DE69932340T2

DE69932340T2 - Eine neue komponente des 'hedgehog'-signalübertragungsweges

Info

Publication number: DE69932340T2
Application number: DE69932340T
Authority: DE
Inventors: G. Peter ZAPHIROPOULOS; Birgitte Anne UNDEN; Rune Toftgard; Fahimeh Rahnama; Robert E. Glaxo Inc. Research Triangle Park HOLLINGSWORTH
Original assignee: Karolinska Innovations AB; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Karolinska Innovations AB; Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 1998-10-06
Filing date: 1999-10-06
Publication date: 2007-07-26
Anticipated expiration: 2019-10-07
Also published as: US20040146929A1; SE9803393D0; JP2002526050A; AU1304400A; ES2268886T3; ATE332711T1; EP1121157B1; WO2000020037A1; EP1121157A1; US6881833B1; DE69932340D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Moleküle, wie z.B. Proteine, Polypeptide und Nucleotide, beteiligt an dem "Hedgehog"-Signalübertragungsweg mit mutmaßlicher Beteiligung an der Embryonalentwicklung und Karzinogenese. Die Erfindung betrifft außerdem verschiedene neue vorteilhafte Verwendungen der erfindungsgemäßen Moleküle, z.B. bei Diagnose und Therapie.
Hintergrund
Beim Studium der Entwicklung von Zellen sind Fruchtfliegen extensiv als ein Modell verwendet worden, weil sie weniger komplex als Säugerzellen sind.
Musterbildung geschieht durch eine Reihe logischer Schritte, die während der Entwicklung eines Organismus viele Male wiederholt werden. Aus einer weiteren evolutionären Perspektive betrachtet sieht man über die Arten hinweg die gleiche Art reiterativer Musterbildungen. Das zentrale Dogma der Musterbildung ist beschrieben worden (Lawrence und Struhl, 1996). Drei ineinandergreifende und überlappende Schritte werden definiert. Zuerst teilen Positionsinformationen in der Form von Morphogengradienten Zellen in nicht-überlappende Sätze auf, wobei jeder Satz ein Kompartiment begründet. Zweitens erwirbt jedes dieser Kompartimente eine genetische Adresse als ein Ergebnis der Funktion aktiver "Selektor"-Gene, die das Zellschicksal innerhalb eines Kompartiments spezifizieren, und außerdem Zellen und ihre Nachkommen anleiten, wie mit Zellen in benachbarten Kompartimenten zu kommunizieren ist. Der dritte Schritt beinhaltet Wechselwirkungen zwischen Zellen in benachbarten Compatimenten, die neue Morphogengradienten initiieren, welche das Muster direkt organisieren.
Wenn man diese Schritte im größeren Detail nimmt, findet man, dass der erste Schritt beim Mustern die Definition von Sätzen an Zellen in jedem Primordium ist. Zellen werden ihren Positionen gemäß hinsichtlich sowohl der dorsoventralen als auch anterioren/posterioren Achse mittels Morphogengradienten zugeordnet. Die Verteilung von Zellen in der Dorsoventralachse legt die Keimschichten bzw. Keimblätter, wie z.B. Mesoderm oder Neuroektoderm, fest.
Bei der Segmentation wird der zweite Schritt (die Spezifizierung des Zellschicksals in jedem Kompartiment) von dem Gen engrailed und Elementen des Bithorax-Komplexes ausgeführt. Engrailed definiert anteriore und posteriore Kompartimente, sowohl bei der Segmentation als auch bei der Ausprägung der Gliedmaßen.
Der dritte Schritt bei der Musterbildung, die Sekretion von Morphogenen, dient zum Differenzieren von Mustern innerhalb von Kompartimenten (und dadurch dem Etablieren von Segmentpolarität). Anfänglich sind alle Zellen innerhalb eines Kompartiments äquipotent, sie werden jedoch zur Ausbildung eines Musters diversifiziert. Musterbildung hängt von Gradienten von Morphogenen ab, von Gradienten, die entlang von Kompartimentgrenzen eingeführt werden. Solche Gradienten werden durch ein Signal kurzer Reichweite etabliert, das in all den Zellen des Kompartiments induziert wird, in welchen das oben erwähnte Selektor-Gen engrailed aktiv ist. Für Segmentpolarität ist dieses Signal Hedgehog. Im benachbarten Kompartiment ist das Selektor-Gen inaktiv, was gewährleistet, dass die Zellen für das Signal empfindlich sind. Der Hedgehog-Signalbereich ist wahrscheinlich nur ein paar Reihen an Zellen weit; ansprechende Zellen werden eine lineare Quelle eines Morphogens mit großer Reichweite, das in alle Richtungen nach außen diffundiert. Es gibt drei bekannte Hedgehogs, Sonic (SHH), Indian (IHH) und Desert (DHH). Die Proteine, die sie codieren, können sich jeweils gegenseitig ersetzen, jedoch resultieren ihre unterschiedlichen Beiträge in Wildtyp-Tieren in einzigartigen Aktivitäten. SHH kontrolliert die Polarität von Gliedmaßenwachstum, steuert die Entwicklung von Neuronen in dem ventralen Neuralrohr und gestaltet Somiten. IHH kontrolliert endochondrale Knochenentwicklung, und DHH ist für die Spermiogenese notwendig. Hedgehog-Gene von Vertebraten werden in vielen anderen Geweben, einschließlich des peripheren Nervensystems, des Gehirns, der Lunge, Leber, Niere, den Zahnprimordien, Genitalien sowie Enddarm- und Kopfdarm-Endoderm exprimiert.
Folglich sind in Fliegen Segmentpolarität-Gene als Mutationen identifiziert worden, welche das Muster der Körpersegmentstrukturen ändern. Mutationen in diesen Genen verursachen, dass Tiere die veränderten Muster auf der Oberfläche von Körpersegmenten entwickeln, wobei die Veränderungen das Muster entlang der Kopf-Schwanz-Achse beeinflussen. Beispielsweise verursachen Mutationen in dem Gen patched, dass jedes Körpersegment sich ohne die normalen Strukturen im Zentrum jedes Segments entwickelt. Stattdessen besteht ein Spiegelbild des normalerweise im anterioren Segment gefundenen Musters. Folglich erzeugen Zellen im Zentrum des Segments die falschen Strukturen und weisen sie in die falsche Richtung hinsichtlich der Gesamt-Kopf- bis -Schwanz-Polarität des Tiers.
Etwa sechzehn Gene in der Klasse sind bekannt. Die codierten Proteine beinhalten Kinasen, Transkriptionsfaktoren, ein Zellverbindungsprotein, zwei sezernierte Proteine, genannt wingless (WG), und das oben genannte Hedgehog (HH), ein einzelnes Transmembran-Protein, genannt patched (PTC), und einige neue Proteine, die zu keinem bekannten Protein verwandt sind. Man glaubt, dass alle diese Proteine in Signalübertragungswegen zusammenarbeiten, die Zellen über ihre Nachbarn informieren, um Zellschicksale und -polaritäten festzusetzen.
PTC wurde, basierend auf genetischen Experimenten in Fliegen, als ein Rezeptor für HH-Protein vorgeschlagen. Ein Modell für das Verhältnis ist, dass PTC über einen weitgehend unbekannten Weg wirkt, um sowohl seine eigene Transkription als auch die Transkription des wingless-Segmentpolarität-Gens zu inaktivieren. Dieses Modell schlägt vor, dass HH-Protein, sezerniert von benachbarten Zellen, an den PTC-Rezeptor bindet, ihn inaktiviert und dadurch verhindert, dass PTC seine eigene Transkription oder die von wingless ab schaltet. Eine Anzahl von Experimenten hat koordinierte Ereignisse zwischen PTC und HH gezeigt.
Humanes patched-Gen (PTCH) wurde kürzlich als das Gen identifiziert, das für das Naevus-artige Basalzellkarzinom-Syndrom (NBCCS), auch bekannt als das Gorlin-Syndrom, verantwortlich ist, welches eine autosomale dominante Störung ist, die sowohl für Krebs als auch Entwicklungsdefekte (Gorlin (1995) Dermatologic Clinics 13:113–125), gekennzeichnet durch multiple Basalzellkarzinome (BCCs), Medulloblastome und Eierstockfibrome sowie zahlreiche Entwicklungsanomalien (Hahn, H., Wicking, C., Zaphiropoulos, P.G., Gailani, M.R., Shanley, S., Chidambaram, A., Vorechovsky, I., Holmberg, E., Unden, A.B., Gillies, S., Negus, K., Smyth, I., Pressman, C., Leffell, D.J., Gerrard, B., Goldstein, A.M., Dean, M., Toftgård, R., Chenevix-Trench, G., Wainright, B. und Bale, A.E. (1996): "Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome", Cell 85, 841–851; und Johnson, R.L., Rothman, A.L., Xie, J., Goodrich, L.V., Bare, J.W., Bonifas, J.M., Quinn, A.G., Myers, R.M., Cox, D.R., Epstein, E.H. Jr. und Scott, M.P. (1996): "Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome", Science 272, 1668–1671) prädisponiert. PTCH codiert für einen Membranrezeptor der autolytisch gespaltenen (Protein-gespaltenen) Amino-terminalen Domäne von sonic hedgehog (SHH) (Mariago, V., Davey, R.A., Zuo, Y., Cunningham, J.M. und Tabin, C.J. (1996): "Biochemical evidence that patched is the Hedgehog receptor", Nature 384, 176–179; und Stone, D.M., Hynes, M., Armanini, M., Swanson, T.A., Gu, Q., Johnson, R.L., Scott, M.P., Pennica, D., Goddard, A., Phillips, H., Noll, M., Hooper, J.E., de Sauvage, F. und Rosenthal, A. (1996): "The tumor-suppressor gene patched encodes a candidate receptor for Sonic hedgehog", Nature 384, 129–134). Man glaubt, dass PTCH im nicht-signalgebenden Zustand die nachfolgende Signalübertragung eines weiteren Membranproteins, smoothened (SMO), inhibiert, jedoch löst Binden von SHH an PTCH diese Inhibition (Goodrich, L.V., Milenkovic, L., Higgins, K.M. und Scott, M.P. (1997): "Altered neural cell fates and medullablastom in mouse patched mutants", Science 277, 1109–1113). Diese Kaskade an Signalübertragungsereignissen, am besten in Drosophila charakterisiert, beinhaltet außerdem eine Anzahl intrazellulärer Komponenten, einschließlich fused (eine Serin-Threonin-Kinase), suppressor of fused, costal 2 und cubitus interruptus (Ruiz i Altaba, A.: "Catching a Glimpse of Hedgehog" (1997) Cell 90, 193–196). Das Letztere ist ein Transkriptionsfaktor, der die Expression von Zielgenen, welche auch PTCH selbst einschließen, positiv reguliert.
Mutationen im PTCH-Gen sind sowohl in sporadischen als auch familiären BCCs identifiziert worden (Gailani, M.R., Ståhle-Bäckdahl, M., Leffell, D.J., Glynn, M., Zaphiropoulos, P.G., Pressman, C., Unden, A.B., Dean, M., Brash, D.E., Bale, A.E. und Toftgård, R. (1996): "The role of human homologue of Drosophila patched in sporadic basal cell carcinomas" Nature Genet. 14, 78–81). Das Fehlen des normalen PTCH-Proteins in diesen Zellen erlaubt, dass die konstitutive Signalübertragung von SMO auftritt, was in der Akkumulation von mutierten PTCH mRNAs resultiert (Undén, B.A., Zaphiropolous, P.G., Bruce, K., Toftgård, R. und Ståhle-Bäckdahl, M. (1997): "Human patched (PTCH) mRNA is overexpressed consistently in tumor cells of both familial and sporadic basal cell carcinoma", Cancer Res. 57, 2336–2340).
WO 96/11260 offenbart die Isolierung von patched-Genen und die Verwendung des PTC-Proteins, um andere Liganden als den etablierten Liganden Hedgehog, die daran binden, zu identifizieren.
Jedoch besteht nach wie vor ein Bedürfnis eines weiteren Verständnisses der SHH/PTCH-Zellsignalübertragung, welches durch Offenbarung weiterer Gene, Peptide und Proteine, die daran beteiligt sind, bereitgestellt werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen signifikanten Schritt vorwärts, betreffend das Verständnis des oben beschriebenen Wegs, dar. Mittels einer Kombination einer cDNA-Bibliothek und RACE-Analyse ist ein neues humanes patched-ähnliches Gen (PTCH2) kloniert und sequenziert worden. Einige alternativ gespleißte mRNA-Formen von PTCH2 sind identifiziert worden, einschließlich Transkripte, denen Segmente fehlen, von denen man glaubt, dass sie an sonic Hedgehog (SHH)-Bindung beteiligt sind, und mRNAs mit unterschiedlich definierten 3-terminalen Exons. Dementsprechend betrifft die Erfindung zwei Spleißvarianten, die in unterschiedlichen C-Termini resultieren, wie in 2B offenbart.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die genomische Sequenz von SEQ ID NO:5, wobei Exons und Introns in der genomischen Sequenz des neuen humanen patched 2-Gens gekennzeichnet sind.
2A offenbart einen Aminosäuresequenzvergleich der humanen PTCH2 (obere Zeilen)- und PTCH1 (untere Zeilen)-Sequenz.
2B ist eine Darstellung der alternativen Spleißereignisse, die in unterschiedlichen C-Termini resultieren.
2C ist eine Darstellung der unterschiedlichen Variationen gespleißter Transkripte, umfassend Exon 1- und Exon 2-Sequenzen.
3A ist eine Dunkelfeld-Mikrophotographie eines BCC-Tumors, hybridisiert mit ³⁵S-markierter, die ein reichlich vorhandenes Signal für PTCH1 mRNA (helle Körner) in allen BCC-Tumorzellen zeigt.
3B offenbart PTCH2 mRNA-Überexpression in BCC und ist im Gegensatz hauptsächlich in den Basaloidzellen in der Peripherie der Tumornester exprimiert.
3C ist ein weiteres BCC, das ein starkes PTCH2 mRNA-Signal in der Peripherie des Tumornestes (Tu) zeigt, wohingegen in der Epidermis (Ep) kein Signal detektiert wird.
3D sind Schnitte des gleichen Tumors (C), hybridisiert mit der PTCH2-Sense-Sonde zeigte sich kein Signal.
3E zeigt Immunreaktivität für Ki-67.
3F offenbart, wie Tumornester unter Hochleistungsvergrößerung reichlich vorhandenes PTCH2 mRNA-Signal (schwarze Körner) in den dunklen Basaloid-Tumorzellen und ein geringeres Signal im Zentrum (Pfeil) zeigen.
Definitionen
Die Ausdrücke "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um auf ein Polymer aus Aminosäureresten Bezug zu nehmen. Die Ausdrücke finden auf Aminosäurepolymere Anwendung, bei welchen ein oder mehrere Aminosäurerest(e) ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich vorkommenden Aminosäure ist, und treffen auch auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere zu.
Die Ausdrücke "isoliert", "gereinigt" oder "biologisch rein" beziehen sich auf Material, welches im Wesentlichen oder tatsächlich von Komponenten frei ist, welche es normalerweise wie in seinem nativen Zustand gefunden begleiten.
Der Ausdruck "Nucleinsäure" bezieht sich auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotid-Polymer in entweder einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, und umfasst, sofern nicht in anderer Weise beschränkt, bekannte Analoga natürlicher Nucleotide, die auf eine ähnliche Weise wie natürlich auftretende Nucleotide wirken können.
Eine "Markierung" ist eine mittels spektroskopischer, photochemischer, biochemischer, immunochemischer oder chemischer Mittel detektierbare Zusammensetzung. Beispielsweise beinhalten nützliche Markierungen ³²P, fluoreszierende Farbstoffe, Elektronendichte-Reagenzien, Enzyme (z.B. wie gewöhnlich in einem ELISA verwendet), Biotin, Dioxigenin ("dioxigenin") oder Haptene, und Proteine, für welche Antiseren oder monoklonale Antikörper erhältlich sind (z.B. kann das Peptid von SEQ ID NO:1 z.B. durch Einbau einer Radiomarkierung in das Peptid detektierbar gemacht werden und verwendet werden, um Antikörper zu detektieren, die spezifisch mit dem Peptid reaktiv sind).
Wie hierin verwendet, ist eine "Nucleinsäure-Sonde" als eine Nucleinsäure definiert, die in der Lage ist, an eine Ziel-Nucleinsäure komplementärer Sequenz über eine oder mehrere Arten chemischer Bindungen, für gewöhnlich über komplementäre Basenpaarung, gewöhnlicherweise über Wasserstoffbrückenbildung, zu binden. Wie hierin verwendet, kann eine Sonde natürliche (d.h. A, G, C oder T) oder modifizierte Basen (7-Deazaguanosin, Inosin etc.) einschließen. Zusätzlich dazu können die Basen in einer Sonde mit einer anderen Bindung als einer Phosphodiesterbindung verbunden sein, solange sie nicht mit der Hybridisierung interferiert. Folglich können Sonden beispielsweise Peptidnucleinsäuren sein, bei welchen die einzelnen Basen durch Peptidbindungen anstatt Phosphodiesterverknüpfungen verbunden sind. Ein Fachmann im Gebiet wird verstehen, dass Sonden abhängig von der Stringenz der Hybridisierungsbedingungen Zielsequenzen binden können, denen vollständige Komplementarität mit der Sondensequenz fehlt. Die Sonden sind vorzugsweise direkt markiert, wie z.B. mit Isotopen, Chromophoren, Lumiphor, Chromogenen, oder sind indirekt markiert, wie z.B. mit Biotin, an welches später ein Streptavidin-Komplex binden kann. Durch Prüfen auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Sonde kann man die Anwesenheit oder Abwesenheit der ausgewählten Sequenz oder Teilsequenz detektieren.
Eine "markierte Nucleinsäure-Sonde" ist eine Nucleinsäure-Sonde, die, entweder kovalent, über einen Linker, oder über ionische, van der Waals- oder Wasserstoffbrückenbindungen an eine Markierung gebunden ist, so dass die Anwesenheit der Sonde durch Detektieren der Anwesenheit der Markierung, die an die Sonde gebunden ist, detektiert werden kann.
Der Ausdruck "Ziel-Nucleinsäure" bezieht sich auf eine Nucleinsäure (oft abgeleitet von einer biologischen Probe), an welche eine Nucleinsäure-Sonde entworfen ist, spezifisch zu hybridisieren. Es ist entweder die Anwesenheit oder Abwesenheit der Ziel-Nucleinsäure, die es zu detektieren gilt, oder die Menge der Ziel-Nucleinsäure, die quantifiziert werden soll. Die Ziel-Nucleinsäure weist eine Sequenz auf, die mit der Nucleinsäuresequenz der entsprechenden Sonde, gerichtet auf das Ziel, komplementär ist. Der Ausdruck Ziel-Nucleinsäure kann sich auf die spezifische Teilsequenz einer größeren Nucleinsäure, auf welche die Sonde gerichtet ist, beziehen, oder auf die Gesamtsequenz (z.B. Gen oder mRNA), bei der der Wunsch nach Detektion des Expressionslevels besteht. Der Unterschied bei Verwendung wird aus dem Zusammenhang ersichtlich sein.
Der Ausdruck "rekombinant", wenn unter Bezugnahme auf eine Zelle oder Nucleinsäure oder einen Vektor verwendet, zeigt an, dass die Zelle oder Nucleinsäure oder der Vektor durch die Einführung einer heterologen Nucleinsäure oder die Veränderung einer nativen Nucleinsäure modifiziert worden ist, oder dass die Zelle von einer so modifizierten Zelle abgeleitet ist.
Der Ausdruck "identisch" im Zusammenhang zweier Nucleinsäuren oder Polypeptidsequenzen bezieht sich auf die Reste in den beiden Sequenzen, welche, wenn zur maximalen Übereinstimmung angeordnet, die gleichen sind. Optimale Anordnung von Sequenzen für einen Vergleich kann z.B. durch den lokale Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482, durch den Homologie-Anordnung-Algorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, durch das Suche-nach-Ähnlichkeit-Verfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, durch computerisierte Implementationen dieser Algorithmen (GAP, GESTFTT, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Betrachtung durchgeführt werden. Der BLAST-Algorithmus führt eine statistische Analyse der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen durch; siehe z.B. Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873–5787.
Der Ausdruck "wesentliche Identität" oder "wesentliche Ähnlichkeit" im Zusammenhang mit einem Polypeptid zeigt an, dass ein Polypeptid eine Sequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz, oder vorzugsweise 80%, oder bevorzugter 85% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz, oder am stärksten bevorzugt 90% Identität über ein Vergleichsfenster von etwa 10–20 Aminosäureresten umfasst. Ein Hinweis darauf, dass zwei Polypeptidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass ein Peptid gegenüber Antikörpern, erzeugt gegen das zweite Peptid, immunologisch reaktiv ist. Folglich ist ein Polypeptid beispielsweise im Wesentlichen identisch mit einem zweiten Polypeptid, wo die beiden Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden.
Ein Hinweis darauf, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass das Polypeptid, welches die erste Nucleinsäure codiert, mit dem Polypeptid, codiert von der zweiten Nucleinsäure, immunologisch kreuzreaktiv ist. Ein weiterer Hinweis darauf, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, dass die beiden Moleküle unter stringenten Bedingungen miteinander hybridisieren.
Die Phrase "hybridisiert spezifisch mit" bezieht sich auf das Binden, Duplexieren oder Hybridisieren eines Moleküls nur an eine spezielle Nucleotidsequenz unter stringenten Bedingungen, wenn diese Sequenz in einem komplexen Gemisch von (z.B. gesamter zellulärer) DNA oder RNA vorliegt. Der Ausdruck "stringente Bedingungen" bezieht sich auf Bedingungen, unter welchen eine Sonde mit ihrer Ziel-Teilsequenz hybridisieren wird, jedoch nicht mit anderen Sequenzen. Stringente Bedingungen sind Sequenz-abhängig und werden unter unterschiedlichen Umständen unterschiedlich sein. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass sie etwa 5°C niedriger als der thermische Schmelzpunkt Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH sind. Die Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke, definiertem pH und definierter Nucleinsäurekonzentration), bei welcher 50% der Sonden, komplementär zu der Zielsequenz, im Gleichgewicht mit der Zielsequenz hybridisieren (weil die Zielsequenzen im Allgemeinen im Überschuss vorhanden sind, sind bei Tm 50% der Sonden im Gleichgewicht besetzt). Typischerweise werden stringente Bedingungen jene sein, bei welchen die Salzkonzentration weniger als 1,0 M Na-Ionenkonzentration, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist, und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze ("whort") Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z.B. größer als 50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch durch Zugabe destabilisierender Mittel, wie z.B. Formamid, erreicht werden.
Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf ein Polypeptid, im Wesentlichen codiert von einem Immunglobulin-Gen oder von Immunglobulin-Genen oder Fragmenten davon, welches spezifisch einen Analyten (Antigen) bindet und erkennt.
Ein "chimärer Antikörper" ist ein Antikörpermolekül, bei welchem (a) die konstante Region oder ein Anteil davon verändert, ersetzt oder ausgetauscht ist, so dass die Antigenbindungsstelle (variable Region) mit einer konstanten Region einer unterschiedlichen oder veränderten Klasse, Effektorfunktion und/oder Spezies verknüpft ist, oder mit einem vollständig unterschiedlichen Molekül verknüpft ist, welches dem chimären Antikörper neue Eigenschaften verleiht, z.B. einem Enzym, Toxin, Hormon, Wachstumsfaktor, Arzneimittel etc.; oder (b) die variable Region oder ein Anteil davon verändert, ersetzt oder ausgetauscht ist mit einer variablen Region, die eine unterschiedliche oder veränderte Antigenspezifität aufweist.
Der Ausdruck "Immunoassay" ist ein Assay, der zum spezifischen Binden eines Analyten einen Antikörper einsetzt. Der Immunoassay ist gekennzeichnet durch die Verwendung spezifischer Bindeeigenschaften eines speziellen Antikörpers, um den Analyten zu isolieren, zu targetieren und/oder zu quantifizieren.
Die Phrasen "bindet spezifisch an ein Protein" oder "spezifisch immunreaktiv mit" bezieht sich, wenn auf einen Antikörper Bezug genommen wird, auf eine Bindungsreaktion, welche für die Gegenwart des Proteins in Anwesenheit einer heterogenen Population von Proteinen und anderen Biologika bestimmend ist. Folglich binden unter vorgesehenen Immunoassay-Bedingungen die spezifizierten Antikörper vorzugsweise an ein spezielles Protein und binden nicht in signifikanter Menge an andere Proteine, die in der Probe vorhanden sind. Spezifisches Binden an ein Protein unter solchen Bedingungen erfordert einen Antikörper, der hinsichtlich seiner Spezifität für ein spezielles Protein ausgewählt ist. Eine Vielfalt an Immunoassay-Formaten kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die mit einem speziellen Protein spezifisch immunreaktiv sind. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um monoklonale Antikörper auszuwählen bzw. zu selektieren, die mit einem Protein spezifisch immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Publications, New York, für eine Beschreibung von Immunoassay-Formaten und -Bedingungen, die verwendet werden können, um sepzifische Immunreaktivität zu bestimmen.
Ein "Genprodukt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Nucleinsäure, deren Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Nucleinsäuresequenz indikativ ist für eine Gegenwart, Abwesenheit, Menge oder Nucleinsäurezusammensetzung des Gens. Genprodukte schließen folglich ein, sind aber nicht limitiert auf, ein mRNA-Transkript, eine cDNA, umkehrtranskribiert von einer mRNA, und RNA, transkribiert von dieser cDNA, eine DNA, amplifiziert aus der cDNA, eine RNA, transkribiert aus der amplifizierten DNA, oder Teilsequenzen von beliebigen dieser Nucleinsäuren. Polypeptide, exprimiert durch das Gen oder Teilsequenzen davon, sind auch Genprodukte. Der spezielle Typ an Genprodukt wird aus dem Kontext und der Verwendung des Ausdrucks ersichtlich sein.
Ein "modifiziertes Arzneimittel" bedeutet eine Verbindung, welche die pharmazeutischen Eigenschaften des ursprünglichen Arzneimittels oder der ursprünglichen aktiven Substanz beibehält, während die Struktur davon modifiziert worden ist. Weiterhin umfasst von dem Ausdruck "Arzneimittel" sind auch Verbindungen, die mittels ihrer spezifischen Bindungseigenschaften in Diagnoseverfahren verwendbar sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung zwei Humanproteine, wie offenbart in 2B, fähig dazu, im humanen PTCH/SHH-Weg während Embryonalentwicklung und/oder Karzinogenese, wie z.B. Basalzellkarzinom, teilzunehmen. Die erfindungsgemäßen Proteine sind von Varianten eines Gens codiert, dessen isolierte Nucleinsäure im Detail unten beschrieben ist und welche aufgrund ihrer Ähnlichkeiten mit "patched 1" (PTCH1) als "patched 2" (PTCH2) bezeichnet wird. Demgemäß weisen die erfindungsgemäßen Proteine, wenn verglichen mit humanem PTCH1-Protein, wesentliche Unterschiede in Sequenz und Funktionen auf. Die Proteine können durch ihre Funktionen gekennzeichnet werden, welche, wenn mit humanem PTCH1 verglichen, ähnlich sind, jedoch auf gewisse Weisen unterschiedlich davon sind, die spezifischer unten in dem Abschnitt "Ergebnisse und Diskussion" offenbart sind. Die neuen humanen PTCH2-Proteine gemäß der Erfindung unterscheiden sich auch von dem zuvor isolierten Maus-PTCH2. Folglich umfasst es in einer bevorzugten Ausführungsform die Aminosäuresequenz, offenbart in SEQ ID NO:1 und eingereicht bei der Gen-Bank unter Protein-Identifikationsnummer AAD17260.1. Eines der vorliegenden Proteine umfasst alle Aminosäuren der Sequenz, bezeichnet SEQ ID NO:1.
Die Proteine gemäß der Erfindung werden von einem Fachmann auf diesem Gebiet mittels rekombinanter DNA-Techniken unter Verwendung der unten offenbarten Moleküle oder irgendeines synthetischen Verfahrens (siehe z.B. Barany und Merrifield, Solid-Phase Peptide synthesis, S. 3–284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Bd. 2: Special Methods in Peptide synthesis, Teil A, Merrifield et al., J. Am. Chem.. Soc., 2149–2156) leicht hergestellt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung der Peptide, Polypeptide und Proteine, die hierin offenbart sind, als Leitverbindungen in Verfahren, die auf das Finden neuer Substanzen, z.B. modifizierter Arzneimittel, wie z.B. Substanzen, die äquivalente oder sogar vorteilhaftere Eigenschaften als die Leitverbindungen als solche aufweisen, abzielen. Solche modifizierten Arzneimittel können auch mittels Verfahren kombinatorischer Chemie entworfen werden, wobei eine strukturell ähnliche Verbindung z.B. mit Hilfe von Computern spezifisch entworfen wird. Alternativ wird das vorliegende modifizierte Arzneimittel durch Screenen einer Bibliothek an Kandidatenverbindungen, z.B. unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, identifiziert. Im vorliegenden Zusammenhang soll verstanden werden, dass, wenn solch ein modifiziertes Arzneimittel identifiziert worden ist, es möglich ist, es mittels irgendeiner anderen geeigneten Technik zu produzieren. Proteomik-Verfahren, wobei vorliegende Moleküle verwendet werden, sowie solch eine Verwendung per se, können auch verwendbar bzw. nützlich sein.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine Nucleinsäure, codierend ein Protein, wie in Ansprüchen 1 und 2 definiert.
Die vorliegende Anmeldung offenbart die isolierte humane genomische PTCH2-Nucleinsäure, umfassend Teile oder alles der genomischen Sequenz, bezeichnet SEQ ID NO:5. In der Offenbarung der genomischen Sequenz, gezeigt in 1, ist die Exon/Intron-Struktur des vorliegenden Gens gezeigt. Zusätzlich zu den darin gezeigten Exons sind Exon 12a und 12b auch identifiziert worden, wie spezifisch definiert von SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4. Interessanterweise gibt es eine Spleißvariante, die Exon 12a mit einem 3'-Segment von Exon 12b mit Konservierung der intronischen GT-AG-Dinucloetide verbindet. Exons 12a und 12b sind nicht Varianten, sondern die eigentlichen Exons des Gens, identifiziert mittels Sequenzierung der entsprechenden genomischen Region. (Materialien und Methoden waren wie unten beschrieben). Demgemäß zeigen diese Ergebnisse, dass PTCH2 die gleiche Intron/Exon-Struktur-Organisation wie PTCH1 aufweist. Die vorliegende Anmeldung offenbart ein Transkript, das nur eines der Exons 9 und 10, definiert in 1, ausgelassen hat. In einer alternativen Ausführungsform hat das erfindungsgemäße Transkript sowohl Exon 9 als auch 10 ausgelassen. Die Spleißvarianten des vorliegenden Gens werden in größerem Detail unten im Abschnitt "Ergebnisse" diskutiert, wobei alle innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Dieser Aspekt der Erfindung ermöglicht vorteilhafterweise das Design geeigneter PCR-Primer, welches wiederum das Screenen aller der codierenden Abschnitte davon nach Mutationen, z.B. mittels SSCP-Analyse, Sequenzieren, oder eines anderen geeigneten Verfahrens, das einem Fachmann auf dem Gebiet bekannt ist, ermöglicht. Demgemäß wurde das neue humane PTCH2-Gen mittels Strahlungshybrid-Kartierung ("radiation hybrid mapping") auf Chromosom lp32-35 mit D15211 und WI-1404 als nächstgelegene flankierende Marker und mit einer geschätzten Lokalisierung 5.5cR von D1S443 lokalisiert. Diese Region wird durch LOH in verschiedenen unterschiedlichen Tumortypen, wie z.B. Neuroblastom, Melanom, Brustkrebs, Darmkrebs etc., oft verloren. Demgemäß ist PTCH2 ein Kandidat für ein Tumorsuppressor-Gen in dieser Region und die vorliegende Erfindung umfasst auch Diagnoseverfahren, basierend auf dieser neuen Offenbarung.
Zu dieser chromosomalen Region sind auch drei Krebs-Prädispositionssyndrome ("cancer predisposition syndroms") kartiert worden, nämlich familiäres Melanom CMM1, Modifiziererlokus für adenomatöse Polyposis coli hMom1 und Michelinreifen-Baby-Syndrom. PTCH2 ist ein weiterer Kandidat für das Gen hinter diesen vererbbaren Syndromen. Die vorliegende Moleküle werden deshalb auch vorteilhafterweise im Zusammenhang dieser Zustände, z.B. bei Therapie und/oder Diagnose, wie z.B. in Assays, verwendet.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch verschiedene PCR-Primer, basierend auf Intronsequenzen, die Amplifikation der gesamten codierenden Sequenz ermöglichen. Solche Primer werden vorteilhafterweise für Mutationsscreenen verwendet.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der neuen isolierten Nucleinsäuren, z.B. um Mutationen für diagnostische und/oder therapeutische Zwecke zu identifizieren.
Weitere Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung beinhalten Nucleinsäure-Sonden, z.B. DNA-Sonden, markierte Nucleinsäuren, cDNAs, RNAs etc., d.h., alle Genprodukte, erhältlich von einem Fachmann im Gebiet, basierend auf den neuen isolierten humanen PTCH2-Varianten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine Nucleinsäure, entsprechend irgendeiner der in 2B offenbarten Spleißvarianten, ein Protein oder Polypeptid, das davon codiert wird, sowie verschiedene Verwendungen davon.
Was die Herstellung von Nucleinsäuren gemäß der Erfindung betrifft, kann eine beliebige geeignete rekombinante DNA-Technik oder ein beliebiges synthetisches Verfahren verwendet werden. (Für allgemeine Laborvorgehensweisen, die in diesem Zusammenhang verwendbar sind, siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl., Bd. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Berger und Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Bd. 153, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols (1994)).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, umfassend eine wie oben definierte Nucleinsäure. Vektoren sind z.B. verwendbar für das Transformieren von Zellen in vitro oder in vivo, um die Proteine und Peptide gemäß der Erfindung zu exprimieren, und können z.B. Plasmide, Viren etc. sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine rekombinante Zelle, wie z.B. eine eukaryotische, z.B. eine Säugerzelle, oder eine prokaryotische Zelle, z.B. ein Bakterium, umfassend einen Vektor, wie oben definiert. Solche Zellen können z.B. verwendet werden, um in einer großen Vielfalt von Zusammenhängen Expressionslevel der erfindungsgemäßen Proteine und erfindungsgemäßen Polypeptide zu verfolgen. Beispielsweise wird, wenn die Effekte eines Arzneimittels bestimmt werden sollen, das Arzneimittel an den transformierten Organismus, das transformierte Gewebe oder die transformierte Zelle verabreicht werden. Dementsprechend sind Modellsysteme, die solche Zellen einschließen, ein weiterer Aspekt der Erfindung.
Einen weiteren Aspekt der Erfindung stellt ein Antikörper dar, wie z.B. ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, welcher spezifisch an ein erfindungsgemäßes Protein oder Polypeptid bindet. Eine beispielhafte Immunglobulin (Antikörper)-Struktureinheit umfasst ein Tetramer. Jedes Tetramer ist zusammengesetzt aus zwei identischen Paaren an Polypeptidketten, wobei jedes Paar eine "leichte" (etwa 25 kD) und eine "schwere" Kette (etwa 50–70 kD) aufweist. Der N-Terminus jeder Kette definiert eine variable Region von etwa 100 bis 110 oder mehr Aminosäuren, vorwiegend verantwortlich für Antigenerkennung. Die Ausdrücke variable leichte Kette (V_L) und variable schwere Kette (V_H) beziehen sich auf diese leichte bzw. schwere Kette.
Die Erfindung umfasst auch chimäre oder andere Antikörper, die die vorliegenden Proteine oder Polypeptide binden. Weiterhin betrifft die Erfindung auch die Verwen dung der vorliegenden Antikörper in Assays (in diesem Zusammenhang siehe z.B. Fundamental Immunology, Dritte Ausgabe, W.E. Paul, Hrsg., Raven Press, N.Y., 1993).
Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine rekombinante Zelle, die einen erfindungsgemäßen Antikörper exprimiert.
Im Allgemeinen können Prokaryoten für das Klonieren der DNA-Sequenzen, codierend eine humane Anti-PTCH2-Immunglobulin-Kette, verwendet werden. E. coli ist ein prokaryotischer Wirt, der insbesondere für das Klonieren der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendbar ist. Mikroben, wie z.B. Hefen, sind auch für die Expression verwendbar. Saccharomyces ist eine bevorzugte Wirtshefe, mit geeigneten Vektoren, die Expressionskontrollsequenzen, einen Replikationsursprung, Terminationssequenzen und dergleichen wie gewünscht aufweisen. Typische Promotoren schließen 3-Phosphoglyceratkinase und andere glykolytische Enzyme ein. Induzierbare Hefepromotoren beinhalten unter anderen Promotoren von Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C und Enzymen, verantwortlich für Maltose- und Galactose-Verwertung.
Säugerzellen sind besonders bevorzugte Wirte für das Exprimieren von Nucleotidsegmenten, codierend Immunglobuline oder Fragmente davon (siehe z.B. Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., 1987). Eine Anzahl geeigneter Wirtszelllinien, fähig zum Sezernieren intakter heterologer Proteine, sind im Fachgebiet entwickelt worden und schließen CHO-Zelllinien, verschiedene COS-Zelllinien, HeLa-Zellen, L-Zellen und Myelomzelllinien ein. Vorzugsweise sind die Zellen nicht-human. Expressionsvektoren für diese Zellen können Expressionskontrollsequenzen beinhalten, wie z.B. einen Replikationsursprung, einen Promotor, einen Enhancer (Queen et al. (1986) Immunol. Rev. 89:49) und notwendige Prozessierungsinformationsstellen, wie z.B. Ribosomenbindungsstellen, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promotoren, abgeleitet von endogenen Genen, Cytomegalovirus, SV40, Adenovirus, Rinderpapillomavirus und dergleichen (siehe z.B. Co et al. (1992) J. Immunol. 1458: 1149).
Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur Detektion eines humanen PTCH2-Gens oder -Polypeptids, umfassend in einem Behälter ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Nucleinsäure, einem Polypeptid oder einem Protein oder einem Antikörper gemäß der Erfindung. Weitere geeignete Komponenten solch eines Kits werden, wie auch die Konditionen ihrer Verwendung, von einem Fachmann auf diesem Gebiet leicht bestimmt.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch die Verwendung einer Nucleinsäure, wie offenbart in Anspruch 1 oder 2 5 in der Gentherapie. Zusätzlich zu den spezifisch offenbarten Sequenzen kann ein beliebiges der hierin offenbarten Exons diesbezüglich verwendet werden. Für einen Review über Gentherapie-Vorgehensweisen siehe Anderson, Science (1992) 256:808–813; Nabel und Felgner (1993) TIBTECH 11:211–217; Mitani und Caskey (1993) TIBTECH 11: 162–166; Mulligan (1993) Science 926–932; Dillon (1993) TIBTECH 11: 167– 175; Miller (1992) Nature 357: 455–460; Van Brunt (1988) Biotechnology 6(10): 1149–1154; Vigne (1995) Restorative Neurology and Neuroscience 8: 35–36; Kremer und Perricaudet (1995) British Medical Bulletin 51(1) 31–44; Haddada et al. (1995) in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler und Böhm (Hrsg.) Springer-Verlag, Heidelberg, Deutschland; und Yu et al., Gene Therapy (1994) 1:13–26.
Die Ablieferung des Gens oder genetischen Materials in die Zelle ist der erste kritische Schritt bei der Gentherapie-Behandlung einer Krankheit. Eine große Anzahl an Ablieferungsverfahren sind dem Fachmann im Gebiet gut bekannt. Solche Verfahren beinhalten beispielsweise Liposomen-basierte Genablieferung (Debs und Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino und Gould-Fogerite (1988) Bio Techniques 6(7): 682–691; Rose US-PS Nr. 5 279 833; Brignam (1991) WO 91/06309; und Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7414), und replikationsdefekte retrovirale Vektoren, die eine therapeutische Polynucleotidsequenz als Teil des retroviralen Genoms tragen (siehe z.B. Miller et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990; Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43, und Cornetta et al., Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)). Weit verwendete retrovirale Vektoren schließen jene, basierend auf murinem Leukämievirus (MuLV), Gibbonaffen-Leukämievirus (GaLV), Affen-Immunodefizienzvirus ("Simian Immuno deficiency virus") (SIV), humanem Immunodefizienzvirus (HIV), und Kombinationen davon, ein. Siehe z.B. Buchscher et al. (1992) J. Virol. 66 (5) 2731–2739; Johann et al. (1992) J. Virol. 66 (5):1635–1640 (1992); Sommerfelt et al. (1990) Virol. 176:58–59; Wilson et al. (1989) J. Virol. 63:2374–2378; Miller et al., J. Virol. 65:2220–2224 (1991); Wong-Staal et al., PCT/US94/05700, und Rosenburg und Fauc (1993) in Fundamental Immunology, Dritte Auflage Panl (Hrsg.) Raven Press, Ltd., New York, und die Referenzen darin, und Yu et al., Gene Therapy (1994) supra.
Die vorliegende Erfindung kann auch in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden. Beispielsweise wird sie Informationen bereitstellen, die schließlich Zellen aus fötalem Gewebe ermöglichen bzw. aktievieren können, welche dann in Patienten transplantiert werden können, die z.B. unter Parkinson'scher Krankheit oder Krebs, wie z.B. BCC, leiden. (Für einen kurzen Übersichtsartikel der Verfahren der Arzneimittelablieferung siehe Langer 249:1 527–1533 (1990), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17. Aufl. (1985) etc.).
Detaillierte Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die genomische Sequenz von SEQ ID NO:5, wobei Exons und Introns in der genomischen Sequenz des vorliegenden humanen patched 2-Gens bezeichnet sind. Jedoch sind Exons 12a und 12b, oben diskutiert, in 1 nicht spezifisch gezeigt, sondern stattdessen als die separaten Sequenzen SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:4 offenbart. Figur 2A offenbart einen Aminosäuresequenzvergleich der Sequenzen von humanem PTCH2 (obere Zeilen) und PTCH1 (unter Zeilen). Vertikale Linien zeigen identische Aminosäuren an, wohin gegen Punkte ähnliche Aminosäuren anzeigen. Die dargestellte PTCH2-Sequenz ist zusammengesetzt aus den ursprünglichen cDNA-Klonen und den Produkten der 5-RACE-Analyse.
2B ist eine Darstellung der alternativen Spleißereignisse, die in unterschiedlichen C-Termini resultieren. In der Parotis und dem Colon sind das vorletzte und letzte Exon kanonisch miteinander verbunden. In fötalem Gehirn dient das vorletzte Exon mit einem Teil des 3-Introns als das terminale Exon. Die Intronsequenz ist durch kleine Buchstaben gezeigt, wobei die flankierenden Exonsequenzen mit Großbuchstaben gezeigt sind. Oberhalb der Nucleotidsequenz ist die abgeleitete Aminosäuresequenz gezeigt, und unterhalb ist die entsprechende Sequenz von Mäuse-Ptch2 gezeigt. Die konservierten intronischen Dinucleotide sind durch Buchstaben in Fettdruck gezeigt, und die Terminationssignale sind mit Sternchen angezeigt. Beachten Sie die Abwesenheit an Konservierung der Position der Stoppkodons zwischen der Mäuse- und humanen PTCH2-Sequenz. Die mutmaßlichen Polyadenylierungssignale sind auch in diesem Diagramm gezeigt. Die genomische Organisation wurde durch Analysieren von BAC-Klonen, umfassend das PTCH2-Gen, erhalten.
2C ist eine Darstellung der unterschiedlichen Variationen an gespleißten Transkripten, umfassend Exon 1- und Exon 2-Sequenzen. Die kanonischen Exons 1 und 2 sind durch Kästchen und das Intron zwischen ihnen durch eine durchgehende Linie gezeigt. Die GT- und AG-Dinucleotide, die sich in den Sequenz erstrecken, die als Introns in individuellen Transkripten verwendet werden, sind durch kleine Buchstaben angezeigt. G, genomische Struktur, abgeleitet aus dem Sequenzieren der Segmente von BAC-Klonen, umfassend das PTCH2-Gen; C, kanonisches Transkript; A, Transkript A (die ausgelassenen Exons 9 und 10 dieses Produkts sind in dem Diagramm nicht gezeigt); B, Transkript B.
3A ist eine Dunkelfeld-Mikrophotographie eines BCC-Tumors, hybridisiert mit ³⁵S-markierter Antisense-Sonde, die ein ausgeprägtes Signal für PTCH1-mRNA (helle Körner) in allen BCC-Tumorzellen zeigt.
3B offenbart PTCH2-mRNA-Überexpression in BCC und ist im Gegensatz hauptsächlich in den Basaloidzellen in der Peripherie der Tumornester exprimiert.
3C ist ein weiterer BCC, der ein starkes PTCH2-mRNA-Signal in der Peripherie des Tumornestes (Tu) zeigt, wohingegen in der Epidermis (Ep) kein Signal detektiert wird.
3D sind Schnitte des gleichen Tumors (C), hybridisiert mit der PTCH2-Sense-Sonde, die kein Signal zeigen.
3E zeigt Immunreaktivität für Ki-67 (braunes Präzipitat), beobachtet in der Peripherie, in den Zellen, die starke Hochregulation von PTCH2-mRNA zeigten.
3F offenbart Tumornester unter Hochleistungsvergrößerung, die ein ausgeprägtes PATCH2-mRNA-Signal (schwarze Körner) in den dunklen Basaloid-Tumorzellen und ein geringeres Signal im Zentrum (Pfeil) zeigen. Balken (A–E), 24 μm, und F, 6 μm.
EXPERIMENTELLES
Materialien und Methoden
Im vorliegenden Zusammenhang wird eine allgemeine Referenz zu G. Zaphiropoulos et al., Cancer Res., Bd. 59, S. 787–792, 15. Februar 1999, gemacht, die im vorliegenden Zusammenhang geeignete Methoden offenbart. Alle in der vorliegenden Anmeldung erwähnten Referenzen sind hierdurch hierin mittels Referenz eingeschlossen. Die Beispiele unten sollen den Umfang der Erfindung nicht beschränken, sondern nur eine Veranschaulichung sein.
Die RACE-Analyse wurde im Wesentlichen wie zuvor beschrieben (Zaphiropoulos, P.G., und Toftgård, R. (1996): "cDNA cloning of a novel WD repeat protein mapping to the 9q22.3 chromosomal region", DNA Cell Biol. 15, 1049–1056) unter Verwendung des Marathon-Kits (Promega) durchgeführt. Die für RACE verwendeten Primersequenzen sind auf Anfrage erhältlich.
³⁵S-markierte PTCH2-RNA-Sonden, verwendet für die in situ-Hybridisierungen, die, wie zuvor beschrieben (Unden et al., (1997), supra) durchgeführt worden waren, entsprachen den Positionen 218 bis 437 und 838 bis 920 in der PTCH2-Sequenz von SEQ ID NO:1.
Ergebnisse und Diskussion
Um zusätzliche Komponenten der PTCH/SHH-Kaskade an Signalübertragungsereignissen zu identifizieren, wurde die Incyte LifeSeq^TM-Datenbank (Incyte Pharmaceuticals Inc., Palo Alto, CA, USA) unter Verwendung von PTCH-Sequenzen durchsucht. Zusätzlich zu Klonen, die die PTCH-cDNA repräsentierten, wurden zwei nahezu identische cDNAs aus der Parotis und dem Colon identifiziert, die Sequenzen enthielten, die ähnlich zu, jedoch verschieden von dem 3-Ende von PTCH waren. Mittels 5-RACE-Analyse unter Verwendung von fötalen Gehirn-cDNAs wurde zusätzliche Sequenzinformation von diesen Transkripten (als PTCH2 bezeichnet) und entsprechend einer Volllängen-cDNA erhalten (2A). PTCH2 ist 75% identisch mit PTCH1, mit einer signifikant variablen Region, die zwischen den Transmembrandomänen 6 und 7 vorhanden ist, und 91% identisch mit der kürzlich publizierten Maus-Ptch2-Sequenz (Motoyama, J., Takabatake, T., Takeshima, K. und Hui, C. (1998): "Ptch2, a second mouse Patched gene is co-expressed with Sonic hedgehog", Nature Genet. 18, 104–106). In Ähnlichkeit mit dem Maus-Gen, fehlt PTCH2 die C-terminale Erweiterung, die in humanem, Maus- und Hühner-PTCH1 vorhanden ist (Goodrich, L.V., Johnson, R.L., Milenkovic, L., Mc-Mahon, J.A., und Scott, M.P. (1996): "Conservation of the hedgehog/patched signalling pathway from flies to mice: Induction of a mouse patched gene by Hedgehog", Genes Dev. 10, 301–312, Marigo, V., Scott, M.P., Johnson, R.L., Goodrich, L.V. und Tabin, C.J. (1996): "Conservation in hedgehog signalling: Induction of a chicken patched homolog by Sonic hedgehog in the developing limb", Development 122, 1225–1233). Jedoch ist gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt worden, dass die humane PTCH2-cDNA 36 Aminosäuren eher als die Maus- Ptch2-Sequenz endet. Weiterhin wurde, als 3-RACE von fötalem Gehirn durchgeführt wurde, eine alternative C-terminale Region identifiziert. Diese hatte eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit der C-terminalen Ptch2-Sequenz, und sie stammt von der genomischen Region ab, die die letzten zwei Exons von PTCH2 verbindet (2B). Deshalb dient in diesen alternativ gespleißten Transkripten das vorletzte Exon mit einem Segment des benachbarten 3-Introns als das terminale Exon.
Weiterhin unterschieden sich die humanen und Maus-Transkripte in der Position der Terminationssingale (die humane Sequenz ist 21 Aminosäuren länger), was eine nicht-konservierte, Spezies-spezifische Funktion dieser alternativen C-terminalen Domäne vorschlägt. Das Finden zweier möglicher C-terminaler Regionen für PTCH2 ist verblüffend und impliziert eine Rolle dieses Phänomens beim Modulieren von Signalübertragung. Zusätzlich alternativ gespleißte Transkripte wurden auch mittels der RACE-Analyse identifiziert (2C). Transkript A fehlt die Sequenz, die Exons 9 und 10 von PTCH1 entspricht (vorläufige Vergleiche der Intron-Exon-Verbindungen von PTCH2 mit PTCH1 zeigen eine ähnliche genomische Organisation an), wobei der offene Leserahmen bei der Verbindung Exon 8-Exon 11 beibehalten wird. Exons 9 und 10 codieren für den letzten Teil der ersten extrazellulären Schleife und für Transmembran-Domänen 2 und 3 in der mutmaßlichen Struktur des PTCH1-Proteins. Weiterhin fehlt diesem Transkript auch ein 5-Segment des kanonischen Exons 2, bedingt durch die Verwendung einer alternativen 3-Spleißstelle, die in diesem Exon vorhanden ist, wobei der offene Leserahmen aufrecht erhalten wird. Die funktionale Konsequenz dieses alternativen Spleißens ist noch nicht bekannt, jedoch ist es interessant anzumerken, dass die extrazellulären Schleifen in PTCH1, wie man vermutet, beim Binden des Liganden SHH beteiligt sind (Marigo et al., (1996), Nature 384, supra; Stone et al., (1996), Nature 384, supra, und dass die Insertion einer Neo-Kassette in Intron 9 des Maus-PTCH1-Gens mit einem schweren Phänotyp assoziiert ist (Hahn, H., Wojnowski, L., Zimmer, A.M., Hall, J., Miller, G. und Zimmer, A. (1998): "Rhabdomyosarcomas and radiation hypersensitivity in a mouse model of Gorlin syndrome", Nature Med. 4, 619–622). Weiterhin codieren Exons 9 und 10 einen Teil einer mutmaßlichen Sterol-Wahrnehmungs-Domäne (Osborne, T.F., und Rosenfeld, J.M. (1998): "Related membrane domains in proteins of sterol sensing and cell signalling provide a glimpse of treasures still buried within the dynamic realm of intracellular metabolic regulation", Curr. Opin. Lipidol. 9, 137–140), auch gefunden in PTCH1, und welche kürzlich mit dem Vermitteln des potenten modulierenden Effekts von Cholesterin auf SHH/PTCH-Signalweiterleitung in Verbindung gebracht wurde (Cooper, M.K., Porter, J.A., Young, K.E., und Beachy, P.A. (1998): "Teratogen-mediated inhibition of target tissue response to Shh signalling", Science 280, 1603–1607). Folglich kann, falls PTCH2 auch als ein Rezeptor für SHH und/oder verwandte Faktoren dient, die Rezeptorform, der Exons 9 und 10 fehlen, veränderte Signalweiterleitungseigenschaften zeigen. Transkript B enthält zusätzliche Sequenzen zwischen kanonischen Exons 1 und 2, die von dem 5-Ende von Intron 1 stammen. Der offene Leserahmen, der das Start-Methionin von Exon 1 einschließt, ist in diesem Transkript nicht beibehalten, was nahe liegt, dass, falls dieses Transkript funktional ist, entweder das Methionin in Exon 2 oder Nicht-Methionin-Kodons verwendet wird/werden, um ein Proteinprodukt zu produzieren. Dies ist ähnlich zu dem, was für die alternativen gespleißten Produkte von humanem PTCH1 vorgeschlagen wurde (Hahn et al., Cell 85, supra). Durch Strahlungshybrid-Kartierung ("radiation hybrid mapping") wurde das PTCH2-Gen im Unterschied zu PTCH1, das sich auf Chromosom 9q22.3 befindet, auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 lokalisiert.
Es wurde berichtet, dass die Maus- und Zebrafisch-Homologen von PTCH2 in einem teilweise überlappenden Muster mit PTCH1 während Embryonalentwicklung exprimiert werden und durch SHH induziert werden (Motoyama et al., (1988) Nature Genet. 18, supra, Concordet, J.P., Lewis, K.E., Moore, J.W., Goodrich, L.V., Johnson, R.L., Scott, M.P. und Ingham, P.W. (1996): "Spatial regulation of a zebrafish patched homologue reflects the roles of sonic hedgehog and protein kinase A in a neural tube and somite patterning", Development 122, 2835–2846), was eine Rolle bei diesem Signalweiterleitungsweg impliziert. Mit diesem Hintergrund waren wir daran interessiert, die Expression von PTCH2 in BCCs, welche konsistente Hochregulation von PTCH1 in allen Tumorzellen zeigen, zu analysieren (Unden et al., (1997) Cancer res. 57, supra. In situ-Hybridisierung wurde bei sechs familiären und vier sporadischen BCCs unterschiedlicher histologischer Subtypen durchgeführt. Ein starkes positives Signal für PTCH2-mRNA wurde ausschließlich in den Tumorzellen aller BCCs beobachtet. Bemerkenswerterweise war das Signal in den Palisaden-Peripherie-Zellen der Tumornester konsistent stärker (2). Diese Zellen zeigten auch eine positive Immunofärbung für den Zellproliferationsmarker Ki-67.
Der Fund, dass in BCCs, die häufige Mutationen in dem PTCH1-Gen aufweisen, die Expression der PTCH2-mRNAs hochreguliert ist, verbindet das neue PTCH2 gemäß der Erfindung eng mit der PTCH/SHH-Kaskade an Signalübertragungsereignissen. Es ist deshalb wahrscheinlich, dass PTCH2 ein Ziel-Gen dieses Wegs darstellt, welches, genau wie PTCH1 selbst, unter der negativen Regulation von PTCH1 ist. Weiterhin legt diese Beobachtung stark nahe, dass PTCH2 Funktionen aufweist, die unterschiedlich zu PTCH1 sind, weil die Hochregulation von PTCH2-Expression nicht in der Lage zu sein scheint, für inaktives PTCH1-Protein zu kompensieren. Diese Schlussfolgerung ist außerdem von der frühen embryonalen Letalität, die in PTCH1 (-/-)-Mäusen 5, 13) gesehen wird, und dem Fehlen genetischer Heterogenität beim Gorlin-Syndrom gestützt. Jedoch verbleibt die Tatsache, ob PTCH2 die konstitutive Signalübertragung von SMO blockieren kann oder als ein zusätzlicher SHH-Rezeptor wirken könnte, möglicherweise abhängig von alternativem Spleißen, der Gegenstand weiteren Experimentierens.
SEQUENZPROTOKOL

Claims

Isolierte Nucleinsäuresequenz, die ein humanes Ptch2-Protein codiert, das SEQ ID NO: 1 aufweist.
Isolierte Nucleinsäuresequenz, die eine Spleißvariante codiert, die Aminosäuren 1-1142 von SEQ ID NO: 1, unmittelbar gefolgt von der Sequenz TrpGlyAlaSerSerSerLeuProGlnSerPheAlaArgValThrThrSerMetThrValAlaIleHisProProProLeuProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThrSerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAlaThrGly, aufweist.
Protein, das SEQ ID NO: 1 aufweist oder Aminosäuren 1-1142 von SEQ ID NO: 1, unmittelbar gefolgt von der Sequenz TrpGlyAlaSerSerSerLeuProGlnSerPheAlaArgValThrThrSerMetThrValAlaIleHisProProProLeuProGlyAlaTyrIleHisProAlaProAspGluProProTrpSerProAlaAlaThrSerSerGlyAsnLeuSerSerArgGlyProGlyProAlaThrGly, aufweist.
Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–2 oder ein Protein nach Anspruch 3 zur Verwendung als ein Medikament.
Verwendung einer Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2 oder eines Proteins nach Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Zustands, involvierend Tumoren, wie z.B. BCC.
In vitro-Diagnoseverfahren, wobei eine Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2 oder ein Protein nach Anspruch 3 verwendet wird.
Screening-Verfahren, wobei eine Bibliothek geeigneter Kandidatenverbindungen unter Verwendung eines Proteins nach Anspruch 3 als eine Leitverbindung nach modifizierten Arzneimitteln durchmustert wird.
Vektor, umfassend eine Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–2.
Rekombinante Zelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 8.
Antikörper, welcher spezifisch an ein Protein nach Anspruch 3 bindet.
Rekombinante Zelle, exprimierend einen Antikörper nach Anspruch 10.
Kit zur Detektion eines human Ptch2-Gens oder -Proteins, umfassend in einem Behälter ein Molekül, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1–2, einem Protein nach Anspruch 3 oder einem Antikörper nach Anspruch 11.
Verwendung einer Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Gentherapie.
In vitro-Verwendung einer Nucleinsäuresequenz nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 2 als Sonde, Primer oder diagnostisches Reagenz.