DE69934328T2

DE69934328T2 - Palladiumsubstituierte bakteriochlorophyllderivate und deren verwendung

Info

Publication number: DE69934328T2
Application number: DE69934328T
Authority: DE
Inventors: Avigdor Scherz; Yoram Salomon; Alexander Brandis; Hugo Scheer
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1998-12-09
Filing date: 1999-12-09
Publication date: 2007-07-19
Anticipated expiration: 2019-12-10
Also published as: IL143591A0; BR9916096B1; EP1137411B1; HU228208B1; BRPI9916096B8; JP4796227B2; JP2002531497A; HK1040638B; DK1137411T3; EP1137411A4; HUP0105411A3; NO20012807D0; AU771292B2; CA2353554A1; CN1160069C; NO20012807L; PL201172B1; NO331426B1; CN1334728A; PL348201A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft palladiumsubstituierte Bacteriochlorophyllderivate, Verfahren und Zwischenprodukte ihrer Herstellung und Arzneimittel, welche dieselben umfassen, ebenso wie ihre Verwendung auf dem Gebiet der photodynamischen Therapie und Diagnose in vivo und des photodynamischen Abtötens von Viren und Mikroorganismen in vitro.
DEFINITIONEN UND ABKÜRZUNGEN

BChl = Bacteriochlorophyll a (Mg-enthaltendes 7,8,17,18-Tetrahydroporphyrin mit einer Phytyl- oder Geranylgeranylgruppe an Position 17³, einer COOCH₃-Gruppe an Position 13², einem H-Atom an Position 13², einer Acetylgruppe an Position 3 und einer Ethylgruppe an Position 8).
BChlid = Bacteriochlorophyllid a (die C17²-freie Carbonsäure abgeleitet von BChl a).
BPhe = Bacteriopheophytin a (BChl, in dem das zentrale Mg-Atom durch zwei H-Atome ersetzt worden ist).
BPheid = Bacteriopheophorbid a (die C-17²-freie Carbonsäure abgeleitet von BPhe).
Pd-BPheid = Pd-Bacteriopheophorbid a (die C-17²-freie Carbonsäure abgeleitet von BPhe mit einem zentralen Pd-Atom, einer COOCH₃-Gruppe an Position 13², einem H-Atom an Position 13², einer Acetylgruppe an Position 3 und einer Ethylgruppe an Position 8).

Es wird die IUPAC-Nummerierung der Bacteriochlorophyllderivate in der gesamten Beschreibung verwendet. Unter Verwendung dieser Nomenklatur tragen die natürlichen Bacteriochlorophylle zwei Carbonsäureester an den Positionen 13² und 17², jedoch sind sie an den Positionen 13³ und 17³ verestert.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es besteht ein wachsendes Interesse an der Verwendung von Photosensibilisatoren zur Krebstherapie. Gemäß dieser Technik, die als photodynamische Therapie (PDT) bekannt ist, werden Photosensibilisatoren zum Beispiel an einem Tumor angewendet, und die Photosensibilisierung in situ erzeugt Verbindungen, welche die malignen Zellen vergiften.
Die photodynamische Therapie unter Verwendung von Porphyrinen und verwandten Verbindungen weist bis jetzt eine ziemlich lange Geschichte auf. Eine frühe Arbeit aus den 1940er Jahren zeigte, dass Porphyrin dazu gebracht werden konnte, in bestrahltem Tumorgewebe zu fluoreszieren. Die Porphyrine schienen in diesen Geweben zu akkumulieren und waren dazu fähig, Licht in situ zu absorbieren, wobei sie ein Mittel bereitstellten, den Tumor durch die Lokalisierung der Fluoreszenz nachzuweisen. Eine weit verbreitete Zubereitung in den frühen Stadien der photodynamischen Behandlung sowohl zum Nachweis als auch zur Therapie war ein rohes Derivat von Hämatoporphyrin, auch Hämatoporphyrinderivat, HpD oder Lipson-Derivat genannt, das, wie von Lipson und Mitarbeitern in J. Natl. Cancer Inst. (1961) 26: 1–8 beschrieben, hergestellt wurde. Es wurde beträchtliche Arbeit unter Anwendung dieser Zubereitung geleistet und Dougherty und Mitarbeiter berichteten von der Verwendung dieses Derivats in der Behandlung von Malignität (Cancer Res. (1978) 38: 2628–2635; J. Natl. Cancer Inst. (1979) 62: 231–237).
Dougherty und Mitarbeiter stellten eine stärker wirksame Form des Hämatoporphyrinderivats her, welche einen Anteil des HpD mit einem Aggregatgewicht > 10 kd umfasste. Diese Form des Arzneistoffs, die in der photodynamischen Therapie nützlich ist, ist der Gegenstand des US-Patents 4,649,151, ist im Handel erhältlich und befindet sich in klinischen Versuchen.
Die allgemeinen Prinzipien der Verwendung von lichtabsorbierenden Verbindungen, insbesondere solchen, die mit Porphyrinen verwandt sind, sind als eine Behandlung von Tumoren, wenn systemisch verabreicht, gut etabliert. Die differenzierte Fähigkeit dieser Zubereitungen, einen Tumor im Gegensatz zu normalem Gewebe zu zerstören, beruht auf der Ansteuerungswirkung dieser Zubereitungen auf die unerwünschten Zellen (siehe zum Beispiel Dougherty, T.J. et al., "Cancer: Principles and Practice of Oncology" (1982), V.T. de Vita, Jr., et al., Hrsg., S. 1836–1844). Es sind Anstrengungen unternommen worden, um die Ansteuerungsfähigkeit durch Konjugieren von Hämatoporphyrinderivaten an Antikörper zu verbessern (siehe zum Beispiel Mew, D. et al., J. Immunol. (1983) 130: 1473–1477). Die Mechanismen dieser Arzneistoffe beim Abtöten von Zellen scheinen die Bildung von Singulett-Sauerstoff unter Bestrahlung einzuschließen (Weishaupt, K.R. et al., Cancer Research (1976) S. 2326–2329).
Die Verwendung des Hämatoporphyrinderivats oder seiner wirksamen Bestandteile in der Behandlung von Hauterkrankungen unter topischer Verabreichung sind auch im US-Patent 4,753,958 beschrieben worden. Zudem sind die Arzneistoffe verwendet worden, um biologische Proben, welche infektiöse Organismen wie Bakterien und Viren enthielten, zu sterilisieren (Matthews, J.L. et al., Transfusion (1988): 81–83). Es sind auch verschiedene andere photosensibilisierende Verbindungen zu diesem Zweck verwendet worden, wie zum Beispiel im US-Patent Nr. 4,727,027 dargelegt.
Im Allgemeinen werden die Verfahren, Strahlungssensibilisatoren mit einer Vielzahl von Strukturen zu verwenden, um die Funktion von biologischen Substraten sowohl in vivo als auch in vitro selektiv zu beeinträchtigen, auf dem Fachgebiet verstanden. Die in diesen Verfahren nützlichen Verbindungen müssen eine differenzierte Affinität für das biologische Zielsubstrat, welches beeinträchtigt oder zerstört werden soll, aufweisen und müssen fähig sein, Licht zu absorbieren, so dass der bestrahlte Arzneistoff auf eine Weise aktiviert wird, dass er eine schädliche Wirkung auf die angenzenden Zusammensetzungen und Materialien aufweist.
Da es immer erstrebenswert ist, die Leistung der therapeutischen und diagnostischen Mittel zu optimieren, ist nach Variationen an den in der Behandlung und Diagnose traditionell verwendeten Porphyrinarzneistoffen gesucht worden. Es sind etliche allgemeine Klassen von Photosensibilisatoren vorgeschlagen worden, einschließlich Phthalocyanine, mit Psoralen verwandte Verbindungen und multicyclische Verbindungen mit resonanzaktiven Systemen im Allgemeinen. Den hierin offenbarten Verbindungen am meisten ähnlich sind verschiedene Pheophorbidderivate, deren Verwendung in der photodynamischen Therapie in der EPO-Anmeldung 220686 der Nihon Metaphysics Company beschrieben ist; Ethylendiaminderivate von Pheophorbid, für diesen Zweck in der Japanischen Anmeldung J85/000981 von Tama Seikayaku, K.K., beschrieben, und die Japanische Anmeldung J88/004805, welche auf 10-Hydroxypheophorbid a gerichtet ist. Zudem offenbaren Beems, E.M. et al., in Photochemistry and Photobiology (1987) 46: 639–643, die Verwendung von zwei Derivaten von Bacteriochlorophyll-a als Photosensibilisatoren-Bacteriochlorophyllin-a (auch als Bacteriopheophorbid-a bekannt, dem der Phytyl-Alkohol, der in Bacteriochlorophyll a derivatisiert ist, fehlt), und Bacteriochlorin-a (dem sowohl die Phytylgruppe als auch das Mg-Ion fehlt). Diese Autoren richten ihre Aufmerksamkeit auf diese Derivate, da sie aus Gründen der verbesserten Wasserlöslichkeit verglichen mit Bacteriochlorophyll-a vorteilhaft sind.
EP 584552 und WO 97/19081, beide von Yeda Research and Development Co. Ltd., beschreiben Chlorophyll- und Bacteriochlorophyllderivate und ihre Verwendung als PDT-Mittel beziehungsweise metallisierte Bacteriochlorophylle und ihre Herstellung durch Transmetallisierung der entsprechenden Cd-BChl-Derivate.
Das Problem, geeignete, in der photodynamischen Therapie und Diagnose nützliche Photosensibilisatoren zu finden, welche für besondere Ziele und besondere Kontexte optimal sind, besteht fort. Deshalb stellt die Erfindung eine weitere Gruppe von photosensibilisierenden Verbindungen bereit, die Teil des Repertoires von Kandidaten zur Verwendung in spezifischen therapeutischen und diagnostischen Situationen wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist nun in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung entdeckt worden, dass die Verbindungen der Formel I, I' oder I'', nachstehend, wobei A, wie nachstehend definiert, einen Substituenten darstellt, der fähig ist, wirksamen Plasmatransfer und Zellmembranpenetration zu ermöglichen, als PDT-Mittel nützlich sind und die Vorteile einer gesteigerten Löslichkeit, Stabilität und/oder Wirksamkeit verglichen mit den bekannten Verbindungen bieten.
Die Erfindung betrifft deshalb die Verbindungen der Formel I, I' oder I''
wobei
A OH,
OR₁,
-O-(CH₂)_n-Y,
-S-(CH₂)_n-Y,
NH-(CH₂)_n-Y,
-O-(CH₂)₂-OH,
NH-(CH₂)₂-NH-BOC oder
-N-(CH₂-CH=CH₂)₂ darstellt,
wobei
R₁ Na⁺, K⁺, (Ca²⁺)_0,5, (Mg²⁺)_0,5, Li⁺, NH⁴⁺
⁺NH₃-C(CH₂OH)₃, ⁺NH₃-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH,
⁺NH₂(CH₃)-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH oder
⁺N(C_n'H_2n'+1)₄ darstellt;
R₂ H, OH oder COOR₄ darstellt, wobei R₄ C₁-C₁₂-Alkyl oder C₃-C₁₂-Cycloalkyl ist;
R₃ H, OH oder C₁-C₁₂-Alkyl oder -Alkoxy darstellt;
n 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist;
Y -NR'₁R'₂ oder -⁺NR'₁R'₂R'₃, X^– ist, wobei R'₁, R'₂ und R'₃ unabhängig voneinander -CH₃ oder -C₂H₅ darstellen;
X F, Cl, Br oder I ist,
n' 1, 2, 3 oder 4 ist,
und wobei * einen asymmetrischen Kohlenstoff kennzeichnet und – eine gesättigte Einfachbindung oder eine ungesättigte Doppelbindung darstellt.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung der vorstehenden neuen Verbindungen.
Deshalb wird in einer Ausführungsform hierin ein Verfahren beschrieben, um die Beeinträchtigung oder Zerstörung eines biologischen Zielsubstrats zu bewirken, wobei das Verfahren das Behandeln des Zielsubstrats mit einer Menge der Verbindung der Formel I, I' oder I'' umfasst, welche wirksam ist, um das Substrat zu photosensibilisieren, gefolgt von Bestrahlen des Zielsubstrats mit Strahlung in einem Wellenlängenband, das von der Verbindung der Formel I, I' oder I'' absorbiert werden kann für eine Zeit, die wirksam ist, um das Substrat zu beeinträchtigen oder zu zerstören.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung deshalb auf Arzneimittel gerichtet, welche mindestens eine Verbindung der Formel I, I', I'' als ein wirksames Mittel zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Die Zusammensetzungen sind für die photodynamische Therapie und Diagnose von Tumoren in vivo und zum Abtöten von Zellen, Viren und Bakterien, Parasiten und Pilzen in Proben und in lebenden Geweben durch bekannte photodynamische Techniken nützlich.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung der Verbindungen der Formel I, I' oder I'' zur Herstellung eines Arzneimittels, das in der photodynamischen Therapie nützlich ist.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zur Herstellung von Zusammensetzungen, die in der Diagnose und zum Abtöten von Bakterien, Parasiten, Viren und Pilzen ex vivo nützlich sind.
Die Erfindung betrifft ferner das Säurechlorid und -anhydrid der Formeln II beziehungsweise III, hierin nachstehend, als Zwischenprodukte.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt das optische Absorptionsspektrum von Pd-BPheid in einem Gemisch aus Aceton und Methanol/K-Phosphatpuffer dar.
Die 2 beziehungsweise 3 stellen Massenspektren hoher und niedriger Auflösung von PD-BPheid dar, durchgeführt mittels schnellem Atombeschuss („Fast Atom Bombardment") (FAB-MS), dar.
4 zeigt die zeitabhängigen morphologischen Veränderungen von A431-Zellen mit Pd-BPheid oder BChl-SerOMe nach PDT [in den Figuren steht Bchl-Ser für BChl-SerOMe, den Serylmethylester von BChl].
5 zeigt die Phototoxizität von Pd-BPheid und BChl-SerOMe, die an ECV-304-Zellen getestet wurde.
6 zeigt die Phototoxizität von Pd-BPheid und Pd-BPheid-Ethylester an kultivierten M2R-Maus-Melanomzellen. (A) Pigmente gelöst in 95 % Ethanol und weiter bis zu den angezeigten Konzentrationen in Kulturmedium + 10 % Serum auf 1 % Ethanol verdünnt. (B) Pigmente direkt in Kulturmedium + 10 % Serum gelöst.
7 zeigt die Phototoxizität von Pd-BPheid an kultivierten M2R-Maus-Melanomzellen und humanen H29-Kolonkarzinomzellen.
8 zeigt PDT von M2R-Maus-Melanomzellen mit Pd-BPheid (2,5 mg/kg) gelöst in Cremophor und in Salzlösung verdünnt.
9 zeigt PDT von M2R-Mausmelanom mit Pd-BPheid (2,5 mg/kg) gelöst in Salzlösung und mit Cremophor verdünnt.
10 veranschaulicht die Heilung von primären C6-Gliomtumoren nach PDT mit Pd-BPheid oder Pd-BPheid-SerOMe [in der Figur Pd-Bchl-Ser].
11 zeigt das Auftreten von C6-Gliommetastasen in CD1-Nacktmäusen nach einem chirurgischen Eingriff (Amputation) oder nach PDT mit Pd-BPheid oder Pd-BPheid-SerOMe [in der Figur Pd-Bchl-Ser].
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Verbindungen der Erfindung die folgende Formel mit der nachstehenden optischer Konfiguration auf
wobei A die vorstehende Bedeutung aufweist.
Wenn die gepunktete Linie, welche die Bindung zwischen C7 und C8 und C17 und C18 in der vorstehenden Struktur darstellt, eine gesättigte Einfachbindung ist, sind die Kohlenstoffatome mit den Nummern 7, 8, 17 und 18 asymmetrische Kohlenstoffatome. Wenn R² oder R³ H ist, ist C13² ein asymmetrisches Kohlenstoffatom.
In Gegenwart von Sauerstoff oder bei Umgebungsluft und unter Lichteinwirkung kann die Oxidation der vorstehenden Bindungen C7-C8 und C17-C18 geschehen, was zu Verbindungen mit Doppelbindungen an den Positioner C7-C8 und C17-C18 führt.
Die Verbindungen der Formel I' und I'' der vorliegenden Erfindung sind oxidierte Formen der Verbindungen der Formel I und können durch die in Chlorophyll, von Scheer, H. (Hrsg.), CRC Press 1991, S. 147–209, beschriebenen Verfahren erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Verbindungen solche, wobei A OR₁ ist.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung der Erfindung Pd-BPheid (hierin manchmal auch Pd-BChl-COOH bezeichnet), die Verbindung der Formel I, wobei A OH ist, mit der folgenden Struktur:
Eines der Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I, wobei A OH ist, umfasst mindestens die Schritte von:

a) kombinierte Demetallisierung und Hydrolyse einer M-BPheid-17³-Z-Verbindung, wobei Z Phytyl, Geranylgeranyl (gg) oder SerOMe (Seryl-O-methylester) ist und M ein Metall, ausgewählt aus Mg, Cd oder Zn, ist;
b) Einbringen von Pd mit einem Pd-Reagens in die durch (a) erhaltene Verbindung, wodurch ein Pd-BPheid erhalten wird, und, falls gewünscht,
c) anschließende Umsetzung des so erhaltenen Pd-BPheid mit einer entsprechenden Verbindung der Formel R₁-H oder A-H, um das entsprechende R₁-Salz oder eine Verbindung zu bilden, wobei A nicht OH ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren auf die Herstellung von Pd-BPheid gerichtet und Bacteriochlorophyll a (Bchla) wird in Schritt (a) demetallisiert und hydrolysiert und das so erhaltene Bacteriopheophorbid (BPheid) wird in Schritt (b) mit einem Pd-Reagens umgesetzt, um das gewünschte Pd-BPheid herzustellen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I umfasst mindestens die Schritte von:

a) Transmetallisierung eines BChlid-17³-Z, um das entsprechende Pd-BPheid-17³-Z zu erhalten, wobei Z Phytyl, gg oder SerOMe ist,
b) Hydrolyse der so erhaltenen Verbindung und
c) gegebenenfalls anschließende Umsetzung des so erhaltenen Pd-BPheid mit einer entsprechenden Verbindung der Formel R₁-H oder A-H, um das entsprechende R₁-Salz oder eine Verbindung zu bilden, wobei A nicht OH ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren auf die Herstellung des Pd-BPheid gerichtet und Bacteriochlorophyll a (Bchla) wird in Schritt (a) transmetallisiert, um das natürliche zentrale Mg-Atom durch Pd zu ersetzen, und das so erhaltene Pd-BPheid-17³-Z, wobei Z Phytyl ist, wird in Schritt (b) hydrolysiert, um das gewünschte Pd-BPheid herzustellen.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I umfasst mindestens die Schritte von:

a) enzymatischer Hydrolyse eines BChlid-17³-Z, wobei Z Phytyl oder Geranylgeranyl ist, um ein Bchlid zu erhalten;
b) Säuredemetallisierung des BChlid von (a);
c) Einbringen von Pd mit einem Pd-Reagens in das demetallisierte BPheid von (b); und
d) gegebenenfalls anschließende Umsetzung des so erhaltenen Pd-BPheid mit einer entsprechenden Verbindung der Formel R₁-H oder A-H, um das entsprechende R₁-Salz oder eine Verbindung zu bilden, wobei A nicht OH ist.

In den vorstehenden Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I kann das Pd-Reagens jede geeignete reaktive Verbindung sein, welche Pd in derartigen Strukturen bereitstellt, wie zum Beispiel Pd-Acetat und Pd-Chlorid.
Das Einbringen von Pd in den vorstehenden Verfahren kann durch ein zweistufiges Verfahren unter Verwendung von Na-Ascorbat oder Ascorbinsäure oder durch ein einstufiges Verfahren unter Verwendung von 6-O-Palmitoyl-L-ascorbinsäure erreicht werden.
Die Verbindungen der Erfindung, wobei A von OH und OR₁ verschieden ist, können durch Umsetzung des Pd-BPheid (Pd-BChl-COOH) mit der entsprechenden A-H-Verbindung erhalten werden.
Die Verbindungen der Formeln II und III, vorstehend, sind Zwischenprodukte für die Verbindungen der Formel I der Erfindung. Die Säurechloride der Formel II, Pd-BPheid-COCl, können unter Verwendung eines jeden Mittels erhalten werden, das geeignet ist, um Acylchloride wie zum Beispiel SOCl₂ zu bilden.
Die Säureanhydride der Formel III können durch Dehydratisierung der Verbindungen der Formel I, I', I'' mit Essigsäureanhydrid erhalten werden.
Durch Umsetzung dieser Zwischenprodukte II und III mit der entsprechenden Verbindung AH können die Verbindungen der Formel I, I' oder I'' erhalten werden.
Die Erfindung umfasst ferner pharmazeutisch verträgliche Salze der freien Säuren der Formeln I, I' und I''. Die Salze können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren gebildet werden, wie durch Umsetzung der freien Säure oder von einem Salz davon mit anorganischen oder organischen Reagenzien wie, jedoch nicht beschränkt auf, NaOH, KOH, geeigneten Calcium- oder Magnesiumsalzen, LiOH, NH₄OH, Tetraalkylammoniumhydroxid, z. B. Tetraethylammoniumhydroxid oder N-Methylglucamin, Glucamin und Triethanolamin.
Die Verbindungen der Erfindung sind in der photodynamischen Therapie und Diagnose in Bezug auf biologische Zielsubstrate von Nutzen. Mit "biologischem Zielsubstrat" sind jegliche Zellen, Viren oder Gewebe gemeint, welche in der Umgebung unerwünscht sind, gegen welche eine Therapie oder eine andere Korrektur wie Sterilisation unternommen wird oder deren Lokalisation in einer Umgebung, die einer Diagnose unterzogen wird, bekannt sein soll.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Arzneistoff der Person injiziert und man lässt ihn eine optimale Konzentration in dem Zielsubstrat erreichen. Dann wird das Zielsubstrat Bestrahlung mit einer Wellenlänge ausgesetzt, die dem Absorptionsspektrum der verabreichten Verbindung entspricht. Die Wirkung der Verbindung kann durch eine begleitende Erhöhung der Temperatur des Zielsubstrats verstärkt werden.
Zur Verwendung in dem Verfahren der Erfindung werden die Verbindungen der Erfindung unter Verwendung üblicher Exzipienten, welche für die beabsichtigte Verwendung geeignet sind, formuliert. Zur systemischen Verabreichung werden im Allgemeinen gepufferte wässrige Zusammensetzungen mit ausreichendem, nicht toxischem Detergens, um den Wirkstoff zu solubilisieren, verwendet. Da die Verbindungen der Erfindung im Allgemeinen in Wasser nicht sehr löslich sind, kann eine solubilisierende Menge eines derartigen Detergens verwendet werden. Geeignete nicht toxische Detergenzien schließen Tween-80, verschiedene Gallensalze wie Natriumglycholat, verschiedene Gallensalzanaloga wie die Fusidate ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Andere Zusammensetzungen benutzen Liposomenträger. Die Lösung wird an einem gewünschten pH-Wert unter Verwendung üblicher Puffer wie Hank-Lösung, Ringer-Lösung oder Phosphatpuffer gepuffert. Andere Bestandteile, welche die Wirksamkeit des Arzneistoffs nicht stören, können ebenfalls eingeschlossen sein, wie stabilisierende Mengen von Protein, zum Beispiel Serumalbumin, oder Lipoprotein mit geringer oder hoher Dichte (LDL beziehungsweise HDL).
Systemische Formulierungen können durch Injektion wie intravenöse (i.v.), intraperitoneale (i.p.), intramuskuläre oder subkutane (s.c.) Injektion verabreicht werden oder können durch transmembrane oder transdermale Techniken verabreicht werden. Formulierungen, die für die transdermale oder transmembrane Verabreichung geeignet sind, schließen Sprays und Suppositorien ein, welche Penetrierungsmittel enthalten, die häufig die vorstehend beschriebenen Detergenzien sein können.
Zur topischen, lokalen Verabreichung kann die Formulierung auch ein Penetrationsmittel enthalten und in Form einer Paste, einer Salbe, eines Einreibemittels, einer Creme oder eines Öls vorliegen. Geeignete Formulierungen sowohl für die systemische als auch die lokalisierte topische Verabreichung werden in Remington's Pharmaceutical Sciences, neueste Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA, gefunden.
Zur Verwendung ex vivo, um zum Beispiel Blut oder Plasma zur Transfusion oder Präparate von Blutprodukten zu behandeln, ist keine spezielle Formulierung notwendig, jedoch werden die Verbindungen der Erfindung vor der Bestrahlung in einem geeigneten kompatiblen Lösungsmittel gelöst und in die biologische Flüssigkeit in einer geeigneten Konzentration, typischerweise in der Größenordnung von 1–100 μg/ml, gemischt.
Für photodynamische therapeutische und diagnostische Anwendungen geeignete Dosierungsbereiche werden mit der Anwendungsart und der Wahl der Verbindung ebenso wie mit der Natur des behandelten oder diagnostizierten Zustands variieren. Jedoch liegen geeignete Dosierungen im Allgemeinen in der Größenordnung von 0,01 bis 50 mg/kg Körpergewicht, bevorzugt 0,1 bis 10 mg/kg. Zur topischen Verabreichung werden typischerweise Mengen in der Größenordnung von insgesamt 5–100 mg verwendet.
Die allgemeinen Verfahren zur photodynamischen ex vivo-Behandlung sind den von Matthews, J.L. et al., Transfusion (supra) beschriebenen analog.
In Kürze, es ist zur systemischen Verabreichung erlaubt, einen geeigneten Zeitraum nach der Verabreichung, typischerweise von wenigen Minuten bis zwei Tagen, verstreichen zu lassen, um die optimale Konzentration der Verbindungen der Erfindung im biologischen Zielsubstrat zu ermöglichen. Im Allgemeinen wird dieses Substrat eine Tumorgefäßversorgung, Tumorzellen oder ein jeglicher anderer Tumorbestandteil sein und die Lokalisation der Verbindung kann durch Messen der optischen Absorption des Zielgewebes verglichen zum Hintergrund überwacht werden. Nachdem die Optimierung erreicht worden ist, wird das biologische Zielsubstrat mit einem geeigneten Strahlungsband im Bereich von 740–800 nm oder 500–600 nm oder 700–900 nm mit einer Menge von 5–750 mW/cm² und einer Gesamtenergie von 100–1000 J/cm² bestrahlt.
Zur topischen Behandlung ist die Lokalisation unmittelbar und die entsprechende Bestrahlung kann danach bereitgestellt werden. Zur Behandlung von biologischen Flüssigkeiten ex vivo wird die Bestrahlung angewendet, nachdem die optimale Bindung/Aufnahme durch das Zielgewebe erreicht worden ist. Die Strahlungsfluenz liegt in der Größenordnung von 1–10 J/cm². Da eine Penetrierung des Gewebes nicht erforderlich ist, kann eine geringere Gesamtenergie verwendet werden.
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen mindestens eine Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie vorstehend definiert, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger. Diese Zusammensetzungen können in Form einer Lösung, einer Lipidemulsion oder eines Gels oder in Form von Liposomen oder Nanopartikeln vorliegen. Der geeignete Träger wird ausgewählt, um die Optimierung der Konzentration der Verbindung der Erfindung am Zielsubstrat zu ermöglichen. Beispiele für derartige Träger sind "Tween 80", Polyethylenglykol, z. B. PEG 400, "Cremophor EL", Propylenglycol, Ethanol, Basilikumöl, Gallensalze und Gallensalzanaloga und Gemische davon, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Liposomformulierungen können zum Beispiel auf Dimyristoylphosphatidylcholin oder Phosphatidylglycerin basiert werden. Der Träger kann auch Dipalmitoylphosphatidylcholin umfassen.
Wenn Nanopartikel verwendet werden, können sie in Form von PEG-überzogenen Poly(milchsäure)-Nanopartikeln vorliegen. In der Form von Lipidemulsionen werden üblicherweise Lipoproteine mit geringer Dichte und Triglyceride verwendet.
In der Zusammensetzung der Erfindung liegt (liegen) die Verbindung (die Verbindungen) in einer Menge von 0,01 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,05 Gew.-% bis 5 Gew.-% des Gesamtgewichts der Zusammensetzung vor.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Herstellung von Pd-BPheid
Pd-BPheid wurde aus BChla durch das folgende 3-stufige Verfahren hergestellt.
(a) Isolierung von Bacteriochlorophyll a (BChla)
BChla wurde aus lyophilisierten Bakterien Rhodovolum sulfidophilum wie folgt extrahiert:
Lyophilisierte Zellen (100 g) wurden zu Pulver zermahlen, fünfmal mit insgesamt 1250 ml Aceton gewaschen, um die Carotenoide teilweise auszuwaschen, das Gemisch wurde filtriert und BChla wurde aus dem Feststoff mit absolutem Methanol (~ 1200 ml, 4–5 Filtrationen) extrahiert. Nach dem Filtrieren wurde die dunkle blaugrüne Lösung teilweise unter Vakuum eingedampft, die eingeengte Lösung (~ 500 ml) wurde zwei- bis dreimal mit Petrolether (Kp. 80–100 °C, ~ 1300 ml) extrahiert, um die Carotinoide weiter zu beseitigen, und die Petroletherphase wurde zweimal mit Methanol (~ 550 ml) extrahiert. Diese Phase wurde dann entfernt, die vereinigte Methanolphase wurde unter Vakuum eingedampft und der blaugrüne Rückstand wurde wieder in Methanol-Aceton (1 : 3, Vol./Vol.) gelöst und auf eine DEAE-Sepharose-Säule (3 × 10 cm), die mit Methanol-Aceton (1 : 3, Vol./Vol.) äquilibriert worden war, geladen. Das BChla wurde mit Methanol-Aceton (1 : 3, Vol./Vol.) eluiert, das Methanol-Acetongemisch wurde eingedampft und das trockene Bchla wurde wieder in einem exakten Volumen (für das Absorptionsspektrum) von Ether gelöst und durch Baumwolle filtriert, um das gelöste Säulenmaterial loszuwerden. Nach finalem Eindampfen wurde das feste Pigment unter Argon in Dunkelheit bei –20°C gelagert. Extraktionsausbeute: etwa 700 mg BChla pro 100 g lyophilisierter Zellen.
Die DEAE-Sepharose-Säule wurde, wie vorher beschrieben, hergestellt (Omata und Murata, 1983, "Preparation of Chlorophyll a, Chlorophyll b and Bacteriochlorophyll a by column chromatography with DEAE-Sepharose C1-6B and Sepharose C1-6B", Plant Cell Physiol., Bd. 24, S. 1093–1100). In Kürze, DEAE-Sepharose wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und dann zu einer Acetatform umgewandelt, indem sie in 1 M Natriumacetatpuffer (pH-Wert = 7) suspendiert wurde. Die Aufschlämmung wurde dreimal mit Aceton gewaschen und schließlich in Methanol-Aceton (1 : 3, Vol.: Vol.) zur Lagerung bei 5°C suspendiert.
(b) Herstellung von Bacteriopheophorbid (BPheid)
Roher Bchla-Extrakt, wie in (a) erhalten (etwa 100 mg Bchla, das einige restliche Carotenoide enthielt), wurde in 80 % wässriger Trifluoressigsäure (etwa 15 ml) gelöst, durch welche man Stickstoff für 10 min hindurchperlen ließ. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur für 2 h gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (250 ml) gegossen und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand auf Siliciumdioxid (3 cm × 15 cm-Säule, Kieselgel 60, Merck) chromatographiert und mit Methanol in Chloroform durch einen schrittweisen Gradienten eluiert: 2 %, 5 %, 10 %, 15 %. Zu Beginn wurden Carotinoide und eine kleine Menge Bacteriopheophytin ausgewaschen, gefolgt von Elution von Allo-Bacteriopheophytin und Carotenoiden. Bei 10 % Methanol in Chloroform begann das Sammeln des Produkts und es wurde durch DC (Kieselgel, Chloroform-Methanol 9 : 1) überwacht. Das Produkt (60 mg) wurde eingedampft und der in CHCl₃ aufgenommene Rückstand wurde durch eine U1traPore-Membran filtriert, um das restliche Siliciumdioxid zu entfernen, das anderenfalls Oxidationen verursachen könnte.
c) Einbringen von Palladium in Bacteriopheophorbid (BPheid)
BPheid (100 mg), wie in (b) erhalten, und Pd-Acetat (80 mg) wurden in Dichlormethan (~ 10 ml) gelöst und zu einer Suspension von 200 mg Natriumascorbat in 50 ml Methanol zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem geschlossenen Kolben bei Raumtemperatur gerührt und alle 15–20 Minuten wurden Proben aus dem Reaktionsgemisch gesammelt und ihre optische Absorption wurde aufgezeichnet. Nach etwa 4 Stunden war der größte Teil der BPheid-Absorption bei 357 nm durch die Pd-BPheid-Absorption bei 330 und 390 nm ersetzt worden.
Das Reaktionsgemisch wurde in eine Chloroform/Wasserlösung (200 ml; 50 : 50 Vol./Vol.) überführt und in einem Trenntrichter geschüttelt. Die organische Phase wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumchlorid getrocknet und eingedampft. Das getrocknete Material wurde zu 80 mg Pd-Acetat zugegeben und die vorstehenden Schritte wurden wiederholt, bis die restliche Absorption bei 357 nm vollständig verschwand und das Verhältnis zwischen der Absorption bei 765 nm (der Peak des Übergangs im äußersten Rotbereich) und des Absorptionsmaximums bei 330 mn einen Wert von ~ 2,4 (in Chloroform) erreichte.
Das getrocknete Reaktionsgemisch wurde in einem minimalen Volumen von 2 : 1-Chloroform Aceton solubilisiert und auf eine CM-Sepharose-Säule (150 mm × 25 mm) geladen, die mit Aceton voräquilibriert worden war. Die Säule wurde zuerst mit Aceton gewaschen und dann wurde die eluierte erste Fraktion entfernt. Die Säule wurde dann mit 9 : 1 Aceton : Methanol gewaschen. Zwei Banden wurden hervorstechend und wurden ausgewaschen – die erste war das Hauptprodukt und die zweite war ein allomerisiertes Nebenprodukt (entfernt). Das Produkt wurde fast bis zur Trockenheit eingeengt und in ein 50 : 50-Chloroform : Wasser-System in einem Trenntrichter überführt. Das Gemisch wurde gründlich geschüttelt und die organische Phase wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat (oder Natriumchlorid) getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft.
Beispiel 2. Herstellung von Pd-BPheid
(a) Isolierung von Bchla
Dieser Schritt des Verfahrens wurde wie in Beispiel 1(a) vorstehend durchgeführt.
(b) Herstellung von Pd-BPheid
6-O-Palmitoyl-L-ascorbinsäure (246 mg, 593 μmol) wurde in MeOH (84 ml) gelöst und man ließ N₂ durch die Lösung passieren. Bpheid (92 mg, 151 μmol) und Pd(CH₃COO)₂ (83 mg, 370 μmol) wurden in CHCl₃ gelöst (34 ml, mit N₂ entgast) und zu der methanolischen Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde unter einer inerten Atmosphäre unter Rühren gehalten und der Umsetzungsfortschritt wurde durch Aufzeichnen der Absorptionsspektren von kleinen Teilen der Umsetzung alle paar Minuten überwacht. Nach ~ 30 min war die Umsetzung abgeschlossen und die Lösungsmittel wurden verdampft.
(c) Reinigung von Pd-Bpheid
Das rohe Pd-BPheid wurde in CHCl₃ gelöst und auf eine Säule geladen, die mit 15 g 0,4 % Siliciumdioxid-Asc. bepackt war. Man ließ ein kleines Volumen von CHCl₃ (~ 30 ml) durch die Säule passieren und dann wurde das Pigment unter Verwendung von MeOH : CHCl₃ (1 : 99, 250 ml) eluiert. Die Reinheit der Fraktionen wurde durch DC und optische Absorptionsspektroskopie bestimmt. Massenspektroskopie und NMR-Nachweis wurden an repräsentativen Proben durchgeführt. Ausbeute: 82,5 mg reines Pd-BPheid (76 %).
Zur Herstellung der 0,4 % Siliciumdioxid-Asc. wurde Ascorbinsäure (240 mg) in einem Gemisch aus 240 cc EtOH : CHCl₃ : MeOH (60 : 60 : 120) gelöst. Silicagel 60 (60 g, Merck, Kat. Nr. 107734, 70–230 mesh) wurde zugegeben und das Aufschlämmungsgemisch wurde für 10 min gerührt und dann an der Pumpe filtriert. Die gelbliche Siliciumdioxid-Asc. wurde schließlich für ~ 1 h bei ~ 50 °C getrocknet. Diese 0,4 %-Siliciumdioxid-Asc. ist fertig, um als reguläres Silicagel verwendet zu werden; seine Natur ist weniger polar und es weist einige antioxidative Eigenschaften auf.
Beispiel 3. Herstellung von Pd-BPheid
(a) Isolierung von Bchla
Dieser Schritt wurde wie in Beispiel 1(a) vorstehend durchgeführt.
(b) Herstellung von Chlorophyllase (Chlase)
Chlorophyllase (Chlase) wurde aus Chloroplasten von Melia azedarach L, den Blättern des Chine Tree, hergestellt. Frische Blätter (50 g) wurden für 2 min in einem Mischer zermahlen, der 350 ml Aceton, das auf –20 °C gekühlt worden war, enthielt. Das Homogenat wurde durch vier Gazeschichten filtriert und das Filtrat wurde gesammelt und man ließ es über Nacht bei 4°C zur weiteren Präzipitation stehen. Das Aceton wurde durch Filtration entfernt und das verbleibende Pulver wurde einige Male mit kaltem Aceton gewaschen, um Spuren von Chlase und Carotinoiden zu entfernen, bis das Filtrat farblos war. Das Chlase-Aceton-Pulver wurde schließlich in einem Lyophilisator getrocknet und weiter bei –20°C gelagert. Unter diesen Bedingungen war die Enzymzubereitung für über 1 Jahr stabil ohne nennenswerten Wirksamkeitsverlust. Ausbeute: Es wurden 20 g Chlase pro 1 kg Blätter erhalten.
(c) Synthese und Reinigung von Bacteriochlorophyllid (BChlid)
Ascorbinsäure (70 mg, Merck) wurde in Wasser (9 ml) gelöst, der pH-Wert der Lösung wurde unter Verwendung von 10 M wässriger KOH-Lösung auf 7,7 eingestellt und 1 ml 0,5 M Natriumphosphatpuffer (pH-Wert 7,7) wurde zugegeben, um den pH-Wert während der Umsetzung aufrecht zu erhalten. Triton X-100 (etwa 80 μl) wurden zugegeben, um eine finale Detergens-Konzentration von 0,8 % (Vol./Vol.) zu erreichen. Chlase-Aceton-Pulver (200 mg) wurde in 6 ml dieser Lösung unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators homogenisiert. Die restliche Lösung wurde verwendet, um das Instrument zu waschen, und wurde dann mit dem Homogenat vereinigt. Die Enzymlösung mit 20 mg festem Bchla, mit Argon gesättigt, wurde mit Ultraschall behandelt und in Dunkelheit für 6 h bei 37°C unter Rühren inkubiert.
Zur Reinigung wurde das Reaktionsmaterial direkt nach 6 h Umsetzung eingefroren (–20°C) und anschließend lyophilisiert. Der trockene Rückstand wurde in Aceton gelöst und mit Ultraschall behandelt und die Lösung wurde dann einer CM-Sepharose-Säule, die in Aceton äquilibriert worden war, unterzogen. Die Säule wurde mit Aceton gewaschen, um das nicht umgesetzte Material zu eluieren, und dann mit 5 % und 7 % Methanol (Vol./Vol.) in Aceton, um das Bacteriochlorophyllid (Bchlid) und Bacteriopheophorbid (Bpheid) zu eluieren. Das Produkt wurde mit 25 % Methanol in Aceton eluiert. Das Lösungsmittel wurde eingedampft und das feste Pigment wurde unter Argon bei –20°C in Dunkelheit gelagert.
Umsetzungsausbeute:
30–55 %.
Die CM-Sepharose zur Chromatographie wurde hergestellt durch erstens Waschen der CM-Sepharose mit Wasser und dann dreimal mit Aceton vor dem Bepacken einer Säule und Äquilibrieren in Aceton. Das Chromatographiematerial kann nach gründlichem Spülen mit 2 M wässriger NaCl-Lösung, bis es farblos ist, Waschen mit Wasser und Resuspendieren in Aceton wieder verwendet werden.
(d) Einbringen von Palladium in das Bacteriopheophorbid (BPheid)
Das Verfahren ist das gleiche wie in Beispiel 1 (c), vorstehend. HPLC des getrockneten Materials zeigte das Hauptprodukt in Form von zwei Epimeren, welche chemisch identisch waren (88 % des gesamten Gemischs), und restliche Allomere. Es gab auch eine leichte (0,5 %) Kontamination des Ausgangsmaterials, BPheid.
Beispiel 4. Bestimmung der Verbindung Pd-BPheid
(a) Extinktionsspektren
Die Extinktionsspektren von Pd-BPheid wurden mit einem UVICON-Spektrophotometer (1 cm Pfadlänge) unter Verwendung eines PM-Detektors, der auf die Grundlinie normalisiert ist, bestimmt. Die Sensibilität beträgt 0,05.
Die Extinktionsspektren von Pd-Bpheid in Aceton und einem Gemisch aus Methanol/K-Phosphatpuffer sind in Tabelle 1 und in 1 aufgezeigt.
Das Extinktionsspektrum von Pd-BPheid im Plasma war auf 763 nm nach rot verschoben.
Tabelle 1
Der Pic-Nachweis offenbarte die folgenden Peaks gemäß 1: bei 758 nm: 1,2502; bei 537 nm: 0,3239; bei 384 nm: 0,5351; und bei 329 nm: 0,7766.
(b) HPLC-Nachweis von Pd-BPheid

Es wurde ein Umkehrphasen-HPLC-Verfahren entwickelt, um das Verunreinigungsprofil zu bestimmen und das Palladium-BPheid zu quantifizieren.

Feste Phase:	eine C₈-Inertsil 5 μm, 250 × 4,6 mm
Flüssige Phase:	Methanol : Kaliumphosphatpuffer 20 mM pH-Wert = 6,59 (70 % : 30 %)
Fließgeschwindigkeit:	1 ml/min
Injektionsvolumen:	100 μl
Nachweis:	1-Spectroflow 783, Deuteriumlampe: 385 nm 2-Spectroflow 757, Wolframlampe: 753 nm

Wie in Tabelle 2 gezeigt, zeigte die HPLC-Analyse des Produkts Pd-Bpheid, wie in Beispiel 3 erhalten, 7 Peaks. Der Hauptpeak stellte 64 bis 70 % des Gesamtprodukts dar.
Lösungen von Pd-BPheid, die in Aceton bei –20 °C gelagert wurden, waren für einen mindestens 2-monatigen Zeitraum stabil. Wenn die Stammlösung bei Raumtemperatur für 18 Stunden gehalten wurde, wurde keine Veränderung im HPLC-Profil beobachtet, was zeigt, dass Pd-Bpheid eine stabile Verbindung ist.
Tabelle 2. HPILC-Nachweis von Pd-BPheid
(c) Bestimmung des Pd-BPheid durch NMR
Nach einem Reinigungsschritt des Pd-BPheid, das gemäß dem Beispiel 3 hergestellt worden war, betrug der prozentuale Anteil des Hauptpeaks über 90 %. Die Reinigung wurde durch eine präparative HPLC-C8 durchgeführt. Die gereinigte Verbindung wurde zur Bestimmung des Produkts durch NMR und Massenspektrometrie verwendet.
Die Analyse des Pd-BPheid durch NMR wurde durchgeführt und die chemischen Verschiebungen sind in Tabelle 3 aufgelistet.

– ¹H-NMR und ¹³C-NMR
– 2D-¹H-NMR (COSY und NOESY)
– 2D-¹H-¹³C-NMR (HMQC und HMBC: reverser Nachweis).

Tabelle 3. ¹³C-Chemische ¹H, Verschiebungen (ppm)
(d) Bestimmung von Pd-BPheid durch Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrieanalyse von Pd-BPheid führte zu den in den 2 und 3 abgebildeten Spektren. Sie wurde durch schnellen Atombeschuss (FAB) unter geringen und hohen Auflösungen durchgeführt. Das Spektrometer war ein "ZabSpec TOF Micromass"-Spektrometer; Ionisationsmod.: LSIMS mit Cs⁺, positiv, Beschleunigung: 8 kV; Quellentemperatur: 40 °C; verwendetes Lösungsmittel: mNBA (meta-Nitrobenzilalkohol); Input: lateral.
Ergebnisse: Ionentyp: M⁺; Formel: C₃₅H₃₆N₄O₆ ¹⁰⁶Pd; Theorie: 714,1670 Z: 1 m/z, theoretisch 714,1670 m/z, gefunden 714,1689.
Diese Ergebnisse bestätigten die NMR-Untersuchung: m/e = 714 und bestätigten die Einfügung von Palladiummetall.
Die chemische Struktur, welche durch NMR und Massenspektrometrie analysiert wurde, ist das Palladiumderivat der freien Säureform von BChl-Pd-BPheid.
Beispiel 5. Biologische Wirksamkeit von Pd-BPheid auf murine L1210- und humane HT29-Zellen

(i) Zelllinien. Die murine Leukämiezelllinie (L1210) wurde in einer Suspensionskultur unter Verwendung von Fischer-Medium, das mit 10 % Pferdeserum, 1 mM Glutamin, 1 mM Mercaptoethanol und Gentamicin supplementiert worden war, gehalten. Der RIF (strahlungsinduziertes Fibrosarkom)-Tumor wurde, wie von Twentyman et al. (1980, "A new mouse Tumor model system (RIF-1) for comparison of end-point studies", J. Natl. Cancer Inst. 64, 595–604) näher ausgeführt, gehalten. Man ließ die Kulturen in Weymouth-Medium, das 10 % fötales Kälberserum und Gentamicin enthielt, wachsen. Humane HT29-Kolon-Adenokarzinomzellen wurden in RPMI 1640 ohne Phenolrot und mit 10 % FCS kultiviert. Die Zellen wurden durch Dispergieren mit 0,25 % Trypsin in 0,02 % EDTA subkultiviert und bei einem Teilungsverhältnis von 1 : 5 wieder ausplattiert.
(ii) Phototoxizität in vitro. Für Studien auf Phototoxizität, an denen L1210 und RIF-Zellen beteiligt sind, wurde Licht von einer 600 Watt Quarz-Halogenquelle bereitgestellt, das mit 10 cm Wasser und einem 850 nm Ausschluss-Filter, um IR zu entfernen, gefiltert wurde. Die Bandbreite wurde ferner auf 660 ± 5 nm durch einen Interferenzfilter (Oriel) begrenzt. Zellen in Suspension (L1210) oder an Deckgläschen mit einem Durchmesser von 24 mm anhaftend wurden in Wachstumsmedium (wobei 20 mM HEPES pH-Wert 7 für weitere Pufferkapazität NaHCO₃ ersetzen) für 15 min in Gegenwart von festgelegten Spiegeln von Sensibilisatoren inkubiert. Die Zellen wurden dann von dem Sensibilisator freigewaschen und in frisches Medium überführt. Die Bestrahlungen wurden bei 10°C durchgeführt. Für einige Studien wurden die Zellen dann mit Fluoreszenzsonden markiert und die Orte des Photoschadens wurden bewertet. In anderen Studien wurden die Zellen dann für 60 min bei 37°C in frischem Medium inkubiert, um den Fortgang der Apoptose zu ermöglichen. Lebensfähigkeitsstudien wurden unter Verwendung von Platten mit 96 Vertiefungen und einem 72-stündigen MTT-Test in vierfacher Ausführung durchgeführt. Für das HT29-Modell wurden die Zellen für 1 Stunde mit verschiedenen Konzentrationen von Pd-Bpheid inkubiert und durch eine Halogenlampe oder einen Titan-Saphir-Laser mit 300 mW/cm² bei 10 und 25 J/cm² bestrahlt.
(iii) Zell-Lebensfähigkeit. Das Überleben der Zellen wurde durch die MTT-Reaktion, die 3 Tage nach dem Ausplattieren von 1.000–50.000 Zellen in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt wurde, getestet. Die Farbintensität wurde mit einer Standardkurve, die variable Zahlen von Kontrollzellen enthielt, verglichen. Die Extinktion bei x nm wurde mit einem BioRad-Plattenlesegerät bestimmt. L1210 ließ man während der nächsten 3 Tage Wachstum in frischem Medium vollziehen, und die Zellzahlen wurden gleichermaßen unter Verwendung des MTT-Testverfahrens geschätzt.
(iv) Binden von Lipoprotein: Das Binden von Pd-BPheid an Protein- und Lipoproteinverbindungen des humanen Kontrollplasmas wurde bestimmt. Inkubation einer 250 μl-Plasmaprobe mit 3 μM der Verbindung für 30 min bei 37°C. Lipoprotein- und Proteinbestandteile wurden dann durch eine Dichtegradientenzentrifuge getrennt. Die Gradienten wurden fraktioniert, die Fraktionen wurden in 3 ml 10 mM Triton X-100-Detergens verdünnt oder die Fluoreszenz bei 750–800 nm wurde unter Anregung bei 400 nm bestimmt.

Ergebnisse

(v) Phototoxizitätswirkung von Pd-BPheid auf L1210-Zellen Murine L1210-Leukämiezellen wurden mit 1 μM Pd-BPheid für 30 nun bei 37°C inkubiert, was zum Abtöten von 50 % der Zellen unter Anwendung einer Lichtdosis von 75 mJ/cm² bei 760 ± 5 nm führte. Ein ähnlicher Grad des Abtötens von Zellen in der RIF-Linie erforderte eine Lichtdosis von 215 mJ/cm².
(vi) Phototoxizitätswirkung von Pd-BPheid auf HT29-Zellen Die Überlebensrate variierte zwischen 100 % und 79 %, wenn HT29-Zellen mit Pd-BPheid ohne Licht inkubiert wurden. Die Zellüberlebensrate nahm ab, wenn die Konzentration von Pd-BPheid höher war und wenn die abgegebenen Energiedosen erhöht wurden. Die Pd-BPheid-Photosensibilisatordosis, welche eine 50%ige Todesrate (auch LD₅₀ genannt) verursachte, betrug 48 μM unter einer Bestrahlung von 25 J/cm². Die Anregungswellenlänge, welche die wichtigste Phototoxizität induzierte, betrug 773 nm.
(vii) Orte des Photoschadens. Unter Verwendung von Maus-L1210-Leukämiezellen war Pd-BPheid ein hoch spezifischer mitochondrialer Photosensibilisator ohne nachweisbaren Photoschaden an der Plasmamembran oder an Lysosomen. Ein derartiges Ergebnis ist mit dem schnellen Einsetzen der Apoptose in Zusammenhang gebracht worden.
(viii) Binden an Plasmalipoprotein. Durchgeführte Studien wiesen darauf hin, dass Pd-BPheid an HDL>LDL>>> Albuminfraktionen des humanen Serums gebunden war, das als eine Determinante der PDT-Selektivität angesehen wird.

Beispiel 6. Formulierungen von Pd-Bpheid: Solubilisierung und Stabilität von Pd-Bpheid in für Tierexperimente verwendeten Lösungsmitteln
Lösungen von Pd-BPheid wurden in unterschiedlichen Formulierungen hergestellt, um eine Konzentration von 0,05 bis 2 % zu erhalten.

(a) Eine Cremophor-Formulierung wurde wie folgt hergestellt: 40 mg Pd-BPheid wurden in 2 ml Cremophor EL in einem trockenen Röhrchen entweder durch langsame Rotation des Fläschchens, bis die Lösung vollständig frei von Teilchen geworden war, oder unter Verwendung von kurzen Pulsen aus einer Ultraschall-Oszillator-Sonde gelöst. Das Röhrchen wurde gekühlt, so dass die Temperatur 30°C nicht überstieg. Nachdem der Arzneistoff solubilisiert worden war, wurden 0,6 ml Propylenglykol zugegeben und wieder entweder durch langsame Rotation oder mit der Ultraschallsonde gemischt. Isotonisches NaCl wurde dann in Portionen von 0,1 ml auf ein Gesamtvolumen von 4 ml zugegeben. Das Gemisch sollte nach jeder Zugabe klar sein, ohne Hinweise auf ein Präzipitat. Die Zusammensetzungen wurden nach jeder Zugabe von NaCl 0,9 % kurz mit der Ultraschallsonde behandelt, wobei darauf geachtet wurde, dass die Temperatur unter 25–30°C blieb. Die Konzentration des Arzneistoffs wurde durch Messen der Extinktion bei 757 nm nach Verdünnung in Ethanol getestet.

Wenn 20 mg/kg Pd-BPheid in den Versuchsstudien verwendet wurden, sind dies umgerechnet 0,4 mg pro 20 Gramm Maus. Da nicht mehr als 0,1 ml Cremophor in eine Schwanzvene injiziert werden kann, betrug die Arzneistoffkonzentration dann 4 mg/ml.

(b) Eine modifizierte Cremophor-Formulierung wurde wie folgt hergestellt: 5 mg Pd-BPheid wurden mit 0,4 ml Cremophor EL gemischt. Nach dem Auflösen wurden 0,12 ml Propylenglycol zugegeben. Isotonische Salzlösung (1,48 ml) wurde dann in kleinen Portionen zugegeben und dasselbe wurde nach jeder Zugabe gemischt. Die finale Lösung war völlig klar und frei von Partikeln. Eine Ultraschallsonde wurde verwendet, um das Lösen des Arzneistoffs zu unterstützen, wobei die Lösungen durch Kühlen nach Bedarf in einem Eisbad unter 25°C gehalten wurden.

Die Bestimmung der Pd-BPheid-Konzentration in der Cremophor-Lösung wurde durch Verdünnen in Methanol durchgeführt. Das Extinktionsspektrum wurde über 740–780 nm gemessen. Der Peakwert wurde mit den Ergebnissen aus einer bekannten Konzentration von Pd-BPheid verglichen.

(c) Zusätzliche Formulierungen wurden unter Verwendung von Tween 80 und Ethanol hergestellt, um Pd-BPheid (1 mg Pd-BPheid/ml Lösung) zu solubilisieren.

Beispiel 7. Tozizitäts-Studien in vivo – Wirkung von Pd-BPheid auf murine Tumormodelle
Es wurden zwei Versuchsreihen unter Beteiligung von murinen Tumormodellen verwendet, um die Phototoxizität von Pd-BPheid zu testen.

(a) Die photodynamische Ansprechempfindlichkeit von Pd-BPheid wurde zunächst in zwei murinen Tumormodellen bewertet: BA-Mamma-Adenokarzinom und strahleninduziertes Fibrosarkom (RIF-1).

Parameter der photodynamischen Therapie: Mäuse mit Tumoren, welche 5–7 mm im Durchmesser messen, wurden in PDT-Versuche aufgenommen. Drei Pd-Bpheid-Arzneistoffdosen (1, 5 und 10 mg/kg) und zwei Lichtdosen (100 und 300 Joule/cm²) wurden bewertet. Eine Formulierung aus in Cremophor gelöstem Pd-BPheid wurde durch i.v.-Injektion in den Schwanz verabreicht. Die PDT-Licht-Exposition wurde entweder 15 Minuten, 1 Stunde oder 4 Stunden nach der Injektion begonnen. Drei Mäuse wurden unter jeder Behandlungsbedingung behandelt, wenn nicht die anfänglichen Ergebnisse eine letale Toxizität oder keine Ansprechempfindlichkeit zeigten. Ein auf 757 nm eingestellter Titan-Saphir-Laser wurde als Lichtquelle für die PDT verwendet. Das durch den Laser erzeugte Licht wurde in Quarzfasern gekoppelt, um das Licht an die Tumore abzugeben. Es wurde eine Lichtleistungsdichte von 75 mW/cm² verwendet. Die Tumorgröße wurde an 3 Tagen pro Woche nach den PDT-Behandlungen gemessen und der prozentuale Anteil der Tumorheilungen (definiert als nicht Wiederauftreten des Tumors für 40 Tage nach der Behandlung) wurde bestimmt.
PDT-Reaktion in vivo: Die Tabellen 4 und 5, hierin nachstehend, stellen Zusammenfassungen der PDT-Behandlungsergebnisse für C3H-Mäuse bereit, denen entweder das BA-Mammakarzinom oder das RIF-1-Fibrosarkom transplantiert worden war. Jede Tabelle zeigt die folgenden Parameter: 1) intravenöse Arzneistoffdosis ausgedrückt in mg/kg; 2) Laserbehandlungsparameter einschließlich der Gesamtlichtdosis (J/cm²), der Wellenlänge (757 nm), der Lichtdosisrate (mW/cm²) und des Zeitintervalls (zwischen für jede Gruppe behandelt), 4) Toxizität (vier Mäuse starben kurz nach der Behandlung), 5) erneutes Tumorwachstum (besteht aus der Anzahl der Tage zwischen der PDT-Behandlung und dem Wiederauftreten des Tumors) und 6) die Anzahl der Mäuse (und des prozentualen Anteils) mit durch Pd-Bpheid-PDT induzierten Tumorheilungen.
Wie hierin gezeigt, wurde entdeckt, dass die Pd-BPheid vermittelte PDT sowohl eine klassische als auch eine wirksame tumorzerstörende Reaktion in zwei Maus-Tumor-Modellen induzierte. Die PDT-vermittelte Tumor-Ansprechempfindlichkeit war direkt mit der Arzneistoffdosis, der Lichtdosis und dem Zeitintervall zwischen der Arzneistoffverabreichung und der Lichtbehandlung korreliert. Genauer erzeugten höhere Arzneistoffdosen und/oder höhere Lichtdosen verstärkte Reaktionen. Es wurde entdeckt, dass das BA-Mammakarzinom empfindlicher auf die Pd-BPheid vermittelte PDT war als vergleichbare PDT-Behandlungen des RIF-1-Fibrosarkoms. Pd-BPheid vermittelte PDT war wirksam, wenn die Lichtbehandlungen innerhalb von 1 Stunde nach der Arzneistoffbehandlung begonnen wurden und war nicht wirksam, wenn ein 4-stündiges Intervall zwischen der Arzneistoffverabreichung und der Lichtbehandlung angewandt wurde.

(b) In der zweiten Versuchsreihe wurde die Phototoxizität von Pd-BPheid in einem Maus-Tumor-Modell getestet, wobei humanes HT29-Kolon-Adenokarzinom transplantiert wurde.

Tier- und Tumormodell: Festes Tumorgewebe (Durchmesser 2 cm) wurde einer Spendermaus unmittelbar nach dem Tod entfernt und mechanisch in 1 ml 0,9 % Salzlösung zerdrückt und die Lösung (0,1 ml) wurde s.c. in ein Hinterbein jeder Maus injiziert. Die Mäuse wurden in die Versuche eingeschlossen, wenn der Tumordurchmesser 8–10 mm betrug. Die Tumore wurden 10 Tage vor dem Versuch s.c. in 8 Wochen alte Schweizer Nacktmäuse transplantiert.
Phototoxische Studien: 0,15 ml Pd-BPheid wurde i.v. mit 15 mg/kg injiziert. Die Mäuse wurden mit Thiopental mit 40 mg/kg unmittelbar vor der Bestrahlung anästhesiert. 30 min, 1 h, 4 h oder 24 h nach der Injektion wurden die Mäuse mit einem Titan-Saphir-Laser mit 300 mW/cm² bestrahlt, der mittlere Durchmesser wurde gemessen, um die Bestrahlungszeit einzustellen, um 200 oder 300 J/cm² zu erhalten. Kontrollmäuse, denen kein Pd-BPheid injiziert worden war, wurden ebenfalls unter den gleichen Bedingungen bestrahlt. Die Verzögerung des Tumorwachstums, das durch PDT ausgelöst worden war, wurde mittels Äquivalenz mit Tests analysiert, die in experimenteller Radiotherapie realisiert wurden. Für die Studien in vivo und für jeden einzelnen Versuch waren alle Ergebnisse das Mittel von 2 oder 3 Einzelversuchen und für jeden einzelnen Versuch wurden 2 Mäuse für jede Versuchsbedingung verwendet.
Bezüglich der Studien zum Tumorwachstum werden die Ergebnisse als Abweichungen vom Tumorindex mit Referenz (= 1) entsprechend dem Tumorindex von nicht behandelten Zellen ausgedrückt. Der Tumorindex wurde wie folgt berechnet: Tumorindex = (größter Tumordurchmesser + senkrecht entgegengesetzter Durchmesser)/2.
Temperaturabweichungsstudien: Um sicherzustellen, dass die thermische Wirkung nicht übermäßig war, wurde die Temperaturabweichung für die Halogenlampen- und die Titan-Saphirlaser-bestrahlung unter Verwendung von nicht absorbierenden, in Alumin eingebetteten Microthermoelementen gemessen.
Die Ergebnisse dieses Versuchs sind die folgenden:

(i) 763 nm-Bestrahlung mit 200 J/cm²: Es wurde eine Abnahme des Tumorwachstums (verglichen mit den Kontrollen) für die Bedingungen 30 min und 4 h nach der Injektion beobachtet. Eine Abnahme des Tumorindex bis zu 7 Tagen wurde für die Bedingungen 1 h und 24 h nach der Injektion beobachtet.
(ii) 763 nm-Bestrahlung mit 300 J/cm²: Es wurde eine Abnahme des Tumorwachstums (verglichen mit den Kontrollen) für die Bedingungen 30 min und 24 h nach der Injektion beobachtet. Eine Abnahme des Tumorindex bis zu 7 Tagen wurde für die Bedingungen 1 h und 4 h nach der Injektion beobachtet.
(iii) 300 J/cm² Bestrahlung 1 h nach der Injektion: Es wurde eine Abnahme des Tumorwachstums (verglichen mit den Kontrollen) für die Bedingung 773 nm bis zu 5 Tage und für die Bedingungen 753 nm und 763 nm bis zu 12 Tagen beobachtet. Die maximale Abnahme des Tumorwachstums wurde für 763 nm beobachtet.
(iv) 300 J/cm²-Bestrahlung 24 h nach der Injektion: Es wurde eine Abnahme des Tumorwachstums (verglichen mit den Kontrollen) für die Bedingung 753 nm bis zu 4 Tagen und für die Bedingungen 763 nm und 773 nm bis zu 12 Tagen beobachtet. Die maximale Abnahme des Tumorwachstums wurde für 773 nm beobachtet.

Es wurde keine übermäßige Temperaturabweichung während der Halogenlampen- und Titan-Saphir-Bestrahlung der Mäuse beobachtet.
In der Zusammenfassung dieser Studie wurde entdeckt, dass die optimale Strahlungs-Wellenlänge 773 nm betrug. Die Verzögerung zwischen Injektion und Illuminierung wies einen Einfluss auf die Tumorreaktion auf. Es wurde gezeigt, dass bei 764 nm eine einstündige Verzögerung die am meisten wirksame war. Wenn eine Wellenlänge von 773 nm verwendet wurde, betrug die wirksamste Verzögerung 24 Stunden.
Tabelle 4 C3H/BA-Mammakarzinom-Reaktion auf Pd-BPheid
Tabelle 5 RIF-1-Reaktion auf Pd-BPheid
Beispiel 8. Morphologische Bewertung von humanen carcinoiden A431-Euithelzellen nach auf Pd-BPheid und BChl-Ser basierter PDT
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die zeitabhängigen morphologischen Veränderungen zu untersuchen, die nach PDT mit Pd-BPheid oder BChl-SerOMe an humanen carcinoiden A431-Epithelzellen auftraten.

(i) Materialien: Das Pd-BPheid wurde wie in Beispiel 1, vorstehend, hergestellt und der Serinmethylester BChl-SerOMe wurde wie in EP 584552 hergestellt.
(ii) Lichtquelle: Halogenlampe (Osram, Deutschland, 100 W) mit 4,5 cm-Wasserfilter und Ausschluss-Filter > 650 nm. Die Zellen wurden für 10 Minuten mit, 15 mW/cm² und einer Gesamtfluenz von 9 J/cm² bestrahlt. Zur Bestrahlung wurden die Kulturplatten auf einen Glastisch platziert, um das Licht vom Boden her bereitzustellen.
(iii) Phototoxizitätsstudie: A431-Zellen (5 × 10⁴ Zellen) wurden in 3 cm-Schalen in doppelter Ausführung ausgesät und bis zu 75 % Konfluenz in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + F12 (1 : 1), gepuffert mit HEPES (25 mM, pH-Wert 7,4), fötalem Kälberserum (FCS) mit Penicillin (0,06 mg/ml) und Streptomycin (0,1 mg/ml) kultiviert. Pd-BPheid oder BChl-Ser wurde zu den Zellen in der entsprechenden LD₉₀-Konzentration (0,1 beziehungsweise 1 μM) zugegeben. Nach einem 4-stündigen Zeitraum wurden die Zellen mit Kulturmedium gewaschen und die Zellen wurden mit der vorstehenden Lichtquelle bestrahlt. Es wurde eine phasenkontrastmikroskopische Untersuchung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Bestrahlung (0, 0,5, 4 und 24 Stunden nach PDT) unter Verwendung eines Zeiss-Axiovert-35-Lichtmikroskops (Vergrößerung X320), das mit einer Contax-35 mm-SLR-Kamera ausgerüstet war, durchgeführt. In der zweiten Schale jeder Doppelansatzes wurde die Zelllebensfähigkeit 24 Stunden nach PDT unter Verwendung eines Neutralrot-Lebensfähigkeitstests (Zhang SZ. 1990, Cell Biol. Toxicol. 6 (2): 219–234) getestet.
(iv) Ergebnisse: Beide Sensibilisatoren verursachen signifikante Veränderungen in der Zellmorphologie. Pd-BPheid verursachte eine schnelle Veränderung in der Zellmembranstruktur (30 Minuten), die Zellen schrumpften rapide und es wurden fibröse Verbindungen gebildet, welche die Membran der Zellen mit den ursprünglichen Herdanhaftungspunkten (fibröser Phänotypus) verbanden. Nach 4 Stunden verloren 90 % der Zellen ihr inneres Volumen und ein großer Teil von ihnen löste sich von der Schale, es wurde keine weitere Veränderung nach 24 Stunden beobachtet (4, rechte Spalte). Bchl-Ser zeigte ein unterschiedliches Muster zeitabhängiger morphologischer Veränderungen, das erst nach 4 Stunden beobachtet werden konnte. Membranblasenbildung wurde als dunkle Vesikel, die aus der Membran der Zellen austrieben, gesehen. Es wurde über 24 Stunden keine signifikante Volumenabnahme beobachtet und nach diesem Zeitraum waren die meisten der Zellen an der Schale anhaftend, erschienen jedoch hohl (Blasenbildungsphänotyp, 4, linke Spalte). 24 Stunden nach der Bestrahlung wurde ein Neutralrot-Lebensfähigkeitstest durchgeführt, der 90 ± 7 % Abtöten der Zellen in beiden Versuchsgruppen bestätigte. In 4 ist der fibröse Phänotypus in der rechten Spalte dargestellt und der Blasenbildungsphänotyp ist in der linken Spalte dargestellt. Die durchgehend weißen Pfeile zeigen die Anordnungen der Fasern oder der apoptotischen Vesikel.

Beispiel 9. Photozytotoxizität von Pd-BPheid und BChl-SerOMe auf die humane Blasenkarzinomzelllinie ECV304
Dieser Versuch wurde durchgeführt, um die photozytotoxischen Wirkungen der Photosensibilisatoren Pd-BPheid und BChl-SerOMe auf die humanen Blasenkarzinomzellen ECV304 zu testen.

(i) Materialien: wie in Beispiel 8 (i).
(ii) Lichtquelle: wie in Beispiel 8 (ii).
(iii) Phototogizitäts-Studie: ECV304-Zellen (2 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) wurden in M-199, 10 % FCS mit Penicillin (0,06 mg/ml) und Streptomycin (0,1 mg/ml) in Platten mit 96 Vertiefungen bis zur Konfluenz kultiviert (~ 2 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung). Auf die Inkubation mit ansteigenden Konzentrationen von Pd-BPheid oder BChl-SerOMe der Zellen für 4 Stunden folgte Waschen mit frischem Kulturmedium und Bestrahlung, wie vorstehend Sek. 1 beschrieben. 24 Stunden nach der Bestrahlung wurde die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung des Neutralrot-Lebensfähigkeitstests getestet. Die folgenden Kontrollen wurden verwendet. Lichtkontrolle: bestrahlte Zellen, nicht mit Sensibilisator behandelt. Dunkelkontrolle: nicht bestrahlte Zellen, mit Sensibilisator in Dunkelheit behandelt. Unbehandelte Kontrolle: Zellen, nicht mit Sensibilisator behandelt und nicht bestrahlt, wurden zur Berechnung des 100 % Überlebens verwendet (Rosenbach-Belkin, V. et al., 1996, Photochem. Photobiol. 64 (1): 174–181).
(iv) Ergebnisse: Sowohl Pd-BPheid als auch BChl-SerOMe zeigten dosis- und lichtabhängige Zytotoxizität auf ECV304-Zellen (5). Die entsprechenden LD₅₀-Werte sind 19 und 1000 nM. Morphologische Veränderungen nach PDT stimmten mit den mit A431-Zellen gemachten Beobachtungen überein (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 10. PDT von Pd-BPheid und Pd-BPheid-Ethylester auf M2R-Mausmelanomzellen:
Das Ziel dieses Versuchs war, die Wirkung von Pd-BPheid und Pd-BPheid-Ethylester auf M₂R-Zellen zu testen.

(i) Materialien: Pd-BPheid wurde wie in Beispiel 1, vorstehend, hergestellt und der Pd-Bacteriopheophorbid a-Ethylester (Pd-Bpheid-Ethylester) wurde, wie in WO 97/19081 beschrieben, hergestellt.
(ii) Lichtquelle: Wie vorstehend in Beispiel 8 (ii), jedoch wurden die Zellen für 10 Minuten mit 12 mW/cm² und einer Gesamtfluenz von 7 J/cm² bestrahlt.
(iii) Phototoxizitäts-Studie: M₂R-Zellen wurden als Monoschichten in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) + F12 (1 : 1), gepuffert mit HEPES (25 mM, pH-Wert 7,4) kultiviert. Fötales Rinderserum (FBS) (10 %), Glutamin (2 mM), Penicillin (0,06 mg/ml) und Streptomycin (0,1 mg/ml) wurden eingeschlossen und man ließ die Zellen bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre, die 8 % CO₂ enthielt, wachsen. Zur Phototoxizitätsanalyse wurden die Zellen (1 × 10⁴ Zellen pro Vertiefung) in Platten mit 96 Vertiefungen für 24 Stunden bis zu einer Dichte von annähernd 2 × 10⁴ Zellen/Vertiefung kultiviert. Die Pigmente wurden direkt in Kulturmedium oder in Ethanol 95 % gelöst und weiter in Kulturmedium bis zu einer finalen Konzentration von 1 % Ethanol verdünnt. Die verdünnten Pigmente wurden zugegeben und die Zellen wurden in Dunkelheit für vier Stunden bei 37°C inkubiert. Vor der Bestrahlung wurden die Zellen einmal gewaschen und frisches Kulturmedium wurde eingetauscht. Die Platten wurden dann vom Boden her für 10 Minuten bei Raumtemperatur bestrahlt und in den Kulturinkubator bei 37°C in Dunkelheit platziert. Das Überleben der Zellen wurde 24 Stunden später bestimmt. Die folgenden Kontrollsysteme wurden verwendet: Dunkelkontrolle – unbehandelte Zellen in Dunkelheit gehalten; Lichtkontrolle – nicht mit Sensibilisator behandelte Zellen, die bestrahlt wurden; Dunkeltoxizität – mit Pigmenten behandelte Zellen, die jedoch in Dunkelheit gehalten wurden. Das Überleben der Zellen wurde durch Einbau von [³H]-Thymidin, wie früher beschrieben (WO 97/19081), bestimmt.
(iv) Ergebnisse: Wie in 6A gesehen werden kann, wies Pd-BPheid, wenn die Pigmente in Ethanol 95 % gelöst worden waren, eine LD₅₀ von 0,03 μM auf, während der Pd-BPheid-Ethylester eine LD₅₀ von 0,07 μM aufwies. Wenn die Pigmente direkt im Kulturmedium, das 10 % Serum enthielt, gelöst wurden, war nur das Pd-BPheid vollständig wirksam, während der Pd-BPheid-Ethylester bis zu 1 μM, der höchsten getesteten Konzentration, überhaupt nicht wirksam war (6B).

Beispiel 11. PDT mit Pd-BPheid an M2R-Mausmelanom- und humanen HT29-Kolonkarzinomzellen
Diese Versuche wurden auf das Bestimmen der phototoxischen Wirkung von Pd-BPheid gegenüber zwei Zelllinien: M2R-Mausmelanom- und humane HT29-Kolonkarzinomzellen ausgerichtet.

(i) Materialien: Pd-Bpheid wurde wie in Beispiel 1, vorstehend, hergestellt.
(ii) Lichtquelle: Die Lichtquelle war eine Xenon-Fluor-LS3-PDT-Lampe (Bio-Spec, Russland) mit 10 cm-Wasserfilter und 720–850 nm-Lichtband. Die Zellen wurden für 10 min, mit 12 mW/cm² bei einer Gesamtenergie von 7 J/cm² bestrahlt.
(iii) Phototogizitäts-Studie: Die Analyse wurde mit dem gleichen Protokoll, wie vorstehend beschrieben (Beispiel 10), mit den folgenden Veränderungen durchgeführt: Pd-BPheid wurde direkt im Medium, das 10 % Serum enthielt, gelöst und dann zu den Zellen zugegeben. Das Überleben der M2R-Zellen wurde durch Einbau von [³H]-Thymidin bestimmt und das der humanen HT29-Zellen mit dem MTT-Test (Merlin J.L. et al., 1992, Eur. J. Cancer 28A: 1452–1458).
(iv) Ergebnisse: Wie in 7 ersichtlich, zeigen die humanen Kolon-HT29-Zellen geringere Sensibilität gegenüber diesem Pigment (LD₅₀ von 0,5 μM), während die M₂R-Zellen etwa zehnmal empfindlicher waren (LD₅₀ von 0,03 μM).

Beispiel 12. In vivo-PDT von M2R-Mausmelanomtumoren mit Pd-BPheid
Das Ziel dieses Versuchs war, die PDT von M2R-Mausmelanomtumoren in CD1-Nacktmäusen mit 2,5 mg/kg Pd-Bpheid zu studieren.

(i) Materialien: Pd-Bpheid wurde wie in Beispiel 1, vorstehend, hergestellt.
(ii) Mäuse: CD1-Nacktmäuse (25–30 g)
(iii) Anästhesie: i.p.-Injektion von 50 μl Ketamin/Rumpon (Vol./Vol. = 85/15)
(iv) Tumorimplantation: Den Mäusen wurden 10⁶ M2R-Zellen auf den Rücken implantiert und die Tumore entstanden bis zur Behandlungsgröße (7–8 mm) innerhalb von 2–3 Wochen.
(v) Lichtquelle: Photo-optische Osram-150 W-Halogenlampe 64643 (D.K. Keller et al., 1999, Int. J. Hyperthermia 15, 467–474), die mit einem λ = 650–900 nm-Spektralfenster, 300 mW cm^–2, ausgerüstet war. Die Bestrahlung wurde für 30 min durchgeführt.
(vi) PDT-Protokoll: Der anästhesierten Maus wurde das Pigment i.v. injiziert und der Tumor wurde sofort bestrahlt. Am Ende der Behandlung wurde die Maus zurück in den Käfig gebracht. Es wurden Photographien des Tumors vor und zu den angezeigten Zeitpunkten gemacht.

Versuch 1:
Herstellung des Sensibilisators:
Zwei mg Pd-BPheid wurden in 0,25 ml Cremophor EL gelöst, gefolgt von 20 min Ultraschallbehandlung. 0,075 ml 1,2-Propylenglykol wurden zugegeben und die Ultraschallbehandlung wurde für weitere 15 min fortgesetzt. Dann wurden 0,9 ml 0,15 mM NaCl zugegeben, gefolgt von 5 min Ultraschallbehandlung. Die Probe wurde für 12 min bei 13.000 UpM (Eppendorf) zentrifugiert. Die berechnete finale Konzentration von Pd-BPheid bezogen auf das Spektrum in Chloroform betrug 0,5 mg/ml.
PDT des Tumors:
Pd-BPheid, 2,5 mg/kg, wurde i.v. CD1-Nacktmäusen, welche einen M2R-Melanom-Tumor trugen, injiziert. Der Tumor wurde für 30 min bei 300 mW cm^–2 bestrahlt. Die Temperatur des Maus-Hauttumorbereichs betrug 37,7–38°C. Die Reaktion des Tumors wurde 1 und 4 Tage nach der Behandlung verfolgt. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Versuch 2:
Herstellung des Sensibilisators:
Zwei mg Pd-BPheid wurden in 0,1 ml Methanol, 0,1 ml 0,1 M KH₂PO₄, pH-Wert = 8,0 und 0,9 ml PBS gelöst und für 10 min mit Ultraschall behandelt. Das Methanol wurde unter Argon eingedampft und 20 % Cremophor EL : 1,2-Propylenglycol (3 : 1) wurden zugegeben, gefolgt von 15 min Ultraschallbehandlung. Die Probe wurde für 8 min bei 13.000 UpM zentrifugiert, die berechnete finale Konzentration von Pd-BPheid bezogen auf das Spektrum in Chloroform betrug 0,5 mg/ml.
PDT des Tumors:
Pd-BPheid, 2,5 mg/kg (120 μl), wurde i.v. an CD1-Nacktmäuse verabreicht, die einen M2R-Melanom-Tumor trugen. Das Tumorgewebe wurde für 30 min bei 300 mW/cm^–2 bestrahlt. Die Temperatur des Maus-Hauttumorbereichs betrug 37,7–38°C. Die Reaktion des Tumors wurde 1 und 4 Tage nach der Behandlung verfolgt. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Ergebnisse:
Wie in den 8 und 9 gezeigt, löst PDT von M2R-Melanomtumoren mit 2,5 mg/kg Pd-Bpheid, wie vorstehend beschrieben, eine schwere Entzündungsreaktion mit Nekrose des Tumors innerhalb von 24 h aus.
Beispiel 13. Pd-BPheid basierte PDT verringert die Rate der C6-Gliom-Metastasenbildung in Mäusen: Vorteil gegenüber chirurgischem Einriff
Diese Versuche wurden durchgeführt, um das therapeutische Potential einer auf Pd-BPheid und einer auf BChl-SerOMe basierten PDT und die Wahrscheinlichkeit einer Metastasenstreuung durch eine Pd-BPheid und BChl-SerOMe basierte PDT zu vergleichen.

(i) Materialien: Pd-BPheid (hergestellt wie in Beispiel 1) oder Pd-BPheid-SerOMe 5 mg/kg in 20 % Cremophor EL.
(ii) Lichtquelle: Die Lichtquelle war eine Xenon-Fluor-LS3-PDT-Lampe (Bio-Spec, Russland) mit 10 cm-Wasserfilter und 720–850 nm-Lichtband.
(iii) Mäuse: CD1-Nacktmäuse.
(iv) Tumore: Den Mäusen wurden 10⁶ C6-Gliomzellen in den Fuß des Hinterbeins implantiert. Die Tumore wurden behandelt, wenn sie eine Länge von 7–8 mm erreichten.
(v) Anästhesie: 50 μl Vetalar/Rumpon (Vol./Vol. = 85/15).
(vi) Analgesie: Oxycodon (12 mg/Liter), zugegeben in Trinkwasser mit 5 % Saccharose, ab der Behandlung (Amputation oder PDT) für eine Woche.
(vii) Protokoll: Es wurden drei Gruppen (10 Mäuse in jeder) i.v. 5 mg/kg Sensibilisator (Pd-BPheid oder Pd-BPheid-SerOMe) injiziert und die Tiere wurden sofort bei 200 mW/cm² für 30 Minuten bestrahlt und konnten sich im Käfig erholen. Gruppen 1 und 2: Tiere, die PDT Pd-Bpheid beziehungsweise Pd-BPheid-SerOMe erhielten. Tumorreaktion und Metastasenbildung in der Leiste wurden für 4 Wochen verfolgt. Gruppe 3: Tiere, die am Knöchelgelenk amputiert worden waren (paarweise mit Gruppe 1), und Metastasenbildung in der Leiste wurden für 4 Wochen verfolgt. Die Parameter der Reaktion auf PDT waren der prozentuale Anteil von Tieren mit Nekrose und Verschwinden des Tumors aus der Gesamtanzahl der behandelten Tiere. Die Metastasenbildung wurde durch Auftreten von Tumoren in der Leiste oder irgendwo anders manifestiert. Die betrachteten Endpunkte waren: Verfolgen für 4 Wochen, spontaner Tod, Tumore, die einen Durchmesser von 2 cm erreichten, Metastasenbildung, was auch immer zuerst auftrat.
(viii) Ergebnisse: Die Ergebnisse der Tumorabflachung (des Verschwindens) sind in 10 gezeigt. Während am Tag 11 die Reaktion auf Pd-BPheid stärker war als auf Pd-BPheid-SerOMe (100 % beziehungsweise 80 % Tumorabflachung), war später, am Tag 28, der prozentuale Anteil der Reaktion ähnlich, etwa 60 %. Die Verminderung der Tumorabflachung auf lange Sicht beruht auf einem gewissen erneuten Tumorwachstum in einigen der behandelten Tiere, wahrscheinlich aufgrund einer mangelnden Übereinstimmung von Lichtfeld und Tumorbereich. Die Ergebnisse des Auftretens von Metastasen sind in 11 gezeigt. Die chirurgische Behandlung durch Beinamputation ergab einen wesentlich höheren prozentualen Anteil an Metastasen im Vergleich zu PDT (bis zu 78 %). Zudem trat die Metastasenbildung nach der Amputation viel früher auf. Die Häufigkeit der Metastasenbildung nach PDT mit Pd-Bpheid war am geringsten (bis zu 23 %). Dieses Ergebnis ist dem ähnlich, das mit Pd-BPheid-SerOMe erhalten worden ist, und der hauptsächliche Vorteil von Pd-BPheid besteht in der Verzögerung des Auftretens von Metastasen. PDT mit Pd-BPheid oder Pd-BPheid-SerOMe sind für C6-Gliomtumore heilend. Die Metastasenbildung nach PDT ist wesentlich geringer, wenn man sie mit der chirurgischen Behandlung vergleicht.

Claims

Verbindung der Formel I, I' oder I''
wobei A OH, OR₁, -O-(CH₂)_n-Y, -S-(CH₂)_n-Y, NH-(CH₂)_n-Y, -O-(CH₂)₂-OH, NH-(CH₂)₂-NH-BOC oder -N-(CH₂-CH=CH₂)₂ darstellt, wobei R₁ Na⁺, K⁺, (Ca²⁺)_0,5, (Mg²⁺)_0,5, Li⁺, NH⁴⁺ ⁺NH₃-C(CH₂OH)₃, ⁺NH₃-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH, ⁺NH₂(CH₃)-CH₂-(CHOH)₄-CH₂OH oder ⁺N(C_n'H_2n'+1)₄ darstellt; R₂ H, OH oder COOR₄ darstellt, wobei R₄ C₁-C₁₂-Alkyl oder C₂-C₁₂-Cycloalkyl ist; R₃ H, OH oder C₁-C₁₂-Alkyl oder -Alkoxy darstellt; n 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist; Y -NR'₁R'₂ oder -⁺NR'₁R'₂R'₃, X^– ist, wobei R'₁, R'₂ und R'₃ unabhängig voneinander -CH₃ oder -C₂H₅ darstellen; X F, Cl, Br oder I ist, n' 1, 2, 3 oder 4 ist, und wobei * einen asymmetrischen Kohlenstoff kennzeichnet und --- eine gesättigte Einfachbindung oder eine ungesättigte Doppelbindung darstellt.
Verbindung I nach Anspruch 1 der nachstehend angegebenen Formel und optischen Konfiguration
wobei A OH oder OR₁ ist und R₁ wie in Anspruch 1 definiert ist.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei A OH ist, hier bezeichnet als Pd-Bacteriopheophorbid a (Pd-BPheid).
Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, als ein Arzneistoff.
Arzneimittel, umfassend mindestens eine Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zusammen mit einem physiologisch verträglichen Träger.
Arzneimittel nach Anspruch 5, wobei das Arzneimittel in Form einer Lösung, einer Lipidemulsion oder eines Gels oder in Form von Liposomen oder Nanopartikeln vorliegt.
Arzneimittel nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Verbindung(en) in einer Menge von 0,01 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Arzneimittels, vorhanden ist(sind).
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, wobei A OH ist, umfassend die Schritte: a) kombinierte Demetallisierung und Hydrolyse einer M-BPheid-17³-Z-Verbindung, wobei Z Phytyl, Geranylgeranyl oder Serylmethylester (SerOMe) ist und M ein Metall, ausgewählt aus Mg, Cd und Zn, ist; und b) Einbringen von Pd mit einem Pd-Reagens in die in (a) erhaltene Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 8 zur Herstellung von Pd-BPheid, wobei Bacteriochlorophyll a (Bchla) in Schritt (a) demetallisiert und hydrolysiert wird und das erhaltene Bacteriopheophorbid a (BPheid) mit einem Pd-Reagens in Schritt (b) umgesetzt wird, um das erwünschte Pd-BPheid herzustellen.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, wobei A OH ist, umfassend die Schritte: a) Transmetallisierung eines BChlid-17³-Z, um das entsprechende Pd-BPheid-17³-Z zu erhalten, wobei Z Phytyl, Geranylgeranyl oder SerOMe ist; und b) Hydrolyse der in (a) erhaltenen Verbindung.
Verfahren nach Anspruch 10 zur Herstellung von Pd-BPheid, wobei Bacteriochlorophyll a (Bchla) in Schritt (a) transmetallisiert wird, um das natürliche zentrale Mg-Atom durch Pd zu ersetzen, und das erhaltene Pd-BPheid-17³-Z, wobei Z Phytyl ist, in Schritt (b) hydrolysiert wird, um das erwünschte Pd-BPheid herzustellen.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, wobei A OH ist, umfassend die Schritte: a) enzymatische Hydrolyse eines BChlid-17³-Z, wobei Z Phytyl oder Geranylgeranyl ist, um ein BChlid zu erhalten, b) Säuredemetallisierung des BChlid von (a); und c) Einbringen von Pd mit einem Pd-Reagens in die demetallisierte Verbindung von (b).
Verfahren nach Anspruch 12 zur Herstellung von Pd-BPheid, wobei Bacteriochlorophyll a (Bchla) in Schritt (a) enzymatisch hydrolysiert wird, in Schritt (b) demetallisiert wird und in Schritt (c) mit einem Pd-Reagens umgesetzt wird, um das gewünschte Pd-BPheid herzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 13, ferner umfassend den Schritt des Umsetzens der erhaltenen Pd-BPheid-Verbindung mit einer entsprechenden A-H-Verbindung, um eine Verbindung der Formel I zu erhalten, wobei A von OH verschieden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, wobei das Pd-Reagens Pd-Acetat oder Pd-Chlorid ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Einbringen von Pd in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von Na-Ascorbat oder Ascorbinsäure, oder in einem einstufigen Verfahren unter Verwendung von 6-O-Palmitoyl-L-ascorbinsäure durchgeführt wird.
Verwendung einer Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur Herstellung von Arzneimitteln, welche für die Verwendung in der photodynamischen Therapie (PDT) von Tumoren geeignet sind.
Verwendung einer Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, zur Herstellung von Zusammensetzungen, welche für die Verwendung in der ex-vivo-Bekämpfung von Bakterien, Viren, Parasiten und Pilzen geeignet sind.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18 von Pd-BPheid.
Verwendung einer Verbindung der Formel I, I' oder I'', wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, für die Herstellung von Arzneimitteln zur Verwendung in der Tumordiagnose.
Verwendung nach Anspruch 20 einer Verbindung der Formel I.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Verbindung der Formel I Pd-Bacteriopheophorbid a ist.
Verbindung der Formel II oder III
als ein Zwischenprodukt.