DE69935156T2

DE69935156T2 - hCG THERAPIE ZUR BEHANDLUNG VON METASTATISCHEM BRUSTKREBS

Info

Publication number: DE69935156T2
Application number: DE69935156T
Authority: DE
Inventors: H. Irma Rydal RUSSO; Jose Rydal RUSSO; Giampiero Deluca; Ph. Jaak JANSSENS
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV; Fox Chase Cancer Center
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV; Fox Chase Cancer Center
Priority date: 1998-12-15
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2019-12-16
Also published as: CY1106525T1; JP2003523311A; BR9916221A; AR023726A1; US7183251B1; ES2277461T3; EP1013281A1; SI1140147T1; EP1140147A2; AU781495B2; WO2000035469A9; CA2351726A1; AU2363100A; DK1140147T3; WO2000035469A3; PT1140147E; WO2000035469A2; ATE353664T1; IL143671A0; IL143671A

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft den Bereich der Krebstherapie. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von humanem Chorion-Gonadotropin (hCG) bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von klinisch manifestiertem Brusttumor (Brustkrebs), der metastatisch ist. Ebenso betrifft sie die Behandlung eines Brusttumors bei nachklimakterischen Frauen. Das Medikament umfasst bevorzugt hCG zusammen mit einem Anti-Östrogen und/oder einem Typ-1-Interferon.
HINTERGUND DER ERFINGUNG
Brustkrebs verursacht seit Jahren den Tod von weltweit einer Viertelmillion Frauen, und es wird angenommen, dass er die Haupttodesursache bei Frauen im Alter zwischen 35 und 54 ist, womit er an zweiter Stelle, lediglich hinter den kardiovaskulären Erkrankungen bei Frauen im Alter über 55, liegt (W.P.D. Logan, Cancer of the female breast. International mortilaty trends. W.H.O. Stat. Rep. 28:232, 1975).
Brustkrebs macht etwa 27 % aller Malignome in der Welt aus. Trotz Verbesserungen bei der Früherkennung dieser Erkrankung ist sein Auftreten ansteigend, und die Sterblichkeitsrate wurde nicht signifikant verringert. Es besteht bekanntermaßen ein Zusammenhang zwischen einer frühen ausgetragenen Schwangerschaft und einer Reduktion des Risikos, im Laufe des Lebens Brustkrebs zu entwickeln; die Mechanismen, die diese schützende Wirkung vermitteln, wurden jedoch noch nicht aufgeklärt.
Im Rattenmodell inhibiert die Vollendung einer ausgetragenen Trächtigkeit vor der Verabreichung eines Karzinogens die Tumorentstehung. Maximale Brusttumor-Inzidenz tritt auf, wenn das Karzinogen jungen Ratten verabreicht wird (Russo und Russo, 1987, Lab. Invest. 57:112-137; Russo und Russo, 1978, J. Natl. Cancer Inst. 61: 1439-1442; Russo et al., 1979, Am. J. Pathol. 96:721-734). Die Tumor-Inzidenz nimmt signifikant ab oder verschwindet nahezu vollständig, wenn das Karzinogen geschlechtsreifen Ratten zwischen 3 und 9 Wochen nach der Entbindung mit oder ohne Laktation verabreicht wird. (Russo und Russo, 1980, Am. J. Pathol. 100:497- 511; Russo und Russo, 1980, Cancer Res. 40:2677-2687; Russo und Russo, 1982, Internat. Res. Com. (IRCS) 10:935-945; Russo und Russo, 1993, European J. Cancer Prevention 2:101-111).
Die Rolle, die endokrine Behandlung bei Brustkrebs spielt, wurde 1896 entdeckt, als Bateson beobachtete, dass Brustkrebs bei Frauen vor der Menopause einer Remission nach Oophorektomie unterliegt. Diese Entdeckung, die anschließend durch andere Wissenschaftler bestätigt wurde, stützte die Annahme, dass das Wachstum wenigstens einiger Brusttumoren direkt von Hormonen abhängig ist, was zu dem therapeutischen Ansatz einer Ablation endokriner Organe zum Zweck der Entfernung der endogenen Hormonquellen führte.
Nach der Entdeckung von Arzneimitteln, die spezifisch der Östrogenwirkung entgegenwirken, wurden diese eine attraktive Alternative zur chirurgischen Ablation. Es wurden mehrere Anti-Östrogen-Verbindungen bei vor- und nachklimakterischen Frauen in klinischen Versuchen der Phasen I und II getestet. Bisher erwies sich Tamoxifen als das Arzneimittel, welches der Wirksamkeit einer chirurgischen endokrinen Therapie am nächsten kommt, und welches im wesentlichen frei von schweren Nebenwirkungen ist. Eine umfassende Darstellung der therapeutischen Wirksamkeit von Anti-Östrogenen bei der Behandlung von Brustkrebs kann Legha & Carter, Antiestrogens in the treatment of breast cancer (Cancer Treat. Rev. 3:205, 1976) entnommen werden. Ein weiterer Review, der sich insbesondere mit der klinischen Erfahrung mit Tamoxifen befasst, ist der von Paterson et al., A review of the International clinical experience with Tamoxifen (Jpn. J. Cancer Clin. 11 (Suppl.): 157, 1981).
Ungefähr ein Drittel der Frauen mit Brustkrebs spricht auf hormonelle Therapie auf Anti-Östrogen-Basis an, wobei eine Erhöhung auf bis zu 70 % Ansprechbarkeit bei Patientinnen mit Rezeptor-reichen Tumoren erwartet wird. Tatsächlich wurde gezeigt, dass der Östrogen-Rezeptor-(ER)-Status prädiktiv für die Ansprechbarkeit bei Brustkrebspatienten ist (Allegra, J.C., Reviews on Endocrine related cancer. Paterson AHG, Lees AW eds Suppl. 14:115, 1984).
Chorion-Gonadotropin ist ein Glycoprotein-Hormon, welches aus zwei nicht-kovalent gebundenen (α- und β-) Untereinheiten zusammengesetzt ist (Labrie, Glycoprotein hormones: gonadotropins and thyrotropin. In: Hormones – From Molecules to Disease. Beanlien EE and Kelly PA – Chapman and Hall, New York and London, pp. 257-275, 1990). Es wird früh während der Schwangerschaft durch den sich entwickelnden Embryo und während der gesamten Schwangerschaftsdauer durch die Synzytiotrophoblasten der Plazenta synthetisiert und im Urin ausgeschieden.
Humanes Chorion-Gonadotropin wird aus dem Urin schwangerer Frauen sowohl für experimentelle Zwecke als auch klinische Verwendungen gewonnen. Das Hormon kann ebenso über den rekombinanten Weg hergestellt werden (WO 85/01959). Die bekannte Hauptfunktion von hCG ist die Stimulierung der Gonaden-Steroidhormon-Produktion durch seine Interaktion mit dem LH/CG-Rezeptor, welcher in den Granulosa-Zellen der Ovarien bei der Frau und in den Hoden-Leydig-Zellen beim Mann vorkommt.
Jüngere Studien zeigen, dass Urin-hCG ein potentes präventives Agens ist, welches chemisch-induzierte Brusttumorentstehung durch Induktion der Differenzierung inhibiert (Russo et al. J. Natl. Cancer Inst. 82:1286-1289, 1990). Weitere Experimente zeigten, dass eine hCG-Behandlung von Ratten, die Karzinogenen ausgesetzt waren, diese vor einer Tumorentwicklung schützte (Russo et al., Br. J. Cancer 62: 2343-2347, 1990). HCG inhibiert außerdem die Proliferation von normalen und neoplastischen humanen Brustepithelzellen (Alvarado et al., In Vitro 30A: 4-8, 1994). Zudem stellte sich heraus, dass Urin-hCG aus verschiedenen Quellen inhibitorische Wirkung auf neoplastische Zelllinien aus verschiedenen Organen oder Systemen hat (Gill et al., J. Natl. Cancer Inst. 89: 1797-1802, 1997; Albini et al., AIDS 11: 713-721, 1997; Mgbonyebi et al., Proc. Annu. Meet. qA, Soc. Cancer Res. 38, PP. A1977, XP002109660, 1997).
Die internationale Patentanmeldung WO 97/49432 beschreibt die Induktion von Zelltod von Brustkrebszellen in vitro durch Behandlung der Zellen mit Urin-hCG. Die gleiche Wirkung wurde mit verschiedenen Fraktionen und der hCG-β-Untereinheit beobachtet.
Zwei weitere Studien, die jeweils in einem Rattenmodell durchgeführt wurden, zeigten, dass Urin-hCG ein präventive Wirkung gegen Karzinogen-induzierte Ratten-Brusttumoren aufweist (Srivastava et al., Carcinogenesis 18: 1799-1808, 1997 und You et al., Cancer Research 58/7: 1498-1502, 1998). Die Ratten wurden mit täglichen Dosen von Urin-hCG über mehrere Wochen vor der Tumor-Induktion vorbehandelt und zu verschiedenen Zeitpunkten nach fortgesetzter hCG-Behandlung getötet. In den vorbehandelten Ratten war das Auftreten von Karzinom-induzierten Brusttumoren reduziert.
Ebenso wurde beobachtet, dass Frauen, die aufgrund von Unfruchtbarkeit oder Gewichtsverlust einer Behandlung mit Urin-hCG unterzogen worden waren, eine reduzierte Inzidenz von Brustkrebs zeigten (Bernstein et al., Cancer Epidemiol., Biomarkers and Prev. 4: 437-440, 1995). Bei diesen Beobachtungen handelte es sich jedoch lediglich um Schlussfolgerungen; Studien, die auf eine Messung der Wirkung von hCG bei der Behandlung von humanem Brustkrebs gerichtet sind, wurden bisher nicht beschrieben. Aus dem Rattenmodell wurde lediglich auf eine schützende Wirkung von Urin-hCG auf die Entwicklung von Krebs geschlossen, wenn das hCG (zeitlich) sehr nahe zur Initiation der Karzinogenese verabreicht wurde. Beim Menschen wird Brustkrebs jedoch gewöhnlich erst diagnostiziert, nachdem er sich bereits als tastbarer Knoten etabliert hat oder durch diagnostische Mammographie detektierbar ist.
Die US-Patente 5,700,781 (Harris, 1997), 5,677,275 und 5,877,148 (Lunardi-Iskandar et al., 1997, 1999) sowie die Internationale Patentanmeldung WO 96/04008 offenbaren Verfahren zur Behandlung von Krebs, wie beispielsweise dem Kaposi-Sarkom, welche die Verabreichung von Urin-hCG beinhalten. Bei dem Kaposi-Sarkom, von dem angenommen wird, dass es endothelialen Ursprungs ist, scheint das hCG die gleiche anti-proliferative Wirkung zu haben, wenn es in Mäuse injiziert wird, bei denen ein metastatisches Kaposi-Sarkom etabliert ist.
Kürzlich wurden die Anti-Tumor-Wirkungen von hCG durch eine Reihe von Experimenten durch die Gruppe von Robert Gallo untersucht und hinterfragt (Lunardi-Iskandar et al., Nature Med. 4: 428-434, 1998, und Kommentare auf den Seiten 370 und 390 bis 391 der gleichen Ausgabe). Diese Experimente zeigten überzeugend, dass die Anti-Kaposi-Sarkom (KS)-Wirkung von hCG-Präparationen nicht auf hCG selbst, sondern vielmehr auf einen nicht identifizierten Urin-Faktor, der als HAF (hCG-assoziierter Faktor) bezeichnet wird, zurückzuführen sind. Eine Anzahl von kommerziell erhältlichen hCG-Präparationen (klinische Qualität und gereinigt), sowie Untereinheiten, Fragmente und rekombinantes hCG wurden auf ihre inhibitorische Aktivität auf neoplastischen KS-Zellen in vitro und in In-vivo-Tiermodellen getestet. Weder gereinigtes Urin noch gereinigtes rekombinantes hCG, Untereinheiten oder Fraktionen von hCG hatten irgendeine Wirkung in dem In-vivo-Tiermodell bzw. dem In-vitro-Assay.
Die Tatsache, dass frühe Trächtigkeit von Mäusen zu einer KS-Tumor-Regression führt, obwohl Mäuse überhaupt kein hCG produzieren, stützt ebenfalls diese Ergebnisse.
Zusammengefasst häuften sich die Hinweise, dass die vorteilhaften Wirkungen von hCG bei der Behandlung von Krebs lediglich ein Artefakt ungenügender Proteinaufreinigung darstellten, wobei das tatsächliche Anti-Tumor-Agens bis heute ein nicht identifizierter Faktor in Zusammenhang mit früher Schwangerschaft ist. Die mit rekombinantem hCG erhaltenen Ergebnisse zusammen mit der Tatsache, dass die Quelle des hCG-assoziierten Faktors "HAF" humaner Urin aus dem ersten Schwangerschaftsdrittel ist, schloss die Möglichkeit aus, dass irgendeine Anti-Tumor-Aktivität aus rekombinanten hCG-Präparationen erhalten werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung fanden nun überraschenderweise heraus, dass sowohl Urin als auch rekombinantes hCG effektiv bei der Behandlung von humanem Brustkrebs ist. Diese Feststellung überwindet das Vorurteil innerhalb der Wissenschaft, das auf den oben beschriebenen Experimenten von Gallo et al. (Lunardi-Iskandar et al., supra) beruht, wonach die Anti-Tumor-Aktivität nicht auf hCG zurückzuführen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von konklamaten und metastatischen Brusttumoren, die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen und Erzeugnisse, welche derartige pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten.
Konklamate humane Brusttumoren sind Brusttumoren, die bereits klinisch manifestiert sind.
Andere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden anhand der Zeichnungen und der folgenden detaillierten Beschreibung und Beispiele besser verständlich.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Das Histogramm zeigt die Wirkung einer r-hCG-Behandlung auf den proliferativen Index von primärem humanen Brustkrebs (ki67+-Zellen). Frauen mit klinisch sichtbarem, neu diagnostiziertem Brustkrebs wurden einer Vorbehandlung in Form von Nadelbiopsien der Brustmasse unterzogen. Sie erhielten dann entweder an jedem folgenden Tag Injektionen von 500 mcg r-hCG oder wurden nicht behandelt. Die Brustmasse wurde dann durch Lumpektomie oder Mastektomie entfernt. Der proliferative Index der Nadel-Biopsien und entfernten Tumoren wurde durch immunohistochemische Anfärbung auf ki67+-Zellen bestimmt.
2. Das Histogramm zeigt die Wirkung einer r-hCG-Behandlung auf die Östrogen-Rezeptor-Expression von primärem humanen Brustkrebs (ER+-Zellen). Frauen mit klinisch sichtbarem, neu diagnostiziertem Brustkrebs wurden einer Vorbehandlung in Form von Nadel-Biopsien der Brustmasse unterzogen. Dann erhielten sie entweder an jedem folgenden Tag Injektionen von 500 mcg r-hCG oder wurden nicht behandelt. Die Brustmasse wurde dann durch Lumpektomie oder Mastektomie entfernt. Die Östrogen-Rezeptor-Expression der Tumorzellen in den Nadel-Biopsien und den entfernten Tumoren wurde durch immunohistochemisches Anfärben auf ER+-Zellen bestimmt.
3. Das Histogramm zeigt die Bewertung der Antwort von Patientinnen mit metastatischem Brustkrebs, die mit r-hCG behandelt worden waren. Die Patientinnen wurden in folgende Kategorien eingeteilt: PD = fortschreitende Erkrankung; SD = stabile Erkrankung; PD = teilweises Ansprechen; CR = vollständiges Ansprechen.
4. Schematisches Diagramm des experimentellen Protokolls, welches zum Testen der präventiven und therapeutischen Wirksamkeit von rekombinantem und humanem Urin-Chorion-Gonadotropin (hCG) auf Ratten-Brustkrebs in vivo entworfen wurde.
5. Die Wirkung von Plazebo, r-hCG und u-hCG auf die Tumorlast. Die Anzahl der Tumoren pro Tier in jungfräulichen Ratten, die zu den in 4 angegebenen Zeiten mit Plazebo: Versuchsgruppen 1 (R1), 4 (R4) und 9 (R9); rekombinantem hCG: Versuchsgruppen 2 (R2), 5 (R5) und 7 (R7) oder Urin-hCG: Versuchsgruppen 3 (R3), 6 (R6) und 8 (R8) behandelt wurden.
6. Grafik, welche den Zeitverlauf der Inhibition der Tumorlast in Ratten durch r-hCG und u-hCG zeigt.
7. Proliferations-Experimente unter Verwendung der humanen Brustkrebs-Zelllinie CG-5. Die Zellen wurden in einem Kulturmedium, welches eine festgesetzte Menge Tamoxifen (TAM) und verschiedene Konzentrationen hCG enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden nach 3 Tagen (7A) und 6 Tagen (7B) gezählt; die Zellzahlen sind prozentual in Bezug auf die Anzahl der Kontrollzellen wiedergegeben. Die gepunktete Linie stellt die Wirkung von 10^–7 M Tamoxifen allein dar. Das Tamoxifen wird entweder gleichzeitig mit (schwarze Kreise) oder nach (schwarze Dreiecke) dem hCG zugegeben.
8. Das Histogramm zeigt die Ergebnisse des Proliferations-Experiments unter Verwendung der humanen Brustkrebs-Zelllinie CG-5, wobei das Kulturmedium nur mit hCG supplementiert war.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wurde nun gezeigt, dass hCG wirksam ist bei der Behandlung von konklamaten, humanen Brusttumoren, das heißt, von Brusttumoren, die bereits klinisch manifestiert und metastatisch sind. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von klinisch manifestierten oder offensichtlichen Brusttumoren, die metastatisch sind.
Unter "klinisch manifestiert" wird verstanden, dass sie unter Anwendung klinischer diagnostischer Verfahren, wie beispielsweise Palpation (Tasten), Mammographie, Ultraschall oder anderer bildgebender diagnostischer Verfahren, wie beispielsweise Thermographie, Lichtabtastung (Scannen), Xeroradiographie oder Magnetresonanzbildgebung (MRI), Szintigraphie usw., oder durch den diagnostischen Nachweis durch histologische Untersuchung von Biopsie-Material, wie beispielsweise Fein-Nadel-Aspirations-Biopsie, oder durch serologische Marker detektierbar sind.
Brustkrebs tritt bei Frauen und Männern auf. Jedoch sind weit häufiger Frauen betroffen. Brustkrebs kann bei Frauen vor oder nach der Menopause auftreten. Die Erfindung betrifft somit ebenso die Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von metastatischen Brusttumoren bei vor- und nachklimakterischen Frauen, obwohl sie auch zur Behandlung von metastatischem Brustkrebs bei Männern geeignet ist.
Wie aus den klinischen Studien an postklimakterischen Frauen hervorgeht, die unten in Beispiel 2 dargestellt sind, wiesen die behandelten Frauen zweidimensional messbare oder tastbare Läsionen auf, und es lag der klinische Beweis einer metastatischen Erkrankung vor; das hCG hatte bei mehr als 50 % der Patientinnen eine positive Wirkung auf den Verlauf der Erkrankung. Die Erfindung betrifft somit bevorzugt die Behandlung von Brusttumoren bei Frauen nach der Menopause. Äußerst bevorzugt ist die Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von metastatischem Brustkarzinom bei postklimakterischen Frauen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird hCG als Adjuvans in Kombination mit anderen Krebstherapien verwendet. Zu anderen Krebstherapien zählen beispielsweise Mastektomie, Lumpektomie, segmentale Mastektomie und jegliche andere chirurgische Behandlung sowie Chemotherapie oder Therapie mit Arzneimitteln oder Arzneimittel-Kombinationen.
Beispielsweise stellte sich heraus, dass bestimmte endokrine Therapien mit Anti-Östrogenen, Progestinen oder Aromatase-Inhibitoren wirksam bei der Behandlung von Brustkrebs sind. Anti-Östrogene sind besonders effektiv bei der Behandlung von Östrogen-Rezeptor (ER)-positiven Tumoren, da sie an den ER binden und die Bindung von Östrogen an seinen Rezeptor kompetitiv blockieren. Die Erfindung betrifft somit ebenso die Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Brustkrebs, wobei die behandelten Tumorzellen Östrogen-Rezeptor-positiv sind, und die Verwendung von hCG in Kombination mit einem Anti-Östrogen. Die Verabreichung von hCG und dem Anti-Östrogen kann gleichzeitig, sequentiell oder separat erfolgen.
Die Verabreichung des Anti-Östrogens im Anschluss an die Behandlung mit hCG ist besonders bevorzugt. Besonders gut geeignet ist das Anti-Östrogen Tamoxifen, welches oral in einer täglichen Menge von etwa 30 Milligramm (mg) verabreicht werden kann. Obwohl Tamoxifen das bevorzugte Anti-Östrogen darstellt, werden andere Substanzen mit analoger Wirkung von dem Begriff "Anti-Östrogen" gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Geeignete Verbindungen sind beispielsweise in einem Review von Legha und Carter: "Antiestrogenes in the treatment of breast cancer" beschrieben (Cancer Treat. Rev. 3:205, 1976).
Die Menge an hCG, die erfindungsgemäß verabreicht wird, beträgt 100 bis 20.000 Internationale Einheiten (IU) pro Tag oder äquivalente Mengen in Mikrogramm (μg). Die Einheit (Unit) "IU" ist spezifisch auf biologisch wirksame Substanzen angepasst. Die Internationale Einheit "IU" von hCG ist die Aktivität, die in einer festgesetzten Menge des internationalen Standards, welcher aus einer Mischung von gefriergetrocknetem Extrakt von Chorion-Gonadotropin aus dem Urin schwangerer Frauen mit Laktose besteht, enthalten ist. Die Äquivalenz in den Internationalen Einheiten des Internationalen Standards wird durch die Weltgesundheitsorganisation festgelegt. Die Potenz von hCG ist in internationalen Einheiten pro Milligramm ausgedrückt. Die Bestimmung der Potenz ist in der European Pharmacopoeia 1997, pp. 913-914 oder in USP, Gold/Official Monographs, p. 718, beschrieben. Der Proteingehalt einer Präparation kann durch jegliche auf dem Gebiet bekannten Assay zur Proteinbestimmung gemessen werden, wie beispielsweise durch den Lowry-Protein-Assay oder den Bradford-Protein-Assay, die auf der Messung der optischen Dichte basieren und einem Fachmann auf dem Gebiet geläufig sind.
Kommerzielle Urin-hCG-Präparationen besitzen einen spezifischen Aktivitätsbereich von bspw. 2.000 bis 10.000 IU/mg. Rekombinante hCG-Präparationen können eine spezifische Aktivität von sogar 20.000 IU/mg aufweisen. Bevorzugt sind tägliche Dosen im Bereich von 5.000 bis 10.000 IU pro Tag pro Patient. Bei Verwendung der Masse zur Dosierung wird das erfindungsgemäße Medikament in einer Menge von 50 bis 10.000 Mikrogramm pro Patient pro Tag verabreicht. Bevorzugt ist eine Menge von 250 bis 3.000 Mikrogramm pro Patient pro Tag. Bevorzugt wird das erfindungsgemäße Medikament jeden zweiten Tag oder dreimal wöchentlich verabreicht.
Die Dauer der hCG-Verabreichung beträgt bevorzugt mehrere Wochen. Insbesondere wird das erfindungsgemäße Medikament alle zwei Tage und über 12 Wochen verabreicht. Äußerst bevorzugt ist eine Verabreichung alle zwei Tage über ungefähr 12 Wochen; dieser Behandlungsplan ist insbesondere geeignet zur Behandlung von metastatischem Brustkrebs bei nachklimakterischen Frauen.
Das erfindungsgemäße Medikament kann lokal, das heißt, direkt in oder auf den Tumor, oder in den Blutstrom verabreicht werden. Es kann ebenso intramuskulär verabreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform geschieht die Verabreichung subkutan.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung, welche eine pharmazeutisch wirksame Menge von hCG und einem Anti-Östrogen in Gegenwart eines oder mehrerer pharmazeutisch akzeptabler Arzneistoffträger enthalten, zur gleichzeitigen, sequentiellen oder separaten Verwendung der aktiven Komponenten bei der Behandlung von Brustkrebs.
Zu geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Arzneistoffträgern zählen jegliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien und Ähnliches, welche für den gewünschten Verabreichungsweg der pharmazeutischen Präparation geeignet sein können. Die Verwendung derartiger Arzneistoffträger für pharmazeutisch aktive Substanzen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Solange irgendein konventionelles Medium oder Agens nicht mit den zu verabreichenden Zusammensetzungen inkompatibel ist, wird von seiner Eignung und Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung ausgegangen. In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen hCG oder ein biologisches Äquivalent davon (bevorzugt 250 bis 500 μg hCG) und einen Zucker (bevorzugt 30 bis 60 mg Saccharose) in einem Phosphatpuffer. Die Präparation wird bevorzugt für die Lagerung und den Transport lyophilisiert und dann vor der Verwendung mit Wasser oder Salzlösung wiederhergestellt.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen sollen in einer Menge von 100 bis 20.000 IU oder einer äquivalenten Masse, berechnet anhand der spezifischen Aktivität (bevorzugt etwa 500 μg, äquivalent zu ungefähr 10.000 IU) verabreicht werden; bevorzugt werden sie subkutan verabreicht. Das bevorzugte Anti-Östrogen zur Verwendung in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen ist Tamoxifen, welches oral in einer täglichen Menge von ungefähr 30 mg verabreicht wird.
Interferone (IFNs) sind eine gut bekannte Familie von Proteinen, von denen gezeigt wurde, dass sie sowohl antivirale als auch Zellwachstums-inhibierende Wirkungen aufweisen. Aus diesem Grund wird in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein Interferon, bevorzugt ein Typ-I-Interferon, bei der Behandlung von Brustkrebs in Kombination mit hCG und einem Anti-Östrogen verwendet. Diese Kombination führt zu einer weiteren Reduzierung des Wachstums der Brustkrebszellen. Der Ausdruck "Typ-I-Interferon" soll IFN-α (alpha), IFN-β (beta), IFN-ω (omega) oder IFN-τ umfassen.
Interferone weisen eine große Anzahl zellulärer Wirkungen auf Krebszellen sowie auf normale Zellen auf; dazu gehören unter anderem Wirkungen auf den Zellphänotyp, wie beispielsweise die Expression von Oberflächen-Antigenen und Rezeptoren. Experimente zeigten, dass Typ-I-IFN das Hormon-Rezeptor-Niveau in Brustkrebszellen modifiziert. Beispielsweise beschreiben Pouillart et al. in "Administration of fibroblast interferon to patients with advanced breast cancer: possible effects on skin metastasis and on hormone receptors" (Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 18: 929-935, 1982) die Wirkung von humanem Fibroblasten-Interferon, welches Patienten mit metastasiertem Brustkrebs verabreicht wurde, und stellten eine Erhöhung der Rezeptoren für Östrogene und Progestine fest. Aus diesen Gründen umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung von hCG und Typ-I-Interferon zusammen mit einem Anti-Östrogen bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Brustkrebs sowie einer pharmazeutischen Zusammensetzung zu diesem Zweck zur gleichzeitigen, separaten oder sequenziellen Verwendung der aktiven Komponenten bei der Behandlung von Brustkrebs.
Erfindungsgemäß können verschiedene Formen von hCG effektiv verwendet werden. Dazu zählen das vollständige hCG-Dimer und jegliches Fragment davon, das die gleiche bzw. ähnliche biologische Aktivität von hCG und/oder Bindungsaktivität an den hCG-Rezeptor aufweist. Das hCG kann entweder "nativ", das heißt, aus natürlichen humanen Quellen (beispielsweise Urin) oder Zelllinien gewonnen, oder "rekombinant", das heißt, aus genetisch konstruierten oder auf andere Weise modifizierten bakteriellen Zellen, Hefezellen oder eukaryontischen Zellen erhalten, sein.
Bekanntermaßen wird der zelluläre Rezeptor, an den hCG bindet, ebenso von dem Lutenisierenden Hormon (LH), einem Hormon, das ebenso eine ähnliche Struktur wie hCG aufweist, erkannt und gebunden. Aus diesem Grund umfasst die vorliegende Erfindung ebenso die Verwendung von LH als Substitut oder Supplement für hCG in jeglichen hierin beschriebenen Medikamenten, pharmazeutischen Präparationen und Verfahren. Die angemessene Dosierung und Anleitung zur Verabreichung von LH ist proportional zu der von hCG, wobei (als Daumenregel) 1 IU hCG ungefähr äquivalent zu 7 IU LH ist.
Im Hinblick auf die gemeinsame Struktur zwischen den Alpha-Untereinheiten von FSH (Follikel-stimulierendes Hormon), TSH (Thyroid-stimulierendes Hormon), LH und hCG, ist die vorliegende Erfindung ebenso auf die Verwendung von FSH-, TSH- und LH-Fusionsproteinen gerichtet, wobei die Beta-Untereinheit derart modifiziert ist, dass das resultierende Fusionsmolekül hCG-artiges Verhalten zeigt. Die hier in Erwägung gezogenen Fusionsmoleküle sind im Stand der Technik, beispielsweise von Dias et al., J. Biol. Chem. 269 (41): 25289-25294 (1994); und Grossman et al., J. Biol. Chem. 272 (24): 15532-15540 (1997), beschrieben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung stellte sich überraschenderweise heraus, dass bereits existierende Brustkarzinome mit hCG, insbesondere mit r-hCG, behandelt werden können, da programmierter Zelltod als Wirkungsweise des Urin-hCG sowohl beim Kaposi-Sarkom als auch bei Brustkrebs eine Rolle spielt; die zuvor erwähnten Veröffentlichungen schrieben die Apoptose-Aktivität der Urin-hCG-Präparationen den hCG-assoziierten Faktoren (HAFs) und nicht dem hCG selbst zu (Lundardi-Iskandar et al., Nature Medicine 4:428-434, 1998; Samaneigo et al., J. Natl. Cancer Inst. 91:135-143, 1999).
Im Hinblick auf die oben beschriebenen unerwarteten Ergebnisse betrifft die vorliegende Erfindung ebenso die Verwendung von hCG und insbesondere r-hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention metastatischer Brusttumoren. Ebenso werden pharmazeutische Zusammensetzungen zur Prävention metastatischer Brusttumoren zur Verfügung gestellt, welche r-hCG allein oder in Kombination mit einem oder mehreren weiteren prophylaktischen oder therapeutischen Agenzien enthalten, entsprechend den oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen zur Behandlung klinisch manifestierter metastatischer Brusttumoren.
Die Dosierung des erfindungsgemäßen Medikaments, der Dosierungsplan und die Dauer der Behandlung zur Prävention metastatischer Brusttumoren sollten denen, die zur Behandlung von klinisch manifestierten Tumoren verwendet werden, entsprechen oder ähnlich sein. Somit beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform die Dosierung von hCG für einen humanen Patienten 100 IU bis 50.000 IU (Internationale Einheiten) pro Dosis; in einer bevorzugteren Ausführungsform beträgt sie 1.000 IU bis 20.000 IU. In einer bevorzugtesten Ausführungsform beträgt die Dosis 10.000 IU. Der Dosierungsplan kann von einmal wöchentlich bis siebenmal wöchentlich reichen, bevorzugt ist jedoch die Verabreichung alle zwei Tage oder dreimal wöchentlich. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Dosis nach Dosierungsplan dreimal wöchentlich gegeben. Die Dauer der Verabreichung von r-hCG beträgt bevorzugt einige Wochen, am bevorzugtesten ungefähr 12 Wochen.
Erfindungsgemäß werden ebenso Erzeugnisse zur Verfügung gestellt, um die Verwendung von hCG (einschließlich u-hCG, r-hCG, hCG-β-Untereinheit oder irgendeinem anderen hCG-Fragment oder -Derivat mit Anti-Krebs-Aktivität), hLH oder Fusionsproteinen, enthaltend eine hCG-β-Untereinheit und entsprechende Untereinheiten von FSH, TSH oder LH, in einem Medikament oder als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung in den oben beschriebenen Verwendungen zur Behandlung klinisch manifestierter metastatischer Brusttumoren zu erleichtern. Derartige Erzeugnisse umfassen Verpackungsmaterial, eine pharmazeutische hCG-Zusammensetzung innerhalb des Verpackungsmaterials und ein Etikett, das anzeigt, dass das darin enthaltene pharmazeutische Agens zur Prävention oder Behandlung von Brusttumoren geeignet ist.
In den folgenden Beispielen wird die Erfindung detaillierter beschrieben. Sie sollen der Veranschaulichung der Erfindung dienen, ohne diese einzuschränken.
BEZUGSBEISPIEL 1
Rekombinantes humanes Chorion-Gonadotropin inhibiert primäres Brusttumorwachstum bei nachklimakterischen Frauen
Die Wirksamkeit von hCG wurde bewertet, indem Patientinnen mit neu diagnostiziertem primärem Brustkrebs mit diesem Hormon behandelt wurden. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde beurteilt, indem bestimmt wurde, ob die Verabreichung von 10.000 IU hCG jeden zweiten Tag über zwei Wochen an Frauen mit neu diagnostiziertem Brustkrebs die Tumorgröße reduziert, die Zellproliferation inhibiert und den prozentualen Anteil der Zellen, die Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren exprimieren, modifiziert. Die systemische Wirkung des Hormons wurde bewertet, indem die Serumniveaus der hypophysären und ovarialen Hormone zu verschiedenen Zeitpunkten der Behandlung bestimmt wurden. In dieser Studie wurde r-hCG verwendet.
Auswahl der Patientinnen.
An dieser Studie nahmen 25 nachklimakterische Frauen teil. Die Patientinnen wiesen tastbare und zweidimensional messbare primäre Brustkrebs mit einem klinischen Durchmesser von über 1,5 cm auf. Der Tumor wurde durch histopathologische Analyse bestätigt. Beim Eintritt in die Studie gab es keinen Hinweis auf eine metastatische Erkrankung. Die Patientinnen wiesen angemessenes Knochenmark und angemessene Leber- und Nierenfunktion auf. Patientinnen mit ulzerierten Tumoren, bei denen die Haut eines entzündlichen Brustkarzinoms betroffen war, wurden ausgeschlossen. Unter den Patientinnen wurden keine konkomitanten hypophysären oder ovarialen Tumoren beobachtet. Es bestand keine aktive Thrombophlebitis oder beschriebene Allergie auf hCG. Keine der Patientinnen war einer hormonellen Ersatztherapie unterzogen worden. Ein Routine-Stufenverfahren bestand aus der cytologischen Bewertung einer Nadelpunktion der betreffenden Läsion, einer Anamnese, gründlicher physischer und gynäkologischer Untersuchung, Brust-Radiographie, Sonographie der Leber, des Abdomens und des Beckens, Knochen-Szintigraphie, Blutuntersuchung -einschließlich CA 15.3-Tumormarker, Mammographie und Sonographie der Brüste. Der primäre Tumor wurde durch klinische Untersuchung, Mammographie und Sonographie unmittelbar vor dem chirurgischen Eingriff gemessen.
Probengewinnung und Behandlung nach dem chirurgischen Eingriff.
Nach Information und mit Zustimmung wurden die Patientinnen einer Kernbiopsie des primären Tumors unter lokaler Anästhesie mit einer Pistole, auf die eine Biopsienadel mit einer Feinheit von 12-14 (Gauge) vom "Tru-Cut"-Typ (Bard, Covington, USA) aufgesetzt war, unterzogen. Dieses Verfahren stellt die Standardbehandlung dar, aus diesem Grund war kein Abweichen von den diagnostischen Routineverfahren erforderlich. Die Kern-Nadelbiopsie wurde durch Gefrierschnitt-Technik untersucht. Wenn der Gefrierschnitt eine positive Malignität ergab, wurden drei weitere Nadelbiopsien aus dem Tumor genommen, um die oben beschriebenen Ersatzmarker (Surrogat-Marker) zu bestimmen. Am gleichen Tag 0 (Vorbehandlung) wurde eine Serumprobe zur Bestimmung der Grundniveaus von Inhibin, Östrogen, Progesteron, FSH, LH und der β-Untereinheit von hCG genommen. Die Serumprobe, genau wie alle nachfolgenden Seren, wurde aus einer Blutprobe erhalten und unmittelbar bis zum Tag der Lieferung an das Forschungslabor bei –70 °C eingefroren. Die anderen Serumproben wurden an den Tagen 5, 9 und 13 genommen. Am Tag 15 der hCG-Behandlung wurde die Patientin einem chirurgischen Eingriff unterzogen, welcher in einer Mastektomie bestand, wenn angenommen wurde, dass die Tumormasse (einschließlich "in-situ"-Komponenten) größer als 3 cm war; anderenfalls wurde die Brust erhalten und eine Lumpektomie durchgeführt. Die Brusterhaltung wurde lediglich dann praktiziert, wenn die chirurgischen Grenzbereiche erkrankungsfrei waren. Eine Lymphknoten-Sektion der Achselhöhle wurde routinemäßig durchgeführt. Alle herausgeschnittenen Gewebe wurden an ein Pathologie-Laboratorium zur mikroskopischen Untersuchung geschickt.
Nach dem chirurgischen Eingriff wurden die Patientinnen einer adjuvanten Behandlung unterzogen. Sie bestand aus 20 mg Tamoxifen pro Tag, wenn der Tumor größer als 3 cm war oder pathologische Lymphknoten vorlagen. Hormonelle adjuvante Therapien werden normalerweise über 5 Jahre fortgesetzt. Eine Bestrahlung nach dem chirurgischen Eingriff wurde in den Fällen durchgeführt, in denen die Brust erhalten worden war, wenn die Grenzen der Resektion der Brustwand positiv waren, oder wenn die Tumoren medial lokalisiert waren. Die Brust wurde mit bis zu 50 Gray in 25 Fraktionen von 2 Gray bestrahlt. An der Stelle des primären Tumors wurde auf bis zu 66 Gray erhöht. Die subklavikularen Lymphknoten und die Brustwand erhielten eine Dosis von 46 Gray in 23 Fraktionen von 2 Gray. Es wurden wöchentlich 5 Fraktionen verabreicht. Nach der primären Behandlung wurde die Patientin alle drei Monate zur klinischen Untersuchung und Blutuntersuchung einbestellt. Außerdem wurde jährlich eine radiologische Kontrolle durchgeführt. Im Fall eines Wiederauftretens der Erkrankung wurde eine Behandlung für rückfälligen Brustkrebs eingeleitet.
Hormonelle Behandlung:
Dosis und Plan. Die für diese Studie ausgewählten Patientinnen erhielten intramuskulär (IM) 10.000 Units des experimentellen Wirkstoffs, rekombinantes humanes Chorion-Gonadotropin, an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11 und 13. Das Lyophilisat wurde unmittelbar vor der Injektion in den Gluteus mit normaler physiologischer Salzlösung rekonstituiert. Die Blindkontrollen erhielten IM-Injektionen eines Plazebos. Bei jeder Injektion wurden die Patientinnen beobachtet und über ihre begleitende Medikation und mögliche Nebenwirkungen informiert. Es handelte sich um eine Doppel-Blindbehandlung mit 20 aktiven Gaben und 5 Kontrollen. Es wurde keine Dosismodifizierung zugelassen. Wenn Nebenwirkungen oder begleitende klinische Probleme auftraten, wurde die Behandlung unterbrochen; dies war bei einer Patientin der Fall. Die Effizienz der Behandlung wurde durch Bewertung der gleichen Parameter, die bei der anfänglichen Kernnadelbiopsie bewertet worden waren, in dem verbleibenden Tumor, der durch Lumpektomie oder Mastektomie am Ende der zweiwöchigen r-hCG-Behandlung reseziert worden war, beurteilt.
Ersatzmarker-Analyse.
Die Wirkungen von r-hCG auf die Brusttumoren wurden unter Verwendung von Immunocytochemie bewertet, die sowohl in Kernbiopsien des Tumors als auch im Resttumor, der bei Lumpektomie- oder Mastektomie-Proben vorlag, durchgeführt wurde. Die folgenden Ersatzmarker wurden unter Verwendung von Immunocytochemie bestimmt: Zell-Proliferationsrate, prozentualer Anteil der Östrogen (ER)- und Progesteron-Rezeptor (PgR)-positiven Zellen und Immunoreaktivität auf Inhibin. Die mikroskopische Analyse dieser Ersatzmarker wurde durchgeführt, indem Fragmente des Tumors, die so weit wie möglich von den Stellen, an denen Nadelbiopsien durchgeführt worden waren, entfernt lagen, ausgewählt wurden, um eine Vermischung der Wirkungen, die durch Heilung und Entzündung induziert werden, zu vermeiden. Die Lymphknoten der gleichen Patientinnen, von denen die primären Tumoren untersucht worden waren, wurden ebenso durch die gleichen Verfahren analysiert.
Behandlung des Brusttumor-Gewebes.
Bei jeder für dieses Protokoll ausgewählten Patientin wurde eine Kernbiopsie des Brusttumors durchgeführt. Die Kernbiopsie wurde eingefroren und durch einen Pathologen histologisch analysiert. Wenn die Diagnose eines invasiven Karzinoms gestellt wurde, wurden drei weitere Tumorgewebe-Kerne zum Zeitpunkt der anfänglichen Diagnose gewonnen. Die Kerne wurden in 10%-igem neutralgepuffertem Formalin (NBF) für eine histopathologische und immunocytochemische Analyse fixiert. Die chirurgischen Proben, welche den Tumor enthielten, d. h. von Lumpektomien oder Mastektomien, wurden in NBF fixiert, und repräsentative Fragmente des Resttumors und normalen Brustgewebes distal zu dem Tumor wurden an ein klinisches Labor geschickt. Lymphknoten, die sich während der Achseldissektion als Metastase-positiv herausstellten, wurden in NBF fixiert, in Paraffin eingebettet und repräsentative Gewebeblöcke ebenso übermittelt. Jede Probe wurde mit einer Patienten-Versuchsnummer und dem Datum, an dem die Probe erhalten worden war, versehen; außerdem wurde vermerkt, ob es sich um die anfängliche Nadelbiopsie des Tumors oder von normalem Gewebe oder um die letzte (zweite) operative Probe, bestehend entweder aus Tumor- oder normalem Gewebe, handelt. Die Formalin-fixierten Nadelbiopsien und Tumorproben wurden dem klinischen Labor durch Eilpost überstellt. Alle Proben wurden nach ihrer Ankunft im Labor durch Experimentnummern (Exp. 721) und eine Zugangsnummer, welche sequentiell nach dem Ankunftsdatum zugeordnet wurde, identifiziert. Alle Proben wurden zu allen Zeiten durch ihre Zugangsnummer identifiziert; erst nachdem alte Daten gesammelt worden waren, wurde die Identität der Patientin und die Behandlung offenbart.
IMMUNOCYTOCHEMISCHE STUDIEN
Antikörper.
Zellproliferation – Ki67 monoklonaler Antikörper (Oncogene Science, Inc. Cambridge, MA); Östrogen-Rezeptor – monoklonaler Maus-Anti-Mensch-Östrogen-Rezeptor-Antikörper (ER) (Klon ER1D5) (Amac Lab, Westbrook, ME) Verdünnung 1:400; Progesteron-Rezeptor (PgR) – monoklonaler Maus-Antikörper Klon PR10A9 (Immunotech, Inc. Westbrook, ME); polyklonale Kaninchen- Antikörper gegen synthetische Inhibin a und b-Peptide, synthetisiert in der Labor-Proteinsynthese-Vorrichtung wurden mit einer Verdünnung von 1:50 verwendet.
Verfahren.
Schnitte von Paraffin-eingebetteten Geweben wurden auf Aminoalkylsilan-beschichteten Trägern befestigt; das Paraffin wurde entfernt, die Schnitte rehydriert und die endogene Peroxidase mit 2%-igem Wasserstoffperoxid inhibiert. Nach der Blockierung wurden die Schnitte mit den jeweiligen Antikörpern über Nacht inkubiert, gewaschen und mit biotinisiertem sekundärem Pferde-Anti-Maus-Antikörper (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) inkubiert. Der "Vectastain Elite ABC Kit" (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) wurde zur Konjugation verwendet; 3,3'-Diaminobenzidin-HCL (DAB) wurde verwendet, um die immunocytochemisch regierenden Stellen kenntlich zu machen. Mit Nicht-Immun-Serum inkubierte Schnitte wurden als negative Kontrollen verwendet. Alle Schnitte wurden leicht mit Hematoxylin gegengefärbt. Die Zellproliferation wurde durch Zählen der Zellen, die das nukleäre Antigen Ki67 im äußeren Teil des Nukleolus und in der granulären Komponente des Nukleus exprimieren, bewertet. Die Möglichkeit, dass unterschiedliche Ergebnisse bei verschiedenen Personen die Ergebnisse beeinflussen könnten, wurde ausgeschlossen, indem die gleichen Proben mehrere Male blind bestimmt wurden. Der Steroid-Rezeptor-Status wurde in einer Reihe von Schnitten, die mit ER- oder PgR-Antikörpern umgesetzt worden waren, durch Zählen der Anzahl der Nuklei, die positiv für jeden der Rezeptoren waren, bestimmt. Die Werte wurden als prozentualer Anteil der positiven Zellen im Vergleich zu der Gesamtzahl der in jedem Gewebeschnitt vorliegenden Tumorzellen ausgedrückt. Das Immunostaining für Inhibin wurde durch Untersuchung der Objektträger unter einem Hellfeld-Mikroskop bewertet und gemäß der Intensität der Braunfärbung als negativ (–), schwach (+), mäßig (++) oder stark (+++) positiv eingestuft. Die Vergleiche wurden zwischen den Werten, die bei der ersten Biopsie und bei den Geweben, die nach zweiwöchiger hCG-Behandlung reseziert worden waren, erhalten wurden, durchgeführt.
Die Apoptose wurde in 5-mm-Schnitten von Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben, die wie oben beschrieben erhalten worden waren, nachgewiesen. Apoptotische Zellkerne wurden unter Verwendung des "Apoptag"-Kits (Oncor, Gaithersburg, MD) identifiziert. Die Schnitte wurden zunächst mit 20 mg/ml Proteinase K in PBS über 20 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, durch 0,002%-iges H₂O₂ 30 Minuten lang inhibiert, mit Puffer äquilibriert und mit terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase (TdT) für 20 bis 40 Minuten inkubiert. Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Schnitte wurden dann mit Stop-Puffer 30 Minuten bei 37 °C gewaschen und mit Anti-Digoxigenin 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Farbe wurde unter Verwendung von 0,05%-igem 3,3'-Dimethylaminobenzol in 0,01-%igem H₂O, verdünnt mit Tris-HCl (pH 7,5), entwickelt und mit Hematoxylin gegengefärbt. Der prozentuale Anteil der positiven Zellen im Verhältnis zur Gesamtzahl der gezählten Zellen gibt den Apoptotischen Index wieder.
Die Bewertung aller immunocytischen Reaktionen wurde blind durch einen der Hauptforscher (JR) ohne Kenntnis des Typs der Behandlung, denen die Patientinnen unterzogen worden waren, durchgeführt. Erst nachdem alle Daten gesammelt und analysiert worden waren, wurde die Identität der Patientin und der Behandlungstyp zum Zweck der tabellarischen Aufstellung der Daten offenbart.
BEWERTUNG DER SYSTEMISCHEN WIRKUNGEN VON R-HCG
Die systemischen Wirkungen dieser Hormonbehandlung wurden durch Bestimmen der Serumniveaus der hypophysären Hormone FSH und LH und der ovarialen Hormone Östrogen und Progesteron und Inhibin als Marker der hCG-Aktivität bewertet. Von 26 Patientinnen wurden an den Tagen 0, 5, 9 und 13 der Behandlung 10 ml Blut abgenommen. Das Serum wurde unmittelbar nach der Abnahme abgetrennt, bei –80 °C eingefroren und die Proben mit der Patienten-Versuchsnummer, dem Datum und der Reihenfolge während der Behandlung identifiziert. Die Seren wurden in Trockeneis von Belgien zu dem klinischen Labor durch Eilpost überführt. Alle Proben wurden nach der Ankunft im Labor durch eine Experiment-Nummer und eine Zugangsnummer, welche fortlaufend durch das Datum der Ankunft bezeichnet wurde, identifiziert.
Die gefrorenen Serumproben wurden an das InterScience Institut (ISI), Inglewood, Kalifornien, zur Durchführung eines Radioimmunassays (RIA) zur quantitativen Bestimmung der Niveaus folgender Hormone geliefert: hCG-β-Untereinheit, Östradiol, Progesteron, FSH, LH und Inhibin. Die quantitative Bestimmung von β-hCG wurde durch SmithKline-Beechman Clinical Laboratories in Philadelphia, PA, bestätigt.
ERGEBNISSE
Von den 25 Patientinnen, die in diese Studie eintraten, konnten bei 22 der Patientinnen histopathologische und immunocytochemische Analysen vollständig durchgeführt werden. Die Gewebe dreier Patientinnen waren nicht für eine Analyse geeignet, da die Menge an Tumor entweder ungenügend war, oder der Tumor für eine immunocytochemische Bestimmung der Zellproliferation, der Steroid-Rezeptoren oder Inhibin nicht ausreichend konserviert war.
Zellproliferation.
Die immunocytochemische Detektion von Ki67 zeigte, dass zu Beginn der Behandlung eine beträchtliche Variation der Zellproliferationsrate unter den Patientinnen auftrat, wie durch die Nadelbiopsie (NB)-Daten gezeigt wird. Die nach der r-hCG-Behandlung entfernten Tumoren wiesen signifikant herabgesetzte Werte auf, mit nur kleinen Variationen zwischen den Personen, während bei den Patientinnen, die das Plazebo erhalten hatten, die Tumoren eine Zellprolifrationsrate aufwiesen, die nahezu identisch mit den anfänglichen Werten waren. Die Reduktion der Zellproliferation war beträchtlich (p < 0,00006) (1) bei 17 der 18 Patientinnen, die eine r-hCG-Behandlung erhalten hatten. Bei neun der mit r-hCG behandelten Patientinnen waren Lymphknoten, die sich zum Zeitpunkt des chirurgischen Eingriffs als positiv herausstellten, für eine Analyse verfügbar. In diesen Knoten wiesen die metastatischen Zellen eine Zellproliferationsrate auf, die im gleichen Bereich wie die des primären Tumors, der beim chirurgischen Eingriff entfernt worden war, lag und signifikant niedriger war als in der Nadelbiopsie. Die positiven Lymphknoten bei einer mit einem Plazebo behandelten Patientin wiesen die gleiche Zellproliferationsrate wie die NB und Exc.B auf. Die in den Lymphknoten metastatischen Karzinomzellen besaßen eine deutlich geringere Zellproliferationsrate als die Keimzentren, welche zahlreiche Ki67-positive Zellen enthielten.
Um zu bestimmen, ob die Wirkung der r-hCG-Behandlung auf die Zellproliferation nicht durch das lokale Trauma, das durch die Kernbiopsie verursacht wurde, maskiert oder verändert wird, wurden Pilotexperimente durchgeführt, um, in Zusammenarbeit mit Dr. Ingmar Persson vom Department of Cancer Epidemiology, Uppsala Universität, Uppsala, Schweden, die Verwendung von Brust-Kernbiopsien zur Bestimmung der Surrogat-Endpunkte der Zellproliferation zu validieren. Eine Pilotstudie wurde zu dem Zweck durchgeführt, die Daten der normalen Brust-Morphologie und Zellproliferation, die bei Brust-Kernbiopsien beobachtet wurden, die unter Verwendung einer Pistole mit aufgesetzter 18-Gauge-Nadel erhalten worden waren, durch ihren Vergleich mit den gleichen Parametern, die in großen Proben, die durch Reduktions-Mammoplastie erhalten worden waren, zu validieren. Die Kernbiopsien wurden an vier Patientinnen durchgeführt. Jede Biopsie hatte ein Ausmaß von ungefähr 2 cm Länge und 0,2 cm Durchmesser. Das Material wurde in gepuffertem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hematoxylin und Eosin angefärbt und mit Ki67, einem Proliferations-Marker, umgesetzt. Es stellte sich heraus, dass die gleichen lobulären Strukturen, die in der Kernbiopsie vorlagen, auch in den chirurgisch gewonnenen Proben beobachtet wurden. Die Proliferations-Aktivität zeigte keinen statistischen Unterschied bei den Zellen aus der Kernbiopsie im Vergleich zu den Zellen aus den Reduktions-Mammoplastie-Proben (unveröffentlichte Ergebnisse). Diese Daten wurden in der vorliegenden Studie bestätigt, in der die Werte der Zellproliferation, die in den Mastektomie-Proben nachgewiesen wurden, denen entsprachen oder ähnelten, die in den sezierten Lymphknoten nachgewiesen wurden. Zusammengefasst konnte durch diese vorläufigen Daten die Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass die Wirkung von r-hCG durch die lokale Manipulation und nicht durch das verabreichte Hormon induziert sein könnte.
Östrogen- und Progesteron-Rezeptor.
Die immunocytochemische Expression von ER wurde als positiv betrachtet, wenn mehr als 20 % der Tumorzellen eine positive nukleäre Reaktion bezüglich dieses Rezeptors zeigten. Auf der Grundlage dieses Konzepts stellt sich heraus, dass in sechs Fällen die r-hCG-Behandlung zu einer Vermindung des ER-Status von einem positiven NB zu einem negativen Exc. B führte (2). Die Lymphknoten-Metastasen dieser Patientinnen zeigten ein ähnliches ER-Niveau, außer in zwei Fällen, die einen ER-Gehalt ähnlich dem der anfänglichen Biopsie exprimierten. Keine der Plazebo-behandelten Gruppen zeigte Veränderungen ihres Rezeptorgehalts zwischen der anfänglichen Biopsie und der Probe nach der Behandlung.
Der Gehalt an PgR wurde ebenso als positiv betrachtet, wenn mehr als 20 der Tumorzellen positiv auf diesen Antikörper reagierten. In sechs der Fälle, in denen die anfängliche NB positiv war, wurde sie nach der Behandlung PgR-negativ. In den Fällen, in denen die anfängliche Biopsie negativ war, erwies sich die exzisionale Biopsie nach der Behandlung ebenso als negativ. In fünf der Fälle, in denen die NB positiv war, erwiesen sich die Lymphknoten-Metastasen als PgR-negativ. Die Plazebo-behandelten Patientinnen wiesen keine Veränderungen bezüglich des PgR- Status ihrer Tumoren auf. In 2 sind die prozentualen Anteile der ER- bzw. PR-positiven Zellen dargestellt.
Immunanfärbung (Immunostaining) von Inhibin.
Bei neun von den 18 Patientinnen mit primärem Brustkrebs, die r-hCG erhalten hatten, wurde eine signifikante Erhöhung der Immunoreaktivität in den neoplastischen Zellen beobachtet. Dieser Effekt wurde nicht in den Gewebeproben der Patientinnen beobachtet, die das Plazebo erhalten hatten.
Hormonelles Profil.
Es wurden die Niveaus der sechs Hormone in den Seren von Brustkrebs-Patientinnen, die r-hCG oder das Plazebo erhalten hatten, gemessen. Es bestand ein signifikanter Unterschied in den Niveaus von b-hCG im Serum der Patientinnen, die mit r-hCG behandelt worden waren, im Vergleich zu denen, die das Plazebo erhalten hatten, an Tag 5, 9 und 13 der Behandlung (p < 0,0001, p < 0,004 bzw. p < 0,007). Es trat keine statistisch signifikante Erhöhung des LH-Niveaus bei den r-hCG-behandelten Patientinnen im Vergleich zu den Plazebo-behandelten Patientinnen zu allen Zeitpunkten, an den Proben genommen wurden, auf. Weder die r-hCG-Behandlung noch die Plazebo-Behandlung modifizierten die Niveaus von FSH, Östradiol, Inhibin und Progesteron.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass eine zweiwöchige Behandlung mit r-hCG, welches wie oben beschrieben verabreicht wurde, bei nachklimakterischen Frauen mit neu diagnostiziertem primärem Brustkrebs eine deutliche und signifikante Reduktion der Zellproliferation in dem primären Tumor induziert. Eine interessante Beobachtung war, dass die Lymphknoten der gleichen Patientinnen in den metastatischen Zellen ein Zellproliferations-Niveau aufwiesen, das ähnlich zu dem der Tumoren nach der r-hCG-Behandlung war; es wurden jedoch keine Veränderungen bei den mit Plazebo behandelten Frauen beobachtet.
Eine Behandlung mit rekombinantem hCG induzierte eine Herunterregulierung der ER- und PgR-Expression bei sechs von neun bzw. sechs von zehn positiven Fällen. R-hCG modifizierte nicht die Serum-Niveaus von Östradiol, Progesteron, Inhibin, FSH oder LH; die bestimmten Werte entsprachen denen, die für nachklimakterische Frauen beschrieben sind. Das r-hCG zeigte weder klinische Nebenwirkungen bei den Patientinnen noch Veränderungen bezüglich ihres hormonellen Milieus. Diese Beobachtungen sind ein erster Hinweis dafür, dass r- hCG eine antiproliferative Wirkung bei primärem und metastatischem Brustkrebs aufweist, ohne dass Veränderungen im Gesamtbefinden der Patienten induziert werden. Die in dieser Arbeit beschriebenen Daten zeigen, dass hCG eine direkte Wirkung auf neoplastische Zellen hat, und dass diese Wirkung nicht durch die ovarialen Hormone vermittelt wird. Bei unseren Patientinnen handelte es sich um Frauen nach der Menopause, bei denen deutlich gezeigt wird, dass das hormonelle Milieu nicht nach der Verabreichung von r-hCG beeinflusst wird.
Bezüglich der lokalen Produktion von Inhibin durch die neoplastischen Zellen fand in 50 % der primären Brustläsionen der mit r-hCG behandelten Patientinnen eine Überexpression statt. Aufgrund der Beschränkungen der Plus-Quantifizierung wurden lediglich solche Fälle beschrieben, bei denen signifikante Unterschiede beobachtet wurden. Für eine quantitative Bewertung dieses Markers wäre eine Western-Blot-Analyse wünschenswert.
Auf dem systemischen Niveau war das einzige Hormon, das durch die r-hCG-Behandlung erhöht wurde, b-hCG. Die Korrelation zwischen der Abnahme der Zellproliferation und dem Anstieg des b-hCG-Niveaus war überraschend.
BEISPIEL 2
Rekombinantes humanes Chorion-Gonadotropin inhibiert metastatischen Brustkrebs bei nachklimaktenschen Frauen.
Um die inhibitorische Wirkung von rekombinantem humanem Chorion-Gonadotropin (r-hCG) auf metastatischen Brustkrebs bei nachklimakterischen Frauen zu untersuchen, wurde eine Open-Label-, Single-Center-Studie durchgeführt. Das vorrangige Ziel dieser Studie war, die Wirkung von r-hCG auf die Tumor-Ansprechgeschwindigkeit von zweidimensional messbaren oder tastbaren Läsionen festzustellen. Die sekundären Ziele waren: i.) die Wirkung der r-hCG-Behandlung auf Symptome, die durch metastatische Brusttumor-Läsionen verursacht werden, festzustellen, ii.) zu bestimmen, ob r-hCG irgendwelche nachteiligen systemischen Wirkungen ausübt, iii.) die Zeit bis zur Tumor-Progression zu messen und iv.) die Wirkungen von r-hCG auf die endokrinologischen Parameter und Tumormarker zu bestimmen.
An der Studie nahmen 13 nachklimakterische Frauen teil, bei denen durch Biopsie Brustkrebs diagnostiziert und klinisch eine metastatische Erkrankung festgestellt worden war. Die Patientinnen wurden dreimal wöchentlich mit 500 mcg r- hCG über wenigstens zwei Monate behandelt. Eine Tumorbewertung und die Messung der Zielindikatoren-Läsionen wurden alle zwei Monate durch Röntgen, CT-Scan, MRI oder physische Untersuchung durchgeführt. Nach 60 Tagen der Behandlung wurde eine erneute Bewertung der metastatischen Läsionen unter Verwendung der/des gleichen diagnostischen Verfahren/s durchgeführt. Im Fall einer progressiven Erkrankung (d. h., Auftreten eines neuen Tumors oder Wachstum der Indikator-Läsionen um wenigstens 25 % bezüglich der Quadratdimensionen) wurde die Studienbehandlung abgebrochen; anderenfalls wurde die Behandlung fortgesetzt, wobei Neubewertungen der Patientinnen alle 8 Wochen durchgeführt wurden, bis eine progressive Erkrankung festgestellt wurde.
Eine Patientin starb aufgrund von Komplikationen des Brustkrebses vor der Visitation an Tag 60; zwölf Patientinnen führten die Visitation bis zum Tag 60 durch. Von diesen zwölf schieden vier Patientinnen aufgrund einer progressiven Erkrankung aus; bei acht Patientinnen wurde eine aktive Behandlung in der Aufrechterhaltungsphase der Studie durchgeführt (3). Zwei Patientinnen wurden als teilweise ansprechend auf der Basis einer mehr als 50%-igen Reduktion der Leber-Metastasen klassifiziert. Sechs der dreizehn Patientinnen wiesen eine stabile Erkrankung auf.
Diese ersten klinischen Daten zeigen, dass hCG wirksam bei der Behandlung von metastatischen Brusttumoren bei nachklimakterischen Frauen ist.
BEISPIEL 3
Humanes Chorion-Gonadotropin schützt gegen Tumorentstehung und inhibiert Tumorwachstum bei Ratten in frühen und späten Stadien der Tumorentwicklung.
Nachdem klinisch die Wirksamkeit von hCG bei der Behandlung von primären und metastatischen Brusttumoren bei nachklimakterischen Frauen gezeigt worden war, wurden die Studien auf die Verwendung eines etablierten Tiermodell-Systems ausgedehnt. Die in diesem Beispiel erhaltenen experimentellen Ergebnisse zeigen in dem Ratten-Modellsystem, dass Urin oder rekombinantes humanes Chorion-Gonadotropin (u-hCG oder r-hCG) eine schützende Wirkung gegen die Entwicklung von Brustkrebs und eine therapeutische Wirkung auf Brusttumoren in frühen und späten Stadien aufweist.
EXPERIMENTELLES PROTOKOLL UND VERFAHREN
Bewertung der Wirksamkeit von r-hCG bei der Prävention von Brustkrebs:
Die in den unten beschriebenen Experimenten verwendeten Versuchsgruppen 1 bis 9 sind in 4 schematisch dargestellt. Die in den Versuchsgruppen 1 bis 9 verwendeten Tiere bestanden aus 450 intakten jungfräulichen Sprague-Dawley-Ratten, die von Taconic Farms (New York, NY) bezogen wurden.
Das Potential von hCG, die Initiation von DMBA-induzierten Ratten-Brustkarzinomen zu inhibieren, wurde bei intakten jungfräulichen Ratten untersucht, die mit Plazebo (Versuchsgruppe 1), 100 IU r-hCG/Tag (Versuchsgruppe 2) oder 100 IU u-hCG/Tag (Versuchsgruppe 3) behandelt worden waren. Alle Tiere erhielten täglich über 21 Tage eine Injektion, wobei begonnen wurde, als die Ratten 45 Tage alt waren. Das Karzinogen DMBA wurde als intragastrische Einzeldosis (8 mg/100 g Körpergewicht) 21 Tage nach der letzten Injektion des Plazebos oder Hormons verabreicht. Bei diesen Versuchsabläufen war die erste bewertete Wirkung das Auftreten von Tumoren, die durch Tasten festgestellt wurden, und das Feststellen ihrer Lage in Bezug auf spezifische Brustdrüsen. Weitere bewertete Parameter waren die Geschwindigkeit des Tumorwachstums, die Tumor-Ulzeration und die Tumor-Regression oder Geschwürheilung und Tumor-Nekrose als Antwort auf die hormonelle Behandlung. Diese Ergebnisse wurden mit dem Grundniveau von Brust-Parenchym-Differenzierung, der Zellproliferations-Geschwindigkeit, dem Expressionsniveau der Gene, die den programmierten Zelltod kontrollieren, der Apoptoserate und der Inhibin-Synthese in Brustepithel zum Zeitpunkt der Karzinogen-Verabreichung korreliert.
Bewertung der therapeutischen Wirksamkeit von r-hCG bei Brustkrebs.
Die tumoristatische und tumorizidale Wirksamkeit von r-hCG und u-hCG auf frühen und fortgeschrittenen Brustkrebs wurde bei intakten, jungfräulichen Ratten, die eine Einzeldosis DMBA im Alter von 45 Tagen erhalten hatten, getestet (4, Versuchsgruppen 4 bis 9). Die Wirkung auf frühe Tumorentwicklung wurde in den Versuchsgruppen 4, 5 und 6 getestet. Sie wurde beurteilt, indem die r-hCG-Behandlung 20 Tage nach der DMBA-Verabreichung, wenn frühe Läsionen, wie beispielsweise intraduktale Proliferationen (IDPs) und Karzinome in situ (CIS) bereits vorlagen, jedoch noch keine Tumoren tastbar waren, gestartet wurde. Die Wirkung auf die fortschreitende Tumorentwicklung wurde durch Starten der hormonellen Behandlung 60 Tage nach der DMBA-Verabreichung, oder wenn tastbare Tumoren einen maximalen Durchmesser von wenigstes 1 cm erreicht hatten, bewertet (Versuchsgruppen 7, 8 und 9). In beiden Gruppen wurde das Hormon über 40 Tage verabreicht, und die finale tumorigene Antwort wurde 20 Wochen nach der DMBA-Verabreichung bewertet. Die Wirkung der hormonellen Behandlung auf die Tumorwachstumsrate, mit speziellem Augenmerk auf die Tumor-Regression, Abwesenheit von Haut-Ulzeration und die finale Tumorgröße und Nekrose, wurden zum Zeitpunkt der Beurteilung der finalen tumorigenen Antwort bestimmt. Diese Ergebnisse wurden mit der Zellproliferationsrate, der Expression der Inhibin-Synthese, dem Östrogen- und Progestin-Rezeptor-Gehalt, der Expression von Programmierter-Zelltod-Genen und von Apoptose in Tumoren, die von r-hCG und u-hCG-behandelten Tieren entwickelt wurden, im Vergleich zu solchen, die von Ratten entwickelt wurden, die das Plazebo erhalten hatten, korreliert.
Alle Behandlungen wurden begonnen, als die Tiere 45 Tage alt waren. In Versuchsgruppe 1 erhielten 50 Ratten eine tägliche intraperitoneale (ip) Injektion von 0,5 ml Plazebo über 21 Tage. In den Versuchsgruppen 2 und 3 erhielt die gleiche Anzahl von Tieren 21 Tage lang 100 IU/Tag r-hCG bzw. u-hCG (Steris Laboratories, Phoenix, AZ). 21 Tage nach Durchführung der letzten Injektion – die Tiere waren dann 87 Tage alt – wurde den drei Tiergruppen eine einzelne intragastrische (ig) Dosis von 8 mg DMBA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) pro 100 g Körpergewicht (bw) verabreicht. Danach wurden alle Tiere regelmäßig abgetastet, um Tumorentwicklung zu detektieren und die Tumorwachstumsrate zu bestimmen. Die letzte tumorigene Antwort wurde 15 Wochen nach Verabreichung von DMBA bewertet.
In den Versuchsgruppen 4 bis 9 wurde 300 Tiere eine einzelne ig Dosis von 8 mg DMBA/100 g bw inokuliert, als sie 45 Tage alt waren. Die tumorigene Antwort wurde durch Abtasten der rechten und linken zervikalen, thorakalen, abdominalen und inguinalen Brustarealen und der ventralen bis dorsolateralen Ausdehnungen der Drüsen bewertet. Alle Tumoren wurden in der Reihenfolge numeriert, in der sie auftraten; ihre Lage wurde aufgezeichnet und die Tumorwachstumsrate durch Messen der Tumorgröße mit einem Vernier-Taster bestimmt. Alle Veränderungen im Gesundheitszustand der Tiere, schnelles Tumorwachstum oder Hautgeschwürbildung (Ulzeration) wurden aufgezeichnet. Diejenigen Tiere, in denen die Tumoren übermäßig groß waren oder ulzerierten, wurden ungeachtet des Stadiums der hormonellen Behandlung in Übereinstimmung mit den IACUC- Regularien getötet. Diejenigen Tiere, die vor Beginn oder vor Beendigung der hormonellen Behandlungen getötet worden waren, wurden aus der statistischen Analyse der finalen tumorigenen Antwort ausgeschlossen.
Die Versuchsgruppen 4 bis 6 wurden verwendet, um die Wirkung der hormonellen Behandlungen auf frühe Tumorentwicklung zu untersuchen. 21 Tage nach DMBA-Verabreichung erhielten die der Versuchsgruppe 4 zugeordneten Tiere erstmals – und dann über 40 Tage – eine tägliche ip Injektion von 0,5 ml Plazebo. In den Versuchsgruppen 5 und 6 erhielten die gleiche Anzahl der Tiere 40 Tage lang 100 IU/Tag r-hCG bzw. u-hCG. Alle Tiere wurden alle zwei Wochen abgetastet, um Tumorentwicklung nachzuweisen und die Tumorwachstumsrate zu bestimmen. Die finale tumorigene Antwort wurde 20 Wochen nach DMBA-Verabreichung bewertet.
In den Versuchsgruppen 7 bis 9 wurden die Wirkungen von r-hCG und u-hCG auf späte (tastbare) Tumorentwicklung getestet: 60 Tage nach DMBA-Gabe – die Ratten waren dann 105 Tage alt – erhielten die der Versuchsgruppe 7 zugeordneten Tiere erstmals – und danach 40 Tage lang – eine tägliche ip-Injektion von 100 IU/Tag r-hCG. In den Versuchsgruppen 8 und 9 erhielt die gleiche Anzahl von Tieren 40 Tage lang 100 IU/Tag u-hCG bzw. 0,5 ml Plazebo. Die tumorigene Antwort wurde alle zwei Wochen durch Abtasten beurteilt. Alle Tumoren wurden nacheinander numeriert, ihre Lage aufgezeichnet und die Tumorwachstumsrate durch Messen der Tumorgröße mit einem Vernier-Taster bestimmt. Die finale tumorigene Antwort wurde 20 Wochen nach DMBA-Verabreichung bewertet.
Beurteilung der finalen tumorigenen Antwort.
Am Ende des Experiments wurden alle Tiere mit einer ip Injektion von Ketamin (90 mg/kg bw)-Nembutal (40 mg/kg bw) anästhesiert; es wurde Blut durch die inferiore Vena Cava abgenommen; das Serum wurde abgetrennt und bei –70 °C gefroren aufbewahrt. Die Tumoren wurden schnell seziert, dreidimensional vermessen und fortlaufend geschnitten. Benachbarte Schnitte wurden:

1) in 10%-igem neutralgepuffertem Formalin (NBF) zur histopathologischen und immunocytochemischen Analyse fixiert,
2) in flüssigem Stickstoff zur RNA-Extraktion eingefroren,
3) in flüssigem Stickstoff zu Östrogen-Rezeptor (ER)- und Progesteron-Rezeptor (PR)-Bestimmungen eingefroren und
4) in sterilem Kulturmedium zur DNA-Analyse durch Fließ-Zytometrie platziert.

Tumoren, die kleiner als 1 cm im Durchmesser waren, wurden lediglich in 10%-igem NBF fixiert. Bei Abwesenheit von Tumoren wurden die rechten thorakalen (2. und 3.) und die rechten abdominalen (4.) Brustdrüsen in 10%-igem NBF zur histopathologischen Bewertung des Ausmaßes der Drüsenentwicklung fixiert. Die rechten und linken Ovarien aller Tiere wurden seziert, dreidimensional mit einem Vernier-Taster vermessen und in 10%-igem NBF fixiert. Alle inneren Organe wurden auf das Auftreten von metastatischen Knötchen, Adhäsionen oder Blutungen untersucht. Veränderungen der Leber, Milz und Lunge wurden dokumentiert und repräsentative Fragmente der Gewebe in 10%-igem NBF zur histopathologischen Untersuchung fixiert. Repräsentative Läsionen wurden fotografiert.
Zur Bewertung der finalen tumorigenen Antwort wurden folgende Kriterien verwendet:

1. Tumorwachstumsrate auf der Grundlage aufeinanderfolgender Messungen der zwei größten Durchmesser der Tumoren bei lebenden Tieren unter Verwendung eines Vernier-Tasters; die Ergebnisse sind in mm angegeben.
2. Finale Tumorgröße auf der Grundlage der Messung der Länge, Breite und Höhe der sezierten Tumoren mit einem Vernier-Taster. Die Ergebnisse sind in mm angegeben. Eine progressive Verkleinerung der Tumoren in aufeinanderfolgenden Messungen war indikativ für eine Tumor-Regression. Tastbare Tumoren, die zum Zeitpunkt der Sezierung verschwunden waren, wurden als zu 100 % zurückgebildet betrachtet. Das Brustgewebe, in dem der Tumor ursprünglich identifiziert worden war, wurde in 10%-igem NBF zur histopathologischen Analyse fixiert. Dieses Kriterium war indikativ für eine inhibitorische Wirkung der hormonellen Behandlungen auf das Tumorwachstum.
3. Tumor-Nekrose in großen tastbaren Tumoren. Obwohl in hormonell behandelten Tieren die Brusttumoren ihre ursprüngliche Größe beibehielten oder weiterhin wuchsen, wurde nach der Sezierung beobachtet, dass die Tumoren aus einer weichen zystischen Formation bestanden, die mit nekrotischem Gewebe gefüllt war, in dem nahezu kein lebendes Gewebe vorlag. Diese Anzeichen wurden als indikativ für Tumor-Destruktion, induziert durch die hormonelle Behandlung, und äquivalent zur Tumor-Regression, die durch die hCG-Behandlung induziert wurde, interpretiert.
4. Auftreten von Haut-Ulzeration bei lebenden Tieren ist indikativ für eine schnelle Tumorwachstumsrate und wird häufiger bei Plazebo-behandelten Tieren gefunden. In diesem Zustand war eine Tötung der Tiere obligatorisch.
5. Statistische Analyse. Die Signifikanz der Unterschiede in der tumorigenen Antwort in den Gruppen wurde anhand der Chi-Quadrat-Analyse und des Student-T-Tests bestimmt.

ERGEBNISSE
Die Wirkung von r-hCG und u-hCG bei der Prävention von Brustkrebs. Versuchsgruppen 1, 2 und 3.
Jungfräuliche Ratten, die 21 Tage lang mit Plazebo, r-hCG oder u-hCG behandelt worden waren und 21 Tage nach der letzten Injektion – sie waren dann 87 Tage alt – DMBA erhielten, schienen über den gesamten Zeitraum der Studie hindurch gesund. Ein Tier aus Versuchsgruppe 1 und eines aus Versuchsgruppe 2 starb als Folge einer akuten Reaktion auf die Anästhesie; sie wurden von der Studie ausgeschlossen, wodurch die gesamte Tierpopulation in jeder dieser zwei Versuchsgruppen auf 49 reduziert wurde. Keines der Tiere musste vor Ende des Experiments getötet werden. Die überwiegende Mehrheit der Tumoren wurde zum Zeitpunkt der Autopsie gefunden, keiner von ihnen war ulzeriert.
Durch die Behandlung der Tiere mit hCG wurde die Anzahl der Tumoren in allen Brustdrüsen signifikant reduziert, und es traten keine Tumoren im Hals- und Ohrenbereich (Gehörgangstumoren) auf; die Anzahl der Tiere mit Tumoren wurde von 22/49 (22 von 49 Tieren insgesamt) auf 4/49 bzw. 6/50 bei r-hCG bzw. u-hCG reduziert. Wie in 5 dargestellt, war ebenso die Anzahl der Tumoren/Tier signifikant herabgesetzt von 0,89 (Plazebo) auf 0,10 (r-hCG) bzw. 0,14 (u-hCG).
Wirkung von r-hCG auf frühe Tumorentwicklung.
Versuchsgruppen 4 5 und 6. Von den 50 Tieren, denen DMBA inokuliert worden war, starb ein Tier aus Versuchsgruppe 4 und ein Tier aus Versuchsgruppe 5 aufgrund einer akuten Reaktion auf die Anästhesie. Die Behandlung der verbleibenden Tiere mit Plazebo, r-hCG oder u-hCG wurde 21 Tage nach Verabreichung des Karzinogens begonnen (4).
Zehn der 49 Tiere aus Versuchsgruppe 4 (Plazebo) entwickelten zumindest einen tastbaren Tumor 42 Tage nach der DMBA-Verabreichung. Ein Tier, welches ernsthaft erkrankt war und zum Zeitpunkt der 14. Plazebo-Injektion starb, wurde aus der Endanalyse ausgeschlossen. Zwei Tiere, die 12 und 14 Tage nach der letzten Injektion starben, wurden in die Endanalyse mit einbezogen. Eines von ihnen war frei von Tumoren, das andere wies drei tastbare Tumoren auf.
Wie auch in den präventiven Versuchsgruppen beobachtet, wurde durch die Behandlung der Tiere mit hCG die Anzahl der Tumoren in den Brustdrüsen und im Nicht-Brustgewebe signifikant reduziert; die Anzahl der Tiere mit Tumoren wurde von 48/49 auf 38/49 bzw. 30/46 durch r-hCG bzw. u-hCG reduziert. Wie in 5 dargestellt, war ebenso die Anzahl der Tumoren/Tier signifikant herabgesetzt, von 5,6 (Plazebo) auf 2,2 (r-hCG) bzw. 1,9 (u-hCG).
Wirkung von r-hCG auf fortgeschrittene Tumorentwicklung. Versuchsgruppen 7. 8 und 9.
Von den 50 Tieren, denen DMBA inokuliert worden war, starb ein Tier aus Versuchsgruppe 7 während der Karzinogen-Verabreichung und wurde aus der Studie ausgeschlossen. Aus der Endanalyse der tumorigenen Antwort wurden außerdem all die Tiere ausgeschlossen, die aufgrund des schellen Wachstums und der Ulzeration der Tumoren vor Beendigung der Behandlung getötet werden mussten. Die gleichen Kriterien wurden auf die Tiere angewendet, die mit r-hCG (Versuchsgruppe 7), u-hCG (Versuchsguppe 8) und Plazebo (Versuchsgruppe 9) behandelt worden waren.
Bei den mit Plazebo behandelten Tieren (Versuchsgruppe 9) wurden insgesamt 40 Tiere nach Beendigung der Behandlung getötet und entsprechend ausgewertet. 39 von ihnen wiesen insgesamt 229 Tumoren auf, mit durchschnittlich 5,7 Tumoren/Tier, in einer Verteilung, die der ähnlich war, die für die Versuchsgruppen 1 bis 6 beobachtet worden war. Außerdem wiesen zwei Tiere metastatische Knötchen in der Milz, Leber und Lunge auf, die nicht in der tabellarischen Endaufstellung der Tumoren enthalten sind.
In der mit r-hCG behandelten Gruppe (Versuchsgruppe 7) erfüllten 37 Tiere die Eignungskriterien für die Endanalyse; 33 von ihnen entwickelten insgesamt 147 Tumoren, was einem Durchschnitt von 4,4 Tumoren/Tier (mit Tumoren) oder 3,9 Tumoren, bezogen auf die Gesamtzahl der Tiere mit Risiko, entspricht. 32 der 36 mit u-hCG behandelten Tiere (Versuchsgruppe 8) entwickelten Tumoren, was einen Durchschnitt von 3,4 Tumoren/Tier ergibt.
Die Ergebnisse der Versuchsgruppen 1 bis 9 sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefasst und in den 5 und 6 dargestellt. Tabelle 1. Zusammenfassung der tumorigenen Antwort bei Tieren, die mit Plazebo (Versuchsgruppen 1, 4 und 9), r-hCG (Versuchsgruppen 2, 5 und 7) oder u-hCG (Versuchsgruppen 3, 6 und 8) behandelt wurden

¹ Signifikante Unterschiede der Tumorinzidenz, analysiert durch Chi-Quadrat-Verteilung waren: Versuchsgruppe 1 gegenüber Versuchsgruppe 2 = 16,96, p < 0,00003; Versuchsgruppe 1 gegenüber 3 = 13,20, p < 0,0002; Versuchsgruppe 4 gegenüber Versuchsgruppe 5 = 9,49, p < 0,0018; Versuchsgruppe 4 gegenüber Versuchsgruppe 6 = 17,3, p < 0,00003. Die Unterschiede zwischen r-hCG (Versuchsgruppen 2, 5 und 7) gegenüber u-hCG (Versuchsgruppen 3, 6 und 8) und zwischen den Versuchsgruppen 9, 7 und 8 waren nicht signifikant.

SCHLUSSFOLGERUNGEN
Die oben aufgeführten Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung von Urin oder rekombinantem hCG an junge, jungfräuliche Ratten die Entstehung von DMBA-induzierten Tumoren verhindert und die Progression von DMBA-induzierten Tumoren inhibiert. Eine 21-tägige Behandlung mit r-hCG erzeugt eine präventive Wirkung, auch wenn die Behandlung 21 Tage vor der Karzinogen-Verabreichung beendet wird. Ähnliche Ergebnisse wurden mit u-hCG erhalten.
Die Ergebnisse zeigen außerdem, dass eine r-hCG-Behandlung von Ratten, denen zuvor DMBA inokuliert worden war, die Entwicklung früher Brustläsionen inhibiert, da der Beginn der hormonellen Behandlung 20 Tage nach Karzinogen-Verabreichung sowohl Tumorinzidenz als auch Tumorbelastung signifikant reduzierte. Dabei wiesen r-hCG und u-hCG ähnliche Tumor-inhibierende Wirkungen auf. Diese Daten sind von erheblicher klinischer Bedeutung, da sie die Eignung der Anwendung dieser Hormonbehandlung bei frühen sowie prämalignen Läsionen zeigen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die therapeutische Wirkung dieser Hormone effizienter ist, je früher ein Behandlung begonnen wird.
Wenn die hormonellen Behandlungen 60 Tage nach Verabreichung von DMBA begonnen wurden, war ebenso die Tumorbelastung, ausgedrückt als Anzahl der Tumoren/Tier, signifikant unterdrückt. 6 zeigt deutlich, dass sowohl r-hCG als auch u-hCG die Tumorbelastung signifikant reduzieren und das Wachstum der Tumoren reduzieren, wie durch die geringere Anzahl der Tumoren/Tier nach Einstellen der hormonellen Behandlungen deutlich wird. Die Analyse der finalen tumorigenen Antwort zeigte, dass die Plazebo-behandelten Tiere 40 % mehr Tumoren aufwiesen als die mit einem der Hormone behandelten Tiere (5). Es ist wichtig, die Steigung der Kurve zwischen Beginn (Start) und Beendigung (Stop) der Behandlung, wie in 6 dargestellt, zu analysieren. Beide Hormone induzieren eine Abnahme der Steigung der Kurve aufgrund einer direkten Wirkung der Hormone auf die Tumorgenese. Am Ende der Behandlung wird die Steigung der Kurve steiler, erreicht jedoch niemals die, die bei Tieren auftritt, die das Plazebo erhielten, was darauf hinweist, dass beide Hormone eine effiziente therapeutische Wirkung durch Reduzieren der Tumorbelastung um 40 % aufweisen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass r-hCG noch wirksamer als therapeutisches Mittel sein könnte, wenn es nicht nur in einem, sondern mutmaßlich in mehreren Behandlungszyklen verwendet wird, um eine vollständige Heilung zu erzielen.
BEISPIEL 4
Inhibierung von Brustkrebszellen durch hCG und Tamoxifen in vitro
Es wurden vorläufige in-vitro-Experimente an CG-S-Zellen, einer Variante der MCF-7-Zellinie (Natoli C. et al., 1983, Breast Cancer Res. Treat. 3:23-32), die durch ein hohes Ausmaß an Östrogen-Ansprechempfindlichkeit und einen merklichen Gehalt an Östrogen-, Androgen-, Glucocorticoid-, und Progesteron-Rezeptoren gekennzeichnet sind, durchgeführt.
EXPERIMENTELLES PROTOKOLL UND VERFAHREN
Die Zellen wurden routinemäßig in Dulbecco's modifiziertem Eagle's-Medium (DMEM), supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika, kultiviert. Für die Zellwachstums-Experimente wurden die Zellen mit einer Dichte von 50.000 Zellen/ml in dem oben beschriebenen Medium ausplattiert. 24 Stunden später wurde das Medium durch frisches Medium, enthaltend 5 % Charkoal-behandeltes FCS (CH-FCS) plus einer festgesetzten Konzentration (10^–7 M) Tamoxifen (TAM) und verschiedenen Konzentrationen (von 10 bis 10.000 IU/ml) hCG, ersetzt. Das Medium wurde alle drei Tage erneuert. In den Experimenten, die die Wirkung von hCG und TAM betrafen, die nacheinander zu den CG-5-Zellen gegeben wurden, wurden die Zellen mit 50.000 Zellen/ml, wie oben beschrieben, ausplattiert; 24 Stunden später wurde das DMEM durch frisches Medium, enthaltend 10 bis 10.000 IU/ml hCG, ersetzt. Für jede hCG-Konzentration wurde eine unterschiedliche Anzahl von Platten hergestellt, um eine ausreichende Anzahl von Zellen am Ende der Behandlung als Ersatz zu erhalten (da hCG selbst eine inhibitorische Wirkung aufweist). Nachdem die CG-S-Zellen eine Woche lang hCG ausgesetzt worden waren, wurden sie in Medium, supplementiert mit 10 % FCS und Antibiotika, ausplattiert; 24 Stunden später wurde das DMEM durch frisches Medium, supplementiert mit 5% CE-FCS und einer festgesetzten Konzentration von TAM (10^–7 M), ersetzt. Das Medium wurde alle drei Tage erneuert. In allen durchgeführten Experimenten wurden die Zellen nach 3 bis 6 Tagen unter Verwendung eines Hämocytometers gezählt.
ERGEBNISSE
Die gleichzeitige Zugabe einer festgesetzten Konzentration von TAM (10^–7 M) zusammen mit hCG in Konzentrationen von 10 bis 1.000 IU/ml zu den CG-5-Kulturen erzeugt eine Inhibierung der Zellproliferation, die nicht mit der hCG-Dosis in Beziehung steht, jedoch höher ist, als die durch TAM allein induzierte Inhibierung. Bei der niedrigsten hCG-Konzentration betrug die Inhibierung der Zellproliferation ungefähr 50 %, bezogen auf die Kontrolle, am dritten Tag nach der Zugabe der zwei Wirkstoffe zu dem Kulturmedium. Wenn die Zellen 6 Tage lang mit der TAM-hCG-Kombination behandelt wurden, wurde die Inhibierung der Zellproliferation abhängig von der hCG-Dosis und erreichte 65 %, bezogen auf die Kontrollen, bei 1.000 IU/ml Wirkstoff.
Die CG-S-Zellen wurden ebenso mit verschiedenen hCG-Konzentrationen vorbehandelt und anschließend 10^–7 M TAM ausgesetzt. Am dritten Tag nach der Zugabe des Anti-Östrogens zu dem Kulturmedium wird eine ungefähr 50%-ige Inhibierung der Zellproliferation, bezogen auf die Kontrolle, in den Zellen gefunden, die die höchste hCG-Konzentration erhalten hatten. Am sechsten Tag nach der Zugabe von TAM zu dem Kulturmedium wird die deutlichsfe Inhibierung der Zellproliferation bei CG-S-Zellen, die mit der geringsten hCG-Konzentration vorbehandelt worden waren, erhalten (ungefähr 65 %, bezogen auf die Kontrolle); und sie bleibt unverändert bei Zellen, die mit ansteigenden Dosen des Wirkstoffs vorbehandelt wurden.
Die Ergebnisse sind in den 7a und 7b zusammengefasst, die einen grafischen Vergleich zwischen den verschiedenen Ausführungsarten (kombinierte oder sequentielle Behandlung) zeigen, die verwendet wurden, um die Wirkung von Tamoxifen und hCG auf das Zellwachstum zu untersuchen. Die Graphiken a und b zeigen die Wirkung von hCG und Tamoxifen, welche gleichzeitig (Punkt-Symbol) oder nacheinander (Dreieck-Symbol) zu den CG-5-Zellen am dritten (a) und sechsten (b) Tag nach der Zugabe der Verbindungen zu dem Kulturmedium gegeben wurden. Im Fall der sequentiellen Verabreichung wurden die Zellen mit den in der Figur angegebenen hCG-Konzentrationen vorbehandelt und dann Tamoxifen ausgesetzt. Die gestrichelte Linie (---) repräsentiert die Wirkung von 10^–7 M Tamoxifen allein, die in Parallel-Experimenten, die nicht im Text beschrieben sind, ermittelt wurden.
8 zeigt die Wirkung von hCG allein auf das Wachstum von CG-5-Zellen, die unter identischen experimentellen Bedingungen kultiviert wurden. In diesem Fall ist die Inhibierung der Zellproliferation offensichtlich, nachdem die Zellen drei Tage hCG ausgesetzt waren, wobei mit einer Konzentration von 100 IU/ml begonnen wurde. Nach sechs Tagen der Behandlung mit hCG nimmt die inhibitorische Wirkung auf die Zellproliferation nur bei einer maximalen Dosis von 1.000 IU/ml deutlich zu.
Der Vergleich zwischen den 7 und 8 zeigt deutlich, dass derartige geringe hCG-Dosen, wie beispielsweise 10 IU/ml, wirksam sind, wenn sie mit dem Anti-Östrogen zusammen verabreicht werden, während die gleichen Dosen praktisch ineffektiv sind, wenn hCG allein verwendet wird. Ähnliche Schlussfolgerungen werden erhalten, wenn die Wirkung von Tamoxifen allein mit der kombinierten Wirkung von Tamoxifen und hCG verglichen wird.

Claims

Verwendung von hCG zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von klinisch manifestierten Brusttumoren, wobei der klinisch manifestierte Brusttumor ein metastatischer Brusttumor ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 zur Behandlung von Brusttumoren bei vor- und nachklimakterischen Frauen.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hCG als Adjuvans in Kombination mit wenigstens einer anderen Krebstherapie verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei es sich bei der anderen Krebstherapie um einen chirurgischen Eingriff oder um Chemotherapie handelt.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die behandelten Tumorzellen Östrogen-Rezeptor-positiv sind.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei hCG in Kombination mit einem Anti-Östrogen verwendet wird.
Verwendung gemäß Anspruch 6, wobei hCG gleichzeitig, sequenziell oder separat mit dem Anti-Östrogen verwendet wird.
Verwendung gemäß den Ansprüchen 6 oder 7, wobei es sich bei dem Anti-Östrogen um Tamoxifen handelt.
Verwendung gemäß Anspruch 8, wobei Tamoxifen oral in einer täglichen Menge von ungefähr 30 mg verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei hCG in einer Menge von 100 bis 20.000 IU pro Patient pro Tag verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei hCG in einer Menge von 50 bis 10.000 μg pro Patient pro Tag verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei hCG in einer Menge von 250 bis 3 000 μg pro Patient pro Tag verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei hCG jeden zweiten Tag verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei hCG dreimal wöchentlich verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei hCG über mehrere Wochen verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß Anspruch 15, wobei hCG über mindestens 12 Wochen verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei hCG subkutan verabreicht werden soll.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, welche außerdem die Verwendung von Typ-1-Interferon in Kombination mit hCG und Anti-Östrogen umfasst.
Verwendung gemäß wenigstens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das hCG rekombinantes hCG ist.
Verwendung eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus LH, rekombinantem LH, LH-Fusions-Molekülen, TSH-Fusions-Molekülen und FSH-Fusions-Molekülen, wobei die Beta-Untereinheit der Fusionsmoleküle derart modifiziert ist, dass das resultierende Fusionsmolekül hCG-artiges Verhalten aufweist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung klinisch manifestierter Brusttumoren, wobei der klinisch manifestierte Brusttumor ein metastatischer Brusttumor ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine pharmazeutisch wirksame Menge an hCG in Gegenwart eines oder mehr pharmazeutisch akzeptabler Arzneistoffträger, und ein Anti-Östrogen zur gleichzeitigen, sequentiellen oder separaten Verwendung zur Behandlung von Brustkrebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine pharmazeutisch wirksame Menge eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus LH, rekombinantem LH, LH-Fusionsmolekülen, FSH-Fusionsmolekülen und TSH-Fusionsmolekülen, wobei die Beta-Untereinheit der Fusionsmoleküle derart modifiziert ist, dass das resultierende Fusionsmolekül hCG-artiges Verhalten aufweist, in Gegenwart einer oder mehr pharmazeutisch akzeptabler Arzneistoffträger, und ein Anti-Östrogen, zur gleichzeitigen, sequentiellen oder separaten Verwendung zur Behandlung von Brustkrebs.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 21, wobei das hCG in einer Menge von 100 bis 20.000 IU pro Patient pro Tag verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 21 oder 23, wobei das hCG in einer Menge von 50 bis 50.000 μg pro Patient pro Tag verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 24, wobei das hCG in einer Menge von 250 bis 3.000 μg pro Patient pro Tag verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 25, wobei das hCG jeden zweiten Tag verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 25, wobei das hCG dreimal wöchentlich verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 27, wobei das hCG über mehrere Wochen verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 28, wobei das hCG über wenigstens 12 Wochen verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 29, wobei das hCG subkutan verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 30, wobei das Anti-Östrogen Tamoxifen ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 31, wobei das Tamoxifen oral in einer täglichen Menge von ungefähr 30 mg verabreicht wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 32, welche in Kombination mit einem Typ-1-Interferon verwendet wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 oder 23 bis 33, wobei das hCG rekombinantes hCG ist.
Erzeugnis, umfassend ein Behältnis, in dem eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß wenigstens einem der Ansprüche 21 bis 34 enthalten ist, und das ein Etikett aufweist, welches die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Brustkrebs angibt.