das Hsp kodieren.
Irgendeine eukaryontische Zelle kann potentiell als Nucleinsäurequelle zur Gewinnung des kodierenden Abschnitts eines Hsp-Gens dienen. Nucleinsäuresequenzen, die für Hsps kodieren, können isoliert werden aus Wirbeltier-, Säugetier- sowie aus Primaten-Quellen, einschließlich Menschen.
Die DNA kann nach Standardprozeduren, die auf dem Fachgebiet für klonierte DNA bekannt sind (z.B. aus einer DNA-"Bibliothek"), oder durch DNA-Vervielfältigung erhalten werden. Klone, die sich von einer Genom-DNA ableiten, können reguläre und Intron-DNA-Abschnitte zusätzlich zu den kodierenden Abschnitten enthalten; Klone, die sich von cDNA ableiten, enthalten nur Exon-Sequenzen. Was auch immer die Quelle ist, sollte das Hsp-Gen molekular in einen geeigneten Vektor zur Übertragung des Gens kloniert werden.
Beim molekularen Klonieren eines Hsp-Gens aus Genom-DNA werden DNA-Fragmente generiert und kloniert, um eine Genom-Bibliothek zu bilden. Da einige der Sequenzen, die für verwandte Hsps kodieren, erhältlich sind und gereinigt und markiert werden können, können die klonierten DNA-Fragmente in der Genom-DNA-Bibliothek durch Nucleinsäurehybridisierung mit markierten Sonden gescreent werden (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science 196:180; Grunstein, M. and Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Solche DNA-Fragmente mit einer wesentlichen Homologie zu der Sonde werden hybridisieren. Es ist auch möglich, das geeignete Fragment durch Verdauung(en) mit Restriktionsenzym(en) zu identifizieren und durch Vergleich der Fragmentgrößen mit denjenigen, die man gemäß einer bekannten Restriktionskarte erwarten würde, wenn eine solche zur Verfügung steht.
Alternativen zum Isolieren der Hsp-Genom-DNA schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, die chemische Synthese der Gen-Sequenz selbst aus einer bekannten Sequenz ein oder die Herstellung von cDNA zu der mRNA, die für das Hsp kodiert. Beispielsweise kann RNA für die cDNA-Klonierung des Hsp-Gens aus Zellen isoliert werden, die das Hsp exprimieren. Eine cDNA-Bibliothek kann nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren generiert werden und mit Hilfe von Verfahren gescreent werden, wie denjenigen, die zum Screenen einer Genom-DNA-Bibliothek beschrieben wurden. Wenn ein Antikörper zu dem Hsp zur Verfügung steht, kann das Hsp durch Binden eines markierten Antikörpers an die vermutlichen Hsp-synthetisierenden Klone identifiziert werden.
Andere spezifische Ausführungsformen für das Klonieren einer Nucleotidsequenz, die für ein Hsp kodiert, werden beispielhaft, jedoch nicht als Einschränkung, wie folgt präsentiert:
Bei einer spezifischen Ausführungsform können Nucleotidsequenzen, die für ein Hitzeschockprotein innerhalb einer Familie kodieren, durch Hybridisierung unter Bedingungen einer niedrigen bis mittleren Stringenz mit einer Probe identifiziert werden, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Hsp kodiert.
Beispielhaft und nicht als Einschränkungen sind Arbeitsweisen unter Anwendung derartiger Bedingungen einer niedrigen Stringenz wie folgt (vergleich auch Shilo und Weinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792). Filter, die DNA enthalten, werden 6 h bei 40 °C in einer Lösung vorbehandelt, die 35% Formamid, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM EDTA, 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA und 500 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA enthält. Hybridisierungen werden in der gleichen Lösung mit den folgenden Modifikationen durchgeführt: 0,02 PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 μg/ml Lachssperma-DNA, 10% (Gew./Vol.) Dextransulfat und 5-20 × 10⁶ cpm ³²P-markierte Sonde werden verwendet. Filter werden in Hybridisierungsmischung 18-20 h bei 40 °C inkubiert, und dann 1,5 h bei 55 °C in einer Lösung gewaschen, die 2× SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA und 0,1% SDS enthält. Die Waschlösung wird durch eine frische Lösung ersetzt und für weitere 1,5 h bei 60 °C inkubiert. Die Filter werden getrocknet und einer Autoradiographie unterzogen. Nötigenfalls werden die Filter ein drittes Mal bei 65-68 °C gewaschen und wieder dem Film ausgesetzt. Andere Bedingungen einer niedrigen Stringenz, die zur Anwendung kommen können, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (z.B. wie sie für Spezies-Kreuzhybridisierungen verwendet werden).
Nach einer anderen Ausführungsform wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, um die gewünschte Sequenz in einem DNA-Klon oder einer Genom-DNA-Bibliothek vor der Selektion zu vervielfachen. PCR kann zum Beispiel unter Verwendung einer Vorrichtung für das thermische Zyklisieren und unter Verwendung von Taq-Polymerase (Gene Amp^TM) durchgeführt werden. Die vervielfältigte DNA kann cDNA oder Genom-DNA irgendeiner Spezies einschließen. Oligonucleotid-Primer, die bekannte Nucleinsäuresequenzen von verwandten Hsps repräsentieren, können als Primer bei der PCR zur Anwendung kommen. Unter einem bevorzugten Aspekt repräsentieren die Oligonucleotid-Primer wenigstens einen Teil des Hsp-Gens, der zwischen Hsp von verschiedenen Spezies hochkonserviert ist. Man kann wahlweise auch verschiedene unterschiedliche degenerierte Primer für eine Verwendung in den PCR-Reaktionen synthetisieren. Es ist auch möglich, die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen, die beim Priming der PCR-Reaktionen angewandt werden, zu variieren, um stärkere oder geringere Grade an Nucleotidsequenzähnlichkeit zwischen der bekannten Hsp-Nucleotidsequenz und den zu isolierenden Nucleinsäurehomologen zu erfassen. Für eine Spezies-Kreuzhybridisierung sind Bedingungen einer niedrigen Stringenz bevorzugt. Für eine Hybridisierung der gleichen Spezies sind Bedingungen einer moderaten Stringenz bevorzugt. Nach einer erfolgreichen Vervielfältigung kann die Sequenz, die für ein Hsp kodiert, kloniert und sequenziert werden. Wenn die Größe des kodierenden Abschnitts des Hsp-Gens, das vervielfältigt wird, zu groß ist, um in einer einzigen PCR vervielfältigt zu werden, können verschiedene PCR, die das gesamte Gen abdecken, vorzugsweise mit überlappenden Abschnitten durchgeführt werden, und Produkte der PCR können miteinander verknüpft werden, um die gesamte kodierende Sequenz zu bilden. Alternativ kann dann, wenn ein Segment eines Hsp-Gens vervielfältigt wird, dieses Segment kloniert werden, und als Sonde verwendet werden, um einen vollständigen cDNA oder Genom-Klon zu isolieren.
Vor der Modifizierung kann das Hsp-Gen in einen geeigneten Kloniervektor inseriert werden und in Wirtszellen eingeführt werden, so dass viele Kopien der Gen-Sequenz erzeugt werden. Es kann eine große Zahl von Vektor-Wirts-Systemen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, zur Anwendung kommen, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakteriophagen, wie beispielsweise Lambda-Derivate oder Plasmide wie pBR322 oder pUC-Plasmidderivate oder der Bluescript-Vektor (Stratagene).
Die obigen Verfahren sollen nicht die Verfahren einschränken, mittels derer Klone von Hsps erhalten werden können oder vermehrt werden können. Die modifizierten Hitzeschockproteine dieser Erfindung sind so modifiziert, dass sie sekretiert werden und leicht aus dem Zellkulturmedium gereinigt werden können. Insbesondere fehlt einem modifiziertem Hsp der Erfindung ein Segment des Polypeptids, das als Signal für die Retention des Hsp im endoplasmatischen Retikulum (ER) dient. Das Retentionssignal wird dadurch außer Funktion gesetzt, dass man das Peptid entfernt, oder dass man es durch ein Peptid ersetzt, das nicht als Signal fungiert. Zusätzlich umfasst das modifizierte Hsp einen Peptid-Tag, der die Gewinnung und Reinigung erleichtert. Der Peptid-Tag kann mit irgendeinem Abschnitt des Hsp fusioniert werden, der nicht am Binden von antigenen Peptiden beteiligt ist, beispielsweise dem Carboxyterminus. Außerdem wird, wenn das Hsp natürlich im endoplasmatischen Retikulum zu Hause ist, ein Leader-Peptid angefügt, um seine Translokation durch die ER-Membran zur Sekretion zu steuern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Retentionspeptid eines Hsp, das üblicherweise am Carboxyterminus angeordnet ist, durch einen Peptid-Tag ersetzt.
5.1.2 Modifizierung von Hitzeschockprotein-Genen
Die modifizierten Hitzeschockproteine der Erfindung sind so modifiziert, dass sie von den Zellen, in denen sie exprimiert werden, sekretiert werden und leicht aus dem Zellkulturmedium gereinigt werden können. Insbesondere fehlt einem modifizierten Hsp der Erfindung ein Segment des Polypeptids, das als Signal für die Retention des Hsp im endoplasmatischen Retikulum (ER) dient. Ein derartiges Peptid wird in Hsp gefunden, die im ER verbleiben, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, gp96. Das Retentionssignal wird dadurch außer Funktion gesetzt, dass man das Peptid deletiert oder durch ein Peptid ersetzt, das nicht als ein Signal fungiert. Zusätzlich umfasst das Hsp einen Peptid-Tag, der die Gewinnung und Reinigung erleichtert. Der Peptid-Tag kann mit irgendeinem Abschnitt des Hsp fusioniert sein, der nicht am Binden von antigenem Peptid beteiligt ist, wie beispielsweise dem Carboxy-Terminus. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Retentionspeptid eines Hsp, das üblicherweise am Carboxy-Terminus angeordnet ist, durch einen Peptid-Tag ersetzt. Wenn außerdem das Hsp natürlicherweise im Cytoplasma zu Hause ist, wird ein Leader-Peptid angefügt, um seine Translokation durch die ER-Membran zur Sekretion zu steuern.
Die in modifizierten Hsps der vorliegenden Erfindung vorhandenen Modifikationen können nach unterschiedlichen Verfahren erzeugt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die Manipulationen, die zu ihrer Produktion führen, können auf dem Gen- oder Protein-Niveau erfolgen, vorzugsweise auf dem Gen-Niveau. Beispielsweise kann der klonierte kodierende Abschnitt eines Hsp durch eine Vielzahl von rekombinanten DNA-Verfahren modifiziert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Ausubel et al., in Kapitel 8 von Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York). Es ergibt sich aus der nachfolgenden Diskussion, dass Substitutionen, Deletionen, Insertionen und irgendwelche Kombinationen davon eingeführt oder kombiniert werden, um schließlich eine endgültige Nucleotidsequenz zu erhalten, die für ein modifiziertes Hsp kodierte.
Alternativ dazu kann modifiziertes Hsp chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann ein Peptid, das einem Abschnitt eines Hsp entspricht, der die gewünschten Modifikationen aufweist, unter Verwendung einer Peptid-Synthesevorrichtung synthetisiert werden.
5.1.3. RETENTIONSPEPTID
Das Peptid, das bewirkt, dass ein Hsp im endoplasmatischen Retikulum (ER) bleibt, ist typischerweise am Carboxyterminus angeordnet und weist die Sequenz auf Xaa-Asp-Glu-Leu (oder XDEL) (Munro & Pelham, 1987, Cell, 48:899-907). Der Begriff "Retentionspeptid" wird hierin so verwendet, dass damit diese Tetrapeptidsequenz bezeichnet wird, die bei den meisten Säugetier-Hsps KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) ist. Die Retentionspeptid-Sequenz in Saccharomyces cerevisiae und in Schizosaccharomyces pombe wird als HDEL (His-Asp-Glu-Leu) bzw. ADEL1 (Ala-Asp-Glu-Leu) gefunden (Pidoux & Armstrong, 1992, EMBO J. 11:1583-1591).
Das Retentionspeptid von Hsps kann außer Funktion gesetzt werden, indem man das Retentionspeptid entweder abspaltet, oder das Signal durch Aminosäuresubstitutionen im Retentionspeptid aufhebt. Als allgemeiner Grundsatz gilt, dass irgendwelche Signale, die in der modifizierten Hsp-Sequenz vorhanden sind, die, wenn sie vorhanden sind, dazu neigen, zu verhindern, dass das modifizierte Hsp von der Zelle sekretiert wird, entfernt werden sollten. In Abhängigkeit von dem individuellen Hsp können derartige Signale Transmembrandomänen und cytoplasmatische Domänen beinhalten.
Um das DNA-Segment zu entfernen, das für die Retentionspeptid-Sequenz oder für andere Signale kodiert, kann die Sequenz des Hsp-Gens an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuclease(n) geschnitten werden, wenn derartige Stellen zur Verfügung stehen, wodurch ein DNA-Fragment freigesetzt wird, das für das Retentionspeptid kodiert. Der Rest des für das Hsp kodierenden Abschnitts wird dann isoliert, und verknüpft, um die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz zu bilden.
Alternativ, wenn geeignete Restriktionsstellen nicht zur Verfügung stehen, kann ein größeres DNA-Fragment freigesetzt werden, indem man Restriktionsstellen verwendet, die in Sequenzen angeordnet sind, die den Abschnitt flankieren, der für die Retentionspeptid-Sequenz kodiert, und kann durch ein ähnliches Fragment einer synthetischen DNA ersetzt werden, dem die Sequenz fehlt, die für das Retentionspeptid kodiert. Dabei muss darauf geachtet werden, sicherzustellen, dass das ordnungsgemäße Translations-Leseraster beibehalten wird.
Wenn gewünscht, können Restriktionsstellen in den geeigneten Stellungen nach Verfahren der ortsspezifischen Mutagenese und/oder der DNA-Vervielfältigung, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, erzeugt weden. Vgl. beispielsweise Shankarappa et al., 1992, PCR Method Appl. 1:277-278. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird allgemein dazu verwendet, gewünschte Sequenzveränderungen in die DNA von Interesse einzuführen. Irgendwelche Veränderungen der Primer-Sequenz können leicht in das DNA-Produkt einer PCR inkorporiert werden, die die nachfolgende Inkorporierung der Veränderungen in die Gen-Sequenz erleichtern. Beispielsweise werden synthetische Oligonucleotide, die die gewünschte Restriktionsstelle enthalten, in Verbindung mit den geeigneten flankierenden Primer-Sequenzen verwendet, um zwei benachbarte DNA-Fragmente zu vervielfältigen. Jedes dieser vervielfältigten Fragmente enthält die neue Restriktionsstelle an einem Ende. Im Anschluß an einen enzymatischen Verdau an sowohl der neuen als auch der flankierenden Stelle werden die vervielfältigten Fragmente verknüpft und in einen Vektor subkloniert, der für weitere Manipulationen bereit ist. Es ist dabei zwingend erforderlich, dass die Einführung von Restriktionsstelle die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins nicht verändert.
Irgendeine Technik zur Mutagenese, die auf dem Fachgebiet bekannt ist, kann dazu verwendet werden, individuelle Nucleotide in einer DNA-Sequenz zu modifizieren, und zwar zum Zwecke der Erzeugung von Aminosäuresubstitution(en) in der exprimierten Peptidsequenz oder um Restriktionsstellen zu erzeugen/zu entfernen, um weitere Manipulationen zu erleichtern. Derartige Techniken schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein eine chemische Mutagenese, eine in vitro ortsgesteuerte Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), eine Oligonucleotid-gesteu erte Mutagenese (Smith, 1985, Ann. Rev. Genet. 19:423-463; Hill et al., 1987, Methods Enzymol. 155:558-568), eine Überlappungsverlängerung auf PCR-Basis (Ho et al., 1989, Gen 77:51-59), eine Megaprimer-Mutagenese auf PCR-Basis (Sarkar et al., 1990, Biotechniques, 8:404-407), usw.. Modifikationen können bestätigt werden durch doppelsträngige Dideoxy-DNA-Sequenzierung.
Das obige Verfahren kann angewandt werden, um einen oder mehrere der Aminosäurereste in der Tetrapeptid-Retentionssequenz zu substituieren, insbesondere die Asp-, Glu- und Leu-Reste. Der Ersatz für eine Aminosäure innerhalb der Retentionspeptid-Sequenz kann unter Gliedern einer anderen Klasse ausgewählt werden als der, zu der die Aminosäure gehört. Die nicht-polaren (hydrophoben) Aminosäuren schließen ein Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen ein Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen ein Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen ein Asparaginsäure und Glutaminsäure. Diejenigen Substitutionen, von denen im Allgemeinen erwartet wird, dass sie die größten Veränderungen der biochemischen Eigenschaften hervorrufen, sind diejenigen, bei denen (a) ein hydrophiler Rest, zum Beispiel Seryl oder Threonyl, als Ersatz für einen (von einem) hydrophoben Rest substituiert wird, z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl; (b) ein Cystein oder Prolin andere Reste substituiert (oder von anderen wird); (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, wird als Ersatz für einen (oder von einem) elektronegativen Rest ersetzt, z.B. Glutamyl oder Aspartyl, oder (d) ein Rest mit einer sterisch anspruchsvollen Seitenkette, z.B. Phenylalanin, ersetzt einen (oder wird ersetzt durch einen) anderen, der keine Seitenkette aufweist, z.B. Glycin.
Die obigen Verfahren sollen die Verfahren nicht einschränken, mittels derer die Retentionspeptid-Sequenz und/ oder ein anderes Signal in einem Hsp entfernt oder unbruachbar gemacht werden können.
5.1.4 PEPTID-TAG UND/ODER LEADER-PEPTID-FUSION
Das modifizierte Hsp der vorliegenden Erfindung ist auch ein Fusionsprotein, das einen Peptid-Tag aufweist. Bei bestimmten Ausführungsformen kann auch ein Leader-Peptid mit einem modifizierten Hsp fusioniert werden, um auf diese Weise den Transport des modifizierten Hsp zur Sekretion in das endoplasmatische Retikulum (ER) zu erleichtern.
Bei verschiedenen Ausführungsformen kann ein derartiges Fusionsprotein hergestellt werden durch Verknüpfung einer Hsp-Gen-Sequenz mit der Sequenz, die für den Peptid-Tag oder das Leader-Peptid kodiert, und zwar in einem ordnungsgemäßen Leseraster. Wenn Genom-Sequenzen verwendet werden, ist darauf zu achten, dass sichergestellt wird, dass das modifizierte Gen innerhalb des gleichen Translations-Leserasters verbleibt, und zwar nicht unterbrochen durch Translations-Stopsignale und/oder fehlerhafte Messenger-RNA-Splicing-Signale.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der Peptid-Tag mit seinem Aminoterminus an den Carboxyterminus des Hsp fusioniert. Der genaue Ort, an dem im Carboxyterminus die Fusion erfolgt, ist nicht kritisch. Beispielsweise kann der Peptid-Tag die Stelle des Retentionspeptids einnehmen. Die optimale Stelle kann durch Routineversuche bestimmt werden. Die Immunogenitäten des modifizierten Hsp können nach Verfahren getestet werden, die in Abschnitt 5.5 beschrieben werden.
Bei der Modifikation eines Hsp kann eine Vielzahl von Peptid-Tags verwendet werden, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die konstanten Abschnitte von Immunglobulinen, eine Polyhistidin-Sequenz (Petty, 1996, Metal-chelate affinity chromatography, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol.. 2; Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience), Glutathion-S-Transferase (GST; Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220- 229), das E. coli Maltose-bindende Protein (Guan et al., 1987, Gene 67:21-30) sowie verschiedene cellulosebindende Domänen (US-Patent 5 496 934; 5 202 247, 5 137 819; Tomme et al., 1994, Protein Eng. 7:117-123), usw. Einige Peptid-Tags können dem modifizierten Hsp neue Struktureigenschaften verleihen, beispielsweise die Fähigkeit, Multimere zu bilden. Die Dimerisierung von modifizierten Hsp mit einem gebundenen Peptid kann die Avidität der Wechselwirkung zwischen dem Hsp und seinem Partner im Verlauf der Antigen-Präsentation erhöhen. Diese Peptid-Tags leiten sich üblicherweise von Proteinen ab, die normalerweise als Homopolymere existieren. Peptid-Tags, wie beispielsweise die extrazellulären Domänen von CD8 (Shiue et al., 1988, J. Exp. Med. 168:1993-2005), oder CD28 (Lee et al., 1990, J. Immunol. 145:344-352) oder Teile des Immunglobulinmoleküls, die Orte für Zwischenketten-Disulfidbindungen enthalten, können zur Bildung von Multimeren führen. Andere mögliche Peptid-Tags sind kurze Aminosäuresequenzen, gegen die monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die folgenden gut bekannten Beispiele und zwar das FLAG-Epitope, das myc-Epitope an den Aminosäuren 408-439, und das Influenza-Virus-Hämagglutinin (HA)-Epitop. Andere Peptid-Tags werden von spezifischen Bindungspartnern erkannt und erleichtern auf diese Weise die Isolierung durch Affinitätsbindung an den Bindungspartner, der vorzugsweise immobilisiert ist und/oder sich auf einen festen Träger befindet. Wie erfahrene Fachleute wissen, können viele Verfahren angewandt werden, um den kodierenden Abschnitt der oben erwähnten Peptid-Tags zu erhalten, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, DNA-Klonieren, DNA-Vervielfältigung sowie synthetische Verfahren. Einige der Peptid-Tags und Reagenzien für ihren Nachweis und ihre Isolation sind kommerziell erhältlich.
Ein bevorzugter Peptid-Tag ist ein nicht-variabler Abschnitt des Immunglobulinmoleküls. Typischerweise umfassen derartige Abschnitte wenigstens eine funktionelle CH2- oder CH3-Domäne des konstanten Abschnitts der schweren Kette eines Immunglobulins. Fusionsproteine werden auch unter Verwendung des Carboxyterminus des Fc-Abschnitts einer konstanten Domäne hergestellt, oder eines Abschnitts, der unmittelbar Amino-terminal zum CH1 der schweren oder der leichten Kette angeordnet ist. Geeignete Peptid-Tags auf Immunglobulin-Basis können erhalten werden von IgG-1, -2, -3 oder -4-Subtypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, vorzugsweise jedoch von IgG1. Vorzugsweise wird ein humanes Immunglobulin verwendet, wenn das modifizierte Hsp für eine in vivo-Verwendung bei Menschen bestimmt ist. Viele DNAs, die für die konstanten Abschnitte der leichten oder schweren Kette eines Immunglobulins kodieren, sind bekannt oder auf einfache Weise aus cDNA-Bibliotheken erhältlich. Vgl. beispielsweise Adams et al., Biochemistry, 1980, 19:2711-2719; Gough et al., 1980, Biochemistry, 19:27802-2710; Dolby et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77:6027-6031; Rice et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:7862-7865; Falkner et al., 1982, Nature, 298:286-288; und Morrison et al., 1984, Ann. Rev. Immunol, 2:239-256. Da viele immunologische Reagenzien und Markierungssysteme für den Nachweis von Immunglobulinen verfügbar sind, kann das Fusionsprotein aus modifiziertem Hsp und Ig ("modifiziertes Hsp-Ig") mit einer Vielzahl von immunologischen Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, leicht nachgewiesen und quantifiziert werden, wie beispielsweise unter Verwendung eines Enzymverknüpften Immunosorbens-Assays (ELISA), durch Immunpräzipitation, Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortieren (FACS), usw. In ähnlicher Weise können dann, wenn der Peptid-Tag ein Epitop mit leicht erhältlichen Antikörpern ist, derartige Reagenzien mit den oben erwähnten Techniken angewandt werden, um ein modifiziertes Hsp, das den Peptid-Tag enthält, nachzuweisen, zu quantifizieren und zu isolieren. In vielen Fällen besteht keine Notwendigkeit, spezifische Antikörper gegen das modifizierte Hsp zu entwickeln.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist eine Fusion eines modifizierten Hsp, dem das Retentionspeptid fehlt, mit den Gelenk-, CH2- und CH3-Domänen von murinem Immunglobulin G-1 (IgG-1) (Bowen et al., J. Immunol. 156:442-442-9). Dieses Peptid enthält drei Cysteinreste, die normalerweise an einer Disulfidbindung mit anderen Cysteinen im Ig-Molekül beteiligt sind. Da keines der Cysteine benötigt wird, damit das Peptid als ein Tag fungieren kann, können einer oder mehrere dieser Cysteinreste ggf. durch einen anderen Aminosäurerest substituiert sein, wie beispielsweise Serin. Verfahren, wie die, die in Abschnitt 5.1.2 beschrieben werden, können angewandt werden, um derartige Substitutionen vorzunehmen.
Für die effiziente Sekretion von modifizierten Hsp aus bakteriellen und Säugetierzellen können verschiedene Leader-Sequenzen, die dem Fachmann bekannt sind, verwendet werden (von Heijne, 1985, J. Mol. Biol. 184:99-105). Leader-Peptide werden auf Basis der in Betracht gezogenen Wirtszelle ausgewählt und können bakterielle, Hefe-, virale, tierische und Säugetier-Sequenzen beinhalten. Beispielsweise ist das Herpes-Virus Glycoprotein D-Leader-Peptid zur Verwendung in einer Vielzahl von Säugetierzellen geeignet. Ein bevorzugtes Leader-Peptid zur Verwendung in Säugetierzellen kann erhalten werden aus der V-J2-C-Region der Maus-Immunglobulin-Kappakette (Bernard et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78:5812-5816).
DNA-Sequenzen, die für den gewünschten Peptid-Tag oder das gewünschte Leader-Peptid kodieren, die bekannt sind oder einfach aus Bibliotheken oder aus kommerziellen Bezugsquellen erhältlich sind, sind in der Praxis dieser Erfindung geeignet. Verfahren zur Gewinnung von Hsp-Sequenzen, die in Abschnitt 5.1.1 beschrieben werden, können auch dazu verwendet werden, Sequenzen zu erhalten, die für einen Peptid-Tag oder ein Leader-Peptid kodieren.
5.2. Herstellung von modifizierten Hsps
Bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung werden Sequenzen, die für modifizierte Hsps kodieren, zur Vermehrung und Expression in rekombinanten Zellen in einen Kompressionsvektor inseriert.
Ein Expressionskonstrukt, wie dieser Begriff hierin verwendet wird, bezeichnet eine Nucleotid-Sequenz, die für ein modifiziertes Hsp kodiert, die funktionsgerecht mit einem oder mehreren regulatorischen Abschnitt assoziiert ist, die die Expression des modifizierten Hsp in einer geeigneten Wirtszelle ermöglichen. "Funktionsgerecht assoziiert" bezeichnet eine Assoziation, bei der die regulatorischen Abschnitte und die modifizierte Hsp-Sequenz, die exprimiert werden soll, auf eine solche Weise verknüpft und positioniert sind, dass eine Transkription und schließlich Translation ermöglicht wird.
Die regulatorischen Abschnitte, die für die Transkription des modifizierten Hsp erforderlich sind, können durch den Expressionsvektor bereitgestellt werden. Ein Translations-Initiationscodon (ATG) kann auch vorgesehen werden, wenn die modifizierte Hsp-Sequenz, der ihr natürliches Initiationscodon fehlt, exprimiert werden soll. In einem kompatiblen Wirts-Konstrukt-System binden zelluläre Transkriptionsfakten, wie beispielsweise RNA-Polymerase, an die regulatorischen Abschnitte auf dem Expressionskonstrukt, um eine Transkription der modifizierten Hsp-Sequenz in dem Wirtsorganismus zu bewirken. Die präzise Natur der regulatorischen Regionen, die für die Gen-Expression benötigt werden, kann von Wirtszelle zu Wirtszelle variieren. Im Allgemeinen ist ein Promotor erforderlich, der in der Lage ist, RNA-Polymerase zu binden und die Transkription einer funktionsgerecht assoziierten Nucleinsäure-Sequenz zu unterstützen. Derartige regulatorische Abschnitte können diejenigen 5'-nicht-kodierenden Sequenzen beinhalten, die an der Initiation von Transkription und Translation beteiligt sind, wie beispielsweise die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz und dergleichen. Der nicht-kodierende Abschnitt 3' zu der kodierenden Sequenz kann regulatorische Sequenzen für die Beendigung der Transkription enthalten, wie beispielsweise Terminatoren und Polyadenylierungsstellen.
Sowohl konstitutive als auch induzierbare regulatorische Abschnitte können zur Expression des modifizierten Hsp verwendet werden. Es kann wünschenswert sein, induzierbare Promotoren zu verwenden, wenn die Bedingungen, die optimal für das Wachstum der rekombinanten Zellen sind, und die Bedingungen für eine Expression des modifizierten Hsp auf hohem Niveau unterschiedlich sind. Beispiele für nützliche regulatorische Abschnitte werden im nächsten Abschnitt weiter unten angefügt.
Um DNA-Sequenzen mit regulatorischen Funktionen, wie beispielsweise Promotoren, an die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz anzufügen, oder um die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz in eine Klonierungsstelle eines Vektors zu inserieren, können Verknüpfer und Adapter, die die geeigneten kompatiblen Restriktionsstellen bereitstellen, an die Enden der cDNAs nach Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, angefügt werden (Wu et al., 1987, Methods in Enzymol 152:343-349). An die Spaltung mit einem Restriktionsenzym kann sich eine Modifikation zur Erzeugung von stumpfen Enden anschließen, in den einzelsträngige DNA-Termini vor der Verknüpfung zurückverdaut oder aufgefüllt werden. Alternativ kann eine gewünschte Stelle für ein Restriktionsenzym in ein Fragment einer DNA durch Vermehrung der DNA unter Anwendung von PCR mit Primern eingeführt werden, die die gewünschte Stelle für das Restriktionsenzym enthalten.
Ein Expressionskonstrukt, das eine modifizierte Hsp-Sequenz umfasst, die funktionsgerecht mit Regulatoren-Abschnitten assoziiert ist, kann direkt in geeignete Wirtszellen zur Expression und Produktion von modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen ohne weiteres Klonieren eingeführt werden. Vgl. z.B. US-Patent Nr. 5 580 859. Die Expressionskonstrukte können auch DNA-Sequenzen enthalten, die die Integration der modifizierten Hsp-Sequenz in das Genom der Wirtszelle erleichtern, z.B. über eine homologe Rekombination. In diesem Fall ist es nicht erforderlich, einen Expressionsvektor zu verwenden, der einen Replikationsursprung aufweist, der für geeignete Wirtszellen geeignet ist, um das modifizierte Hsp in den Wirtszellen zu vermehren und zu exprimieren.
5.2.1 Wirts-Vektor-Systeme
Hierin werden Systeme aus Vektoren und Wirtszellen beschrieben, die für die Expression von modifizierten Hsps verwendet werden können. Es kann eine Vielzahl von Expressionsvektoren bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Plasmide, Cosmide, Phagen, Phagemide oder modifizierte Viren. Typischerweise umfassen derartige Expressionsvektoren einen funktionellen Ursprung der Replikation zur Vermehrung des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle, eine oder mehrere Restriktions-Endonucleasenstellen zur Insertion der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz und einen oder mehrere Selektionsmarker. Der Expressionsvektor muss mit einer kompatiblen Wirtszelle verwendet werden, die sich von einem prokaryontischen oder einem eukaryontischen Organismus ableiten kann, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Bakterien, Hefen, Insekten, Säugetiere und Menschen.
Expressionskonstrukte und Vektoren werden in Wirtszellen zum Zwecke der Erzeugung eines sekretierten modifizierten Hsp eingeführt. Irgendein Zelltyp, der Hitzeschockproteine erzeugen kann und mit dem Expressionsvektor kompatibel ist, kann verwendet werden, einschließlich derjenigen, die in vitro kultiviert wurden oder mit gentechnischen Verfahren erzeugt wurden. Wirtszellen können von normalen oder erkrankten Patienten erhalten werden, einschließlich von gesunden Menschen, Krebspatienten und Patienten mit einer Infektionserkrankung, aus privaten Laboratoriumshinterlegungen, aus öffentlichen Kultursammlungen wie beispielsweise der American Type Culture Collection oder von kommerziellen Lieferanten.
Zellen, in die eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz zum Zwecke der Produktion und Sekretion von modifizierten Komplexen aus Hsp und antigenem Peptid in vivo eingeführt werden können, können, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen Epithelzellen, Endothelzellen, Keratinocyten, Fibroblasten, Muskelzellen, Hepatocyten; Blutzellen wie beispielsweise T-Lymphocyten, B-Lymphocyten, Monocyten, Makrophagen, Neutrophile, Eosinophile, Megakaryocyten, Granulocyten; verschiedene Stamm- oder Vorläuferzellen, insbesondere hämatopoetische Stamm- oder Vorläuferzellen, beispielsweise wie sie erhalten werden aus Knochenmark, Nabelschnurblut, peripherem Blut, einer Fötusleber usw. Die Wahl des Zelltyps hängt ab vom Typ der Tumor- oder Infektionserkrankung, die behandelt oder der vorgebeugt wird, und kann von einem erfahrenen Fachmann bestimmt werden.
Unterschiedliche Wirtszellen weisen charakteristische und spezifische Mechanismen für die post-translationale Prozessierung und Modifikation von Proteinen auf. Es kann eine Wirtszelle gewählt werden, die das exprimierte Genprodukt auf eine spezifische Weise modifiziert und prozessiert und zwar ähnlich der Art, in der der Empfänger seine Hsps prozessiert. Für den Zweck der Erzeugung von großen Mengen an Hsp ist es bevorzugt, dass der Typ der verwendeten Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung zur Expression von heterologen Genen verwendet wurde und ausreichend gut charakterisiert und entwickelt ist für Produktionsprozesse in großem Maßstab. Bei einer spezifischen Ausführungsform stammen die Wirtszellen vom gleichen Patienten, dem die modifizierten Hsp-Peptid-Komplexe oder rekombinante Zellen, die modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe sekretieren, anschließend verabreicht werden, d.h. die Zelle, die zur Expression von modifiziertem Hsp und zur Verabreichung an eine Person verwendet wird, ist bezüglich der Person autolog.
In einer besonderen Ausführungsform wird ein Expressionskonstrukt, das eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz aufweist, in eine antigene Zelle eingeführt. Im Sinne der Verwendung hierin können antigene Zellen präneoplastische Zellen beinhalten, die mit einem krebsauslösenden infektiösem Mittel infiziert sind, wie beispielsweise einem Virus, die jedoch noch nicht neoplastisch sind; oder antigene Zellen, die einem Mutagen oder einem krebsauslösendem Mittel ausgesetzt wurden, wie beispielsweise DNA-schädigenden Mitteln, einer Strahlung usw. Andere Zellen, die verwendet werden können, sind präneoplastische Zellen, die sich in der Übergangsform von einer normalen zu einer neoplastischen Form befinden, und zwar nach Maßgabe ihrer Charakterisierung durch Morphologie, physiologische oder biochemische Funktionen.
Vorzugsweise sind die bei den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Krebszellen und präneoplatischen Zellen solche aus Säugetieren. Säugetiere, die gemäß diesem Aspekt der Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen ein Menschen, Begleittiere (z.B. Hunde und Katzen), landwirtschaftliche Tiere (z.B. Schafe, Rinder, Ziegen, Schweine und Pferde), Laboratoriumstiere (z.B. Mäuse, Ratten und Kaninchen) sowie gefangene und freie wilde Tiere.
Gemäß verschiedenen Ausführungsformen können irgendwelche Krebszellen, vorzugsweise menschliche Krebszellen, in den vorliegenden Verfahren zur Produktion von modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen oder zur Verwendung als Impfstoff verwendet werden. Die Krebszellen stellen die antigenen Peptide, die nicht-kovalent mit dem exprimierten modifizierten Hsp assoziiert werden. Krebsarten, die mit immunogenen Zusammensetzungen, die nach den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, behandelt werden können oder denen damit vorgebeugt werden kann, sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Tumore wie Sarkome und Karzinome. Beispiele für Krebsarten, die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung zugänglich sind, sind in Abschnitt 5.7 aufgezählt. Demgemäß können irgendwelche Gewebe oder Zellen, die aus einer präneoplastischen Läsion, einem Krebs, einschließlich eines Krebses, der sich metastasisch auf viele entfernte Orte verteilt hat, bei dem vorliegenden Verfahren verwendet werden. Beispielsweise können Zellen, die in einem anormal wachsenden Gewebe gefunden werden, zirkulierende Leukämiezellen, metastatische Läsionen sowie festes Tumorgewebe verwendet werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform können auch Zellen verwendet werden, die sich von einer präneoplastischen Läsion ableiten, von Krebsgeweben oder Krebszellen verwendet werden, vorausgesetzt, dass die Zellen der Zelllinie wenig stens eine oder mehrere antigene Determinanten aufweisen, die sie mit Antigenen auf den Ziel-Krebszellen teilen. Krebsgewebe, Krebszellen, mit einem krebsauslösenden Mittel infizierte Zellen, andere neoplastische Zellen und Zelllinien humanen Ursprungs sind bevorzugt. Vorzugsweise werden Krebszellen verwendet, die dem Patienten entnommen wurde, dem schließlich die Komplexe verabreicht werden sollen, d.h. die autologe Ausführung der Erfindung, obwohl das nicht der Fall sein muss (z.B. können die Krebszellen von einer oder mehreren unterschiedlichen Personen stammen).
Krebszellen und präneoplastische Zellen können durch irgendein Verfahren identifiziert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Beispielsweise können Krebszellen identifiziert werden durch Morphologie, Enzym-Assays, Proliferations-Assays, mittels einer cytogenetischen Charakterisierung, DNA-Mapping, DNA-Sequenzieren, anhand der Anwesenheit eines krebsauslösenden Virus oder einer Vorgeschichte der Einwirkung eines Mutagens oder krebsauslösenden Mittels, durch Bildgebungstechniken, usw. Als ein weiteres Beispiel können Krebszellen durch Chirurgie, Endoskopie oder mittels anderer Biopsietechniken erhalten werden. Wenn bestimmte unterscheidungskräftige Eigenschaften der Krebszellen bekannt sind, können sie auch nach irgendwelchen biochemischen und immunologischen Verfahren gewonnen und gereinigt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, durch Affinitätschromatographie und durch Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (z.B. mit fluoreszierend markierten Antikörpern gegen ein Antigen, das von den Krebszellen exprimiert wird).
Es besteht kein Erfordernis, dass eine klonale oder homogene oder gereinigte Population von Krebszellen verwendet wird. Krebsgewebe, Krebszellen oder Zelllinien können von einer einzigen Person erhalten werden oder von verschiedenen Personen gepoolt werden. Es ist nicht wesentlich, Zellen des schließlichen Ziels in vivo zu verwenden (z.B. Zellen aus dem Tumor des beabsichtigten Empfängers), solange wenigstens eine oder mehrere antigene Determinanten auf den Ziel-Krebszellen auch auf den Zellen vorhanden sind, die zur Expression eines modifizierten Hsp verwendet werden. Zusätzlich können Zellen, die sich von entfernten Metastasen ableiten, dazu verwendet werden, eine immunogene Zusammensetzung gegen den primären Krebs herzustellen. Es kann auch eine Mischung von Zellen verwendet werden, vorausgesetzt, dass eine erhebliche Zahl von Zellen in der Mischung Krebszellen sind und wenigstens eine antigene Determinante mit der Ziel-Krebszelle teilen. Bei einer spezifischen Ausführungsform sind die Krebszellen zur Verwendung für die Expression eines modifizierten Hsp gereinigt.
Vektoren auf der Basis von E. coli sind die populärsten und vielseitigsten Systeme zur Expression von Fremdproteinen auf hohem Niveau (Makrides, 1996, Microbiol Rev, 60:512-538). Nicht-einschränkende Beispiele für regulatorische Abschnitte, die zur Expression in E. coli verwendet werden können, können, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen lac, trp, lpp, phoA, recA, tac, T3, T7 und λP_L (Makrides, 1996, Microbiol Rev, 60:512-538). Nicht-einschränkende Beispiele für prokaryontische Expressionsvektoren können einschließen die Reihe der λgt-Vektoren, wie beispielsweise λgt11 (Huynh et al., 1984 in "DNA Cloning Techniques", Vol. I: A Practical Approach (D. Glover, ed.), Seiten 49-78, IRL Press, Oxford), und die Reihe der pET-Vektoren (Studier et al., 1990, Methods Enzymol., 185:60-89).
Ein potentieller Nachteil eines prokaryontischen Wirt-Vektor-Systems ist die Unfähigkeit, viele der post-translationalen Prozessierungsschritte von Säugetierzellen durchzuführen. Somit wird ein eukaryontisches Wirts-Vektor-System bevorzugt, und ein Säugetier-Wirts-Vektor-System ist stärker bevorzugt, und ein menschliches Wirts-Vektor-System ist am stärksten bevorzugt.
Zur Expression von modifizierten Hsp in Säugetier-Wirtszellen kann eine Vielzahl von regulatorischen Abschnitten verwendet werden, beispielsweise die frühen und späten SV40-Promotoren, der direkte frühe Cytomegalovirus (CMV)-Promotor und der Rous-Sarkom-Virus-Promotor mit langem terminalen Repeat (RSV-LTR). Induzierbare Promotoren, die in Säugetierzellen nützlich sein können, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen ein, die mit dem Metallothionein-II-Gen assoziiert sind, Maus-Mammatumorvirus-Glucocorticoid-reaktive lange terminale Repeats (MMTV-LTR), dem β-Interferon-Gen und dem hsp70-Gen (Williams et al., 1989, Cancer Res. 49:2735-42; Taylor et al., 1990, Mol. Cell Biol., 10:165-75). Es kann vorteilhaft sein, Hitzeschockpromotoren oder Stresspromotoren zu verwenden, um die Expression des modifizierten hsp in einer rekombinanten Wirtszelle anzutreiben.
Die folgenden tierischen regulatorischen Abschnitte, die eine Gewebespezifität zeigen und in transgenen Tieren verwendet wurden, können auch in Tumorzellen eines speziellen Gewebetyps verwendet werden: der Kontrollabschnitt des Elastase-I-Gens, der in pankreatischen acinaren Zellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); der Kontrollabschnitt des Insulin-Gens, der in pankreatischen Beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), der Kontrollabschnitt des Immunglobulin-Gens, der in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658, Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444), der Kontrollabschnitt des Mäusemammatumor-Virus, der in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), der Kontrollabschnitt des Albumin-Gens, der in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), der Kontrollabschnitt des alpha-Fetoprotein-Gens, der in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58; der Kontrollabschnitt des alpha-Antitrypsin-Gens, der in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171), der Kontrollabschnitt des beta-Globin-Gens, der in Myeloid-Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); der Kontrollabschnitt des basischen Myelin-Protein-Gens, der in Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); der Kontrollabschnitt des Gens für die leichte Kette-2 von Myolin, der in Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314:283-286), der Kontrollabschnitt des Gens für das Gonadotrophin-Releasing-Hormon, der im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Die Wirksamkeit der Expression des modifizierten Hsp in einer Wirtszelle kann durch Einschluss von geeigneten Transkriptionsverstärkerelementen in den Expressionsvektor verstärkt werden, wie denen, die gefunden werden im SV40-Virus, im Hepatitis-B-Virus, dem Cytomegalovirus, in Immunglobulingenen, Metallothionein, β-Aktin (vgl. Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544, Gormon, 1990, curr. Op. in Biotechnol. 1:36-47).
Der Expressionsvektor kann auch Sequenzen enthalten, die das Verbleiben und die Replikation des Vektors in mehr als einem Typ von Wirtszellen gestatten, oder die Integration des Vektors in das Wirts-Chromoson. Derartige Sequenzen können, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen Applikationsursprünge, autonom replizierende Sequenzen (ARS), Zentromeren-DNA und Telomeren-DNA. Es kann auch vorteilhaft sein, Shuttle-Vektoren zu verwenden, die in wenigstens zwei Typen von Wirtszellen repliziert und gehalten werden können.
Zusätzlich kann der Expressionsvektor selektierbare und screenbare Marker-Gene für das ursprüngliche Isolieren, das Identifizieren oder das Verfolgen von Wirtszellen enthalten, die DNA enthalten, die für ein modifiziertes Hsp kodieren. Für eine langfristige Produktion von modifizierten Hsp-Peptidkomplexen in hoher Ausbeute ist eine stabile Expression in Säugetierzellen bevorzugt. Als Säugetierzellen können eine Vielzahl von Selektionssystemen verwendet werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, die Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., 1977, Cell 11:223), die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Szybalski und Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al., 1980, Cell 22:817)-Gene, und diese können in tk^–, hgprt^–- bzw. aprt^–-Zellen verwendet werden. Außerdem kann auch eine Antimetabolit-Resistenz als Basis der Selektion für Dihydrofolat-Reduktase (Dhfr) verwendet werden, die eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, die eine Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); Neomycinphosphotransferase (neo), die eine Resistenz gegen das Aminoglycosid G-418 verleiht (Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1); und Hygromycin-Phosphotransferase (hyg), die eine Resistenz gegen Hygromycin verleiht (Santerre et al., 1984, Gene 30:147): Andere selektierbare Marker, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Histidinol und Zeocin^TM können ebenfalls verwendet werden.
Bevorzugte Säugetier-Wirtszellen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein solche die sich ableiten von Menschen, Affen oder Nagetieren (vgl. Kriegler M. in "Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual", New York, Freeman & Co. 1990), wie beispielsweise die Affennieren-Zelllinie, die durch SV40 transformiert ist (COS-7, ATCC CRL 1651); die humane embryonale Nierenlinie (293, 2903-EBNA oder 293 Zellen, subkloniert zum Wachstum in Suspensionskultur, Graham et al., J. Gen. Virol., 36:59, 1977; Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Ovarialzellen des chinesischen Hamsters-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin. Proc. Natl. Acad. Sci. 77; 4216, 1980); Maus-Sertoli-Zellen (Mather, Biol. Reprod. 23:243-251, 1980); Maus-Fibroblasten-Zellen (NTH-3T3), Affen-Nierenzellen (CVI ATCC CCL 70); Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane zervikale Karzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hunde-Kidney-Zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); humane Leberzellen (Hep G2, HB 8065); und Mäuse-Mammatumor-Zellen (MMT 060562, ATCC CCL51). Bei spielhafte Krebszelltypen, die zur Demonstration der Nützlichkeit von rekombinanten Zellen (die modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe erzeugen) als Krebsimpfstoff verwendet werden, werden wie folgt angegeben: eine Mäuse-Fibroblasten-Zelllinie NIH3T3, eine Mäuse-Lewis-Lungenkarzinom-Zelllinie, LLC, eine Maus-Mastocytom-Zelllinie, P815, eine Maus-Lymphom-Zelllinie, EL4 und deren Ovalbumin-Transfektant, E.G7, eine Maus-Melanom-Zelllinie, B16F10, eine Maus-Fibrosarkom-Zelllinie, MC57, und humane kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinien, SCLC#2 und SCLC#7.
Es kann mit Säugetierzellen auch eine Vielzahl von Expressionssystemen auf Virenbasis verwendet werden, um modifizierte Hsp herzustellen. Vektoren, die DNA-Virus-Rückgratabschnitte verwenden, wurden erhalten vom Simian-Virus 40 (SV40) (Hamer et al., 1979, Cell 17:725), vom Adenovirus (Van Doren et al., 1984, Mol Cell Biol 4:1653), vom Adeno-assoziierten Virus (McLaughlin et al., 1988, J Virol 62:1963), und vom bovinen Papilloma-Virus (Zinn et al., 1982, Proc Natl. Acad Sci 79:4897). In Fällen, in denen ein Adenovirus als Expressionsvektor verwendet wird, kann die Donor-DNA-Sequenz mit einem Adenovirus-Transkriptions/-Translations-Kontrollkomplex ligiert sein, beispielsweise dem späten Promotor und der tripartiten Leader-Sequenz. Dieses Chimären-Gen kann dann in das Adenovirus-Genom durch in vitro- oder in vivo-Rekombination inseriert werden. Die Insertion in einen nicht-essentiellen Abschnitt des Virus-Genoms (z.B. den Abschnitt E1 oder E3) liefert einen rekombinanten Virus, der lebensfähig und in der Lage ist, heterologe Produkte in infizierten Wirten zu exprimieren (vgl. z.B. Logan and Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659).
Das bovine Papilloma-Virus (BPV) kann viele höhere Wirbeltiere, einschließlich des Menschen, infizieren, und seine DNA repliziert sich als ein Episom. Es wurde eine Anzahl von Shuttle-Vektoren für die rekombinante Gen-Expression entwickelt, die existieren als stabile Mehrkopien(20-300 Kopien/Zelle) extrachromosomale Elemente in Säuge tierzellen. Typischerweise enthalten diese Vektoren ein Segment von BPV DNA (das gesamte Genom oder ein 69%iges transformierendes Fragment), einen Promotor mit einem breiten Wirtsbereich, ein Polyadenylierungssignal, Splicing-Signale, einen selektierbaren Marker und "giftfreie" Plasmid-Sequenzen, die die Vermehrung des Vektors in E. coli ermöglichen. Im Anschluss an die Konstruktion und Vervielfältigung in Bakterien wird das Expressions-Gen-Konstrukt in kultivierte Säugetierzellen transfiziert, beispielsweise durch die Calciumphosphat-Copräzipitationstechnik. Für diejenigen Wirtszellen, die keinen transformierten Phänotyp zeigen, wird eine Selektion von Transformanten unter Verwendung eines dominanten selektierbaren Markers erreicht, wie beispielsweise durch Histidinol oder G418-Resistenz. Wie in Abschnitt 6 beschrieben wird, wurde eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz in zwei BPV-Vektoren, pBCMGSNeo und pBCMGHis, inseriert (Karasuyama et al., Eur. J. Immunol. 18:97-104; Ohe et al., Human Gene Therapy, 6:325-33), die dann in einen vielgestaltigen Bereich von Zelltypen zur Expression des modifizierten Hsp transfiziert wurden.
Alternativ kann der Vaccinia 7,5 K-Promotor verwendet werden (vgl. z.B. Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49:857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931.) In Fällen, in denen eine menschliche Wirtszelle verwendet wird, können Vektoren auf der Basis des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Ursprungs(OriP) und des EBV-Kernantigens 1 (EBNA-1; ein trans-wirkender Replikationsfaktor) verwendet werden. Derartige Vektoren können mit einem weiten Bereich von menschlichen Wirtszellen verwendet werden, z.B. EBO-pCD (Spickofsky et al., 1990, DNA Prot Eng Tech 2:14-18); pDR2 und λDR2 (erhältlich von Clontech Laboratories).
Modifizierte Hsps können auch mit einem Expressionssystem auf Retrovirusbasis hergestellt werden. Retroviren, wie beispielsweise der murine Leukämie-Virus von Moloney, können verwendet werden, da das meiste der viralen Gen-Sequenz entfernt werden kann und durch eine modifizierte Hsp-Gen-Sequenz ersetzt werden kann, während die fehlenden viralen Funktionen in trans geliefert werden können. Im Kontrast zur Transfektion können Retroviren in wirksamer Weise Gene in einen weiten Bereich von Zelltypen infizieren und transfizieren, einschließlich, beispielsweise, primären hämatopoetischen Zellen. Darüber hinaus kann der Wirtsbereich zur Infektion mit einem retroviralen Vektor manipuliert werden durch die Wahl der Hülle, die zum Verpacken des Vektors verwendet wird.
Beispielsweise kann ein retroviraler Vektor einen langen 5'-terminalen Repeat (LTR), einen 3'-LTR, ein Verpackungssignal, einen bakteriellen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker enthalten. Die DNA des modifizierten Hsp wird in einer Position zwischen dem 5'-LTR und 3'-LTR so inseriert, dass eine Transkription vom 5'-LTR-Promotor die klonierte DNA transkribiert. Der 5'-LTR umfasst einen Promotor, der, ohne darauf beschränkt zu sein, einen LTR-Promotor, einen R-Abschnitt, einen U5-Abschnitt und eine Primer-Bindungsstelle in der genannten Reihenfolge umfasst. Nucleotid-Sequenzen dieser LTR-Elemente sind dem Fachmann gut bekannt. Ein heterologer Promotor sowie multiple Arzneimittel-Selektionsmarker können ebenfalls in den Expressionsvektor aufgenommen werden, um die Selektion von infizierten Zellen zu erleichtern. Vgl. McLauchlin et al., 1990, Prog Nuclein Acid Res and Molec Biol 38:91-135; Morgenstern et al., 1990, Nucleic Acid Res 18:3587-3596; Choulika et al., 1996, J Virol 70:1792-1798; Boesen et al., 1994, Biotherapy 6:291-302; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4:129-141; und Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114.
Andere nützliche eukaryontische Wirt-Vektor-Systeme können Hefe- und Insektensysteme einschließen. In Hefen kann eine Vielzahl von Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, verwendet werden mit Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe), Schizosaccharomyces pombe (Spalthefe), Pichia pastoris, und Hansenula polymorpha (methylotrope Hefen). Als Review vgl. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, in Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, Seiten 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; und Bittner, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, Seiten 673-684; und The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I und II.
In einem Insektensystem kann Autographa californica Kern-Polyhidrosis-Virus (AcNPV), ein Baculovirus, als Vektor zur Expression von modifiziertem Hsp in Spodoptera-Frugiperda-Zellen verwendet werden. Die modifizierte Hsp-Gen-Sequenzen können in nicht-essentielle Abschnitte (beispielsweise das Polyhedrin-Gen) des Virus kloniert und unter die Kontrolle eines AcNPV-Promotors gestellt werden (beispielsweise des Polyhedrin-Promotors). Diese rekombinanten Viren werden dann dazu verwendet, Wirtszellen zu infizieren, in denen die inserierte DNA exprimiert wird (vgl. z.B. Smith et al., 1983, J. Virol 46:584; Smith, US-Patent No. 4 215 051).
Irgendeiner der Klonier- und Expressions-Vektoren, die hierin beschrieben werden, kann aus bekannten DNA-Sequenzen nach dem Fachmann gut bekannten Techniken synthetisiert und zusammengestellt werden. Die regulatorischen Abschnitte und die Verstärker-Elemente können verschiedensten Ursprungs sein, sowohl natürlichen als auch synthetischen. Einige Vektoren und Wirtszellen können kommerziell bezogen werden. Nicht limitierende Beispiele für nützliche Vektoren werden beschrieben in Appendix 5 of Current Protocols in Molecular Biology, 1988, ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, wobei diese Literaturstelle hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird; und in den Katalogen von kommerziellen Lieferanten wie Clontec Laboratories, Stratagene Inc., und Invitrogen, Inc.
5.2.2. Expression von modifierten Hsps
Expressionskonstrukte, die eine klonierte Nucleotidsequenz enthalten, die für modifizierte Hsps kodiert, können in die Wirtszelle nach einer Vielzahl von Techniken eingeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind, wozu, ohne darauf beschränkt zu sein, gehören für prokaryontische Zellen die bakterielle Transformation (Hanahan, 1985, in DNA Cloning, A Practical Approach, 1:109-136), und für eukaryontische Zellen die Calciumphosphat-vermittelte Transfektion (Wigler et al., 1977, Cell 11:223-232), die Liposomen-vermittelte Transfektion (Schaefer-Ridder et al., 1982, Science 215:166-168), die Electroporation (Wolff et al., 1987, Proc Natl. Acad Sci 84:3344) und die Mikroinjektion (Cappechi, 1980, Cell 22:479-488). Coexpression eines modifizierten Hsp und eines Antigens in der gleichen Wirtszelle kann nach im Wesentlichen den gleichen Verfahren erreicht werden.
Für eine langfristige Produktion in hoher Ausbeute von ordnungsgemäß prozessierten modifizierten Hsp oder modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen ist eine stabile Expression in Säugetierzellen bevorzugt. Zelllinien, die modifizierte Hsp oder modifizierte Hsp-Peptid-Komplexe stabil exprimieren, können unter Verwendung eines Vektors konstruiert werden, der einen selektierbaren Marker enthält. Als Beispiel, ohne Einschränkung, können im Anschluss an die Einführung des Expressionskonstrukts die gentechnisch veränderten Zellen 1-2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen, und werden dann auf ein selektives Medium umgestellt. Der selektierbare Marker in dem Expressionskonstruk verleiht eine Resistenz gegenüber der Selektion und ermöglicht es den Zellen auf optimale Weise, das Expressionskonstrukt stabil in ihre Chromosomen zu integrieren und in Kultur zu wachsen und zu einer Zelllinie expandiert zu werden. Derartige Zellen können übereinen langen Zeitraum kultiviert werden, wobei modifiziertes Hsp kontinuierlich exprimiert wird.
Die rekombinanten Zellen können unter Standardbedingungen bezüglich Temperatur, Inkubationszeit, optischer Dichte und Medienzusammensetzung kultiviert werden. Alternativ kann eine rekombinante antigene Zelle unter Bedingungen kultiviert werden, die die ernährungsmäßigen und physiologischen Anforderungen der Krebszelle oder infizierten Zelle nachbilden. Die Bedingungen für das Wachstum von rekombinanten Zellen können sich jedoch von denen für die Expression von modifizierten Hsps und antigenen Proteinen unterscheiden. Modifizierte Kulturbedingungen und Medien können ebenfalls angewandt werden, um die Produktion von Hsp-Peptid-Komplexen zu verstärken. Beispielsweise können rekombinante Zellen, die modifizierte Hsps mit ihren natürlichen Promotoren enthalten, Hitze oder einem anderen Umweltstress oder einem chemischen Stress ausgesetzt werden. Es kann irgendeine auf dem Fachgebiet bekannte Technik angewandt werden, um die optimalen Bedingungen zur Produktion von modifizierten Hsp oder modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen festzustellen.
Bei einer Ausführungsform, bei der die rekombinanten Zellen, die das modifizierte Hsp exprimieren, als Impfstoff verwendet werden, wird die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz in eine Zelle eingeführt, bevor man die resultierende rekombinante Zelle in vivo verabreicht. Eine derartige Einführung kann nach irgendeinem Verfahren erfolgen, das dem Fachmann bekannt ist, einschließlich des Fachgebiets der Gentherapie, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, durch Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Infektion mit einem viralen oder Bakteriophagen-Vektor, der die modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen enthält, durch Zellfusion, Chromosomen-vermittelten Gen-Transfer, Mikrozellen-vermittelten Gen-Transfer, Sphäroplastenfusion usw. Es können zahlreiche Techniken, die auf dem Fachgebiet zur Einführung von Fremdgenen in Zellen bekannt sind (vgl. z.B. Loeffler und Behr, 1993, Meth. Enzymol. 217:599-618; Cohen et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:618-644; Cline, 1985, Pharmac. Ther. 29:69-902) gemäß der vorliegenden Erfindung angewandt werden, vorausgesetzt, dass die erforderlichen Entwicklungs- und physiologischen Funktionen der Empfängerzellen nicht zerstört werden. Die Technik sollte einen stabilen Transfer der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz in die Zelle gewährleisten, so dass die Sequenz von der Zelle exprimierbar ist und vorzugsweise vererblich und von ihren Zell-Nachkömmlingen exprimierbar ist.
Die resultierenden rekombinanten Zellen können einem Patienten nach verschiedenen verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, verabreicht werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Epithel-Zellen injiziert, z.B. subkutan. Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Hautzellen als Hauttransplantat einem Patienten zugeführt werden. Rekombinante Blutzellen (z.B. hämatopoetische Stammzellen oder Vorläuferzellen) werden vorzugsweise intravenös verabreicht. Die für die Verwendung vorgesehene Menge an Zellen hängt ab von dem gewünschten Effekt, vom Zustand des Patienten usw. und kann von einem erfahrenen Fachmann bestimmt werden.
5.2.3. Coexpression von modifizierten Hsps und Antigenen
In einer alternativen Ausführungsform kann eine exprimierbare Form einer Nucleotid-Sequenz, die für ein Protein-Antigen oder für Abschnitte davon kodiert, in eine rekombinante Zelle eingeführt werden, die eine exprimierbare Hsp-Gen-Sequenz enthält, so dass das Antigen mit einer modifizierten Hsp coexprimiert wird. Verfahren zur Gewinnung der Nucleotid-Sequenz, die für ein Antigen kodiert, werden beschrieben in Abschnitt 5.4.5. Es kann irgendeine Technik zur Einführung der exprimierbaren Form der Antigen-Gensequenz angewandt werden, wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, die in Abschnitt 5.2.2 beschriebenen. Das Protein-Antigen oder Teile davon werden nicht kovalent mit dem modifizierten ER der rekombinanten Zelle assoziiert, und der resultierende Komplex modifiziertes Hsp-antigenes Peptid wird sekretiert. Ein derartiger Komplex kann aus dem Zellkulturmedium nach irgendeinem Verfahren gereinigt werden, wie es in Abschnitt 5.3 beschrieben wird, sowie nach anderen Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Der gereinigte Komplex aus modifiziertem Hsp-Antigen kann als Impfstoff verwendet werden, um eine Immunreaktion gegen das antigene Protein in einer Person zu stimulieren, und zwar zum Zwecke der Behandlung oder Prävention von Krebs oder Infektionserkrankungen.
Ferner können die rekombinanten Zellen, die exprimierbare Formen von sowohl einer modifizierten Hsp-Gen-Sequenz und einer Nucleotid-Sequenz, die für ein antigenes Protein kodiert, enthalten, direkt als Impfstoff für eine Injizierung in eine Person verwendet werden. Wie oben beschrieben wurde, sekretieren derartige Zellen den Komplex aus modifiziertem Hsp-Antigen, der eine Immunreaktion gegen das antigene Protein in der Person stimulieren kann, und zwar zum Zwecke der Behandlung oder Prävention von Krebs oder Infektionserkrankungen. Die Verwendung eines derartigen Komplexes aus modifiziertem Hsp-Peptid und von rekombinanten Zellen, die exprimierbare Formen eines modifizierten Hsp und eine Antigen-Gen-Sequenz enthalten, um Krebs oder Infektionserkrankungen zu behandeln oder diesen vorzubeugen, werden in den Abschnitten 5.7 und 5.8 beschrieben.
5.3. Reinigung von modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen
Allgemein kann das modifizierte Hsp gemäß der Erfindung aus rekombinanten Zell-Kulturen nach bekannten Verfahren gewonnen und aufgereinigt werden, einschließlich der Ammoniumsulfatfällung, der Säureextraktion, der Anionen- oder Kationen-Austausch-Chromatographie, der Phosphocellulose-Chromatographie, Immunoaffinitäts-Chromatographie, der Hydroxyapatit-Chromatographie und der Lectin-Chromatographie.
Die Reinigung von hsp70-Peptid-Komplexen aus Zell-Lysaten wurde bereits beschrieben, vgl. beispielsweise Udono et al., 1993, J. Exp. Med. 178.1391-1396. Die Reinigung von hsp90-Peptid-Komplexen und gp96-Peptid-Komplexen aus Cell-Lysaten wurde beispielsweise beschrieben in WO 95/24923, mit Datum vom 21. September 1995, und in WO 97/10000, mit Datum vom 20. März 1997. Diese Verfahren können verwendet werden, um das modifizierte Hsp oder die Komplexe aus modifiziertem Hsp und Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung aus den rekombinanten Zellen zu reinigen, und mit geringfügigen Modifikationen, die dem Fachmann bekannt sind, auch des modifizierten Hsp oder der Komplexe aus modifiziertem Hsp und Peptid aus der Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung stellt jedoch verbesserte Verfahren zur Reinigung der modifizierten Hsps bereit, die auf den Eigenschaften des Peptid-Tags beruhen, der an den modifizierten Hsp vorhanden ist. Ein Ansatz beruht auf spezifischen molekularen Wechselwirkungen zwischen einem Tag und seinem Bindungspartner. Der andere Ansatz beruht auf dem immunspezifischen Binden eines Antikörpers an ein Epitop, das auf dem Tag vorhanden ist. Das Prinzip der auf dem Fachgebiet gut bekannten Affinitäts-Chromatographie ist auf beide dieser Ansätze allgemein anwendbar.
Nachfolgend werden verschiedene Verfahren beschrieben, die auf spezifischen molekularen Wechselwirkungen eines Tags und seines Bindungspartners beruhen.
Ein Verfahren, das allgemein anwendbar ist auf die Reinigung von modifizierten Hsp, die mit konstanten Abschnitten von Immunglobulinen fusioniert sind, ist die Protein A-Affinitätschromatographie, eine Technik, die dem Fachmann gut bekannt ist. Das Staphylokokken-Protein A ist ein 42 kD-Polypeptid, das spezifisch an einen Abschnitt bindet, der zwischen dem zweiten und dem dritten konstanten Abschnitt der schweren Kette von Immunglobulinen lokalisiert ist. Wegen der Fc-Domänen von unterschiedlichen Klassen, Unterklassen und Spezies von Immunglobulinen ist die Affinität von Protein A für humane Fc-Abschnitte stark, kann jedoch im Falle anderer Spezies variieren. Unterklassen, die weniger bevorzugt sind, schließen ein humanes IgG-3 sowie die meisten Ratten-Unterklassen. Für bestimmte Unterklassen kann bei der Reinigung anstelle von Protein A Protein G (aus Streptokokken) verwendet werden. Protein-A-Sepharose (Pharmacia oder Biorad) wird üblicherweise als Festphase zur Affinitätsreinigung von Antikörpern verwendet, und kann auf im Wesentlichen die gleiche Weise zur Reinigung von modifizierten Hsp verwendet werden, die mit einem Immunglobulin- Fc-Fragment fusioniert sind. Sekretiertes modifiziertes Hsp, das im Zellüberstand vorhanden ist, bindet spezifisch an Protein A an der Festphase, während die Verunreinigungen ausgewaschen werden. Das gebundene modifizierte Hsp kann mit Hilfe unterschiedlicher Puffersysteme, die dem Fachmann bekannt sind, eluiert werden, einschließlich einer Folge von Citrat-, Acetat- und Glycin-HCl-Puffern, wobei der pH allmählich abgesenkt wird. Dieses Verfahren ist weniger bevorzugt, wenn die rekombinanten Zellen auch Antikörper produzieren, die mit dem modifizierten Hsp mitaufgereinigt würden. Vgl. beispielsweise Langone, 1982, J. Immunol. meth. 51:d; Wilchek et al., 1982, Biochem. Intl. 4:629; Sjobriong et al., 1991, J. Biol. Chem. 26:399; Seite 617-618, in: Antibodies A Laboratory Manual, edited by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.
Alternativ kann ein Polyhistidin-Tag verwendet werden, wobei in diesem Falle das modifizierte Hsp durch Metallchelat-Chromatographie gereinigt werden kann. Der Polyhistidin-Tag, üblicherweise eine Sequenz aus sechs Histidinen, weist eine hohe Affinität für zweiwertige Metallionen auf, wie beispielsweise für Nickelionen (Ni²⁺), die an einer Festphase mobilisiert werden können, wie beispielsweise an Nitrilotriessigsäure-Matrizen. Polyhistidin weist eine gut charakterisierte Affinität für Ni²⁺-NTA-Agarose auf, und kann nach irgendeiner von zwei milden Behandlungen eluiert werden: Imidazol (0,1-0,2 M) konkurriert in wirksamer Weise mit dem Harz um Bindungsstellen; oder die Absenkung des pH bis gerade unter 6,0 führt zu einer Protonierung der Histidin-Seitenketten und zerstört die Bindung. Das Reinigungsverfahren umfasst das Aufgeben des Zellkultur-Überstands auf die Ni²⁺-NTA-Agarosesäule, das Waschen der Verunreinigungen durch die Säule und das Eluieren des modifizierten Hsp mit Imidazol oder einer schwachen Säure. Ni²⁺-NTA-Agarose kann von kommerziellen Lieferanten wie Sigma (St. Louis) und Quiagen erhalten werden. Antikörper, die den Polyhistidin-Tag erkennen, sind ebenfalls erhältlich, die zum Nachweis und zur Quantifizierung des modifizierten Hsp verwendet werden können.
Ein anderes Beispiel für einen Peptid-Tag, der verwendet werden kann, ist die Glutathion-S-Transferase (GST)-Sequenz, die ursprünglich aus dem Wurm Schistosoma japonicum kloniert wurde. Im Allgemeinen kann eine Fusion aus modifiziertem Hsp-GST, die in einer prokaryontischen Wirtszelle exprimiert wurde, wie beispielsweise in E. coli, aus dem Zell-Kulturüberstand durch Absorption mit Glutathion-Agarose-Perlen gereinigt werden, gefolgt von einer Elution in Gegenwart von freiem reduziertem Glutathion bei neutralem pH. Während der Reinigung sind an keiner Stelle denaturierende Bedingungen erforderlich, weshalb sie für eine Verwendung bei der Beladung von immobilisiertem modifiziertem Hsp mit antigenen Peptiden wünschenswert sein kann. Da ferner bekannt ist, das GST unter bestimmten Bedingungen Dimere bildet, kann ein Dimer-modifiziertes Hsp erhalten werden. Vgl. Smith, 1993, Methods Mol. Cell Bio. 4:220-229.
Ein weiterer nützlicher Peptid-Tag, der verwendet werden kann, ist das Maltose-bindende Protein (MBP) von E. Coli, für das das ma1E-Gen kodiert. Das sekretierte modifizierte Hsp-MBP, das in dem Zellüberstand vorhanden ist, bindet an Amylose-Harz, während Verunreinigungen ausgewaschen werden. Das gebundene modifizierte Hsp-MBP wird durch Maltose von dem Amylose-Harz eluiert. Vgl. beispielsweise Guan et al., 1987, Gene 67:21-30.
Der zweite Ansatz zur Reinigung von modifiziertem Hsp ist auf Peptid-Tags anwendbar, die ein Epitop enthalten, für das polyklonale oder monoklonale Antikörper zur Verfügung stehen. Es können verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet zur Reinigung von Protein mit Hilfe eines immunspezifischen Bindens bekannt sind, wie beispielsweise Immunoaffinitäts-Chromatographie oder Immunpräzipitation, angewandt werden. Vgl. beispielsweise Kapitel 13 in: Antibodies A Laboratory Manual, herausgegeben von Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; und Kapitel 8, Abschnitte I und II in Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al., John Wiley, 1991; wobei deren Inhalt durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird.
Die beschriebenen Ausführungsformen können verwendet werden, um sekretierte Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid aus dem Zellkulturmedium von Säugetierzellen, wie beispielsweise humanen Zellen, die ein erfindungsgemäßes modifiziertes Hsp exprimieren, zu gewinnen und zu reinigen. Die Verfahren können so angepasst werden, dass eine Reinigung von modifiziertem Hsp und/oder von Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid im mittleren oder im großen Maßstab durchgeführt wird. Verfahren, die keine Absenkung des pH oder denaturierende Bedingungen benötigen, sind zur Reinigung von Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid besonders bevorzugt. Obwohl sie in den Beispielen für Tumorzellen beschrieben werden, können die beschriebenen Verfahren verwendet werden, um Hsps aus irgendwelchen eukaryontischen Zellen zu isolieren, beispielsweise aus Geweben, isolierten Zellen oder immortalisierten eukaryontischen Zelllinien, die mit einem intrazellulären Pathogen infiziert sind, oder Zellen, die von einer Person erhalten wurden, die mit einem Pathogen infiziert ist.
5.4. In Vitro-Produktion von Komplexen Hsp-antigenes Molekül
Bei einer Ausführungsform, bei der Komplexe aus modifizierten Hsp und den Peptiden, mit denen sie in rekombinanten Zellen endogen assoziiert wurden, nicht zur Anwendung kommen, können Komplexe aus modifizierten Hsps mit antigenen Molekülen in vitro produziert werden. Wie Fachleute verstehen, können die antigenen Peptide, die entweder nach den nachfolgenden Verfahren isoliert wurden oder die chemisch synthetisiert wurden oder rekombinant hergestellt wurden, mit einer Vielzahl von modifizierten Hitzeschockproteinen in vitro rekonstituiert werden, um immunogene nicht-kovalente Komplexe modifiziertes Hsp-Peptid zu erzeugen. Solche Komplexe können als die immuntherapeutischen und prophylaktischen Impfstoffe der Erfindung verwendet werden. Die Verfahren der in vitro-Produktion des Komplexes modifiziertes Hsp-Peptid können so angepasst werden, dass sie in einem mittleren Maßstab oder in einem großen Maßstab durchgeführt werden. Antigene oder antigene Teile davon, die für einen oder mehrere Typen von Krebszellen spezifisch sind, oder die für eine infizierte Zelle oder ein infektiöses Mittel spezifisch sind, können zur Verwendung als antigene Peptide für die Komplexbildung mit modifizierten Hsp unter denen ausgewählt werden, die dem Fachmann bekannt sind oder bei denen mittels eines Immunoassays bestimmt wurde, dass sie in der Lage sind, an einen Antikörper oder an MHC-Moleküle (Antigenität) zu binden oder eine Immunreaktion zu erzeugen (Immunogenität).
5.4.1. Exogene antigene Moleküle
Um die Immunogenität oder Antigenität eines vermutlichen Antigens durch Nachweis seiner Bindung an einen Antikörper zu bestimmen, können verschiedene Immunoassays verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, kompetitiver und nicht-kompetitiver Assay-Systeme unter Anwendungen von Techniken wie Radioimmunoassays, ELISA (Enzym-verknüpfter Immunosorbens-Assay), "Sandwich"-Immunoassays, immunoradiometrischen Assays, Geldiffusions-Präzipitinreaktionen, Immunodiffusions-Assays, in vivo-Immunoassays (unter Verwendung von beispielsweise Labeln aus kolloidalem Gold, Enzym oder Radioisotopen), Western Blots, Immunpräzipitationen, Agglutinations-Assays (z.B. Gel-Agglutinations-Assays, Hämagglutinations-Assays, Komplement-Expressions-Assays, Immunfluoreszenz-Assays, Protein A-Assays und Immunelektrophorese-Assays usw.). Gemäß einem Aspekt wird die Antikörperbindung dadurch nachgewiesen, dass man ein Label an dem primären Antikörper nachweist. Gemäß einem anderen Aspekt wird der primäre Antikörper dadurch nachgewiesen, dass man das Binden eines sekundären Antikörpers oder eines Reagens an den primären Antikörper nachweist. Gemäß einem weiteren Aspekt ist der sekundäre Antikörper markiert. Es sind auf dem Fachgebiet viele Mittel zum Nachweis der Bin dung in einem Immunoassay bekannt und werden zur Verwendung in Betracht gezogen. Gemäß einer Ausführungsform zum Nachweis der Immunogenität können T-Zell-vermittelte Reaktionen nach Standardverfahren geprüft werden, z.B. in vitro Cytoxität-Assay oder in vivo Assays zur Hypersensitivität vom verzögerten Typ.
Potentiell nützliche Antigene oder Derivate davon zur Verwendung als antigene Moleküle können ebenfalls nach verschiedenen Kriterien identifiziert werden, wie beispielsweise die Beteiligung des Antigens an der Neutralisation der Infektivität eines Pathogens (wenn ge wünscht wird, die Infektion durch ein derartiges Pathogen zu behandeln oder dieser vorzubeugen) (Norrby, 1985, Summary in Vaccines 85, Lerner, et al. (eds.), Cold Spring Harbor Labroatory, Cold Spring Harbor, New York, Seiten 388-389), Typen- oder Gruppenspezifität, die Erkennung durch Antiseren des Patienten oder Immunzellen und/oder die Demonstration von Schutzeffekten von Antiseren oder Immunzellen, die für das Antigen spezifisch sind. Ferner, wenn gewünscht wird, eine von einem Pathogen ausgelöste Erkrankung zu behandeln oder ihr vorzubeugen, sollte das kodierte Epitop des Antigens vorzugsweise eine geringe oder überhaupt keine Antigenvariation über die Zeit oder zwischen unterschiedlichen Isolaten des gleichen Pathogens aufweisen.
Wenn gewünscht wird, Krebs zu behandeln oder Krebs vorzubeugen, werden vorzugsweise bekannte tumorspezifische Antigene oder Fragmente oder Derivate davon verwendet. Beispielsweise schließen derartige tumorspezifische oder tumorassoziierte Antigene, ohne darauf beschränkt zu sein, ein das KS 1/4 Pan-Karzinom-Antigen (Perez and Walker, 1990, J. Immunol. 142:3662-3667; Bumal, 1988, Hybridoma 7(4):407-415); das Ovarialkarzinom-Antigen (CA125)) (Yu, et al., 1991, Cancer Res. 51(2):468-475); das prostatische saure Phosphat (Tailer, et al., 1990, Nucl. Acids Res. 18(16):4928); das Prostata-spezifische Antigen (Henttu und Vihko, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 160(2):903-910; Israeli, et al., 1993, Cancer Res. 53:227-230); das Melanom assoziierte Antigen p97 (Estin, et al., 1989, J. Natl. Cancer Inst. 81(6):445-446); das Melanom-Antigen gp75 (Vijayasardahl, et al., 1990, J. Exp. Med. 171(4):1375-1380); das hochmolekulargewichtige Melanom-Antigen (Natali, et al., 1987, Cancer 59:55-63) und das Prostata-spezifische Membran-Antigen.
Bei einer spezifischen Ausführungsform wird ein Antigen oder Fragment oder Derivat davon, das für einen bestimmten Tumor spezifisch ist, für die Komplexierung mit modifiziertem Hsp und die nachfolgende Verabreichung an einen Patienten, der diesen Tumor hat, ausgewählt.
Wenn beispielsweise gewünscht wird, Viruserkrankungen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, werden Moleküle, die Epitope von bekannten Viren aufweisen, verwendet. Beispielsweise können derartige antigene Epitope von Viren hergestellt werden, die, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen Hepatitis Typ A, Hepatitis Typ B, Hepatitis Typ C, Grippe, Varicella, Adenovirus, Herpes simplex Typ I (H5V-I), Herpes simplex Typ II (HSV-II), Rinderpest, Rhinovirus, ECHO-Virus, Rotavirus, Respiratory-Syncytial-Virus, Papilloma-Virus, Papova-Virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Huntavirus, Coxsackie-Virus, Mumps-Virus, Masern-Virus, Rubella-Virus, Polio-Virus, der humane Immunschwäche-Virus Typ I (HIV-I), und der humane Immunschwäche-Virus Typ II (HIV-II).
Wenn gewünscht wird, bakterielle Infektionen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, werden vorzugsweise Moleküle mit Epitopen von bekannten Bakterien verwendet. Beispielsweise können derartige antigene Epitope hergestellt werden von Bakterien, zu denen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Mycobacteria rickettsia, Mycoplasma, Neisseria und Legionella.
Wenn es gewünscht wird, Protozoeninfektionen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, werden vorzugsweise Moleküle verwendet, die Epitope von bekannten Protozoen aufweisen. Beispielsweise können derartige antigene Epitope hergestellt werden von Protozoen, die einschließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Leishmania, Kokzidioa und Trypanosoma. Wenn gewünscht wird, parasitische Infektionen zu behandeln oder ihnen vorzubeugen, werden vorzugsweise Moleküle mit Epitopen von bekannten Parasiten verwendet. Beispielsweise können derartige antigene Epitope solche von Parasiten sein, zu denen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Chlamydia und Rickettsia gehören.
5.4.2. Peptide aus Hsp-Peptid-Komplexen
Antigene Peptide zur in vitro-Komplexierung mit modifiziertem Hsp gemäß der Erfindung können auch aus endogenen Komplexen von Peptiden und Hsps erhalten werden. Es können zwei Verfahren angewandt werden, um das Peptid aus einem Hsp-Peptid-Komplex zu eluieren. Ein Ansatz beinhaltet die Inkubation des Hsp-Peptid-Komplexes in Gegenwart von ATP. Der andere Ansatz beinhaltet die Inkubation der Komplexe in einem Puffer mit niedrigem pH.
Kurzgefasst wird der Komplex von Interesse durch eine Centricon 10-Anordnung (Millipore) zentrifugiert, um jegliches niedermolekulargewichtiges Material zu entfernen, das locker mit dem Komplex assoziiert ist. Die hochmolekulargewichtige Fraktion kann entfernt werden und mittels SDS-PAGE analysiert werden, während die niedermolekulargewichtige Fraktion mit HPLC analysiert werden kann, wie nachfolgend beschrieben wird. Bei dem ATP-Inkubationsprotokoll wird der Hsp-Peptid-Komplex in der hochmolekulargewichtigen Fraktion mit 10 mM ATP für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Bei dem Niedrig-pH-Protokoll wird Essigsäure oder Trifluoressigsäure (TFA) zu dem Hsp-Peptid-Komplex zugesetzt, um eine Endkonzentration von 10% (Vol/Vol) zu erhalten, und die Mischung wird bei Raumtemperatur oder in einem siedenden Wasserbad oder bei irgendeiner Temperatur dazwischen, und zwar für 10 Minuten (vgl. van Bleek, et al., 1990, Nature 348:213-216; und Li, et al., 1993, EMBO Journal 12:3143-3151) inkubiert.
Die resultierenden Proben werden wie oben erwähnt durch eine Centricon 10-Anordnung zentrifugiert. Die hochmolekulargewichtigen und niedermolekulargewichtigen Fraktionen werden gewonnen. Der restliche hochmolekulargewichtige Hsp-Peptid-Komplex kann wieder mit ATP oder bei niedrigem pH inkubiert werden, um alle restlichen Peptide zu entfernen.
Die resultierenden niedermolekulargewichtigen Fraktionen werden gepoolt, durch Eindampfen konzentriert und in 0,1% TFA aufgelöst. Das aufgelöste Material wird dann durch Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) fraktioniert, wobei man beispielsweise eine VYDAC C18-Umkehrphasensäule verwendet, die mit 0,1% TFA equilibriert ist. Das gebundene Material wird dann bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 0,8 ml/min eluiert, indem man die Säule mit einem linearen Gradienten von 0 bis 80% Acetonitril in 0,1% TFA entwickelt. Die Elution der Peptide kann mittels OD₂₁₀ überwacht werden, und die Fraktionen, die die Peptide enthalten, werden gesammelt.
5.4.3. Peptide aus MHC-Peptid-Komplexen
Peptide, die an MHC-Moleküle gebunden sind, können auch dazu verwendet werden, in vitro mit modifizierten Hsp der vorliegenden Erfindung Komplexe zu bilden. Die Isolation von potentiell immunogenen Peptiden von MHC-Molekülen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt und wird daher hierin nicht in näheren Einzelheiten beschrieben (vgl. Falk, et al., 1990, Nature 348:248-251; Rotzsche, et al., 1990, Nature 348:252-254; Elliott, et al., 1990, Nature 348:191-197; Falk, et al., 1991, Nature 351:290-296; Demotz, et al., 1989, Nature 343:682-684; Rotzsche, et al., 1990, Science 249:283-287), wobei die genannten Beschreibungen durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden.
Kurz gesagt können MHC-Peptid-Komplexe mittels einer konventionellen Immunaffinitätisprozedur isoliert werden. Die Peptide können dann dadurch aus dem MHC-Peptid-Komplex eluiert werden, dass man die Komplexe in Gegenwart von etwa 0,1% TFA in Acetonitril inkubiert. Die eluierten Peptide können wie oben durch Umkehrphasen HPLC fraktioniert und gereinigt werden.
5.4.4. Synthetische Peptide
Die Aminosäure-Sequenzen der Peptide, die von den MHC-Molekülen oder Hsps eluiert werden, können entweder mittels manueller oder automatisierter Aminosäurensequenzierungstechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind, bestimmt werden. Wenn einmal die Aminosäure-Sequenz eines potentiell schützenden Peptids bestimmt wurde, kann das Peptid in irgendeiner gewünschten Menge unter Verwendung herkömmlicher Peptid-Synthesen oder anderer Protokolle, die dem Fachmann gut bekannt sind, synthetisiert werden.
Peptide, die die gleiche Aminosäure-Sequenz aufweisen wie die oben isolierten, können mittels Festphasen-Peptid-Synthese synthetisiert werden unter Anwendung von Arbeitsweisen, die den von Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 beschriebenen ähnlich sind. Während der Synthese werden N-α-geschützte Aminosäuren mit geschützten Seitenketten schrittweise an eine wachsende Polypeptidkette angefügt, die über ihren C-Terminus an einen unlöslichen polymeren Träger gebunden ist, z.B. Polystyrolperlen. Die Peptide werden dadurch synthetisiert, dass man eine Amino-Gruppe einer Aminosäure ohne N-α-Schutzgruppe mit einer α-Carboxylgruppe einer N-α-geschützten Aminosäure verknüpft, die dadurch aktiviert wurde, dass man sie mit einem Reagens wie beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid umsetzte. Das Anfügen einer freien Aminogruppe an die aktivierte Carboxylgruppe führt zur Bildung einer Peptidbindung. Die am häufigsten verwendeten N-α-Schutzgruppen schließen ein Boc, die säurelabil ist, und Fmoc, die basen-labil ist. Einzelheiten zur geeigneten Chemie, den Harzen, den Schutzgruppen, den geschützten Aminosäuren und Reagenzien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden daher darin nicht in Einzelheiten diskutiert (vgl. Atherton, et al., 1989, Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, und Bodanszky, 1993, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 2nd Ed., Springer-Verlag).
Die Reinigung der resultierenden Peptide wird mittels herkömmlicher Arbeitsweisen erreicht, wie beispielsweise mittels präparativer HPLC unter Anwendung der Gel-Permeations-, der Verteilungs- und/oder Ionenaustausch-Chromatographie. Die Auswahl geeigneter Matrizen und Puffer ist dem Fachmann gut bekannt und wird daher hierin nicht detailliert beschrieben.
5.4.5. Genetische Sequenzen, die für Antigene kodieren
Bei einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann eine Nucleotid-Sequenz, die für ein Protein-Antigen oder für Teile davon kodiert, zur Produktion des Antigens in eine Wirtszelle eingeführt werden. Die Nucleotid-Sequenz, die für irgendein antigenes Protein kodiert, kann gewonnen werden und in einem Expressionsvektor zur Expression im Wesentlichen nach den gleichen Verfahren kloniert werden, die für das Klonieren und die Expression einer Hsp-Gen-Sequenz beschrieben wurden. Die Techniken sind beschrieben in den Abschnitten 5.1.-5.1.1. und 5.2-5.2.2. und auf dem Fachgebiet gut bekannt. Das rekombinante antigene Protein oder Teile davon können nach irgendwelchen Verfahren gereinigt werden, die für das Protein geeignet sind, und dann dazu verwendet werden, in vitro-Komplexe mit modifizierten Hsps zu bilden, wie in Abschnitt 5.4.6. beschrieben wird. Ein derartiger Komplex modifiziertes Hsp-Antigen kann als Impfstoff verwendet werden, um eine Immunreaktion gegen das antigene Protein in einer Person zu stimulieren, um Krebs oder eine Infektionserkrankung zu behandeln oder ihnen vorzubeugen.
5.4.6. In vitro-Bildung von Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid
Ein bevorzugtes beispielhaftes Protokoll für das nichtkovalente Komplexieren eines modifizierten Hsp und eines antigenen Moleküls in vitro wird nachfolgend gegeben. Es kann vorteilhaft sein, modifizierte Hsps zu verwenden, die mit Hilfe ihres Peptid-Tags reversibel an eine Festphase gebunden sind, um einen Pufferaustausch, das Waschen und die Isolation der Komplexe vor oder nach der Komplexierungsreaktion zu erleichtern.
Vor der Komplexierung werden die modifizierten Hsps mit ATP oder bei niedrigem pH vorbehandelt, um jegliche Peptide zu entfernen, die mit dem Hsp von Interesse assoziiert sind. Wenn die ATP-Arbeitsweise angewandt wird, wird überschüssiges ATP durch Zugabe von Apyranase aus dem Präparat entfernt, wie beschrieben wird von Levy et al., 1991, Cell 67:265-274. Wenn die Nieder-pH-Arbeitsweise angewandt wird, wird der Puffer durch Zugabe von pH-modifizierenden Reagentien wieder auf neutralen pH eingestellt.
Die antigenen Moleküle (1 μg) und das vorbehandelte modifizierte Hsp (9 μg) werden vermischt, um ein Mol-Verhältnis von etwa 5 antigenes Molekül: 1 Hsp zu erhalten. Danach wird die Mischung 15 Minuten bis 3 Stunden bei 4 °C bis 45 °C in einem geeigneten Bindepuffer inkubiert, beispielsweise in einem, der 20 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 350 mM NaCl, 3 mM MgCl₂ und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) enthält. Die Präparationen werden durch eine Centricon 10-Anordnung (Millipore) zentrifugiert, um jegliche ungebundene Peptide zu entfernen. Wenn das modifizierte Hsp an eine Festphase gebunden ist, können die gebildeten Komplexe aus modifiziertem Hsp und Peptid von ungebundenem Peptid freigewaschen werden, bevor man den Komplex aus modifiziertem Hsp-Peptid von der Festphase eluiert. Die Assoziation der Peptide mit dem modifizierten Hsp kann mittels SDS-PAGE verfolgt werden. Das ist das bevorzugte Verfahren für die in vitro-Komplexbildung von Peptiden, die aus MHC-Peptid-Komplexen erhalten wurden, oder von Peptiden, die durch die Dissoziation aus endogenen Hsp-Peptid-Komplexen erhalten wurden.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung, die bevorzugt ist für Komplexe aus modifiziertem hsp70 mit exogenen antigenen Molekülen wie Proteinen, werden 5 bis 10 μg gereinigtes Hsp mit äquimolaren Mengen des antigenen Moleküls in 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 3 mM MgCl₂ und 1 mM ADP in einem Volumen von 100 μl bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert. Diese Inkubationsmischung wird auf 1 ml in Phosphat-gepufferter Salzlösung verdünnt.
Bei einer anderen alternativen Ausführungsform der Erfindung, die für die Herstellung von Komplexen von modifiziertem gp96 mit Peptiden bevorzugt ist, werden 5-10 μg modifiziertes gp96, das mittels eines Affinität-Tags an eine Festphase immobilisiert ist, mit äquimolaren oder überschüssigen Mengen des antigenen Peptids in einem geeigneten Puffer inkubiert, beispielsweise einem, der 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, 0,5 M NaCl, 3 nM MgCl2 enthält, und zwar bei etwa 50 °C für etwa 10 Minuten. Beispielsweise können modifiziertes gp96, das den Ig-Tag enthält, für diese Prozedur an Protein A-Sepharose immobilisiert werden. Diese Inkubationsmischung wird dann weitere etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Festphase mit den gebundenen modifizierten Hsp-Peptid-Komplexen wird mehrfach gewaschen, um alles ungebundene Peptid zu entfernen. Die Komplexe modifiziertes Hsp-Peptid werden dann nach der geeigneten Technik von der Festphase eluiert.
Im Anschluss an die Komplexbildung können die immunogenen Hsp-Antigen-Molekül-Komplexe ggf. in vitro untersucht werden, unter Verwendung beispielsweise des gemischten Lymphocyten-Target-Zell-Assays (MLTC), der nachfolgend beschrieben wird. Wenn einmal immunogene Komplexe isoliert wurden, können sie ggf. in Tiermodellen weiter charakterisiert werden, und zwar unter Verwendung der bevorzugten Verabreichungsprotokolle und Hilfsstoffe, die nachfolgend diskutiert werden.
5.5. Bestimmung der Immunogenität von Hsp-Peptid-Komplexen
Bei einer fakulativen Arbeitsweise können die gereinigten Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid auf ihre Immunogenität untersucht werden unter Anwendung des Misch- Lymphocyten-Target-Kultur-Assays (MLTC), der dem Fachmann gut bekannt ist.
Als Beispiel, jedoch nicht als Einschränkung, kann die folgende Prozedur zur Anwendung kommen. Kurz gesagt werden Mäusen die Kandidatenkomplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid subkutan indiziert. Anderen Mäusen werden entweder andere Hsp-Peptid-Komplexe aus normalen, nicht-rekombinanten Zellen inkubiert oder ganze infizierte Zellen, die als positive Kontrollen für den Assay dienen. Die Mäuse werden zweimal gespritzt, und zwar 7-10 Tage getrennt. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung werden die Milzen entfernt, und die Lymphocyten freigesetzt. Die freigesetzten Lymphocyten können anschließend in vitro durch Zugabe von toten Zellen, die den Komplex von Interesse exprimierten, restimuliert werden.
Beispielsweise können 8 × 10⁶ Immun-Milzzellen mit 4 × 10⁴ Mitomycin C behandelten oder γ-bestrahlten (5-10.000 Rads) pathogen-infizierten Zellen stimuliert werden (oder mit Zellen, die mit einem Gen transfiziert wurden, das für ein Antigen des infektiösen Mittels kodiert, ja nachdem), oder mit Tumorzellen in 3 ml RPMI-Medium, das 10% fötales Kälberserum enthält. In bestimmten Fällen können 33% eines sekundären vermischten Lymphocytenkulturüberstands oder Interleukin 2 (IL-2) in das Kulturmedium als Quelle für die T-Zelle-Wachstumsfaktoren gegeben werden (vgl. Glasebrook et al., 1980, J. Exp. Med. 151:876). Um die primäre cytotoxische T-Zell-Reaktion nach der Immunisierung zu testen, können Milzzellen ohne Stimulierung kultiviert werden. Bei gewissen Versuchen können Milzzellen der immunisierten Mäuse auch mit antigen unterschiedlichen Zellen restimuliert werden, um die Spezifität der cytotoxischen T-Zell-Reaktion zu bestimmen.
Sechs Tage später werden die Kulturen in einem 4 Stunden ⁵¹Cr-Freisetzungs-Assay auf Cytotoxizität getestet (vgl. Palladino et al, 1987, Cancer Res. 47:5074-5079 und Blachere, et al., 1993, J. Immunotherapy 14:352-356). Bei diesem Assay wird die Misch-Lymphocytenkultur einer Zielzel lensuspension zugesetzt, um unterschiedliche Effektor:Target (E:T)-Verhältnisse zu erhalten (üblicherweise 1:1 bis 40:1). Die Target-Zellen sind vormarkiert durch Inkubieren von 1 × 10⁶-Zielzellen in einem Kulturmedium, das 200 mCi ⁵¹Cr/ml enthält, und zwar für eine Stunde bei 37 °C. Die Zellen werden im Anschluss an die Markierung dreimal gewaschen. Jeder Assaypunkt (E:T-Verhältnis) wird dreifach durchgeführt, und geeignete Kontrollen sind eingeschlossen, um die spontane ⁵¹Cr-Freisetzung (dem Assay werden keine Lymphocyten zugesetzt) und die 100 %ige Freisetzung (Zell-Lyse mit einem Detergens) zu messen. Nach Inkubation der Zellmischungen für 4 Stunden werden die Zellen durch Zentrifugieren bei 200 g für 5 Minuten pelletiert. Die Menge des in den Überstand freigesetzten ⁵¹Cr wird mittels eines Gamma-Counters gemessen. Die prozentuale Cytotoxizität wird gemessen als cpm in der Testprobe minus spontan freigesetztem cpm, geteilt durch die gesamten Detergens freigesetzten cpm minus spontan freigesetzte cpm.
Um die MHC-Klasse I-Kaskade zu blockieren, wird ein konzentrierter Hybridoma-Überstand, der von K-44-Hybridom-Zellen erhalten wurde (ein anti-MHC-Klasse I Hybridom) zu den Testproben bis zu einer Endkonzentration von 12,5% zugesetzt (Heike et al., 1994, J. Immunotherapy 15:165-174).
Eine Alternative zu dem Chrom-Freisetzungs-Assay ist der ELISPOT-Assay, der die Cytokin-Freisetzung durch cytotoxische T-Zellen in vitro nach Stimulation mit einem spezifischen Antigen mißt. Die Cytokin-Freisetzung wird nachgewiesen mit Antikörpern, die spezifisch für ein spezielles Cytokin sind, wie beispielsweise Interleukin-2, Tumor Necrose-Faktor α oder Interferon-γ (beispielsweise, vgl. Scheibenbogen et al., 1997, Int. J. Cancer, 71:932-936). Der Assay wird in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, die mit einem Antikörper vorbeschichtet wurde, der für ein Cytokin von Interesse spezifisch ist, der das von den T-Zellen sekretierte Cytokin einfängt. Nach der Inkubation von T-Zellen für 24-48 Stunden in den beschichteten Vertiefungen werden die cytotoxischen T-Zellen entfernt und durch einen zweiten markierten Antikörper ersetzt, der ein anderes Epitop des Cytokins erkennt. Nach einem extensiven Waschen zur Entfernung von ungebundenem Antikörper wird der Platte ein Enzymsubstrat zugesetzt, das ein gefärbtes Reaktionsprodukt bildet. Die Zahl Cytokin-produzierender Zellen wird unter einem Mikroskop gezählt. Dieses Verfahren weist die Vorteile einer kurzen Assay-Zeit und der Empfindlichkeit auf, ohne dass eine große Zahl von cytotoxischen T-Zellen benötigt wird.
5.6. Formulierung
Nicht-kovalente Komplexe aus modifizierten Hsp und antigenen Proteinen oder Peptiden, die nach den erfindungsgemäßen Verfahren gereinigt wurden, können zu pharmazeutischen Zubereitungen für die Verabreichung an Säugetiere zur Behandlung oder Prävention von Krebs oder Infektionserkrankungen formuliert werden. Die Arzneimittellöslichkeit und der Ort der Absorption sind Faktoren, die zu berücksichtigen sind, wenn man den Verabreichungsweg eines therapeutischen Mittels wählt. Komplexe aus modifizierten Hsp-antigenem Molekül gemäß der Erfindung können auf irgendeinem gewünschten Verabreichungsweg verabreicht werden, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, subkutan, intravenös oder intramuskulär, obwohl intradermal oder mukosal bevorzugt wird. Vorteile der intradermalen oder mukosalen Verabreichung umfassen die Verwendung von niedrigeren Dosen bzw. einer raschen Absorption. Mukosale Verabreichungswege schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, eine orale, rektale und nasale Verabreichung. Verabreichungen für mukosale Verabreichungen sind in verschiedenen Formulierungen geeignet, wie nachfolgend beschrieben wird. Der Verabreichungsweg kann während einer Behandlung variiert werden. Bevorzugte Dosierungen, Verabreichungswege und therapeutische Behandlungsprotokolle für Komplexe aus Peptiden und natürlich auftretenden Hsps werden beschrieben in den internationalen PCT-Patentanmeldungen, die als WO 96/10411 und WO 97/10001 veröffentlicht wurden, die durch Bezugnahme in ihrem gesamten Umfang hierin inkorporiert werden.
Gemäß bevorzugter Aspekte wird eine Menge an Komplex aus modifiziertem gp96 und Peptid an einen Menschen verabreicht, die im Bereich von etwa 10 bis 600 μg, vorzugsweise 10 bis 100 μg, besonders bevorzugt bei etwa 25 μg, liegt, und zwar einmal wöchentlich für etwa 4-6 Wochen, und intradermal, wobei die Verabreichungsstelle nacheinander variiert wird.
Zusammensetzungen, die nicht-kovalente Komplexe formuliert in einem kompatiblen, pharmazeutischen Träger aufweisen, können hergestellt, verpackt und etikettiert werden für die Behandlung des angegebenen Tumors, beispielsweise von humanen Sarkomen und Karzinomen, z.B. Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenem Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synovialom, Mesotheliom, Ewing Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Dickdarmkarzinom, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweissdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papillärem Karzinom, papillärem Adenokarzinom, Cystadenocarcinoma, medullärem Karzinom, bronchogenem Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallenleiterkarzinom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilms'Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelialkarzinom, Gliom, Astrocytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustischem Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom; Leukämien, z.B. akuter lymphocytischer Leukämie und akuter myelocytischer Leukämie (myeloplastischer, promyelocytischer, myelomonocytischer, monocytischer und Erythroleukämie); chronische Leukämie (chronische myelocytische (granulocytische) Leukämie und chronische lymphocytische Leukämie); und Polycythemia vera, Lymphom, (Hodgkin's Krankheit und Nicht-Hodgkin's Krankheit), multiplem Myelom, Waldenström Makroglobulinämie und Schwerkettenerkrankung usw. Wenn der Komplex wasserlöslich ist, dann kann er in einem geeigneten Puffer formuliert werden, beispielsweise einer Phosphat-gepufferten Salzlösung oder einer anderen physiologisch kompatiblen Lösung.
Alternativ, wenn der resultierende Komplex in wässrigen Lösemitteln eine schlechte Löslichkeit aufweist, kann er mit einem nicht-ionischen Tensid wie beispielsweise Tween oder Polyethylenglycol formuliert werden. Somit können die nichtkovalenten Komplexe und ihre physiologisch annehmbaren Solvate für die Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) verabreicht werden oder für die orale, bukkale, parenterale, rektale Verabreichung oder, im Falle von Tumoren, durch direkte Injektion in einen festen Tumor.
Für die orale Verabreichung kann die pharmazeutische Zusammensetzung in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise als Lösungen, Sirups oder Suspensionen oder sie kann als ein Arzneimittelprodukt für eine Rekonstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Derartige flüssige Präparationen können auf herkömmliche weise mit pharmazeutisch annehmbaren Zusätzen hergestellt werden, wie beispielsweise Suspendiermitteln (z.B. Sorbitsirup, Cellulose-Derivaten oder hydrierten genießbaren Fetten); Emulgierungsmitteln (z.B. Lecithin oder Acacia); nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, öligen Estern oder fraktionierten Pflanzenölen); und Konservierungsstoffen (z.B. Methyl- oder Propyl-p-Hydroxybenzoaten oder Sorbinsäure). Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können beispielsweise die Form von Tabletten oder Kapseln aufweisen, die auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoffen wie Bindemitteln (z.B. vorverkleisterter Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z.B. Lactose, mikrocrystalline Cellulose oder Calcium-Hydrogenphosphat); Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talk oder Kieselsäure); Zerfallshilfsmitteln (z.B. Kartoffelstärke oder Natrium-Stärkeglycolat); oder Netzmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) herge stellt werden. Die Tabletten können nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, überzogen sein.
Präparate für die orale Verabreichung können auf geeignete Weise so formuliert werden, dass sie eine kontrollierte Freisetzung der Komplexe liefern. Derartige Zusammensetzungen können die Form von Tabletten oder Pastillen aufweisen, die auf herkömmliche Weise formuliert wurden.
Zur Verabreichung durch Inhalation können die Komplexe in geeigneter Weise in Form einer Aerosol-Spray-Darreichung aus Druckverpackungen oder mit einem Vernebler bereitgestellt werden, unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas. Im Falle eines komprimierten Aerosols kann die Dosierungseinheit dadurch bestimmt werden, indem man ein Ventil zur Abgabe einer gemessenen Menge zur Verfügung stellt. Kapseln und Patronen aus beispielsweise Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können formuliert werden, die eine Pulvermischung aus den Komplexen und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder Stärke enthalten.
Die Komplexe können für eine parenterale Verabreichung durch Injektion formuliert werden, beispielweise durch Bolus-Injektion oder kontinuierliche Infusion. Formulierungen für die Injektion können in Einheitsdosenform angeboten werden, z.B. in Ampullen oder in Mehrdosenbehälter, mit einem zugesetzten Konservierungsmittel. Die Zusammensetzungen können beispielsweise Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern aufweisen, und können Formulierungsmittel wie Suspendier-, Stabilisier- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der aktive Wirkstoff in Pulverform zur Rekonstituierung mit einem geeigneten Träger, z.B. sterilem pyrogen-freiem Wasser, vor der Verwendung vorliegen.
Die Komplexe können auch in rektalen Zusammensetzungen wie Suppositorien oder Retentionsklistieren formuliert wer den, die beispielsweise herkömmliche Suppositorienbasen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
Zusätzlich zu den vorausgehend beschriebenen Formulierungen können die Komplexe als auch Depot-Präparate formuliert werden. Derartige langwirkende Formulierungen können durch Implantation (beispielsweise subkutan oder intromuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Somit können die Komplexe beispielsweise mit geeigneten Polymeren oder hydrophoben Materialien formuliert werden (beispielsweise als Emulsion in einem annehmbaren Öl) oder mit Ionenaustauscherharzen oder als schwach-lösliche Derivate, beispielsweise als ein schwach-lösliches Salz. Liposomen und Emulsionen sind gut bekannte Beispiele für Verabreichungsvehikel oder Träger für hydrophile Arzneimittel.
Die Komplexe können gewünschtenfalls in einer Packung oder in einer Abgabevorrichtung angeboten werden, die eine oder mehrere Einheitsdosenformen, die die nicht-kovalenten Komplexe enthalten, enthalten können. Die Verpackung kann beispielsweise eine Metall- oder Kunststofffolie, wie beispielsweise eine Blister-Packung enthalten. Die Verpackung oder die Abgabevorrichtung kann mit Gebrauchsanweisungen versehen sein.
Die Erfindung stellt auch Kits zur Durchführung der therapeutischen Behandlungsprotokolle der Erfindung bereit. Derartige Kits umfassen in einem oder mehreren Behältern therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Mengen der nichtkovalenten Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid in einer pharmazeutisch annehmbaren Form. Die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid in einer Ampulle eines erfindungsgemäßen Kits können in Form einer pharmazeutisch annehmbaren Lösung vorliegen, z.B. in Kombination mit einer sterilen Salzlösung, einer Dextrose-Lösung oder einer gepufferten Lösung oder einer anderen pharmazeutisch annehmbaren sterilen Flüssigkeit. Alternativ kann der Komplex lyophilisiert oder getrocknet sein; in diesem Falle umfasst der Kit ggf. in einem Behälter eine pharmazeutisch annehmbare Lösung (z.B. Salzlösung, Dextrose-Lösung usw.), und zwar vorzugsweise steril, um den Komplex unter Bildung einer Lösung für Injektionszwecke zu rekonstituieren.
Bei einer anderen Ausführungsform umfasst ein Kit der vorliegenden Erfindung eine Nadel oder Spritze, die vorzugsweise in steriler Form verpackt sind, zur Injizierung des Komplexes und/oder einen verpackten Alkohol-Bausch. Gegebenenfalls sind Anweisungen für die Verabreichung der Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid durch einen Arzt oder durch den Patienten beigefügt.
5.7. Prävention und Behandlung von Krebs
Es gibt viele Gründe, warum eine Immuntherapie, wie sie durch die nicht-kovalenten Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid oder durch rekombinante Zellen, die modifizierte Hsp exprimieren, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, für eine Verwendung bei Krebspatienten wünschenswert ist. Erstens kann, wenn die Krebspatienten immunsupprimiert sind und ein chirurgischer Eingriff mit Anästhesie und eine nachfolgende Chemotherapie die Immunsuppression verschlechtern kann, mit einer geeigneten Immuntherapie im präoperativen Zeitraum diese Immunsuppression verhindert oder rückgängig gemacht werden. Das könnte zu weniger infektiösen Komplikationen führen und die Wundheilung beschleunigen. Außerdem ist im Anschluß an einen chirurgischen Eingriff die Tumormasse minimal, und in dieser Situation ist eine Immuntherapie höchstwahrscheinlich wirksam. Ein dritter Grund liegt in der Möglichkeit, dass die Tumorzellen während des chirurgischen Eingriffs in die Blutbahn abgegeben werden, und eine wirksame Immuntherapie, die zu diesem Zeitpunkt angewandt werden kann, kann diese Zellen eliminieren.
Bei einer spezifischen Ausführungsform richtet sich die präventive und therapeutische Nützlichkeit der Erfindung auf die Erhöhung der Immunkompetenz des Krebspatienten entweder vor einem chirurgischen Eingriff, oder nach einem chirurgischen Eingriff, und auf die Induzierung einer tumorspezifischen Immunität gegenüber Krebszellen, wobei das Ziel die Inhibierung von Krebs ist, und wobei das ultimative klinische Ziel eine totale Krebsregression und Vernichtung ist.
Gemäß der Erfindung umfassen bevorzugte Verfahren zur Behandlung oder Prävention von Krebs die Isolation von Krebszellen aus einem oder mehreren Individuen, vorzugsweise aus dem Individuum, das die Behandlung benötigt, und die Einführung von exprimierbaren modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen in derartige Zellen, vorzugsweise als Expressions-Genkonstrukt. Die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz wird nach den Verfahren manipuliert, die oben in Abschnitt 5.1. beschrieben wurden, so dass die modifizierte Hsp-Gen-Sequenz, in Form eines Expressionskonstruktus oder intrachromosomalintegriert, geeignet ist zur Expression des modifizierten Hsp in den rekombinanten Zellen. Die rekombinanten Zellen, die die Expressions-Gen-Konstrukte enthalten, werden unter Bedingungen kultiviert, dass die modifizierten Hsp, für die das Expressions-Gen-Konstrukt kodiert, von den rekombinanten Wirtszellen exprimiert werden. Die Komplexe aus modifizierten Hitzeschockproteinen, die nicht-kovalent mit Peptiden der Krebszelle assoziiert sind, werden sekretiert und vorzugsweise nach den Verfahren aus dem Kulturmedium gereinigt, die in Abschnitt 5.2. beschrieben wurden. In Abhängigkeit vom Verabreichungsweg werden die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid entsprechend formuliert, wie in Abschnitt 5.4. beschrieben ist, und der Person autolog verabreicht (z.B., um den primären Krebs oder Metastasen davon zu behandeln) oder auch an andere Personen, die eine Behandlung von Krebs eines ähnlichen Gewebetyps benötigen, oder Personen, bei denen ein erhöhtes Krebsrisiko aufgrund der Familiengeschichte oder aufgrund von Umwelt-Risikofaktoren besteht. Beispielhafte Verfahren für therapeutische und prophylaktische Verwendungen von Hsp-Peptid-Komplexen wurden auch beschrieben in den PCT-Veröffentlichungen WO 96/10411, mit Datum vom 11. April 1996, und WO 97/10001, mit Datum vom 20. März 1997.
Beispielsweise kann eine Behandlung mit Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid, die wie oben hergestellt wurden, zu jedem beliebigen Zeitpunkt nach dem chirurgischen Eingriff beginnen. Wenn der Patient jedoch eine Chemotherapie erhalten hat, werden Hsp-Antigen-Komplexe üblicherweise nach einem Intervall von vier Wochen oder mehr verabreicht, damit sich das Immunsystem erholen kann. Das therapeutische Behandlungsprotokoll kann wöchentliche Injektionen des Komplexes aus modifiziertem Hsp-Antigen, gelöst in einer Salzlösung oder einer anderen physiologisch kompatiblen Lösung, beinhalten. Der Weg und der Ort der Injektion wird jedesmal variiert, und beispielsweise wird die erste Injektion subkutan am linken Arm verabreicht, die zweite Injektion am rechten Arm, die dritte Injektion im linken Bauchbereich, die vierte Injektion im rechten Bauchbereich, die fünfte Injektion an der linken Hüfte, die sechste Injektion an der rechten Hüfte usw. Der gleiche Ort wird nach einer Unterbrechung durch eine oder mehrere Injektionen wiederum genutzt. Zusätzlich werden Injektionen aufgeteilt, und jede Hälfte der Dosis wird am gleichen Tag an einem anderen Ort verabreicht. Insgesamt werden die ersten vier bis sechs Injektionen in wöchentlichen Intervallen verabreicht. Anschließend werden zwei Injektionen in zwei-wöchigen Intervallen verabreicht, gefolgt von einem Behandlungsprotokoll von Injektionen in monatlichen Intervallen.
Alternativ könnnen rekombinante Tumorzellen, die die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptiden sekretieren, als Impfstoffinjektion in einen Patienten verwendet werden, um eine Immunreaktion gegen die Tumorzellen oder Zellen, die Tumorantigene aufweisen, zu stimulieren. Autologe rekombinante Tumorzellen, die Komplexe aus modifizierten Hsp-Peptiden stabil exprimieren und sekretieren sind bevorzugt. Um die geeignete Dosis zu bestimmen, wird die Menge an Komplex aus modifiziertem Hsp-Peptid, die von den rekombinanten Zellen sekretiert wird, quantifiziert, und die Zahl an rekombinanten Zellen, die für die Impfung verwendet wird, wird entsprechend eingestellt, um ein konsistentes Sekretionsniveau in vivo sicherzustellen. Eine bevorzugte Dosis ist diejenige Zahl von rekombinanten Zellen, die etwa 100 ng modifiziertes gp96 pro 24 Stunden sekretieren kann. Für die Sicherheit des Patienten können ihre rekombinanten Tumorzellen unmittelbar vor der Injektion in einen Patienten bestrahlt werden (12.000 rad). Bestrahlte Zellen vermehren sich nicht und können die Sekretion von Komplexen aus modifiziertem Peptid für etwa 7-10 Tage fortsetzen, was ausreicht, um eine Immunreaktion auszulösen.
Krebsarten, die unter Verwendung der nicht-kovalenten Hsp-Peptid-Komplexe, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, behandelt werden können, oder denen vorgebeugt werden kann, schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, humane Sarkome und Karzinome ein, z.B. Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synovialom, Mesotheliom, Ewing Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Colonkarzinom, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Schuppenzellkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweissdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläre Adenokarzinome, Cystadenocarcinom, medulläres Karzinom, bronchogenes Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallenleiterkarzinom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilms Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrocytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustisches Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom; Leukämien, z.B. akute lymphocytische Leukämie und akute myelocytische Leukämie (myeloblastisch, promyelocytisch, myelomonocytisch, monocytisch und Erythroleukämie); chronische Leukämie (chronische myelocytische (granulocytische) Leukämie und chronische lymphocytische Leukämie); und Polycythemia vera, Lymphom (Hodgkins-Krankheit und Nicht-Hodgkins-Krankheit), multiples Myelom, Waldenströms-Makroglobulinämie und Schwerkettenkrankheit. Spezifische Beispiele für derartige Krebsarten werden in den nachfolgen Abschnitten beschrieben.
Bei einer spezifischen Ausführungsform ist der Krebs metastatisch. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der Patient, der an Krebs leidet, immunsupprimiert, weil er einer anti-Krebstherapie (z.B. Chemotherapie, Bestrahlung) unterzogen wurde, bevor die Hsp-Peptid-Molekül-Komplexe der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform ist der Krebs ein Tumor.
Die Wirkung der Immuntherapie mit Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid auf den Fortschritt von neoplastischen Erkrankungen kann nach irgendeinem Verfahren überwacht werden, die der Fachmann kennt, wozu, ohne darauf beschränkt zu sein, gehören die Messung: a) einer verzögerten Hypersensivität als Bewertung der zellulären Immunität; b) die Aktivität von cytolytischen T-Lymphocyten in vitro; c) die Spiegel tumorspezifischer Antigene, z.B. von carcinoembryonischen (CEA) Antigenen; d) Veränderungen der Morphologie von Tumoren unter Anwendungen von Techniken wie Computertomographie (CT)-Scannen; e) Veränderungen der Spiegel von anerkannten Risikomarkern für einen speziellen Krebs bei Hochrisikopatienten, und f) Veränderungen der Tumormorphologie unter Verwendung eines Sonogramms. Andere Techniken, die ebenfalls zur Anwendung kommen können, schließen ein die Szintographie und die Endoskopie.
Die präventive Wirkung einer Immuntherapie unter Verwendung von Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid kann ebenfalls dadurch abgeschätzt werden, dass man die Spiegel eines anerkannten Risikobiomarkers schätzt, dass man die Spiegel eines anerkannten Risikobiomarkers für einen spezifischen Krebs bestimmt. Beispielsweise wird bei Personen mit einem erhöhten Risiko auf Prostatakrebs das Serum-Prostataspezifische Antigen (PSA) nach dem Verfahren gemessen, das beschrieben wird von Brawer et al., 1992, J. Urol. 147:841-845; und Catalona et al., 1993, JAMA 270:948-958; oder bei Risikopersonen für einen colorektalen Krebs wird CEA nach dem Fachmann bekannten Verfahren gemessen; und bei Personen mit einem erhöhten Risiko für Brustkrebs wird die 16-α- Hydroxylierung von Östradiol nach dem Verfahren gemessen, das beschrieben wird von Schneider et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3047-3051. Die oben beschriebenen Literaturreferenzen werden durch Bezugnahme vollständig hierin aufgenommen.
5.8. Prävention und Behandlung von Infektionserkrankungen
Es wurde entdeckt, dass die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid gemäß der Erfindung aus Zellen hergestellt werden können, die mit einem intrazellulären Pathogen infiziert sind, sowie Zellen, die durch ein intrazelluläres Pathogen transformiert wurden. Beispielsweise können immunogene Hsp-Peptid-Komplexe aus eukaryontischen Zellen isoliert werden, die mit einem transformierenden Virus, wie beispielsweise SV40, transformiert wurden.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt der Erfindung können die Impfstoffe aus gereinigtem modifiziertem Hsp-Peptid eine besondere Nützlichkeit bei der Behandlung von menschlichen Erkrankungen aufweisen, die durch intrazelluläre Pathogene ausgelöst werden. Es versteht sich jedoch, dass die Impfstoffe, die unter Anwendung der hierin beschriebenen Prinzipien entwickelt wurden, auch für die Behandlung von Erkrankungen von anderen Säugetieren nützlich sind, beispielsweise von landwirtschaftliche Tieren wie Rindern, Pferden, Schafen, Ziegen und Schweinen, sowie Haustieren einschließlich Katzen und Hunden, die in ähnlicher Weise durch intrazelluläre Pathogene ausgelöst werden.
Gemäß den hierin beschriebenen Verfahren können Impfstoffe hergetellt werden, die eine Immunreaktion, insbesondere eine cytotoxische T-Zell-Reaktion, gegen Zellen stimulieren, die mit Viren infiziert sind, die, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen Hepatitis Typ A, Hepatitis Typ B, Hepatitis Typ C, Influenza, Varicella, Adenovirus, HSV-I, HSV-II, Rinderpest, Rhinovirus, ECHO-Virus, Rotavirus, respiratorischen Syncytial-Virus, Papilloma-Virus, Papova-Virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Huntavirus, Coxsackie-Virus, Mumps-Virus, Masern-Virus, Rubella-Virus, Polio-Virus, HIV-I und HIV-II. In ähnlicher Weise können auch Impfstoffe hergestellt werden, die eine cytotoxische T-Zell-Reaktion gegen Zellen stimulieren, die mit intrazellulären Bakterien infiziert sind, zu denen, ohne darauf beschränkt zu sein, gehören Mycobacteria, Rickettsia, Mycoplasma, Neisseria und Legionella. Zusätzlich können auch Impfstoffe hergestellt werden, die eine cytotoxische T-Zell-Reaktion gegen Zellen stimulieren, die mit intrazellulären Protozoen infiziert sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Leishmania, Kokzidioa und Trypanosoma. Darüber hinaus können Impfstoffe hergestellt werden, die cytotoxische T-Zell-Reaktionen gegen Zellen stimulieren, die mit intrazellulären Parasiten infiziert sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, Chlamydia und Rickettsia.
Wie der Fachmann versteht, können die hierin beschriebenen Protokolle verwendet werden, Hsp-Peptid-Komplexe aus irgendeiner Zelle zu isolieren, die genetisch manipuliert wurde, um ein modifiziertes Hsp zu exprimieren, beispielsweise Gewebe, isolierte Zellen und immortalisierte eukaryontische Zellen, die mit einem intrazellulären Pathogen infiziert sind. Wenn immortalisierte tierische Zelllinien als Quelle für die Komplexe aus modifizierten Hsp-Peptid verwendet werden, ist es wichtig, Zelllinien zu verwenden, die mit dem Pathogen von Interesse infiziert werden können. Es ist ferner bevorzugt, Zellen zu verwenden, die von der gleichen Spezies erhalten wurden, wie der beabsichtigte Empfänger des Impfstoffs. Techniken zur Einführung einer exprimierbaren Form der modifizierten Hsp-Gen-Sequenzen in diesen Zelllinien wurden oben in Abschnitt 5.2.2. beschrieben.
Wenn zu erwarten ist, dass ein Pathogen eine Lyse der Wirtszellen bewirkt, ist es bevorzugt, die exprimierbare modifizierte Hsp-Gen-Sequenz in die Wirtszelle einzuführen, bevor die Zelle mit dem Pathogen infiziert wird. Um beispielsweise einen Hsp-Peptid-Komplex zur Verabreichung an Menschen herzustellen, der gegen HIV-I wirksam sein kann, kann das Virus in Humanzellen vermehrt werden, die, ohne darauf beschränkt zu sein, einschließen humane CD4+-T-Zellen, HepG2-Zellen und U937 promonocytische Zellen, die bereits mit einer exprimierbaren Hsp-Gen-Sequenz transfiziert wurden. Beispielsweise können Influenza-Viren in beispielsweise transfizierten humanen Fibroblasten-Zelllinien und MDCKL-Zellen vermehrt werden, und Mycobakterien können beispielsweise in transfizierten humanen Schwaan-Zellen kultiviert werden.
Der Zellüberstand, der den sekretierten Komplex aus modifiziertem Hsp-Peptid enthält, kann direkt vor der Lyse der Wirtszelle gesammelt werden.
Bei einer anderen Ausführungsform kann, wenn das Gen, das für eine spezielle antigene Determinante eines Pathogens identifiziert wurde, das Gen, das für das Antigen kodiert, in einer humanen oder Säugetier-Zelllinie gemeinsam mit einer modifizierten Hsp-Gen-Sequenz transfiziert und coexprimiert werden, und zwar unter Anwendungen von Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind. Derartige rekombinante antigene Zellen, die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid sekretieren, können als Impfstoff für die Injektion in einen Patienten verwendet werden, um eine Immunreaktion gegen die infizierten Zellen oder Zellen, die das Antigen aufweisen, zu stimulieren. Autologe rekombinante antigene Zellen, die Komplexe aus modifiziertem Hsp-Peptid stabil exprimieren und sekretieren, sind bevorzugt.
Der Wirkung einer Immuntherapie mit Komplexen aus modifiziertem Hsp-Peptid auf den Fortschritt von Infektionserkrankungen kann nach irgendwelchen Verfahren überwacht werden, die einem Fachmann bekannt sind.
6. BEISPIEL: Produktion von modifiziertem gp96-Ig in Säugetierzellen
Ein modifiziertes Hsp, gp96-Ig, wurde durch Konstruktionen einer Nucleotid-Sequenz produziert, die für ein chimäres Protein kodierte, das ein gp96 ohne das Retentions-Peptid (KDEL) und die konstanten Abschnitte von murinen IgG1 umfasste, durch Klonieren der modifizierten gp96-Gen-Sequenz in einem Expressionskonstrukt und Transfizieren des Expressions-Genkonstrukts in einer Vielzahl von Säugetierzellen. Verfahren zur Konstruktion der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz zur Herstellung der rekombinanten Zellen und zur Reinigung des modifizierten gp96 werden in den folgenden Abschnitten beschrieben:
6.1. Konstruktion einer modifizierten gp96-Ig-Gen-Sequenz
Der kodierende Abschnitt von humanem gp96 ist 2.412 Basen lang, und er kodiert für ein Signal-Peptid am Amino-Terminus (21 Aminosäurereste), einen potentiellen Transmembranabschnitt, der reich an hydrophoben Resten ist, und die Peptid-Sequenz für die Retention im endoplasmatischen Retikulum (ER) (KDEL) am Carboxy-Terminus. Das Protein wies 804 Aminosäuren auf sowie ein geschätztes Molekulargewicht von etwa 96 KD. Dieser kodierende Abschnitt wurde ohne die Sequenz, die für das KDEL-Tetrapeptid kodierte, vervielfacht, während eine Sequenz, die für die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen von murinen IgG1 kodierte, eingeschlossen wurde. Der Tag auf Immunglobulin-Basis erleichtert den Nachweis durch ELISA, die Reinigung durch eine Affinitätschromatographie an einer Protein A-Sepharose-Säule und die Analyse mittels fluoreszenzaktivierter Zell-Sortier-Analyse. Eine sekretorische Form eines modifizierten gp96 wird von Zellen produziert, die mit der modifizierten Hsp-Gen-Sequenz transfiziert wurden, und das modifizierte gp96 enthält gebundene Peptide.
Um eine modifizierte gp96-Gen-Sequenz zu konstruieren, wurde eine Gesamt-RNA mit einer sauren Isothiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion aus Jurkat-Zellen (einer Humanzelllinie) extrahiert. Eine doppelsträngige cDNA wurde auf der Basis der RNA unter Verwendung des GeneAmp RNA PCR Kits (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) hergestellt, und der kodierende Abschnitt von humanem gp96 wurde mittels PCR vervielfältigt, indem Pwo- und Taq-Polymerase des Expand^TM Long Template PCR-Systems verwendet wurden (Boehringer Mann heim, Indianapolis, IN). Die PCR-Zyklierbedingungen waren: Denaturierung von Templat-DNA bei 94 °C für 2 min; dann 10 Zyklen bei 94 °C für 10 s, bei 55 °C für 30 s und bei 68 °C für 2 min; und dann 25 Zyklen bei 94 °C für 10s, bei 55 °C für 30 s und bei 68 °C für 2 min mit einer Zyklusverlängerung von 20 min für jeden Zyklus, und einem abschließenden Verlängerungsschritt bei 68 °C für 7 min. Die verwendeten PCR-Primer waren 5'-ATTACTCGAGGGCCGCACGCCATGAGGG-3', der eine XhoI-Stelle enthielt (Vorwärts-Primer-1), und 2) 5'-GCCCGGATCCTTCAGCTGTAGATTCCTTTGC-3', der eine BamHI-Stelle enthielt (Revers-Primer-2). Das Produkt der Vervielfältigung, das ein 2,4 kb-Fragment ist, wurde durch Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt, durch TA-Klonieren in dem pCRII-Vektor kloniert (Invitrogen, San Diego, CA), und in das Bluescript II SK (+/–) Phagemid rekloniert.
Die Sequenz, die für die Scharnier-, CH2- und CH3-Domänen von murinen IgG1 kodierte (der Ig-Tag) wurde erhalten durch PCR unter Verwendung von muriner IgG1-cDNA als Templat, oder des Plasmids, murine IgG1-pCRII. Die drei Cystein-Reste im Scharnier-Abschnitt der IgG1 wurden nach Standard-Techniken zu Serin-Resten mutiert. Die PCR-Zyklierbedingungen waren: Denaturierung bei 95 °C für 2 min; dann 30 Zyklen bei 95 °C für 1 min, bei 50 °C für 1 min und bei 72 °C für 2 min, und ein abschließender Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min. Die PCR-Primer waren 5'-GCGAGGATCCGTGCCCAGGGATTCTGGTTCTAAG-3', der eine BamHI-Stelle enthielt (Vorwärts-Primer-3), und 5'-CTAAGCGGCCGCAAGGACACTGGGATCATTTACCAGG-3', der eine NotI-Stelle enthielt (Revers-Primer-4). Das PCR-Produkt ist ein 0,68 kb-Fragment, das mittels Agarose-Gel-Elektrophorese gereinigt wurde, durch TA-Klonieren in pCRII kloniert wurde und in das Bluescript II SK (+/–) Phagemid inseriert wurde.
Um das klonierte modifizierte gp96 mit dem klonierten Ig-Tag zu verbinden, wurde die Sequenz, die für gp96 kodierte, in die XhoI und BamHI-Stellen von pBluescript inseriert, während der Ig-Tag in die BamHI und NotI-Stellen von pBluescript inseriert wurde. Die Expression des Fusions proteins gp96-Ig wurde durch in vitro gekoppelte Transkription/Translation bestätigt (Promega, Madison). Dann wurde die Sequenz, die für die modifizierte gp96-Ig-Fusion kodierte, mit XhoI und NotI ausgeschnitten und in die eukaryontischen Expressionsvektoren inseriert, pBCMGSNeo, der gp96-Ig unter dem CMV-Promoter exprimiert, und pBMGHis, der gp96-IgG unter dem Metallothionein-Promoter exprimiert. Die Größe der modifizierten gp96-Ig-Sequenz betrug 3,08 kb, und das Molekulargewicht des sekretierten chimären gp96 wurde abgeschätzt als etwa 121 kD.
6.2. Produktion von modifiziertem gp96-Ig in Säugetierzellen
Die Mäuse-Fibroblasten-Zelllinie, NIH3T3, die Mäuse-Lewis-Lungenkarzinom-Zelllinie, LLC, die Mäuse-Mastocytom-Zelllinie, P815, die Mäuse-Lymphom-Zelllinie, EL4 und deren Ovalbumin-Transfektant, E.G7, die Mäuse-Melanom-Zelllinie, die B16F10, die Mäuse-Fibrosarkom-Zelllinie, MC57, und die humane kleinzellige Lungenkarzinom-Zelllinien, SCLC#2 und SCLC#7 wurden zur Expression der modifizierten gp96-Ig-Gen-Sequenz verwendet. Es wurden Standardtechniken angewandt, um die Expressions-Genkonstrukte in diese Zellen einzuführen. Die episomal erhaltenen Expressionsvektoren pBCMGSNeo oder pBCMGHis, die auf dem bovinen Papillom-Virus (BPV) basieren und die modifizierte Sequenz enthielten (gp96-Ig-pBCMGSNeo und gp96-Ig-pBCMGHis) wurden dazu verwendet, LLC, B16F10, MC57, SCLC#2 und SCLC#7 mittels Lipofectin (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) zu transfizieren, NIH3T3-Zellen mittels Calciumphosphat und EL4, E.G7 und P815-Zellen mittels Elektroporation. NIH3T3 wurde in IMDM-Medium (GIBCO BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem Kälberserum (GIBCO BRL) kultiviert. E.G7 und E14 wurden in IMDM-Medium, ergänzt mit 10% Hitze-inaktiviertem FCS (GIBCO BRL) und 50 μM β-Mercaptoethanol (Bio-Rad, CA) kultiviert. Alle anderen Zelllinien wurden in IMDM-Medium, ergänzt mit 10% Hitzeinaktiviertem FCS kultiviert. NIH3T3, MC57, SCLC#2 und SCLC#7 wurden als Monolayer-Kulturen gehalten und wenn erforderlich, durch kurze Trypsinierung mit 0,05% Trypsin plus EDTA (GIBCO BRL) passagiert. Transfizierte Zellen wurden mit 1 mg/ml G418 (GIBCO) oder 2,5 mM L-Histidinol (Sigma, St. Louis, MO) für 2 Wochen selektiert und zahlenmäßig durch Verdünnung und weitere Kultivierung expandiert. Klone, die große Mengen des sekretierten gp906-Ig-Fusionsproteins produzieren, wurden durch limitierende Verdünnungen erzeugt.
Nichttransfizierte Zelllinien sekretierten kein Maus-IgG in den Kulturüberstand, Zelllinien, die mit der modifizierten gp96-Ig-Gen-Sequenz transfiziert waren, sekretierten jedoch modifiziertes gp96.
Die Zellen wurden zu 10⁶/ml in AIMV oder IMDM mit 10% FCS plattiert, und die Kulturüberstände wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten geerntet. Zur Analyse der intrazellulären Expression von gp96-Ig wurden die Zellen auf ähnliche Weise plattiert, geerntet, mit PBS gewaschen und durch drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Die Lysate wurden bei 600 g für 10 min zentrifugiert, und die Überstände wurden nochmals bei 13.000 g für 60 min zentrifugiert. Der endgültige Überstand wurde dazu verwendet, um die intrazelluläre Expression von gp96-Ig zu quantifizieren.
Die Konzentration von gp96-Ig in dem Zellkulturmedium wurde mittels ELISA bestimmt, indem man den Ig-Tag als Antigen nutzte. Der Ig-Tag wurde mittels eines markierten Anti-Maus-Antikörpers nachgewiesen. Für den ELISA wurden Flachbodenplatten mit 96 Vertiefungen (Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA) mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (5 μg/ml) bei 4 °C über Nacht beschichtet und mit 1% Gelatine in PBS bei 37 °C für 1 h blockiert. Die Vertiefungen wurden mit Kulturüberständen oder murinen IgG (ICN, Costa Mesa, CA) als Kontrolle bei 37 °C 1 h inkubiert und mit Peroxidase-konjugiertem affinipurem F(ab')2-Fragment Ziegen-anti-Maus-IgG (H+L) bei 37 °C 1 h entwickelt, gefolgt von einer Inkubation mit 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) (Sigma). Die Extinktion wurde mit Immunoreader SLT-Labinstruments EAR 400 AT (Österreich) bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. Gp96-Ig-Konzentration wurde dadurch be stimmt, dass man ihre Extinktion mit der des murinen IgG-Standards verglich. Tabelle 1 Sekretion von gp96-Ig in Kulturüberstände

^a Metallothionein-Promotor

Alle murinen und humanen Zelllinien, die mit gp96-Ig in den episomalen Expressionsvektoren auf Basis des Papilloma-Virus transfiziert waren, sekretierten das Fusionsprotein (1a und Tabelle 1). Mock-transfizierte Zellen sekretierten kein gp96-Ig. Unter standardisierten Bedingungen variierten die Mengen an sekretiertem Fusionsprotein in Abhängigkeit vom Transfektanten von 5 ng/ml bis 3300 ng/ml.
Die Sekretion von gp96-Ig führte zu seiner zeitabhängigen linearen Akkumulation im Überstand (2). Intrazelluläres gp906-Ig wurde bei niedrigem Niveau und bei konstantem Steady-State-Niveau in Lysaten von transfizierten Zellen nachgewiesen, was anzeigte, dass es sich in der Zelle nicht ansammelte.
6.3. Sekretion von gp96-Ig durch Säugetierzellen
Zur Anfärbung der Membran von gp96-Ig-transfizierten SCLC-Zellen wurden Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC- oder Ziegenanti-Kaninchen-IgG-FITC als Kontrolle zum Anfärben für 15 min bei 4 °C verwendet und mittels eines Becton Dickinson FACScan-Flow-Cytometers analysiert. Für die intrazelluläre Anfärbung wurden Zellen mit 4% Paraformaldehyd und mit 1% Saponin permeabilisiert, gefolgt von einem Anfärben mit Ziegen-anti-Maus-IgG-FITC (Boehringer, Mannheim, Indianapolis, IN), Ziegen-anti-Maus-IgG-PE (Southern Biotechnology, Birmingham, AL), Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-FITC oder Ziegenanti-syrische Hamster-IgG-FITC (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) für 15 min bei 4 °C und mittels Flow Cytometer analysiert.
FACS-Analyse von Membran-intakten, transfizierten Turmorzellen ergaben keine Anfärbung mit Anti-Maus-IgG über dem Hintergrund, was anzeigte, dass die IgG-Einheit des Fusionsproteins nicht auf dem äußeren Blatt der Plasma-Membran präsentiert wird. Im Gegensatz dazu wird bei einer Permeabilisierung der Membran gp96-Ig intrazellulär mit Ziegen-anti-Maus-IgG-Antikörper nachgewiesen, jedoch nicht mittels Kontroll-Ziegen-anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern. Die Transmembran-Domäne von gp906 stört die Sekretion von gp96-Ig nicht und führt nicht zu einer intrazellulären Akkumulation. Diese Daten sind konsistent mit früheren Berichten, die andeuten, dass die Transmembran-Domän nicht zur Verankerung von gp96 in der Membran verwendet wird und dass gp96 kein integrales Membran-Protein ist.
6.4. Reinigung von modifiziertem gp96-Ig
Gp96-Ig wurde durch Affinitätschromatographie auf einer Protein A-Säule (Bio-Rad, Hercules, CA) gereinigt. Ein verbrauchtes serumfreies Kulturmedium von gp96-Ig-transfizierten SCLC#7 (SOLCH#7-gp96-Ig) wurde als Quelle für die Reinigung des Ig-Fusionsproteins verwendet. Gp96-Ig-transfizierte NIH3T3-Zellen wurden zu 10⁶ ml in AIMV ausplattiert, und die Kulturüberstände wurden nach 6-8 Tagen geerntet. Nach der Entfernung von Zelltrümmern durch Zentrifugation und Filtration wurde das gesamte Protein des Überstands mittels Ammoniumsulfat-Fällung (55% Sättigung) konzentriert und gegen PBS dialysiert. Proben wurden 1:2 mit 3,5 M NaCl, 1,6 M Glycin, pH 9,0 (Bindungspuffer) verdünnt und auf die Protein A-Säule übertragen. Die Säule wurde sorgfältig mit Bindungspuffer gewaschen, und gebundenes Protein wurde mit 0,1 M Citronensäure, pH 6,5 eluiert. Fraktionen, die Protein enthielten, wurden gepoolt und gegen PBS dialysiert. Die Konzentration von gp96-Ig wurde mittels des Micro BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, IL) bestimmt.
Natriumdodecylsulfalt-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde an 4-15% Tris-Glycin-Gelen (Bio-Rad) durchgeführt, und mit Coomassie Blue angefärbt. Für Western-Blotting wurden Proteine auf SDS-PAGE auf Nitrocellulose geblottet, und mit einem monoklonalen Ratten-Antikörper, der spezifisch für Grp94 ist (9G10; StressGen, Victoria, Canada) als Sonde behandelt, gefolgt von Peroxidase-konjugiertem affinitätsreinem F(ab')2-Fragment Ziegen-anti-Ratten-IgG (H+L) (Jackson ImmunoResearch, PA).
Wenn mittels Protein A-Chromatographie gereinigtes gp96-Ig mittels SDS-PAGE analysiert wurde, wanderte das Material als eine Hauptbande mit dem vorausgesagten Molekulargewicht von 120 kG, sowie als zwei geringfügigere Banden mit höherem Molekulargewicht, die früher bereits auch für unmodifiziertes gp96 beschrieben wurden (1b). Western Blotting mit einem monoklonalen Antikörper, der für gp96 spezifisch war, bestätigte die Identität des Fusionsproteins. Nur die Hauptbande wird angefärbt, was darauf hindeutet, dass die schwächeren Banden Glycolisierungsvarianten für gp96, die nicht durch den Antikörper erkannt werden, sind.
Sekretierte modifizierte gp96-Ig-Moleküle wurden auch mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen analysiert. 1C zeigt einen Vergleich von gereinigten gp96-Ig-Molekülen, die von SCLC#2 sekretiert wurden, von murinen IgG und von einem Fusionsprotein aus CD30 und dem Ig-Peptid-Tag. Das gp96-Ig-Fusionsprotein, das gp96 (96 kD) und den IG-Tag (25 kD) umfasst, erscheint im richtigen Größenbereich. Die Triplets, die modifiziertes gp96-Ig sowohl in den reduzierten als auch nicht-reduzierten Fraktionen repräsentieren, wurden vorher für gp96 beschrieben.
7. BEISPIEL: Tumorigenität von Tumorzellen, die modifiziertes gp96-IG produzieren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind rekombinante Tumorzellen, die Komplexe aus modifizierten Hsp-Peptid sekretieren, nützlich als Impfstoff. Die in vivo-Immunigenität derartiger rekombinanter Zellen wurden geprüft, indem man ihre Tumorigenität in Tieren beurteilte, die keine vorexistierenden Tumoren aufwiesen.
Rekombinante Tumorzellen wurden in Mäuse injiziert, um festzustellen, ob die Tumorigenität derartiger rekombinanter Zellen, bezogen auf unmodifizierte Tumorzellen des gleichen Typs (d.h. ohne das Expressions-Gen-Konstrukt) reduziert wurde. Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, dass diese rekombinanten Tumorzellen weniger aktiv sind als die ursprünglichen Tumorzellen im Hinblick auf eine Tumorbildung bei den Testtieren. Es liegt nahe, dass das Immunsystem dieser Tiere eine wirksame Immunreaktion gegen derartige Zellen entwickelt hat, die stärker immunogen und/oder antigen sind als die ursprünglichen Tumorzellen. Tumorzellen, die in Testtieren verblieben, denen ursprünglich rekombinante Tumorzellen injiziert worden waren, wurden isoliert und in Kultur zurückgeführt. Die Beobachtung, dass diese Tumorzellen aufhörten, die Moleküle aus modifiziertem Hsp-Ig zu sekretieren, deutet daraufhin, dass diese Tumorzellen selektierte Varianten waren und von den Immun-Effektormechanismen nicht wirksam erfasst wurde.
7.1. Vergleich der relativen Tumorigenität von E.G7 und E.G7-gp906-Ig
Zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden jeweils subkutan mit der identischen Zahl von lebenden E.G7 und E.G7-gp96-Ig-Tumorzellen geimpft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
Nahezu alle Mäuse, denen E.G7 injiziert wurde, zeigten sich entwickelnde Tumore. E.G7-gp96-Ig-Tumore wurden jedoch bei den meisten der Mäuse abgestoßen. Das deutet darauf hin, dass das modifizierte gp96, das von E.G7-gp96-Ig sekretiert wurde, Tumor-Peptide von E.G7 festhält und eine Tumor-Immunität gegen E.G7 induzieren kann. Tumore wurden aus zwei Mäusen mit E.G7-gp96-Ig-Tumoren entnommen und in das Kulturmedium zurückübertragen. Diese Tumorzellen sekretierten in Kultur kein modifiziertes gp96-Ig. Wir nehmen an, dass diese Tumorvarianten, die die Fähigkeit verloren hatten, modifiziertes gp96-Ig zu sekretieren, in vivo selektiert worden waren.
7.2. Vergleich der relativen Tumorigenität von EL4 und EL4-gp96-IG
Zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden jeweils subkutan identische Zahlen von lebenden EL4 und EL4-gp96-Ig-Tumorzellen injiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Nahezu alle Mäuse, denen EL4 injiziert worden war, zeigten sich entwickelnde Tumoren. EL4-gp96-IG-Tumoren wurden jedoch bei nahezu 50% der geimpften Mäuse abgestoßen.
Diese Beobachtung deutet daraufhin, dass aus EL4-gp96-Ig sekretiertes gp96 Tumor-Peptide von EL4 festhält und eine Tumorimmunität gegen EL4-Zellen induzieren kann. Aus 3 Mäusen mit EL4-gp-Ig-Tumoren wurden Tumoren entnommen und in das Kulturmedium zurückgeführt. Ähnlich wie vorher hörten diese Tumorvarianten auf, modifiziertes gp96-Ig zu sekretieren, was darauf hindeutet, dass sie in vivo dem Immun-Effektormechanismus entkamen.
7.3. Vergleich der relativen Tumorigenität von MC57 und MC57-gp96-Ig
C57BL/6-Mäuse wurden subkutan mit der angegebenen Zahl von Leber-Tumorzellen geimpft. Alle Mäuse, denen MC57 injiziert worden war, überlebten ohne Tumor. Eine Maus, der MC57-gp96-Ig-Zellen injiziert worden war, zeigten sich entwickelnde Tumoren. Der Tumor wurde entnommen und in das Kulturmedium zurückgeführt. Die Menge an modifizierten gp96-Ig-Molekülen im Kulturüberstand des entnommenen Tumors hatte auf 100 μg/ml abgenommen. Tabelle 4
7.4. Vergleich der relativen Tumorigenität von B16F10 und B16F10-gp96-Ig
Zwei Gruppen von C57BL/6-Mäusen wurden jeweils subkutan die angegebenen Zahlen von lebenden B16F10- und B16F10-gp96-Ig-Tumorzellen injiziert. Alle Mäuse, denen B16F10-gp96-Ig-Zellen injiziert worden waren, zeigten keine Tumorabstoßung. Zwei Mäuse, denen 1 × 10⁴ BF6F10-Zellen injiziert worden waren, stießen den Tumor ab. Tabelle 5
7.5. Tumorigenität von E.G7-gp96-Ig und LLC-gp96-Ig
Für eine weitere in vivo-Untersuchung wurden zwei Zelllinien ausgewählt. E.G7 ist ein Ovalbumin-Transfektant des EL4-Lymphoms. E.G7 bildet tödliche Tumoren in C57BL/6-Mäusen, trotz ihrer relativen Immunogenität. Gp96-Ig-Transfektion von E.G7 gestattet die Bestimmung, ob E.G7-gp-Ig- Immunisation immunisiert gegen einen oder beide EL4-assoziierten Antigene und das Ovalbumin-Surrogat-Antigen. Der zweite Tumor, LLC transfiziert mit Sequenzen, die für gp96-Ig oder Ovalbumin kodieren, wurden deshalb verwendet, weil er im Gegensatz zu E.G7 ein nicht-hämatopoetischer, wenig immunogener Tumor ist. Beide Zelllinien sekretieren vergleichbare Mengen an gp96-Ig (vgl. Tabelle 1).
Die Tumorigenität in vivo wurde bestimmt durch subkutane Injektion von lebenden Tumorzellen in 200 μl PBS in die Flanken der Mäuse. Die Größe von Tumoren wurde zweimal wöchentlich für wenigstens 2 Monate gemessen. Wenn das mittlere Tumorwachstum nach 3 Wochen einen Durchmesser von 10 mm überschritt, wurden die Mäuse als Tumor-positiv angesehen und getötet. Mäuse wurden durch subkutane Injektion von 10⁶ lebenden E.G7-gp96-Ig oder mit bestrahltem E.G7 als Kontrolle (in 200 μl PBS) immunisiert, verabreicht in die rechte Flanke. Es wurden zwei Immunisierungen in 2 Wochen-Intervallen verabreicht.
Gp96-Ig-Sekretion vermindert die Tumorigenität von E.G7 in C57BL/6-Mäusen um mehr als das Hundertfache und zwar verglichen mit Mock-transfizierten oder nicht-transfizierten E.G7. Die subkutane Inokulation von zehn Millionen Hitzeschockprotein sekretierenden Tumorzellen führte nur in 10% der inokulierten Mäuse zu Tumoren (3). Eine ähnliche Verminderung der Tumorigenität durch gp96-Ig-Sekretion wurde mit EL4 beobachtet. Gp96-Ig-Sekretion durch LLC führte zu einer mäßigeren, etwa fünffachen Verminderung der Tumorigenität (3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sekretorisches gp96-Ig die Tumorigenität von Tumoren vermutlich aufgrund einer Erhöhung ihrer Immunogenität verminderte.
8. BEISPIEL: Schützende Wirkung einer Impfung mit Zellen, die modifizierte gp96-Ig exprimieren
Um die Fähigkeit von rekombinanten Tumorzellen, die modifizierte gp96-Ig produzieren, zur Stimulation einer schützenden Immunreaktion zu demonstrieren, wurden Mäuse zuerst mit rekombinanten Tumorzellen geimpft, und dann mit einer Injektion von Tumorzellen gereizt, die das modifizierte gp96-IG-Gen-Konstrukt nicht enthielten.
Gruppen von Mäusen wurden durch subkutane Injektion von 1 × 10⁶ von lebenden E.G7-gp96-IG, verabreicht in die rechte Flanke, immunisiert. Es wurden zwei Immunisationen in 2 Wochen-Intervallen verabreicht. Die Mäuse wurde dann durch subkutane Injektionen der angegebenen Zahl von lebenden E.G7 oder EL4-Zellen 2 Wochen nach der letzten Immunisierung in die linke Flanke gereizt. E.G7-Zellen sind EL4-Zellen, die mit einem Ovalbumin-Gen-Konstrukt transfiziert sind. Tabelle 6
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, dass weniger Mäuse, die mit rekombinanten E.G7-gp96-Ig-Zellen geimpft worden waren, E.G7- und EL4-Tumoren entwickelten, und sie weisen daraufhin, dass derartige rekombinante Tumorzellen prophylaktisch verwendet werden können, um das Auftreten von spezifisch antigen-verwandten Tumoren zu verhindern oder zu vermindern.
8.1. Schützende Wirkung von E.G7-gp96-Ig gegen E.G7 und LLC-Tumorzellen
Die Zelllinien E.G7 und LLC wurden für weitere in vivo-Studien ausgewählt. Wie oben beschrieben, wurden Mäuse durch subkutane Injektion in die rechte Flanke mit nichtbestrahlten E.G7-Zellen, die gp96-IG sekretierten, immunisiert. Es wurden zwei Immunisierungen in 2 Wochen-Intervallen gegeben. Anschließend wurden sie mit nicht-transfizierten oder Mocktransfizierten E.G7, mit EL4, mit nicht-transfizierten LLC und mit LLC-Ova gereizt. Um LLC-Ova herzustellen, wurde ein Hühner-Ovalbumin-Gen, das in einen Expressionsvektor, pAc-NEO-OVA, kloniert war, dazu verwendet, LLC mittels Lipofectin (GIBCO BRL) zu transfizieren. Transfizierte Zellen wurden mit 1 mg/ml G418 (GIBCO BRL) wenigstens 2 Wochen selektiert, und ihre Sekretionsniveaus wurden mittels ELISA getestet. Mäuse, die mit bestrahlten E.G7 immunisiert wurden, und nicht geimpfte Mäuse dienten als Impfkontrollen.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt. E.G7-gp96-Ig-immunisierte Mäuse waren gegen eine zehnfach höhere Reizdosis mit E.G7 geschützt als nicht-immunisierte Mäuse oder Mäuse, die mit bestrahlten Zellen geimpft worden waren. Die Wirkung der Immunisierung war noch stärker ausgeprägt, wenn mit EL4 gereizt wurde, was eine fünfzigfache Dosiserhöhung bei gereizten, verglichen mit Kontrolltieren, ermöglichte. Wie erwartet, bot die EG7-gp96-IG-Immunisierung keinen Schutz gegen einen Reiz mit nicht-transfizierten oder Vektor-transfizierten LLC, während eine moderate, etwa dreifache Zunahme des Schutzes beobachtet wurde, wenn Oval-bumin-transfizierte LLC verwendet wurden. Der starke Schutz von EG7-gp96-IG-immunisierten Mäusen gegen den EL4-Reiz kann Folge der multiplen Tumorantigene sein, die sich EG7 und EL4 teilen. Im Gegensatz dazu hängt der schwache Schutz, der mit LLC-Ova erhalten wurde, von T-Zellen ab, die ein einziges oder eine begrenzte Anzahl von Epitopen erkennen, die sich von Ovalbumin ableiten und durch H2^b-Molekülen präsentiert werden.
9. BEISPIEL: In vivo-Abreicherung oder Inaktivierung von kompeteten Immunzellen bei inokulierten Tieren
Die Beteiligung von Immunmechanismen bei der Abstoßung von EG7-gp96-IG wurde ferner durch in vivo-Abreicherung oder Inaktivierung von kompetenten Immunzellen untersucht.
Monoklonale Antikörper, die für die in vivo-Abreicherung der CD4⁺- und CD8⁺-Zell-Untergruppen verwendet wurden, waren GK1.5 bzw. 2.43. Sie wurden aus Hybridom-Überständen, gefolgt von einer Protein G-Affinitätschromatographie gereinigt. 100 μg GK1.5 oder 2.43 in 200 μl PBS wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht, und zwar 2 Tage vor oder 3 Tage nach einer subkutanen Inokulation von 10⁶ lebenden E.G7-gp96-Ig (in 200 μl PBS). Die Abreicherung von CD4- und CD8-Zellen wurde durch FACS-Analyse verifiziert. Für eine funktionelle Inhibierung von Makrophagen wurde 1 mg Carrageenan (Typ II; Sigma) in 200 μl PBS durch intraperitoneale Injektion verabreicht.
Einem Tier wurde eine Million Tumorzellen, die gp96-Ig sekretierten, eingeimpft, eine Dosis, die ausreicht, Tumoren zu etablieren, die bis zu einem Mittel von etwa 8 mm Durchmesser wachsen und anschließend schrumpfen und abgestoßen werden. Die Tumorabstoßung wird bei Mäusen blockiert, die mit dem Anti-CD8-Antikörper 2,43 behandelt wurden, und zwar entweder zwei Tage vor oder drei Tage nach der Tumorinokulation (5). Der Anti-CD4-Antikörper GK1.5 wies keine Wirkung auf die Tumorabstoßung auf, unabhängig vom Zeitpunkt der Injektion, obwohl er zu einem vollständigen Entzug von CD4-Zellen für mehr als 14 Tage führte. In ähnlicher Weise hatte Carrageenan, für das bekannt ist, dass es Makrophagen in vivo inaktiviert, keinen Effekt auf die Tumorabstoßung.
Diese Daten sind konsistent mit der Erklärung, dass Peptide, die mit sekretierten gp96-IG assoziiert sind, von Klasse I MHC präsentiert werden und eine tumorspezifische CD8⁺ CTL-Reaktion stimulieren, die zu einer Tumorabstoßung führt. Diese Reaktion scheint unabhängig zu sein von einer CD4-Hilfe und benötigt keine Makrophagen. In unserem Modellsystem wird gp96-Ig von lebenden Tumorzellen sekretiert und dient dazu, die Maus zu immunisieren, was zu der nachfolgenden Abstoßung des Tumors führt. Das Tumorwachstum begann sich von Tag 6 bis Tag 8 zu verlangsamen, was anzeigte, dass eine Anti-Tumorimmunität ausgelöst worden war, und Tumoren wurden innerhalb der nachfolgenden Woche abgestoßen. CD4-Zellen und Makrophagen waren für die Tumorabstoßung nicht erforderlich, und zwar unabhängig vom Zeitpunkt ihrer Abreicherung, zwei Tage vor oder drei Tage nach der Tumorinkulation. Das zeigt, dass CD4-Zellen und Makrophagen zur Induktion einer Immunität nicht essentiell sind, und dass sie auch nicht in der Effektorphase bei diesem Tumorsystem benötigt werden. CD8-Zellen andererseits sind in allen Phasen der Reaktion auf sekretorische gp96-Ig von kritischer Bedeutung.

Claims

Gereinigte molekulare Komplexe, die jeweils ein modifiziertes Hitzeschockprotein aufweisen, das nicht-kovalent mit eine Antigen assoziiert ist, wobei (a) das modifizierte Hitzeschockprotein (i) von einer Zelle sekretiert wird, in der es rekombinant exprimiert wird; (ii) keine Retentionssequenz für das endoplasmatische Retikulum aufweist, die in dem unmodifizierten Hitzeschockprotein vorhanden ist; und (iii) einen Peptid-Tag aufweist, der von einem spezifischen Bindungspartner erkannt wird; (b) das Antigen ein Protein oder ein Peptid ist; und (c) die molekularen Komplexe aus der Zelle sekretiert wurden.
Gereinigte molekulare Komplexe, die jeweils ein modifiziertes Hitzeschockprotein aufweisen, das nicht-kovalent mit einem Antigen assoziiert ist, wobei (a) das modifizierte Hitzeschockprotein (i) von einer Zelle sekretiert wird, in der es rekombinant exprimiert wird; (ii) ein Leader-Peptid umfasst, das in dem unmodifizierten Hitzeschockprotein nicht vorhanden ist; und (iii) einen Peptid-Tag aufweist, der von einem spezifischen Bindungspartner erkannt wird; (b) das Antigen ein Protein oder ein Peptid ist; und (c) die molekularen Komplexe aus der Zelle sekretiert wurden.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei das genannte Hitzeschockprotein ERp72, ERp61, hsp60, hsp70, hsp90, gp96, BiP oder Disulfidisomerase ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei sich die genannten Antigene von einer infizierten Zelle ableiten.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannten Antigene Peptide umfassen, für die ein infektiöses Mittel kodiert.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannten Antigene Peptide umfassen, für die eine Krebszelle kodiert.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Verabreichung der Komplexe an eine Person eine spezifische Immunität gegen neoplastische Zellen oder pathogen-infizierte Zellen, die das Antigen exprimieren, hervorruft.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannten Antigene das KS 1/4 Pan-Karzinomantigen, das Ovarialkarzinom-Antigen, das saure Phosphat-Prostata-Antigen, das Prostata-spezifische Antigen, das Melanom-assoziierte Antigen p97, das Melanom-Antigen gp75, das hochmolekulargewichtige Melanom-Antigen oder das Prostata-spezifische Membran-Antigen umfassen.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die genannten Antigene ein Antigen umfassen, für das ein Virus kodiert.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 9, wobei die Antigene ein Epitop umfassen von Hepatitis Typ A, Hepatitis Typ B, Hepatitis Typ C, Grippe, Windpocken, Adenovirus, Herpes simplex Typ I (HSV-I), Herpes simplex Typ II (HSV-II), Rinderpest, Rhinovirus, ECHO-Virus, Rotavirus, Respiratory-Syncytial-Virus, Papilloma-Virus, Papova-Virus, Cytomegalovirus, Echinovirus, Arbovirus, Huntavirus, Coxsackie-Virus, Mumps-Virus, Masern-Virus, Rubella-Virus, Polio-Virus, humanem Immuninsuffizienz-Virus Typ I (HIV-I), oder humanem Immuninsuffizienz-Virus Typ II (HIV-II).
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannten Antigene ein Antigen umfassen, für das ein Bakterium, ein Protozoon oder ein Parasit kodiert.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 11, wobei die genannten Antigene ein Antigen umfassen, für das Leishmania, Kokzidie, Trypanosoma, Chlamydie oder Rickettsie kodieren.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die genannte Zelle eine rekombinante Krebszelle oder eine rekombinante präneoplastische Zelle ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 13, wobei die Zelle eine Sarkom-, Karzinom- oder Leukämiezelle ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle eine von einem Krebs ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenem Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synovialom, Mesotheliom, Ewing Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Dickdarmkarzinom, Pankreaskrebs, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweissdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papillärem Karzinom, papillärem Adenokarzinom, Cystadenocarcinoma, medullärem Karzinom, bronchogenem Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallenwegskarzinom, Choriokarzinom, Seminom, Embryonalkarzinom, Wilms Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelialkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngiom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, akustischem Neurom, Oligodendrogliom, Meningiom, Melanom, Neuroblastom, Retinoblastom, Leu kämie, Lymphom, multiplem Myelom, Waldenström Makroglobulinämie und Schwerkettenkrankheits-Zellen.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Zelle eine rekombinante Zelle ist, die mit einem pathogenen oder infektiösen Mittel infiziert ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 16, wobei das Mittel ein Virus, eine Bakterie, ein Pilz oder ein Parasit ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Zelle eine rekombinante Zelle ist, die der Einwirkung eines Mutagens oder krebsauslösenden Mittels ausgesetzt wurde.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6 oder 13, wobei die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 6 oder 13, wobei die Zelle eine menschliche Zelle ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 4, 5, 13 oder 17, wobei die genannte Retentionssequenz für das endoplasmatische Retikulum für XDEL kodiert, wobei X irgendeine Aminosäure sein kann.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 21, wobei die genannte Retentionssequenz für das endoplasmatische Retikulum KDEL oder HDEL ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 2, wobei die genannte Retentionssequenz für das endoplasmatische Retikulum durch ein Peptid ersetzt ist, das nicht als Signal fungiert.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 3, 4, 5, 13 oder 16, wobei der genannte Peptid-Tag ein konstanter Immunglobulinabschnitt, eine Polyhistidinsequenz, Glutathion-S-Transferase, das Maltose-bindende Protein aus E. coli, eine Cellulose-bindende Domän, eine extrazelluläre Domän von CD8 oder eine extrazelluläre Domän von CD28 ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 4, 5, 13 oder 16, wobei der genannte Peptid-Tag ein Epitop ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 25, wobei der genannte Peptid-Tag ein FLAG-Epitop, das Epitop bei den Aminosäuren 408-439 des myc-Proteins oder ein Influenza-Virus-Hämagglutinin (HA)-Epitop ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1, 2, 4 oder 13, wobei der genannte Peptid-Tag ein nicht-variabler Abschnitt eines Immunglobulinmoleküls ist, der eine CH2-Domän und eine CH3-Domän des konstanten Abschnitts der schweren Kette des Immunglobulinmoleküls umfasst.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei der genannte Peptid-Tag ein Abschnitt eines Immunglobulins ist, der Stellen für Zwischenketten-Disulfidbindungen enthält, der erhalten wurde aus einem IgG-Subtyp 1, IgG-Subtyp 2, IgG-Subtyp 3, IgG-Subtyp 4, IgA, IgE, IgD oder IgM.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 28, wobei das Immunglobulin menschlichen Ursprungs ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 28, wobei das Immunglobulin aus der Maus stammt.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 13, wobei die Zelle von einem Krebs stammt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Dickdarmkarzinom, Brustkrebs, Ovarialkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Nierenzellkarzinom, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, Melanom, Leukämie und Lymphom.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 27, 28 oder 29, wobei das modifizierte Hitzeschockprotein humanes gp96 ist, und der Peptid-Tag die CH2- und CH3-Domänen des konstanten Abschnitts eines Immunglobulins G1 umfasst.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei das genannte Hitzeschockprotein ein Glied der hsp60, hsp70 oder hsp90-Familien von Hitzschockproteinen ist.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 1 oder 2, wobei die molekularen Komplexe ausgewählt wurden aus einer Mischung von rekombinanten Krebszellen, die in vivo wenigstens eine antigene Determinante mit einer Ziel-Krebszelle teilen.
Molekulare Komplexe nach Anspruch 2, wobei das Leader-Peptid das Herpes-Virus Glycoprotein D Leader-Peptid ist, oder wobei das Leader-Peptid aus dem V-J2-C-Abschnitt der Mäuse-Immunglobulin-Kappakette erhalten wurde.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die umfasst (a) gereinigte molekulare Komplexe nach einem der Ansprüche 1-35 und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der genannten molekularen Komplexe umfasst, die ausreicht, eine Immunreaktion gegen das Antigen zu stimulieren.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der molekularen Komplexe von Anspruch 4, 5 oder 6 umfasst, die zur Behandlung einer Krankheit oder Gesundheitsstörung wirksam ist, die mit der Expression des genannten Antigens assoziiert ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der molekularen Komplexe von Anspruch 13 umfasst, die im Hinblick auf eine Inhibierung des Wachstums von Krebszellen oder von präneoplastischen Zellen wirksam ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei die Krebszellen oder präneoplastischen Zellen solche vom gleichen Typ wie die rekombinante Krebszelle oder rekombinante präneoplastische Zelle sind oder wobei die Krebszellen oder präneoplastischen Zellen wenigstens eine oder mehrere antigene Determinanten aufweisen, die sie mit der rekombinanten Krebszelle oder rekombinanten präneoplastischen Zelle teilen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der molekularen Komplexe von Anspruch 34 umfasst, die im Hinblick auf eine Inhibierung des Wachstums von Krebszellen wirksam ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei die Krebszellen vom gleichen Typ sind wie die rekombinanten Krebszellen oder wobei die Krebszellen wenigstens eine oder mehrere antigene Determinanten aufweisen, die sie mit den rekombinanten Krebszellen teilen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der molekularen Komplexe von Anspruch 16 umfasst, die im Hinblick auf die Behandlung einer Krankheit oder Gesundheitsstörung, die von dem pathogenen oder infektiösem Mittel bewirkt wird, wirksam ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 36, die eine solche Menge der molekularen Komplexe von Anspruch 18 umfasst, die zur Inhibierung des Wachstums von Krebs- oder präneoplastischen Zellen wirksam ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Kit, der umfasst (a) in einem Behälter die pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 36-42 und (b) Anweisungen für die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung.
Verfahren zur Herstellung der Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-35, wobei das Verfahren umfasst: (a) Kultivieren der genannten Zelle, die rekombinant das modifizierte Hitzeschockprotein exprimiert; und (b) Reinigung der Komplexe nach Sekretion der Komplexe aus der Zelle.
Verfahren nach Anspruch 44, das außerdem die Stufe der Einführung der Sequenz eines modifizierten Hitzeschockprotein-Gens vor der genannten Kultivierungsstufe in die Zelle umfasst.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Verwendung als Arzneimittel.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, 9-12, 16-17, 19-30, 32, 33 und 35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention einer infektiösen Erkrankung.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, 9-12, 16-17, 19-30, 32, 33 und 35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention einer infektiösen Erkrankung in einem Patienten mit einer infektiösen Erkrankung oder bei dem die Prävention einer infektiösen Erkrankung gewünscht wird, wobei die Zelle, aus der die molekularen Komplexe aufgereinigt werden, eine infizierte Zelle ist, die von einer Person erhalten wurde, die sich von dem Patienten unterscheidet und die an einer infektiösen Erkrankung des gleichen Typs wie der Patient leidet.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-5, 9-12, 16-17, 19-30, 32, 33 und 35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention einer infektiösen Erkrankung in einem Patienten mit einer infektiösen Erkrankung oder für den eine Prävention gegen eine infektiöse Erkrankung gewünscht wird, wobei die genannte Zelle, aus der die molekularen Komplexe aufgereinigt werden, eine von dem Patienten erhaltene infizierte Zelle ist.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, 6-8, 13-15 und 18-35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention von Krebs.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, 6-8, 13-15 und 18-35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einem Patienten mit einem Typ von Krebs oder bei dem eine Prävention gegen einen Typ von Krebs gewünscht wird, wobei (i) die Zelle, aus der die moleku laren Komplexe aufgereinigt werden, eine Krebszelle ist, die von einer Person erhalten wurde, die sich von dem Patienten unterscheidet; und (ii) die Person an einem Krebs des gleichen Typs leidet wie der Patient oder wobei die Person an einem Krebs eines Typs leidet, der eine oder mehrere antigene Determinanten mit dem Krebstyp bei dem Patienten teilt.
Molekulare Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-3, 6-8, 13-15 und 18-35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einem Patienten, der an einem Krebstyp leidet oder bei dem eine Prävention gegen einen Krebstyp gewünscht wird, wobei die genannte Zelle, aus der die genannten molekularen Komplexe aufgereinigt werden, eine Krebszelle ist, die von dem Patienten erhalten wurde.
Verwendung der molekularen Komplexe nach irgendeinem der Ansprüche 1-35 oder wie sie nach einem Verfahren hergestellt werden, wie es in Anspruch 44 oder 45 beansprucht wird, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Auslösung einer Immunreaktion gegenüber einem Antigen bei einer Person zur Behandlung oder Prävention von Krebs bei einer Person oder zur Behandlung oder Prävention einer Infektionserkrankung bei einer Person.