DE69933471T2

DE69933471T2 - Unblutige bestimmung einer physiologischen reaktion in einem säugetier

Info

Publication number: DE69933471T2
Application number: DE69933471T
Authority: DE
Inventors: R. Pamela Alameda CONTAG; Ning Alameda ZHANG
Original assignee: Xenogen Corp
Current assignee: Xenogen Corp
Priority date: 1998-12-17
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: US7449615B2; ATE341637T1; EP1141359A2; WO2000036106A3; WO2000036106A2; WO2000036106A9; US20020138855A1; EP1141359B1; CA2355900A1; DE69933471D1; AU2366700A; AU774183B2

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft diagnostische Säugetiermodelle, Testtiere, Verfahren zum Erschaffen solcher Tiere und Verfahren zur Verwendung dieser zur Identifikation und Charakterisierung von Verbindungen.
Hintergrund der Erfindung
Toxikologiestudien von Substanzen beruhten normalerweise auf Einzellern (z.B. der Ames-Test oder der karzinogene Hefe-Test, der im US-Patent Nr. 4.997.757 beschrieben ist) oder In-vitro-Systemen zum Testen der Toxizität sowie zur Vorhersage des menschlichen Risikos. Es gibt jedoch viele Faktoren, die es schwierig machen, von solchen Daten auf das menschliche Risiko zu extrapolieren, unter anderem zelluläre Affinität der Substanz, Aufnahme- und Verteilungsunterschiede zwischen einzelnen Zellen und ganzen Tieren, der Metabolismus der Substanz und die Kaskadenwirkungen, bei denen die Wirkung der Substanz durch einen zellulären (Prozess vermittelt wird. Dieselben Faktoren können den Fortschritt der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung beeinflussen genauso wie Versuche der Entwicklung und/oder Vorhersage der Wirkungen einer Verbindung in einem Tiersystem.
Weiters ist der Endpunkt traditioneller, tierbasierter Toxikologiestudien typischerweise die Bestimmung einer LD50 (Dosis, bei der 50 % der Testtiere sterben). Tote Tiere können weiteren Analysen unterzogen werden, z.B. Histopathologie, solche Analysen sind jedoch im Allgemeinen arbeitsintensiv und relativ unempfindlich.
MacGregor et al. (Fundamental and Applied Toxicology 26, 156-173 (1995)) beschrieben molekulare Endpunkte und Routine-Toxizitätstestverfahren, die folgende umfassen: durch Schaden induzierbare Gene in einzelnen Zellen; bakterielle Modelle der Toxizität; Screening der Stress-Gen-Expression unter Verwendung von Hybridisierung oder der Polymerasekettenreaktion; Hybridisierungssonden zur Detektion chromosomaler Abweichungen; Einzelzellen-Elektrophoresetests; und In-vivo- Tierstudien, die das Töten von Tieren und die darauf folgende Analyse von Gewebe-/Zellschäden umfassen.
Allgemeine Strategien zur Erschaffung transgener (Tg-)Tiere wurden bereits häufig beschrieben (C.A. Pinkert (Hrsg.), Transgenic animal technology: A laboratory handbook, Academic Press, Inc., San Diego, Kalifornien (1994); G.M. Monastersky und J.M. Robl (Hrsg.), Strategies in transgenic animal science, ASM Press, Washington D.C. (1995)), die zeitintensiven Verfahren des Screenings auf die Gegenwart und die Funktion des Transgens blieben jedoch geschwindigkeitslimitierende Schritte. Diese Screenings umfassen typischerweise herkömmliche Tests, PCR, Southern-Blot-Hybridisierung oder Slot-Blot-Hybridisierung (B.T. Tinkle et al., in C.A. Pinkert (Hrsg.), Transgenic aminal technology: A laboratory handbook, 221-34, Academic Press. Inc., San Diego, Kalifornien (1994)), um die Gegenwart integrierter DNA zu zeigen. Um zu bestimmen, ob die Genprodukte exprimierte Gleichgewichtsmengen der mRNA sind, können Transkripte durch die Northern-Blot-Hybridisierung, RT-PCR oder In-situ-Hybridisierung getestet werden, und die Proteinexpression kann unter Verwendung von Western-Blots oder Immunfluoreszenzfärbung getestet werden. Schließlich wird eine große Bandbreite an Tests benötigt, um die Funktion als einen Indikator für den geeigneten Phänotypen zu bestimmen. Gewebe aus dem Tg-Tier ist erforderlich, um diese molekularen und funktionellen Analysen durchzuführen (C.J. Bieberich et al., Transgenic aminal technology: A laboratory handbook, 235-62, C.A. Pinkert (Hrsg.), Academic Press. Inc., San Diego, Kalifornien (1994)), und eine Entfernung von Gewebe kann unmöglich sein, bis eine Linie etabliert wird. Es wird daher ein schnelles, nicht invasives Screeningverfahren als funktioneller Test für die Erschaffung und Studien an Tg-Tieren benötigt.
Eine große Bandbreite von Tg-Mäusen, die Reporterkonstrukte in sich tragen, wurde entwickelt und getestet. Es wurden z.B. Tg-Mäuse, die virale lange terminate Wiederholungs-(LTR-)Promotorfusionen enthalten, verwendet, um die Bandbreite an Geweben und Zelltypen zu studieren, die in der Lage sind, die HTLV-1-Expression und die Entwicklung von neurofibromatoseartigen Tumoren zu unterstützen, die mit dem HTLV-1-Retrovirus assoziiert sind (C.J. Bieberich et al., Virol. 196, 309-18 (1993)). Die LTR von HIV-1 wurde an Luciferase fusioniert, um die transkriptionelle Regulation mittels UV-Licht und verschiedenen sensibilisierenden Agenzien zu evaluieren (J.D. Morrey et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 5, 1195-203 (1992); J.D. Morrey et al., J. Viol. 65, 5045-51 (1991)). Kardiovaskuläre Biologie und Erkrankungen wurden unter Verwendung von gewebsspezifischen Promotoren in Tg-Mausmodellen untersucht (J. Johnson et al., Mol. Cell. Biol. 9, 3393-9 (1989); H. Rindt et al., J. Biol. Chem. 268, 5332-8 (1993); C.E. Seidman et al., Can. J. Physiol. Pharmacol. 69, 1486-92 (1991); R.W. Tsika et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 379-83 (1990)), und die Regulierung der auf Insulin antwortenden Glucose-Transporter GLUT4 und Apo-A-I-Gene wurde ebenso in Modellen an Diabetes, Obesitas (M.L. Liu et al., J. Biol. Chem. 267, 11673-6 (1992)) und Koronararterienerkrankungen studiert (A. Walsh et al., J. Lipid Res. 34, 617-23 (1993); A. Walsh et al., J. Biol. Chem. 264, 6488-94 (1989)).
Photoproteine wurden für mehr als ein Jahrzehnt als biologische Markierungen zum Studium von Genexpression in Zellkulturen oder unter Verwendung entfernter Gewebe verwendet (A.K. Campbell, Chemiluminescence, Principles and applications in biology and medicine, Ellis Horwood Ltd und VCH Verlagsgesellschaft mbH, Chichester, England (1988); J. W. Hastings, Gene 173, 5-11 (1996); J.D. Morrey et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 5, 1195-203 (1992); J.D. Morrey, J. Viol. 65, 5045-51 (1991)). Schwachlichtbilddarstellung interner Biolumineszenzsignale wurde verwendet, um temporale und räumliche Genregulation in relativ dünnen oder beinahe transparenten Organismen zu studieren (A.J. Millar et al., Plant Cell 4, 1075-87 (1992); R. Stanewsky et al., EMBO J. 16, 5006-18 (1997); C. Brandes et al., Neuron 16, 687-92 (1996)). Es wurde die externe Detektion von internem Licht, das undurchsichtige Tiergewebe durchdringt, beschrieben (P.R. Contag et al., Nature Med. 4, 245-7 (1998); C.H. Contag et al., Photochem. Photobiol. 66, 523-31 (1997); C.H. Contag et al., Mol. Microbiol. 18, 593-603 (1995)).
Dafür wurde bis jetzt jedoch kein In-vivo-Screeningverfahren beschrieben, das ein Screening der Verbindungen in ganzen, lebenden Tieren ermöglicht, wodurch Echt zeitdaten über die Wirkungen einer Testsubstanz, z.B. spezifische Aspekte der Toxizität und des Metabolismus der Substanz, gesammelt werden konnten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Expressionskassetten, Gruppen von Expressionskassetten, transgene nichtmenschliche Tiere, die besagte Expressionskassetten in sich tragen, diagnostische transgene nichtmenschliche Tiermodelle, Testtiere, Verfahren zur Erschaffung solcher Tiere und Verfahren der Verwendung solcher Tiere zur Identifikation und Charakterisierung von Verbindungen.
Hierin wird eine Gruppe von Expressionskassetten offenbart, die Folgendes umfasst:
eine erste Expressionskassette, die ein ausgewähltes erstes Kontrollelement umfasst, das operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein erstes lichterzeugendes Polypeptid kodieren, und
eine zweite Expressionskassette, die ein ausgewähltes zweites Kontrollelement umfasst, das operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein zweites lichterzeugendes Polypeptid kodieren.
Die Kontrollelemente stammen vorzugsweise aus verschiedenen Genen, sie können ebenso aus demselben oder ähnlichen Genen stammen und operabel an dasselbe oder verschiedene lichterzeugende Polypeptid(en) gebunden sein. Dasselbe Kontrollelement kann z.B. operabel an das lichterzeugende Polypeptid gebunden sein, das für Sequenzen kodiert, die von einem luc-Gen und einem lux-Gen abstammen.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine transgene Maus dar, die eine Gruppe von Expressionskassetten umfasst, wobei diese Gruppe eine erste Expressionskassette umfasst, die ein erstes Kontrollelement umfasst, das von einem ersten stressinduzierbaren Gen abstammt, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA-Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionsele menten, JNK, p38, HO, GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe, enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein erstes lichterzeugendes Polypeptid kodieren, sowie eine zweite Expressionskassette, die ein zweites Kontrollelement umfasst, das von einem zweiten stressinduzierbaren Gen abstammt, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA-Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionselementen, JNK, p38, HO, GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe, enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das zweite Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein zweites lichterzeugendes Polypeptid kodieren, und dieses zweite Kontrollelement von einem anderen stressinduzierbaren Gen abstammt als das erste Kontrollelement, worin die Expressionskassetten im Embryonalstadium in die transgene Maus oder einen Vorfahren der transgenen Maus eingeführt worden ist.
Die Gruppe der transgenen Maus der vorliegenden Erfindung umfasst weiters eine dritte Expressionskassette, die ein Kontrollelement umfasst, das von einem dritten stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA- Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionselementen, JNK, p38, HO, GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe, enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das dritte Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein drittes lichterzeugendes Polypeptid kodieren, und dieses dritte Kontrollelement von einem anderen stressinduzierbaren Gen abstammt als das erste und das zweite Kontrollelement.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung produzieren die ersten, zweiten und dritten lichterzeugenden Polypeptide dieselbe Lichtfarbe. In einer alternativen Ausführungsform produzieren zumindest zwei der ersten, zweiten und dritten lichterzeugenden Polypeptide verschiedene Lichtfarben.
Gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung kann die Gruppe weiters zusätzliche Expressionskassetten umfassen, worin jede Expressionskassette ein Kontrollelement umfasst, das von einem unterschiedlichen stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, worin das Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein lichterzeugendes Polypeptid kodieren.
Die hierin offenbarten Gruppen umfassen drei, vier, fünf oder mehr solcher Expressionskassetten, typischerweise nicht mehr als 10 und meist nicht mehr als 15-50. Die lichterzeugenden Polypeptide in diesen Expressionskassetten können alle dieselben sein oder sie können unterschiedlich sein. Die lichterzeugenden Polypeptide können z.B. von kodierenden Sequenzen für lux, luc oder fluoreszierende Proteine (z.B. grünfluoreszierendes Protein) abstammen.
Die in der vorliegenden Beschreibung offenbarten ausgewählten Kontrollelemente können aus Gengruppen ausgewählt sein, umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: stressinduzierbare Gene; apoptoseassoziierte Gene; angiogeneseassoziierte Gene; entzündungsassoziierte Gene; Gene, deren Expression als Reaktion auf ein infektiöses Agens in einem Wirt induziert wird; Gene aus einzelnen, verzweigten oder verwandten biochemischen Stoffwechselwegen; onkogeneseassoziierte Gene und entwicklungsassoziierte Gene.
Die hierin offenbarten Expressionskassetten können zu Sets zusammengestellt werden, z.B. zum kommerziellen Verkauf und/oder Verwendung. Diese Sets können die Expressionskassetten in geeigneten Vektoren) zur Verwendung in der Erschaffung transgener, nichtmenschlicher Tiere umfassen.
Ebenso hierin offenbart ist ein transgenes, nichtmenschliches Tier, das eine beliebige Gruppe an hierin beschriebenen Expressionskassetten umfasst, worin die Expressionskassetten im Embryonalstadium in das Tier oder einen Vorfahren des Tiers eingeführt wurden.
Die Beschreibung offenbart ebenso die Bereitstellung der hierin offenbarten transgenen Tiere etwa zur Verwendung in Evaluationsverfahren der Wirkungen der Verbindungen in lebenden Tieren. Diese Wirkungen können die Bestimmung toxikologischer und pharmakologischer Daten umfassen.
Ebenso hierin offenbart ist eine Kohorte transgener, nichtmenschlicher Tiere, die eine beliebige Gruppe an hierin beschriebenen Expressionskassetten umfasst, worin (i) jedes transgene Tier der Kohorte zumindest eine Expressionskassette der Gruppe enthält und (ii) die transgenen Tiere, die die Kohorte umfassen, relativ zueinander im Wesentlichen isogen sind. Verfahren zur Erschaffung von im Wesentlichen isogenen Kohorten an Tieren werden hierin beschrieben (z.B. 1).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Verfahren zur Bestimmung der Wirkung eines Analyten auf die Genexpression, die durch von stressindu zierbaren Genen abstammende Kontrollelemente vermittelt wurde, worin die Expression in einer transgenen Maus erfolgt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Verabreichen des Analyten an eine lebende transgene Maus gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Verabreichung des Analyten unter Bedingungen erfolgt, die eine Lichterzeugung ermöglichen, die durch das lichterzeugende Polypeptid vermittelt wird, (b) das Platzieren der transgenen Maus innerhalb des Detektionsfelds einer Photodetektorvorrichtung, (c) das Belassen der transgenen Maus im Detektionsfeld der Vorrichtung und (d) während dieses Belassens das Messen der Photonenemission aus der transgenen Maus mit der Photodetektorvorrichtung, um das Expressionslevel des lichterzeugenden Polypeptids in der lebenden transgenen Maus nachzuweisen, worin die Expression von zumindest einem der Kontrollelemente vermittelt wird. Die Expression des lichterzeugenden Proteins unter der Steuerung eines ausgewählten Kontrollelements reflektiert die Wirkung der Verbindung bei der Expression von etwa einem nativen Gen des Tieres, in dem das Gen dasselbe Kontrollelement aufweist. Das Verfahren kann weiters Bedingungen umfassen, die eine durch das lichterzeugende Polypeptid vermittelte Lichterzeugung ermöglichen, umfassend die Verabreichung von zumindest einem Substrat für das lichterzeugende Polypeptid (z.B. Luciferin) an die transgene Maus. Ebenso wird ein Verfahren offenbart, worin eine Kohorte an Tieren für das Screening des Analyten verwendet wird, worin die Verabreichung des Analyten an jedes die Kohorte umfassende transgene Tier erfolgt.
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung ein nichtinvasives Verfahren zum Nachweisen eines Expressionslevels als Reaktion auf einen Analyten, worin die Expression (i) durch Kontrollelemente vermittelt ist, die von stressinduzierbaren Genen abgeleitet werden, und (ii) in einer lebenden transgenen Maus erfolgt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) Verabreichung des Analyten an eine lebende transgene Maus gemäß der vorliegenden Erfindung, worin die Verabreichung des Analyten unter Bedingungen durchgeführt wird, die eine Lichterzeugung ermöglichen, die durch das lichterzeugende Polypeptid vermittelt wird, (b) das Platzieren der transgenen Maus innerhalb des Detektionsfelds einer Photodetektorvorrichtung, (c) das Belassen der transgenen Maus im Detektionsfeld der Vorrichtung und (d) wäh rend dieses Belassens das Messen der Photonenemission aus der transgenen Maus mit der Photodetektorvorrichtung, um das Expressionslevel des lichterzeugenden Polypeptids in der lebenden transgenen Maus nachzuweisen, worin die Expression von zumindest einem der Kontrollelemente vermittelt wird. Das Verfahren kann weiters in ausgewählten Intervallen das Wiederholen der Schritte (b) bis (d) umfassen, worin das Wiederholen wirksam ist, um Veränderungen im Level der Lichtemission in der transgenen Maus über eine gewisse Zeitspanne nachzuweisen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren der Bereitstellung einer transgenen Maus, die für das Screening eines ausgewählten Analyten geeignet ist, umfassend die Erschaffung einer transgenen Maus gemäß der vorliegenden Erfindung und die Bereitstellung der transgenen Maus oder ihrer Nachkommenschaft zur Verwendung beim Screening eines ausgewählten Analyten. Die hierin beschriebenen transgenen Tiere sind für das Studium der In-vivo-Regulation der ausgewählten Gene zweckdienlich. Ebenso hierin beschrieben werden Verfahren zur Erschaffung von Populationen von im Wesentlichen isogenen transgenen Tieren sowie von Vektoren, die in diesen Verfahren nützlich sind.
Diese Beschreibung bezieht sich auf ein transgenes, nichtmenschliches Säugetier, z.B. ein Nagetier, wie etwa eine Maus. Das Säugetier umfasst zumindest ein nicht essentielles Einzelkopie-Gen im Genom, worin (i) zumindest ein Teil von zumindest einem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen durch zum Gen heterologe Polynucleotidsequenzen ersetzt wird, und (ii) die Polynucleotidsequenzen eine erste Expressionskassette umfassen, die im Embryonalstadium in das Säugetier oder einen Vorfahren des Säugetiers eingeführt wurde. Die erste Expressionskassette umfasst einen ersten selektierbaren Marker, ein zum Gen heterologes erstes Transkriptions-Promotorelement und für lichterzeugende Proteine kodierende Sequenzen. Die für lichterzeugende Proteine kodierenden Sequenzen sind operabel an das Promotorelement gebunden.
Das nicht essentielle Einzelkopie-Gen kann aus der aus Vitronectin, fosB und Galactin 3 bestehenden Gruppe ausgewählt sein, und der erste selektierbare Marker kann aus der aus Neomycin-Phosphotransferase II, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase und Adeninphosphoribosyltransferase bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Ebenso hierin offenbart sind alternative Ausführungsformen, in denen das erste Transkriptions-Promotorelement ein induzierbarer Promotor, ein reprimierbarer Promotor oder ein konstitutiver Promotor ist und aus der aus VEGF, VEGFR und TIE2 bestehenden Gruppe ausgewählt sein kann.
In zusätzlichen, hierin offenbarten Ausführungsformen umfasst das oben beschriebene transgene, nichtmenschliche Säugetier ein zweites nicht essentielles Einzelkopie-Gen im Genom, worin (i) zumindest ein Teil des zweiten nicht essentiellen Einzelkopie-Gens durch zu dem zweiten Gen heterologe Polynucleotidsequenzen ersetzt ist und (ii) die Polynucleotidsequenzen eine zweite Expressionskassette umfassen, die im Embryonalstadium in das Säugetier oder einen Vorfahren des Säugetiers eingeführt wurde. Die zweite Expressionskassette umfasst einen zweiten selektierbaren Marker, ein zweites zu dem zweiten Gen heterologes Transkriptions-Promotorelement und für lichterzeugende Proteine kodierende Sequenzen. Die für lichterzeugende Proteine kodierenden Sequenzen sind operabel an das Promotorelement gebunden. Solche Tiere, die mehrfache Expressionskassetten enthalten, können direkt durch die hierin beschriebenen Verfahren generiert werden (d.h. direkte Integration der Reporterexpressionskassetten an ausgewählter/ausgewählten Stelle(n)) oder durch Zucht transgener Tiere der vorliegenden Erfindung, wobei die Zuchtpartner jeweils verschiedene Reporterexpressionskassetten enthalten. Werden transgene Tiere durch Zuchtpartner erschaffen, wird die die gewünschten Kombinationen der Reporterexpressionskassetten umfassende Nachkommenschaft durch Verfahren identifiziert, die nach dem Stand der Technik bekannt sind (z.B. Identifikation der selektierbaren Marker, Northern-Analyse, genomische DNA-Analyse etc.).
Die ersten und zweiten Transkriptions-Promotorelemente und selektierbaren Marker können dieselben oder verschiedene sein, und das lichterzeugende Protein in der ersten Expressionskassette kann in Bezug auf das lichterzeugende Protein in der zweiten Expressionskassette eine unterschiedliche Lichtfarbe produzieren.
Diese Beschreibung offenbart ein Verfahren zur Erschaffung eines transgenen, nichtmenschlichen Säugetiers, wie etwa einer Maus. Das Säugetier besitzt zumindest ein nicht essentielles Einzelkopie-Gen im Genom. Das Verfahren umfasst das Transfizieren einer embryonalen Stammzelle des Säugetiers mit einem linearen Vektor, umfassend

(a) einen ersten selektierbaren Marker und eine Reporterexpressionskassette, wobei die Reporterexpressionskassette ein Transkriptions-Promotorelement umfasst, das operabel an eine für ein lichterzeugendes Protein kodierende Sequenz gebunden ist, und
(b) das Abzielen auf zu einem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen homologe Polynucleotidsequenzen im Genom des Säugetiers, wobei die abzielenden Polynucleotidsequenzen (a) flankieren, worin (i) die Länge der Polynucleotidsequenzen ausreichend ist, um die homologe Rekombination zwischen dem Vektor und dem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen zu erleichtern, und (ii) das Transkriptions-Promotorelement zu dem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen heterolog ist;

Ebenso sind hierin bestimmte Ausführungsformen offenbart, in denen die Nachkommenschaft zur Keimbahn-Transmission der Reporterexpressionskassette in der Lage ist, und das Verfahren kann weiters das Züchten der Nachkommenschaft mit einem Säugetier umfassen, das im Wesentlichen isogen mit den embryonalen Stammzellen ist, sodass die Zucht zu transgenen F1-Nachkommen führt, die die Reporterkassette in sich tragen. In speziellen Ausführungsformen umfasst das Verfahren die Zucht des ersten F1-Nachkommens, der die Reporterkassette in sich trägt, mit einem zweiten F1-Nachkommen, der die Reporterkassette in sich trägt, worin die Zucht zu transgenen F2-Nachkommen führt, die die Reporterkassette in sich tragen.
In zusätzlichen Ausführungsformen können die embryonalen Stammzellen von einer Maus mit dunkler Fellfarbe abstammen, das mit den embryonalen Stammzellen im Wesentlichen isogene Tier kann eine helle Fellfarbe aufweisen, und/oder die die Reporterkassette in sich tragende F2-Nachkommenschaft kann eine helle Fellfarbe aufweisen. In besonderen Ausführungsformen stammen die embryonalen Stammzellen von einer C57BL/6-Maus mit einer dunklen Fellfarbe, und das mit den embryonalen Stammzellen im Wesentlichen isogene Säugetier ist eine C57BL/6-Tyr-C2j/+-Maus mit einer hellen Fellfarbe.
Unterschiedliche transgene F2-Nachkommen, die durch dieses Verfahren erschaffen wurden, können miteinander gezüchtet werden, um weitere transgene, nichtmenschliche Tiere zu erhalten, die mehrere Expressionskassetten in sich tragen (wobei verschiedene Expressionskassetten von verschiedenen F2-Nachkommen in sich getragen werden).
Die Offenbarung dieser Beschreibung betrifft auch einen Vektor zur Verwendung bei der Erschaffung eines transgenen, nichtmenschlichen Säugetiers, z.B. eines Nagetiers, wie etwa eine Maus. Das Säugetier besitzt zumindest ein nicht essentielles Einzelkopie-Gen im Genom. Der Vektor umfasst

(a) einen ersten selektierbaren Marker und eine Reporterexpressionskassette, wobei die Reporterexpressionskassette ein Transkriptions-Promotorelement umfasst, das operabel an eine für ein lichterzeugendes Protein kodierende Sequenz gebunden ist, und
(b) das Abzielen auf zu einem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen im Genom des Säugetiers homologe Polynucleotidsequenzen, wobei die abzielenden Polynucleotidsequenzen (a) flankieren, worin (i) die Länge der abzielenden Polynucleotidsequenzen ausreichend ist, um die homologe Rekombination zwischen dem Vektor und dem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen zu erleichtern, und (ii) das Transkriptions-Promotorelement zu dem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen heterolog ist.

In gewissen Ausführungsformen stellt der erste selektierbare Marker eine positive Auswahl bereit und kann aus der aus Neomycin-Phosphotransferase II, Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase, Hygromycin-B-Phosphotransferase, Chloramphenicol-Acetyltransferase und Adeninphosphoribosyltransferase bestehenden Gruppe ausgewählt sein. Zusätzlich dazu kann das Transkriptions-Promotorelement ein induzierbarer Promotor, ein reprimierbarer Promotor oder ein konstitutiver Promotor sein und kann aus der aus VEGF, VEGFR und TIE2 bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
In alternativen Ausführungsformen umfasst der Vektor weiters einen zweiten selektierbaren Marker, und zumindest eine Target-Polynucleotidsequenz befindet sich zwischen dem zweiten selektierbaren Marker und dem ersten selektierbaren Marker. Zusätzlich kann der zweite selektierbare Marker eine negative Auswahl bereitstellen und kann aus der aus Adenosindeaminase, Thymidinkinase und Dihydrofolatreduktase bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Die oben beschriebenen Vektoren können kreisförmig sein und können zumindest eine Restriktionsstelle enthalten, deren Spaltung zu einem linearen Vektor führt, der die folgende Elementanordnung aufweist: Target-Polynucleotidsequenz – (a) – abzielende Polynucleotidsequenzen oder Target-Polynucleotidsequenz – (a) – abzielende Polynucleotidsequenzen B (zweiter selektierbarer Marker).
Die kodierenden Sequenzen der im Vektor vorhandenen Reporterexpressionskassette können Codons umfassen, die für die Expression in einem Wirtssystem optimal sind, in das die Expressionskassette eingeführt werden soll. Zusätzlich können die abzielenden Polynucleotidsequenzen aus nicht essentiellen Einzelkopie-Genen aus der aus Vitronectin, fosB und Galactin 3 bestehenden Gruppe ausgewählt sein.
Das lichterzeugende Protein in den Säugetieren und die oben beschriebenen Verfahren können entweder von prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen abstammen, und in besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das lichterzeugende Protein eine Luciferase.
Diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden für den Fachmann hinsichtlich der hierin enthaltenen Lehren klar erkenntlich sein.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Erschaffung gezielter transgener Mäuse unter Verwendung der hierin beschriebenen Targeting-Vektoren sowie Kreuzungen, die unter Verwendung dieser transgenen Tiere und ihrer Nachkommen entstehen (F1, erste Generation; F2, zweite Generation).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Durchführung der vorliegenden Erfindung umfasst, falls nicht anders angegeben, herkömmliche, nach dem Stand der Technik bekannte Verfahren der Chemie, Biochemie, Molekularbiologie, Immunologie und Pharmakologie. Solche Verfahren werden in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage (Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1990)); Handbook of Experimental Immunology, Band I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell (Hrsg.), Blackwell Scientific Publications (1986)); F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Media PA; und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage) (1989); die Serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach (M.J. McPherson, B.D. Hames und G.R. Tayler (Hrsg.) (1995)) und Animal Cell Culture (R.I. Freshney (Hrsg.) (1987)).
Wie in dieser Beschreibung und in den im Anhang befindlichen Ansprüchen verwendet, umfassen die Singular-Formen „ein", „eine" und „der/die/das" den Verweis auf die Pluralform, es sei denn, der Inhalt gibt klar und deutlich etwas anderes an. So kann z.B. ein Verweis auf „eine Verbindung" ein Gemisch aus zwei oder mehreren solcher Agenzien umfassen.
1.0.0 Definitionen
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe verwendet und sind wie unten stehend angegeben zu definieren. Falls nicht anders angegeben, haben alle hierin verwendeten Begriffe dieselbe Bedeutung, die sie für einen Fachmann auf dem Gebiet der vorliegenden Erfindung hätten.
Die Begriffe „Nucleinsäuremolekül" und „Polynucleotid" werden als Synonym verwendet und beziehen sich auf eine polymere Form von Nucleotiden jeder Länge, entweder Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide oder Analoga davon. Polynucleotide können eine beliebige dreidimensionale Struktur haben und können eine beliebige, bekannte oder unbekannte, Funktion erfüllen. Nicht einschränkende Beispiele an Polynucleotiden umfassen ein Gen, ein Genfragment, Exons, Introns, Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA, ribosomale RNA, Ribozyme, cDNA, rekombinante Polynucleotide, verzweigte Polynucleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNA einer beliebigen Sequenz, isolierte RNA einer beliebigen Sequenz, Nucleinsäuresonden und Primer.
Ein Polynucleotid besteht typischerweise aus einer spezifischen Sequenz von vier Nucleotidbasen: Adenin (A); Cytosin (C); Guanin (G); und Thymin (T) (Uracil (U) für Thymin (T), wenn das Polynucleotid RNA ist). Der Begriff Polynucleotidsequenz ist daher die alphabetische Darstellung eines Polynucleotidmoleküls. Diese alphabeti sche Darstellung kann in Datenbanken in einem Computer mit einer CPU eingegeben werden und für bioinformatische Anwendungen, wie z.B. funktionelle Genomforschung und Homologiesuche, verwendet werden.
Eine „kodierende Sequenz" oder eine Sequenz, die „für" ein ausgewähltes Polypeptid „kodiert", ist ein Nucleinsäuremolekül, das in ein Polypeptid transkribiert (im Fall von DNA) und translatiert (im Fall von mRNA) wird, z.B. in vivo, wenn es sich unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen befindet (oder „Kontrollelementen"). Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden typischerweise durch ein Startcodon am 5'-(Amino-)Terminus und ein Translationsstopcodon am 3'-(Carboxy-) Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt, Folgendes umfassen: cDNA aus viraler, prokaryotischer oder eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus viraler oder prokaryotischer DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen. Eine Transkriptionsterminationssequenz kann 3' von der kodierenden Sequenz zu finden sein. Andere „Kontrollelemente" können ebenso mit einer kodierenden Sequenz assoziiert werden. Eine für ein Polypeptid kodierende DNA-Sequenz kann für die Expression in einer ausgewählten Zelle unter Verwendung der von der ausgewählten Zelle bevorzugten Codons optimiert werden, um die DNA-Kopie der kodierenden Sequenz des gewünschten Polypeptids darzustellen. „Kodiert von" bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, die für eine Polypeptidsequenz kodiert, worin die Polypeptidsequenz oder ein Teil davon eine Aminosäuresequenz von zumindest 3 bis 5 Aminosäuren, noch bevorzugter zumindest 8 bis 10 Aminosäuren und noch bevorzugter zumindest 15 bis 20 Aminosäuren, aus einem Polypeptid enthält, für das die Nucleinsäuresequenz kodiert. Ebenso sind Polypeptidsequenzen umfasst, die immunologisch mit einem Polypeptid, das von der Sequenz kodiert wird, identifizierbar sind.
Typische „Kontrollelemente" oder „Expressions-Kontrollelemente" oder „Regulationssequenzen" umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Transkriptionspromotoren, Transkriptions-Enhancerelemente, Transkriptionsterminationssignale, Polyadenylierungssequenzen (befinden sich 3' vom Translationsstopcodon), Sequenzen für die Optimierung der Initiation der Translation (befinden sich 5' von der kodierenden Sequenz), Translations-Enhancersequenzen und Translationsterminationssequenzen. Transkriptionspromotoren können induzierbare Promotoren (worin die Expression einer operabel an den Promotor gebundenen Polynucleotidsequenz durch einen Analyten, Cofaktor, ein Regulationsprotein etc. induziert wird), reprimierbare Promotoren (worin die Expression einer operabel an den Promotor gebundenen Polynucleotidsequenz durch einen Analyten, Cofaktor, ein Regulationsprotein etc. induziert wird) und konstitutive Promotoren umfassen.
„Expressions-Enhancersequenzen" beziehen sich typischerweise auf Kontrollelemente, die die Transkription oder Translation eines Polynucleotids relativ zum Expressionsniveau in Abwesenheit solcher Kontrollelemente verbessern (z.B. Promotoren, Promotorenhancer, Enhancerelemente und Translationsenhancer (z.B. Shine- und Dalgarno-Sequenzen)).
„Gereinigtes Polynucleotid" bezieht sich auf ein Polynucleotid von Interesse oder ein Fragment davon, das im Wesentlichen frei ist, z.B. weniger als etwa 50 %, vorzugsweise weniger als etwa 70 % und noch bevorzugter weniger als etwa 90 %, des Proteins enthält, mit dem das Polypeptid natürlich assoziiert wird. Verfahren zur Reinigung von Polynucleotiden von Interesse sind nach dem Stand der Technik wohlbekannt und umfassen etwa die Zerstörung der Zelle, die das Polynucleotid enthält, mit einem chaotropen Agens und die Trennung des Polynucleotids/der Polynucleotide und Proteine mittels Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie und Sedimentierung gemäß der Dichte.
Eine „heterologe Sequenz" wie sie hierin verwendet wird bezieht sich typischerweise entweder auf (i) eine Nucleinsäuresequenz, die normalerweise nicht in der Zelle oder dem Organismus von Interesse zu finden ist, oder auf (ii) eine Nucleinsäuresequenz, die an einer genomischen Stelle eingeführt wird, worin die Nucleinsäuresequenz normalerweise in der Natur nicht an dieser Stelle zu finden ist. Z.B. kann eine DNA-Sequenz, die für ein Polypeptid kodiert, aus Hefe erhalten werden und in eine Bakterienzelle eingeführt werden. In diesem Fall ist die Hefe-DNA-Sequenz „heterolog" zu der nativen DNA der Bakterienzelle. Alternativ dazu kann eine Promotorsequenz aus einem Tie2-Gen am genomischen Platz eines fosB-Gens eingeführt werden. In diesem Fall ist die Tie2-Promotorsequenz „heterolog" zu der nativen genomischen fosB-Sequenz.
Ein „Polypeptid" wird im weitesten Sinne des Begriffs verwendet, um eine Verbindung von zwei oder mehreren Untereinheiten an Aminosäuren, Aminosäureanaloga oder anderen Peptidmimetika zu beschreiben. Die Untereinheiten können durch Peptidbindungen oder andere Bindungen verbunden sein, z.B. Ester, Ether etc. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Aminosäure" entweder auf natürliche und/oder unnatürliche oder synthetische Aminosäuren, unter anderem Glycin und beide der optischen D- oder L-Isomere, sowie Aminosäureanaloga und Peptidmimetika. Ein Peptid von drei oder mehreren Aminosäuren wird normalerweise ein Oligopeptid genannt, wenn die Peptidkette kurz ist. Ist die Peptidkette lang, so wird das Peptid typischerweise ein Polypeptid oder ein Protein genannt.
„Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Anordnung von Elementen, worin die beschriebenen Bestandteile so angeordnet sind, dass sie ihre normale Funktion ausüben können. Daher ist ein bestimmter Promotor, der operabel an eine kodierende Sequenz (z.B. eine Reporterexpressionskassette) gebunden ist, in der Lage, die Expression der kodierenden Sequenz durchzuführen, wenn die richtigen Enzyme vorhanden sind. Der Promotor oder andere Kontrollelemente müssen nicht an die kodierende Sequenz angrenzen, solange sie die Expression dieser steuern. So können z.B. unterbrechende, untranslatierte, jedoch transkribierte Sequenzen zwischen der Promotorsequenz und der kodierenden Sequenz vorhanden sein, und die Promotorsequenz kann immer noch als „operabel" an die kodierende Sequenz „gebunden" betrachtet werden.
„Rekombinant", wie hierin verwendet, um ein Nucleinsäuremolekül zu beschreiben, bedeutet ein Polynucleotid genomischen Ursprungs, cDNA-Ursprungs, semisynthetischen oder synthetischen Ursprungs, das entweder durch seine Herkunft oder durch Manipulation Folgendes ist: (1) nicht mit dem ganzen oder einem Teil des Polynucleotids assoziiert ist, mit dem es in der Natur assoziiert ist; und/oder (2) an ein anderes Polynucleotid gebunden ist als jenes, an das es in der Natur gebunden ist. Der Begriff „rekombinant", wie er im Hinblick auf ein Protein oder Polypeptid verwendet wird, bedeutet ein Polypeptid, das durch Expression eines rekombinanten Polynucleotids produziert wurde. „Rekombinante Wirtszellen", „Wirtszellen", „Zellen", „Zelllinien", „Zellkulturen" oder andere solche Begriffe, die prokaryotische Mikroorganismen oder eukaryotische Zelllinien beschreiben, die als einzellige Einheiten gezüchtet wurden, werden als Synonyme verwendet und beziehen sich auf Zellen, die als Rezipienten für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet wurden, und umfassen die Nachkommenschaft der originalen Zelle, die transfiziert wurde. Es wird davon ausgegangen, dass die Nachkommenschaft einer einzelnen parentalen Zelle nicht notwendigerweise vollkommen identisch mit der ursprünglichen Elternzelle bezüglich der Morphologie oder des genomischen oder totalen DNA-Komplements sein muss, und zwar aufgrund zufälliger oder absichtlicher Mutationen. Die Nachkommenschaft der parentalen Zelle, die der Elternzelle ausreichend ähnlich ist, um sich durch die relevante Eigenschaft auszuzeichnen, wie z.B. das Vorhandensein einer Nucleotidsequenz, die für ein gewünschtes Peptid kodiert, ist in der mit dieser Definition gemeinten Nachkommenschaft enthalten und ist ebenso von den oben genannten Begriffen abgedeckt. Ein „isoliertes Polynucleotid"-Molekül ist ein Nucleinsäuremolekül, separat und getrennt vom ganzen Organismus, mit dem das Molekül in der Natur zu finden ist; oder ein Nucleinsäuremolekül, das, ganz oder teilweise, frei von Sequenzen ist, die normalerweise mit ihm in der Natur assoziiert sind; oder eine Sequenz, wie sie in der Natur existiert, jedoch mit heterologen Sequenzen (wie oben definiert), die mit ihr assoziiert sind.
Verfahren zur Bestimmung der Nucleinsäure- und Aminosäure-„Sequenzidentität" sind nach dem Stand der Technik ebenfalls bekannt. Typischerweise umfassen solche Verfahren die Bestimmung der Nucleotidsequenz der mRNA für ein Gen und/oder die Bestimmung der Aminosäuresequenz, die dadurch kodiert wird, sowie das Vergleichen dieser Sequenzen mit einer zweiten Nucleotid- oder Aminosäuresequenz. Im Allgemeinen bezieht sich „Identität" auf eine exakte Nucleotid-zu-Nucleotid- oder Aminosäure-zu-Aminosäure-Korrespondenz von zwei Polynucleotiden bzw. Polypeptidsequenzen. Zwei oder mehr Sequenzen (Polynucleotid oder A minosäure) können durch Bestimmung ihrer „Prozent-Identität" verglichen werden. Die Prozentidentität von zwei Sequenzen, egal ob Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, ist die Anzahl exakter Übereinstimmungen zwischen zwei angeordneten Sequenzen, dividiert durch die Länge der kürzeren Sequenzen und multipliziert mit 100. Eine ungefähre Anordnung für Nucleinsäuresequenzen wird durch den lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman bereitgestellt, Advances in Applied Mathematics 2, 482-489 (1981). Dieser Algorithmus kann auf Aminosäuresequenzen angewandt werden, und zwar unter Verwendung der Bewertungsmatrix, entwickelt von Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff (Hrsg.) 5. Suppl. 3, 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, und normalisiert von Gribskov, Nucl. Acids Res. 14 (6), 6745-6763 (1986). Ein Beispiel für eine Anwendung dieses Algorithmus zur Bestimmung der Prozentidentität einer Sequenz wird von der Genetics Computer Group (Madison, WI) in der „BestFit"-Utility-Anwendung bereitgestellt. Die Vorgabeparameter für dieses Verfahren werden im „Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual", Version 8 (1995), beschrieben (erhältlich bei Genetics Computer Group, Madison, WI). Ein bevorzugtes Verfahren zur Bestimmung der Prozentidentität im Kontext der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des MPSRCH-Programmpakets, Copyright: University of Edinburgh, entwickelt von John F. Collins und Shane S. Sturrok und vertrieben von IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Aus dieser Paketreihe kann der Smith-Waterman-Algorithmus verwendet werden, wenn Vorgabeparameter für die Bewertungstabelle verwendet werden (z.B. „open gap penalty" von 12, „gap extension penalty" von eins, und eine Lücke von sechs). Aus den generierten Daten spiegelt der „Match"-Wert die „Sequenzidentität" wider. Andere geeignete Programme zur Berechnung der Prozentidentität oder der Ähnlichkeit zwischen Sequenzen sind im Allgemeinen nach dem Stand der Technik bekannt, ein weiteres Anordnungsprogramm ist z.B. BLAST, das mit Vorgabeparametern verwendet wird. BLASTN und BLASTP z.B. können unter Verwendung der folgenden Vorgabeparameter verwendet werden: genetic code = standard; filter = none; strand = both; cutoff = 60; Expect = 10; Matrix = BLOSUM62; Descriptions = 50 sequences; sort by = HIGH SCORE; Databases = non-redundant, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Details über diese Programme sind unter der folgenden Internetadresse zu finden: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.
Alternativ dazu kann der Grad der Sequenzähnlichkeit zwischen Polynucleotiden durch Hybridisierung von Polynucleotiden unter Bedingungen bestimmt werden, die stabile Duplexe zwischen homologen Regionen bilden, gefolgt von Verdau mit einzelstrangspezifischen Nuclease(n) sowie Größenbestimmung der verdauten Fragmente. Zwei DNA- oder zwei Polypeptidsequenzen sind „im Wesentlichen homolog" zueinander, wenn die Sequenzen zumindest etwa 80 % – 85 %, vorzugsweise zumindest etwa 85 % – 90 %, noch bevorzugter zumindest etwa 90 % – 95 % und insbesondere zumindest 95 % – 98 %, Sequenzidentität über eine definierte Moleküllänge aufweisen, wie dies unter Verwendung der oben angegebenen Verfahren bestimmt wird. Wie hierin verwendet, bezieht sich „im Wesentlichen homolog" auch auf Sequenzen, die eine vollständige Identität mit der spezifizierten DNA- oder Polypeptidsequenz aufweisen. DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen homolog sind, können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment z.B. unter stringenten Bedingungen identifiziert werden, wie für dieses spezielle System definiert. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist nach dem Stand der Technik möglich. Siehe z.B. Sambrook et al., s.o.; DNA Cloning, s.o.; Nucleic Acid Hybridization, so.
Von zwei Nucleinsäurefragmenten wird angenommen, sie würden „selektiv hybridisieren", wie hierin beschrieben. Der Grad der Sequenzidentität zwischen zwei Nucleinsäuremolekülen bestimmt die Wirksamkeit und Stärke der Hybrisierungsvorkomnisse zwischen solchen Molekülen. Eine teilweise identische Nucleinsäuresequenz inhibiert zumindest teilweise eine vollständig identische Sequenz bezüglich der Hybridisierung an ein Target-Molekül. Die Inhibierung der Hybridisierung der vollständig identischen Sequenz kann während der Hybridisierungstests untersucht werden, die nach dem Stand der Technik wohlbekannt sind (z.B. Southern Blot, Northern Blot, Lösungshybridisierung oder dergleichen, siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor N.Y. (1989)). Solche Versuche können unter Verwendung variierender Selektivitätsgrade durchgeführt werden, z.B. unter Verwendung von Bedingungen, die von niedriger bis hoher Stringenz reichen. Falls Bedingungen niedriger Stringenz verwendet werden, so kann das Fehlen einer nichtspezifischen Bindung unter Verwendung einer Sekundärsonde überprüft werden, der sogar ein teilweiser Grad der Sequenzidentität fehlt (z.B. eine Sonde mit weniger als etwa 30 % Sequenzidentität mit dem Targemolekül), sodass in Abwesenheit nichtspezifischer Bindungsvorkommnisse die Sekundärsonde nicht mit dem Target hybridisiert.
Bei der Verwendung eines auf einer Hybridisierung basierenden Detektionssystems wird eine Nucleinsäuresonde ausgewählt, die komplementär zu einer Targetnucleinsäuresequenz ist, und danach „hybridisieren" die Sonde und die Targetsequenz „selektiv" unter Auswahl der geeigneten Bedingungen oder binden sich aneinander, um ein Hybridmolekül zu bilden. Ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, selektiv mit einer Target-Sequenz unter „moderat stringenten" Bedingungen zu hybridisieren, hybridisiert typischerweise unter Bedingungen, die eine Detektion einer Targetnucleinsäuresequenz von zumindest 10-14 Nucleotiden in der Länge mit zumindest etwa 70 % Sequenzidentität mit der Sequenz der ausgewählten Nucleinsäuresonde ermöglichen. Stringente Hybridisierungsbedingungen ermöglichen typischerweise eine Detektion der Targetnucleinsäuresequenzen von zumindest etwa 10-14 Nucleotiden in der Länge mit einer Sequenzidentität von mehr als etwa 90 – 95 % mit der Sequenz der ausgewählten Nucleinsäuresonde. Die Hybridisierungsbedingungen, die für die Sonden-/Target-Hybridisierung nützlich sind und bei denen die Sonde und das Ziel einen spezifischen Grad an Sequenzidentität aufweisen, können nach dem Stand der Technik bestimmt werden (siehe z.B. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames und S.J. Higgins (Hrsg.), IRL Press, Oxford, Washington, DC, (1985)).
Bezüglich der Stringenzbedingungen zur Hybridisierung ist nach dem Stand der Technik wohlbekannt, dass zahlreiche äquivalente Bedingungen verwendet werden können, um eine bestimmte Stringenz herzustellen, z.B. durch Variieren folgender Faktoren: Länge und Art der Sonde und Target-Sequenzen, Basenzusammensetzung der verschiedenen Sequenzen, Konzentrationen von Salzen und anderer Hybridisierungslösungsbestandteile, Vorhandensein oder Fehlen von blockierenden Agenzien in den Hybridisierungslösungen (z.B. Formamid, Dextransulfat und Polyethylenglykol), Hybridisierungsreaktionstemperatur und Zeitparameter sowie variierende Waschbedingungen. Die Auswahl eines bestimmten Sets an Hybridisierungsbedingungen erfolgt gemäß Standardverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
Ein „Vektor" ist in der Lage, Gen-Sequenzen zu Target-Zellen zu transferieren. Typischerweise bedeutet „Vektor-Konstrukt", „Expressionsvektor" und „Gen-Transfervektor" ein beliebiges Nucleinsäurekonstrukt, das in der Lage ist, die Expression eines Gens von Interesse zu steuern, und das Gen-Sequenzen zu Target-Zellen transferieren kann. Der Begriff umfasst daher Klonierungs- und Expressionsvehikel genauso wie integrierende Vektoren.
„Nucleinsäureexpressionsvektor" oder „Expressionskassette" bezieht sich auf eine Anordnung, die in der Lage ist, die Expression einer Sequenz oder eines Gens von Interesse zu steuern. Der Nucleinsäureexpressionsvektor umfasst einen Promotor (typischerweise mit Expressionskontrollsequenzen assoziiert), der operabel an die Sequenzen oder Gene) von Interesse gebunden ist. Andere Kontrollelemente können ebenso vorhanden sein. Die hierin beschriebenen Expressionskassetten können in einem Plasmidkonstrukt enthalten sein. Zusätzlich zu den Bestandteilen der Expressionskassette kann das Plasmidkonstrukt ebenso auch einen bakteriellen Replikationsstartpunkt, einen oder mehrere selektierbare Marker, ein Signal, das eine Existenz des Plasmidkonstrukts als einzelsträngige DNA ermöglicht (z.B. ein M13-Replikationsstartpunkt), eine Mehrfachklonierungsstelle und einen „Säugetier"-Replikationsstartpunkt (z.B. einen SV40- oder Adenovirus-Replikationsstartpunkt) umfassen.
Eine „Expressionskassette" umfasst ein beliebiges Nucleinsäurekonstrukt, das in der Lage ist, die Expression eines Gens/einer kodierenden Sequenz von Interesse zu steuern. Solche Kassetten können zu einem „Vektor", „Vektorkonstrukt", „Expressionsvektor" oder „Gentransfervektor" umgebaut werden, um die Expressionskassette in die Target-Zellen zu transferieren. Daher umfasst der Begriff Klonierungs- und Expressionsvehikel sowie virale Vektoren.
„Lichterzeugend" wird definiert als in der Lage, Licht durch eine chemische Reaktion oder durch die Absorption von Strahlung zu erzeugen.
Ein „lichterzeugendes Protein" oder „lichtausstrahlendes Protein" ist ein Protein, das in der Lage ist, Licht im sichtbaren Spektrum zu erzeugen (zwischen etwa 350 nm und 800 nm). Beispiele umfassen biolumineszierende Proteine, wie z.B. Luciferasen, etwa bakterielle und Glühwürmchen-Luciferasen, sowie fluoreszierende Proteine, etwa grünfluoreszierendes Protein (GFP).
„Luciferase" umfasst, falls nicht anders angegeben, prokaryotische und eukaryotische Luciferasen sowie Varianten, die unterschiedliche oder geänderte optische Eigenschaften aufweisen, wie z.B. Luciferasen, die unterschiedliche Lichtfarben produzieren (z.B. N. Kajiyama und E. Nakano, Protein Engineering 4 (6), 691-693 (1991)). „Lux" bezeichnet prokaryotische Gene, die mit Luciferase und Photonenemission assoziiert sind. „Luc" bezeichnet eukaryotische Gene, die mit Luciferase und Photonenemission assoziiert sind.
„Licht" wird hierin, falls nicht anders angegeben, als elektromagnetische Strahlung mit einer Wellelänge zwischen etwa 300 nm und etwa 1100 nm definiert.
„Tier" bezeichnet, wie hierin verwendet, typischerweise ein nichtmenschliches Säugetier, umfassend, ohne Einschränkung, landwirtschaftliche Nutztiere, wie etwa Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen und Pferde; domestizierte Säugetiere, wie etwa Hunde und Katzen; Labortiere, unter anderem Nagetiere, wie etwa Mäuse, Ratten und Meerschweinchen; Vögel, unter anderem domestizierte, wilde und Jagdvögel, wie etwa Hühner, Truthähne und andere hühnerartige Vögel, Enten, Gänse und dergleichen. Der Begriff definiert kein bestimmtes Alter. Daher fallen sowohl erwachsene als auch neugeborene Individuen unter diese Definition.
Ein „transgenes Tier" bezeichnet ein gentechnisch verändertes Tier oder einen Nachkommen von genetisch veränderten Tieren. Ein transgenes Tier enthält normalerweise Material aus zumindest einem nichtverwandten Organismus, wie z.B. aus einem Virus, einer Pflanze oder einem anderen Tier. Die „nichtmenschlichen Tiere" der Erfindung umfassen Wirbeltiere, wie z.B. Nagetiere, nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Amphibien, Vögel, Fische, Insekten, Reptilien etc. Der Begriff „chimäres Tier" wird verwendet, um Tiere zu bezeichnen, in denen das heterologe Gen zu finden ist oder in denen das heterologe Gen in einigen, jedoch nicht allen Zellen des Tiers exprimiert wird.
„Analyt" bezeichnet, wie hierin verwendet, eine beliebige Verbindung oder Substanz, deren Wirkungsweisen (z.B. Induktion oder Repression eines spezifischen Promotors) unter Verwendung der Testtiere und Verfahren der vorliegenden Erfindung evaluiert werden können. Solche Analyten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Wirkstoffe, chemische Verbindungen, pharmazeutische Verbindungen, Polypeptide, Peptide, Polynucleotide und Polynucleotidanaloga. Viele Organisationen (z.B. die National Institutes of Health, pharmazeutische und chemische Unternehmen) besitzen große Bibliotheken chemischer oder biologischer Verbindungen aus natürlichen oder synthetischen Prozessen oder Fermentationsbrühen oder -extrakte. Solche Verbindungen/Analyten können bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „positiver Selektionsmarker" ein Gen, das für ein Produkt kodiert, das nur jenen Zellen das Überleben und/oder Wachstum unter bestimmten Bedingungen ermöglicht, die das Gen in sich tragen. Pflanzen- und Tierzellen z.B., die das eingeführte Neomycin-Resistenz-(Neo^⎾-) Gen exprimieren, sind gegen die Verbindung G418 resistent. Zellen, die den Neo^⎾-Genmarker nicht in sich tragen, werden von G418 abgetötet. Andere positive Selektionsmarker werden dem Fachmann bekannt sein. Typischerweise kodieren positive Selektionsmarker für Produkte, die leicht zu testen sind. Positive Selektionsmarker können daher verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein bestimmtes DNA-Konstrukt in eine Zelle, Organ oder Gewebe eingeführt wurde.
„Negativer Selektionsmarker" bezeichnet ein Gen, das für ein Produkt kodiert, das verwendet werden kann, um unter bestimmten Bedingungen Zellen selektiv abzutöten und/oder das Wachstum von Zellen zu inhibieren. Nicht einschränkende Beispiele negativer Selektionsinserts umfassen ein Herpes-Simplex-Virus-(HSV-)Thymidinkinase-(TK-)Gen. Zellen, die ein aktives HSV-TK-Gen enthalten, sind nicht in der Lage, in Gegenwart von Gangcylovir oder ähnlichen Agenzien zu wachsen. In Abhängigkeit vom Substrat können einige Genprodukte daher als entweder positive oder negative Selektionsmarker fungieren. Der Begriff „homologe Rekombination" bezeichnet den Austausch von DNA-Fragmenten zwischen zwei DNA-Molekülen oder Chromatiden an der Stelle im Wesentlichen identischer Nucleotidsequenzen. Es wird davon ausgegangen, dass im Wesentlichen homologe Sequenzen Insertionen, Deletionen und Substitutionen in der Nucleotidsequenz unterbringen können. Lineare Sequenzen von Nucleotiden können daher im Wesentlichen identisch sein, sogar wenn einige der Nucleotidreste nicht genau übereinstimmen oder angeordnet sind (siehe oben).
Eine „Knock-out"-Mutation bezeichnet den teilweisen oder vollständigen Verlust der Expression von zumindest einem Teil des Targetgens. Beispiele für Knock-out-Mutationen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Genersetzung durch heterologe Sequenzen, Genunterbrechung durch heterologe Sequenzen und Deletion essentieller Elemente des Gens (z.B. Promotorregion, Teile einer kodierenden Sequenz). Eine „Knock-out"-Mutation wird typischerweise durch den durch die Mutation erzeugten Phänotyp identifiziert.
Ein „Einzelkopie-Gen", wie hierin verwendet, bezeichnet ein Gen, das im Genom eines Organismus von nur einer einzigen Kopie an einem speziellen chromosomalen Locus dargestellt wird. Dementsprechend besitzt ein diploider Organismus zwei Kopien des Gens, und beide Kopien scheinen an derselben chromosomalen Stelle auf.
Ein „Gen" ist, wie im Kontext der vorliegenden Erfindung verwendet, eine Sequenz an Nucleotiden in einer genetischen Nucleinsäure (Chromosom, Plasmid etc.), mit der eine genetische Funktion assoziiert wird. Ein Gen ist eine Erbeinheit, z.B. eines Organismus, die eine Polynucleotidsequenz umfasst (z.B. eine DNA-Sequenz für Säugetiere), die einen bestimmten physischen Ort (einen „Gen-Locus" oder „genetischen Locus") im Genom eines Organismus einnimmt. Ein Gen kann für ein exprimiertes Produkt kodieren, z.B. ein Polypeptid oder ein Polynucleotid (z.B. tRNA). Alternativ dazu kann ein Gen einen genomischen Ort für ein bestimmtes Vorkommnis/eine bestimmte Funktion definieren, wie z.B. die Bindung von Proteinen und/oder Nucleinsäuren (z.B. Phagen-Anheftungsstellen), worin das Gen für kein exprimiertes Produkt kodiert. Typischerweise umfasst ein Gen kodierende Sequenzen, z.B. für ein Polypeptid kodierende Sequenzen, und nicht kodierende Sequenzen, wie z.B. Promotorsequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Transkriptionsregulationssequenzen (z.B. Enhancersequenzen). Viele eukaryotische Gene besitzten „Exons" (kodierende Sequenzen), die durch „Introns" (nicht kodierende Sequenzen) unterbrochen sind. In gewissen Fällen kann ein Gen Sequenzen mit anderen Genen teilen (z.B. überlappende Gene).
„Isogen" bedeutet zwei oder mehrere Organismen oder Zellen, von denen angenommen wird, wie wären genetisch identisch. „Im Wesentlichen isogen" bedeutet zwei oder mehrere Organismen oder Zellen, worin es an der Mehrheit der genetischen Loci (z.B. mehr als 99,000 %, noch bevorzugter mehr als 99,900 %, noch bevorzugter mehr als 99,990 %, noch bevorzugter mehr als 99,999 %) eine genetische Identität zwischen den zu vergleichenden Organismen oder Zellen gibt. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird von zwei Organismen (z.B. Mäusen) angenommen, sie wären „im Wesentlichen isogen", wenn z.B. die insertierten Transgene die Hauptunterschiede zwischen dem genetischen Aufbau der zu vergleichenden Mäuse darstellen. Falls weiters z.B. die genetischen Hintergründe der zu vergleichenden Mäuse dieselben sind, mit der Ausnahme, dass eine der Mäuse eine oder mehrere definierte Mutationen) aufweist (z.B. die Fellfarbe verändernd), so werden diese Mäuse als im Wesentlichen isogen betrachtet. Ein Beispiel für zwei Stämme im Wesentlichen isogener Mäuse sind C57BL/6 und C57BL/6-TyrC2j/+.
Ein „Pseudogen", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Typ einer Gensequenz, der in Genomen, typischerweise von Eukaryoten, zu finden ist, in denen die Sequenz sehr stark einem bekannten funktionellen Gen ähnelt, jedoch sich dadurch unterscheidet, dass das Pseudogen nicht funktionell ist. Eine Pseudogensequenz kann z.B. mehrere Stopcodons in dem enthalten, was einem offenen Leseraster im funktionellen Gen entsprechen würde. Pseudogene können ebenso Deletionen oder Insertionen aufweisen, die ihr korrespondierendes funktionelles Gen betreffen. Falls es z.B. in einem Genom ein funktionelles Gen und ein verwandtes Pseudogen gibt, so wird vom funktionellen Gen angenommen, es wäre ein Einzelkopie-Gen (dementsprechend wird das Pseudogen ebenso für eine Einzelkopie gehalten).
Ein „nicht essentielles Gen" bezeichnet ein Gen, dessen Deletion, Unterbrechung, Eliminiation, Reduktion der Genfunktion oder Mutation nicht letal ist und keine offensichtlichen negativen Wirkungen auf die Fähigkeit des Organismus, zu reifen und sich zu reproduzieren, zeigt. Ein „nicht essentielles Gen ohne Phänotyp" bezeichnet ein nicht essentielles Gen, dessen Deletion, Unterbrechung, Elimination, Reduktion der Genfunktion oder Mutation keine schädigende Wirkung auf den Organismus hat. Typischerweise gibt es keine sich im Phänotyp widerspiegelnden Gen-Dosierungswirkungen, die mit der Modifikation eines nicht essentiellen Gens ohne Phänotyp assoziiert sind – z.B. Deletion, Unterbrechung oder Mutation beider Kopien eines nicht essentiellen Gens ohne Phänotyp in einem diploiden Organismus zeigt im Wesentlichen dieselbe Wirkung wie eine Deletion, Unterbrechung oder Mutation einer der beiden Kopien, die im diploiden Organismus vorhanden sind. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein nicht essentielles Gen typischerweise eines, dessen Funktion eliminiert wurde (z.B. durch eine Deletionsmutation), und diese Elimination der Funktion war nicht letal, und der Organismus entwickelte sich, reifte und war in der Lage, sich zu reproduzieren.
Die „native Sequenz" oder „Wildtyp-Sequenz" eines Gens ist die Polynucleotidsequenz, die den genetischen Locus umfasst, der dem Gen entspricht, z.B. alle regulatorischen kodierenden Sequenzen und kodierenden Sequenzen des offenen Leserasters, die für die Expression eines vollständig funktionellen Genprodukts erforderlich sind, wie sie im Wildtyp-Genom eines Organismus vorhanden sind. Die native Sequenz eines Gens kann z.B. Transkriptionspromotorsequenzen, Translationsen hancersequenzen, Introns, Exons und Poly-A-Bearbeitungssignalstellen umfassen. Es ist anzumerken, dass in der allgemeinen Bevölkerung Wildtyp-Gene multiple vorherrschende Versionen umfassen können, die Sequenzveränderungen relativ zueinander enthalten und trotzdem keine erkennbare pathologische Wirkung aufweisen. Diese Variationen werden als „Polymorphismen" oder „Allelvariationen" bezeichnet.
Mit „Ersatzsequenz" ist eine Polynucleotidsequenz gemeint, die anstelle von zumindest einem Teil der nativen oder Wildtyp-Sequenz eines Gens substituiert wird.
Ein „linearer Vektor" oder ein „linearisierter Vektor", wie hierin verwendet, ist ein Vektor mit zwei Enden. Kreisförmige Vektoren z.B., wie etwa Plasmide, können durch Verdau mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert werden, die an einer einzelnen Stelle im Plasmid schneidet. Vorzugsweise werden die hierin beschriebenen abzielenden Vektoren so linearisiert, dass sich die Enden nicht in den abzielenden Sequenzen befinden.
Eine „Kohorte" wird hierin als Gruppe von Individuen mit einem gemeinsamen statistischen Faktor verwendet. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist der gemeinsame statistische Faktor, dass die Individuen im Wesentlichen isogen sind.
Ein „undurchsichtiges Medium" wird hierin verwendet, um sich auf ein Medium zu beziehen, das „traditionell" undurchsichtig ist, jedoch nicht notwendigerweise absolut undurchsichtig ist. Dementsprechend ist ein undurchsichtiges Medium als ein Medium definiert, das weitgehend weder als transparent noch als durchscheinend gilt, und umfasst Gegenstände, wie z.B. ein Holzbrett oder Fleisch und Haut eines Säugetiers.
2.0.0 Arten der Durchführung der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben wird, ist anzumerken, dass diese Erfindung nicht auf bestimmte Formulierungen oder Verfahrensparameter eingeschränkt ist, da diese natürlich variieren können. Es ist ebenso anzumerken, dass die hierin verwendete Terminologie lediglich dem Ziel dient, spezielle Ausführungsformen der Erfindung zu beschreiben, und ist nicht als einschränkend anzusehen ist.
Obwohl eine Reihe an Verfahren und Materialien, die den hierin beschriebenen ähneln oder diesen entsprechen, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, so werden die bevorzugten Materialien und Verfahren hierin beschrieben.
2.1.0. Allgemeiner Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein starkes neues Werkzeug zur Analyse biochemischer Stoffwechselwege und physiologischer Funktionen dar (z.B. Toxizität, Entzündung, Schmerz, Entwicklung, Onkogenese, Apoptose etc.), sowohl in vivo als auch in vitro. Unter Verwendung dieses einzigartigen Ansatzes, der In-vivo-Differentialdisplay (IVDD) genannt wird, kann die Genexpression in lebenden Tieren leicht studiert werden. IVDD kann vielseitig angewandt werden, unter anderem, jedoch mit Sicherheit nicht eingeschränkt auf, Wirkstofftests und -entwicklung sowie toxikologische Tests für Chemikalien.
Während beinahe aller abnormalen physiologischen Zustände aktivieren (induzieren) Organismen spezifische Gene oder Gengruppen. Infektiöse Agenzien, pathologische Bedingungen, Umgebungs- und/oder toxische Stimuli können die Expression bestimmter Gene induzieren, die mit einem bestimmten biochemischen Stoffwechselweg oder einem physiologischen Zustand assoziiert sind.
Gene und Promotoren, die von diesen Genen abgeleitet werden, die durch die zuvor beschriebenen Stimuli induziert werden, können wie hierin beschrieben identifiziert werden. So kann z.B. die Substraktionshybridisierung verwendet werden, um zu bestimmen, welche Transkripte aktiviert werden (oder überexprimiert werden), wenn die Zellen oder Tiere den Stimuli von Interesse ausgesetzt werden.
Zu einer Gruppe von Genen, von der bekannt ist, dass sie als Reaktion auf das Aussetzen gegenüber gewissen toxischen und/oder Umgebungsstimuli induziert werden, gehören „Hitzeschock"-Gene oder Gene, die durch UV-Schädigung durch Induktion von DNA-Reparaturgenen induziert werden. Gene, die auf eine charakteristische Art und Weise auf solche Umgebungsstimuli/toxischen Stimuli reagieren, wurden durch Schaden induzierbare oder stressbezogene Gene genannt (J.T. MacGregor et al., Fundamental and Applied Toxicology 26, 156-173 (1995)). Typischerweise sind die Expressionsprodukte dieser Gene in das Schützen des Organismus vor dem Stress involviert, der mit der Induktion des Gens/der Gene assoziiert ist, oder spielen eine Rolle bei der Entgiftung des Organismus durch Schaden, der auf das Aussetzen gegenüber den Stimuli zurückzuführen ist. Toxine können das Resultat zellulären Schadens sein (z.B. die Bildung von Thymindimeren als Reaktion auf UV-Licht), oder Toxine können die direkte Ursache der negativen Wirkungen auf einen Zelltyp, Zellgruppen oder Organsystemen in einem Subjekt sein. Einige der Wege, auf die Produkte dieser stressinduzierten Gene in die Entgiftung involviert sind, umfassen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt auf, die direkte Neutralisierung einer toxischen Substanz (oder verwandter Stoffwechselprodukte) durch chemische Veränderung; Elimination einer solchen Substanz (oder verwandter Stoffwechselprodukte) aus betroffenen Zellen (z.B. Transport aus der Zelle) oder das Reparieren von Schaden, der durch die Substanz (oder verwandte Stoffwechselprodukte) hervorgerufen wird.
Es gibt zahlreiche Beispiele toxinvermittelten zellulären Schadens, die die Expression stressbezogener Gene induzieren, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: Schaden der zellulären DNA, osmotischer Schock, Oxidation von Lipiden, Unterbrechung (z.B. Abkoppeln) des Elektronentransports, Membranschaden (z.B. Permeabilisierung). Viele stressbezogene Gene wurden in einem breiten Spektrum prokaryotischer und eukaryotischer Organismen identifiziert. Weiters sind die Sequenzen vieler dieser Gene (unter anderem kodierende Sequenzen für das Genprodukt und gemeinsame Kontrollelemente) auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Ein hoher Konservierungsgrad über Phyla wurde als zelluläre Reaktion auf Stress festgestellt. Die für Hitzeschockproteine kodierenden Gene z.B. stellen eine solche hochgradig konservierte Genklasse dar (C. Hunt und R. Morimoto, Proc. Natl. hochgradig konservierte Genklasse dar (C. Hunt und R. Morimoto, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 6455-6459 (1985)).
Es gibt ebenso zahlreiche Gene, deren Einbindung in folgende physiologische Funktionen gezeigt wurde: Schmerz und/oder Entzündung (z.B. Endorphine und Enkephaline); Organentzündung (TGF-β1); Fieber (IL-1-α/β; TNF-α/β; IFN-α, IL-6); Zellproliferation (PCNA, TNF); Entwicklung (bmp4 – defekte Gastrulation, Mesodermbildung, bmp5 – Skelettstörungen, bmp7 – Niere, Auge, Skelett); Wirkstoffstoffwechsel (z.B. Oxidierung, NO-(Stickoxid-) Synthese und -Abbau; N-Acetylierung und S-Methylierung); Apoptose (z.B. FAS, ICE, Bax); Infektionskrankheiten (z.B. Chlamydia, Toxoplasmose); Karzinogenese (z.B. Tumorsuppressionsgene, Onkogene und Proto-Onkogene); Zellnekrose (TNF, TNF-β1); Onkogenese und Angiogenese (z.B. Heparanase, ApoB100, CETP, sPLA2, TIE2, VEGF-Gene und VEGFR-Gene).
Die Kontrollelemente der Gene von Interesse sind operabel an Reportergene gebunden, um chimäre Gene zu bilden, die verwendet werden, um transgene Tiere zu erschaffen (z.B. Mäuse). Diese transgenen Tiere können danach als Testtiere dienen, z.B. für toxikologische oder Stress-Tests. Eine Induktion der Expression dieser Gene kann unter Verwendung nicht invasiver Bilderzeugung evaluiert werden.
Nicht invasive Bilderzeugung und/oder die Detektion von lichtausstrahlenden Konjugaten in Säugetieren wurde im US-Patent Nr. 5.650.135 (in Co-Besitz, ausgegeben am 22. Juli 1997) von Contag et al. beschrieben. Dieses Bilderzeugungsverfahren kann bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung hinsichtlich der Lehren der vorliegenden Beschreibung verwendet werden.
Es können verschiedene Formen unterschiedlicher hierin beschriebener Ausführungsformen der Erfindung kombiniert werden.
2.1.1 Toxikologie
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung daher Tier-Testsysteme und Verfahren für Toxikologiestudien eines Analyten von Interesse. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden transgene Säugetiere erschaffen, in denen Kontrollelemente, z.B. ein Promotor oder eine Transkriptionsregulationssequenz, von zwei oder mehreren stressinduzierten Genen operabel an für Reportergene kodierende Sequenzen (z.B. Luciferase) gebunden sind. Ein geeignetes Substrat für das Reportergenprodukt wird dem Tier zusätzlich zu einem Analyten von Interesse verabreicht. Die Reihenfolge der Verabreichung dieser beiden Substanzen kann empirisch für jeden Analyten von Interesse bestimmt werden. Eine Induktion der Expression, die durch beliebige Kontrollelemente vermittelt wird, wird danach mittels nicht invasiver Bildgebungsverfahren unter Verwendung des ganzen Tiers evaluiert.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die hierin beschriebenen transgenen Tiere verwendet werden, um die In-vivo-Wirkungen von Chemikalien mit hohem Produktionsvolumen (HPV-Chemikalien) zu evaluieren, z.B. durch Untersuchung der Wirkungsweisen von HPVs auf die Expression von toxizitätsverwandten Genen. Bis heute gibt es etwa 3000 HPV-Chemikalien in der Gruppe nichtpolymerer Chemikalien (polymere Chemikalien werden im Allgemeinen schlecht von Organismen absorbiert und besitzen daher im Allgemeinen eine geringe Toxizität). Vor der vorliegenden Erfindung gab es keinen routinemäßigen, wirksamen Weg, um die Toxizität dieser Chemikalien in vivo zu evaluieren, der nicht nur die Toxizität der Chemikalie selbst, sondern auch ihre Metaboliten (z.B. Spaltungsprodukte) berücksichtigt.
Produzenten und Importeure chemischer Stoffe wurden von der „United States Environmental Protection Agency" (EPA) eingeladen, grundlegende Toxizitätsinformationen über ihre Chemikalien mit hohem Produktionsvolumen (HPV) bereitzustellen. HPV-Chemikalien sind Chemikalien, die in den Vereinigten Staaten produziert werden oder in diese importiert werden, und zwar in Mengen von über 1 Million Pfund pro Jahr. Jedes chemische Unternehmen, das an dem freiwilligen Programm teil nimmt, verpflichtet sich dazu, Chemikalien zu identifizieren, die das Unternehmen testen möchte. Gemäß den von der EPA festgelegten Richtlinien führen die teilnehmenden Unternehmen folgende Aufgaben durch: Überprüfung der Angemessenheit der existierenden Daten; Design und Einreichung der Testpläne; Bereitstellung der erhaltenen Testergebnisse und Zusammenstellen von Zusammenfassungen bezüglich der jede Chemikalie beschreibenden Daten. Im Moment verwendet das freiwillige Programm dieselben Tests, Testprotokolle und grundlegenden Informationszusammenfassungsformate, wie sie vom „Screening Information Data Set"-Programm (SIDS-Programm) verwendet werden. SIDS ist ein auf gemeinsamer Arbeit beruhender, internationaler Versuch, grundlegende Toxizitätsinformationen über HPV-Chemikalien weltweit sicherzustellen. Dementsprechend sind Informationen, die für das nationale US-Programm zusammengestellt wurden, im Rahmen der internationalen Bemühungen akzeptabel.
Von den etwa 3000 Chemikalien, die die USA in einer Menge von mehr als 1 Million Pfund/Jahr importieren oder produzieren, zeigt eine kürzlich durchgeführte EPA-Analyse, dass 43 % dieser Chemikalien mit hohem Produktionsvolumen keine Testdaten bezüglich der grundlegenden Toxizität besitzen und dass nur sieben Prozent eine vollständige Reihe an Testdaten aufweisen (http://www.epa.gov/opptintr/chemrtk). Dieses Fehlen an Testdaten kompromittiert das Recht der Öffentlichkeit, über die Chemikalien Bescheid zu wissen, die sich in der Umgebung, in den Häusern, Arbeitsplätzen und den Produkten befinden.
Es gibt sechs grundlegende Tests, auf die man sich international für das Screening von Chemikalien mit hohem Produktionsvolumen (HPV-Chemikalien) bezüglich der Toxizität geeinigt hat. Die Tests, denen im Rahmen des Screening-Informationsdatenset-Programms der Organisation für Wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung zugestimmt wurden (OECD/SIDS), umfassen Folgende: akute Toxizität; chronische Toxizität; die Entwicklung/Reproduktion beeinflussende Toxizität; Mutagenität; Ökotoxizität und das Schicksal in der Umwelt. Einige dieser Tests beruhen auf Tiermodellen, in denen das Tier getötet werden muss, um die Toxizitätsdaten zu erhalten. Die hierin beschriebenen transgenen Tiere sind nützlich für Toxizitätstests und umgehen die Notwendigkeit eines Models, in dem „Tod ein Endpunkt" ist.
Dementsprechend bietet die Verwendung transgener Tiere der vorliegenden Erfindung zur Evaluierung der Toxizität eine menschlichere Art und Weise des Toxizitätstestens. Weiters können, da „Tod als Endpunkt" nicht immer notwendig ist, bei der Verwendung transgener Tiere, die die Reporterexpressionskassetten der vorliegenden Erfindung in sich tragen, die mit Toxizitätstests an lebenden Tieren assoziierten Kosten wahrscheinlich reduziert werden.
Die „Chemical Hazard Data Availability Study" (Verfügbarkeitsstudie über Daten chemischer Gefahr) der EPA fand große Lücken in jenen grundlegenden Informationen, die der Öffentlichkeit leicht zugänglich sind. Die meisten Konsumenten nehmen an, dass grundlegende Toxizitätstests erhältlich sind und dass alle Chemikalien, die sich heutzutage im Handel befinden, sicher sind. Eine kürzlich durchgeführte EPA-Studie fand heraus, dass es sich dabei nicht um eine vernünftige Annahme handelt. Die EPA untersuchte die öffentlich zugänglichen Daten über diese Chemikalien und fand heraus, dass die meisten von ihnen nie getestet worden sein könnten, um ihre Toxizität auf Menschen oder die Umwelt zu bestimmen. Die EPA kann nicht beginnen, die Gefahren und Risiken von HPV-Verbraucher-Chemikalien ohne grundlegende Informationen zu bewerten, und tatsächlich werden weitaus ausführlichere und umfassendere Tests benötigt, um diese Chemikalien mit hohem Aussetzungsgrad zu bewerten (http://www.epa.gov/opptintr/chemrtk). Es liegt auf der Hand, dass die Unternehmen mehr tun müssen, um sich dieses Problems anzunehmen.
SIDS-Tests messen die Toxizität einer Chemikalie nicht vollständig. Die Tests stellen nur eine minimale Informationsreihe bereit, die verwendet werden kann, um die relativen Gefahren von Chemikalien zu bestimmen und um zu bewerten, ob zusätzliche Tests erforderlich sind. Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung stellen jedoch Modelle für In-vivo-Toxizitätstests bereit, die die vorhandenen Informationen über die Gefahren dieser Chemikalien und ihrer Metaboliten stark ausweiten können.
OSHA legt zulässige Aussetzungslimits (PELs) für gefährliche Chemikalien am Arbeitsplatz fest. Es erscheint vernünftig, zu erwarten, dass Chemikalien mit PELs ausführlich getestet wurden, zumindest bezüglich ihrer Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit. Sogar Chemikalien mit hohem Volumen mit PELs weisen jedoch signifikante Datenlücken im Teil über die menschliche Gesundheit der grundlegenden Screeningtestreihe auf. Nur 53 % dieser Chemikalien mit hohem Volumen mit PELs besitzen grundlegende Screeningtests für alle vier der menschlichen Gesundheits-Endpunkte. Im Gegensatz dazu besaßen nur 5 % der nicht-PEL-getesteten HPV-Chemikalien alle vier Gesundheitswirkungstests, und für 49 % waren keine Gesundheitstestdaten erhältlich (httpa/www.epa.gov/opptintr/chemrtk). Daher fehlen dem Großteil der HPV-Chemikalien ohne PELs sogar jene minimalen Daten, die erforderlich sind, um die Entwicklung eines PEL-Werts zum Schutz von Arbeitern zu unterstützen. Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung stellen Mittel zum Testen der Toxizität bereit, die spezifische In-vivo-Daten bezüglich der Toxizität bereitstellen, und zwar nicht nur der Chemikalien selbst, sondern auch der Metaboliten dieser Chemikalien.
Schlussendlich sind Chemikalien, die sich in Verbraucherprodukten befinden, ein wichtiges Problem aufgrund der Wahrscheinlichkeit, dass Kinder und andere empfindliche Bevölkerungsgruppen (z.B. schwangere Frauen und Individuen, deren Gesundheit kompromittiert ist) diesen ausgesetzt werden. Obwohl die chemische Industrie grundlegende Tests für mehr dieser Chemikalien durchgeführt hat als dies bei anderen HPV-Chemikalien der Fall ist, wäre doch eine vollständigere Evaluierung der In-vivo-Toxizität unter Verwendung der transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung wünschenswert. Hinsichtlich des großen Aussetzungspotentials von Verbraucherprodukten werden bedeutend größere Mengen an Tests benötigt, um die Risiken solcher Chemikalien zu bewerten. Die hierin beschriebenen transgenen Tiere helfen dabei, dieser Notwendigkeit gerecht zu werden.
In einem verwandten Aspekt der vorliegenden Erfindung können die hierin beschriebenen transgenen Tiere verwendet werden, um die In-vivo-Wirkungen von endokrinen Disruptoren (ED) zu evaluieren. EDs sind typischerweise Chemikalien, die die normale Funktion des endokrinen Systems stören (unter anderem etwa viele Pestizide und Düngemittel). Die steigende Notwendigkeit für eine Evaluierung von HPV und potentieller endokriner Disruptoren, sowohl hinsichtlich des öffentlichen Interesses als auch bezüglich der Testmandate der US-Bundesregierung, kann wahrscheinlich durch die transgenen Tiere und die begleitenden Verbindungs-Screeningverfahren der vorliegenden Erfindung abdeckt werden.
Unten stehend werden verschiedene Klassen stressbezogener Gene und Promotoren davon ausführlich beschrieben. Kontrollelemente (z.B. Promotoren und/oder Expressionsregulationselemente), die von den Genen von Interesse abstammen, sind operabel an eine kodierende Sequenz eines lichterzeugenden Proteins, z.B. Luciferase, gebunden. Beispiel-Gene und Regulationselemente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: Stickstoffoxidsynthetase (NOS) – Immunologisches NOS (iNOS), Neuronales NOS (nNOS), Endothel-NOS (eNOS); Cytochrom P450 (10) – 2D5, 2C19, 3A2, 3A4, 2C9, 2B1, 2B4, 2E1, 1A1, 4A2; N-Acetyltransferase (NAT) – NAT1, NAT2; S-Methyltransferase – TMT, TPMT; Flavinhältige Monooxygenase (FMO) – FMO1, FMO2, FMO3, FMO4, FMO5; Cyclooxygenase (COX) – COX-1 (konstitutiv), COX-2 (induzierbar); Hitzeschockprotein (HSP) – HSP 23, HSP 70; apoptosebezogen – bak, p21, bax; Monaminoxidase (MO) – MAO A, MAO B; Glutathion-S-Transferase (GST) – GSTa, GSTm, GSTp, GSTs, GSTq; UDP-Glucuronyltransferase (UGT) – UGT1, UGT2; S-Methyltransferase (MT) – Thiol-MT (MT), Thioether-S-MT (TEMT), Thiopurin-MT (TPMT); Alkoholdehydrogenase (ADH) – ADH1, ADH2, ADH3, ADH4, ADH5, ADH6, ADH7; Aldehyddehydrogenase (ALDH) – Klasse-1-ALDH, Klasse-2-ALDH, Klasse-3-ALDH; morphogenetisches Knochenprotein (BMP) – BMP-4; und endokriner Disruptor – Östrogenreaktionselement (ERE), Progesteron-RE (PRE), Androgen-RE (ARE), Thyroidhormon-RE (THRE), Gonadotropin-RE (GnRE).
Unten stehend werden verschiedene Klassen stressbezogener Gene und die Promotoren/Kontrollelemente dieser ausführlich beschrieben.
2.1.2 Biochemische Stoffwechselwege
In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Testsysteme zum Studium der Wirkung eines Analyten auf einen biochemischen Stoffwechselweg (z.B. Mehrschritt- und verzweigte Stoffwechselwege). Kontrollelemente (z.B. Promotoren und/oder Expressionsregulationselemente), die von verschiedenen Genen im ausgewählten Stoffwechselweg abstammen, sind operabel an eine für Luciferase kodierende Sequenz gebunden. In einer Ausführungsform ist jedes Gen an eine Luciferase einer unterschiedlichen Wellenlänge gebunden, und jedes Konstrukt wird danach in ein ganzes Tier oder in Zellen eingeführt. Ein geeignetes Substrat für das Reportergenprodukt wird einem Tier oder Zellen zusätzlich zu einem Analyten von Interesse verabreicht. Die Reihenfolge der Verabreichung dieser beiden Substanzen kann empirisch für jeden Analyten von Interesse bestimmt werden. Die Induktion der Expression, die durch ein beliebiges der Kontrollelemente vermittelt wird, wird danach in den Zellen oder mittels nicht invasiver Bildverfahren unter Verwendung des ganzen Tiers evaluiert.
2.1.3 Tiermodelle für Krankheitszustände
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso Testsysteme zum Studium einer großen Bandbreite von physiologischen Funktionen bereit. Daher sind die hierin beschriebenen Testsysteme zusätzlich zu den Toxikologiestudien nützlich, um Schmerz, Entzündung, Apoptose, Angiogenese, Entwicklungsdefekte, Onkogenese und spezifische Erkrankungszustände zu studieren (z.B. durch Kreieren von Tiermodellen). Es wurden zahlreiche Gene, die mit allen dieser Stoffwechselwege und Funktionen assoziiert werden, identifiziert. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen werden die Kontrollelemente des bekannten Gens von Interesse operabel an eine für eine Luciferase kodierende Sequenz gebunden, um eine Expressionskassette herzustellen, die eine Beobachtung der Expression des Gens von Interesse ermöglicht. Weiters ermöglicht Luciferase auch die In-vivo-Beobachtung der Genexpression, z.B. als Reaktion auf die Verabreichung eines Analyten von Interesse, in transgenen Säugetieren, die unter Verwendung der Expressionskassette erschaffen wurden.
2.1.4 Weitere Tiermodell-Testsysteme
Die vorliegende Erfindung ist ebenso nützlich bei der Entwicklung von Testsystemen, bei denen die Identität des Gens von Interesse unbekannt ist. In solchen Fällen kann das Gen von Interesse durch eine Reihe an Stoffwechselwegen identifiziert werden. Um z.B. Gene zu identifizieren, die mit spezifischen Erkrankungen assoziiert sind, wie z.B. Infektionen, wird RNA aus von der Krankheit betroffenen Zellen isoliert (z.B. Wirtszellen, die mit einem infektiösen Agens, wie z.B. Chlamydia, infiziert waren). Diese RNA wird danach in cDNA umgewandelt und im Vergleich zu einer normalen, nicht erkrankten Kontrollprobe gescreent, z.B. unter Verwendung von Chip-Arrays. Dies ermöglicht eine Identifikation der Transkripte, die in den betroffenen Zellen hinaufreguliert oder überexprimiert werden. Kontrollelemente, die mit den überexprimierten Transkripten assoziiert sind, werden danach identifiziert, und die Kontrollelemente werden operabel an für Luciferase kodierende Sequenzen gebunden. Wie oben beschrieben, wird ein geeignetes Substrat und ein Analyt von Interesse verabreicht, und die Expression der Luciferasen wird beobachtet.
2.1.5 Ziel-Validierung unter Verwendung von Tiermodell-Testsystemen
Zwei Hauptgründe, warum die meisten Wirkstoffe bei dem Schritt von In-vitro-Studien hin zur Anwendung an Tieren versagen, sind die Folgenden: (a) das für das Screening ausgewählte Ziel (z.B. ein ausgewählter Zelltyp, der in Kultur gehalten wird, oder die Wirkung der Expression eines ausgewählten Gens) war prognostisch nicht so hilfreich bezüglich der In-vivo-Wirkungen wie ursprünglich angenommen; und (b) die Toxizität des zu testenden Wirkstoffs war im System eines ganzen Tiers inakzeptabel, und die Toxizitätswirkungen waren im In-vitro-Studiensystem nicht zu sehen oder wurden unterschätzt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, ein/mehrere Reportergene) mit einer Funktion zu korrelieren, d.h. Detektion des Reporters korreliert mit der gewünschten Zielwirkung (wie z.B. Toxizität) im Tier.
Die Biochemie des Metabolismus fremder Verbindungen und die einzelnen Rollen, die von Cytochrom-P450-(CYP-) Enzymen in diesem Metabolismus gespielt werden, sind wichtige Bereiche molekularer Pharmakologie und Toxikologie. Ziel-Validierung spezifischer Stoffwechselwege, die von einem lebenden Tier im Metabolismus solcher Verbindungen verwendet werden, ist ein Vorteil der transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung. Die hierin beschriebenen transgenen Tiere stellen einen wichtigen Fortschritt dar in der Fähigkeit, die Wirkungen fremder Verbindungen in vivo zu evaluieren. In einem Aspekt ermöglichen die hierin beschriebenen transgenen Tiere die Evaluierung der Mechanismen, durch die z.B. Xenochemikalien die Expression hepatischer P450-Enzyme induzieren. Beispiel-Gene, aus denen Promotor- und weitere Kontrollelemente abgeleitet werden können, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: Mitglieder der Kernrezeptor-Überfamilie (z.B. PXR, Pregnenolon-X-Rezeptor; PPAR, aktivierter Peroxisomproliferationsrezeptor, unter anderem α-, β- und γ-Isotypen; sowie RXR, retinoider X-Rezeptor); Gene, die in hepatische Gluconeogenese involviert sind (z.B. PEPCK, Phosphoenolpyruvatcarboxykinase-Gen); andere Kernrezeptoren (z.B. LXR und FXR, die jeweils durch Oxysterole und Gallensäure aktiviert werden); und hepatische P450s (z.B. CYP2, CYP3 und CYP4). Weiters gehören alle fünf im Moment bekannten P450-Regulationskernrezeptoren derselben Kernrezeptor-Genfamilie an (NR1). Diese Rezeptoren haben einen gemeinsamen Heterodimerisationspartner, retinoiden X-Rezeptor (RXR) und unterliegen gegenseitigen Wechselwirkungen mit anderen Kernrezeptoren und anderen intrazellulären Signalwegen, unter anderem jene, die von gewissen Zytokinen und Wachstumsfaktoren aktiviert werden.
Promotoren und andere Regulationselemente, die von diesen Genen abgeleitet werden (z.B. stromauf gelegene Regulationsregionen der verschiedenen hepatischen p450s oder RXR-hältige Regionen), sind jeder/jedes einzeln operabel an einen Reporter, z.B. ein lichterzeugendes Protein, gebunden, um Expressionskassetten zu er zeugen. Eine Gruppe solcher p450-verwandter Expressionskassetten kann als Toxizitätsevaluierungs-Expressionskassettengruppe benannt werden. Diese Expressionskassetten werden anschließend verwendet, um z.B. ein transgenes Tier oder eine Kohorte an Tieren zu erschaffen. In einer Ausführungsform kann ein Tier mehrere Expressionskassetten enthalten (z.B. Expressionskassetten, die Promotoren/Regulationselemente aus hepatischen p450s CYP2, CYP3 und CYP4 enthalten). Andernfalls kann eine Kohorte an Tieren erschaffen werden, in der jedes Tier eine solche Expressionskassette oder verschiedene Kombinationen an Expressionskassetten enthält. Solche Tiere werden dann verwendet, um Verbindungen von Interesse zu screenen (z.B. Xenochemikalien) und um herauszufinden, welche Gene als Reaktion auf die Verabreichung der Verbindung in einem lebenden transgenen Tier aktiviert (oder reprimiert) werden. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifikation spezifischer Stoffwechselweg-Aktivierungen) als Reaktion auf z.B. eine ausgewählte Xenochemikalie, die ein Mittel der Ziel-Validierung spezifischer Stoffwechselwege bereitstellt, die von einem lebenden Tier im Metabolismus solcher Verbindungen verwendet werden (z.B. bevorzugte Induktion von CYP2 in Bezug auf CYP3 und CYP4). Zwei wichtige Vorteile der transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung sind die Tatsachen, dass Tod nicht der Evaluationspunkt ist (wie dies bei der Bestimmung einer LD50 der Fall ist) und dass die Tiere sowohl für das Testen anderer Konzentrationen derselben Verbindung als auch anderer Verbindungen nach der Clearance der ersten Verbindung erneut verwendet werden können. Dementsprechend stellen diese transgenen Tiere humanere Testverfahren sowie auch Kosteneinsparungen bereit.
Ein weiteres Beispiel der Ziel-Validierung kann die Markierung von Stoffwechselwegen umfassen, die in das Fortschreiten oder die Termination einer Infektionskrankheit involviert sind. Ein transgenes Tier der vorliegenden Erfindung kann z.B. wie folgt drei Expressionskassetten enthalten: Expressionsregulationssequenzen, die von einem α-Interferon-Gen abstammen, das operabel an kodierende Sequenzen für ein erstes lichterzeugendes Protein gebunden ist; Expressionsregulationssequenzen, die von einem β-Interferon-Gen abstammen, das operabel an kodierende Sequenzen für ein zweites lichterzeugendes Protein gebunden ist; und Expressionsregulations sequenzen, die von einem γ-Interferon-Gen abstammen, das operabel an kodierende Sequenzen für ein drittes lichterzeugendes Protein gebunden ist; worin die drei lichterzeugenden Proteine Licht in drei verschiedenen Wellenlängen emittieren. Ein infektiöses Agens (z.B. Chlamydia) wird der Maus verabreicht, und die relativen Aktivierungsspiegel (oder Repressionsspiegel) der verschiedenen Interferon-Regulationssequenzen werden evaluiert (siehe unten).
Als Reaktion auf die Verabreichung des infektiösen Agens wird z.B. beobachtet, dass die Produktion von γ-Interferon induziert wird (d.h. die Produktion des mit den γ-Interferon-Regulationselementen assoziierten lichterzeugenden Proteins wird beobachtet). Dies deutet darauf hin, dass ein „Ziel" des infektiösen Agens die Induktion von γ-Interferon ist. Um vom infektiösen Agens beeinträchtigte Ziel-Stoffwechselwege weiter zu validieren, können zusätzliche Mäuse verwendet werden. In diesem Beispiel können solche zusätzlichen Mäuse einzelne transgene Mäuse oder Kohorten transgener Mäuse mit Expressionskassetten umfassen, die Regulationssequenzen einer Reihe an Genen besitzen, die der γ-Interferon-Regulierung oder -Produktion unterliegen oder mit dieser in Bezug stehen. Solche Expressionskassetten können z.B. Promotoren und/oder Regulationssequenzen umfassen, die von den folgenden Genen abstammen: CD95 (Fas); CD95-Ligand (Fas-L); Klasse-II-Haupt-Histokompatibilitätskomplex; B7-1; induzierbares Protein 10 (IP-10); und induzierbare Stickstoffoxidsynthase (iNOS). Auf diese Art können spezifische Stoffwechselwege, die vom infektiösen Agens beeinträchtigt werden, identifiziert werden.
Ein weiteres Beispiel der Stoffwechselweg-Markierung, die zur Ziel-Validierung in einem lebenden Tier verwendet werden kann, ist eine Gruppe an Expressionskassetten, die angeordnet ist, um eine Reihe an verschiedenen Stoffwechselwegen darzustellen, die gewöhnlich in die Pathogenese infektiöser Agenzien involviert sind (z.B. Chlamydia oder Trypanosome). Solch eine Gruppe an Expressionskassetten kann z.B. Promotoren und/oder induzierbare (oder reprimierbare) Regulationssequenzen umfassen, die in die Expression der folgenden Genen involviert sind: unmittelbares frühes Gen c-fos (ein Indikator der zellulären Aktivität); Tumornekrosefaktor α (TNF- α); Interleukin 6 (IL-6, ein beispielhaftes Pro-Entzündungs-Zytokin); inhibitorischer Faktor Kappa B α (I-Kappa-B-α-B, ein Indikator der Kernfaktor-Kappa-B-Aktivität, der Transkriptionsfaktor zahlreicher Pro-Entzündungs-Moleküle); Interleukin 12 (IL-12); Makrophagen-Entzündungsprotein 2 (MIP-2); und induzierbare Stickstoffoxidsynthetase (iNOS). Wie hierin beschrieben, können solche Regulationssequenzen operabel an lichterzeugende Proteine gebunden sein, die Licht in unterschiedlichen Wellenlängen (typischerweise wenn mehrere Expressionskassetten verwendet werden, um ein einzelnes transgenes Tier zu erschaffen) oder ähnlichen Wellenlängen emittieren (typischerweise wenn die Expressionskassetten verwendet werden, um Kohorten an Tieren zu erschaffen). Die mit einem oder mehreren solcher Regulationselement(e) assoziierte Lichtproduktion kann einen Ziel-Stoffwechselweg anzeigen.
2.2.0 Vorteile
Vorteile der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, (i) das Erhalten von In-vivo-Informationen über biochemische Stoffwechselwege und physiologische Funktionen, sowohl für charakterisierte als auch für nicht charakterisierte Gene; (ii) das Erhalten von In-vivo-Informationen über den molekularen Schaden, der toxischen Wirkungen zugrunde liegt, wodurch die Verlässlichkeit der Labor-Toxikologiestudien verbessert wird, (iii) das Erhalten von Testsystemen, um die Genexpression und die Wirkstoffentwicklung für spezifische Krankheiten, wie z.B. Chlamydia, zu studieren; (iv) das Vorhandensein von Toxinen und/oder toxinverwandtem Zellschaden (hervorgerufen durch Aussetzung gegenüber einem Toxin oder toxischem Stress) kann wirksam charakterisiert und beobachtet werden; (v) Hilfe bei der Bestimmung der Level eines Analyten, die wirksam sind und von einem Tier toleriert werden können, (vi) das Prognostizieren der Wirkstoffwirksamkeit und der Toxizität bei Menschen, und (vii) das Bereitstellen der Mittel für eine Untersuchung sowohl der Wirkungen eines bestimmten Analyten als auch der Wirkungen von Spalt- oder Modifikationsprodukten, die in vivo nach der Verabreichung des Analyten gebildet werden.
3.0.0 Expressionskassetten
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Reportergenexpressionskassetten unter Verwendung von Kontrollelementen (z.B. Promotoren) konstruiert, die aus einem Gen oder Gruppen von Genen ausgewählt sein, deren Expression bekannterweise mit einem bestimmten biochemischen Stoffwechselweg oder einer physiologischen Funktion assoziiert wird. In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Gruppe (oder ein Array) an Expressionskassetten geschalten. Ein Array an Expressionskassetten z.B. kann für die Evaluierung der Toxizität einer ausgewählten Verbindung geschalten werden oder für das Erschaffen eines Krankheitsmodells in einer Maus/Mäusen.
Die Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung können in Gruppen zusammengefasst werden, z.B. eine Gruppe von zumindest zwei, vorzugsweise drei, noch bevorzugter vier oder mehr (typischerweise bis zu zehn und meist nicht mehr als 15 – 50). Solche Gruppen werden typischerweise nach dem Gen-Typ geordnet, von denen die Kontrollelemente, die in der Erschaffung der Expressionskassetten verwendet werden, abstammen. Hierin werden Gruppen von Genen beschrieben, und diese umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: stressinduzierbare Gene; apoptoseverwandte Gene; angiogeneseverwandte Gene; entzündungsverwandte Gene; Gene, deren Expression in einem Wirt als Reaktion auf ein infektiöses Agens induziert wird; onkogeneseverwandte Gene; und entwicklungsbezogene Gene. Solche Gruppen an Expressionskassetten können in einzelne oder mehrere Tiere eingeführt werden. Weiters können Tiere Expressionskassetten enthalten, die mit einer oder mehreren Gruppen in Bezug stehen. In dieser Ausführungsform können die verschiedenen Gruppen z.B. in ihren Expressionskassetten jeweils kodierende Sequenzen für ein lichterzeugendes Polypeptid enthalten, das Licht in unterschiedlichen Wellenlängen emittiert (dementsprechend kann die Expression der Reporterkassetten im Tier mit ihrer entsprechenden Gruppe identifiziert werden). Die Verwendung von lichterzeugenden Polypeptiden, die Licht in unterschiedlichen Wellenlängen emittieren, ist jedoch nicht notwendig, und ein einzelnes, lichterzeugendes Polypeptid kann z.B. in transgenen Tieren verwendet werden, die für anfängliche kann z.B. in transgenen Tieren verwendet werden, die für anfängliche Screenings verwendet wurden.
Die Gruppen an Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung können ebenso zu einem Set zusammengestellt werden. Solche Sets können weiters Behälter, Anweisungen und die Expressionskassetten umfassen, die die in einem oder mehreren Vektoren) platzierte Gruppe umfassen, die für Transformations- oder Transfektionsverfahren nützlich sind (z.B. Vektor(en), der/die für die Transfektion von ES-Zellen nützlich ist/sind).
3.1.0 Konstruktion von Reporterexpressionskassetten
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Reportergenexpressionskassetten unter Verwendung von Kontrollelementen konstruiert, die aus einem Gen oder Gruppen von Genen ausgewählt sind, deren Expression bekannterweise mit einem bestimmten biochemischen Stoffwechselweg oder einer physiologischen Funktion assoziiert wird. Die Kontrollelemente können z.B. stressinduzierbare Kontrollelemente sein, die aus einem Gen oder Gruppen von Genen ausgewählt sind, die mit zellulärem Stress oder Toxizität assoziiert werden. Die Toxizität kann daher in vivo durch Analyse der Expression des Reportergens beobachtet werden. Zusätzlich können die Kontrollelemente aus einem Gen oder Gruppen von Genen ausgewählt sein, die mit einem biochemischen Stoffwechselweg oder einer physiologischen Funktion assoziiert werden (z.B. Schmerz/Entzündung, Infektion, Karzinogenese, Angiogenese, Entwicklung oder dergleichen).
Jedes Gen wird von einem einzigartigen Promotor gesteuert. Gene, die auf einen bestimmten Stimulus (z.B. Stress, Infektion) reagieren, können jedoch in ihren Promotoren ein gemeinsames Antwortelement (CRE) enthalten oder, assoziiert mit ihren Promotoren, Regulations- oder Kontrollsequenzen, die in die Regulation der Expression des Gens (z.B. Induktion oder Repression) involviert sind. In einem Aspekt, nach dem Aussetzen der Zellen gegenüber einem bestimmten Stimulus, sind die Wirkungen der Transkriptionsfaktoren auf CREs für die Induktion der Expression der Sammlung der Gene verantwortlich, die das CRE von Interesse aufweisen. CREs (oder andere Regulations- oder Kontrollelemente, die mit einem ausgewählten Gen assoziiert sind) können isoliert werden (z.B. durch synthetisches Herstellen der Sequenz oder durch Polymerasekettenreaktionsamplifikation aus einer Matrize; K.B. Mullis, US-Patent Nr. 4.683.202, ausgegeben am 28. Juli 1987; K.B. Mullis et al., US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987) und operabel an einen minimalen Promotor und ein Reportergen gebunden sein. In diesem Fall verleihen die Regulations-(oder Kontroll-)Sequenzen dem Konstrukt Reaktionsfähigkeit, d.h. der als Ganzes genommene Promotor funktioniert wie ein Promotor, der aus einem ausgewählten Gen stammt.
Das Kontrollelement (z.B. ein Promotor) kann aus derselben Spezies stammen wie das transgene Tier (z.B. Maus-Promotor, der im Konstrukt verwendet wird, um eine transgene Maus zu erschaffen), aus einer anderen Spezies (z.B. menschlicher Promotor, der im Konstrukt verwendet wird, um eine transgene Maus zu erschaffen) oder ein gemischtes Kontrollelement sein (z.B. einige Kontrollelemente aus einem Maus-Promotor, kombiniert mit einigen Kontrollelementen aus einem menschlichen Promotor). Das Kontrollelement kann aus einem beliebigen Gen von Interesse durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren abgeleitet werden (z.B. PCR unter Verwendung von Primern, die die Kontrollsequenz von Interesse flankieren). In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Promotor von einem Gen abgeleitet, dessen Expression während der Angiogenese induziert wird, z.B. pathogene Angiogenese, wie z.B. Tumorentwicklung. Wenn sich daher ein Tumor in einem transgenen Tier zu entwickeln beginnt, das ein Vektorkonstrukt der vorliegenden Erfindung in sich trägt, so wird der Promotor induziert, und das Tier exprimiert z.B. Luciferase, die dann in vivo beobachtet werden kann.
Beispiele für Promotoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gedacht sind, werden ausgewählt, sodass sie in einem Zelltyp und/oder Tier, in den/das sie eingeführt werden, funktionell sind.
Regulations- (oder Kontroll-) Sequenzen können aus einem Gen von Interesse durch Verfahren erhalten werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Z.B. kommerzielle Datenbanken (z.B. ENTREZ und GENBANK – National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; EMBL – The European Bioinformatics Institute, Hinxton, UK, http://www.ebi.ac.uk/) und zeitgenössische wissenschaftliche Literatur (MEDLINE B The National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD, http://nlm.nih.gov/) können nach Informationen über ein ausgewähltes Gen (z.B. iNOS) durchsucht werden, unter anderem nach Kodierungsorten und Regulationssequenzen. Alternativ dazu sind Verfahren zur Identifikation von Regulationssequenzen, die mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, auf dem Gebiet der Erfindung bekannt, z.B. Deletionsanalyse oder PCR-Amplifikation von Fragmenten, die von nicht kodierenden 5'-Regionen eines ausgewählten Gens abstammen, wo diese Fragmente danach operabel an ein Reportergen gebunden werden, um Regulations- (oder Kontroll-) Sequenzen zu identifizieren. Diese Reportergene mit assoziierten Regulationssequenzen können z.B. in kultivierten Zellen gescrennt werden.
Reporterexpressionskassetten, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können unter Verwendung eines beliebigen Kontrollelements von Interesse konstruiert werden, das operabel an geeignete für Reportergene kodierende Sequenzen gebunden ist. Die Expressionskassetten können entweder direkt verwendet werden oder in einer beliebigen Anzahl an Vektoren platziert werden, um Zellen mit der Expressionskassette stabil oder vorübergehend zu transfizieren. Zusätzlich dazu kann die Expressionskassette entweder direkt zur Erschaffung transgener Tiere verwendet werden oder in eine beliebige Anzahl an Vektoren platziert werden, die für die Erschaffung transgener Tiere nützlich ist. Diese Tiere (Testtiere) können danach verwendet werden, um die In-vivo-Wirkungen eines ausgewählten Analyten (z.B. eines Wirkstoffs von Interesse) auf die durch das/die ausgewählte(n) Kontrollelemente) vermittelte Expression zu untersuchen.
Die Konstruktion solcher Expressionskassetten verwendet, gemäß der Lehren der vorliegenden Beschreibung, Verfahren, die auf dem Gebiet der Molekularbiologie wohlbekannt sind (siehe z.B. Ausubel oder Maniatis). Vor der Verwendung der Expressionskassette zur Erschaffung eines transgenen Tiers kann die Reaktionsfähigkeit der Expressionskassette auf den Stress-Induktor, der mit ausgewählten Kontrollelementen assoziiert ist, durch Einführen der Expressionskassette in eine geeignete Zelllinie (z.B. Primärzellen, transformierte Zellen oder immortalisierte Zelllinien) getestet werden.
Die Kontrollelemente der Gene von Interesse sind operabel an Reportergene gebunden, um chimäre Gene zu erzeugen (z.B. Reporterexpressionskassetten), die verwendet werden, um transgene Tiere zu erzeugen (z.B. Mäuse). Diese transgenen Tiere können danach wie hierin beschrieben als Testtiere dienen. Induktion, Repression oder ein beliebiger Zustand der Expression dieser Reportrexpressionskassettengene können unter Verwendung nicht invasiver Bildverfahren evaluiert werden.
Verschiedene, hierin beschriebene Formen der verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung können kombiniert werden.
3.1.1 Kontrollelemente, die von stressinduzierbaren Genen abstammen
Viele stressinduzierbare Gene wurden identifiziert, sequenziert und analysiert. Informationen über stressbezogene Kontrollelemente sind leicht erhältlich. Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung werden stressbezogene Kontrollelemente ausgewählt und operabel an eine kodierende Sequenz eines Reportergens gebunden, was zu der Erzeugung chimärer Gene führt, in denen die kodierenden Sequenzen des Reportergens (z.B. Sequenzen, die für ein lichterzeugendes Polypeptid kodieren, wie z.B. Luciferase) der Regulation unterliegen, die durch die stressbezogenen Kontrollelemente bereitgestellt wird.
Prokaryotische und eukaryotische Zellen verwenden sensorische und Signalsysteme, um Informationen von ihrer Umgebung zu erhalten und weiterzugeben, um zelluläre Funktionen anzupassen. Externe Faktoren, die solche molekularen Kommunikationsvorgänge auslösen, umfassen Nährstoffe, Ionen, Wirkstoffe und andere Verbin dungen sowie physikalische Parameter (z.B. Temperatur). „Stress", der auf Zellen ausgeübt wird, kann typischerweise als eine beliebige Störung der normalen Wachstumsbedingungen einer Zelle angesehen werden und kann jede beliebige Abweichung von optimalen Wachstumsbedingungen umfassen.
Die Reaktion auf Hitzeschock z.B. wurde ausgiebig untersucht (W.H. Mager und A.J. Kruijff, Microbiol. Rev. 59 (3), 506-531 (1995); C. Hunt und R. Morimoto, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 6455-6459 (1985)). Sich häufende Beweise deuten darauf hin, dass die Expression von Hitzeschockproteinen in einer Reihe an Erkrankungszuständen eine Rolle spielt, unter anderem bei Entzündung und Ischämie (S. Leppa und L. Sistonen, Ann. Med. 29 (1), 73-78 (1997)). Die Hitzeschockantwort zielt hauptsächlich auf Folgendes ab: (i) Schutz und Reparatur von zellulären Bestandteilen und (ii) teilweise auf den Erwerb einer Toleranz gegenüber Hitze.
Weiters induzieren Hitzebelastungsbedingungen eine allgemeine Antwort, die auch bei anderen metabolisch nachteiligen Umständen häufig auftritt, die zu physiologischen Störungen führen (z.B. osmotischer oder oxidativer Stress). Die Induktion der Genexpression als Reaktion auf eine Forderung durch Stress wird von der Zelle hauptsächlich durch Transkriptionsfaktoren durchgeführt, durch ihre zugehörigen Promotorelemente und durch die Modulation der Aktivität der Transkriptionsfaktoren bezüglich der Übertragung der Stresssignale. Bezüglich der hitzeschockinduzierten Expression sind sehr viele Informationen sowohl für prokaryotische als auch für eukaryotische Organismen erhältlich.
Zusätzlich dazu wurde eine große Anzahl anderer stressinduzierbarer Gene charakterisiert. Diese Gene können im Großen und Ganzen in fünf Gruppen eingeteilt werden, und zwar hinsichtlich der Art des Stresses, der mit der Induktion der Genexpression assoziiert wird: inter- und intrazelluläres Potential; DNA-bezogen; proteinbezogen; energiebezogen und membranbezogen. Stressinduzierbare Kontrollelemente wurden in der Literatur ausgiebig charakterisiert, und Sequenzen einiger beispielhafter Kontrollelemente wurden von Farr et al., (US-Patent Nr. 5.811.231, ausgegeben am 22. September 1998), S. Lindquist (US-Patent Nr. 5.827.685, ausgege ben am 27. Oktober 1998), J. Kowalksi et al. (US-Patent Nr. 5.733.745, ausgegeben am 31. März 1998) und MacGregor et al. (Fundamental and Applied Toxicology 26, 156-173 (1995)) zusammengefasst. Sequenzen ausgewählter Kontrollelemente, die mit stressinduzierter oder schadensbezogener Expression assoziiert werden, können ebenso aus Sequenzdatenbanken erhalten werden (z.B. GENBANK oder ENTREZ, National Center for Biotechnology Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD, US).
Nun folgen Beispiele stressinduzierter Promotoren, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind.
3.1.1.1 Kontrollelemente stressbezogener Gene, die mit DNA-Funktion, – Replikation und – Reparatur assoziiert sind
DNA-Stress betrifft Änderungen der Desoxyribonucleinsäure oder der Vorläufer-Nucleotide, die zu Stress oder Toxizität für eine Zelle führen. DNA-Stress umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, DNA-Strangbrüche, DNA-Strangvernetzung, DNA-Alkylierung, Aussetzen gegenüber DNA-interkalierenden Agenzien, sowohl verstärkte als auch verringerte Superhelizität und Oxidation oder Alkylierung von Nucleosidtriphosphaten. DNA-Stress kann ebenso auch durch eine Inhibierung der DNA-Synthese, der DNA-Replikation, der Mitose oder Meiose hervorgerufen werden. Weiters kann das Aussetzen gegenüber den folgenden Bedingungen ebenso zu DNA-Stress führen: entzündungsverursachende Agenzien, Wachstumsfaktoren, Tumornekrosefaktor, Tumorpromotoren, Interferone, Phorbolester, hydrophobe cytotoxische Wirkstoffe, Mitogene, Karzinogene, Röntgenstrahlen und UV-Strahlung.
Mit DNA-Stress verbundene Promotoren und Reaktionselemente, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Promotoren der DNA-abhängigen PK, DNA-Reparaturgene, GADD45-, FOS-, XHF- und GADD153-Gene sowie die TRE- und p53RE-Reaktionselemente. Das GADD45-Gen kodiert für ein Wachstumsstillstands- und ein DNA-Protein, das auf Schaden reagiert. Das Gen wird durch UV-Bestrahlung, Röntgenstrahlung und Methylmethansulfonat (MMS) induziert (Q. Zhan et al., Mol. Cell Biol. 13, 4242-4250 (1993)). FOS kodiert für das Onkogen-Protein c-fos. Bestandteile seines Promotors sind DNA-stressempfindlich und werden von Wachstumsfaktoren und Tumorpromotoren induziert (E.M. Haliday, EMBO J. 10, 109-115 (1991); F. van Straaten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3183-3187 (1983)). Das XHF-Gen kodiert für Kollagenase. Das XHF-Gen wird durch Mitogenese, entzündungsverursachende Agenzien, UV-Strahlung und 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA; einen Tumorpromotor) aktiviert (P. Angel et al., Mol. Cell. Biol. 7, 2256-2266 (1987)). Die Expression des GADD153-Gens wird als Reaktion auf DNA-schädigende Agenzien und Signalagenzien, die das Wachstum zum Stillstand bringen, induziert (J.D. Luethy und N.J. Holbrook, Cancer Res. 52, 5-10 (1992); A.J. Fornace et al., Mol. Cell. Biol. 9, 4196-4203 (1989)).
Zusätzlich zu diesen Genen sind einige mit DNA-Stress verbundene Reaktionselemente ebenso bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich, unter anderem TRE und p53RE. TRE ist das TPA-Reaktionselement, das auf DNA-Stress reagiert, der durch Phorbolester induziert wird (P. Angel et al., Cell 55, 875-885 (1988)). p53RE ist das p53-Reaktionselement, das durch Röntgenstrahlen und MMS induziert wird (Q. Zahn et al., Mol. Cell Biol. 13, 4242-4250 (1993)).
3.1.1.2 Kontrollelemente stressbezogener Gene, die mit Proteinschädigung und -änderung assoziiert sind
Schädigung oder Änderung zellulärer Proteine (proteinbezogener Stress) umfasst, ist jedoch nicht eingeschränkt auf, Änderungen von Polypeptiden, Änderungen einzelner Aminosäuren, Oxidation einzelner Aminosäuren, Inhibierung enzymatischer Funktionen, Störungen des intrazellulären Transports von Proteinen, Denaturierung von Proteinen, Vernetzung von Proteinen, Protein-Fehlfaltungen, Chelatbildung von Proteincofaktoren, Oxidation von Inter- und Intra-Polypeptidkettenbindungen (z.B. Disulfidbindungen), Alkylierung von Proteinen und Proteinschädigung (z.B. hervorgerufen durch das Aussetzen gegenüber Schwermetallen oder Hitze).
Kontrollelemente, die auf Proteinschädigung oder -änderungen reagieren (proteinbezogener Stress), sind ebenso bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich. Solche Kontrollelemente umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, jene, die aus den folgenden Genen erhalten werden können: JNK, p38, HO, GRP78, HSP70, MTIIA, JUN und FOS. Das GRP78-Gen kodiert für ein Protein, das ein Hauptbestandteil des endoplasmatischen Retikulums ist. Die Expression des GRP78-Gens wird durch Glykosylierungsblocks und fehlgefaltete Proteine induziert (S.K. Wooden et al., Mol. Cell. Biol. 11, 5612-5623 (1991); E. Resendez et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1212-1219 (1985)). Das HSP70-Gen kodiert für das Nitzeschockprotein 70. Das Gen wird durch Inhibitoren des Energiemetabolismus, Hitze, Aminosäureanaloga, Schwermetalle, Anoxie und denaturierte Proteine induziert (D.D. Mosser et al., Mol. Cell. Biol. 8, 4736-4744 (1988), C. Hunt und R.I. Morimoto, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6455-6459 (1985)). Das Gen MT IIA kodiert für Metallothionein IIA. Die Expression des Gens wird durch Schwermetalle und Glucocorticoide induziert (M. Karin et al., Nature 299, 797-802 (1982)). MT 1A (R.I. Richards et al., Cell 37, 263-272 (1984)) und MT III (R.D. Palmitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6333-6337 (1992)) sind ebenso für Metallothionein kodierende Gene, die durch Cadmium (ein Schwermetall) induziert werden. JUN (oben stehend beschrieben) und FOS (unten stehend beschrieben) enthalten ebenso auf Proteinstress reagierende Elemente, die durch Hitze induziert werden.
3.1.1.3 Kontrollelemente stressbezogener Gene, die mit zellulärem Potential assoziiert sind
Eine Unterbrechung des normalen Reduktions-/Oxidations-Potentials („Redox") einer Zelle führt zu der Expression von Genen, die durch eine Gruppe an Säugetierpromotoren vermittelt werden. Redox oder zellulärer Potentialstress umfasst erhöhte Spiegel an Superoxidradikalen, erhöhte Spiegel an Peroxiden – sowohl Wasserstoffperoxid als auch organische Peroxide -, verringerte Spiegel an Glutathion und jeden anderen Zustand, der das Redox-Potential der Zelle verändert, wie z.B. das Aussetzen gegenüber starken reduzierenden Agenzien, einigen aromatischen Kohlenwasserstoffen, elektrophilen Verbindungen, Aldehyden, intrazellulären Thiolen, Steroiden, Methylcholanthren, Phenobarbital und CCl₄. Der Begriff umfasst ebenso alle zusätzlichen Bedingungen, die eine Proliferation der Peroxisome hervorrufen.
Kontrollelemente, die mit Genen assoziiert sind, die auf zelluläre Potentialstressbelastungen reagieren, können aus einer Reihe an Genen erhalten werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Folgende: HMO, CYP1A1, GST Ya, ALDH1 und JUN.
Das HMO-Gen kodiert für Hämoxygenase. Die Genexpression wird durch Redox-Stress induziert, unter anderem durch oxidativen Stress, Wasserstoffperoxide und Natriumarsenit (S.T. Keyse und R.M. Tyrell, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 99-103 (1989)). Das CYP1A1-Gen kodiert für Cytochrom P450 1A1, ein Enzym, das in den Metabolismus polyzyklischer aromatischer Kohlenwasserstoffe involviert ist. Die Genexpression ist durch aromatische Kohlenwasserstoffe, Pflanzenflavone und Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) induzierbar (L.A. Neuhold et al., Mol. Cell. Biol. 9, 2378-2386 (1989); Y. Fujii-Kuriyama et al., The FASEB J. 6, 706-710 (1992); R.A. Dixon et al., Biol. Rev. 61, 239-241 (1986); K. Sogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (21), 8044-8048 (1986)). Das GST-Ya-Gen kodiert für eine Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit. Der stressempfindliche Teil des GST-Ya-Promotors wird stark durch elektrophile Herbizide, Insektizide und planare aromatische Kohlenwasserstoffe induziert (T.H. Rushmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3826-3830 (1990)). Das ALDH-2-Gen kodiert für Aldehyddehydrogenase. Die Genexpression wird durch Aldehyde und Peroxisom-Proliferatoren induziert (D.W. Nebert, Env. Health Persp. 88, 13-25 (1990); L.C. Hsu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3771-3775 (1985)). JUN ist ein Onkogen, das für c-jun kodiert, das an der Bildung des AP-1-Transkriptions-Aktivatorkomplexes beteiligt ist. Stressbelastungen, die die Expression des JUN-Gens aktivieren, sind Superoxidradikale und UVA-Strahlung (R. De Groot et al., EMBO J. 10, 2523-2532 (1991)).
Zusätzlich zu den oben genannten Genen gibt es bekannte Reaktionselemente, die mit Genen assoziiert sind, die auf zelluläre Potentialstressbelastungen reagieren, un ter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: ThRE, NFkBRE, XRE, RARE, PPRE und ERE.
Das Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE) reagiert auf Stress, der durch das Thyroidhormon und seine Analoga induziert wird (M. Beato, Cell 56, 335-344 (1989)). NFkBRE ist ein Stress-Reaktionselement, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der durch intrazelluläre Thiole aktiviert wird (B. Nelson et al., Molec. Cell. Biol. 8, 3526-3531 (1988); K. Leung und G. Nabel, Nature 333, 776-778 (1988); R. Schreck et al., EMBO J. 10, 2247-2258 (1991)). Das XRE-Stress-Reaktionselement reagiert auf Xenobiotika, wie z.B. aromatische Kohlenwasserstoffe (T.H. Rushmore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3826-3830 (1990)). RARE ist das Retinsäure-Reaktionselement, das auf das Steroidhormon Retinsäure und ihre Analoga reagiert (H. de The et al., Nature 343, 177-180 (1990)). PPRE ist das Peroxisom-Proliferations-Reaktionselement, das durch Peroxisom-Proliferatoren induziert wird (C. Dreyer et al., Cell 68, 879-887 (1992)). ERE ist das Östrogen-Reaktionselement, das auf Stressinduktion durch Östrogenverbindungen reagiert (V. Kumar et al., Cell 55, 145-156 (1988)).
3.1.1.4 Kontrollelemente stressbezogener Gene, die mit Membranen assoziiert sind – Zusammensetzung, Struktur und Funktion
Zelloberflächenrezeptorvermittelte Stressbelastungen verändern typischerweise das Transkriptionsniveau der Gene, deren Expression durch die Wechselwirkung eines Zelloberflächenrezeptors mit einem Ligand reguliert wird. Kontrollelemente, die mit Genen assoziiert sind, die auf zelloberflächenrezeptorvermittelten Stress reagieren, können aus einer Reihe an Genen erhalten werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, IL-1α, IL-1β, TNF-α; G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10 und ICAM-1. Das Interleukin-(IL-) 1-α-Gen kodiert für ein Zytokin. Die Expression des Gens wird durch Lipopolysaccharid (LPS), PMA, Mitogene, andere Zytokine und UVB-Bestrahlung induziert (T.A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95, 1005-1045 (1990); Y. Furutani et al., Nucleic Acids Res. 14, 3167-3179 (1986)). Die Expression des IL-1-β-Gens wird ebenso durch diese Agenzien induziert (J.J. Huang et al., J.
Immunol. 140, 3838-3843 (1988)). Das α-Gen des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF) kodiert für ein Protein, das eine Selbstexpression induzieren kann. Die Expression des TGF-α-Gens wird auch durch IFN-γ induziert (F. Iris et al., Nature-Genetics 3, 137-145 (1993)). Das Tumornekrosefaktor-(TNF-) α-Gen kodiert für ein Protein, das durch IFN-γ und IL-1-α induziert wird (B.J. Nickoloff et al., J. Invest. Dermatol. 94, 151S-157S (1990); D. Semon et al., Nucleic Acids Res. 15, 9083-9084 (1987)). Das Gen des Granulozyten-koloniestimulierenden Faktors (G-CSF) kodiert für ein Protein, dessen Expression durch PMA, Endotoxin und Interferone induziert wird (T.A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95, 100S-104S (1990); S. Nagata et al., EMBO J. 5, 575-581 (1986)). Die Induktion der Expression des Gens des Granulozytenmakrophagen-koloniestimulierenden Faktors (GM-CSF) erfolgt als Reaktion auf dieselben Stimuli wie G-CSF (T.A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95, 100S-104S (1990); S. Miyatake et al., EMBO J. 4, 2561-2568 (1985)). Die Expression des IL-3-Gens wird durch Interferon-(IFN-)γ, PMA und UVB-Bestrahlung induziert (T.A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95, 100S-104S (1990); D.R. Cohen et al., Nucl. Acids Res. 14, 3641-3658 (1986)). Die Expression des IL-6-Gens wird als Reaktion auf andere Zytokine, bakterielle Toxine, Viren, Tumorpromotoren und Natriumlaurylsulphat (SDS) induziert (T. Hunziker et al., Brit. J. Dermatol. 127, 254-257 (1992); T.A. Luger et al., J. Invest. Dermatol. 95, 100S-104S (1990); R. Yasukawa et al., EMBO J. 6, 2939-2945 (1987)). Die Expression des IL-8-Gens wird durch 1L-1-α, Tumornekrosefaktor (TNF-α) und IFN-γ induziert. Die Expression des Gens kann ebenso auch durch Lipopolysaccharide (LPS) und Tumorpromotoren induziert werden (I.C. Oliveira et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9049-9053 (1992); N. Mukaida et al., J. Immunol. 143, 1366-1371 (1989)). Die Expression von IL-10 wird durch Kontaktallergene und Hapten induziert (J.M. Kim et al., J. Immunol. 148, 3618-3623 (1992)). Die Expression des intrazellulären Adhäsionsmolekül-(ICAM-) 1-Gens wird durch Zytokine, Hydrocortison, LPS und PMA induziert (S.W. Caughman et al., J. Invest. Dermatol. 98, 61S-65S (1992); B.G. Stade et al., Immunobiology 181, 851-856 (1990)).
3.1.1.5 Kontrollelemente stressbezogener Gene, die mit zellulären Energie-Stressbelastungen assoziiert sind
Zelluläre Energie-Stressbelastungen umfassen Zustände, die die ATP-Levels in der Zelle oder die Zellmembran-Ionengradienten beeinflussen. Beispiele für Energiestress umfassen Unterbrechungen des Elektronentransports, erzwungenen anaeroben Metabolismus in Gegenwart von Sauerstoff, Depolarisierung von Zellmembranen, das Aussetzen gegenüber Entkopplern, osmotischen Schock, das Aussetzen gegenüber Ionen (z.B. Kalzium oder Natrium) sowie das Aussetzen gegenüber Ethanol.
Kontrollelemente, die mit Genen assoziiert sind, die auf zellulären Energiestress reagieren, können aus einer Reihe an Genen erhalten werden, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, GRP78, FOS, TH, DBH und ODC. GRP78 (oben stehend beschrieben) umfasst ein auf Energie- oder Ionenstress reagierendes Element, das auf Kalzium-Ionophore reagiert. CRE ist das cAMP-Reaktionselement, das auf erhöhte Spiegel an cAMP reagiert – FOS (oben stehend beschrieben) enthält das cAMP-Reaktionselement („CRE") (W.J. Roesler et al., J. Biol. Chem. 263, 9063-9066 (1988)). TH, das für Tyrosinhydroxylase kodiert (A. Lamouroux et al., EMBO J. 6, 3921-3937 (1987)), und DBH, das für Dopamin-β-hydroxylase kodiert (B. Grima, Nature 326, 707-711 (1987)), werden beide durch Membran-Depolarisierung induziert. ODC kodiert für Ornithin-Decarboxylase, und die Expression des Gens wird durch osmotischen Schock induziert (N.J. Hickok et al., DNA 6, 179-187 (1987)).
3.1.2 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in biochemische Stoffwechselwege involviert sind
Wie oben beschrieben, können die bei der Durchführung der Erfindung nützlichen Kontrollelemente von Genen abstammen, deren Polypeptidprodukt bekannterweise in einen bestimmten biochemischen Stoffwechselweg involviert ist. Viele Gene, die in biochemische Wege involviert sind, wurden identifiziert, sequenziert und analysiert. Wenn daher ein Kontrollelement aus einem Gen, das in einen biochemischen Stoff wechselweg von Interesse involviert ist, operabel an eine Sequenz gebunden ist, die für ein lichterzeugendes Protein kodiert (z.B. ein Polypeptid, das für eine Luciferase kodiert), so können die Wirkungen eines Analyten auf die Expression des Gens im Stoffwechselweg von Interesse beobachtet werden.
Zusätzlich dazu kann die Expression mehrerer Gene in einem Stoffwechselweg beobachtet werden, z.B. (1) durch eine operable Bindung eines jeden ausgewählten Kontrollelements an ein Reportergen und durch Einführung der Expressionskassetten in verschiedene Tiere oder (2) durch eine operable Bindung eines jeden ausgewählten Kontrollelements an lichterzeugende Proteine (wie z.B. Luciferasen), die Licht in unterschiedlichen Wellenlängen emittieren. Die Wirkung des Analyten, z.B. wo im Stoffwechselweg er wirkt, kann auf diese Art und Weise bestimmt werden (z.B. durch molekulare Epistasie).
Nicht einschränkende Beispiele biochemischer Stoffwechselwege von Interesse umfassen: Stoffwechselwege zur Produktion von endokrinen Stoffen; Stoffwechselwege zur Produktion von Prostaglandinen; Fettsäure- und/oder Lipid-Biosynthese-Stoffwechselwege; Stoffwechselwege zur Produktion von Sterolverbindungen (z.B. Testosteron und Östrogen); Wirkstoffmetabolismusstoffwechselwege, unter anderem biochemische Reaktionen, die in enzymatische Modifikationen von Proteinen involviert sind. Das für Cytochrom P450 kodierende Gen z.B. ist, wie gezeigt wurde, in den Wirkstoffmetabolismus involviert. Daher können die vom P450-Gen abstammenden Kontrollelemente verwendet werden, um Expressionskassetten zur In-vivo-Beobachtung des Wirkstoffmetabolismus zu konstruieren. Auf ähnliche Art und Weise sind Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die für in Stockstoffoxid-(NO-) Stoffwechselwege involvierte Produkte kodieren, ebenso in der Konstruktion von Expressionskassetten nützlich, die verwendet werden können, um den Wirkstoffmetabolismus zu evaluieren. Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in die N-Acetylierung und S-Methylierung involviert sind, werden ebenso zur Verwendung in der Entwicklung von Testsystemen für den Wirkstoffmetabolismus in Betracht gezogen.
Andere nützliche Gene, aus denen Regulations- (oder Kontroll-)Elemente erhalten werden können, umfassen das Ataxie-Teleangiektasie-(ATM-) Genprodukt, HO und das Superoxiddismutase-(SOD-) Genprodukt, wobei von beiden gezeigt wurde, dass sie eine Rolle bei oxidativem Schaden spielen.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein einzelner Schritt eines biochemischen Stoffwechselwegs markiert werden. Dies ermöglicht eine Analyse der individuellen Genexpressions-Vorkommnisse (z.B. Induktion oder Repression).
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung können mehrere Schritte innerhalb eines linearen Stoffwechselwegs markiert werden (z.B. durch das Erschaffen von Reporterexpressionskassetten mit Regulationselementen, die von mehreren Genen im Stoffwechselweg abstammen, die operabel z.B. an für ein lichterzeugendes Protein kodierende Sequenzen gebunden sind). In dieser Ausrührungsform kann eine einzelne Maus mehrere Expressionskassetten in sich tragen, oder eine Kohorte an Mäusen kann je zumindest eine der Expressionskassetten in sich tragen, die für die Markierung des ausgewählten Stoffwechselwegs bereitgestellt werden. Dementsprechend können einzelne Mäuse und Kohorten von Mäusen in Gruppen angeordnet werden, die definierte Wege darstellen. Im Falle einer einzelnen Maus können die verschiedenen Expressionskassetten z.B. für kodierende Sequenzen für lichterzeugende Proteine kodieren, die Licht in unterschiedlichen Wellenlängen B emittieren, wodurch eine Analyse der Expression ermöglicht wird, die von verschiedenen Regulationssequenzen innerhalb derselben Maus vermittelt wird. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht die Bestimmung des/der genauen Schritts/Schritte im Stoffwechselweg, den eine Verbindung (die in den transgenen Tieren getestet wird) beeinflusst (d.h. molekulare Epistasie-Analyse). Transgene Tiere, die Expressionskassetten in sich tragen, die einen Stoffwechselweg auf diese Weise markieren, ermöglichen eine Bildanalyse des ganzen Tiers (z.B. um spezifische Gewebe zu identifizieren, die im Tier betroffen sind, z.B. die Milz), eine Analyse der Stromab-Wirkungen, eine Quantifizierung, Pharmacokinetik und mögliche Wirkungen auf die Entwicklung.
In einem weiteren, dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung können viele Gene in mehrfach verzweigten Stoffwechselwegen, verzweigten Stoffwechselwegen mit Wechselwirkungen oder verwandten Stoffwechselwegen unter Verwendung von Kontrollelementen markiert werden, die von Genen an variierenden Punkten in diesen Stoffwechselwegen abstammen, wo diese Kontrollelemente verwendet werden, um Reporterexpressionskassetten zu konstruieren (z.B. unter Verwendung von Sequenzen, die für ein lichterzeugendes Protein oder lichterzeugende Proteine kodieren, die Licht in verschiedenen Wellenlängen emittieren). Wie oben stehend beschrieben, können solche multiplen Expressionskassetten in einzelnen transgenen Tieren getragen werden sowie auch in Kohorten transgener Tiere. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Analysen ermöglicht eine solche Mehrfach-Stoffwechselweg-Markierung auch eine Analyse der Stoffwechselweg-Interaktionen und Stoffwechselweg-Redundanzen.
3.1.3 Kontrollelemente, die von apoptoseverwandten Genen abstammen
Apoptose ist der allgemeine Begriff für den Vorgang des programmierten Zelltods. Für einen allgemeinen Überblick siehe: Apoptosis: the Molecular Basis of Cell Death, Tomei und Cope (Hrsg.), Current Communications in Cell and Molecular Biology 3; Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1991). Unter normalen Bedingungen stellt Apoptose sicher, dass die Anzahl an sterbenden Zellen in einem Gewebe in etwa der Anzahl der neu produzierten Zellen entspricht. In verschiedenen Erkrankungszuständen oder als Resultat eines Angriffs auf ein Gewebe kann es jedoch zu einer Regulationsstörung des Prozesses der Apoptose kommen. Es gibt z.B. Beweise, dass der exzessive Zelltod Apoptose bei Rückenmarksverletzungen hervorruft, bei denen das Durchtrennen von Axonen Neuronen neurotrophe Faktoren entzieht, die für das Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit der Zelle notwendig sind; nach einem Schlaganfall, nach dem nach einer anfänglichen Phase des auf Ischämie zurückzuführenden nekrotischen Zelltods das Aufbrechen toter Zellen zu einer Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter führt, wie z.B. glutamat- und Sauerstoffradikale, die Apoptose in benachbarten gesunden Neuronen stimulieren; und bei einer In fektion mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV), die eine Apoptose der T-Lymphozyten induziert.
Im Gegensatz dazu scheint die normale Apoptose in hyperproliferativen Zellen, wie z.B. Krebszellen, inhibiert zu sein. Diese Zellen tendieren dazu, länger zu überleben als ihre normalen Gegenstücke, und als ein Resultat kann die Tumormasse sogar dann zunehmen, wenn die Verdopplungszeit der Krebszellen nicht ansteigt. Gene, von denen gezeigt wurde, dass sie eine wichtige Rolle in der Apoptose spielen, umfassen Gene, die für Proteine, wie z.B. Bcl-2 und ein Bcl-2-verwandtes Protein, genannt „Bax", kodieren. Genauer gesagt blockiert die Expression von Bcl-2 in einer Zelle die Apoptose, wohingegen die Expression von Bax in einer Zelle Apoptose induziert. Das für das p53-Tumorsuppressorprotein (p53) kodierende Gen ist ein weiteres Beispiel für ein Gen, das in die Apoptose involviert ist (siehe z.B. A.J. Levine et al., Nature 351, 453-455 (1991); B. Vogelstein und K.W. Kinzler, Cell 70, 523-526 (1992); G. Zambetti und A.J. Levine, FASEB J. 7, 855-865 (1993), für Übersichtsartikel zum p53-Gen). Das Wildtyp-p53-Protein induziert Apoptose in einer Zelle, wohingegen Mutanten-p53-Proteine dies nicht tun. Andere, in die Apoptose involvierte Gene sind FAS (Itoh et al., Cell 66, 233-243 (1991)); Interleukin-1b-konvertierendes Enzym (ICE) (M. Miura, H. Zhu, R. Rotello, E.A. Hartweig, J. Yuan, Cell 75, 653-660 (1994)); Phosphoinositid-3-kinasen (PI3Ks); Serin-/Threonin-Kinase-Akt/Protein-Kinase-B (PKB); BAD (B.L. Craddock et al., J. Biol. Chem. 274 (15), 10633-40 (9. April 1999)); und die Caspasen-Gene.
Kontrollelemente, die aus in die Apoptose involvierten Genen erhalten werden, sind operabel an ein Reportergen gebunden, insbesondere ein lichterzeugendes Protein (z.B. ein Polypeptid, das für eine Luciferase kodiert). In einem geeigneten Vektor kann die Expressionskassette in eine Zelle eingeführt werden oder verwendet werden, um transgene Tiere zur In-vivo-Beobachtung der Genexpression von apoptosebezogenen Genen zu erschaffen.
3.1.4 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in die Angiogenese involviert sind
Die Angiogenese ist die Entwicklung neuer Blutgefäße aus bestehenden Kapillargefäßen. Die anormale Expression von in die Angiogenese involvierten Genen betrifft eine Reihe von menschlichen Erkrankungen sowie das Wachstum und die Metastase fester Tumoren. Bei einigen Formen der Arthritis bilden sich neue Kapillargefäße im Gelenk, was schrittweise zu dessen Zerstörung führt. Feste Tumoren müssen ebenso die Bildung neuer Blutgefäße stimulieren, um die/den für ihr Wachstum notwendigen Nährstoffe und Sauerstoff zu erhalten, wodurch sich ein Weg ergibt, auf dem die Tumoren Metastasen an entfernten Stellen bilden können.
In die Angiogenese involvierte Genprodukte umfassen den sauren Fibroblastenwachstumsfaktor (aFGF), den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), den Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), den aus Blutplättchen gewonnenen Wachstumsfaktor (PDGF) und den von transformierten Zellen gebildeten Wachstumsfaktor (TGF). (Siehe z.B. Liotta et al., Cell 64, 327-336 (1991); Hanahan et al., Cell 86, 353-364.) Andere, in die Angiogenese involvierte Gene sind ApoB100; CETP und sPLA2.
VEGF- und VEGFR-Gene werden unten stehend ausführlicher beschrieben.
3.1.5 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in Entzündungs- und/oder Schmerz-Reaktionen involviert sind
Unter Verwendung der Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung erschaffene transgene Tiere ermöglichen wahrscheinlich das Studium des Schmerzes auf der Ebene des Gens. Die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die durch Regulationselemente von Genen vermittelte Expression zu beobachten, wobei die Regulationselemente in Entzündungs- und/oder Schmerz-Reaktionen involviert sind (z.B. ob mit solchen Regulationselementen assoziierte Reportergene unter geeigneten Bedingungen überexprimiert, unterexprimiert oder nicht exprimiert werden, so gibt es etwa zahlreiche Schmerzmodelle bei Mäusen, die die schmerzauslösende oder analgetische Empfindlichkeit umfassen). Es wurde eine Reihe an Genen identifiziert, die von Schmerz beeinflusst werden, z.B. in Mäusen, umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, Gene, die mit Folgenden verwandt sind: Neurotrophine und ihre Rezeptoren, periphere Mittlersubstanzen der Schmerzwahrnehmung und der Hyperalgesie, Opioide und ihre Rezeptoren, nicht-opioide Transmitterrezeptoren und intrazelluläre Moleküle, die an der Signalübertragung beteiligt sind.
Beispiele für Gene, die in Schmerz-Reaktionen involviert sind, umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das für den mu-Opiat-Rezeptor kodierende Gen (G.R. Uhl et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96 (14), 7752-5 (1999)) und das für die schmerzmodulatorischen Neuropeptide NPFF, NPAF und NPSF kodierende Gen (F.S. Vilim et al., Mol. Pharmacol. 55 (5), 804-11 (1999)). Ebenso stellen die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung Mittel zur Ziel-Validierung in Schmerzmodellen bereit. Beispielsweise die Evaluierung der Expression einer Reporterexpressionskassette, in der die Expression durch einen mu-Opiat-Rezeptor vermittelt wird (und Varianten davon, die z.B. operabel an ein lichterzeugendes Protein gebunden sind), und zwar unter Bedingungen eines Mausmodells der Schmerzwahrnehmung.
Die Expression von entzündungsbezogenen Genen kann ebenso mit einer Reihe an Bedingungen evaluiert werden, unter Verwendung der Reporterexpressionskassetten (und transgenen Tiere) der vorliegenden Erfindung. Expressionskontrollsequenzen können von den folgenden, nicht einschränkenden Beispielen für Gene abgeleitet werden: TNF; IL-2; NFkB; NFAT; INF-α/-β; iNOS; induzierbare Cyclooxygenase-Isoform COX-2 (T. Yang et al., Am. J. Physiol. 277 (1 Pt. 2): F10-6 (1999)); IL-1-β (H.R. Zhou et al., J. Toxicol. Environ. Health 57 (2), 115-36 (1999)); TGF-β-1 (S.J. Engle et al., Cancer Res. 59 (14), 3379-86 (1999)); von transformierten Zellen gebildeter Wachstumsfaktor α und heparinbindender epidermaler Wachstumsfaktor (HB-EGF) (D.K. Madtes et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 20 (5), 924-34 (1999)).
Das COX-2-Gen kodiert für eine Cyclooxygenase und ist ein Schlüsselregulator der Prostaglandinsynthese (Hla et al., PNAS USA 89, 7384-7388 (1992); Jones et al., J. Biol. Chem. 268, 9049-9054 (1993)). Insbesondere wird COX-2 im Allgemeinen für eine Mittlersubstanz von Entzündungen gehalten, und eine Überexpression von COX2 in Ratten-Epithelzellen führt zu erhöhten Spiegeln von E-Cadherin und Bcl2 (Tsujii & DuBois, Cell 83, 493-501 (1995)). Bei Co-Kulturen von Endothel-Zellen und Kolonkarzinom-Zellen produzieren Zellen, die COX2 überexprimieren, Prostaglandine, proangiogene Faktoren und stimulieren sowohl die Endothelmigration als auch die Knollenbildung (Tsujii et al., Cell 93, 705-716 (1998)). Unter Verwendung von APC-Knock-out-Mäusen durchgeführte Experimente haben gezeigt, dass Tiere, die für einen unterbrochenen COX2-Locus homozygot sind, signifikant mehr adenomatöse Polypen entwickeln (Oshima et al., Cell 87, 803-809 (1996)). COX-2-„Knockout"-Mäuse entwickeln schwerwiegende Nephropathie, sind anfällig für Peritonitis, weisen verringerte arachidonsäureinduzierte Entzündungen auf und zeigen weniger indomethacininduzierte Magengeschwüre (Morham et al., Cell 83, 473-482 (1995); Langenbach et al., Cell 83, 483-492 (1995)). Weibliche Mäuse mit einem Mangel an Cyclooxygenase 2 zeigen mehrfache Reproduktionsstörungen (Lim et al., Cell 91, 197-208 (1997)).
Weiters können die transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Gen-Gruppierungen darzustellen, die unter verschiedenen Stimuli differentiell exprimiert werden (worin die Regulationssequenzen solcher Gene operabel an Sequenzen gebunden sind, die für lichterzeugende Proteine kodieren). Ein Beispiel für einen Weg, Regulationselemente von Genen zu identifizieren, die auf einen Stimulus, z.B. Entzündung, unterschiedlich reagieren, ist mittels der Verwendung einer Differentialdisplay-RT-PCR (DDRT-PCR; siehe z.B. A.M. Silva et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 32 (7), 845-52 (1999); G. Miele et al., Prep. Biochem. Biotechnol. 29 (3), 245-55 (Aug. 1999); K. Krohn., Glia 25 (4), 332-42 (15. Februar 1999); J.G. De Oliveira et al., Mol. Biotechnol. 11 (2), 195-7 (Apr. 1999); S. Colonna-Romano et al., Microb. Pathog. 25 (2), 55-66 (Aug. 1998); N.R. Smith et al., Nucleic Acids Res. 25 (17), 3552-4 (1. September 1997); N.R. Smith et al., Biotechniques 23 (2), 274-9 (Aug. 1997); A. Bhattacharjee et al., Biotechniques 22 (6), 1048-51 (Juni 1997); M. Rhode et al., Me et al., Methods. Mol. Biol. 67, 419-30 (1997); D. Bauer et al., PCR Methods Appl. 4 (2), S97-108 (Okt. 1994); D. Bauer et al., Nucleic Acids Res. 21 (18)., 4272-80 (11. September 1993)).
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass, da die Evaluierung der Expression in ganzen Tieren durchgeführt werden kann, die Wirkungen auf die Expression von Reporterkassetten in spezifischen Organen, Geweben etc. sowie auch im ganzen Tier untersucht werden können.
3.1.6 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in spezifische Krankheiten involviert sind
Gene, die während spezifischer Erkrankungszustände induziert werden, können ebenso als Quelle für ausgewählte Kontrollelemente verwendet werden. Bei fast jedem abnormalen Zustand (z.B. Erkrankungszustand) reagiert ein Organismus durch eine Verstärkung der Expression (Hinaufregulierung) bestimmter Gene. In einigen Fällen wurden Gene identifiziert, die in Erkrankungszustände involviert sind, und dementsprechend können Kontrollelemente aus diesen Genen leicht, wie hierin beschrieben, erhalten und operabel an ein Reportergen von Interesse gebunden werden.
In anderen Fällen können die hinaufregulierten Gene identifiziert und anschließend die Kontrollelemente isoliert werden. Die Identifikation solcher Gene kann durch ein beliebiges Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, erfolgen, z.B. durch eine Variation des Verfahrens, das als „Substraktionshybridisierung" bekannt ist. So wird z.B. ein Substraktionshybridisierungsverfahren zur Identifikation von Kontrollelementen, die mit Genen assoziiert sind, die in die Infektionskrankheit Chlamydia involviert sind, kurz beschrieben. Typischerweise besteht mRNA aus isolierten Zellen eines Tieres (z.B. einer Maus), das mit Chlamydia infiziert ist, und die cDNA wird aus der mRNA durch ein beliebiges Verfahren, das nach dem Stand der Technik bekannt ist, hergestellt. Die cDNA kann danach gegen eine normale Kontrollgruppe gescreent werden. Das Screening erfolgt z.B. durch das Aussetzen eines Chips (o der eines anderen festen Trägers), der eine Gruppe an Sequenzen einer normalen Kontrollgruppe enthält, gegenüber der cDNA, die aus den infizierten Zellen erhalten wurde. Jene Transkripte, die in infizierten Zellen hinaufreguliert sind, können leicht identifiziert werden. Danach können die Kontrollelemente unter Verwendung der hinaufregulierten Transkripte als Klone erhalten werden. Zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens können die Transkripte durch das Screenen von Bibliotheken auf Klone voller Länge, durch Sequenzvergleich mit bekannten Genen oder unter Verwendung von Technologien, wie z.B. von Chip-Arrays, zur Identifikation des Gens identifiziert werden. Die ausgewählten Kontrollelemente werden danach operabel an das Reportergen gebunden und in die Tiere eingeführt. Die Tiere können verwendet werden, um durch Screening Substanzen zu identifizieren, die die Expression dieser krankheitsinduzierten Gene durchführen.
Ein weiteres Verfahren, das für die Identifikation und die Isolierung von Genen, die z.B. während der Infektion eines Tieres mit einem infektiösen Agens differentiell exprimiert wurden, nützlich ist, ist die Differentialdisplay-RT-PCR (DDRT-PCR, siehe z.B. A.M. Silva et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 32 (7), 845-52 (1999), und weitere, oben angeführte Verweise).
Obwohl die Identifikation von Kontrollelementen im Hinblick auf die Infektionskrankheit Chlamydia beschrieben wird, wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass die Lehren dieser Beschreibung genauso auch auf andere Erkrankungszustände mit bekannten oder unbekannten molekularen Krankheitsmechanismen anwendbar sind (z.B. virale Infektion (z.B. HIV, Hepatitis B, Hepatitis C, Influenza etc.); mikrobielle Infektionen (Chlamydia, Streptococcus, Staphylococcus, Pneumonie, Toxoplasma etc.); angeborene Störungen; Entwicklungsstörungen (z.B. unter anderem Störungen, die die Muskelentwicklung, die Organentwicklung, die Herzentwicklung etc. beeinflussen) und andere Erkrankungszustände, von denen viele in unterschiedlichen Abschnitten hierin beschrieben werden).
3.1.7 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in die Onkogenese involviert sind
Krebs (z.B. anormales Zellwachstum) ist oftmals auf (i) spontan entstehende genetische Veränderungen, (ii) virale Infektionen oder (iii) eine Antwort auf Stimuli aus der Umgebung, z.B. chemische Karzinogene oder Strahlung, zurückzuführen. Gene, die für die Transformation einer normalen Zelle in eine Krebszelle verantwortlich sind, werden Onkogene genannt. Mit dem beginnenden Aufschwung der Molekularbiologie wurden große Anzahlen an Onkogenen identifiziert, kloniert und sequenziert. In vielen Fällen sind die identifizierten Onkogene in veränderter Form eines oder derselben nativen zellulären Gene vorhanden, die als Proto-Onkogene bekannt sind, oder durch Überproduktion (Überexpression) von Genprodukten. Beispiele für nicht einschränkende Ausführungsformen solcher onkogenesebezogenen Gene umfassen Folgende: Tumornekrosefaktor; p53; VEGF; VEG-R1; VEG-R2 und Heparanse.
Beispiele für Promotoren (unter anderem Expressionskontrollelemente) zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden so ausgewählt, dass sie in einem Zelltyp und/oder Tier, in den/das sie eingeführt werden, funktionell sind. Beispiele für Promotoren umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Promotoren, die aus den folgenden Mausgenen erhalten werden: Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) (VEGF-Promotor im US-Patent Nr. 5.916.763 beschrieben; Shima et al., J. Bio. Chem. 271, 3877-3883 (1996); Sequenz unter der Zugriffsnr. U41383 bei NCBI erhältlich); VEGFR2, auch als Flk-1 bekannt (VEGFR-2-Promotor z.B. in Rönicke et al., Circ. Res. 79, 277-285 (1996); Patterson et al., J. Bio. Chem. 270, 23111-23118 (1995); Kappel et al., Blood 93, 4282-4292 (1999), beschrieben; Sequenz unter der Zugriffsnr. X89777 der NCBI-Datenbank erhältlich); Tie2, auch als Tek bekannt (Tie2-Promotor z.B. in Fadel et al., Biochem. J. 338, 335-343 (1998); Schlaeger et al., Develop. 121, 1089-1098 (1995); Schlager et al., PNAS USA 94, 3058-3063 (1997), beschrieben). VEGF ist in vitro ein spezifisches Mitogen für EC und ein starker angiogener Faktor in vivo. In einer Tumorgenese-Studie wurde gezeigt, dass VEGF kritisch für das anfängliche subkutane Wachstum von T-47D-Brustkarzinomzellen war, die in Nacktmäuse transplantiert wurden, wohingegen andere angiogene Faktoren, wie z.B. bFGF, den Verlust von VEGF kompensieren können, nachdem die Tumoren eine gewisse Größe erreicht haben (H. Yoshiji et al., Cancer Research 57, 3924-28 (1997)). VEGF ist eine bedeutende Mittlersubstanz bei abnormaler EC-Proliferation und Gefäßpermeabilität bei einer Reihe menschlicher pathologischer Situationen, wie z.B. Tumor-Angiogenese, diabetischer Retinopathie und rheumatoider Arthritis (L.E. Benjamin et al., PNAS 94, 8761-66 (1997); S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)). VEGF wird in vivo von Tumorzellen synthetisiert und akkumuliert in sich in der Nähe befindlichen Blutgefäßen. Da löchrige Tumorzellen eine Serie an Vorkommnissen in Gang setzen, die den Plasma-Austritt inkludieren und schlussendlich zu Angiogenese und Tumor-Stroma-Bildung führen, spielt VEGF eine entscheidende Rolle bei der Förderung des Tumorwachstums (H.F. Dvorak et al., J. Exp. Med. 174, 1275-8 (1991)). Die VEGF-Expression wird durch Hypoxie hinaufreguliert (D. Shweiki et al., Nature 359, 843-5 (1992)). VEGF wird ebenso durch die Überexpression des v-Src-Onkogens hinaufreguliert (D. Mukhopadhyay et al., Cancer Res. 15, 6161-5 (1995)), c-SRC (D. Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577-81 (1995)) und Mutanten-ras-Onkogen (K.H. Plate et al., Nature 359, 845-8 (1992)). Der Tumorsuppressor p53 reguliert die VEGF-Expression hinunter (D. Mukhopadhyay et al., Cancer Res. 15, 6161-5 (1995)).
Alternative Namen für einige dieser Gene sind die folgenden: VEGF (Gefäßendothelwachstumsfaktor) wird auch VPF (Gefäßpermeabilitätsfaktor) genannt; VEGFR-1 wird auch FLT1 genannt; VEGFR-2 wird auch KDR/FLK1 genannt, und VEGFR-3 wird auch FLT4 genannt.
VEGF ist ein homodimeres 45-kDa-Protein (Monomor 23 kDa). VEGF besitzt fünf Isoformen, von denen VEGF165 und VEGF121 die am häufigsten zu findenden sind. Beide sind Liganden für VEGFR-2 sowie für VEGFR-1 (S. Soker et al., JBC 271, 5761-67 (1996)). VEGF165 ist die einzige VEGF-Isoform, die an Neuropillin-1 bindet (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)). VEGF ist extrem instabil – seine Halbwertszeit im Blutkreislauf liegt bei nur 3 Minuten (N. Ferrara et al., Nature 380, 439-442 (1996); N. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)).
VEGF-B ist zu 43 % (aa) mit VEGF identisch und existiert als Homodimer. Es kann ebenso Heterodimere mit VEGF bilden (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2576-81 (1996)). VEGF-B ist ein Ligand für VEGFR-1 (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11709-14 (1998)).
VEGF-C ist zu 30 % (aa) mit VEGF identisch. Das reife VEGF-C weist 23 kDa auf, das Vorläuferprotein 35,8 kDa. VEGF-C ist ein Ligand für VEGFR-3 sowie für VEGFR-2. Es induziert die Autophosphorylierung beider Rezeptoren (V. Joukov et al., EMBO J. 15, 290-298 (1996)).
VEGF-D ist zu 31 % (aa) mit VEGF165 identisch und zu 48 % (aa) mit VEGF-B identisch. Das reife VEGF-D weist etwa 22 kDa auf. VEGF-D ist ein Ligand für VEGFR-3 sowie für VEGFR-2. Es induziert die Autophosphorylierung beider Rezeptoren (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)).
PIGF ist zu 46 % (aa) mit VEGF identisch (D. Maglione et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 9267-71 (1991) und kann Heterodimere mit VEGF bilden (J. Disalvo et al., JBC 270, 7717-23 (1995)).
VEGFR-1 ist ein etwa 180-kDa-Tyrosinkinase-Rezeptor für VEGF-B (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11709-14 (1998)) und VEGF (C. de Vries et al., Science 255, 989-91 (1992)) und PIGF (J.E. Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646-54 (1994)).
VEGFR-2 ist ein etwa 200-kDa-Tyrosinkinase-Rezeptor für VEGF (B.I. Terman et al., Oncogene 6 (9), 1677-83 (Sep. 1991)), VEGF-C (V. Joukov et al., EMBO J. 15, 290-298 (1996)) und VEGF-D (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)).
VEGFR-3 ist ein Tyrosinkinase-Rezeptor (K. Pajusola et al., Cancer Res. 52, 5738-43 (1992)) auf lymphatischem EC für VEGF-C (D.J. Dumont et al., Science 282, 946-949 (1998)) und VEGF-D (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)). VEGFR-3 besitzt eine bearbeitete, reife Form von etwa 125 kDa und eine unbearbeitete Form von etwa 195 kDa (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)).
Neuropillin-1 ist eine etwa 130-kDa-Rezeptor-Tyrosinkinase. Sie bindet VEGF165, jedoch nicht VEGF121 (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)).
Die Expression vieler dieser Gene wurde in Erwachsenen evaluiert. Hier folgt nun eine Zusammenfassung der Informationen bezüglich der Expression.
VEGF besitzt ein etwa 3,7-kb-Transkript. Es wird in mehreren menschlichen Geweben, unter anderem Herz, Skelettmuskel und Prostata, exprimiert. Bei Mäusen wird VEGF hauptsächlich im Herz, in der Lunge und der Niere exprimiert. Der Rest der menschlichen oder Maus-Gewebe, unter anderem Gehirn und Hoden, exprimieren keine nachweisbaren oder signifikanten Level an VEGF (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2576-81 (1996)). In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass VEGF hochgradig in Epithelzellen der Lungenalveolen, der Nierenglomeruli und der Nebennierenrinde sowie in Herz-Myozyten exprimiert wird (B. Berse, MCB 3, 211-20 (1992)).
VEGF-B besitzt ein etwa 1,4-kb-Transkript. Es wird in einer Mehrheit der menschlichen und Maus-Gewebearten exprimiert. VEGF-B wird am bekanntesten im Herzen, in den Skelettmuskeln, im Pankreas, im Gehirn und in der Prostata exprimiert. Bei Mäusen wird VEGF-B hauptsächlich im Herzen, in Skelettmuskeln, im Gehirn und in den Nieren exprimiert. Die Leber scheint kein signifikantes Level an VEGF-B zu exprimieren, weder in Menschen noch in Mäusen. VEGF-B und VEGF werden in vielen menschlichen Geweben co-exprimiert, wie z.B. im Herzen, in Skelettmuskeln, im Pankreas und in der Prostata. Im Allgemeinen wird VEGF-B in größerem Ausmaß exprimiert als VEGF. VEGF-B kann als ein Endothelzellen-Wachstumsfaktor fungieren (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2576-81 (1996)).
VEGF-C besitzt ein etwa 2,4-kb-Transkript, das in mehreren menschlichen Geweben exprimiert wird, am bekanntesten im Herzen, in den Skelettmuskeln, in der Plazenta, in den Eierstöcken, im Dünndarm, im Pankreas und in der Prostata. Einige Gewebearten, unter anderem Gehirn und Leber, scheinen keine nachweisbaren Levels an VEGF-C zu exprimieren (V. Joukov et al., EMBO J. 15, 290-298 (1996)).
VEGF-D besitzt ein etwa 2,3-kb-Transkript, das in mehreren menschlichen Geweben exprimiert wird, am bekanntesten im Herzen, in den Skelettmuskeln, in der Lunge, im Dickdarm und im Dünndarm. Einige Gewebearten, unter anderem Gehirn, Leber, Plazenta, scheinen keine nachweisbaren Levels an VEGF-D zu exprimieren (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)).
VEGFR-1 scheint endothelzellenspezifisch zu sein (K.G. Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 8915-19 (1993)). VEGFR-1-cDNA ist etwa 7,7 kb lang und kodiert für ein Protein von 1338 aa. Es wurde in einer Reihe an normalen Geweben einer erwachsenen Ratte exprimiert (M. Shibuya et al., Oncogene 5, 519-24 (1990)). In einem Gliom-Modell der Tumor-Angiogenese werden sowohl VEGFR-1 als auch VEGFR-2 spezifisch in Ecs exprimiert, die in den Tumor eingedrungen sind, fehlen jedoch in Ecs in den normalen Gehirngeweben. Die VEGF-Expression war in Gliomzellen entlang des nekrotischen Rands nachweisbar (K.H. Plate et al., Cancer Research 53, 5822-27 (1993)).
VEGFR-2 wird in einem etwa 7-kb-Transkript exprimiert (B.I. Terman et al., Oncogene 6 (9), 1677-83 (Sept. 1991)), der endothelzellenspezifisch zu sein scheint. VEGFR-2 wird ubiquitär in vielen Geweben exprimiert, unter anderem im Herzen, in der Plazenta, in der Lunge und in der Niere. Die Expressionslevels von VEGFR-2 sind in diesen Geweben im Vergleich zur Neuropillin-Expression relativ niedrig. Das Gehirn scheint keine nachweisbaren Levels an VEGFR-2 zu exprimieren (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)). Eine In-situ-Hybridisierungsanalyse ergab eine spezifische Assoziation von VEGFR-2 mit Endothelzellen in allen Stadien der Mausentwicklung. Er kommt in großem Ausmaß in proliferierenden Endothelzellen vaskulärer Sprosse und in sich verzweigenden Gefäßen im embryonalen und frühen postnata len Gehirn vor, wird jedoch im erwachsenen Gehirn, in dem die Proliferation aufgehört hat, dramatisch reduziert (B. Millauer, Cell 72, 835-46 (1993)).
VEGFR-3 wird als etwa 5,8-kb- und als 4,5-kb-mRNAs exprimiert. Die meisten fötalen Gewebearten exprimierten VEGFR-3, wobei die Milz, der Zwischenhirnbereich und die Lunge die höchsten Mengen aufwiesen. Er scheint nicht in den Endothelzellen der Blutgefäße exprimiert zu werden (K. Pajusola et al., Cancer Res. 52, 5738-43 (1992)). Während der embryonalen Entwicklung wird VEGFR-3 in Blutgefäßen exprimiert, wird jedoch nach der Geburt großteils auf das lymphatische Endothelium eingeschränkt (A. Kaipainen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3566-3570 (1995)).
Neuropillin-1 wird sowohl in Endothelzellen als auch in vielen Typen an Tumorzellen als ein etwa 7-kb-Transkript exprimiert. Die meisten Gewebearten exprimieren große Mengen an Neuropillin-1, dies gilt besonders für das Herz und die Plazenta. Skelettmuskeln, Pankreas, Lunge und Niere exprimieren ebenso hohe Level an Neuropillin-1. Das Gehirn scheint keine nachweisbaren Levels an Neuropillin-1 zu exprimieren (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)).
Einige Funktionen dieser Gene wurden evaluiert und werden wie folgt beschrieben.
VEGF ist in vitro ein spezifisches Mitogen für EC sowie ein starker angiogener Faktor in vivo. In vitro bindet und induziert VEGF die Autophosphorylierung von VEGFR-2 und VEGFR-1, die mitogene Reaktion wird jedoch nur durch VEGFR-2 vermittelt (J. Waltenberger, JBC 269, 26988-95 (1994)). VEGF fungiert als ein Überlebensfaktor für neu gebildete Gefäße während der entwicklungsbedingten Gefäßneubildung, möglicherweise durch eine vermittelnde Wechselwirkung der Endothelzellen mit der zugrunde liegenden Matrix, ist jedoch für den Erhalt ausgewachsener Gefäße nicht erforderlich (L.E. Benjamin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8761-66 (1997)). Bei der Embryogenese induziert die Wechselwirkung zwischen VEGF und VEGFR-2 die Geburt und die Proliferation von Endothelien (D. Hanahan, Science 277, 48-50 (1997)). Die Bindung von VEGF an VEGFR-1 löst endothele Zell-Zell-Wechselwirkungen so wie die Bildung von Kapillarröhrchen aus, ein Prozess, der dicht auf die Proliferation und Migration der Endothelzellen folgt (D. Hanahan, Science 277, 48-50 (1997)). In einer Tumorgenese-Studie wurde gezeigt, dass VEGF kritisch für das anfängliche, subkutane Wachstum von T-47D-Brustkarzinomzellen ist, die in Nacktmäuse transplantiert wurden, wohingegen andere angiogene Faktoren, wie z.B. bFGF, den Verlust von VEGF kompensieren können, nachdem die Tumoren eine gewisse Größe erreicht haben (H. Yoshiji et al., Cancer Research 57, 3924-28 (1997)). VEGF ist eine wichtige Mittlersubstanz abnormaler Endothelzellen-(EC-) Proliferation und Gefäßpermeabilität in einer Reihe menschlicher pathologischer Zustände, wie z.B. der Tumor-Angiogenese, der diabetischen Retinopathie und der rheumatoiden Arthritis (L.E. Benjamin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8761-66 (1997); S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)). VEGF induziert die Expression des Plasminogenaktivators (PA), des PA-Inhibitors 1 (PAI-1), MMP und der interstitiellen Collagenase in EC. Diese Erkenntnisse entsprechen den proangiogenen Aktivitäten von VEGF. VEGF fördert die Expression von VCAM-1 und ICAM-1 in EC und kann daher die Adhäsion aktivierter NK-Zellen an EC erleichtern. VEGF kann die Monozyten-Chemotaxis fördern (M.S. Pepper et al., BBRC 181, 902-906 (1991); N. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)). Von Tumoren wird angenommen, sie wären die Hauptquelle von VEGF. Es wurde eine Korrelation zwischen der VEGF-Expression und der Gefäßdichte in menschlichen Brusttumoren, Nierenzellenkarzinomen und Kolonkrebs beobachtet (T.A.T. Fong et al., Cancer Res. 59, 99-106 (1999)). VEGF- und PGF-Expressionen wurden im Vergleich zu angrenzenden normalen Nierengeweben signifikant hinaufreguliert in 96 % und 91 % der hypervaskulären Nierenkarzinomgewebe (A. Takahashi et al., Cancer Res. 54, 4233-7 (1994)).
VEGF-B ist ein Mitogen für EC und kann in die Angiogenese von Muskeln und dem Herzen involviert sein (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 2576-81 (1996)). In vitro führt die Bindung von VEGF-B an seinen Rezeptor VEGFR-1 zu einer verstärkten Expression und Aktivität des Urokinase-Typ-Plasminogenaktivators und des Plasminogenaktivatorinhibitors, was auf eine Rolle von VEGF-B in der Regulierung der extrazellulären Matrix-Degradation, der Zelladhäsion und Migration hindeutet (B. Olofsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 11709-14 (1998)).
VEGF-C kann die Angiogenese der lymphatischen Gefäßanordnung regulieren, wie dies aus dem Muster der VEGF-C-Expression in Maus-Embryos herausgeht (E. Kukk et al., Development 122, 3829-37 (1996)). Obwohl VEGF-C auch ein Ligand für VEGFR-2 ist, ist die funktionelle Signifikanz dieser potentiellen Wechselwirkung unbekannt. Die Überexpression von VEGF-C in der Haut transgener Mäuse führte zu lymphatischer, jedoch nicht vaskulärer, Endothelproliferation und Gefäßvergrößerung, was darauf hindeutet, dass die bedeutende Funktion von VEGF-C durch VEGFR-3 anstatt durch VEGFR-2 erfolgt (M. Jeltsch et al., Science 276, 1423-5 (1997)). Unter Verwendung des CAM-Tests wurde von VEGF und VEGF-C gezeigt, dass sie spezifisch angiogene bzw. lymphangiogene Wachstumsfaktoren waren (S.J. Oh et al., Del. Biol. 188, 96-109 (1997)).
VEGF-D ist ein Mitogen für EC. VEGF-D kann auch VEGFR-3 aktivieren. Es ist möglich, dass VEGF-D in die Regulierung des Wachstums und/oder der Differenzierung des lymphatischen Endotheliums involviert sein könnte (M.G. Achen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 548-53 (1998)).
PIGF kann die Wirkung von niedrigen Konzentrationen an VEGF in vitro und in vivo potenzieren (J.E. Park et al., J. Biol. Chem. 269, 25646-54 (1994)).
Der VEGFR-1-Signalweg kann normale Endothelzell-Zell- oder -Zell-Matrix-Wechselwirkungen während der vaskulären Entwicklung regulieren, wie dies aus einer Knockout-Studie hervorgeht (G.H. Fong et al., Nature 376, 65-69 (1995)). Obwohl VEGFR-1 eine höhere Affinität zu VEGF besitzt als VEGFR-2, so transduziert es doch nicht die mitogenen Signale von VEGF in ECs (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)).
VEGFR-2 scheint der Haupttransduzent an VEGF-Signalen in EC zu sein, die zu Chemotaxis, Mitogenizität und groben morphologischen Veränderungen in Target-Zellen führen (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)).
VEGFR-3 spielt eine essentielle Rolle in der Entwicklung des embryonalen kardiovaskulären Systems vor der Ausbildung der lymphatischen Gefäße, wie dies von einer Knockout-Studie gezeigt wird (D.J. Dumont et al., Science 282, 946-949 (1998)).
Neuropillin-1 ist ein Rezeptor für VEGF165. Es kann die Bindung von VEGF165 an VEGFR-2 und die VEGF165-vermittelte Chemotaxis verstärken (S. Soker et al., Cell 92, 735-745 (1998)).
Die Gen-Regulierung einiger dieser Gene wurde untersucht und wird unten stehend hierin behandelt.
In-situ-Hybridisierung hat gezeigt, dass VEGF-mRNA in transplantierten Tumorzellen, jedoch nicht in Tumorblutzellen vorhanden war, was darauf hindeutet, dass die immunhistochemische Markierung von Tumorgefäßen mit VEGF-Antikörpern die Aufnahme von VEGF wiederspiegelt und nicht die endogene Synthese. VEGF-Proteinfärbung war in angrenzenden, bereits existierenden Venolen und kleinen Venen bereits 5 Stunden nach der Tumortransplantation erkennbar und erreichte einen Höchstwert bei Maximalwerten der Intensität in neu induzierten Tumorgefäßen nach etwa 5 Tagen. Im Gegensatz dazu waren Gefäße mit einem Abstand von mehr als etwa 0,5 mm von den Tumoren nicht hyperpermeabel und zeigten keine immunhistochemische Färbung auf VEGF. Die Gefäßfärbung verschwand innerhalb von 24-48 Stunden nach der Tumorabstoßung. Diese Studien zeigen, dass VEGF in vivo von Tumorzellen synthetisiert wird und in nahgelegenen Blutgefäßen akkumuliert. Da löchrige Tumorzellen eine Serie an Vorkommnissen in Gang setzen, die den Plasma-Austritt inkludieren und schlussendlich zu Angiogenese und Tumor-Stroma-Bildung führen, spielt VEGF eine entscheidende Rolle bei der Förderung des Tumorwachstums (H.F. Dvorak et al., J. Exp. Med. 174, 1275-8 (1991)). Zusätzlich dazu wurde gezeigt, dass Stroma-Zellen durch transplantierte Tumorzellen zur VEGF-Produktion stimuliert werden können (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). In vitro gezüchtete Fibroblasten sind für die VEGF-Promotorfunktion im Vergleich zu Fibroblasten in frisch isolierten Tumoren hochgradig aktivierend, was darauf hindeutet, dass die Kulturbedingung den Status von normalem (nicht aktiviertem) Gewebe in vivo nicht imitierte (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). C6-Tumor-Spheroide (C6 ist eine Zelllinie, die von einem Gliatumor einer Ratte abstammt – C6-Zellen aggregieren und bilden in Kultur kleine Speroide) z.B., die in Nacktmäuse implantiert worden waren, wurden neovaskularisiert, begleitet von einer schrittweisen Reduktion der VEGF-Expression (D. Shweiki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 768-772 (1995)). Die VEGF-Promotorregion trägt viele der Merkmale eines Haushaltsgens (E. Tischer, JBC 266, 11947-11954 (1991)), es ist daher wahrscheinlich, dass bei hypoxischem oder ischämischem Bedarf beinahe jeder Zelltyp als Quelle für VEGF dienen könnte (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)).
Die VEGF-Expression wurde durch Hypoxie hinaufreguliert (D. Shweiki et al., Nature 359, 843-5 (1992)), sowohl aufgrund der erhöhten Transkriptionsaktivierung als auch aufgrund der Stabilität seiner mRNA (E. Ikeda et al., JBC 270, 19761-5 (1995)). In einer Reihe an In-vitro-Studien wurde gezeigt, dass Hypoxie die VEGF-Expression durch die Aktivierung des P13K/Akt-Wegs (N.M. Mazure et al., Blood 90, 3322-31 (1997)) und HIF-1 (ein Enhancer, der durch Hypoxie induziert wird und an die VEGF-Promotorregion bindet) hinaufreguliert (J.A. Forsythe, MCB 16, 4604-13 (1996); N.M. Mazure et al., Blood 90, 3322-31 (1997)). VEGF wird ebenso durch die Überexpression des v-Src-Onkogens hinaufreguliert (D. Mukhopadhyay, Cancer Res. 15, 6161-5 (1995)), c-SRC (D. Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577-81 (1995)) und Mutantenras-Onkogen (K.H. Plate, Nature 359, 845-8 (1992)). Der Tumorsuppressor p53 reguliert die VEGF-Expression hinunter (D. Mukhopadhyay, Cancer Res. 15, 6161-5 (1995)). Eine Reihe an Zytokinen und Wachstumsfaktoren, unter anderem PGF, TPA (S. Grugel et al., JBC 270, 25915-9 (1995)), EGF, TGF-b, IL-1 und IL-6, induzieren die VEGF-mRNA-Expression in gewissen Zelltypen (N. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18, 4-25 (1997)). Das Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV), das für einen an ein G-Protein gekoppelten Rezeptor kodiert – ein Homolog des IL-8-Rezeptors – kann JNK/SAPK und p38MAPK aktivieren und die VEGF-Produktion erhöhen, wodurch eine Zelltransformation und Tumorgenizität hervorgerufen wird (C. Bais, Nature 391, 86-9 (1998)).
Das Wachstum des androgenabhängigen Shionogikarzinoms bei Immundefizienten Mäusen ging zurück, nachdem die Mäuse kastriert wurden, begleitet von einem Rückgang der VEGF-Expression. Zwei Wochen nach der Kastration beginnt eine zweite Welle der Angiogenese und das Tumorwachstum mit einer gleichzeitigen Zunahme der VEGF-Expression (R.K. Jain, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10820-5 (1998)).
VEGF-D wird bei Mäusen durch den Transkriptionsfaktor c-fos induziert (M. Orlandini, Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 11675-80 (1996)).
Eine Überexpression einiger dieser Gene wurde unter Verwendung verschiedener Systeme evaluiert.
Eine VEGF-Überexpression in der Haut transgener Mäuse induziert Angiogenese, vaskuläre Hyperpermeabilität und beschleunigte Tumorentwicklung (F. Larcher et al., Oncogene 17, 303-11 (1998)). Retinagewebespezifische VEGF-Überexpression in transgenen Mäusen führt zu intraretinaler und subretinaler Gefäßneubildung (N. Okamoto et al., Am. J. Pathol. 151, 281-91 (1997)). Eine VEGF-Überexpression, die durch das Tet-System vermittelt wird, fördert die Tumorgenese von C6-Gliomzellen bei der Transplantation in Nacktmäuse. Die Tumoren werden hypervaskularisiert mit abnormal großen Gefäßen, die auf exzessive Fusionen zurückzuführen sind. Die Tumoren waren weniger nekrotisch. Nachdem die VEGF-Expression abgeschlossen war, kam es aufgrund der Loslösung der Endothelzellen von den Wänden der zuvor ausgebildeten Zellen und deren darauf folgender Apoptose zu einer Regression der Tumoren. Ein vaskulärer Kollaps führte weiters zu Hämorrhagien und extensiver Tumornekrose (L.E. Benjamin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 8761-66 (1997)). In human-VEGF-Promotor-GFP-transgenen Mäusen induziert die Implantation von festen Tumoren eine spezifische GFP-Expression in Stroma-Zellen. Transgene Mäuse wurden mit T-Antigen-Mäusen gekreuzt (fähig, spontane Mammatumoren auszubilden), um doppelt transgene Mäuse zu erschaffen, in denen sich spontane Mammatumoren ausbildeten. Eine starke Stroma-, jedoch keine Tumor-, Expression von GFP wurde beobachtet (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). Eine CCD-Kamera wurde verwendet, um die GFP-Expression zu beobachten. Die GFP-Halbwertszeit lag, den Resultaten zufolge, zwischen etwa 1,2 bis 1,5 Tagen (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). Das Transgen wurde mittels DNA-Rekombination in den IgG-Locus des Chromosoms integriert (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). Von FVB abstammende VEGF-GFP-transgene Mäuse wurde mit Wildtyp-C3H-Mäusen gekreuzt, um Hybridmäuse zu erschaffen, die als Wirte für von C3H-abstammende Tumorlinien verwendet werden können (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)).
Eine VEGF-C-Überexpression in der Haut transgener Mäuse führte zu lymphatischer, jedoch nicht zu vaskulärer, Endothelproliferation und Gefäßvergrößerung (M. Jeltsch et al., Science 276, 1423-5 (1997)).
Eine Neuropillin-1-Überexpression in transgenen Mäusen führte zu Embryoletalität. Die Embryos besaßen ein Übermaß an Kapillar- und Blutgefäßen. Erweiterte Gefäße und Hämorrhagien wurden ebenso beobachtet (T. Kitsukawa et al., Development 121, 4309-18 (1995)).
Die Funktionen einiger dieser Gene wurden in Knockout-Mäusekonstrukten, Tierstudien und In-vitro-Studien evaluiert.
Ein VEGF-Knockout war für die Embryos letal. F1 ist ebenso für die Embryos letal, und die Angiogenese wurde behindert. Die VEGF-Sekretion von „+/–"-ES-Zellen wurde auf 50 % reduziert (P. Carmellet et al., Nature 380, 435-439 (1996); N. Ferrara et al., Nature 380, 439-442 (1996)).
VEGFR-1 wurde in einem IacZ-Knockin evaluiert, worin ein Fragment des Exons, das das ATG-Startcodon enthält, durch LacZ ersetzt wurde. Knockout-Mäuse waren embryonisch letal. Es wurden Blutgefäße ausgebildet, die Anordnung der Blutgefäße war jedoch gestört (G.H. Fong et al., Nature 376, 65-69 (1995)).
VEGFR-2 war embryonisch letal und wurde durch defekte Endothelzellenentwicklung hervorgerufen (F. Shalaby et al., Nature 376, 62-65 (1995)).
VEGFR-3 (LacZ-Knockin) war embryonisch letal und wurde durch defekte Blutgefäßentwicklung hervorgerufen (D.J. Dumont et al., Science 282, 946-949 (1998)).
Neuropillin-1 war embryonisch letal (D.J. Dumont et al., Science 282, 946-949 (1998)).
In-vitro-Studien haben gezeigt, dass ein Mutanten-VEGF (ein Heterodimer von zwei Mutanten-VEGF) (G. Siemeister et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 4625-9 (1998)) sowie ein GST-Exon7-(VEGF-)Fusionsprotein (S. Soker et al., JBC 272, 31582-88 (1997)) in der Lage waren, die Endothelzellenproliferation zu inhibieren, indem sie als ein VEGF-Antagonist agierten und die VEGF-Bindung an VEGFR-2 und VEGFR-1 störten (G. Siemeister et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 4625-9 (1998)). Noch wichtiger, das VEGF-neutralisierende chimäre Protein, das die extrazelluläre Domäne des VEGF-Rezeptors (entweder VEGFR-1 oder VEGFR-2) fusioniert mit IgG enthielt, reduzierte die Entwicklung der retinalen Gefäßneubildung bei Injektion in Mäusen mit ischämischer retinaler Erkankung substantiell (L.P. Aiello et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 10457-61 (1995)).
Die Behandlung von Tumoren mit monoklonalen Antikörpern, die gegen VEGF gerichtet sind, führte zu einer damatischen Reduktion der Tumormasse aufgrund der Suppression der Tumorangiogenese (K.J. Kim et al., Nature 362, 841-44 (1993)). Die Injektion von Antikörpern gegen VEGF reduzierte die vaskuläre Tumorpermeabilität und den Gefäßdurchmesser bei Immundefizienten Mäusen, in die ein menschliches Glioblastom, ein Kolon-Adenokarzinom und ein Melanom transplantiert worden waren (F. Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 14765-70 (1996)). Eine retrovirusvermittelte Überexpression einer dominanten negativen Form von VEGFR-2 in Nacktmäusen unterdrückt das Wachstum transplantierter Ratten-C6-Gliomtumorzellen (B. Millauer et al., Nature 367, 576-9 (1994)) sowie von Mamma- und Ovarialtumoren und Lungenkarzinomen (B. Millauer et al., Cancer Res. 56, 1615-20 (1996)).
Viele der Schwierigkeiten beim Verständnis der Tumordynamik sind auf die Komplexität der In-vivo-Experimentiersysteme sowie auf die Unfähigkeit der In-vitro- Kulturmodelle hinsichtlich der wahrheitsgetreuen Wiedergabe der sich im Kontext eines Organismus abspielenden Vorkommnisse zurückzuführen (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). In vitro gezüchtete Fibroblasten sind für die VEGF-Promotorfunktion im Vergleich zu aus Tumoren frisch isolierten Fibroblasten hochgradig aktivierend, was darauf hindeutet, dass die Kulturbedingungen den Status von normalem (nicht aktiviertem) Gewebe in vivo nicht imitierten (D. Fukumura et al., Cell 94, 715-25 (1998)). Die hierin beschriebenen Konstrukte und Verfahren stellen wertvolle Ressourcen zur In-vivo-Evaluierung der Rollen dieser Gene in ganzen Tieren bereit.
Wie hierin beschrieben, können solche Promotoren und assoziierte Expressionskontrollelemente verwendet werden, um die Expressionskassetten und transgenen Tiere der vorliegenden Erfindung zu erschaffen. Eine Gruppe an Expressionskassetten mit Kontrollsequenzen, die von onkogenesebezogenen Genen abstammen, kann z.B. verwendet werden, um eine Maus oder eine Kohorte an Mäusen zu erschaffen, die für die Evaluierung des onkogenen Potentials von Verbindungen nützlich ist (worin die Verbindungen den transgenen Tieren verabreicht werden können und die Expression der Reporterexpressionskassetten beobachtet werden kann).
3.1.8 Kontrollelemente, die von Genen abstammen, die in die Entwicklung involviert sind
Wie oben erwähnt, ist die vorliengende Erfindung auch auf die Erschaffung von In-vivo-Modellen von Genen anwendbar, die in unterschiedliche Entwicklungsstadien involviert sind, sowie von Genen, die in Entwicklungsstörungen involviert sind. Nicht einschränkende Beispiele von entwicklungsassoziierten Genen umfassen die Folgenden. Vom bmp-4-Genprodukt (T. Katagiri et al., Dev. Genet. 22 (4), 340-8 (1998)) wurde gezeigt, dass es in die Gastrulation und die Mesoderm-Bildung involviert ist. Das bmp5-Genprodukt (M.J. Solloway et al., Development 126 (8), 1753-68 (1999); A. Bailon-Plaza et al., Bone 24 (3), 211-6 (1999)) scheint in Skelettdefekte involviert zu sein, während das bmp7-Genprodukt (T. Katagiri et al., Dev. Genet. 22 (4), 340-8 (1998); M.J. Solloway et al., Development 126 (8), 1753-68 (1999)) in die Entwick lung von Niere, Auge und des Skeletts involviert zu sein scheint. Unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren können Promotoren und Expressionskontrollelemente, die mit solchen Genen assoziiert werden, verwendet werden, um Expressionskassetten und transgene Tiere zu erschaffen. Transgene Tiere, die solche Reporterexpressionskassetten in sich tragen, können verwendet werden, um z.B. die Wirkung einer Verbindung auf die Expression von entwicklungsassoziierten Genen zu evaluieren, und können z.B. als Indikator für teratogene Wirkungen solcher Verbindungen in Tieren gelten.
3.2.0 Reportergene, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind
Reportergene, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Sequenzen, die für lichterzeugende Proteine oder Polypeptide kodieren. Nicht einschränkende Beispiele solcher Sequenzen, die für lichterzeugende Proteine kodieren, umfassen sowohl lux-Gene (prokaryotische Gene, die für eine Luciferase-Aktivität kodieren) als auch luc-Gene (eukaryotische Gene, die für eine Luciferase-Aktivität kodieren). Es wurde eine Reihe an für Luciferase kodierenden Genen identifiziert, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: B.A. Sherf und K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.670.356, ausgegeben am 23. September 1997; J. Kazami et al., US-Patent Nr. 5.604.123, ausgegeben am 18. Februar 1997; S. Zenno et al., US-Patent Nr. 5.618.722; K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.650.289, ausgegeben am 22. Juli 1997; K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.641.641, ausgegeben am 24. Juni 1997; N. Kajiyama und E. Nakano, US-Patent Nr. 5.229.285, ausgegeben am 20. Juli 1993, M.J. Cormier und W.W. Lorenz, US-Patent Nr. 5.292.658, ausgegeben am B. März 1994; M.J. Cormier und W.W. Lorenz, US-Patent Nr. 5.418.155, ausgegeben am 23. Mai 1995; R.J. de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987); H.N. Tatsumi et al., Biochim. Biophys. Acta 1131, 161-165 (1992), und K.V. Wood et al. Science 244, 700-702 (1989). Luciferase katalysiert unter Verwendung von Luciferin als lumineszierendes Substrat eine Reaktion, um Licht zu produzieren. Ein typisches Anregungsmaximum zur Detektion der Luciferase-Aktivität liegt bei 550 nm.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein auf Stress reagierendes Kontrollelement operabel an ein ausgewähltes Reportergen gebunden. Wenn mehrere, auf Stress reagierende Kontrollelemente bei der Erschaffung eines einzelnen transgenen Tieres (oder Tierlinie) verwendet werden sollen, so kann jedes auf Stress reagierende Kontrollelement z.B. operabel an Sequenzen gebunden werden, die für Luciferasen mit unterschiedlichen Anregungsmaximalwerten kodieren (d.h. Luciferasen, die unterschiedliche Lichtfarben produzieren). Solche Konstrukte ermöglichen die Identifikation jenes auf Stress reagierenden Kontrollelements, das unter einer bestimmten Reihe an Bedinungen induziert wird. Kajiyama und Nakano z.B. (Protein Eng. 4 (6), 691-693 (1991); US-Patent Nr. 5.330.906, ausgegeben am 19. Juli 1994) lehren fünf Varianten an Glühwürmchen-Luciferasen, die durch einzelne Aminosäureveränderungen der kodierenden Sequenz der Luciola-cruciata-Luciferase erzeugt wurden. Diese Varianten besitzen Anregungsmaximalwerte von 558 nm, 595 nm, 607 nm, 609 nm und 612 nm. Eine typische Bandbreite zur Untersuchung der Anregungsmaximalwerte liegt zwischen etwa 300 nm und 1100 nm.
Zusätzlich zu Kontrollelementen, die von Genen von Interesse abstammen (typischerweise einen Promotor und Expressionskontrollsequenzen umfassend), kann die Reportergenkassette der vorliegenden Erfindung auch weitere Expressionskontrollelemente umfassen, z.B. Transkriptionsterminationssignale, Polyadenylierungssequenzen (befinden sich 3' vom Translationsstopcodon), Sequenzen zur Optimierung der Initiation der Translation (befinden sich 5' von der kodierenden Sequenz) und Translationsterminationssequenzen. Weiters kann die Codon-Verwendung in den kodierenden Sequenzen des lichterzeugenden Polypeptids (das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde) optimiert werden, um dem Tier zu entsprechen, in dem das Transgen exprimiert werden soll (z.B. Mäuse).
4.0.0 Evaluierung ausgewählter Kontrollelemente in transgenen Tieren
Transgene Tiere zur Verwendung in der Durchführung der vorliegenden Erfindung können in Übereinstimmung mit den Lehren der vorliegenden Beschreibung zur Erzeugung von Reportergenkassetten (umfassend z.B. auf Stress reagierende Kon trollelemente, unter anderem einen funktionellen Promotor und ein Luciferase-Reportergen) und zur Inkorporation dieser Reportergenkassetten in Tiere unter Anwendung bestehender Verfahren erzeugt werden. Verfahren zur Erschaffung transgener, nicht menschlicher Tiere sind nach dem Stand der Technik bekannt (P. Leder et al., US-Patent Nr. 4.736.866, ausgegeben am 12. April 1988; S. Melmed et al., US-Patent Nr. 5.824.838, ausgegeben am 20. Oktober 1998; F. Bosch et al., US-Patent Nr. 5.837.875, ausgegeben am 17. November 1998; M.R. Capecchi et al., US-Patent Nr. 5.487.992, ausgegeben am 30. Jänner 1996; A. Bradley et al., US-Patent Nr. 5.614.396, ausgegeben am 25. März 1997; H.E. Ruley, US-Patent Nr. 5.627.058, ausgegeben am 6. Mai 1997).
Bei der Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird der Analyt von Interesse (z.B. ein Wirkstoff, der gescreent wird, um seine Toxizität zu bestimmen) dem transgenen Tier verabreicht. Der Analyt kann dem transgenen Tier auf einem beliebigen Standard-Verabreichungsweg verabreicht werden, und dies kann zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger erfolgen. Verabreichungswege umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Injektion (subkutan, epidermal, intradermal), in eine Schleimhaut (z.B. nasal, rektal und vaginal), intraperitoneal, intravenös, oral oder intramuskulär. Andere Verabreichungswege umfassen orale und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen. Die Dosierungsbehandlung kann planmäßig aus einer Einzeldosis oder aus mehreren Dosen bestehen. Der Analyt von Interesse kann z.B. über eine Bandbreite an Konzentrationen verabreicht werden, um eine Dosis/Reaktions-Kurve zu erhalten. Der Analyt kann einer Reihe an Testtieren oder einem einzelnen Testtier verabreicht werden (vorausgesetzt, dass die Reaktion auf den Analyten aus dem transgenen Tier entfernt werden kann).
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein transgenes Tier oder eine Kohorte transgener Tiere erschaffen und an eine Stelle geliefert, die einen Bedarf an solchen Tieren hat, z.B. zur Verwendung im Screening auf einen oder mehrere Analyten von Interesse.
Das Substrat für das Reportergen, falls eines notwendig ist, wird dem transgenen Tier ebenfalls verabreicht. Geeignete Konzentrationen für das Substrat können empirisch für jede konstruierte Linie der Testtiere bestimmt werden. Das Substrat (typischerweise Luciferin) kann vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des Analyten von Interesse erfolgen. Die Verabreichungswege des Substrats können dieselben sein, wie sie für den Analyten beschrieben wurden. Bevorzugte Verabreichungswege des Substrats umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, intravenöse oder lokale Verabreichung.
Die Beobachtung der Expression der lux/luc-Reportergene unter Verwendung nicht invasiver, das ganze Tier umfassender Bildgebungsverfahren wurde bereits beschrieben (C. Contag et al., US-Patent Nr. 5.650.135, 22. Juli 1997; P. Contag et al., Nature Medicine 4 (2), 245-247 (1998); C. Contag et al., OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3, 220-224 (1996); C.H. Contag et al., Photochemistry and Photobiology 66 (4), 523-531 (1997); D.A. Benaron et al., Phil. Trans. R. Soc. London B 352, 755-761 (1997); C.H. Contag et al., Molecular Microbiology 18 (4), 593-603 (1995)). Solche Bildgebungsverfahren verwenden typischerweise zumindest ein Photodetektor-Vorrichtungselement, z.B. eine ladungsgekoppelte Kamera (CCD-Kamera).
4.1.0 Ein Alternativverfahren zur Erschaffung im Wesentlichen isogener transgener Tiere
Ein neues Verfahren, das für die Erschaffung im Wesentlichen isogener einzelner und/oder von Kohorten transgener Tiere der vorliegenden Erfindung nützlich ist, wird unten stehend beschrieben.
Das folgende Verfahren zur Erschaffung transgener Tiere umfasst das Abzielen auf Kassetten, die typischerweise die folgenden Komponenten umfassen: (1) eine geeignete Vektor-Hauptkette; (2) ein Polynucleotid, das für ein lichterzeugendes Protein kodiert; (3) einen Promotor, der operabel an Sequenzen gebunden ist, die für das lichterzeugende Protein kodieren, worin der Promotor zu den kodierenden Sequen zen des lichterzeugenden Proteins heterolog ist; (4) eine Sequenz, die für einen positiven Selektionsmarker kodiert; (5) Insertionsstellen, die die Sequenz, die für den positiven Selektionsmarker kodiert, und das Polynucleotid, das für ein Luciferase-Gen kodiert, flankieren zur Insertion von Sequenzen, die auf ein nicht essentielles chromosomales Einzelkopie-Gen abzielen, und, gegebenenfalls, (6) eine Sequenz, die für einen negativen Selektionsmarker kodiert.
Geeignete Vektor-Hauptketten umfassen im Allgemeinen einen F1-Replikationsstartpunkt; einen von einem Plasmid abstammenden colE1-Replikationsstartpunkt; Polyadenylierungssequenz(en); Sequenzen, die für eine Antibiotika-Resistenz kodieren (z.B. Ampicillin-Resistenz) und andere Regulations- oder Kontrollelemente. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Hauptketten umfassen: pBluescriptSK (Stratagene, La Jolla, CA); pBluescriptKS (Stratagene, La Jolla, CA) und andere im Handel erhältliche Vektoren.
Sequenzen, die für lichterzeugende Proteine kodieren, wurden oben bereits erörtert. Für Luciferase kodierende Sequenzen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Sequenzen, die aus lux-Genen (prokaryotische Gene, die für eine Luciferase-Aktivität kodieren) und luc-Genen (eukaryotische Gene, die für eine Luciferase-Aktivität kodieren) erhalten wurden. Es wurde eine Reihe an für Luciferase kodierenden Genen identifiziert, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: B.A. Sherf und K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.670.356, ausgegeben am 23. September 1997; J. Kazami et al., US-Patent Nr. 5.604.123, ausgegeben am 18. Februar 1997; S. Zenno et al., US-Patent Nr. 5.618.722; K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.650.289, ausgegeben am 22. Juli 1997; K.V. Wood, US-Patent Nr. 5.641.641, ausgegeben am 24. Juni 1997; N. Kajiyama und E. Nakano, US-Patent Nr. 5.229.285, ausgegeben am 20. Juli 1993, M.J. Cormier und W.W. Lorenz, US-Patent Nr. 5.292.658, ausgegeben am B. März 1994; M.J. Cormier und W.W. Lorenz, US-Patent Nr. 5.418.155, ausgegeben am 23. Mai 1995; R.J. de Wet et al., Molec. Cell. Biol. 7, 725-737 (1987); H.N. Tatsumi et al., Biochim. Biophys. Acta 1131, 161-165 (1992), und K.V. Wood et al. Science 244, 700-702 (1989). Eukaryotische Luciferase katalysiert unter Verwendung von Luciferin als lumineszieren des Substrat eine Reaktion, um Licht zu produzieren, wohingegen prokaryotische Luciferase unter Verwendung eines Aldehyds als lumineszierendes Substrat eine Reaktion katalysiert, um Licht zu produzieren.
Wildtyp-Glühwürmchen-Luciferasen besitzen typischerweise ein Emissionsmaximum bei etwa 550 nm. Es wurden ebenso zahlreiche Varianten mit unterschiedlichen Emissionsmaximalwerten untersucht. Kajiyama und Nakano z.B. (Protein Eng. 4 (6), 691-693 (1991); US-Patent Nr. 5.330.906, ausgegeben am 19. Juli 1994) lehren fünf Varianten an Glühwürmchen-Luciferasen, die durch einzelne Aminosäureveränderungen der kodierenden Sequenz der Luciola-cruciata-Luciferase erzeugt wurden. Die Varianten besitzen Emissionspeaks von 558 nm, 595 nm, 607 nm, 609 nm und 612 nm. Eine gelbgrüne Luciferase mit einem Emissionspeak von etwa 540 nm ist im Handel bei Promega, Madison, WI, unter dem Namen pGL3 erhältlich. Eine rote Luciferase mit einem Emissionspeak von etwa 610 nm wird z.B. in Contag et al., Nat. Med. 4, 245-247 (1998), und Kajiyama et al., Prot. Eng. 4, 691-693 (1991), beschrieben.
Positive Selektionsmarker umfassen jedes Gen mit einem Produkt, das leicht zu testen ist. Beispiele umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, ein hprt-Gen (J.W. Littlefield, Science 145, 709-710 (1964)), ein Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(gpt-) Gen oder ein Adenosin-Phosphoribosyltransferase-(aprt-) Gen (Sambrook et al., s.o.), ein Thymidinkinase-Gen (d.h., „TK") und insbesondere das TK-Gen des Herpes-Simplex-Virus (M. Giphart-Gassler et al., Mutat. Res. 214, 223-232 (1989)), ein nptII-Gen (K.R. Thomas et al., Cell 51, 503-512 (1987); S.L. Mansour et al., Nature 336, 348-352 (1988)) oder andere Gene, die Resistenz gegen Aminosäure- oder Nucleosid-Analoga oder Antibiotika etc. verleihen, z.B. Gen-Sequenzen, die für Enzyme kodieren, wie z.B. Dihydrofolatreductase-(DHFR-) Enzym, Adenosindeaminase (ADA), Asparaginsynthetase (AS), Hygromycin-B-Phosphotransferase oder ein CAD-Enzym (Carbamylphosphatsynthetase, Aspartattranscarbamylase und Dihydroorotase).
Die Zugabe des geeigneten Substrats des positiven Selektionsmarkers kann verwendet werden, um zu bestimmen, ob das Produkt des positiven Selektionsmarkers exprimiert wird, z.B. Zellen, die den positiven Selektionsmarker nptII nicht exprimieren, werden abgetötet, wenn sie gegenüber dem Substrat G418 (Gibco BRL Life Technology, Gaithersburg, MD) ausgesetzt werden.
Der abzielende Vektor enthält typischerweise Insertionsstellen zur Insertion von abzielenden Sequenzen (z.B. Sequenzen, die im Wesentlichen homolog zu den Target-Sequenzen im Wirtsgenom sind, in dem die Integration des/der abzielenden Vektors/Expressionskassette gewünscht wird). Diese Insertionsstellen sind vorzugsweise inkludiert, sodass es zwei Stellen gibt, eine Stelle an jeder Seite der Sequenzen, die für den positiven Selektionsmarker kodieren, der Sequenzen, die für ein lichterzeugendes Protein kodieren, und der Promotor. Insertionsstellen sind z.B. Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen und können z.B. einzigartige Restriktionsstellen darstellen. Auf diese Art und Weise kann der Vektor mit den geeigneten Enzymen verdaut werden, und die abzielenden Sequenzen können in den Vektor ligiert werden.
Gegebenenfalls kann das abzielende Konstrukt ein Polynucleotid enthalten, das für einen negativen Selektionsmarker kodiert. Geeignete negative Selektionsmarker umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, HSV-tk (siehe z.B. Majzoub et al., New Engl. J. Med. 334, 904-907 (1996), und US-Patent Nr. 5.464.764) sowie Gene, die für verschiedene Toxine kodieren, unter anderem das Diphterie-Toxin, das Tetanus-Toxin, das Cholera-Toxin und das Pertussis-Toxin. Ein weiteres negatives Selektionsmarker-Gen ist das Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-(HPRT-) Gen zur negativen Selektion in 6-Thioguanin.
Beispiele für Promotoren, die mit den Sequenzen assoziiert sind, die für ein lichterzeugendes Protein kodieren, wurden oben stehend bereits beschrieben.
Ein zentraler Punkt dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die Tatsache, dass die abzielenden Konstrukte „abzielende" Sequenzen enthalten (die kodierende Se quenz des lichterzeugenden Proteins und den Promotor flankierend), die von einem nicht essentiellen Einzelkopie-Gen abstammen. Diese abzielenden Sequenzen im Konstrukt wirken über homologe Rekombination, um zumindest einen Teil des nicht essentiellen Gens im Genom mit den für das lichterzeugende Protein kodierenden Sequenzen (z.B. Luciferase) zu ersetzen, die operabel an einen ausgewählten Promotor gebunden sind.
Nicht einschränkende Beispiele für abzielende Sequenzen zur Verwendung bei der Erschaffung transgener Mäuse umfassen Sequenzen, die aus Vitronectin, Fos B und Galactin 3 erhalten werden oder von diesen abstammen. Eine Suche in der Maus-Knockout-&-Mutation-Datenbank (Genome Systems, Inc., St. Louis, MO) kann verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die in Mäusen einem Knockout-Schritt unterzogen wurden, wobei die erzeugten Knockout-Mäuse keine sichtbaren Defekte aufwiesen.
Einige bevorzugte nicht essentielle Einzelkopie-Gene ohne Phänotypen der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, die Folgenden: Moesin (Msn), Y. Doi et al., J. Biol. Chem. 274, 2315-2321 (1999); Plasminogenaktivatorinhibitor, Typ II (Planh2) und Planh1, K.M. Dougherty, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 686-691 (1999); Nuklearrezeptor-Coaktivator 1 (Ncoa1), C. Qi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 1585-1590 (1999); Nuclearer Faktor des Kappa-Leichtkettengenenhancers in B-Zellen-Inhibitoren, α und β (Nfkbia und Nfkbib), J.D. Cheng et al., J. Exp. Med. 6, 1055-1062 (1998); H19-Fötalleber-mRNA (H19), B.K. Jones et al., Genes Dev. 12, 2200-2207 (1998); Prionen-Protein (Prnp), H.P. Lipp et al., Behav. Brain Res. 95, 47-54 (1998); Centromer-Autoantigen B (Cenpb), A.V. Perez-Castro et al., Dev. Biol. 201, 135-143 (1998); Placenta- und Embryo-Onkofötal-Gen (Pem), J.L. Pitman et al., Dev. Biol. 202, 196-214 (1998); extern regulierte Phosphatase (Ptpn16), K. Dorfman et al., Oncogene 13, 925-931 (1996); transformationsbezogenes Protein 53 (Trp53), M. Ohashi et al., Jpn. J. Cancer Res. 87, 696-701 (1996); H1-0-Histon (H1fv); A.M. Sirotkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6434-6438 (1995); Keratinkinase, mitochondrial 1, ubiquitär (Ckmt1), K. Steeghs et al., Biochim. Biophys. Acta 1230, 130-138 (1995); Neuroblastom-ras-Onkogen (Nras), H. Umanoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 1709-1713 (1995); Vitronectin (Vtn), X. Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 12426-12430 (1995); Vimetin (Vim), G.E. Colucci et al., Cell 79, 679-694 (1994); zelluläres retinsäurebindendes Protein 1 (Crabp1), P. Gorry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9032-9036 (1994); Retinsäurerezeptor β2 (RARβ2), C. Mendelsohn et al., Dev. Biol. 166, 246-258 (1994); Retinsäurerezeptor, α (Rara), E. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1590-1594 (1993); T. Lufkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7225-7229 (1993); Lectin, galactosebindend, löslich 1 (Lgals1), F. Poirier, E.J. Robertson, Development 119, 1229-1236 (1993); myogene Differenzierung 1 (Myod1), M.A. Rudnicki et al., Cell 71, 383-390 (1992); und Tenascin C (Tnc), Y. Saga et al., Genes Dev. 6, 1821-1831 (1992). Hinsichtlich der Richtlinien der vorliegenden Erfindung kann ein durchschnittlicher Fachmann ähnliche, geeignete, nicht essentielle Einzelkopie-Gene in Mäusen und anderen Zelltypen/Organismen auswählen.
Die abzielenden Konstrukte, die die Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung enthalten, worin die Expressionskassette von Sequenzen flankiert wird, die aus dem Gen erhalten wurden, in dem durch homologe Rekombination auf eine Integration abgezielt wird, werden in eine pluripotente Zelle eingeführt (z.B. ES-Zelle, E.J. Robertson, Current Communications in Molecular Biology, 39-44, M.R. Capecchi (Hrsg.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Geeignete ES-Zellen können von jeder beliebigen Spezies abstammen oder aus dieser isoliert werden oder aber auch von jedem beliebigen Stamm einer bestimmten Spezies. Obwohl dies nicht erforderlich ist, stammen die pluripotenten Zellen typischerweise von derselben Spezies ab wie der Rezipient, für den sie gedacht sind. ES-Zellen können aus kommerziellen Quellen erhalten werden, von Internationalen Hinterlegungsstellen (z.B. ATCC), oder alternativ dazu können sie wie von E.J. Robertson, s.o., beschrieben erhalten werden. Beispiele für von Klonen abstammende ES-Zelllinien umfassen 129/SVJ-ES-Zellen, RW-4- und C57BL/6-ES-Zellen (Genome Systems, Inc.).
ES-Zellen werden unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, z.B. wie in Ausubel et al., Abschnitt 9.16, s.o., beschrieben. ES-Zellen werden vorzugsweise auf Stoma- Zellen gezüchtet (wie z.B. STO-Zellen (insbesondere SNC4-STO-Zellen) und/oder primäre Embryo-Fibroblasten-Zellen), wie von E.J. Robertson, s.o., S. 71-112, beschrieben. Kulturmedien umfassen vorzugsweise den leukozytenhemmenden Faktor („lif") (N.M. Gough et al., Reprod. Fertil. Dev. 1, 281-288 (1989); Y. Yamamori et al., Science 246, 1412-1416 (1989)), der dabei zu helfen scheint, eine Differenzierung der ES-Zellen in der Kultur zu verhindern. Es können ebenso auch Stroma-Zellen verwendet werden, die mit dem für lif kodierenden Gen transformiert wurden.
Die abzielenden Konstrukte werden in die ES-Zellen durch jedes beliebige Verfahren eingeführt, das es dem eingeführten Molekül ermöglicht, sich an seinen Homologie-Regionen einer Rekombination zu unterziehen, z.B. Mikro-Injektion, Kalziumphosphat-Transformation oder Elektroporation (F. Toneguzzo et al., Nucleic Acids Res. 16, 5515-5532 (1988); A. Quillet et al., J. Immunol. 141, 17-20 (1988); P. Machy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8027-8031 (1988)). Das in die ES-Zelle zu insertierende Konstrukt muss zuerst eine lineare Form aufweisen. Wenn daher das Knockout-Konstrukt wie oben beschrieben in einen Vektor insertiert wurde, so wird die Linearisierung durch Verdau der DNA mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease durchgeführt, die ausgewählt wurde, um nur innerhalb der Vektorsequenz und nicht innerhalb der Knockout-Konstruktsequenz zu schneiden. Sollen die ES-Zellen elektroporiert werden, um das Konstrukt zu insertieren, so werden die ES-Zellen und die Konstrukt-DNA unter Verwendung einer Elektroporationsmaschine einem elektrischen Impuls ausgesetzt, wobei die Richtlinien des Herstellers zur Verwendung beachtet werden. Nach der Elektroporation wird es den ES-Zellen typischerweise ermöglicht, sich unter geeigneten Inkubationsbedingungen zu erholen. Die Zellen werden dann unter herkömmlichen Bedingungen, wie sie nach dem Stand der Technik bekannt sind, kultiviert und auf die Gegenwart des Konstrukts gescreent.
Das Screening und die Selektion jener Zellen, in die das abzielende Konstrukt integriert wurde, kann unter Verwendung des positiven Selektionsmarkers und/oder des negativen Selektionsmarkers im Konstrukt erreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Konstrukt sowohl positive als auch negative Selektionsmarker. In einem Aspekt werden Verfahren verwendet, die auf der Expression des Selek tionsmarkers beruhen, z.B. durch das Hinzufügen des geeigneten Substrats, um lediglich jene Zellen auszuwählen, die das Produkt des positiven Selektionsmarkers exprimieren, oder um jene Zellen zu eliminieren, die den negativen Selektionsmarker exprimieren. Wenn z.B. der positive Selektionsmarker für eine Neomycin-Resistenz kodiert, so wird G418 in ansteigenden Dosen zum transformierten ES-Zellkulturmedium hinzugefügt. Auf ähnliche Art und Weise wird, wenn der negative Selektionsmarker verwendet wird, ein geeignetes Substrat (z.B. Gancyclovir, wenn der negative Selektionsmarker für HSV-TK kodiert) zu der Zellkultur hinzugefügt. Entweder vor oder nach der Selektion unter Verwendung des geeigneten Substrats kann die Gegenwart der positiven und/oder negativen Selektionsmarker in einer Rezipientenzelle ebenso durch andere Verfahren bestimmt werden, z.B. durch Hybridisierung, Detektion von radiomarkierten Nucleotiden, PCR und dergleichen. In bevorzugten Ausführungsformen werden zuerst Zellen mit integrierten abzielenden Konstrukten durch Hinzufügen des geeigneten Substrats für die positiven und/oder negativen Selektionsmarker ausgewählt. Zellen, die den Selektionsprozess überleben, werden danach mittels anderer Verfahren auf die Gegenwart der integrierten Sequenzen gescreent, wie z.B. PCR oder Southern Blot.
Nachdem geeignete ES-Zellen, die das Konstrukt am geeigneten Ort enthalten, identifiziert wurden, können die Zellen in einen Embryo, vorzugsweise einen Blastozyst, insertiert werden. Die Blastozyten werden durch Perfundieren des Uterus schwangerer Weibchen erhalten. In einer Ausführungsform werden die Blastozyten z.B. aus dem FVB/N-Stamm von Mäusen erhalten, und die ES-Zellen werden z.B. aus dem C57BL/6-Stamm von Mäusen erhalten. Geeignete Verfahren, um dies zu erreichen, sind dem Fachmann bekannt und werden z.B. von Bradley et al., Biotechnology 10, 534-539 (1992), dargelegt. Eine Insertion in den Embryo kann durch eine Reihe verschiedener Wege erreicht werden, die dem Fachmann bekannt sind, ein bevorzugtes Verfahren ist jedoch die Mikroinjektion. Für die Mikroinjektion werden etwa 10-30 ES-Zellen in einer Mikropipette gesammelt und in Embryos injiziiert, die sich im richtigen Entwicklungsstadium befinden, um die Integration der fremden ES-Zelle, die das Konstrukt enthält, in den sich entwickelnden Embryo zu ermöglichen. Das geeignete Entwicklungsstadium des für die Insertion der ES-Zellen verwendeten Embryos ist von der Spezies abhängig und liegt bei Mäusen bei etwa 3,5 Tagen.
Während ein beliebiger Embryo im richtigen Entwicklungsstadium zur Verwendung geeignet ist, wird jedoch die Verwendung von Blastozysten bevorzugt. Zusätzlich sind bevorzugte Blastozysten männlich und besitzen weiters Gene, die für eine Fellfarbe kodieren, die sich von der, für die die Gene der ES-Zellen kodieren, unterscheidet. Auf diese Art und Weise können die Nachkommen leicht auf die Gegenwart des Knockout-Konstrukts gescreent werden, indem nach Tieren mit gefleckten Fellabschnitten gesucht wird (was darauf hindeutet, dass die ES-Zelle in den sich entwickelnden Embryo inkorporiert wurde). Wenn daher z.B. die ES-Zelllinie das Gen für schwarzes Fell in sich trägt, so trägt der ausgewählte Blastozyst Gene für weißes oder braunes Fell in sich.
Nachdem die ES-Zelle in den Blastozyst eingeführt wurde, wird der Blastozyst typischerweise in den Uterus einer pseudoträchtigen Pflegemutter zur Reifung implantiert. Pseudoträchtige Weibchen werden durch Paarung mit Mäuse-Männchen mit Vasektomie derselben Spezies erschaffen, und eine erfolgreiche Implantation muss normalerweise innerhalb von 2-3 Tagen nach der Paarung erfolgen.
Die Nachkommen werden anfänglich auf Tiere mit gefleckten Fellabschnitten gescreent, wobei die Fellfarb-Selektionsstrategie verwendet wurde. Es können ebenso auch Southern-Blot-Tests und/oder PCR verwendet werden, um die Gegenwart der Sequenzen von Interesse zu bestimmen. Nachkommen mit gefleckten Fellabschnitten (chimäre Nachkommen) werden danach miteinander gezüchtet, um homozygote Tiere zu erschaffen. Homozytogen und Heterozygoten können mittels Southern-Blot äquivalenter Mengen genomischer DNA aus Mäusen identifiziert werden, die das Ergebnis dieser Kreuzung sind, sowie aus Mäusen, die bekannte Heterozygoten sind, und Wildtyp-Mäusen. Alternativ dazu können Northern Blots verwendet werden, um die mRNA zu sondieren, um die Gegenwart oder das Fehlen von Transkripten zu identifizieren, die entweder für das ersetzte Gen oder Sequenzen, die für das lichterzeugende Protein (z.B. Luciferase-Gen) kodieren, oder aber beide kodieren. Zusätz lich können Western Blots verwendet werden, um das Expressionslevel des Luciferaseproteins mit einem Antikörper gegen das Luciferase-Genprodukt zu überprüfen. Schlussendlich kann eine In-situ-Analyse (wie z.B. Bindung der Zellen und Markieren mit einem Antikörper) und/oder eine FACS-Analyse (fluoreszenzaktiviertes Zellsortieren) verschiedener Zellen der Nachkommen unter Verwendung geeigneter (z.B. Anti-Luciferase-) Antikörper durchgeführt werden, um nach der Gegenwart oder dem Fehlen des abzielenden Konstrukts zu suchen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammen die Tiere vom C57BL/6-Mausstamm ab. Dieser Stamm entwickelt einer Reihe an Tumoren und wurde verwendet, um eine Reihe an Tumorzelllinien zu entwickeln, z.B. B16-Mclanom-Zellen (unter anderem B16F10, B16D5 und B16F1), Lewis-Lungenkarzinom-Zellen (unter anderem LLC, LLC-h59), T241-Maus-Fibrosarkom-Zellen, RM-1- und pTC2-Maus-Prostatakrebs-Zellen und MCA207-Maus-Sarkom-Zellen. Diese Zelllinien wurden nach der Injektion in C57BL/6-Mäuse extensiv für In-vivo-Tumorbiologie-Studien verwendet. Die erschaffenen transgenen Mäuse aus den Beispielen, auf die abgezielt wurde, befinden sich im genetischen C57BL/6-Hintergrund, und diese Tiere sind zur Injektion oder Implantation solcher Tumorzellen geeignet sowie auch anderer Tumorzellen, die in der Literatur beschrieben werden und für C57BL/6-Mäuse immunkompetent sind. Daher können die transgenen Tiere nun z.B. verwendet werden, um in vivo die Tumor-Progression (z.B. das Wachstum) sowie die Wirksamkeit von Therapien bezüglich der Tumor-Regression zu beobachten. Ist das transgene Tier z.B. anfällig für Tumoren, so wird es auf die Expression eines Reporters hin, z.B. Luciferase, beobachtet, die Indikativ für die Tumorgenese und/oder die Angiogenese ist. Die Beobachtung der Expression von Luciferase-Reporterexpressionskassetten unter Verwendung nicht invasiver, das ganze Tier betreffender Bildgebungsverfahren wurde bereits beschrieben (C. Contag et al., US-Patent Nr. 5.650.135, 22. Juli 1997; P. Contag et al., Nature Medicine 4 (2), 245-247 (1998); C. Contag et al., OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3, 220-224 (1996); C.H. Contag et al., Photochemistry and Photobiology 66 (4), 523-531 (1997); C.H. Contag et al., Molecular Microbiology 18 (4), 593-603 (1995)). Sol che Bildgebungsverfahren verwenden typischerweise zumindest ein Photodetektor-Vorrichtungselement, z.B. eine ladungsgekoppelte Kamera (CCD-Kamera).
Das hierin beschriebene transgene Tier kann ebenso verwendet werden, um die Wirkung eines Analyten (z.B. einer Therapie) zu bestimmen, z.B. auf die Tumorprogression, wobei der Promotor die Expression des lichterzeugenden Proteins induziert, wenn sich ein Tumor entwickelt. Verabreichungswege des Analyten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Injektion (subkutan, epidermal, intradermal), in eine Schleimhaut (z.B. nasal, rektal und vaginal), intraperitoneal, intravenös, oral oder intramuskulär. Andere Verabreichungswege umfassen orale und pulmonale Verabreichung, Suppositorien und transdermale Anwendungen. Die Dosierungsbehandlung kann planmäßig aus einer Einzeldosis oder aus mehreren Dosen bestehen. Der Analyt von Interesse kann z.B. über eine Bandbreite an Konzentrationen verabreicht werden, um eine Dosis/Reaktions-Kurve zu erhalten. Der Analyt kann einer Reihe an Testtieren oder einem einzelnen Testtier verabreicht werden (vorausgesetzt, dass die Reaktion auf den Analyten aus dem transgenen Tier entfernt werden kann).
Die Zucht der chimären Mäuse erzeugt homozygote transgene Mäuse, die erhalten werden sollen, wie dies in 1 dargestellt wird. Die Mäuse, die erhalten werden sollen, werden verwendet, um die Genexpression durch das Messen der luciferasevermittelten Lichtemission aus den Mäusen zu beobachten. In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt die Maus, die erhalten werden soll, eine helle Fellfarbe (z.B. ein weißes Fell), da das schwarzfärbige Fell (ein Beispiel für eine dunkle Fellfarbe) von C57BL/6-Mäusen Licht absorbieren kann, das aus dem Körper emittiert wird, und die Empfindlichkeit des Biolumineszenz-Tests stören kann. Ein Inzucht-Mausstamm C57BL/6-Tyr-C2j/+-Stamm (Jackson Laboratory, Bar Harbor, MN) ist für diesen Zweck erhältlich. Dieser Mausstamm besitzt ein weißfarbiges Fell, hat jedoch trotzdem denselben genetischen Hintergrund wie C57BL/6-Mäuse, außer dass das Gen, das für die schwarze Fellfarbe verantwortlich ist, mutiert wurde. Dementsprechend kann dieser Stamm nützliche Zuchtpartner erzeugen. Leider sind jedoch C57BL/6-Tyr-C2j/+-ES-Zellen im Moment nicht erhältlich. Daher hat das in 1 dargestellte, entworfene Zuchtprogramm zum Ziel, Mäuse zu erschaffen, die für das Target- Transgen homozygot sind und eine weiße Fellfarbe aufweisen. C57BL/6-ES-Zellen werden wie oben beschrieben hergestellt und in einen geeigneten Blastozyst eingeführt (z.B. aus dem FVB/N-Mausstamm). Die Blastozysten werden in eine Pflegemutter implantiert. Chimäre Mäuse werden in 1 als weiße Tiere mit schwarzen und grünen Flecken dargestellt. Chimäre Tiere werden mit C57BL/6-Tyr-C2j/+-Mäusen gezüchtet, um F1-Hybride zu erschaffen. Weiteres Züchten der F1-Hybride erzeugt mehrere Typen an Mäusen, unter anderem den einen, der für das Target-Transgen homozygot ist und eine weiße Fellfarbe aufweist (in 1 als b/b; L/L dargestellt), der zur In-vivo-Beobachtung der Genregulation verwendet wird.
Eine C57BL/6-Maus und eine C57BL/6-Tyr-C2j/+-Maus werden als im Wesentlichen isogen betrachtet. Dementsprechend stellt das in 1 dargestellte Verfahren der vorliegenden Erfindung einen Weg zur Erschaffung von Kohorten oder Zuchtgruppen von im Wesentlichen isogenen Mäusen in einem ausgewählten genetischen Hintergrund bereit, die zumindest ein Transgen von Interesse in sich tragen. Der Besitz von im Wesentlichen isogenen transgenen Mäusen, die eine Kohorte zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen, ermöglicht eine Fehlerreduktion, die ihren Ursprung in Variationen des genetischen Hintergrunds hat.
Transgene Tiere der vorliegenden Erfindung, die mehr als eine Reporterexpressionskassette in sich tragen, können direkt durch die oben beschriebenen Verfahren erschaffen werden (z.B. mehrere Expressionskassetten können an einer einzelnen Stelle integriert werden, oder aber einzelne Expressionskassetten können integriert werden, je an einer unterschiedlichen Stelle). Alternativ dazu können solche Tiere durch Zucht eines ersten transgenen Tieres, das zumindest eine Reporterexpressionskassette in sich trägt, mit einem zweiten transgenen Tier, das zumindest eine Reporterexpressionskassette in sich trägt, erschaffen werden.
4.2.0 Bilddarstellung
Nicht invasive Bilddarstellung und/oder Detektion lichtemittierender Konjugate in Säugetieren wurde in dem im Co-Besitz befindlichen US-Patent Nr. 5.650.135 von Contag et al., ausgegeben am 22. Juli 1997, beschrieben.
Im Bildgebungsverfahren enthalten die Konjugate eine biokompatible Einheit und eine lichterzeugende Gruppierung. Biokompatible Einheiten umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, kleine Moleküle, wie z.B. zyklische organische Moleküle; Makromoleküle wie z.B. Proteine; Mikroorganismen, wie z.B. Viren, Bakterien, Hefe und Pilze; eukaryotische Zellen; alle Typen an Pathogenen und pathogenen Substanzen; und Teilchen, wie z.B. Perlen und Liposomen. In einem anderen Aspekt können biokompatible Einheiten alle oder einige der Zellen sein, aus denen das abgebildete Säugetier besteht.
Die Fähigkeit, Licht zu emittieren, wird den biokompatiblen Einheiten durch die Konjugation einer lichterzeugenden Gruppierung verliehen. Solche Gruppierungen umfassen fluoreszierende Moleküle, fluoreszierende Proteine, enzymatische Reaktionen, die Photonen abgeben, und lumineszierende Substanzen, wie z.B. biolumineszierende Proteine. Die Konjugation kann einen chemischen Kopplungsschritt, das gentechnische Verändern eines Fusionsproteins oder die Transformation einer Zelle, eines Mikroorganismus oder Tieres involvieren, um ein biolumineszierendes Protein zu exprimieren.
Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung sind z.B. die biokompatiblen Einheiten die Zellen, aus denen das abgebildete Säugetier besteht. In diesem Fall ist die lichterzeugende Gruppierung typischerweise ein biolumineszierendes oder fluoreszierendes Protein, das durch lokalisierte, promotorgesteuerte Expression aus einem Vektorkonstrukt, das in die Zellen eingeführt wurde, an die Zellen „konjugiert" wird, und zwar durch das Erschaffen eines transgenen oder chimären Tieres.
Lichtemittierende Konjugate werden einem Subjekt typischerweise durch ein beliebiges einer Vielzahl an Verfahren verabreicht, danach wird es ihnen ermöglicht, im Subjekt zu lokalisieren, wonach sie schließlich dargestellt werden. Da die Darstellung oder das Messen der Photonenemission des Subjekts bis zu einer Zeitspanne von mehreren zehn Minuten dauern kann, wird das Subjekt während des Abbildungsverfahrens normalerweise, jedoch nicht immer, immobilisiert.
Die Abbildung der Licht emittierenden Teile involviert die Verwendung eines Photodetektors, der in der Lage ist, besonders niedrige Lichtlevels zu detektieren – typischerweise einzelne Photonenvorkommnisse – und die Photonenemission zu integrieren, bis ein Bild konstruiert werden kann. Beispiele solcher empfindlichen Photodetektoren umfassen Vorrichtungen, die die einzelnen Photonenvorkommnisse intensivieren, bevor diese von einer Kamera detektiert werden, sowie Kameras (z.B. mit flüssigem Stickstoff gekühlt), die in der Lage sind, einzelne Photonen über dem einem Detektionssystem innewohnenden Hintergrundgeräusch zu detektieren.
Ist einmal ein Photonenemissionsbild generiert, so wird es typischerweise über ein „normales" Bild des Subjekts aus reflektiertem Licht gelegt, um einen Referenzrahmen für die Quelle der emittierten Photonen bereitzustellen (d.h. die Licht emittierenden Konjugate im Hinblick auf das Subjekt zu lokalisieren). Dieses „zusammengesetzte" Bild wird danach analysiert, um den Ort und/oder das Expressionslevel eines Reportergens im Subjekt zu bestimmen.
5.0.0 Nutzen
Es gibt einige geschwindigkeitsbegrenzende Schritte, die die Progression von der Entdeckung eines Wirkstoffs bis zur Entwicklung eines Arzneimittels stören können. Die biologische Überprüfung in prognostischen Tiermodellen ist einer dieser geschwindigkeitsbegrenzenden Schritte und ist eines der schwierigsten Probleme, mit denen die pharmazeutische Industrie konfrontiert ist. Der enorme Zeit- und Geldaufwand, der für die Entwicklung neuer Medikamente erforderlich ist, kann größtenteils auf dieses Problem zurückgeführt werden.
Die Entwicklung von Medikamenten ist teuer, da sie ineffizient ist. Trotz der enormen Anstrengungen, die unternommen werden, um den prognostischen Wert von In-vitro-Screenings und anderen Technologien mit hohem Durchsatz zu verbessern, scheitern jedoch die meisten neuen chemischen Einheiten im Stadium der vorklinischen/klinischen Tests. Weiters scheitert schlussendlich die große Mehrheit der Verbindungen, die bis zu den klinischen Tests in Phase III kommen.
Experimente, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, deuteten darauf hin, dass die Lösung dieses Problems in der Entwicklung von Screening-Verfahren für Wirkstoffe liegt, die in vivo durchgeführt werden. Die Testtiere und die Screening-Verfahren der Verbindungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen ein toxikologisches Screening der Verbindungen sowie das Sammeln relevanter Echtzeit-Daten in lebenden Tieren, wodurch sich eine Möglichkeit des Erhalts besserer Daten über die Toxizität einer ausgewählten Verbindung (eines Analyten) ergibt, bevor zu den vorklinischen oder klinischen Tests übergegangen wird. Daten, die unter Verwendung der Testtiere und Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden, verbessern die Wirksamkeit des Entwicklungsprozesses für Wirkstoffe, indem eine Selektion der am wenigsten toxischen Kandidaten für die weitere Entwicklung ermöglicht wird (d.h. jener Kandidaten, die die wenigsten unerwünschten Nebenwirkungen aufweisen).
Die Testtiere und Verfahren der vorliegenden Erfindung stellen eine In-vitro-Differentialdisplay-Technologie bereit, die ein Screening von Verbindungen in lebenden Tieren mit hohem Durchsatz ermöglichen kann. Durch die Durchführung eines Screenings von Kandidatenverbindungen in lebenden Tieren können größere Mengen physiologischer und pharmakologischer Daten zusammengestellt werden als dies in vitro möglich gewesen wäre. Durch die Verwendung eines Tieres oder einer Reihe an Tieren, das/die Reportergenexpressionskassetten der vorliegenden Erfindung in sich trägt/tragen, kann z.B. die Toxzität eines Testanalyten in Bezug auf eine große Bandbreite an stressinduzierten Systemen im lebenden Tier bestimmt werden, umfassend, jedoch nicht eingeschränkt auf, DNA-bezogenen Stress, proteinbezogenen Stress, energie-/ionenbezogenen Stress, redoxbezogenen Stress, zelloberflä chenrezeptorvermittelte Stressbelastungen, zellulären energiebezogenen Stress. Weiters können die Wirkungen solcher Verbindungen (oder Testanalyten) auf identifizierte Target-Stoffwechselwege (z.B. biochemische Stoffwechselwege, Stoffwechselwege der Entwicklung, onkogene Stoffwechselwege, s.o.) in lebenden Tieren wirksam evaluiert werden. Dementsprechend kann ein großes Ausmaß an Informationen betreffend der spezifischen Natur von z.B. toxischen oder unerwünschten Nebenwirkungen einer/eines Testverbindung/-analyten unter Verwendung der Testtiere und Verfahren der vorliegenden Erfindung zusammengestellt werden.
Durch das In-vivo-Evaluieren der Testverbindungen/-analyten können genauere Überprüfungen bezüglich toxikologischer (unter anderem bezüglich potentieller Nebenwirkungen von Testsubstanzen) und pharmakologischer Informationen erhalten werden. Diese Informationen ermöglichen genauere Prognosen über das Verhalten der/des Testverbindung/-analyten in intakten Säugetiersystemen.
Wie dem Fachmann bekannt ist, können verschiedene Modifikationen und Variationen der oben angeführten Ausführungsformen durchgeführt werden, ohne dabei vom Geist und dem Umfang dieser Erfindung abzuweichen. Diese Modifikationen und Variationen liegen im Schutzumfang dieser Erfindung.

Claims

Transgene Maus, umfassend eine Gruppe von Expressionskassetten, worin die Gruppe folgende Elemente umfasst: eine erste Expressionskassette, die ein erstes Kontrollelement umfasst, das von einem ersten stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA-Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionselementen, JNK, p38, HO GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein erstes lichterzeugendes Polypeptid kodieren, und eine zweite Expressionskassette, die ein zweites Kontrollelement umfasst, das von einem zweiten stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA-Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionselementen, JNK, p38, HO GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das zweite Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein zweites lichterzeu gendes Polypeptid kodieren und das zweite Kontrollelement von einem anderen stressinduzierbaren Gen als das erste Kontrollelement abgeleitet ist, worin die Expressionskassetten im Embryonalstadium in die transgene Maus oder einen Vorfahren der transgenen Maus eingeführt worden ist.
Transgene Maus nach Anspruch 1, worin die Gruppe weiters eine dritte Expressionskassette umfasst, die ein Kontrollelement umfasst, das von einem dritten stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, das aus der aus DNA-abhängiger PK, DNA-Reparaturgenen, GADD45, FOS, XHF, GADD153, TRE, p53RE-Reaktionselementen, JNK, p38, HO GRP78, HSP70, Metallothionein IIA (MTIIA), c-jun (JUN), FOS, Hämoxygenase (HMO), Cytochrom P450 1A1 (CYP1A1), Glutathion-S-Transferase-Ya-Untereinheit (GST Ya), Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH1), IL-1α, IL-1β, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-8, IL-10, ICAM-1, Tyrosin-Hydroxylase (TH), Dopamin-β-Hydroxylase (DBH), Ornithin-Decarboxylase (ODC) und einem Gen, das ein Reaktionselement, ausgewählt aus der aus Thyroidhormon-Reaktionselement (ThRE), NFkBRE, XRE, Retinsäure-Reaktionselement (RARE), Peroxisomproliferations-Reaktionselement (PPRE) und Östrogen-Reaktionselement (ERE) bestehenden Gruppe enthält, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, worin das Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein drittes lichterzeugendes Polypeptid kodieren und das dritte Kontrollelement von einem anderen stressinduzierbaren Gen als das erste und das zweite Kontrollelement abgeleitet ist.
Transgene Maus nach Anspruch 2, worin das erste, zweite und dritte lichterzeugende Polypeptid dieselbe Lichtfarbe erzeugen.
Transgene Maus nach Anspruch 2, worin zumindest zwei von erstem, zweitem und drittem lichterzeugendem Polypeptid unterschiedliche Lichtfarben erzeugen.
Transgene Maus nach Anspruch 2, worin die Gruppe weiters zusätzliche Expressionskassetten umfasst, worin jede Expressionskassette ein Kontrollelement umfasst, das von einem unterschiedlichen stressinduzierbaren Gen abgeleitet ist, worin das Kontrollelement operabel an Sequenzen gebunden ist, die für ein lichterzeugendes Polypeptid kodieren.
Verfahren zur Bestimmung der Auswirkung eines Analyten auf die Genexpression, die von Kontrollelementen vermittelt wird, die von stressinduzierbaren Genen abgeleitet sind, worin die Expression in einer lebenden transgenen Maus erfolgt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Verabreichen eines Analyten an eine lebende transgene Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Verabreichen des Analyten unter Bedingungen erfolgt, die Lichterzeugung durch das lichterzeugende Polypeptid ermöglichen, (b) das Platzieren der transgenen Maus in ein Detektionsfeld einer Photodetektorvorrichtung, (c) das Halten der transgenen Maus im Detektionsfeld der Vorrichtung und (d) während des Haltens der Maus, das Messen von Photonenemission aus der transgenen Maus mit der Photodetektorvorrichtung, um das Expressionsniveau des lichterzeugenden Polypeptids in der lebenden transgenen Maus zu detektieren, worin die Expression durch zumindest eines der Kontrollelemente vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 6, worin die Bedingungen, die durch das lichterzeugende Polypeptid vermittelte Lichterzeugung ermöglichen, das Verabreichen von zumindest einem Substrat für das lichterzeugende Polypeptid an die transgene Maus umfassen.
Nichtinvasives Verfahren zur Detektion eines Expressionsniveaus als Reaktion auf einen Analyten, worin die Expression (i) durch Kontrollelemente vermittelt wird, die von stressinduzierbaren Genen abgeleitet sind, und (ii) in einer lebenden transgenen Maus erfolgt, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: (a) das Verabreichen eines Analyten an eine lebende transgene Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Verabreichen des Analyten unter Bedingungen erfolgt, die Lichterzeugung durch das lichterzeugende Polypeptid ermöglichen, (b) das Platzieren der transgenen Maus in ein Detektionsfeld einer Photodetektorvorrichtung, (c) das Halten der transgenen Maus im Detektionsfeld der Vorrichtung und (d) während des Haltens der Maus, das Messen von Photonenemission aus der transgenen Maus mit der Photodetektorvorrichtung, um das Expressionsniveau des lichterzeugenden Polypeptids in der lebenden transgenen Maus zu detektieren, worin die Expression durch zumindest eines der Kontrollelemente vermittelt wird.
Verfahren nach Anspruch 8, weiters umfassend: (e) das Wiederholen der Schritte (b) bis (d) in ausgewählten Intervallen, worin das Wiederholen wirksam ist, um zeitliche Änderungen der Intensität der Lichtemission in der transgenen Maus zu detektieren.
Verfahren zur Bereitstellung einer transgenen Maus, die zum Screenen eines ausgewählten Analyten geeignet ist, umfassend: das Erzeugen einer transgenen Maus nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und das Bereitstellen der transgenen Maus oder einer von ihr abstammenden Nachkommenschaft zur Verwendung beim Screenen eines ausgewählten Analyten.