DE69935607T2

DE69935607T2 - Verfahren zur klonierung von tieren

Info

Publication number: DE69935607T2
Application number: DE69935607T
Authority: DE
Inventors: Alexander B. Grafton BAGUISI; Eric W. Grafton OVERSTROM
Original assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDFORD; Tufts University
Current assignee: TRUSTEES OF TUFTS COLLEGE MEDFORD; Tufts University
Priority date: 1998-11-02
Filing date: 1999-11-02
Publication date: 2007-11-29
Anticipated expiration: 2019-11-03
Also published as: JP2003523719A; ATE357514T1; EP1127112B1; DE69935607D1; EP1127112A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Herstellung gewünschter Proteine ist bei der Entwicklung von Medikamenten und der Behandlung von Krankheiten von Nutzen. Verschiedene herkömmliche Verfahren zur Herstellung von Proteinen, insbesondere in großen Mengen, sind aus verschiedenen Gründen oft unzulänglich. Die transgene Technologie oder die Klonierungstechnologie können zu verschiedenen Fortschritten in der Medizin führen, einschließlich der Gewinnung von nützlichen Proteinen. Mit Hilfe der transgenen Technologie oder der Klonierungstechnologie lässt sich eine transgene Nucleotidsequenz in ein Wirtstier einführen, wodurch sich diese transgene Nucleotidsequenz exprimieren und sich das Protein herstellen lässt.
Dementsprechend gibt es wenige zuverlässige Verfahren zur Erzeugung transgener oder klonierter Tiere, insbesondere solche Verfahren, die in der Lage sind, nützliche Proteine zu produzieren. Es besteht daher ein Bedarf nach einer Erzeugung von transgenen oder klonierten Tieren und insbesondere von Tieren, die solche erwünschten Proteine produzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß Anspruch 1 stellt die vorliegende Erfindung effektive Verfahren zur Erzeugung von transgenen oder klonierten nicht menschlichen Tieren sowie zur Erhaltung von nützlichen Proteinen zur Verfügung. Die Erfindung umfasst Verfahren zum Klonieren eines der angegebenen Tiere, indem ein Genom aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte kombiniert wird, um dadurch einen Kerntransfer-Embryo zu bilden, und ein Tier mit dem Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen befruchtet wird, die für eine Trächtigkeit des geklonten Tieres geeignet sind. Die aktivierte Spenderzelle befindet sich in einer Stufe des mitotischen Zellzykluses, z.B. der G₁-Phase, S-Phase oder G₂/M-Phase. Die aktivierte Spenderzelle kann aus verschiedenen Zellen bestehen, wie z.B. einer somatischen Zelle (z.B. einer somatischen Zelle eines Erwachsenen oder eines Embryos), einer Keimzelle oder einer Stammzelle. Typen von somatischen Zellen sind Fibroblasten oder Epithelzellen. Die aktivierte kernlose Oocyte liegt in einem Zustand des meiotischen Zellzyklus vor, wie z.B. der Metaphase I, der Anaphase I, der Anaphase II oder der Telophase II. Die Oocyte kann auf chemischem Wege, durch Röntgenbestrahlung, durch Bestrahlung mit einem Laser oder mittels einer physikalischen Entfernung des Kerns von diesem befreit werden.
Nach Anspruch 3 umfasst die Erfindung auch ein Verfahren zur Produktion eines nicht humanen transgenen Tieres, indem ein genmanipuliertes Genom aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte kombiniert wird, um dadurch einen transgenen Kerntransfer-Embryo zu bilden, und indem ein Tier mit dem transgenen Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen befruchtet wird, die für eine Trächtigkeit des transgenen Tieres geeignet sind. Die Phasen des Zellzyklus für die aktivierte Spenderzelle und die aktivierte kernlose Oocyte sind oben beschrieben. Die Typen der aktivierten Spenderzelle sind ebenfalls oben beschrieben. Die Oocyte kann auf chemischem Wege, durch Röntgenbestrahlung, durch Bestrahlung mit einem Laser oder mittels einer physikalischen Entfernung des Kerns von diesem befreit werden.
Gemäß Anspruch 4 betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Erzeugung eines Kerntransfer-Embryos, indem ein nicht menschliches Genom aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte kombiniert wird. Die Oocyte wird aktiviert, indem sie erhöhten Konzentrationen von Calcium ausgesetzt wird und/oder die Phosphorylierung in der Oocyte herabgesetzt wird. Verbindungen oder Bedingungen, welche die Oocyte aktivieren sind z.B. Ethanol, eine ionophore oder elektrische Stimulierung in Gegenwart von Calcium. Der Anstieg von Calcium kann zwischen etwa 10% und 60% über den Basiswerten von Calcium liegen. Die Spenderzelle wird aktiviert, indem die Nährstoffe im Serum der Spenderzelle (z.B. 0,5% fötales Rinderserum) über einen Zeitraum reduziert werden und die Spenderzelle dann einem Serum mit einer erhöhten Menge an Nährstoffen ausgesetzt wird (10% fötales Rinderserum). Das Kombinieren eines Genoms aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten Oocyte kann das Fusionieren der aktivierten Spenderzelle mit der aktivierten Oocyte oder eine Mikroinjektion des Kerns der aktivierten Spenderzelle in die aktivierte Oocyte umfassen.
Gemäß Anspruch 6 betrifft die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten Proteins in einem nicht humanen Tier mit den Schritten: Kombinieren eines nicht humanen Genoms aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen Kerntransfer-Embryo zu bilden, wobei das Genom aus der aktivierten Spenderzelle das gewünschte Protein codiert; Befruchten eines Tieres mit dem Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die zur Trächtigkeit eines geklonten Tieres geeignet sind und Reinigen des gewünschten Proteins aus dem geklonten Tier. Die Reinigung des gewünschten Proteins kann aus Gewebe, Zellen oder einer Körperausscheidung des geklonten Tieres erfolgen. Beispiele für solche Gewebe, Zellen oder Körperausscheidungen sind Milch, Blut, Urin, Haare, die Brustdrüse, Muskeln, die inneren Organe (z.B. das Hirn, das Herz, die Lunge, die Niere, der Pankreas, die Gallenblase, die Leber, der Magen, das Auge, der Dickdarm, der Dünndarm, die Harnblase, der Uterus und die Hoden).
Gemäß Anspruch 8 umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Produktion eines heterologen Proteins in einem nicht humanen transgenen Tier mit den Schritten: Kombinieren eines genmanipulierten Genoms aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen Kerntransfer-Embryo zu bilden, wobei das Genom aus der aktivierten Spenderzelle das heterologe Protein codiert; Befruchten eines Tieres mit dem Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die für eine Trächtigkeit des Kerntransfer-Embryos in ein geklontes Tier geeignet sind und Gewinnen des heterologen Proteins aus dem geklonten Tier. Das genmanipulierte Genom umfasst einen funktionsfähig gebundenen Promotor (z.B. einen endogenen Wirtspromotor, einen exogenen Promotor und einen gewebsspezifischen Promotor). Beispiele für gewebsspezifische Promotoren sind der Milchdrüsen-spezifische Promotor, der Blut-spezifische Promotor, der Muskel-spezifische Promotor, der Nerven-spezifische Promotor, der Haut-spezifische Promotor, der Haar-spezifische Promotor und der Harnorgan-spezifische Promotor.
In der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren zum Entkernen einer Oocyte mit einem meiotischen Spindelapparat beschrieben, indem die Oocyte einer Verbindung ausgesetzt wird, welche den meiotischen Spindelapparat destabilisiert. Die Destabilisierung des meiotischen Spindelapparats führt zu einer Destabilisierung der Mikrotubuli, der Chromosomen oder der Zentriolen. Verbindungen, welche den meiotischen Spindelapparat destabilisieren können, sind z.B. Demecolzin, Nocodazol, Colchicin und Paclitaxel. Um die Destabilisierung des meiotischen Spindelapparats weiter voranzutreiben, können die Temperatur, die Osmolalität oder die Zusammensetzung des die Oocyte umgebenden Mediums verändert werden.
Zusätzlich werden Verfahren zur Gewinnung einer Oocyte für den Kerntransfer beschrieben, wobei die Oocyte Ethanol, einem Ionophor oder einer elektrischen Stimulation ausgesetzt wird, um dadurch eine aktivierte Oocyte zu erhalten, und die aktivierte Oocyte einer Verbindung ausgesetzt wird, welche den meiotischen Spindelapparat destabilisiert um dadurch die aktivierte Oocyte von ihrem Kern zu befreien. Die oben beschriebenen Verbindungen destabilisieren den Spindelapparat der Meiose. Die aktivierte Oocyte kann sich in einer Phase des meiotischen Zellzyklus befinden, wie z.B. der Mataphase I, der Anaphase I, der Anaphase II und der Telophase II.
Mit der vorliegenden Erfindung lassen sich effizientere Klonierungsverfahren ausführen. Durch das Fusionieren oder Kombinieren einer aktivierten Oocyte mit dem Genom aus einer aktivierten Spenderzelle ist der erhaltene Kerntransfer-Embryo zu seiner Weiterentwicklung besser befähigt. Dieser entwicklungsmäßig begünstigte Kerntransfer-Embryo führt zu einer besseren Trächtigkeitserwartung eines mit dem Kerntransfer-Embryo befruchteten Tieres. Diese Tiere werfen klonierte Tiere.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Klonieren von Tieren, die ausgewählt sind aus Mäusen, Ratten, Schweinen, Pferden und Wiederkäuern, indem eine aktivierte Oocyte mit dem Genom aus einer aktivierten Spenderzelle kombiniert wird. "Klonieren eines Tieres" bezieht sich auf die Erzeugung eines aus Mäusen, Ratten, Schweinen, Pferden und Wiederkäuern ausgewählten Tieres, das sich aus einer die genetische Information oder die Nucleinsäuresequenz eines anderen Tieres enthaltenden Oocyte entwickelt, wobei das Tier geklont ist. Das geklonte Tier verfügt im Wesentlichen über die gleiche oder identische Information wie die des Tieres, das geklont wird. "Klonieren" bezieht sich auch auf das Klonieren einer Zelle, wobei die Produktion einer Oocyte mit der genetischen Information oder der Nucleinsäuresequenz eines anderen Tieres mit umfasst ist. Die erhaltene Oocyte, die das Spendergenom enthält, wird hier als "Kerntransfer-Embryo" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung umfasst das Klonieren von verschiedenen, in den Ansprüchen angegebenen Tieren. Diese Tiere sind nicht menschliche Säugetiere, ausgewählt aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Wiederkäuer (z.B. Kühe, Schafe, Ziegen, Kamele, Rinder, Lamas), Schweine und Pferde. Insbesondere wurden Ziegen aus der Schweiz, z.B. die Ziegenzüchtungen Alpine, Saanen und Toggenburg, in den hier beschriebenen Beispielen eingesetzt. Die Spenderzelle und die Oocyte sind vorzugsweise von demselben Tier.
Sowohl die Spenderzelle als auch die Oocyte müssen aktiviert sein. Eine aktivierte (z.B. nicht ruhende) Spenderzelle ist eine Zelle, die aktiv in Teilung begriffen ist (z.B. in keinem Ruhezustand der Mitose). Insbesondere ist eine aktivierte Spenderzelle im Zellzyklus der Mitose, wie z.B. der G₁-Phase, S-Phase oder G₂/M-Phase, begriffen. Der Zellzyklus der Mitose hat die folgenden Phasen: G₁, S, G₂ und M. Die G₂/M-Phase bezieht sich auf die Übergangsphase zwischen der G₂-Phase und der M-Phase. Der als START (oder Restriktionspunkt) bezeichnete Einleitungsvorgang in den Zellzyklus erfolgt während der G₁-Phase. Der hier verwendete Begriff "START" betrifft die späte G₁-Phase des Zellzyklus vor dem Einleiten einer Zelle, die dann durch den Zellzyklus fortschreitet. Die Entscheidung, ob die Zelle einen weiteren Zellzyklus durchläuft, erfolgt bei START. Hat die Zelle erst einmal START passiert, durchläuft sie den Rest der G₁-Phase (d.h. die Vorphase der DNA-Synthese). Die S-Phase ist die Phase für die DNA-Synthese, auf welche die G₂-Phase folgt, die Phase zwischen Synthese und Mitose. Die Mitose findet während der M-Phase statt. Falls die Zelle vor START keinen weiteren Zellzyklus durchläuft, wird die Zelle angehalten. Darüber hinaus kann eine Zelle induziert werden, den Zellzyklus zu verlassen und ruhend oder inaktiv zu werden. Eine "ruhende" oder "inaktive" Zelle wird als Zelle in der G₀-Phase bezeichnet. Eine ruhende Zelle befindet sich in keinem der oben beschriebenen Phasen des Zellzyklus. In der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise eine Spenderzelle in der G₁-Phase des mitotischen Zellzyklus eingesetzt.
Es ist bevorzugt, dass die Spenderzellen synchronisiert sind. Wenn man Spenderzellen an bestimmten Phasen des Zellzyklus, z.B. der G₁-Phase, einsetzt, lassen sich die Spenderzellen synchronisieren. Man kann die Spenderzellen synchronisieren, indem man den Spenderzellen eine ausreichende Menge an Nährstoffen im Medium vorenthält (z.B. reduziert), die ihnen die Teilung erlauben. Haben die Spenderzellen erst einmal aufgehört, sich zu teilen, dann werden die Spenderzellen einem Medium (Serum) ausgesetzt, das eine ausreichende Menge an Nährstoffen enthält, um ihnen die Teilung (z.B. Mitose) zu erlauben. Die Spenderzellen beginnen mit der Mitose im Wesentlichen zu derselben Zeit und sind daher synchron. Die Spenderzellen erleiden z.B. einen Mangel an ausreichender Konzentration an Serum, wenn man die Zellen für etwa eine Woche in 0,5% fötales Rinderserum (FBS) gibt. Danach werden die Zellen in etwa 10% FBS gegeben und sie beginnen etwa zur gleichen Zeit sich zu teilen. Sie treten etwa zur gleichen Zeit in die G₁-Phase ein und sind daher für den Klonierungsprozess bereit. Zu genauen Angaben über das Synchronisieren der Spenderzellen siehe den Abschnitt mit den Beispielen.
Verfahren zur Bestimmung, in welcher Phase des Zellzyklus sich eine Zelle befindet, sind dem Fachmann bekannt, z.B. aus dem US-Patent 5,843,705 von DiTullio et al., Campbell, K. H. S. et al., Embryo Transfer Newsletter, Bd. 14(1): 12-16 (1996), Campbell, K. H. S. et al., Nature, 380: 64-66 (1996), Cibelli, J. B. et al., Science, 280: 1256-1258 (1998), Yong, Z. und L. Yugiang, Biol. of Reprod., 58: 266-269 (1998) und Milmut, I.. et al., Nature, 385: 810-813 (1997). Wie weiter unten in den Beispielen beschrieben, gibt es z.B. in den verschiedenen Phasen des Zellzyklus verschiedene Marker. Solche Marker können die Cycline D1, 2, 3 und das Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) für die G₁-Phase sein sowie BrDu, um eine DNA-Syntheseaktivität nachzuweisen. Darüber hinaus lassen sich Zellen induzieren, um in die G₀-Phase einzutreten, indem die Zellen auf einem serumarmen Medium kultiviert werden. Alternativ lassen sich Zellen in der G₀-Phase induzieren, um über eine Serumaktivierung in den Zellzyklus, d.h. in die G₁-Phase, einzutreten (z.B. indem man die Zellen einem Serum aussetzt, nachdem ihnen eine bestimmte Menge an Serum vorenthalten worden war).
Die Spenderzelle kann jede Art von Zelle sein, die ein genomisches oder genetisches Material (z.B. eine Nucleinsäure) enthält, wie z.B. eine somatische Zelle, eine Keimzelle oder eine Stammzelle. Der hier verwendete Begriff "somatische Zelle" bezieht sich auf eine differenzierte Zelle. Die Zelle kann eine somatische Zelle sein oder eine Zelle, die von einer somatischen Zelllinie abstammt. Alternativ kann in jedem der hier beschriebenen Verfahren eine diploide Stammzelle eingesetzt werden, welche eine Keimzelle ausbilden kann, um das Genom zur Gewinnung eines Kerntransfer-Embryos zu liefern. Die somatische Zelle kann von einem Tier oder von einer Zelle und/oder einem Gewebskultursystem stammen. Wird sie einem Tier entnommen, kann sich das Tier in jeder Entwicklungsstufe befinden, z.B. von einem Embryo, einem Fötus oder einem Erwachsenen. Zusätzlich können in der vorliegenden Erfindung somatische Embryozellen eingesetzt werden. Embryozellen können sowohl embryonische Stammzellen als auch von einer somatischen Zelllinie abstammende Embryozellen umfassen. Derartige Zellen können aus dem Endoderm, dem Mesoderm oder dem Ektoderm des Embryos erhalten werden. Von einer somatischen Zelllinie abstammende Embryozellen betreffen Zellen, welche ungefähr am zehnten Tag nach der Embryogenese oder danach isoliert wurden. Es können jedoch Zellen vor dem zehnten Tag der Embryogenese erhalten werden. Wird eine Zelllinie als Quelle für ein chromosomales Genom verwendet, sind Primärzellen bevorzugt. Der hier verwendete Ausdruck "primäre Zelllinie" umfasst sowohl Primärzellen als auch von Primärzellen abstammende Zelllinien.
Geeignete somatische Zellen umfassen Fibroblasten (z.B. primäre Fibroblasten), Epithelzellen, Muskelzellen, Cumuluszellen, Nervenzellen und Brustzellen. Andere geeignete Zellen sind Hepatocyten und Inselzellen des Pankreas.
Das Genom der somatischen Zelle kann das natürlich vorkommende Genom sein, z.B. für die Erzeugung von geklonten Tieren, oder das Genom kann genetisch verändert sein und eine transgene Sequenz umfassen, z.B., wie weiter unter beschrieben, für die Erzeugung von transgenen geklonten Tieren.
Die somatischen Zellen lassen sich z.B. mittels Zerstückelung von Gewebe mit mechanischen (z.B. Zerhacken, Zerschneiden) oder enzymatischen Mitteln (z.B. Trypsinisierung) erhalten, um eine Zellsuspension zu erhalten, gefolgt von einer Kultur der Zellen, bis eine konfluente Monoschicht erhalten wird. Die somatischen Zellen können dann geerntet und für eine Kältekonservierung hergerichtet oder als Stammkultur gehalten werden. Die Isolierung von somatischen Zellen, wie z.B. von Fibroblasten, wird hier beschrieben.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oocyten sind aktivierte Oocyten. Aktivierte Oocyten befinden sich in einem Teilungsstadium der meiotischen Zellteilung und umfassen die Metaphase I, die Anaphase I, die Anaphase II und vorzugsweise die Telophase II. Man geht davon aus, dass sich die Oocyten in der Metaphase II in einem Ruhezustand befinden.
Die Oocyten können sich im Ruhezustand der Metaphase II befinden und dann unter Einsatz der hier beschriebenen Verfahren aktiviert werden. Das Stadium, in welchem sich die Oocyte befindet, lässt sich durch visuelle Beobachtung der Oocyte bei einer geeigneten Vergrößerung ermitteln. Oocyten, die sich in der Telophase II befinden, werden z.B. durch das Vorkommen einer Vorwölbung der Plasmamembran eines zweiten Polkörpers identifiziert. Verfahren zur Identifizierung des Stadiums der meiotischen Zellteilung sind im Stand der Technik bekannt.
Oocyten werden aktiviert, indem man sie steigenden Calciumkonzentrationen aussetzt. Steigende Konzentrationen von Calcium, z.B. zwischen etwa 10% und etwa 60% über der Basislinie induzieren die Aktivierung oder die meiotische Zellteilung der Oocyte. Die Konzentrationen an der Basislinie sind solche Konzentrationen von Calcium, wie sie in einer inaktiven Oocyte gefunden werden. Steigende Konzentrationen von Calcium zusammen mit einer abnehmenden Phosphorylierungsrate erleichtern zusätzlich die Aktivierung der Oocyte. Es gibt verschiedene Verfahren, mit denen sich eine Aktivierung der Oocyte durchführen lässt. Insbesondere ist ein Calciumionophor (z.B. Ionomycin) ein Mittel, das die Durchlässigkeit der Oocytenmembran erhöht und Calcium den Eintritt in die Oocyte ermöglicht. Wenn die Konzentration an freiem Calcium in der Zelle zunimmt, während diese dem Ionophor ausgesetzt wird, wird die Oocyte nach der Abnahme der MPF-Aktivität (Maturation Promoting Factor) aktiviert. Derartige Verfahren zur Aktivierung werden in dem US-Patent Nr. 5,496,720 beschrieben. Ethanol hat eine ähnliche Wirkung. Vor oder nach der Entfernung des Kerns lässt sich eine Oocyte in der Metaphase II gemäß der Aktivierungsbehandlung mit Ethanol, wie sie in Presicce und Yang, Mol. Reprod. Dev., 37: 61-68 (1994) und in Bordignon & Smith, Mol. Reprod. Dev., 49: 29-36 (1998) beschrieben wird, mit Ethanol aktivieren. Eine Calcium-Exposition der Oocyte lässt sich auch über eine elektrische Stimulierung bewirken. Die elektrische Stimulierung bewirkt den Eintritt steigender Konzentrationen von Calcium in die Oocyte.
Oocyten lassen sich aus Spendertieren während deren Reproduktionszyklus erhalten. Beispielsweise lassen sich Oocyten zu bestimmten Zeiten während des Reproduktionszyklus (exogen Hormon-stimuliert oder nicht stimuliert) von den Follikeln der Ovarien absaugen. Ebenfalls zu einer bestimmten Zeit nach der Ovulation befindet sich z.B. ein beträchtlicher Prozentsatz der Oocyten in der Telophase. Darüber hinaus lassen sich Oocyten erhalten und dann induzieren, um sie in vitro bis zum angehaltenen Stadium der Metaphase II reifen zu lassen. Die in vivo oder in vitro erzeugten Oocyten im angehaltenen Stadium der Methaphase II lassen sich dann in vitro induzieren, um in die Telophase einzutreten. Somit lassen sich in der Telophase befindliche Oocyten zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung leicht erhalten. Insbesondere lassen sich Oocyten nach Superovulationen von einem weiblichen Tier sammeln. Oocyten lassen sich auf chirurgischem Wege gewinnen, indem die Oocyten aus dem Eileiter eines weiblichen Spenders ausgespült werden. Verfahren zum Auslösen von Superovulationen bei z.B. Ziegen und das Einsammeln der Oocyten werden hier beschrieben.
Vorzugsweise steht das Zellstadium der aktivierten Oocyten mit dem Stadium des Zellzyklus der aktivierten Spenderzelle in Korrelation. Diese Korrelation zwischen dem meiotischen Stadium der Oocyte und dem Mitose-Stadium der Spenderzelle wird hier auch als "Synchronisation" bezeichnet. Beispielsweise liefert eine mit dem Genom einer Spenderzelle in G₁ vor START fusionierte Oocyte in der Telophase eine Synchronisation zwischen der Oocyte und den Kernen des Spenders ohne eine Kondensation des Chromatins (PCC, Premature Chromatin Condensation) und eine Auflösung der Kernmembran (NEBD, Nuclear Envelope Breakdown).
In der vorliegenden Erfindung wird eine Oocyte verwendet, aus welcher der Kern entfernt worden ist. Eine vom Kern befreite Oocyte weist kein Genom auf oder ist "funktionell ohne Kern". Eine Oocyte, die funktionell ohne Kern ist, enthält ein nicht funktionelles Genom, sie kann z.B. keine DNA replizieren oder synthetisieren. Siehe z.B. Bordignon, V. und L. C. Smith, Molec. Reprod. Dev., 49: 29-36 (1998). Vorzugsweise wird das Genom der Oocyte aus der Oocyte entfernt. Das Genom einer Oocyte lässt sich durch Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, Laserbestrahlung, physikalische Entfernung des Genoms oder mit chemischen Mitteln funktionell ausschalten. Andere bekannte Verfahren der Entkernung können mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, um die Oocyte von ihrem Kern zu befreien.
Die Oocyte lässt sich auch funktionell inaktivieren, indem z.B. das endogene Kernmaterial in der Oocyte bestrahlt wird. Verfahren zur Verwendung von Strahlung sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. in Bradshaw et al., Molecul. Reprod. Dev., 41: 503-512 (1995) beschrieben.
Um das Genom einer Oocyte physikalisch zu entfernen, kann man eine Mikropipette oder Nadel in die Zona pellicuda der Oocyte einführen, um aus der Oocyte das Kernmaterial zu entfernen. In einem Beispiel können Oocyten in der Telophase mit zwei Polkörpern mit einer Mikropipette oder einer Nadel von ihrem Kern befreit werden, indem der zweite Polkörper im umgebenden Cytoplasma entfernt wird. Speziell lassen sich Oocyten im Stadium der Telophase der Meiose zu jedem Zeitpunkt von ihrem Kern befreien, beginnend bei der Vorwölbung der Plasmamembran aus dem zweiten Polkörper bis zur Bildung des zweiten Polkörpers selbst. Daher werden hier Oocyten, welche eine Vorwölbung der Plasmamembran zeigen, an der gewöhnlich eine Spindel befestigt ist, bis zur Ausbildung eines zweiten Polkörpers als Oocyten in der Telophase angesehen. Verfahren zur Befreiung einer Oocyte von ihrem Kern werden genauer in dem Abschnitt mit den Beispielen beschrieben.
Die Oocyte kann auch mit chemischen Methoden inaktiv gemacht werden. Dem Fachmann sind Verfahren zur chemischen Inaktivierung der DNA bekannt. Beispielsweise kann eine chemische Inaktivierung unter Einsatz der bei Fulka und Moore, Molecul. Reprod. Dev., 34: 427-430 (1993) beschriebenen Etopsoid-Cycloheximid-Methode erfolgen. Die vorliegende Erfindung umfasst das Entkernen des Genoms einer Oocyte durch Behandlung der Oocyte mit einer Verbindung, welche das Oocytengenom (z.B. das Chromatin) dazu bringt, während des meiotischen Reifungsprozesses sich in die Polarkörper aufzuspalten, wodurch die Oocyte von einem funktionellen Genom frei gehalten wird und dazu geführt wird, einen Empfängercytoplasten für den Einsatz in Kerntransfer-Verfahren zu bilden. Beispiele für Wirkstoffe, die eine solche differentielle Aufspaltung bewirken sind Mittel, welche 1) die Strukturen des Cytoskeletts aufreißen, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, Taxol^® (z.B. Paclitaxel), Demecolcin, Phalloidin, Colchicin, Nocodozol, Cytochalasine und 2) den Stoffwechsel zum Erliegen bringen, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, Cycloheximid und Tunicamycin. Darüber hinaus werden in dem bevorzugten Verfahren auch mit umfasst, dass die Oocyten anderen Wirkstoffen oder Bedingungen (z.B. eine Erhöhung oder Abnahme von Temperatur, pH und Osmolalität) ausgesetzt werden, welche vorzugsweise die asymmetrische Aufspaltung des Oocytengenoms induzieren, so dass sie von den Rändern der Oocyte herausgepresst werden (z.B. zu Polkörpern). Zu Verfahren, welche die Änderungen im Cytoskelett und des Stoffwechsels von Zellen umfassen und dem Fachmann bekannt sind, siehe z.B. Andreau, J. M. und Timasheff, SN, Proc. Nat. Acad. Sci. 79: 6753 (1982); Obrig TG. et al., J. Biol. Chem. 246: 174 (1971), Duskin, D. und Mahoney, WC, J. Biol. Chem. 257: 3105 (1982), Scialli, AR et al., Teratogen, Carcinogen, Mutagen 14: 23 (1994), Nishiyama, I. und Fujii, T., Exp. Cell Res. 198: 214 (1992), Small, JV et al., J. Cell Sci. 89: 21 (1988) und Lee, JC et al., Biochem. 19: 6209 (1980).
Die Kombination der aktivierten kernfreien Oocyte mit dem Genom aus der aktivierten Spenderzelle zur Bildung des Kerntransfer-Embryos kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Das Genom einer aktivierten Spenderzelle kann mittels Einsatz eines Mikroinjektors (z.B. einer Mikropipette oder Nadel) in die aktivierte Oocyte injiziert werden. Das Kerngenom der aktivierten Spenderzelle, z.B. einer somatischen Zelle, wird durch Einsatz einer Mikropipette oder Nadel extrahiert. Ist es erst einmal extrahiert, kann das Kerngenom des Spenders sodann in die aktivierte Oocyte eingebracht werden, indem die Mikropipette oder Nadel in die Oocyte eingeführt und das Kerngenom der Spenderzelle freigesetzt wird. McGrath, J. und D. Solter, Science, 226: 1317-1319 (1984).
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Kombination des Genoms einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten Oocyte mit Hilfe einer Fusion, z.B. einer Elektrofusion, einer viralen Fusion, einer liposomalen Fusion, einer Fusion mit biochemischen Reagenzien (z.B. dem Phytohämaglutinin (PHA)-Protein), oder einer chemischen Fusion (z.B. mit Polyethylenglykol (PEG) oder Ethanol). Der Kern der Spenderzelle kann innerhalb der Zona pelliduca abgelegt werden, welche die Oocyte enthält. Die Schritte der Fusion des Kerns mit der Oocyte können dann durchgeführt werden, indem ein elektrisches Feld angelegt wird, welches ebenfalls zu einer zweiten Aktivierung der Oocyte führt. Die verwendeten Oocyten in der Telophase sind bereits aktiviert, daher würde jede Aktivierung nach oder gleichzeitig mit der Einführung des Genoms aus einer somatischen Zelle als zweite Aktivierung angesehen. Bezüglich der Elektrofusion sind Kammern wie z.B. das BTX^® 200-Embryomanipulations-System zur Durchführung der Elektrofusion im Handel erhältlich, z.B. von BTX^®, San Diego. Die Kombination des Genoms der aktivierten Spenderzelle mit der aktivierten Oocyte führt zu einem Kerntransfer-Embryo.
Ein Kerntransfer-Embryo der vorliegenden Erfindung wird sodann in ein weibliches Empfängertier transferiert und zu einem geklonten oder transgenen Tier sich entwickeln oder reifen gelassen. Geeignete Bedingungen für die Reifung sind Bedingungen, unter denen sich der Embryo zu einem Fötus und gegebenenfalls zu einem lebenden Tier entwickeln und reifen kann. Solche Bedingungen werden in dem Abschnitt mit den Beispielen näher beschrieben und sind im Stand der Technik bekannt. Der Kerntransfer-Embryo kann z.B. wie in dem Abschnitt mit den Beispielen beschrieben über die Fimbrien in das Lumen des Eileiters von jedem weiblichen Empfängertier transferiert werden. Darüber hinaus werden, wie dem Fachmann bekannt, Verfahren zum Transfer eines Embryos auf einen Empfänger in Ebert et al., Bio/Technology, 12: 699 (1994) beschrieben. Der Kerntransfer-Embryo kann bis mindestens zur ersten Teilung (Zweizellen-Stadium) bis zum Blastozysten-Stadium in einem Kultursystem gehalten werden, vorzugsweise werden die Embryonen im Zweizellen- oder Vierzellen-Stadium transferiert. Dem Fachmann sind verschiedene Kulturmedien zur Entwicklung von Embryonen bekannt. Der Kerntransfer-Embryo kann z.B. zusammen mit einem Monolayer aus Epithelzellen des Eileiters kultiviert werden, die von der Tierart stammen, welche vom Ausführenden vorgesehen sind. Verfahren zum Erhalt von Eileiter-Epithelzellen der Ziege (GOEC), mit welchen die Zellen in einer Cokultur gehalten werden, werden z.B. in den Beispielen weiter unten beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Gewinnung transgener Tiere durch eine Kombination einer aktivierten Oocyte mit einem gentechnisch veränderten Genom aus einer aktivierten Spenderzelle. Eine derartige Kombination führt zu einem transgenen Kerntransfer-Embryo. Ein transgenes Tier ist ein Tier, welches aus einem Genom aus einer Spenderzelle erzeugt wurde, die genetisch verändert worden ist, um z.B. ein besonderes Protein (ein gewünschtes Protein) zu produzieren. Verfahren zur Einführung eines DNA-Konstrukts in die Keimbahn eines Tieres zur Erzeugung eines transgenen Tieres sind im Stand der Technik bekannt. Beispielsweise lassen sich eine oder mehrere Kopien des Konstrukts mit standardisierten transgenen Techniken in das Genom eines Tierembryos einbauen.
Es lassen sich embryonale Zielzellen mit verschiedenen Stadien der Entwicklung einsetzen, um Transgene einzuführen. Ein Transgen ist ein Gen, welches das gewünschte Protein produziert und gegebenenfalls in das Genom der aktivierten Oocyte eingebaut ist. Je nach dem Entwicklungsstadium der embryonalen Zielzelle werden unterschiedliche Verfahren verwendet. Die spezielle(n) Zelllinie(n) von jedem Tier, die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt wurden, werden nach dem allgemeinen guten Gesundheitszustand, guten Ausbeuten an Embryonen, der guten Erkennbarkeit eines Vorkerns im Embryo und einer guten reproduktiven Kondition ausgewählt. Darüber hinaus ist der Haplotyp ein bedeutender Faktor.
Gentechnisch veränderte Spenderzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung lassen sich aus einer Zelllinie erhalten, in welche eine bestimmte Nucleinsäure, z.B. eine ein Protein kodierende Nucleinsäure, eingeführt worden ist.
Ein Konstrukt lässt sich in eine Zelle über herkömmliche Transformations- oder Transfektions-Techniken einführen. Die hier verwendeten Ausdrücke "Transfektion" und "Transformation" umfassen verschiedene Techniken zur Einführung einer transgenen Sequenz in eine Wirtszelle, einschließlich die Copräzipitation mit Calciumphosphat oder Calciumchlorid, die DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, die Lipofektion oder die Elektroporation. Darüber hinaus lassen sich, wie weiter unten beschrieben, biologische Vektoren wie z.B. virale Vektoren einsetzen. Proben von Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen stehen in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual In Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). Zwei nützliche und praktische Verfahren zur Einführung von genetischem Material in eine Zelle stellen die Elektroporation und die Lipofektion dar.
Das DNA-Konstrukt lässt sich mit Hilfe der Elektroporation unter Verwendung der folgenden Vorschrift stabil in eine Spenderzelllinie einführen: Die Spenderzellen, z.B. embryonische Fibroblasten, werden mit etwa 4 × 10⁶ Zellen pro ml in phosphatgepufferter Saline (PBS) resuspendiert. 50 μg der linearisierten DNA werden der Zellsuspension von 0,5 ml zugesetzt und die Suspension in eine Küvette mit einem Elektrodenspalt von 0,4 cm gegeben. Die Elektroporation wird mit Hilfe eines BioRad-Gene-Pulser-Elektroporators (BioRad) mit einem Puls von 330 Volt bei 25 mA, 1000 μF und unendlichem Widerstand durchgeführt. Falls das DNA-Konstrukt ein Neomycin-Resistenzgen für die Selektion enthält, werden nach der Inkubation mit 350 mg/ml G418 (GIBCO BRL) über einen Zeitraum von 15 Tagen neomycinresistente Klone selektiert.
Das DNA-Konstrukt lässt sich mit Hilfe der Lipofektion unter Verwendung der folgenden Vorschrift stabil in eine somatische Spenderzelllinie einführen: Etwa 2 × 10⁵ Zellen werden in eine Vertiefung mit einem Durchmesser von 3,5 cm plattiert und unter Einsatz eines LipfectAMINE^® (GIBCO BRL) mit 2 mg linearisierter DNA transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen 1:1000 und 1:5000 aufgeteilt und, falls das DNA- Konstrukt ein Neomycin-Resistenzgen für die Selektion enthält, G418 bis zu einer Endkonzentration von 0,35 mg/ml zugesetzt. Die neomycinresistenten Klone werden isoliert und für eine Kryokonservierung sowie einen Kerntransfer vervielfältigt.
Es ist oft erwünscht, ein Protein, z.B. ein heterologes Protein, in einem speziellen Gewebe oder einer Flüssigkeit, wie z.B. der Milch eines transgenen Tieres, zu exprimieren. Ein heterologes Protein ist von einer anderen Spezies als die klonierte Spezies. Das heterologe Protein lässt sich aus dem Gewebe oder der Flüssigkeit, in welchem es exprimiert wird, gewinnen, Es ist z.B. oft erwünscht, das heterologe Protein in Milch zu exprimieren. Ein Verfahren zur Produktion von heterologen Proteinen unter der Kontrolle eines milchspezifischen Promotors wird weiter unten beschrieben. Zusätzlich werden weiter unten andere gewebsspezifische Promotoren sowie andere regulatorische Elemente, wie z.B. Signalsequenzen und Sequenzen beschrieben, welche die Sekretion von nicht ausgeschiedenen Proteinen begünstigen. Das transgene Produkt (z.B. ein heterologes Protein) lässt sich exprimieren und daher aus verschiedenen Geweben, Zellen oder Körperausscheidungen der transgenen Tiere gewinnen. Beispiele für solche Gewebe, Zellen oder Ausscheidungen sind das Blut, der Urin, das Haar, die Haut, die Milchdrüsen, die Muskeln oder die Eingeweide (oder eine Gewebskomponente derselben), einschließlich, aber nicht ausschließlich, das Hirn, das Herz, die Lungen, die Nieren, der Pankreas, die Gallenblase, die Leber, der Magen, das Auge, der Dickdarm, der Dünndarm, die Harnblase, der Uterus und die Hoden. Die Gewinnung eines transgenen Produkts aus diesen Geweben sind dem Fachmann vertraut, siehe z.B. Ausubel, F. M. et al., (Hrsg), Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Kapitel 10 (1991).
Nützliche Transskriptionspromotoren sind solche Promotoren, welche vorzugsweise in den Epithelzellen der Brust aktiviert werden, einschließlich der Promotoren, die Gene kontrollieren, welche Proteine wie Kaseine, β-Lactoglobulin (Clark et al., Bio/Technology, 7: 487-492 (1989), saure Molkeproteine (Gordon et al., Bio/Technology, 5: 1183-1187 (1987) und Lactalbumin (Soulier et al., Febs Ltts., 297: 13 (1992)) codieren. Die Kaseinpromotoren können von den Alpha-, Beta-, Gamma- oder Kappa-Kasein-Genen von jeder Tier-Spezies stammen; ein bevorzugter Promotor stammt von dem β-Kaseingen der Ziege (Ditullio, Bio/Technology, 10: 74-77 (1992)). Der milchspezifische Proteinpromotor oder die Promotoren, welche spezifisch in Brustgewebe aktiviert werden, können von cDNA oder von genomischen Sequenzen stammen.
Informationen über die DNA-Sequenz in mindestens einem und oft in einigen Organismen sind für die oben angeführten brustdrüsenspezifischen Gene verfügbar. Siehe z.B. Richards et al., J. Biol. Chem., 256: 526-532 (1981) (α-Lactalbumin aus Ratten); Campbel et al., Nucleic Acids Res., 12: 8685-8697 (1984) (WAP-Ratte); Jones et al., J. Biol. Chem., 260: 7042-7050 (1985) (β-Kasein aus Ratten); Yu-Lee und Rosen, J. Biol. Chem., 258: 10794-10804 (1983) (α-Kasein aus Ratten); Hall, Bio. Chem. J., 242: 735-742 (1987) (menschliches α-Lactalbumin); Stewart, Nucleic Acids Res., 12: 389 (1984) αS1- und κ1-Kasein aus Rindern, cDNAs); Gorodetsky et al., Gene, 66: 87-96 (1988) β-Kasein aus Rindern); Alexander et al., Eur. J. Biochem., 178: 395-401 (1988) (Kasein aus Rindern und κ-Kasein); Brignon et al., Febs Let., 188: 48-55 (1977) (αS2- Kasein aus Rindern); Gamieson et al., Gene, 61: 85-90 (1987); Ivanov et al., Biol. Chem. Hopp-Seylar, 369: 425-429 (1988); Alexander et al., Nucleic Acid Res., 17: 6739 (1989) (β-Lactoglobulin aus Rindern); Vilotte et al., Biochimie, 69: 609-620 (1987) (α-Lactalbumin aus Rindern).
Einen Überblick über die Struktur und Funktion der verschiedenen Milchproteingene wird von Mercier & Vilotte, J. Dairy Sci., 76: 3079-3098 (1993) gegeben. Falls zusätzliche flankierende Sequenzen für die Optimierung der Expression von heterologem Protein nützlich sind, lassen sich derartige Sequenzen klonen, indem die vorhandenen Sequenzen als Sonden eingesetzt werden. Milchdüsenspezifische regulatorische Sequenzen aus unterschiedlichen Organismen können erhalten werden, wenn mit Hilfe bekannter verwandter Nucleotidsequenzen Bibliotheken von solchen Organismen durchsucht werden, oder Antikörper gegen verwandte Proteine als Sonden eingesetzt werden.
Es können nützliche Signalsequenzen wie z.B. milchspezifische Signalsequenzen oder andere Signalsequenzen eingesetzt werden, die zu der Sekretion von eukaryotischen oder prokaryotischen Proteinen führen. Vorzugsweise wird die Signalsequenz aus milchspezifischen Signalsequenzen ausgewählt, d.h., sie stammt aus einem Gen, das ein in die Milch ausgeschiedenes Produkt codiert. Am meisten bevorzugt ist die milchspezifische Signalsequenz mit dem in dem Konstrukt eingesetzten milchspezifischen Promotor verwandt. Die Größe der Signalsequenz ist nicht kritisch. Alles was verlangt wird ist, dass die Sequenz eine ausreichende Größe hat, um die Ausscheidung des gewünschten rekombinanten Proteins, z.B. im Brustgewebe, zu bewirken. Beispielsweise können Signalsequenzen von Genen eingesetzt werden, welche Kaseine wie z.B. α-, β-, γ- oder κ- Kaseinen und dergl. codieren. Eine bevorzugte Signalsequenz ist die β-Kasein-Signalsequenz der Ziege. Es können auch Signalsequenzen von anderen ausgeschiedenen Proteinen eingesetzt werden, z.B. von Nierenzellen, Pankreaszellen oder Leberzellen ausgeschiedene Proteinen. Vorzugsweise führt die Signalsequenz zur Ausscheidung von Proteinen in z.B. den Urin oder das Blut.
Ein nicht ausgeschiedenes Protein kann auch so modifiziert werden, dass es ausgeschieden wird, indem z.B. die ganze codierende Sequenz eines Proteins oder ein Teil davon, welche normalerweise ausgeschieden wird, in das auszuscheidende Protein eingebaut wird. Vorzugsweise ist die ganze Sequenz des Proteins, das normalerweise ausgeschieden wird, nicht in der Sequenz des Proteins enthalten, sondern eher nur ein ausreichender Anteil des Aminoendes des Proteins, das normalerweise ausgeschieden wird, um zu einer Ausscheidung des Proteins zu führen. Beispielsweise wird ein Abschnitt, der normalerweise ausgeschieden wird, (gewöhnlich an seinem Amino-Terminus), an einen aminoendständigen Abschnitt des Proteins fusioniert, das normalerweise ausgeschieden wird.
In einem Aspekt ist das normalerweise ausgeschiedene Protein ein Protein, das normalerweise in Milch ausgeschieden wird. Derartige Proteine sind durch die Epithelzellen der Brust ausgeschiedene Proteine, Milchproteine wie Kaseine, β-Lactoglobulin, saure Molkeproteine und Lactalbumin. Die Kaseinproteine, welche α-, β-, γ- oder κ-Kasein umfassen, stammen von Genen von jeder Säugetierspezies. Das bevorzugte Protein ist β-Kasein, z.B. das β-Kasein der Ziege. Die Sequenzen, welche das ausgeschiedene Protein codieren, können entweder von cDNA oder von genomischen Sequenzen stammen. Vorzugsweise sind sie genomischen Ursprungs und umfassen eines oder mehrere Introns.
Es können andere gewebsspezifische Promotoren eingesetzt werden, welche für eine Expression in einem besonderen Gewebe sorgen. Gewebsspezifische Promotoren sind Promotoren, die in einem besonderen Gewebe stärker als in anderen Geweben exprimiert werden. Gewebsspezifische Promotoren werden oft ausschließlich nur in dem spezifischen Gewebe exprimiert.
Gewebsspezifische Promotoren, die eingesetzt werden können, sind: ein nervenspezifischer Promotor, z.B. Nestin, Wnt-1, Pax-1, Engrailed 1, Engrailed 2, Sonic-Hedgebog; ein leberspezifischer Promotor, z.B. Albumin, Alpha-1, Antitrypsin; ein muskelspezifischer Promotor, z.B. Myogenin, Actin, MyoD, Myosin; ein oocytenspezifischer Promotor, z.B. ZP1, ZP2, ZP3; ein hodenspezifischer Promotor, z.B. Protamin, Fertilin, synaptonemales Kompex-Protein-1; ein blutspezifischer Promotor, z.B. Globulin, GATA-1, Porphobilinogen-Deaminase; ein lungenspezifischer Promotor, z.B. Surfactin-Protein-C; ein haut- oder wollspezifischer Promotor, z.B. Keratin, Elastin; ein endothelspezifischer Promotor, z.B. TIE-1, TIE-2 und ein knochenspezifischer Promotor, z.B. BMP. Zusätzlich können allgemeine Promotoren für die Expression in einigen Geweben zum Einsatz kommen. Beispiele für allgemeine Promotoren sind β-Actin, ROSA-21, PGK, FOS, c-myc, Jun-A und Jun-B.
Eine Kassette, die ein heterologes Protein codiert, kann als einem Konstrukt aufgebaut sein, das einen Promotor für ein spezifisches Gewebe, wie z.B. die Epithelzellen der Brust oder einen Caseinpromotor umfasst. Das Konstrukt kann auch downstream von der die nicht ausgeschiedenen Proteine codierenden DNA-Sequenz eine am 3'-Ende nicht translatierte Region umfassen. Solche Regionen können das RNA-Transkript des Expressionssystems stabilisieren und somit die Ausbeute des gewünschten Proteins aus dem Expressionssystem steigern. Unter den am 3'-Ende nicht translatierten Regionen, die in den Konstrukten zur Verwendung in der Erfindung von Nutzen sind, sind Sequenzen, die ein PolyA-Signal liefern. Solche Sequenzen können z.B. von dem SV40 Small t antigen, der am 3'-Ende nicht translatierten Region von Casein oder anderen im Stand der Technik bekannten am 3'-Ende nicht translatierten Sequenzen stammen. In einem Aspekt stammt die am 3'-Ende nicht translatierte Region von einem milchspezifischen Protein. Die Länge der am 3'-Ende nicht translatierten Region ist nicht kritisch, die stabilisierende Wirkung ihres PolyA-Transkripts scheint jedoch für die Stabilisierung der RNA der Expressionssequenz von Bedeutung zu sein.
Wahlweise kann das Konstrukt eine am 5'-Ende nicht translatierte Region zwischen dem Promotor und der die Signalsequenz codierenden DNA-Sequenz umfassen. Solche nicht translatierten Regionen können von der gleichen Kontrollregion sein wie die, aus welcher der Promotor entnommen ist, oder sie können von einem unterschiedlichen Gen sein, z.B. können sie von anderen synthetischen, halbsynthetischen oder natürlichen Quellen stammen. Erneut ist ihre spezifische Länge nicht kritisch, sie scheinen jedoch für ein höheres Ausmaß der Expression von Nutzen zu sein.
Das Konstrukt kann auch etwa 10%, 20%, 30% oder mehr der den N-Terminus codierenden Region eines Gens umfassen, welches vorzugsweise in den Epithelzellen der Brust exprimiert wurde. Die den N-Terminus codierende Region kann z.B. dem eingesetzten Promotor entsprechen, beispielsweise einer den N-Terminus des β-Kaseins der Ziege codierenden Region.
Das Konstrukt lässt sich mit Hilfe von dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Das Konstrukt kann als Teil eines größeren Plasmids hergestellt werden. Mit einer solchen Herstellung lassen sich die richtigen Konstruktionen wirkungsvoll klonieren und selektieren. Das Konstrukt kann zwischen passenden Restriktionsstellen auf dem Plasmid angeordnet sein, so dass es zum Einbauen in das gewünschte Tier leicht von den restlichen Plasmidsequenzen isoliert werden kann.
Heterologe Proteine codierende transgene Sequenzen können in die Keimbahn eines Tieres eingeführt oder in eine Zelllinie transfiziert werden, um wie oben beschrieben, eine Quelle für gentechnisch veränderte Spenderzellen zu erhalten. Das Protein kann ein Komplex oder ein multimeres Protein wie ein homo- oder heteromultimeres Protein sein. Das Protein kann ein Protein sein, welches durch Entfernen des N-Terminus, des C-Terminus oder interner Fragmente weiterbehandelt wird. Sogar Komplexproteine lassen sich in aktiver Form exprimieren. Proteine codierende Sequenzen, welche in das Genom eines Tieres, wie z.B. einer Ziege eingebaut werden können, umfassen Sequenzen für Glykoproteine, Neuropeptide, Immunglobuline, Enzyme, Peptide und Hormone. Das Protein kann ein natürlich vorkommendes Protein oder ein rekombinantes Protein, wie z.B. ein Fragment oder ein Fusionsprotein (z.B. ein Immunglobulin-Fusionsprotein oder ein Muton) sein. Die das Protein codierende Nucleotidsequenz kann menschlichen oder nicht-menschlichen Ursprungs sein. Das heterologe Protein kann ein potentielles Therapeutikum oder Pharmazeutikum sein, wie z.B., jedoch nicht ausschließlich, der Alpha-1-Proteinase-Inhibitor, Alpha-1-Antitrypsin, alkalische Phosphatase, Angiogenin, Antithrombin III, jeder der Blutgerinnungsfaktoren einschließlich Faktor VIII, Faktor IX und Faktor X, Chitinase, Erythropoietin, extrazelluläre Superoxiddismutase, Fibrinogen, Glucocerebrosidase, Glutamatdecarboxylase, der menschliche Wachstumsfaktor, menschliches Serumalbumin, Immunglobulin, Insulin, basisches Myelin-Protein, Proinsulin, Prolactin, lösliches CD 4 oder eine Komponente oder ein Komplex desselben, Lactoferrin, Lactoglobulin, Lysozym, Lactalbumin, Gewebsplasminogenaktivator oder eine Variante desselben. Ein besonders bevorzugtes Protein ist ein Immunglobulin. Beispiele für Immunglobuline sind IgA, IgG, IgE, IgM, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, rekombinante Antikörper, einzelkettige Antikörper und Antikörper-Protein-Fusionen.
Informationen über die Nucleotidsequenzen für einige der die oben angeführten heterologen Proteine kodierenden Gene in mindestens einem und oft in mehreren Organismen sind verfügbar. Siehe z.B. Long et al., Biochem., 23(21): 4828-4837 (1984) (Alpha-1-Antitrypsin); Mitchell et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7182-7186 (1986) (alkalische Phosphatase); Schneider et al., Embo J., 7(13): 4151-4156 (1988) (Angiogenin); Bock et al., Biochem., 27(16): 6171-6178 (1988) (Antithrombin); Olds et al., Br. J. Haematol., 78(3): 408-413 (1991) (Antithrombin III); Lyn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82(22): 7580-7584 (1985) (Erythropoietin); US-Patent Nr. 5,614,184 (Erythropoietin); Horowitz et al., Genomics, 4(1): 87-96 (1989) (Glucocerebrosidase); Kelly et al., Ann. Hum. Genet., 56(3): 255-265 (1992) (Glutamatdecarboxylase); US-Patent Nr. 5,707,828 (menschliches Serumalbumin); US-Patent Nr. 5,652,352 (menschliches Serumalbumin); Lawn et al., Nucleic Acid Res., 9(22): 6103-6114 (1981) (menschliches Serumalbumin); Kamholz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83(13): 4962-4966 (1986) (basisches Myelin-Protein); Hiraoka et al., Mol. Cell Endocrinol., 75(1): 71-80 (1991) (Prolactin); US-Patent Nr. 5,571,896 (Lactoferrin); Pennica et al., Nature, 301(5897): 214-221 (1983) (Gewebsplasminogenaktivator); Sarafanov et al., Mol. Biol., 29: 161-165 (1995).
Ein transgenes Protein kann in dem transgenen geklonten Tier in relativ hohen Konzentrationen und in großen Volumina produziert werden, beispielsweise in Milch, welche eine kontinuierlich große Menge an normal verarbeitetem Protein liefert, das sich leicht aus einer erneuerbaren Quelle gewinnen lässt. Für die Isolierung von Proteinen aus Milch gibt es einige im Stand der Technik bekannte unterschiedliche Verfahren.
Milchproteine werden üblicherweise durch eine Kombination von Prozessen isoliert. Die Rohmilch wird zuerst fraktioniert, um z.B. durch Abschöpfen, Zentrifugieren und Sedimentieren (H. E. Swaisgood, Development in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY 1982), saures Fällen (US-Patent Nr. 4,644,056) oder enzymatisches Koagulieren mit Rennin oder Chymotrypsin (Swaisgood, ibid.) die Fette zu entfernen. Als nächstes können die hauptsächlichen Milchproteine entweder zu einer klaren Lösung oder zu einem komplexen Niederschlag fraktioniert werden, aus welchem sich das spezifische gewünschte Protein leicht reinigen lässt.
In dem französischen Patent Nr. 2 487 642 wird die Isolierung von Milchproteinen aus entrahmter Milch oder Molke beschrieben, indem eine Ultrafiltration zusammen mit einer Ausschlusschromatographie oder einer Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird. Die Molke wird zuerst gewonnen, indem das Kasein mittels Koagulation mit Lab oder Milchsäure koaguliert wird. In dem US-Patent Nr. 4,485,040 wird die Isolierung eines mit α-Lactoglobulin angereicherten Produkts in dem Retentat aus Molke mit Hilfe von zwei aufeinander folgenden Ultrafiltrationsschritten beschrieben. In dem US-Patent Nr. 4,644,056 wird ein Verfahren zur Reinigung von Immunglobulin aus Milch oder der Vormilch mittels saurer Fällung bei einem pH von 4,0-5,5 angegeben, gefolgt von einer nacheinander erfolgenden Querstromfiltration zuerst auf einer Membran mit einer Porengröße von 0,1-1,2 mm, um das Produkt zu klären, und dann auf einer Membran mit einer Trenngrenze von 5-80 kD, um es zu konzentrieren. Auf ähnliche Weise wird im US-Patent Nr. 4,897,465 die Aufkonzentrierung und Anreicherung eines Proteins, wie z.B. eines Immunglobulins aus Blutserum, Eigelb oder Molke mittels aufeinander folgender Ultrafiltration auf metallischen Oxidmembranen mit einer pH-Verschiebung gelehrt. Die Filtration erfolgt zuerst bei einem pH unter dem isoelektrischen Punkt (pI) des ausgewählten Proteins, um aus dem Retentat die massiven verunreinigenden Stoffe zu entfernen, sodann wird als nächstes der pH über den pI des ausgewählten Proteins angehoben, um die Verunreinigungen zurückzuhalten und das ausgewählte Protein zum Permeat passieren zu lassen. Ein unterschiedliches Filtrations-Konzentrierungs-Verfahren wird von dem europäischen Patent Nr. EP 467 482 B1 gelehrt, in welchem entfettete entrahmte Milch unter den pI des Milchproteins auf einen pH von 3-4 gebracht wird, um sowohl das Kasein als auch die Molkeproteine in Lösung zu bringen. In drei aufeinander folgenden Ultrafiltrationsdurchgängen finden eine Diafiltration und eine Aufkonzentrierung der Proteine statt, um ein Retentat mit 15-20% Feststoffen zu bilden, von denen 90% das Protein darstellt. Alternativ wird in der britischen Patentanmeldung Nr. 2179947 die Isolierung von Lactoferrin aus Molke mittels Ultrafiltration zur Aufkonzentrierung der Probe beschrieben, gefolgt von einer schwachen Kationenaustauscher-Chromatographie bei annähernd neutralem pH. In der PC-Veröffentlichung Nr. WO 95/22258 wird keine Reinigungsmaßnahme angegeben, ein Protein wie z.B. Lactoferrin wird aus Milch gewonnen, welche durch Zugabe eines konzentrierten Salzes auf eine hohe Ionenstärke eingestellt und danach einer Kationenaustauscher-Chromatographie unterzogen worden ist.
In allen diesen Verfahren werden zunächst Milch oder eine Fraktion derselben behandelt, um die Fette, Lipide und andere Teilchenstoffe zu entfernen, welche die Filtrationsmembranen oder das Chromatographiemedium verstopfen würden. Die so produzierten Anfangsfraktionen können aus Kasein, Molke oder Vollmilchprotein bestehen, aus denen das gewünschte Protein dann isoliert wird.
In der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 94/19935 wird ein Verfahren zur Isolierung eines biologisch aktiven Proteins aus Vollmilch offenbart, indem die Löslichkeit der Vollmilchproteine mit einem positiv geladenen Wirkstoff, wie z.B. Arginin, Imidazol oder Bis-Tris stabilisiert wird. Bei dieser Behandlung wird eine klare Lösung gebildet, aus welcher das Protein isoliert wird, beispielsweise mittels Filtration durch Membranen, welche sonst von den ausgefallenen Proteinen verstopft würden.
Verfahren zur Isolierung einer löslichen Milchkomponente, wie z.B. ein Peptid in seiner biologisch aktiven Form aus Vollmilch oder einer Milchfraktion mittels Querflussfiltration, sind bekannt. Anders als bei den vorhergehenden Isolierungsverfahren wird der Bedarf einer ersten Fraktionierung der Vollmilch zur Entfernung der Fettmizellen ausgeschaltet, wodurch das Verfahren vereinfacht wird, indem Verluste bei der Wiedergewinnung der biologischen Aktivität vermieden werden. Dieses Verfahren kann zusammen mit zusätzlichen Reinigungsschritten eingesetzt werden, um Verunreinigungen weiter zu entfernen und das Produkt zu reinigen (z.B. das erwünschte Protein).
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst Verfahren zum Entkernen einer aktivierten Oocyte, welche den Schritt umfassen, die Oocyte mit einer Verbindung in Kontakt zu bringen, welche den Spindelapparat der Meiose destabilisiert (ihn z.B. zerbricht oder demontiert). Das Zerbrechen des Spindelapparates der Meiose führt zu einem Zerbrechen der Mikrotubuli, Chromosomen und Centriolen. Eine derartige Verbindung macht den Kern funktionsunfähig. Beispiele für solche Verbindungen sind Cochicin, Pactiltaxel, Nocodazol und vorzugsweise Demecolcin.
Dieser Aspekt der Erfindung kann zusammen mit den hier beschriebenen Verfahren zum Entkernen eingesetzt werden. Beispielsweise kann sich eine aktivierte Oocyte für einen Kerntransfer hergerichtet werden, indem die Oocyte aktiviert wird (z.B. indem die Oocyte Ethanol oder einem Ionophor ausgesetzt wird) und die aktivierte Oocyte dann einer Verbindung ausgesetzt wird, welche den Spindelapparat der Meiose destabilisiert (z.B. Demecolcin). Ist die aktivierte Oocyte erst einmal gewonnen, kann sie mit dem Genom einer aktivierten Spenderzelle kombiniert werden, um einen Kerntransfer-Embryo zu erhalten.
Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sollen keineswegs einschränken.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: KLONIEREN VON MÄUSEN UNTER EINSATZ DES VERFAHRENS DER INDUZIERTEN ENUKLEATION
Fortschritte in der Methodik des Kerntransfers (NT) von somatischen Zellen zeigten sich bei einer Reihe von geklonten Schafen, Kühen, Mäusen und Ziegen. Trotz des klaren potentiellen Nutzens dieser Technologie für genetische Manipulationen bleiben die Erfolgsziffern erbärmlich niedrig. Die mit dem Kerntransfer einhergehenden Einschränkungen umfassen die Selektion und Gewinnung von fähigen Spendercytoplasten. Das Cytoplasma spielt eine lebenswichtige Rolle bei der Umprogrammierung und Reaktivierung des Genoms und daher sind Manipulationen, welche die Entwicklungsfähigkeit der Oocyten aufs Spiel setzen, für den Erfolg eines Kerntransfers schädlich. Die vorliegende Untersuchung zielte darauf ab, alternative Verfahren zu entwickeln, um für Kerntransfer-Verfahren fähige Cytoplasten effizienter herzustellen. In Versuch 1 wurden in vivo produzierte Maus-Oocyten in der Metaphase II (B6D2, Aguti, 16-20 Stunden nach hCG gewonnen) aktiviert, indem sie entweder 7% Ethanol oder 2 μm Ionomycin in PBS + 10% FBS ausgesetzt wurden (5 Minuten). Am Beginn der anfänglichen zweiten Polkörperbildung (10-15 Minuten nach der Aktivierung) und der Ausstoßung (Anaphase/Telophase-Stadium) wurden die Oocyten nach dem Zufallsprinzip einer Kontrolle zugeteilt (0,5-1,5 Stunden kultiviert) oder mit Taxol^® (5 μg/ml), Cycloheximid (10 μg/ml) oder in Demecolcin (0,4 μg/ml) in PBS + 10% FBS inkubiert, bis der zweite Polkörper ausgestoßen war (0,5-1,5 Stunden nach der Aktivierung), um die Befreiung von Kernchromatin zu induzieren. Die Oocyten wurden angefärbt (H33342, 5 μg/ml), um unter Einsatz der Fluoreszenzmikroskopie das Ausmaß der Befreiung von Kernchromatin zu bestätigen. Das Ausmaß der durch die Behandlung induzierten Befreiung von Kernchromatin betrug für die Kontrolle 3,7% (0-15%) für die Behandlung mit Taxol^® 3,6% (0-10%), für die Behandlung mit Cycloheximid 16,3% (0-24%) und für die Behandlung mit Demecolcin 54% (27-70%). In Versuch 2 wurden für die Kerntransfer-Empfänger mit Demecolcin induzierte vom Kern befreite Cytoplasten verwendet. Die Spenderkerne wurden aus Cumuluszellen (Black Swiss) durch teilweise Lyse (1% Natriumcitrat) und nachfolgendem Absaugen unter Verwendung einer Injektionspipette (7 μm) gewonnen. Die Spenderkerne wurden in mit Cytochalasin-B (5 μg/ml, 15 min) vorbehandelte Cytoplasten injiziert. Wiederhergestellte NT-Embryos wurden dann zusammen mit Eileiterzellen in Tropfen von M-199 + 10% FBS kultiviert (72-96 Stunden). Die Teilungsrate betrug 70% (85/121) und das Ausmaß der Blastocystenbildung 42% (51/121). Nach einem Embryo-Transfer in den Uterus (10 Embryos/Empfänger) wurden 2 von drei Empfängern trächtig (CD1, weiß). Insgesamt wurden 14 schwarze weibliche Junge geboren (47%, 14/30), von denen 7 von einem Empfänger tot geboren wurden und die anderen 7 lebend (23%, 7/30), aber 3 wurden binnen 24 Stunden von ihren eigenen Artgenossen gefressen. Die vier geklonten Jungen waren normal und gesund und ihre Fruchtbarkeit wird bewertet. Diese Daten lagen nahe, dass das Cytoskelett modifizierende Wirkstoffe die Befreiung von Kernchromatin ohne eine mit einer mechanischen Befreiung vom Kern einhergehenden Störung und ohne Verlust an Cytoplasma in annehmbarem Ausmaß induzieren können. Darüber hinaus sind die aus diesem Kernbefreiungsverfahren hervorgehenden Cytoplasten in der Lage, die Reaktivierung des Genoms und die rechtzeitige Entwicklung des Fötus zu unterstützen. Dieser technisch einfache Ansatz kann für ein effizienteres Verfahren sorgen, um eine große Zahl von Cytoplasten für Klonierungen zu gewinnen.
BEISPIEL 2: KLONIEREN EINER TRANSGENEN ZIEGE
Die in den folgenden Beispielen eingesetzten Spender und Empfänger waren Milchziegen der folgenden Züchtungen (gemischt oder nicht): Alpine, Saanen, und Toggenburg. Das Einsammeln und die Überführung erfolgten während des Frühlings und frühen Sommers (Off-Season).
Isolierung von somatischen Ziegenzellen
Die als Karyoplastenspender eingesetzten fötalen Fibroblastenzelllinien der Ziege stammten von 35-40 sechs Tage alten Föten, welche durch künstliche Besamung von nicht transgenen Weibchen mit frisch gesammeltem Samen von einem transgenen Antithrombin III (ATIII)-Ziegenbock-Founder stammten. Eine ATIII Zellinie wurde ausgewählt, weil sie die somatischen Zelllinien mit einem gut charakterisierten genetischen Marker versieht und sie eine sehr ergiebige Expression eines komplexen glykosylierten Proteins (ATIII) in der Milch von Milch absondernden Weibchen zum Ziel hat. Am Tag 40 nach dem Koitus wurden 3 Föten, die von dem Samen des transgenen ATIII-Ziegenbocks abstammten chirurgisch entfernt und in äquilibrierte Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-freie phosphatgepufferte Saline (PBS) gegeben. Durch Zerhacken und den Verdau von fötalem Gewebe in 0,025% Trypsin/0,5 mM EDTA bei 37°C über einen Zeitraum von 10 Minuten wurden Zellsuspensionen zubereitet. Die Zellen wurden mit äquilibriertem Medium 199^TM (M199) (Gibco) + 10% fötalem Rinderserum (FBS), das mit Nucleosiden, 0,1 mM 2-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 IE jeweils pro ml) (fötales Zellmedium) supplementiert worden war, gewaschen und in Kolben mit 25 cm² kultiviert. Die Kulturen wurden 24 Stunden später mit dem fötalen Zellmedium erneut versorgt. Mittels Trypsinisierung am Tag 4 wurde ein konfluenter Monolayer von primären fötalen Zellen geerntet, indem der Monolayer zweimal mit Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-freier PBS gewaschen wurde, gefolgt von einer Inkubation mit 0,025% Trypsin/0,5 mM EDTA bei 38°C über einen Zeitraum von 7 Minuten.
Sodann wurden die potentiell ATIII exprimierenden Zellen für die Kryokonservierung präpariert oder als Vorratskulturen gehalten.
Sexing und Genotypisierung von Spender-Zelllinien
Genomische DNA wurde aus fötalem Kopfgewebe für ATIII-Spenderkaryoplasten mittels Verdau mit Proteinnase K und einer nachfolgenden, wie in Laird et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19: 4293 beschriebenen Fällung mit Isopropanol isoliert und mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf das Vorkommen von menschlichen Antithrombin III (ATIII)-Sequenzen hin analysiert. Die ATIII-Sequenz ist ein Teil des zu der in Edmunds et al. (1998) Blood: 4561-4571 beschriebenen Erzeugung der transgenen ATIII-Linie verwendeten BC6-Konstrukts (Beta-Kasein der Ziege – menschliche ATIII-cDNA). Die menschliche ATIII-Sequenz wurde durch Amplifikation einer 367 bp-Sequenz mit den Oligonucleotiden GTC11 und GTC12 nachgewiesen (siehe weiter unten). Für das Sexing wurde das zfX/zfY-Primerpaar verwendet (siehe weiter unten), was zu einer 445 bp (zfX)1447 bp (sfy)-Dublette führte. Nach Verdau mit dem Restriktionsenzym SacI (New England Biolabs) wurde die zfX-Bande in zwei kleine Fragmente (272 und 173 bp) zerschnitten. Die Männchen wurden durch die Gegenwart der nicht zerschnittenen 447 bp-zfY-Bande identifiziert.
Für die PCR-Reaktionen wurden ungefähr 250 ng genomische DNA in 50 ml PCR-Puffer verdünnt (20 mM Tris, pH 8,3, 50 mM KCl und 1,5 mM MgCl₂), 0,25 mM Desoxynucleotidtriphosphate) zugesetzt und jeder Primer bei einer Konzentration von 600 mM mit 2,5 Einheiten Taq-Polymerase versetzt und mit Hilfe des folgenden Temperaturprogramms weiterbehandelt.
Zum Nachweis der ATIII-Sequenz wurde der folgende Satz von Primern verwendet:
GTC11: CTCCATCAGTTGCTGGAGGGTGTCATTA (SEQ ID NO: 1)
GTC12: GAAGGTTTATCTTTTGTCCTTGCTGCTCA (SEQ ID NO: 2)
Für das Sexing wurde der folgende Satz von Primern eingesetzt:
zfX: ATAATCACATGGAGAGCCACAAGC (SEQ ID NO: 3)
zfY: GCACTTCTTTGGTATCTGAGAAAG (SEQ ID NO: 4)
Zwei der Föten wurden als männlich identifiziert und sie waren beide negativ für die ATIII-Sequenz. Ein anderer Fötus wurde als weiblich identifiziert und erwies sich als positiv für das Vorkommen der ATIII-Sequenz.
Präparation von ATIII exprimierenden Spenderzellen für die Embryo-Neubildung
Eine aus einem 40 Tage alten Fötus stammende transgene weibliche Zelllinie (CFF155-92-6) wurde wie oben beschrieben mit Hilfe der PCR-Analyse identifiziert und für alle Kerntransfer-Manipulationen eingesetzt. Transgene fötale Fibroblastenzellen wurden in 25 cm² Kolben mit fötalem Zellmedium gehalten, am Tag 4 nach jeder Passage mit neuem Medium versorgt und am Tag 7 mittels Trypsinisierung geerntet. Von jeder Passage wurde ein neuer 25 cm² Kolben beimpft, um die Vorratskultur weiter zu führen. Die fötalen Zellen wurden auf 4 Platten mit Vertiefungen mit fötalem Zellmedium überimpft und in Kultur gehalten (5% CO₂ bei 39°C). 48 Stunden später wurde das Medium durch frisches fötales Zellmedium ersetzt, welches 0,5% FBS enthielt. Die Kultur wurde über die nächsten 7 Tage alle 48-72 Stunden mit 0,5% FBS enthaltendem frischem fötalem Zellmedium versorgt. Am siebten Tag nach der ersten Zugabe von fötalem Zellmedium (0,5% FBS) wurden die als Karyoplastenspender eingesetzten somatischen Zellen, wie zuvor beschrieben, durch Trypsinisierung geerntet. Ein bis drei Stunden vor der Fusion mit vom Kern befreiten Oocyten wurden die Zellen in äquilibriertem M199 + 10% FBS resuspendiert, das mit 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (jeweils 10.000 IE. pro ml) ergänzt worden war.
Karyotypisierung der Zelllinien
Die geklonten Zelllinien wurden durch Karyotypisierung weiter bewertet, um in den Zelllinien schwere Chromosomen-Anomalien zu ermitteln. Durch Inkubation mit 0,02 μg/ml Demecolcin (Sigma) über einen Zeitraum von 12 Stunden wurden die Zellen dazu gebracht, in der Metaphase zu verweilen. Nach der Trypsinisierung wurde das erhaltene Pellet in einer hypotonischen Lösung von 75 mM KCl in Wasser suspendiert und bei 37°C 20 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden jedes mal 5 Minuten lang in 3 Ansätzen einer eiskalten Eisessig-Methanol-Lösung (1:3) fixiert, bevor Tropfen der Zellsuspension auf zuvor gewaschene mikroskopische Objektträger gegeben wurden. Nach dem Trocknen an der Luft wurden die Chromosomenpräparate mit 3% Giemsa-Farbe (Sigma) in PBS 10 Minuten lang angefärbt. Für jede Zelllinie wurde die Chromsomenzahl bei 1000-facher Vergrößerung unter Ölimmersion gezählt.
Immunhistochemische Analyse
Zur Charakterisierung und Bestätigung der Morphologie der Zelllinien wurden gegen Vimentin (Sigma) und pan-Cytokeratin (Sigma) spezifische Antikörper eingesetzt. Die Zellen wurden in sterile mit Gelatine beschichtete Deckgläser bis zu einer Konfluenz von 75% plattiert und mit 0,05% Saponin in 2% Paraformaldehyd 1 Stunde lang fixiert. Die Zellen wurden in 0,5% PVP in PBS (PBS/PVP) mit primären Antikörpern zwei Stunden lang bei 37°C inkubiert, in Intervallen von 10 Minuten 3 Mal mit PBS/PVP abgespült und 1 Stunde lang mit CY3 bzw. FITC konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert. Die alkalische Phosphatase (Sigma)-Aktivität der Zellen wurde auch gemessen, um die Gegenwart oder Abwesenheit von undifferenzierten Zellen zu ermitteln. Die Deckgläser wurden abgespült und danach auf Objektträger mit 50% Glycerin in PBS/PBP mit 10 μg/ml Bisbenzimid (H-33342, Sigma) übertragen und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
Die für Vimentin und Pan-Cytokeratin positiven und für die alkalische Phosphataseaktivität negativen Epithel- und Fibroblasten-Zelllinien wurden aus den ATIII-Primärkulturen erzeugt. In den Zellkulturen wurden zwei morphologisch unterschiedliche Zelltypen beobachtet. Größere "fibroblastenähnliche" Zellen färbten sich für Vimentin positiv und kleinere "epithelähnliche" Zellen färbten sich für Pan-Cytokeratin positiv, welche in den Primärzellkulturen nebeneinander existierten. Die isolierten Fibroblasten-Linien von ATIII zeigten die Neigung, sich zu epithelähnlichen Zellen zu differenzieren, wenn sie 3 Tage nach Erreichen von Konfluenz kultiviert wurden. Nachfolgende Passagen induzierten eine Selektion gegen Fibroblastenzellen und führten zu reinen Epithelzellen, was durch das Fehlen einer positiven Färbung für Vimentin bestätigt wurde. Ein Altern oder ein mögliches Anhalten des Zellzyklus wurde zuerst bei Passage 28 beobachtet. Diese Zellen scheinen im Vergleich mit den normal wachsenden Zellen (15-25 μm) größer zu sein (>30 μm) und lassen sich in Abwesenheit einer sichtbaren mitotischen Aktivität einige Monate lang ohne Verlust ihrer Lebensfähigkeit in Kultur halten. Eine Embryo-Neubildung unter Einsatz der Kerne aus den angehaltenen Zellen lieferte Embryonen im Morula-Stadium, was eine Wiedererlangung der mitotischen Aktivität vermuten lässt.
Synchronisierung und Charakterisierung des Spender-Karyoplasten-Zellzyklus
Selektierte diploide transgene weibliche Zelllinien wurden vermehrt, nacheinander einer Passage unterzogen und als künftiger Vorrat für Karyoplasten in einer Kryobank deponiert. Die Spenderkaryoplasten für den Kerntransfer wurden in 4 Platten mit Vertiefungen überimpft und bis zu 48 Stunden oder, wenn die Zellen eine Konfluenz von 70-80% erreichten, in DMEM + 10% FBS kultiviert. Danach wurden die Zellen dazu induziert, durch Entzug des Serums über einen Zeitraum von 7 Tagen unter Einsatz von mit 0,5% FBS supplementiertem DMEM die Wachstumsphase zu verlassen und in die Ruhephase (G₀) einzutreten, um die Zellen zu synchronisieren. Nach der Synchronisation bei G₀ wurde durch Resuspension der Zellen in M199 + 10% FBS bis zu drei Stunden vor der Fusion von Karyoplast und Cytoplast eine Gruppe von Zellen dazu induziert, wieder in den Zellzyklus einzutreten, um die Zellen in der frühen G₁-Phase vor START zu synchronisieren. Eine zweite Gruppe von Zellen wurde ebenfalls aus der Ruhephase entlassen und in M199 + 10% FBS über einen Zeitraum von 12 oder 36 Stunden kultiviert, um die Zellen in der S-Phase zu synchronisieren. Mittels standardisierter Trypsinisierung wurden die Zellen dann geerntet, in M199 + 10% FBS resuspendiert und binnen 1 Stunde als Karyoplastenspender einer Elektrofusion unterzogen.
Die Metaphasen-Spreads aus den das ATIII-Konstrukt tragenden transgenen Zelllinien waren in Passage 5 zu 81% diploid und dies änderte sich nicht signifikant in Passage 15, wo 78% der Spreads diploid waren.
Die Synchronisation des Zellzyklus wurde mittels immunhistochemischer Analyse ermittelt, indem Antikörper gegen Cyclin D1, 2, 3 und PCNA (Oncogene Research Products) für das Fehlen des Proteinkomplexes, um ein Ruhen (G₀) anzuzeigen, oder für das Vorkommen des Komplexes, um den Eintritt in die G₁-Phase anzuzeigen, eingesetzt wurden. Zellen in der vermuteten S-Phase des Zellzyklus wurden durch das Auftreten einer DNA- Syntheseaktivität identifiziert, wobei das Thymidinanaloge 5-Brom-2'desoxyuridin5'-triphosphat (BrDu, Sigma) und der Streptavidin-Biotin-BrDu-Staining-Kit (Oncogene Reasearch Products) verwendet wurden.
Eine Immunfluoreszenzanalyse der dem Synchronisationsablauf unterzogenen Zellen zeigte, dass nach 7 Tagen des Serumentzugs 90% der Zellen für die Cycline D1, 2, 3 und PNCA der G₁-Phase negativ waren und daher in G₀ festsaßen. Eine Wiederherstellung des Serumgehalts auf 10% für diese Zelllinie induzierte den Wiedereintritt in den Zellzyklus, wobei annähernd 74% der Zellen binnen 3 Stunden nach der Zugabe des Serums die frühe G₁-Phase erreichten, bezogen auf eine positive Färbung für Cyclin D1. Die Wiederherstellung des Serums für 12 und 36 Stunden zeigte, dass 89% der Zellen für BrDu positiv waren, was auf eine DNA-Syntheseaktivität hinweist. In dieser Untersuchung reagierten klonierte Zelllinien im Allgemeinen unterschiedlich auf den Synchronisationsablauf mit dem Serum. Es wurde ein indirekter Zusammenhang beobachtet, wobei die Zellsynchronisationsrate mit zunehmender Zahl an Passagen abnimmt. Ferner nahm mit zunehmender Anzahl an Passagen die Zeit für das Verdoppeln der Population ab, wobei jede klonierte Zelllinie eine abnehmende Empfindlichkeit gegenüber der Synchronisation mit dem Serum zeigte.
Superovulation von Spenderziegen und Beschaffung von Oocyten
Am Tag 0 wurde durch eine subkutane Implantation von 6 mg Norgestomet (Synchro-mate B) in das Ohr die Brunst synchronisiert. Am Tag 7 wurde eine einzelne Injektion von Prostaglandin (PGF2α) (Upjohn US) verabreicht. Beginnend am Tag 12 wurde FSH (Folltropin-V, Vetrepharm, St. Laurent, Quebec, Kanada) zweimal täglich über vier aufeinander folgende Tage verabreicht. Am Tag 14 wurde das Implantat im Ohr entfernt. 24 Stunden nach Entfernung des Implantats wurden die Spendertiere über ein Intervall von 48 Stunden mehrmals mit vasektomierten Männchen gepaart. Nach der letzten FSH-Injektion wurde eine einzelne Injektion von GnRH (Rhone-Merieux, US) intramuskulär verabreicht. Ungefähr 18 bis 24 Stunden nach der letzten Paarung wurden die Oocyten von den Spendertieren mittels Laparotomie in der Mitte des Bauches gewonnen, indem der Eileiter mit bei 37°C vorgewärmter Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-freier PBS ausgespült wurde. Die Oocyten wurden sodann gewonnen und in mit 2 mM L-Glutamin, 1% Penicillin/Streptomycin (jeweils 10.000 I.E. pro ml) supplementiertem M199 + 10% FBS kultiviert.
Befreiung der Oocyten vom Kern
Aus Spenderziegen wurden in vivo gereifte Oocyten gesammelt. Oocyten mit anhaftenden Cumuluszellen oder ohne Polkörper wurden verworfen. Die Cumulus-freien Oocyten wurden in zwei Gruppen unterteilt: In Oocyten mit nachweislich nur einem Polkörper (Metaphase II-Stadium) und in Oocyten in der aktivierten Telophase II (Oocyten mit einem Polkörper und Anzeichen für das Ausstoßen eines zweiten Polkörpers). Die Oocyten in der Telophase II wurden 3 bis 4 Stunden lang in M199 + 10% FBS kultiviert. Oocyten, die während dieses Zeitraum aktiviert worden waren, was sich durch einen ersten Polkörper und einen teilweise ausgestoßenen zweiten Polkörper zu erkennen gab, wurden zu in Kultur induzierten Calcium-aktivierten Telophase II-Oocyten zusammengefasst (Telophase II-Ca²⁺) und von ihrem Kern befreit. Die nicht aktivierten Oocyten wurden vor ihrer Befreiung vom Kern 5 Minuten lang in 7% Ethanol enthaltender PBS inkubiert. Die Oocyten im Metaphase II-Stadium (ein Polkörper) wurden mit einer Glaspipette von 25-30 μ von ihrem Kern befreit, indem der erste Polkörper und das den Palkörper umgebende, angrenzende, vermutlich die Metaphaseplatte enthaltende Cytoplasma (ungefähr 30% des Cytoplasmas) abgesaugt wurde.
Wie oben beschrieben wurden Oocyten im Stadium der Telophase nach zwei Verfahren gewonnen. Die Oocyten wurden zunächst in mit 5% FBS supplementierter phosphatgepufferter Saline (PBS, Ca²⁺/Mg²⁺-frei) 15 Minuten lang inkubiert und ungefähr 3 Stunden lang in M199 + 10% FBS bei 38°C kultiviert, bis die Konfiguration der Telophasespindel oder das Ausstoßen des zweiten Polkörpers erreicht waren. Alle Oocyten, die auf die folgende Kultur unter einer unterschiedlichen extrazellulären Calcium-Behandlung ansprachen, wurden abgetrennt und als Telophase II-Ca²⁺ zusammengefasst. Die anderen Oocyten, welche nicht ansprachen, wurden weiter 5-7 Minuten lang in 7% Ethanol in M199 + 10% FBS inkubiert (Telophase II-EtOH) und in M199 + 10% FBS 2 bis 4 Stunden lang kultiviert. Die Oocyten wurden sodann 10-15 Minuten lang bei 38°C in 5 μg/ml Cytochalasin-B enthaltendem M100 + 10% FBS kultiviert. Die Oocyten wurden mit einer Glaspipette von 30 μ (OD) von ihrem Kern befreit, indem der erste Polkörper und ungefähr 30% des angrenzenden, in der Metaphase II befindlichen Cytoplasmas oder etwa 10% des die Telophase II-Spindel enthaltenden Cytoplasmas abgesaugt wurden. Nach der Befreiung von ihren Kernen wurden die Oocyten unmittelbar wiederhergestellt.
Rekonstruktion des Embryos
Die als Karyoplastenspender eingesetzten somatischen CFF 155-92-6-Zellen wurden durch Trypsinisierung (0,025% Trypsin/0,5 mM EDTA) (Sigma) über einen Zeitraum von 7 Minuten am Tag 7 geerntet. Einzelne Zellen wurden in mit 2 mM L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin supplementiertem äquilibriertem M199 + 10% FBS resuspendiert. Die Injektion der Spenderzelle erfolgte im gleichen Medium wie das für die Befreiung vom Kern. Vor ihrer Selektion für die Injektion in von ihrem Kern befreite Cytoplasten wurden die Spenderzellen in kleine, mittlere und große Zellen eingeteilt. Kleine einzelne Zellen (10-15 μ) wurden mit Hilfe einer Glaspipette mit einem Durchmesser von 20-30 μ selektiert. Die Pipette wurde durch den gleichen Schlitz der Körpergegend eingeführt, welcher während der Befreiung vom Kern gemacht wurde, und die Spenderzellen wurden zwischen der Zona pellicuda und der Ooplasmamembran injiziert. Die rekonstruierten Embryonen wurden vor ihrer Fusion und Aktivierung 30-60 Minuten lang in M199 inkubiert.
Fusion und Aktivierung
Alle rekonstruieren Embryonen (Vorbehandlung mit Ethanol oder nicht) wurden 3 Minuten vor der Elektrofusion im Fusionspuffer (0,3 M Mannit, 0,05 mM CaCl₂, 0,1 mM MgSO₄, 9 mM K₂HPO₄, 0,1 mM Glutathion, 0,1 mg/ml BSA in destilliertem Wasser) gewaschen. Die. Fusion und die Aktivierung erfolgten bei Raumtemperatur in einer mit Fusionspuffer gefüllten Kammer mit zwei Elektroden aus rostfreiem Stahl, die 200 μ voneinander beabstandet waren (BTX^® 200 Embryomanipulation System, BTX^®-Genetronics, San Diego, CA). Die rekonstruierten Embryonen wurden mit einer Pipette in Gruppen von 3 bis 4 eingeführt und mit Hand so ausgerichtet, dass sich die Cytoplasmamembran der Empfänger-Oocyten und der CFF155-92-6-Spenderzellen parallel zu den Elektroden befanden. Die Induktion von Zellfusion und Aktivierung erfolgte gleichzeitig 32-42 Stunden nach der Injektion von GnRH mit einem anfänglichen 7 Sekunden langen Alignment/Holding-Puls von 5-10 V Wechselstrom gefolgt von einem 70 Mikrosekunden dauernden Fusionspuls von 1,4 bis 1,8 KV/cm Gleichstrom unter Einsatz eines Electrocell Manipulator and Enhancer 400 (BTX^®-Genetronics). Die Embryonen wurden 3 Minuten lang in Fusionsmedium gewaschen und dann in 5 μg/ml Cytochalasin-B (Sigma) und 10% FBS enthaltendes M199 übertragen und 1 Stunde lang inkubiert. Die Embryonen wurden aus dem M199/Cytochalasin-B-Medium entnommen und in 50 μl Tropfen von M199 + 10% FBS zusammen mit Eileiter-Epithelzellen der Ziege kultiviert, die mit Paraffinöl überschichtet waren. Vor dem Transfer der Embryonen in Ziegenweibchen wurden die Embryokulturen 48 Stunden lang bei 39°C mit 5% CO₂ in einem luftfeuchten Inkubator gehalten.
Die rekonstruierten Embryonen zeigten 1 Stunde nach der gleichzeitigen Aktivierung und Fusion mit den Karyoplasten in der G₀-, G₁ und S-Phase eine Auflösung der Kernmembran (NEBD, Nuclear Envelope Breakdown), und eine vorzeitige Kondensation der Chromosomen (PCC), wenn sich die Cytoplasten im angehaltenen Metaphase II-Stadium befanden. Es wurde eine nachfolgende Bildung einer Kernmembran beobachtet, die sich 4 Stunden nach der Aktivierung auf etwa 35% belief. Die rekonstruierten Oocyten im Telophase II-Stadium zeigten, dass von den 1 Stunde nach der Fusion der Karyplasten in der G₀-, G₁ und S-Phase beobachteten Oocyten im Mittel 22% einen NEBD oder eine PCC erlitten, während die übrigen Oocyten eine den dekondensierenden Kern umgebende intakte Kernmembran aufwiesen. Zwischen den verwendeten Rekonstruktionen für die Metaphase und die zwei Telophasen wurde keine andere beständige Kernmorphologie als das Fehlen oder Vorkommen eines NEBD oder einer PCC beobachtet. Die Unterschiede wurden offensichtlich, wenn bei den klonierten Embryonen beobachtet wurde, dass dann, wenn die Embryonen mit Spenderkernen in der S-Phase rekonstruiert worden waren, sie eine größere Häufigkeit von fortgeschrittenen Teilungsstadien (8 bis 32 Blastomere) aufweisen, als wenn nach einer 36 bis 48 Stunden dauernden in vitro-Kultur Karyoplasten in der G₀- oder G₁-Phase eingesetzt wurden (2 bis 8 Blastomere). Die Analyse mit dem Fluoreszenzmikroskop zeigte, dass die Kerne von einigen sich schnell teilenden Embryonen fragmentiert waren. Andere Embryonen entwickelten sich in der Kultur innerhalb von 3 Tagen bis zu einem Stadium von 32 bis 64 Zellen, bevor die Entwicklung der Teilung blockiert wurde. Eine Analyse der Blastomere und der Anzahl der Kerne zeigte, dass ein synchrones Auftreten der Cytokinese oder der Karyokinese nicht stattfand, wobei bei den Blastomeren entweder die entsprechenden Kerne fehlten oder sie mehrere Kerne enthielten. Im Gegenteil dazu wiesen morphologisch normal aussehende Embryonen eine synchrone Cytokinese und Karyokinese auf.
Mit Epithelzellen aus dem Eileiter der Ziege (GOEC) rekonstruierte Embryonen-Cokultur
Die GOEC stammten von Eileitergewebe, das gesammelt wurde, während an synchronisierten und superovulierten Ziegenweibchen das chirurgische Durchspülen des Eileiters vorgenommen wurde. Eileitergewebe aus einem einzelnen Ziegenweibchen wurde in ein 5 ml äquilibriertes M199 10% FBS, 2 mM L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin enthaltendes Polypropylen-Kulturröhrchen von 15 ml transferiert. Eine einzelne Zellsuspension wurde zubereitet, indem 1 Minute lang gevortext und dann bis zu einer Stunde bei 38°C in einem feuchten 5% CO₂-Inkubator kultiviert wurde. Das Röhrchen wurde ein zweites Mal 1 Minute lang gevortext und dann zusätzlich 5 Minuten in Kultur gehalten, damit sich die Zelltrümmer absetzen konnten. Die vermutlich einzelne Zellen enthaltenden 4 ml Überstand wurden in ein neues Röhrchen von 15 ml transferiert und bei 600 g 7 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet in 8 ml äquilibriertem GOEC-Medium resuspendiert. Die GOEC wurden in einem Kolben von 25 cm² kultiviert, am Tag 3 mit neuem Kulturmedium versetzt und, wie zuvor beschrieben, am Tag 6 mittels Trypsinisierung geerntet. Für jedes Experiment wurden wöchentlich aus primären GOEC-Kulturen Monolayer hergestellt. Die Zellen wurden in GOEC-Medium mit 5 × 10⁵/ml resuspendiert und 50 μl/Vertiefung wurden auf 4-2311-Platten (15 mm) überimpft. Das Medium wurde mit 0,5 ml Leichtparaffin überzogen und die Platten in einem feuchten 5% CO₂-Inkubator bei 38°C kultiviert. Die Kulturen wurden am Tag 2 mit 80% frischem äquilibriertem Kulturmedium neu versorgt. Vor ihrem Transfer in Rezipienten auf einer GTC-Farm wurden alle rekonstruierten Embryonen zusammen mit den GOEC-Monolayern in vitro in einem Inkubator bei 39°C unter 5% CO₂ cokultiviert.
Alle experimentellen Wiederholungen für ATIII ergaben Embryonen in einem Teilungsstadium, welche am Tag 2 in synchronisierte Empfänger transferierbar waren. Embryonen, bei denen Fibroblasen und Epithelzell-Phänotypen als Spenderkaryoblasten verwendet wurden, zeigten in Kultur eine Teilung und Entwicklung. Der Prozentsatz der Teilungsentwicklung war bei rekonstruierten Paaren, bei welchen voraktivierte Cytoplasten im Telophase II-Stadium (45%) und mit Ethanol aktivierte Cytoplasten im Telophase II- Stadium (56%) verwendet wurden, größer im Vergleich mit Cytoplasten, bei denen unter Einsatz von ATIII-Karyoplasten die Metaphase II angehalten worden war (35%). Bei den Teilungsraten von Embryonen, die unter Einsatz von Spenderkaryoplasten in der G₀-, G₁- oder S-Phase des Zellzyklus rekonstruiert worden waren, wurden keine Unterschiede beobachtet, obwohl die morphologische Qualität der Embryonen besser war, wenn die Spenderkaryoplasten in der G₀ oder G₁-Phase waren, als wenn sie in der S-Phase waren. Die Embryonen waren im Allgemeinen zwischen dem 2- und 8-Zellen-Stadium, wobei die Mehrheit der Embryonen zur Zeit des Transfers 3 bis 4 Blastomere umfassten. Die normale Teilungsentwicklung entsprach chronologisch der 36 und 48 Stunden nach der Fusion und Aktivierung. Nach einer in vitro-Entwicklung über einen Zeitraum von 36 bis 48 Stunden wurden die morphologisch normal aussehenden Embryonen in der 2- bis 8 Zellstadium selektiert.
Synchronisation der Brunst von weiblichen Empfänger-Ziegen
Für die Empfänger wurden die Hormonbehandlungen um 1 Tag verzögert (im Vergleich mit den Spendern), um einen Spender/Empfänger-Synchronismus sicher zu stellen. Die Brunst wurde an Tag 1 mit Hilfe eines subkutanen Ohrimplantats aus 6 mg Norgestomet synchronisiert. Am Tag 8 wurde eine einzelne Injektion von Prostaglandin verabreicht. Beginnend am Tag 14 wurde eine einzelne intramuskuläre Behandlung mit PMSG (CalBiochem US) verabreicht. Am Tag 15 wurde das Ohrimplantat entfernt. 24 Stunden nach der Entfernung des Implantats wurden die Empfänger-Ziegenweibchen mehrmals an drei aufeinander folgenden Tagen mit vasektomierten Männchen gepaart.
Embryo-Transfer auf weibliche Empfänger-Ziegen
Rekonstruierte Embryos wurden vor ihrem Transfer auf synchronisierte Empfänger zusammen mit GOEC-Monolayern über einen Zeitraum von ungefähr 48 Stunden cokultiviert. Unmittelbar vor dem Transfer wurden die rekonstruierten Embryos in äquilibriertes Ham's F12-Medium + 10% FBS gegeben. 2 bis 4 rekonstruierte Embryos wurden über die Fimbria in das Lumen des Eileiters von jedem Empfänger transferiert. Die Transfers erfolgten in einem Minimalvolumen von Ham's F-12-Medium + 10% FBS mittels einer sterilen feuerpolierten Mikropipette aus Glas.
Die Entwicklung der durch Kerntransfer unter Einsatz von transgenen fötalen Fibroblasten der Ziege und von in vivo gewonnenen Oocyten rekonstruierten Embryonen ist in Tabelle 1 zusammengestellt. Es gab insgesamt 14 Runden des Sammelns und Transferierens mit 4 Spendern für das Sammeln und 5 bis 6 Empfängern für den Transfer 48 Stunden später. Es wurden die drei unterschiedlichen Enukleations/Aktivierungs-Vorschriften verwendet: Metaphase II, Telophase und mit Ethanol vorbehandelte Metaphase II. Nach der Fusion-Aktivierung wurden die rekonstruierten Embryonen zusammen mit primären Epithelzellen der Ziege mindestens bis zu einer Teilung (2-Zellen-Stadium) bis zum frühen 16-Zellen-Stadium cokultiviert, wobei die meisten Embryonen in den im zeitlichen Ablauf korrekten 2- und 4-Zellen-Stadien transferiert wurden. Alle Transfers erfolgten chirurgisch und in den Eileiter in mit Hormonen synchronisierte Empfänger (wegen der Jahreszeit). Das Ausmaß der Entwicklung war bei Verwendung der Vorschrift mit der Telophase und dem Ethanol geringfügig größer als bei Verwendung der Vorschrift mit der Metaphase II. Dies ist teilweise auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Enukleation des zweiten Polkörpers für die Oocyten weniger traumatisch zu sein scheint, und teilweise darauf, dass mit Ethanol vorbehandelte Oocyten eine höhere Aktivierungsrate zu haben scheinen.
TABELLE 1
Entwicklung von mittels Kerntransfer von transgenen fötalen Fibroblasten rekonstruierten Embryonen der Ziege. Es wurden drei Verfahren zur Befreiung vom Kern eingesetzt: Metaphase II (Enukleation des ersten Polkörpers), Telophase (Enukleation des zweiten Polkörpers), Ethanol (Voraktivierung der Oocyten im Mataphase II-Stadium mittels Behandlung mit 7% Ethanol vor der Enukleation). In allen Fällen wurde eine gleichzeitige Fusion und Aktivierung verwendet.
Nach dem Embryo-Transfer wurden die weiblichen Spenderziegen schon am Tag 25 mittels Ultraschall untersucht. Es wurden hohe Trächtigkeitsraten von 55 bis 78% für weibliche ATIII-Empfängerziegen diagnostiziert. Bei allen drei Enukleations-/Aktivierungs-Verfahren wurde beobachtet, dass ein großer Anteil von Ziegenweibchen (65%) am Tag 30 positiv zu sein schien. Es muss jedoch darauf hingewiesen werden, dass in den meisten Fällen zu einem solch frühen Stadium keine Herzschläge nachgewiesen werden konnten. Darüber hinaus war das am Tag 30 nachgewiesene positive Ultraschallsignal nicht charakteristisch für die Entwicklung normaler Embryonen und schien in engerer Beziehung zu einer Gefäßentwicklung zu stehen, die nicht mit der Bildung eines richtigen Embryos assoziiert war. Diese Art von Embryoentwicklung wird typischerweise bei anderen Embryo-Transferverfahren bei der Ziege (z.B. bei mikroinjizierten Embryonen) nicht beobachtet. Eine zweimal wöchentlich erfolgende Untersuchung dieser Gefäßentwicklungen zwischen Tag 25 und Tag 40 ergaben, dass diese Trächtigkeiten anomal waren und am Tag 40 wurden alle Föten reabsorbiert und normale Ultraschallbilder wurden nicht gesehen.
Bei zwei Trächtigkeiten wurden jedoch am Tag 40 Herzschläge nachgewiesen. In diesen zwei Fällen wies eine Ultraschalluntersuchung zwischen Tag 25 und Tag 40 nicht nur einen Herzschlag nach, sondern sie zeigte auch die Entwicklung von erkennbaren Embryostrukturen. Eine dieser Trächtigkeiten stellte sich bei Verwendung des Enukleations-/Aktivierungs-Verfahrens in der Metaphase II ein, indem der vom Kern befreite Cytoplast mit einem ruhenden Caryoplasten fusioniert wurde, der von der CFF155-92-6-Fibroblastenzelllinie aus Passage 6-Kultur stammte. In diesem Falle wurden rekonstruierte Embryonen im 4-Zellen-Stadium in den Eileiter der weiblichen Empfängerziege transferiert. Die andere Trächtigkeit (Zwillinge) wurde von gemäß dem Enukleations-/Aktivierungs-Verfahren in der Telophase rekonstruierten Embryonen erhalten, indem ein vom Kern befreiter von voraktivierten Telophase Ca²⁺-Oocyten stammender Cytoplast und von der CFF155-92-6-Epithelzelllinie aus Passage 5-Kultur stammende G₁-Karyoplasten fusioniert wurden. In diesem Falle wurden 3 rekonstruierte Embryonen (ein Embryo im 2-Zellen-Stadium und zwei Embryonen im 4-Zellen-Stadium) in den Eileiter der weiblichen Empfängerziege transferiert.
Mit Embryonen, die nach dem Ethanol-Enukleations-/Aktivierungs-Verfahren gewonnen wurden, wurden keine Trächtigkeiten beobachtet. Die Zahlen waren jedoch nicht groß genug, um auf die relative Wirksamkeit der in dieser Untersuchung eingesetzten 3 Enukleations-/Aktivierungs-Verfahren schließen zu können.
Perinatale Betreuung der Empfänger-Embryonen
Die Ziegenweibchen wurden über die gesamte Dauer der Trächtigkeit hinweg nach den äußerlichen Eindrücken ihres Gesundheitszustands hin überwacht (z.B. Appetit, Regsamkeit, Erscheinungsbild). Die Trächtigkeit wurde mit einem Ultrasonographen 25 bis 28 Tage nach dem ersten Tag der Brunstzeit ermittelt. Die Ziegenweibchen wurden zweimal wöchentlich bis zum Tag 75 einer Ultraschallbehandlung unterzogen und danach einmal pro Monat, um die Beurteilung der Lebensfähigkeit des Fötus aufzuzeichnen. Zusätzlich wurden den weiblichen Empfängerziegen ungefähr am Tag 21 nach der Brunstzeit für eine Analyse des Serum-Progesterons Serumproben entnommen. Dies geschah, um zu ermitteln, ob ein funktionierendes Corpus luteum vorlag und wie sich dies mit dem Fortpflanzungsstatus des Tieres (d.h. Trächtigkeit) vergleichen ließ. Ungefähr am Tag 130 wurden die trächtigen Ziegenweibchen mit Tetanustoxoid und Clostridium C&D geimpft. Selen & Vitamin E (Bo-Se) sowie die Vitamine A, D und der B-Komplex wurden intramuskulär oder subkutan gegeben und ein Entwurmungsmittel verabreicht. Die Ziegenweibchen wurden ungefähr am Tag 143 in einen sauberen Stall für Zicklein überführt und sich vor dem Werfen an die neue Umgebung anpassen gelassen. Die Beobachtungen der trächtigen Ziegenweibchen wurden verstärkt, um auf Anzeichen einer bevorstehenden Geburt hin zu überwachen. Nach Beginn von regelmäßigen Wehen blieben die Ziegenweibchen bis zum Eintritt der Geburt unter periodischer Beobachtung. Wenn die Anstrengungen nach 15 Minuten starker Wehen nicht zum Erfolg führten, wurde durch Abtasten der Vagina die Lage des Fötus beurteilt. Wenn die Lage normal schien, ließ man die Anstrengungen 5 bis 30 Minuten (je nach Ziegenweibchen) weitergehen, bevor Geburtshilfemaßnahmen eingeleitet wurden. Falls es angezeigt war, wurde ein Kaiserschnitt durchgeführt. Wenn es angezeigt war, wurde die Geburt mit ungefähr 5-10 mg PGF2α (z.B. Lutalyse) herbeigeführt. Diese Induktion kann ungefähr zwischen den Tagen 145-155 der Gestation erfolgen. Das Werfen erfolgt allgemein zwischen 30 bis 40 Stunden nach der ersten Injektion. Das Aufzeichnungsverfahren ist dasselbe wie oben beschrieben.
Wenn ein Junges erst einmal geboren war, wurde das Tier rasch mit einem Handtuch abgetrocknet und auf starke Anomalien und normales Atmen hin untersucht. Die Jungen wurden unmittelbar vom Muttertier getrennt. War erst einmal ermittelt, dass sich das Tier in gutem Gesundheitszustand befand, wurde der Nabel in 7% Jodtinktur getaucht. Innerhalb der ersten Stunde seit der Geburt erhielten die Jungen ihre erste Fütterung aus hitzebehandelter Vormilch. Zum Zeitpunkt ihrer Geburt erhielten die Jungen Injektionen aus Selen & Vitamin E (Bo-Se) sowie die Vitamine A, D und den B-Komplex, um die Leistungsfähigkeit und den Gesundheitszustand zu steigern.
Die erste transgene mittels Kerntransfer gewonnene weibliche Nachkommenschaft von Ziegen wurde nach einer Trächtigkeit von 154 Tagen nach Einleiten der Geburt und einem Kaiserschnitt geboren. Das Gewicht der Nachkommenschaft bei der Geburt betrug 2,35 kg, was im mittleren Bereich der Zucht Alpine liegt. Die weiblichen Zwillinge wurden auf natürliche Weise mit minimaler Hilfestellung einen Monat später mit einer Trächtigkeitsdauer von 151 Tagen geboren. Das Gewicht der Zwillinge bei der Geburt betrug bei beiden 3,5 kg, was ebenfalls im mittleren Gewichtsbereich für Zwillinge dieser Züchtung liegt. Alle drei Jungen erschienen normal und gesund und waren im Hinblick auf ihre Fellfarbe phänotypisch ähnlich und wiesen für die Züchtung Alpine typische Musterungen auf. Zusätzlich wiesen alle drei Nachkommen ein ähnliches Erscheinungsbild auf wie der transgene Founder-Bock. Es wurde kein unterscheidbarer phänotypischer Einfluss von der Züchtung der Spenderoocyte (Züchtung Saanen, Toggenburg) oder von der heterogenen Expression des fötalen Genotyps beobachtet.
Transgene geklonte Ziegen
Um zu bestätigen, dass die drei Jungen für das BC6-Konstrukt mit dem Beta-Casein-Promotor der Ziege und der menschlichen ATIII-Gensequenz transgen waren, wurden eine PR-Amplifikation und eine Southern-Analyse des Segments des Transgens durchgeführt.
Kurz nach der Geburt wurden von den geklonten weiblichen Ziegen und den Leihböcken Blutproben und Biopsien der Haut des Ohres erhalten. Die Proben wurden einer genomischen DNA-Isolierung unterzogen. Laird et al., Nucleic Acids Res., 19: 4293 (1991). Jede Probe wurde zunächst mittels PCR unter Verwendung von ATIII-spezifischen Primern analysiert und sodann einer Southern Blot-Analyse unter Einsatz der ATIII-cDNA unterzogen (Edmunds et al., Blood 91: 4561-4571 (1998). Für jede Probe wurden mit EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) 5 μg genomische DNA verdaut, in 0,7% Agarose Gelen (SeaKam^®, ME) einer Elektophorese unterzogen und mittels Kapillartransfer nach Standardverfahren (Laird et al., Nucleic Acids Res., 19: 4293 (1991) auf Nylon- Membranen (MagnaGraph, MSI, Westboro, MA) immobilisiert. Die Membranen wurden mit dem mit α³²P dCTP markierten 1,5 kb XhoI bis SalI ATIII-cDNA-Fragment unter Einsatz des Prime-It^®-Kits (Stratagene, LaJolla, CA) sondiert. Über Nacht erfolgte bei 65°C eine Hybridisierung (Church et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1984). Der Blot wurde mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und 48 Stunden lang einem X-)MAT^TM AR-Film ausgesetzt.
Die PCR-Analyse bestätigte, dass alle Jungen für das BC6-Konstrukt mit dem Beta-Casein-Promotor der Ziege und der menschlichen ATIII-Gensequenz transgen waren. Die Southern Blot-Analyse zeigte die Unversehrtheit des BC6-Transgens. Eine Hybridisierung an ein diagnostisches 4,1 kb EcoRI-Fragment wurde für alle drei geklonten Tiere, die Zelllinien und eine transgene positive Kontrolle nachgewiesen, nicht jedoch für die beiden weiblichen Empfängerziegen. Wie erwartet wurde in Folge einer Kreuzhybridisierung der ATIII-cDNA-Sonde an den endogenen AT-Locus der Ziege in allen Proben eine 14 kb Bande nachgewiesen.
Darüber hinaus wurde eine in situ-Fluoreszenz-Hybridisierung (FISH) durchgeführt, um den Integrationsort des BC6-Konstrukts zu ermitteln. Zur Typisierung der geklonten Ziegen wurde für die Ernte von Lymphocyten Vollblut kultiviert (Ponce de Leon et al., J. Hered., 83: 36-42 (1992). Fibroblastenzellen und Lymphocyten wurden wie zuvor in van de Corput et al., Histochem. Cell Biol., 110: 431-437 (1998) und Klinger et al., Am. J. Human Genet., 51: 55-65 (1992) beschrieben vorbehandelt und hybridisiert. In diesem Verfahren wurde eine mit Dioxygen markierte, das gesamte BC6-Transgen von 14,7 kb enthaltende Sonde eingesetzt. Es wurde das TSA^TM-Direct-System (NEN^TM Life Science Products, Boston, MA) verwendet, um das Signal zu amplifizieren. Die R-Bande wurden mit Hilfe einer DAPI-Kontrastfärbung sichtbar gemacht und wie bei Di Berardino et al., J. Hered., 78: 225-230 (1987) identifiziert. Ein Zeiss-Axioskop-Mikroskop, an dem eine Hamarmatsu-Digitalkamera montiert ist, wurde mit der Image-Pro^® Plus-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) verwendet, um Bilder zu machen und zu entwickeln.
Eine FISH-Analyse der Blutkulturen von jedem transgenen Jungen mit Sonden für das BC6-Transgen zeigte, dass alle drei eine Transgen-Integration im Chromosom 5 aufwiesen, die identisch mit der war, welche in den von der CFF6-Zelllinie stammenden Metaphaseplatten gefunden wurden. Darüber hinaus bestätigte die Analyse der letzten 75 Metaphaseplatten für jeden geklonten Nachwuchs, dass die transgene Integration in das Chromosom 5 nicht mosaikartig war.
Als letzte Bestätigung, dass alle drei Jungen von der transgenen CFF6-Zelllinie abstammten, erfolgte eine PCR-RFLP-Analyse für das äußerst polymorphe MHC-Klasse II-DRB-Gen. Die Typisierung für das zweite Exon des MHC-Klasse II-DRB-Gens der Ziege wurde unter Einsatz des wie in Amills et al., Immunopathol., 55: 255-260 (1996) beschriebenen PCR-RFLP-Typing ausgeführt. 15 μl des Produkts aus einer verschachtelten PCR wurden mit 20 Einheiten Rsal (New England Biolabs, Beverly, MA) verdaut. Nach dem Verdau wurden die Restriktionsfragmente bei Raumtemperatur in einem 4 bis 20% nicht denaturierenden Polyacrylamid-Gel (MVP^TM Precast-Gel, Stratagene, LaJolla, CA) in Gegenwart von Ethidiumbromid aufgetrennt.
Wie die RsalI-Verdaus des zweiten Exons des DRB-Gens zeigen, sind die drei geklonten Nachkommen untereinander identisch und mit der CFF6-Spenderzelllinie identisch, während die weiblichen Empfängerziegen unterschiedliche Allele aufweisen.
Induktion der Laktation und transgene Expression von Proteinen in die Milch
Um zu ermitteln, ob die angestrebte, für die Milchdrüsen spezifische Expression von menschlichen ATIII-Proteinen in die Milch vorhanden ist, wurden die geklonten transgenen präpubertären Klone vorübergehend zur Sekretion von Milch induziert. Ein zwei Monate alter klonierter Nachkomme wurde zwei Wochen lang einer hormoninduzierten Laktation unterzogen. Die Hormoninduktion der Laktation für das CFF6-1-Weibchen wurde wie in Ryot et al., Indian J. Anim. Res., 10: 49-51 (1989) beschrieben, durchgeführt. Das CFF6-1-Junge wurde einmal täglich per Hand gemolken, um Milchproben für die Analyse der ATIII-Expression zu sammeln. Alle Analyseverfahren für Proteine wurden in Edmunds et al., Blood, 91: 4561-4571 (1998) beschrieben. Die Konzentration von rekombinantem ATIII in der Milch wurde mittels eines schnellen Umkehrphasen-HPLC-Verfahrens unter Einsatz einer Hewlett Packard 1050 HPLC (Wilmington, DE) mit Nachweis bei 214 nm ermittelt. Die ATIII-Aktivität wurde durch Messen der Thrombin-Hemmung mit einem kolorimetrischen zweistufigen Endpunktassay bestimmt. Die Western-Blot-Analyse wurde mit einem affinitätsgereinigten HRP-konjugierten polyklonalen Schafsantikörper gegen ATIII (Sero Tec, Oxford, UK) durchgeführt. Vor dem Packen auf ein 10-20% Gradientengel (Owl Scientific) wurden die Proben 30 Sekunden lang in reduzierendem Probenpuffer gekocht. Die Elektrophorese wurde bei 164 Volt (konstant) betrieben, bis die Farbstofffront aus dem Gel austrat.
Am Ende der Behandlung wurden täglich über einen Zeitraum von 20 Tagen kleine Milchproben von 0,5 bis 10 ml gesammelt. Die kleinen anfänglichen Milchvolumina von 0,5 bis 1 ml waren typisch für die Mengen bei für eine Laktation hormoninduzierten präpubertären weiblichen Ziegen. Die Volumina nahmen bis zu 10 ml pro Tag zu bis zu dem Zeitpunkt, wo das Weibchen dann keine Milch mehr gab, 25 Tage nach Beginn. Die Konzentration und Aktivität von ATIII in einigen der Proben wurden bestimmt. Wie zuvor angegeben wurden bei Ziegenweibchen aus dieser spezifischen transgenen BC6-Zelllinie hohe Konzentrationen an rekombinantem ATIII mittels Western-Blot-Analyse nachgewiesen (Edmunds et al., Blood, 91: 4561-4571 (1998). Die Konzentration an rekombinantem ATIII in der Milch der geklonten Nachkommenschaft belief sich auf 5,8 Gramm pro Liter (205 E/ml) am Tag 5 und auf 3,7 Gramm pro Liter (14,6 E/ml) am Tag 9. Dies stimmte mit den während des frühen Abschnitts einer ersten natürlichen Laktation von Ziegenweibchen aus dieser BC6-Zellinie berichteten Konzentrationen (3,7 bis 4,0 Gramm pro Liter) überein.
Gesunde transgene Ziegen wurden durch Kerntransfer von somatischen Zellen auf Oocyten erhalten, die entweder im Metaphase II-Arrest oder dem aktivierten Telophase II-Stadium von ihrem Kern befreit wurden. Diese Untersuchungen zeigen, dass in abgereichertem Serum gewachsene Zellen, das zur Erzeugung einer fristgerechten Trächtigkeit eingesetzt wurde, nach ihrer Rekonstruktion mit 10% Serum wahrscheinlich ein Übergangsstadium durchlaufen.
Das Immunofluoreszenz-Screenen zeigte, dass die fötalen somatischen Zellen 7 Tage nach der Behandlung mit abgereichertem Serum für die Cycline D1, D2, D3 und PCNA im G₁-Stadium negativ waren, während binnen 3 Stunden nach der Aktivierung mit 10% FBS-Serum eine Mehrzahl (z. B. ungefähr 70%) diese Marker exprimierte.
Die Rekonstruktion einer vom Kern befreiten Oocyte im arretierten Metaphase II-Stadium mit dem Transfer eines Kerns aus einem Spenderkaryoplasten, der nach der gleichzeitigen Fusion und Aktivierung in der G₀- oder G₁-Phase des Zellzyklus synchronisiert worden war, ahmt die zeitlich aufeinander folgenden Geschehnisse während der Befruchtung nach. Die erfolgreiche Entwicklung bis zum berechneten Zeitpunkt der Geburt sowie die Geburt eines normalen und gesunden transgenen Nachwuchses nach dem Verfahren der gleichzeitigen Fusion und Aktivierung steht im Gegensatz zu den Verfahren, welche in anderen Untersuchungen eingesetzt wurden, wo berichtet wird, dass die Spenderkerne längere Zeit einer erhöhten cytoplasmatischen MPF-Aktivität ausgesetzt werden müssen, um die Umgestaltung und Umprogrammierung des Chromatins zu unterstützen (Siehe Campbell et al., (1996) Nature 380: 64-66; Wilmut et al. (1997) Nature 385: 810-813; Schnieke et al., (1997) Science 278: 2130-2133; Cibelli et al., (1998) Science 280: 1256-1258). Dieses Ergebnis stellt die Behauptung in Frage, dass eine Umgestaltung der somatischen Zellen über längere Zeit unter Bedingungen einer erhöhten MPF-Aktivität vor der Aktivierung für die Entwicklung des Embryos und des Fötus wichtig sei. Die Ergebnisse zeigen auch, dass bei einem rekonstruierten Embryo der Spenderkern nicht über längere Zeit MPF ausgesetzt zu werden braucht, noch dass eine NEBD und PCC insgesamt erforderliche Ereignisse darstellen. Eher sind die Umgestaltungen des Chromatins, bei denen eine NEBD und PCC eine Rolle spielen, ebenfalls zulässige Wirkungen einer MPF-Aktivität und brauchen als solche nicht für den Erwerb der Fähigkeit oder Omnipotenz für die Entwicklung notwendig zu sein. Stattdessen dienen diese Ereignisse wahrscheinlich dazu, den Erwerb der Synchronisation zwischen dem Cytoplasten und dem Karyoplasten zu erleichtern. Diese Ereignisse können sogar schädlich sein, falls eine normale Diploidie nicht beibehalten wird, wenn die Spenderkerne dazu induziert werden, in Folge eines teilweise wegen der MPF-Aktivität aberranten Spindelapparates eine PCC mit einer resultierenden Chromosomendispersion einzugehen. Daher ist eine Synchronisation von Karyoplast und Cytoplast in Bezug auf den Zellzyklus wichtig, um erstens eine normale Ploidie aufrecht zu erhalten und zweitens, um die Reaktivierung des Genoms und den nachfolgenden Erwerb der Fähigkeit zur Entwicklung von rekonstruierten Embryonen richtig zu induzieren.
Eine weitere Unterstützung wird im zweiten Verfahren zur Verfügung gestellt, wo im Metaphase II-Arrest befindliche Oocyten mit intaktem Chromatin aktiviert wurden, um die MPF-Aktivität zu reduzieren und die Oocyte dazu zu induzieren, die M-Phase zu verlassen und in die erste Mitose-Teilung einzutreten. Ungefähr 3 Stunden nach der Aktivierung wurden vor Beginn von G₁ die Oocyten im Telophase-Stadium von ihrem Kern befreit und fusioniert und zur gleichen Zeit in G₁ vor START des Zyklus mit einem Spenderkaryoplasten aktiviert. Zusätzlich stellten die gleichzeitige Aktivierung und Fusion sicher, dass die Neigung nicht gealterter Oocyten, zu einem Arrest-Stadium zurückzukehren, umgangen wird. Bei Benutzung dieses Musters wurde ein normaler und gesunder Satz von geklonten transgenen Zwillingsjungen erzeugt. Diese Vorgehensweise liefert auch inhärent eine homogene Synchronisationsvorschrift für den Cytoplasten, um vor START näher mit den Spenderkernen in G₁ übereinzustimmen. Ferner induziert die Voraktivierung der Oocyte einen Abfall bei der MPF-Aktivität im Cytoplasma und hemmt so das Auftreten einer NEBD und PCC. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine NEBD und PCC nur fakultativ für die Induktion der Synchronisierung von Cytoplast und Karyoplast ist, aber notwendig für den Erwerb einer richtigen Reaktivierung des Genoms und der nachfolgenden Entwicklung des Kerntransfer-Embryos bis zum Zeitpunkt der Geburt unter Einsatz der Kerne von somatischen Zellen. Diese Befunde legen ferner nahe, dass differenzierte Zellen im G₀- oder G_l-Stadium ähnlich funktionieren wie die Blastomere von Embryonen in Bezug auf ihre Fähigkeit, Omnipotenz zu erwerben, wenn sie zusammen mit einem arretierten oder aktivierten Empfänger-Cytoplasten eingesetzt werden.
Die Verwendung von Cytoplasten sowohl im Metaphase II-Arrest als auch in der Telophase II sorgt für zweifache Optionen für die Gewinnung von Cytoplasten zusätzlich zur Gelegenheit eines längeren Zeitrahmens für die Gewinnung des Cytoplasten. Der Einsatz von Telophase II-Cytoplasten kann verschiedene praktische und biologische Vorteile bieten. Der Telophase-Ansatz erleichtert eine wirksame Befreiung vom Kern und vermeidet die Notwendigkeit einer Anfärbung des Chromatins und einer UV-Lokalisierung. Darüber hinaus können bei einer Enukleation in der Telophase minimales Cytoplasmamaterial entfernt und synchrone Gruppen von aktivierten Spendercytoplasten ausgewählt werden. Dieses Verfahren ermöglicht auch die Herstellung einer äußerst homogenen Gruppe von Spenderkernen mit dem Zellzyklus des Cytoplasten zu synchronisieren. Bei Einsatz für eine Rekonstruktion des Embryos zeigten diese Populationen in vitro eine höhere Entwicklungsrate der Embryonen. Somit sind aus einem synchron aktivierten Cytoplasten und Karyoplasten bestehende rekonstruierte Embryonen für das Wachstum befähigt.
Zusätzlich zu einer erfolgreichen transgenen Founder-Produktion lässt sich mit dem Kerntransfer von somatischen Zellen vor der Gewinnung von geklonten transgenen Embryonen die geeignete transgene Zelllinie auswählen. Dies ist besonders wichtig in Fällen, wo mehrere Proteine von der transgenen Brustdrüse zusammen exprimiert werden müssen. Beispielsweise hilft die Verfügbarkeit von mehreren vollständig identischen rekombinantes menschliches ATIII produzierenden transgenen Weibchen bei der Ermittlung des Ausmaßes der Variation in der Kohlenhydratstruktur dieses Proteins, wenn es von der Brustdrüse produziert wird. Somit kann es möglich sein, die Merkmale der in dem transgenen tierischen System produzierten rekombinanten Proteine zu verbessern, indem Umweltfaktoren (wie z.B. die Ernährung) variiert werden, oder die Ausbeute des Milchvolumens in den Laktations-Induktions-Verfahren zu erhöhen, um ferner die Zeit zu verkürzen, die benötigt wird, um passende Mengen von rekombinanten Proteinen für vorklinische oder klinische Programme zu erhalten.
Das hohe Ausmaß der Expression von rekombinantem menschlichem ATIII, das in der Milch der CFF6-1-geklonten Ziege nachgewiesen wurde, veranschaulicht einen der wichtigsten Aspekte dieser Technologie. Indem der Kerntransfer mit der Induktion der Laktation in präpubertären Ziegen kombiniert wird, kann es möglich sein, transgene Tiere und die Proteine zu charakterisieren, die sie in 8 bis 9 Monaten ab der Zeit der Zelllinien-Transfektion der Milch-Expression ausscheiden. Die Menge der bei einer induzierten Laktation gesammelten Milch reicht nicht nur aus, die Ausbeute an rekombinantem Protein zu bestimmen, sondern ist auch für eine qualitative Analyse geeignet, wenn mg/ml Exprimierungsmengen erhalten werden (Glykosylierung, vorläufige Pharmakokinetik, biologische und pharmakologische Aktivitäten). Die ständige Verfügbarkeit der Zelllinie aus transfizierten Spenderzellen stellt auch sicher, dass sich genetisch identische Tiere schnell erzeugen lassen, um schnell therapeutische Proteine (mit vorhersagbaren Eigenschaften) zu erhalten.
BEISPIEL 3: VERLAUF DER ORGANISATION DES CYTOSKELETTS UND DES KERNS WÄHREND DER IN VITRO-REIFUNG DER OOCYTEN DER ZIEGE
Eine optimierte in vitro-Reifung der Ziegenoocyten ist essentiell für die Anstrengungen zur Charakterisierung der Dynamik des Zellzyklus während der gesamten Meiose in der Ziege und insbesondere bei den Anstrengungen zu einer Verbesserung der optimalen Reifung des Cytoplasmas und des Kerns für Kerntransfer-Verfahren. Die Ziegenoocyten wurden aus Follikeln von 2-5 mm von stimulierten (FSH) und nicht stimulierten (Schlachthaus) Tieren abgesaugt. Die Reifung der Oocyten wurde untersucht, indem die Dynamik der Mikrotubuli, der Mikrofilamente und des Kern in der GV (0-2-5 Stunden), der erwarteten M I (12,5 Stunden), der erwarteten M II (22-23 Stunden) und gealterten Oocyten (44 Stunden) geprüft wurden. Es wurde die Reifung der Oocyten in zwei unterschiedlichen Medien miteinander verglichen: M-199-Medium (Earle's Salze, 25 mM HEPES), 10% FBS, Glutamin (0,1 mg/ml); M-199, 10% Ziegenserum (aus Vollblut und nicht hitzeinaktiviert) uns Glutamin (0,1 mg/ml). Die Oocyten wurden gleichzeitig fixiert, indem sie 1 Stunde bei 37°C in einen Stabilisierungspuffer für das Cytoskelett (MTSB) eingetaucht, dann gewaschen und vor der Analyse in einer Blocklösung (PBS-Azid, 0,2% Milchpulver 2% normales Ziegenserum, 1% BSA, 0,1 M Glycin 0,1% Triton X-100) bei 4°C vor der Analyse gewaschen und aufbewahrt werden. Die Oocyten wurden für eine Immunfluoreszenz-Lokalisierung der Mikrotubuli, Mikrofilamente und des Chromatins unter Einsatz von monoklonalen Anti-α- und Anti-β-Tubulin-Antikörpern, Oregon Green phalloidin (Molecular Probes) bzw. Hoechst 33258, weiterbehandelt. Das Fluoreszenzsignal wurde unter Einsatz von sowohl der Standard-Immunfluoreszenz-Mikroskopie als auch der Konfokalmikroskopie sichtbar gemacht.
Vorläufige Schätzungen von in Gegenwart von FBS gereiften Oocyten zeigten, dass sich ungefähr 90% ungenau weiterentwickelten (N = 40 bis heute). Die Bildung der M I-Spindel war gefährdet, wobei dann das Ausstoßen eines Polkörpers unterblieb. Derartige Oocyten, die sich bis M II weiterentwickeln, taten dies, ohne dass der erste Polkörper ausgestoßen wurde und die M II-Spindel war ungenau im Zentrum der Zelle platziert anstatt in der Nähe des Cortex. Vorläufige Schätzungen von in Gegenwart von Ziegenserum gereiften Oocyten zeigten, dass sich ungefähr 90% durch die Meiose hindurch weiterentwickelten (N = 480 bis heute). Die Morphologie des am Cortex platzierten Mikrofilament-Netzwerks unterschied sich nicht signifikant von in FBS und Ziegenserum gereiften Oocyten. Es kann zu einem möglichen Defekt in der Dynamik der Polkörper-Ausstoßung kommen, welcher durch das Fehlen der ungenauen Morphogenese der M I-Spindel maskiert wird. Was das Cytoskelett anbelangt, gab es ferner keinen klaren Unterschied bei der Meiosereifung zwischen Oocyten, die von stimulierten und nicht stimulierten Tieren gesammelt wurden.
Diese Daten zeigen, dass FBS in der Ziege für eine normale meiotische Weiterentwicklung in vitro nicht ausreicht. Ein Ziegenserum enthaltendes Reifungsmedium begünstigt die Organisation und Dynamik von normalen Mikrotubuli und der Spindel sowie die erwarteten Merkmale der Meiose im Kern. Merkmale, wie die Entwicklung des Rands um den GV-Kern, welcher auf den Erwerb der Fähigkeit zur Meiose hinweist sowie die Kondensation der DANN, sind für eine Fortpflanzung in der M I und M II erforderlich. Das Ziegenserum, das nicht hitzeinaktiviert worden ist, da es nicht spezifisch aus einem Männchen oder Weibchen ausgewählt worden ist, muss ausreichend mit Hormonen, Gonadotropinen und anderen Faktoren angereichert sein, um in den Oocyten der Ziege die Weiterentwicklung der Meiose zu unterstützen.
BEISPIEL 4: KLONIEREN VON MÄUSEN
Die Aufgabe dieses Versuchs bestand darin, unter Einsatz von aktivierten Maus-Oocyten in der Telophase II in Kombination mit somatischen Zellen (Cumulus-Zellen) Kerntransfer-Embryos zu erzeugen.
Die Oocyten wurden von superovulierten Mäusen gesammelt, indem die Eileiter zum Sammeln von Oocyten im Telophase II-Stadium ausgespült wurden. Die Oocyten wurden sodann nach einem von zwei Verfahren aktiviert, um in vitro den Telophase II-Zustand zu erreichen: in Kultur induzierte Ca²⁺-Aktivierung oder Ionomycin-Aktivierung (4 μM, 5 min) und Befreiung vom Kern. Die Karyoplasten wurden aus Cumulus-Zellen gewonnen (natürliche G₀-Phase) und ein Kerntransfer durchgeführt, gefolgt von einer Elektrofusion mit Cytoplasten in der Telophase II.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 2 wiedergegeben. TABELLE 2 Entwicklung der Kerntransfer-Embryonen der Maus unter Verwendung des Verfahrens in der aktivierten Telophase II (Versuche 3 Mal wiederholt)
BEISPIEL 5: IN VITRO-REIFUNG VON TRANSPORTIERTEN SCHWEINE-OOCYTEN IN EINEM DEFINIERTEN PROTEINFREIEN MEDIUM
Die verbesserte Wirksamkeit der in vitro Embryoproduktion beim Klonieren von Embryonen mit Hilfe des Kerntransfers beruht auf einem genauen Verständnis der Zell- und Kernentwicklung während der in vitro Reifung (IVM) der Oocyten im Schwein. Das Ziel dieser Untersuchung war es, die Entwicklung der Dynamik des Chromatins und der Mikrotubuli in Schweine-Oocyten während der IVM unter Einsatz eines definierten proteinfreien Mediums aufzuzeigen. Die Follikel von Ovarien aus dem Schlachthof wurden mit 18G-Nadeln abgesaugt. Die Cumulus-Oocyten-Komplexe (COCs) wurden gewaschen und in 0,5 ml Röhrchen in voräquilibriertem (5% CO₂) M199-Medium kultiviert, das Polyvinylalkohol (0,1%) Cystein 0,1 mg/ml), EGF (10 ng/ml) Pen/Strep, hCG 10 I.E./ml) und PMSG (10 I.E./ml; Abeydeera et al., Biol. Reprod. 58: 1316-1320 (1998) enthielt. Die Oocyten wurden sodann über Nacht von einem Luftkurier transportiert (Minitube-Inkubator, 39°C). Nach dem Empfang (24 Stunden Reifung) wurden die COGs von Cumulus- und Koronazellen befreit und in einem Stabilisierungspuffer für die Mikrotubuli fixiert (1 Stunde, 37°C). Die fixierten Oocyten wurden vor ihrer Anfärbung bei 4°C aufbewahrt (PBS, 0,1% PVA). Es erfolgte eine Fluoreszenzfärbung für die Mikrotubuli und das Chromatin. Die gefärbten Oocyten wurden auf Deckgläsern angebracht (PBS/50% Glycerin) und bei 400-facher Vergrößerung ausgewertet (siehe Tabelle 3). TABELLE 3 Entwicklungsstadien von Schweine-Oocyten zu unterschiedlichen Zeitpunkten der in vitro-Reifung
Fortschreitende Veränderungen in der Konfiguration des Chromatins und der Mikrotubuli von Astern, die sich während der Prometaphase mit dem Chromatin assoziierten und weiter die Kondensation des Chromatins und eine Verlängerung der Meiose-Spindel bis zur Telophase I gefolgt vom Ausstoßen des ersten Polarkörpers wurden beobachtet und photographisch festgehalten. Schließlich ist der Prozentsatz der M II-Oocyten zur Stunde 44 nach der Reifung (76%) mit den Ergebnissen nach einer routinemäßigen IVM bei Verwendung desselben Verfahrens vergleichbar (86% Abeydeera et al., 1998). Unsere Daten zeigen, dass das definierte proteinfreie Medium die IVM von Schweine-Oocyten unterstützt, die während der ersten 24 Stunden der IVM über Nacht transportiert worden waren.
BEISPIEL 6: UNTERSCHIEDLICHE EXPRESSION VON E-CADHERIN UND Na⁺/K⁺-ATPase-PROTEINEN IN PARTHOGENETISCHEN SCHWEINEEMBRYONEN
Eine parthogenetische Aktivierung von Schweine-Oocyten unterstützt eine begrenzte und variable Entwicklung der Embryonen in vitro und in vivo. Da parthogene Tiere sich ohne elterliche Gene entwickeln, war das Ziel der Untersuchung, die Bewertung der Fähigkeit des maternalen Genoms, den Schlüsselprozess der Entwicklung der Embryokompaktierung und Kavernenbildung zu steuern. Die Expression und Lokalisierung des E-Cadherins, eines bei der Kompaktierung eine Rolle spielenden wichtigen Transmembran-Zelladhäsionsmoleküls, und der Na⁺/K⁺-ATPase, eines bei der Kavernenbildung eine Rolle spielenden aktiven Enzyms für den Transmembran-Ionentransport, wurden sowohl in in vivo gewonnenen Embryonen als auch in in vitro sich nach der Aktivierung entwickelnden parthenogenen Schweine-Embryonen charakterisiert. Die Ovarien der Schweine wurden aus Schlachthausmaterial erhalten und die Oocyten wurden abgesaugt (Follikel von 2,6 mm), in mit HEPES gepufferter Tyrode's-Lösung (HbT) gewaschen und in Waymouth MB-Medium, das 10 I.E. hCG, 10% fötales Rinderserum und 10% (v/v) Follikelflüssigkeit vom Schwein enthielt, 24 Stunden reifen gelassen, gefolgt von weiteren 24 Stunden ohne Hormone. Die Oocyten wurden mit Hilfe von elektrischen Pulsen (5 V Wechselstrom gefolgt von 1,44 kV/cm Gleichstrom über einen Zeitraum von 31,2 msec) in Hbt-0,3 M Mannit in 5% HbT aktiviert und chirurgisch in ligierte Eileiter von synchronen Empfänger-Jungsauen transferiert. Parthenogenetisch und in vivo (natürlicher Zyklus) erzeugte Embryonen wurden an den Tagen 3 oder 6 nach dem Transfer in den Teilungs- oder Morula-Stadien der Entwicklung gewonnen. Die Embryonen wurden gewaschen (2 × HbT) und in jedem der Stabilisierungspuffer für die Mikrotubuli (MTSB; 0,1 M PIPES, 5 mM MgCl₂, 2,5 mM EDTA, 0,01% Aprotinin, 1 mM DTT, 50% Deuteriumoxid, 1 μM Taxol^®, 0,1% Triton X-100, 3,7% Formalin) oder 4% Paraformaldehyd/0,5% Saponin über einen Zeitraum von 60 Minuten bei 37°C fixiert. Bestimmte Embryonen wurden für eine Immunfluoreszenz-Lokalisierung des E-Cadherins (Anti-E-Cadherin-MAB/GAR-Cy3, 23°C, 2 h) oder der Na⁺/K⁺-ATPase (Anti-α/β-Untereinheit MAB/GAR-Cy3, 23°C, 2 h) weiterbehandelt, gefolgt vom Anfärben des Kerns (Hoechst 33258, 10 μg/ml in PBS, 37°C, 15 min). Einzelne Embryonen wurden auf Objektträgern aus Glas befestigt (50% Glycerin in PBS) und dann mit Hilfe eines konventionellen und eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops analysiert. Die Färbung der Na⁺/K⁺-ATPase fiel zuerst an den aneinander stoßenden Zellgrenzen der Blastomeren der kompaktierten Morulae von sowohl in vivo- als auch parthenogenetischen Embryonen auf. Ähnlich waren die Untereinheiten der Na⁺-Pumpe einheitlich an den basalen seitlichen Domänen der Trophektoderm-Zellen von sowohl in vivo- als auch parthenogenetischen Blastocysten lokalisiert. E-Cadherin war an den Cortex-Regionen des Zell-Zell-Kontaktes in den meisten Blastomeren von Embryonen mit 8 Zellen und den nicht kompaktierten und kompaktierten Morulae sowie in den trophektodermalen Zellen von in vivo produzierten Blastocysten lokalisiert. Im Gegensatz dazu wurde beobachtet, dass E-Cadherin unter den Blastomeren von parthogenetischen Embryonen in allen embryonalen Stadien eine heterogene Cortex-Färbung aufwies. Ferner zeigten parthenogenetische Embryonen von geringer morphologischer Qualität eine ausgeprägte Zerrissenheit der E-Cadherin-Färbung am Cortex. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Expression des E-Cadherins (Kompaktierung) aber nicht der Na⁺/K⁺-ATPase (Kavernenbildung) für eine normale Differenzierung der Blastomere vor der Kompaktierung die Teilnahme des paternalen Genoms erfordern kann, da die unterschiedliche Expression dieser Proteine zeitlich mit der Genaktivierung der Zygote im Schwein zusammenfällt. Alternativ können die beobachtete heterogene Protein/Gen-Expression und die Lokalisierungsmuster in den Zellen das Ergebnis einer aberranten Aufspaltung der Chromosomen sein.

Claims

Verfahren zum Klonen eines nicht humanen Tieres welches die Schritte umfasst: a. Kombinieren eines nicht menschlichen Genoms aus einer aktivierten, differenzierten, somatischen Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen nicht humanen Kerntransfer-Embryo zu bilden; und b. Befruchten eines nicht humanen Tieres mit dem nicht humanen Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die für eine Trächtigkeit des geklonten nicht menschlichen Tieres geeignet sind, wobei das nicht humane Tier ausgewählt wird aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde und Wiederkäuer.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt der Aktivierung der Spenderzelle aufweist; oder welches ferner den Schritt aufweist, auf chemischem Wege, durch Röntgenbestrahlung, durch Bestrahlung mit einem Laser, durch physikalische Entfernung die Oocyte von ihrem Kern zu befreien und wahlweise den Schritt, die Temperatur oder Osmolarität oder die Zusammensetzung des die Oocyte umgebenden Mediums zu ändern, um den Spindelapparat der Meiose zu destabilisieren.
Verfahren zur Produktion eines nicht humanen transgenen Tieres, welches die Schritte umfasst: a. Kombinieren eines genmanipulierten nicht menschlichen Genoms aus einer aktivierten, differenzierten, somatischen Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen nicht humanen Kerntransfer-Embryo zu bilden; und b. Befruchten eines nicht humanen Tieres mit dem transgenen nicht humanen Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die für eine Trächtigkeit des nicht menschlichen transgenen Tieres geeignet sind, wobei das nicht humane Tier ausgewählt wird aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde und Wiederkäuer.
Verfahren zur Produktion eines nicht humanen transgenen Kerntransfer-Embryos, welches die Schritte umfasst: a. Kombinieren eines nicht menschlichen Genoms aus einer aktivierten, differenzierten, somatischen Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen Kerntransfer-Embryo zu bilden; und b. Befruchten eines nicht humanen Tieres mit dem Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die für eine Trächtigkeit des nicht menschlichen Kerntransfer-Embryos geeignet sind, wobei das nicht humane Tier ausgewählt wird aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde und Wiederkäuer.
Verfahren nach Anspruch 1, 3 oder 4, in welchem a. die Oocyte aktiviert wird, indem sie Bedingungen ausgesetzt wird, welche den Kalziumspiegel in der Zelle erhöhen und wahlweise ferner die Phosphorylierung in der Oocyte herabsetzen; oder b. die Oocyte aktiviert wird, indem sie Ethanol ausgesetzt wird, einer ionophoren oder elektrischen Stimulation in Gegenwart von Calcium unterzogen wird und wahlweise ferner die Phosphorylierung in der Oocyte herabgesetzt wird; oder c. die Spenderzelle aktiviert wird, indem die Nährstoffe im Serum der Spenderzelle reduziert werden und die Spenderzelle dann einem Serum mit einer erhöhten Menge an Nährstoffen ausgesetzt wird; oder d. ein nicht humanes Genom aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten Oocyte fusioniert wird; oder e. ein nicht humanes Genom aus einer aktivierten Spenderzelle mit einer aktivierten Oocyte kombiniert wird und ferner der Kern der aktivierten Spenderzelle mittels Mikroinjektion in die aktivierte Oocyte eingeführt wird.
Verfahren zur Produktion eines gewünschten Proteins in einem nicht humanen Tier mit den Schritten: a. Kombinieren eines nicht humanen Genoms aus einer aktivierten, differenzierten, somatischen Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen nicht humanen Kerntransfer-Embryo zu bilden, wobei das nicht humane Genom aus der aktivierten Spenderzelle das gewünschte Protein codiert; b. Befruchten eines nicht humanen Tieres mit dem nicht humanen Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die zur Trächtigkeit eines geklonten nicht humanen Tieres geeignet sind; und c. Reinigen des gewünschten Proteins aus dem geklonten nicht humanen Tier, wobei das nicht humane Tier ausgewählt wird aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde und Wiederkäuer.
Verfahren nach Anspruch 8, in welchem das gewünschte Protein in Gewebe, Zellen oder einem Körpersekret des geklonten Tieres exprimiert wird und in welchem wahlweise das Gewebe, die Zellen oder das Körpersekret ausgewählt werden aus der Gruppe Milch, Blut, Urin, Haar, Brustdrüse, Muskel, Viscera und in welchem wahlweise die Viscera ausgewählt werden aus der Gruppe Hirn, Herz, Lunge, Niere, Pankreas, Gallenblase, Leber, Magen, Auge, Dickdarm, Dünndarm, Harnblase, Gebärmutter und Hoden.
Verfahren zur Produktion eines heterologen Proteins in einem nicht humanen transgenen Tier mit den Schritten: a. Kombinieren eines genmanipulierten Genoms aus einer aktivierten, differenzierten, somatischen Spenderzelle mit einer aktivierten, kernlosen Oocyte, um dadurch einen nicht humanen Kerntransfer-Embryo zu bilden, wobei das Genom aus der aktivierten Spenderzelle das heterologe Protein codiert; b. Befruchten eines nicht humanen Tieres mit dem nicht humanen Kerntransfer-Embryo unter Bedingungen, die für eine Trächtigkeit des nicht menschlichen Kerntransfer-Embryos in ein geklontes nicht humanes Tier geeignet sind, und c. Gewinnen des heterologen Proteins aus dem geklonten nicht humanen Tier wobei das nicht humane Tier ausgewählt wird aus der Gruppe Mäuse, Ratten, Schweine, Pferde und Wiederkäuer.
Verfahren nach Anspruch 8, in welchem das genmanipulierte Genom einen funktionsfähig gebundenen Promotor aufweist und in welchem wahlweise der Promotor ausgewählt wird aus der Gruppe endogener Wirtspromotor, exogener Promotor und gewebsspezifischer Promotor und wobei wahlweise der gewebsspezifische Promotor ausgewählt wird aus der Gruppe Milchdrüsen-spezifischer Promotor, Blut-spezifischer Promotor, Muskel-spezifischer Promotor, Nerven-spezifischer Promotor, Haut-spezifischer Promotor, Haar-spezifischer Promotor und Harnorgan-spezifischer Promotor.
Verfahren zum Klonen des in Anspruch 1 beanspruchten nicht humanen Tieres, das ferner den Schritt der chemischen Entfernung des Kerns aus einer Oocyte umfasst.
Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem sich die differenzierte Spenderzelle vor ihrer Aktivierung in der G₀-Phase befindet und die Spenderzelle aktiviert ist, wodurch die Kombination des Spenderzellkerns und der aktivierten kernfreien Oocyte synchron ist, und in welchem wahlweise die differenzierte Spenderzelle eine Kumuluszelle ist.
Verfahren nach Anspruch 11, in welchem a. sich die aktivierte Spenderzelle in einer Phase des Mitose-Zellzyklus befindet, welche ausgewählt wird aus der Gruppe G₁-Phase, S-Phase und G₂/M-Phase; oder b. sich die aktivierte kernfreie Oocyte in einer Phase des Meiose-Zellzyklus befindet, welche ausgewählt wird aus der Gruppe Metaphase I, Anaphase I, Anaphase II und Telophase II.
Verfahren nach Anspruch 10, in welchem die chemische Entfernung des Kerns aus der aktivierten Oocyte den Schritt umfasst, dass die Oocyte mindestens einer Verbindung ausgesetzt wird, die den Spindelapparat der Meiose destabilisiert, wobei die Verbindung Demecolzin, Nocodazol, Colchicin oder Paclitaxel ist.
Verfahren nach jedem der vorhergehenden Ansprüche, in welchem die Wiederkäuer ausgewählt werden aus der Gruppe Kühe, Schafe, Ziegen, Kamele und Lamas.