DE69930370T2

DE69930370T2 - Testisspezifische, menschliche proteinase, svph1-8

Info

Publication number: DE69930370T2
Application number: DE69930370T
Authority: DE
Inventors: Pat Douglas Seattle CERRETTI
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1998-01-14
Filing date: 1999-01-12
Publication date: 2006-10-12
Anticipated expiration: 2019-01-13
Also published as: EP1045914A1; ATE320496T1; EP1045914B8; NZ506277A; AU750038B2; CA2317838A1; IL137265A0; DK1045914T3; DE69930370D1; AU2221999A; EP1045914B1; ES2260899T3; WO1999036549A1; PT1045914E; JP2002508969A; CY1105287T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist auf gereinigte und isolierte SVPH1-8 Polypeptide gerichtet, die Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, Verfahren zur Herstellung rekombinanter Formen solcher Polypeptide, Antikörper, die gegen diese Polypeptide erzeugt wurden, fragmentierte Peptide, die von diesen Polypeptiden abgeleitet sind, die Verwendung solcher Polypeptide und fragmentierter Peptide als Molekulargewichtsmarker, die Verwendung solcher Polypeptide und fragmentierter Polypeptide als Kontrollen für die Peptidfragmentierung, die Verwendung solcher Nukleinsäuren, Polypeptide und Antikörper als Zell- und Gewebemarker und Kits, die diese Reagenzien umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entdeckung und Identifizierung von Proteinen steht in der vordersten Reihe der modernen Molekularbiologie und Biochemie. Die Identifizierung der Primärstruktur oder Sequenz eines Testproteins ist der Höhepunkt eines beschwerlichen Experimentierungsprozesses. Um ein unbekanntes Testprotein zu identifizieren, kann der Forscher auf den Vergleich des unbekannten Testproteins mit bekannten Peptiden unter Verwendung einer Vielzahl von Methoden, die den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, vertrauen. Zum Beispiel werden Proteine routinemäßig unter Verwendung von Methoden, wie z.B. der Elektrophorese, Sedimentation, Chromatografie und Massenspektrometrie, analysiert.
Der Vergleich einer unbekannten Proteinprobe mit Polypeptiden mit bekanntem Molekulargewicht erlaubt eine Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts der unbekannten Proteinprobe (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)). Proteinmolekulargewicht-Standards sind kommerziell erhältlich und sind bei der Abschätzung von Molekulargewichten unbekannter Proteinpro ben behilflich (New England Biolabs Inc. Katalog: 130–131, 1995; J. L. Hartley, US-Patent Nr. 5,449,758). Jedoch kann es vorkommen, dass die Molekulargewicht-Standards in ihrer Größe nicht ausreichend genug mit dem unbekannten Testprotein übereinstimmen, um eine genaue Einschätzung des scheinbaren Molekulargewichts zu erlauben.
Die Schwierigkeit bei der Abschätzung des Molekulargewichts ist in dem Fall von Proteinen, die einer Fragmentierung durch chemische oder enzymatische Mittel unterzogen werden, noch erhöht (A. L. Lehninger, Biochemistry 106–108 (Worth Books, 2d ed. 1981)). Chemische Fragmentierung kann durch Inkubieren eines Proteins mit einer Chemikalie, wie z.B. Cyanbromid, das zur Spaltung der Peptidbindung auf der Carboxylseite von Methioninresten führt, erreicht werden (E. Gross, Methods in Enz. 11: 238–255, 1967). Die enzymatische Fragmentierung eines Proteins kann durch Inkubation eines Proteins mit einer Protease erreicht werden, die an mehreren Aminosäureresten spaltet (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977). Die enzymatische Fragmentierung eines Proteins kann außerdem durch Inkubation eines Proteins mit einer Protease, wie z.B. der Achromobacter Protease I (F. Sakiyama und A. Nakata, US-Patent Nr. 5,248,599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55, 1981), erreicht werden, was zu einer Spaltung der Peptidbindung auf der Carboxylseite von Lysinresten führt. Die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide können einen großen Bereich von Molekulargewichten abdecken, und die Peptide können zahlreich sein. Variationen in dem Grad der Fragmentierung können ebenfalls erreicht werden (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977).
Die einzigartige Beschaffenheit der Zusammensetzung eines Proteins im Hinblick auf dessen spezifische Aminosäure-Konstituenten resultiert in einer einzigartigen Lage der Spaltungsstellen innerhalb des Proteins. Die spezifische Spaltung eines Proteins durch chemische oder enzymatische Spaltung resultiert in einem einzigartigen "Peptid-Fingerprint" (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977; M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50: 309–316, 1980). Folglich resultiert die Spaltung an spezifischen Stellen in einer reproduzierbaren Fragmentierung eines bestimmten Proteins in Peptide mit präzisen Molekulargewichten. Darüber hinaus besitzen diese Peptide einzigartige Ladungseigenschaften, die den isoelektrischen pH des Peptids bestimmen. Diese einzigartigen Eigenschaften können unter Verwendung einer Vielzahl von elektrophoretischen und anderen Methoden ausgenutzt werden (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)).
Wenn ein Peptid-Fingerprint von einem unbekannten Protein erhalten wird, kann dieser mit einer Datenbank von bekannten Proteinen verglichen werden, um bei der Identifizierung des unbekannten Proteins behilflich zu sein (W. J. Henzel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17: 588–599, 1996). Eine Vielzahl von Computer-Software-Programmen sind dem Fachmann auf dem Gebiet zur Erleichterung dieser Vergleiche über das Internet zugänglich, wie z.B. Multi-Ident (Internetseite: www.expasy.ch/sprot/multiident.html), PeptideSearch (Internetseite: www.mann.embl-heidelberg.de... deSearch/FR_PeptideSearchForm.html) und Pro-Found (Internetseite: www.chait-sgi.rockefeller.edu/cgi-bin/prot-id-frag.html). Diese Programme erlauben dem Benutzer, die Spaltungsmittel und die Molekulargewichte der fragmentierten Peptide innerhalb einer festgelegten Toleranz zu bestimmen. Die Programme vergleichen diese Molekulargewichte mit Proteindatenbanken, um bei der Bestimmung der Identität des Testproteins behilflich zu sein. Genaue Informationen betreffend die Anzahl der fragmentierten Peptide und das genaue Molekulargewicht dieser Peptide sind für eine akkurate Identifizierung erforderlich. Daher sollte eine Zunahme der Genauigkeit bei der Bestimmung der Anzahl fragmentierter Peptide und dem genauen Molekulargewicht dieser Peptide zu einem verbesserten Erfolg bei der Identifizierung unbekannter Proteine führen.
Die Fragmentierung von Proteinen wird weiterhin bei der Herstellung von Fragmenten für die Analyse von Aminosäure-Zusammensetzungen und bei der Proteinsequenzierung angewendet (P. Matsudiara, J. Biol. Chem. 262: 10035–10038, 1987; C. Eckerskorn et al., Electrophoresis 1988, 9: 830–838, 1988), insbesondere bei der Herstellung von Fragmenten von Proteinen mit einem "blockierten" N-Terminus. Zusätzlich kann die Fragmentierung von Proteinen bei der Herstellung von Peptiden für die Massenspektrometrie verwendet werden (W. J. Henzel et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5011–5015, 1993; B. Thiede et al., Electrophoresis 1996, 17: 588–599, 1996), für die Immunisierung, für die Affinitätsselektion (R. A. Brown, US-Patent Nr. 5,151,412), für die Bestimmung von Modifikationsstellen (z.B. Phosphorylierung), für die Erzeugung von aktiven biologischen Wirkstoffen (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorga nisms 300–301 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)) und zur Differenzierung von homologen Proteinen (M. Brown et al., J. Gen. Virol. 50: 309–316, 1980).
Die EMBL-Datenbank-Zugangsnummer AF0229900 ist ein EMBL-Datenbank-Eintrag, der die ADAM 21 genannte Sequenz offenbart, ein Polypeptid, das keine Proteasefunktion zeigt und das eine 99,8% Identität über einen Abschnitt von 1626 Basenpaaren mit der Sequenz ID NO 1 der vorliegenden Erfindung teilt.
Angesichts des fortdauernden Interesses an der Proteinforschung und der Aufklärung von Proteinstruktur und -eigenschaften, besteht auf dem Gebiet ein Bedarf an Polypeptiden, die zur Verwendung in Peptidfragmentierungsstudien und bei Molekulargewichtsmessungen geeignet sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung ist bei der Erfüllung dieses Bedarfs auf dem Gebiet behilflich. Die Erfindung umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1;
(b) einem Nukleinsäuremolekül, das die Sequenz der Nukleotide 595–1191 der SEQ ID NO: 1 umfasst;
(c) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die Sequenz der SEQ ID NO: 2 umfasst;
(d) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die Aminosäuren 199–397 der SEQ ID NO: 2 umfasst;
(e) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem von beiden Strängen einer denaturierten, doppelsträngigen DNA, welche die Nukleinsäure gemäß (a), (b), (c) oder (d) umfasst, unter Bedingungen moderater Stringenz in 50% Formamid und 6 × SSC, bei 42°C und bei Waschbedingungen von 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS hybridisiert, wobei das genannte Nukleinsäuremolekül eine Aminosäuresequenz kodiert, die wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist und Proteinaseaktivität hat; und
(f) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment des Polypeptids der SEQ ID NO: 2 kodiert und Proteinaseaktivität hat.

Folglich umfasst die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfasst und ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 kodiert. Die Erfindung umfasst außerdem Nukleinsäuremoleküle, die komplementär zu diesen Sequenzen sind. Als solche schließt die Erfindung doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle, welche die DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 umfassen und isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche die Aminosäuresequenzen SEQ ID NO: 2 kodieren, ein. Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige RNA- und DNA-SVPH1-8 Nukleinsäuremoleküle sind von der Erfindung umfasst. Diese Moleküle können verwendet werden, um sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige RNA- und DNA-Varianten von SVPH1-8, die von der Erfindung umfasst sind, zu detektieren. Eine doppelsträngige DNA-Sonde erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, die einem von beiden Strängen des Nukleinsäuremoleküls entsprechen. Isolierte Nukleinsäuremoleküle, die mit einer denaturierten, doppelsträngigen DNA, welche die DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 oder ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 kodiert, umfasst, unter Bedingungen moderater Stringenz in 50% Formamid und 6 × SSC, bei 42°C und bei Waschbedingungen von 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS hybridisieren, sind von der Erfindung umfasst.
Die Erfindung umfasst weiterhin isolierte Nukleinsäuremoleküle, die mit Hilfe von in vitro-Mutagenese von der SEQ ID NO: 1 abgeleitet sind. In vitro-Mutagenese würde zahlreiche auf dem Gebiet bekannte Methoden einschließen, ist jedoch nicht auf ortsgerichtete Mutagenese, Zufallsmutagenese und in vitro-Nukleinsäuresynthese beschränkt. Die Erfindung umfasst außerdem isolierte Nukleinsäuremoleküle, die in Bezug auf die SEQ ID NO: 1 als Ergebnis des genetischen Codes degeneriert sind, isolierte Nukleinsäuremoleküle, die allele Varianten der humanen SVPH1-8 DNA sind, oder ein Artenhomolog der SVPH1-8 DNA. Die Erfindung umfasst außerdem rekombinante Vektoren, welche die Expression dieser Nukleinsäuremoleküle steuern und Wirtszellen, die mit diesen Vektoren transformiert oder transfiziert sind.
Die Erfindung umfasst weiterhin isolierte Polypeptide, die von diesen Nukleinsäuremolekülen kodiert werden, einschließlich isolierter Peptide, die ein Molekulargewicht von etwa 81 kD, wie durch SDS-PAGE bestimmt, aufweisen und isolierte Peptide in nicht-glycolysierter Form. Isolierte polyklonale oder monoklonale Antikörper, die an diese Polypeptide binden, sind von der Erfindung umfasst. Die Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Herstellung von SVPH1-8 Polypeptiden, einschließlich der Kultivierung einer Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression fördern und der Gewinnung der Polypeptide aus dem Kulturmedium. Insbesondere ist die Expression von SVPH1-8 Polypeptiden in Bakterien, Hefen, Pflanzen- und Tierzellen von der Erfindung umfasst.
Zusätzlich sind Assays, welche die SVPH1-8 Polypeptide zum Screenen nach potenziellen Inhibitoren der Aktivität, die mit SVPH1-8 Polypeptid-Gegenstrukturmolekülen assoziiert ist, verwenden und Verwendungsformen der SVPH1-8 Polypeptide als therapeutische Mittel für die Behandlung von Krankheiten, die durch SVPH1-8 Polypeptid-Gegenstrukturmoleküle vermittelt werden, umfasst. Weiterhin sind auch Verfahren zur Verwendung von SVPH1-8 Polypeptiden bei der Konstruktion von Inhibitoren davon ein Aspekt der Erfindung.
Die Erfindung umfasst weiterhin die fragmentierten Peptide, die von den SVPH1-8 Polypeptiden durch chemische oder enzymatische Behandlung hergestellt werden. Darüber hinaus sind Formen von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern und fragmentierten Peptiden davon, in denen wenigstens eine der Stellen, die für die Fragmentierung durch chemische oder enzymatische Mittel notwendig sind, mutiert worden ist, ein Aspekt der Erfindung.
Bevorzugt ist ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) Aminosäuren 1–26 der SEQ ID NO: 2
(b) Aminosäuren 1–397 der SEQ ID NO: 2:
(c) Aminosäuren 1–501 der SEQ ID NO: 2;
(d) Aminosäuren 1–680 der SEQ ID NO: 2;
(e) Aminosäuren 2–76 der SEQ ID NO: 2;
(f) Aminosäuren 27–198 der SEQ ID NO: 2;
(g) Aminosäuren 27–245 der SEQ ID NO: 2;
(h) Aminosäuren 27–397 der SEQ ID NO: 2;
(i) Aminosäuren 27–501 der SEQ ID NO: 2;
(j) Aminosäuren 27–680 der SEQ ID NO: 2;
(k) Aminosäuren 172–245 der SEQ ID NO: 2;
(l) Aminosäuren 199–397 der SEQ ID NO: 2;
(m) Aminosäuren 99–501 der SEQ ID NO: 2;
(n) Aminosäuren 199–680 der SEQ ID NO: 2; und
(o) einem Fragment der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, das Proteinaseaktivität hat;
(p) einer Aminosäuresequenz, die 80% Identität mit den Aminosäuren 1–26 der SEQ ID NO: 2 hat; und
(q) einer Aminosäuresequenz, die 80% Identität mit den Aminosäuren 2–76 der SEQ ID NO: 2 aufweist;

Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Visualisierung von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern und fragmentierten Polypeptiden davon unter Verwendung von Elektrophorese. Die Erfindung schließt weiterhin ein Verfahren zur Verwendung von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern und fragmentierten Peptiden davon als Molekulargewichtsmarker ein, welche die Abschätzung des Molekulargewichts einer Proteinprobe oder einer fragmentierten Proteinprobe erlaubt. Die Erfindung umfasst ferner Verfahren zur Verwendung von SVPH1-8 Polypeptiden und fragmentierten Peptiden davon als Marker, die bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes eines Testproteins behilflich sind. Die Erfindung umfasst auch Verfahren zur Verwendung von SVPH1-8 Polypeptiden und fragmentierten Peptiden davon als Kontrollen zur Ermittlung des Ausmaßes der Fragmentierung einer Proteinprobe.
Weiterhin von dieser Erfindung umfasst sind Kits, die bei der Bestimmung des Molekulargewichts eines Testproteins unter Verwendung von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern, fragmentierten Peptiden davon und Formen von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern, in denen wenigstens eine der Stellen, die für die Fragmentierung durch chemische oder enzymatische Mittel notwendig sind, mutiert worden ist, behilflich sind.
Weiterhin von dieser Erfindung umfasst sind Verfahren zur Verwendung von SVPH1-8 Nukleinsäuren, Polypeptiden und Antikörpern als Zell- und Gewebe-Marker bei der Identifizierung und Reinigung von SVPH1-8 exprimierenden Zellen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Eine cDNA, die humanes SVPH1-8 Polypeptid kodiert, wurde isoliert und ist in SEQ ID NO: 1 offenbart.
Durch Northern-Blot-Analyse unter Verwendung einer SVPH1-8 Nukleinsäuresonde wurde die Expression der SVPH1-8 RNA nur in Hoden nachgewiesen. Daher kann die SVPH1-8 Expression als Marker für Hodenzellen und -gewebe verwendet werden.
Die Entdeckung der für humanes SVPH1-8 Polypeptid kodierenden cDNA ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche die Nukleinsäuresequenzen, die die SVPH1-8 Polypeptide kodieren, umfassen; Wirtszellen, die mit den Expressionsvektoren transfiziert oder transformiert sind; biologisch aktive humane SVPH1-8 Proteinase und SVPH1-8 Molekulargewichtsmarker als isoliert und gereinigte Proteine; und Antikörper, die mit SVPH1-8 Polypeptiden immunologisch reagieren.
Die SVPH1-8 DNA (SEQ ID NO: 1) kodiert das SVPH1-8 Polypeptid (SEQ ID NO: 2):
Das SVPH1-8 Polypeptid (SEQ ID NO: 2) weist alle konservierten Domänenstrukturen auf, die in Säuger-Adamalysinen (ADAMS) zu finden sind: Signalsequenz (Aminosäuren 1–26 der SEQ ID NO: 2), Pro-Domäne (Aminosäuren 27–198 der SEQ ID NO: 2), katalytische Domäne einschließlich der drei konservierten His-Reste (Aminosäuren 199–397 der SEQ ID NO: 2), Disintegrin-Domäne (Aminosäuren 398–501 der SEQ ID NO: 2), Cysreiche Domäne (Aminosäuren 502–680 der SEQ ID NO: 2), Transmembran-Domäne (Aminosäuren 681–707 der SEQ ID NO: 2) und eine cytoplasmatische Domäne (Aminosäuren 708–722 der SEQ ID NO: 2).
ADAMS 1–6 wurden mit der Fertilisation und/oder Spermatogenese in Verbindung gebracht (Barker, H. L., Perry, A. C., Jones, R., und Hall, L., Biochim Biophys Acta, 1218, 429–31, 1994; Blobel, C. P., Wolfsberg, T. G., Turck, C. W., Myles, D. G., Primakoff, P., und White, J. M., Nature, 356, 248–252, 1992; Evans, J. P., Schultz, R. M., und Kopf, G. S., J. Cell Sci, 108, 3267–3278, 1995; Perry, A. C., Barker, H. L., Jones, R., und Hall., L., Biochim Biophsy Acta, 1207, 134–137, 1994; Perry, A. C., Gichuhi, P. M., Jones, R., und Hall, L., Biochem J., 307, 843–850, 1995; Perry, A. C., Jones, R., und Hall, L., Biochem J., 312, 239–244, 1995; Wolfsberg, T. G., Bazan, J. F., Blobel, C. P., Mules, D. G., Primakoff, P., und White, J. M., Proc Natl Acad Sci USA, 90, 10783–10787, 1993; und Wolfsberg, T. G., Straight, P. D., Gerena, R. L., Huovila, A. P., Primakoff, P., Myles, D. G., und White, J. M., Dev Biol, 169, 378–383, 1995). Das Ergebnis durch Northern-Analyse, wonach SVPH1-8 spezifisch in Hoden exprimiert wird, bringt dieses Familienmitglied ebenfalls mit der Fertilisation und/oder Spermatogenese in Verbindung. Darüber hinaus haben Menschen keine aktive Form dieses Gens, während von ADAM1 festgestellt wurde, dass es für die Fusion von Spermium und Ei notwendig ist. Folglich könnte SVPH1-8 das humane Pendant sein. Die katalytische Domäne von SVPH1-8 ist für die biologische Aktivität erforderlich. Ein Proteinaseinhibitor der katalytischen Domäne würde die SVPH1-26 Aktivität inhibieren und wäre nützlich als Verfahren für die Geburtenkontrolle. Außerdem kann ein Inhibitor der Disintegrinn-Domäne von SVPH1-26 die Fertilisation beeinträchtigen.
Die SVPH1-8 Protease ist ein Mitglied der Schlangengift-Proteasefamilie und ist homolog zu dem TACE-Protein. TACE ist eine Proteinase, die für den Abwurf (shedding) von Membranproteinen einschließlich TNFα, p80 TNFR, p60TNFR, L-Selectin, Typ II IL-1R und β-Amyloid-Vorläuferprotein erforderlich ist. Die SVPH1-8 Proteinase weist außerdem eine Homologie zu Fertilin-α auf, das für die Bindung des Spermiums an das Ei erforderlich ist; Meltrin-α, das für die Fusion von Myoblasten in Muskelzellen erforderlich ist; Reprolysin, welches das basische Myelin-Protein spaltet; und Kuzbanian, das ein Drosophila-Homolog von Reprolysin ist und für die Neurogenese und das axonale Wachstum erforderlich ist. Die Proteinaseaktivität von SVPH1-8 ist wahrscheinlich an dem Abwurf von Membranproteinen beteiligt.
Die Proteaseaktivität könnte an der Spermium/Ei-Fusion beteiligt sein. Folglich könnte ein Inhibitor ein kontrazeptives Mittel sein. Von der Disintegrin-Domäne einiger Homologer wurde festgestellt, dass sie Integrin bindet. Die Disintegrin-Domäne von Fertilin-α und Meltrin-α wurde mit der Spermium/Ei-Fusion bzw. der Myoblasten-Fusion in Verbindung gebracht. Unter Verwendung der Disintegrin-Domäne von SVPH1-8 in einem Screening könnten Inhibitoren der Zellfusion entdeckt werden, die als kontrazeptive Mittel geeignet sind.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann die Expression rekombinanter SVPH1-8 Polypeptide unter Verwendung der Fusion von Sequenzen, welche die SVPH1-8 Polypeptide kodieren, mit Sequenzen, die ein anderes Polypeptid kodieren, um die Reinigung von SVPH1-8 Polypeptiden zu unterstützen, erreicht werden. Ein Beispiel für eine solche Fusion ist eine Fusion von Sequenzen, die ein SVPH1-8 Polypeptid kodieren, mit Sequenzen, die das Produkt des malE-Gens des pMAL-c2-Vektors von New England Biolabs, Inc. kodieren. Solch eine Fusion erlaubt die Affinitätsreinigung des Fusionsproteins, ebenso wie die Trennung des Anteils des Maltose-Bindungsproteins des Fusionsproteins von dem SVPH1-8 Polypeptid nach der Reinigung. Es versteht sich natürlich, dass viele verschiedene Vektoren und Methoden für die Expression und Reinigung von SVPH1-8 Polypeptiden verwendet werden können und dass diese Ausführungsform den Umfang der Erfindung in keinster Weise limitiert.
Die Insertion von DNA, die das SVPH1-8 Polypeptid kodiert, in den pMAL-c2-Vektor kann auf verschiedenste Weise unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Methoden erreicht werden. Die bevorzugte Konstruktion der Insertion enthält ein Terminations-Codon angrenzend an das carboxyl-terminale Codon des SVPH1-8 Polypeptids. Darüber hinaus resultiert die bevorzugte Konstruktion der Insertion in der Fusion des Aminoterminus des SVPH1-8 Polypeptids direkt an den Carboxylterminus der Faktor Xa-Spaltungsstelle in dem pMAL-c2-Vektor. Ein DNA-Fragment kann durch PCR unter Verwendung von SVPH1-8 DNA als Temple-DNA und zwei Oligonukleotid-Primern erzeugt werden. Die Verwendung der Oligonukleotid-Primer erzeugt ein DNA-Fragment mit glatten Enden (blunt-ended), das durch konventionelle Mittel isoliert werden kann. Dieses PCR-Produkt kann zusammen mit pMAL-p2 (verdaut mit der Restriktionsendonuklease Xmn I) unter Verwendung konventioneller Mittel ligiert werden. Positive Klone können mit Hilfe konventioneller Mittel identifiziert werden. Die Induktion der Expression und die Reinigung des Fusionsproteins kann gemäß den Herstellerangaben durchgeführt werden. Diese Konstruktion erleichtert eine genaue Trennung des SVPH1-8 Polypeptids von dem fusionierten Maltose-Bindungsprotein unter Verwendung einer einfachen Behandlung mit Protease gemäß den Herstellerangaben. Auf diese Weise kann gereinigtes SVPH1-8 erhalten werden. Darüber hinaus kann ein solcher konstruierter Vektor leicht unter Verwendung bekannter molekularbiologischer Verfahren modifiziert werden, um zusätzliche Fusionsproteine zu erzeugen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der SVPH1-8 Polypeptide als Molekulargewichtsmarker, um das scheinbare Molekulargewicht eines Testproteins durch Gelelektrophorese abzuschätzen. Ein isolierter und gereinigter SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker gemäß der Erfindung hat ein Molekulargewicht von etwa 80766 Dalton in Abwesenheit von Glycosylierung. Das SVPH1-8 Polypeptid kann zusammen mit einem Testprotein mit Hilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch konventionelle Mittel (U. K. Laemmli, Nature 227: 680–685, 1970) in zwei getrennten Spuren eines Gels, das Natriumdodecylsulfat und eine Acrylamidkonzentration zwischen 6–20% enthält, aufgetrennt werden. Die Proteine auf dem Gel können unter Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens visualisiert werden. Der SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker kann als Molekulargewichtsmarker bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts des Testproteins verwendet werden. Die einzigartige Aminosäuresequenz von SVPH1-8 (SEQ ID NO: 2) spezifiziert ein Molekulargewicht von etwa 80766 Dalton. Daher dient der SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker besonders gut als ein Molekulargewichtsmarker für die Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts von Testproteinen, die scheinbare Molekulargewichte nahe 80766 Dalton aufweisen. Die Verwendung dieses Polypeptid-Molekulargewichtsmarkers erlaubt eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die scheinbare Molekulargewichte haben, die nahe 80766 Dalton liegen. Es versteht sich natürlich, dass viele verschiedene Methoden für die Bestimmung des Molekulargewichts eines Testproteins unter Verwendung von SVPH1-8 Polypeptiden verwendet werden können und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung limitiert.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform gemäß der Erfindung ist die Verwendung von SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern, die durch chemische Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids erzeugt werden, als Molekulargewichtsmarker für die Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts eines Testproteins durch Gelelektrophorese. Das isolierte und gereinigte SVPH1-8 Polypeptid kann mit Cyanbromid unter herkömmlichen Bedingungen behandelt werden, die zur Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkers durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Methioninreste innerhalb des SVPH1-8 Polypeptids führen (E. Gross, Methods in Enz. 11: 238–255, 1967). Aufgrund der einzigartigen Aminosäuresequenz des SVPH1-8 Polypeptids erzeugt die Fragmentierung der SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker mit Cyanbromid ein einzigartiges Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern. Die Verteilung der Methioninreste bestimmt die Anzahl der Aminosäuren in jedem Peptid, und die einzigartige Aminosäure-Zusammenstellung eines jeden Peptids bestimmt dessen Molekulargewicht.
Das einzigartige Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern, das durch die Behandlung des SVPH1-8 Polypeptids mit Cyanbromid erzeugt wurde, umfasst 14 fragmentierte Peptide mit einer Größe von wenigstens 10 Aminosäuren. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 2–76 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 8205 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 77–171 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 10865 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 246–269 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2809 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 270–297 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 3253 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 298–349 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 5573 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 350–365 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1902 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 366–384 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2240 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 385–404 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2355 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 406–458 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 5747 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 459–599 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 16175 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 600–641 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekular gewicht von etwa 4426 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 642–705 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 6898 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 706–722 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1847 Dalton.
Folglich erzeugt die Spaltung des SVPH1-8 Polypeptids durch chemische Behandlung mit Cyanbromid ein einzigartiges Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern. Die einzigartige und bekannte Aminosäuresequenz dieser SVPH1-8 fragmentierten Peptide erlaubt die Bestimmung des Molekulargewichts dieser fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker. In dem vorliegenden Fall haben die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker Molekulargewichte von etwa 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton.
Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können zusammen mit einem Testprotein mit Hilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch konventionelle Mittel in zwei getrennten Spuren eines Gels, das Natriumdodecylsulfat und eine Acrylamidkonzentration zwischen 10–20% enthält, aufgetrennt werden. Die Proteine auf dem Gel können unter Verwendung eines herkömmlichen Färbeverfahrens visualisiert werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können als Molekulargewichtsmarker bei der Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts eines Testproteins verwendet werden. Die einzigartige Aminosäuresequenz von SVPH1-8 bestimmt ein Molekulargewicht von etwa 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton für die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker. Daher eignen sich die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker besonders gut als Molekulargewichtsmarker für die Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts von Testproteinen, die scheinbare Molekulargewichte nahe 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton aufweisen. Folglich erlaubt die Verwendung dieser fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die scheinbare Molekulargewichte nahe 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Testprotein und das SVPH1-8 Polypeptid gleichzeitig, jedoch getrennt voneinander unter konventionellen Bedingungen mit Cyanbromid behandelt werden, die zu einer Fragmentierung des Testproteins und des SVPH1-8 Polypeptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Methioninreste innerhalb des Testproteins und des SVPH1-8 Polypeptids führen. Wie oben beschrieben, haben die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker, die durch die Spaltung des SVPH1-8 Polypeptids mit Cyanbromid erzeugt werden, Molekulargewichte von etwa 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton.
Die fragmentierten Peptide, sowohl von dem SVPH1-8 Polypeptid als auch von dem Testprotein, können mit Hilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch konventionelle Mittel in zwei getrennten Spuren eines Gels, das Natriumdodecylsulfat und eine Acrylamidkonzentration zwischen 10–20% enthält, aufgetrennt werden. Die fragmentierten Peptide auf dem Gel können unter Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens visualisiert werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können als Molekulargewichtsmarker bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts der fragmentierten Proteine, die von den Testproteinen stammen, verwendet werden. Wie oben beschrieben, eignen sich die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker besonders gut als Molekulargewichtsmarker für die Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte nahe 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton aufweisen. Folglich erlaubt die Verwendung dieser SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte nahe 8205; 10865; 8568; 2809; 3253; 5573; 1902; 2240; 2355; 5747; 16175; 4426; 6898 und 1847 Dalton haben. Das Ausmaß der Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids wird weiterhin als Kontrolle zur Bestimmung der Bedingungen verwendet, die für eine vollständige Fragmentierung des Testproteins erwartet werden. Es versteht sich natürlich, dass viele Chemikalien zur Fragmentierung der SVPH1-8 Polypeptide verwendet werden könnten und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung beschränkt.
In einer weiteren Ausführungsform kann ein einzigartiges Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern unter Verwendung von Enzymen, die das Polypeptid an spezifischen Aminosäureresten spalten, von dem SVPH1-8 Polypeptid erzeugt werden. Aufgrund der einzigartigen Beschaffenheit der Aminosäuresequenz des SVPH1-8 Polypeptids wird die Spaltung an verschiedenen Aminosäureresten zu der Erzeugung verschiedener Sets an fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern führen.
Ein isoliertes und gereinigtes SVPH1-8 Polypeptid kann mit Achromobacter Protease I unter konventionellen Bedingungen behandelt werden, die zu einer Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Lysinreste innerhalb des SVPH1-8 Polypeptids führen (T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50, 1981; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55, 1981). Aufgrund der einzigartigen Aminosäuresequenz des SVPH1-8 Polypeptids erzeugt die Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkers mit Achromobacter Protease I ein einzigartiges Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern. Die Verteilung der Lysinreste bestimmt die Anzahl der Aminosäuren in jedem Peptid, und die einzigartige Aminosäurezusammensetzung jedes Peptids bestimmt dessen Molekulargewicht.
Das einzigartige Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern, das durch die Behandlung des SVPH1-8 Polypeptids mit Achromobacter Protease I erzeugt wurde, umfasst 20 fragmentierte Peptide mit einer Größe von wenigstens 10 Aminosäuren. Die Erzeugung der 20 fragmentierten Peptide mit dieser Enzymbehandlung des SVPH1-8 Polypeptids im Vergleich zu der Erzeugung von 14 fragmentierten Peptiden mit Hilfe der Cyanbromidbehandlung des SVPH1-8 Polypeptids veranschaulicht deutlich, dass die Größe der fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker von der Fragmentierungsbehandlung, die zur Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids verwendet wird, abhängig ist. Sowohl die Größe als auch die Anzahl dieser Fragmente werden von der Aminosäuresequenz des SVPH1-8 Polypeptids vorgegeben. Folglich wird die Anzahl der fragmentierten Peptide abhängig von der Fragmentierungsbehandlung, die zur Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids verwendet wird, variieren.
Das Peptid, das durch die Aminosäuren 1–47 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 5130 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 57–71 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1665 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 81–137 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 6451 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 138–160 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2702 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 161–178 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2023 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 179–198 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2316 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 199–230 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 3794 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 231–283 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 6173 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 284–300 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1966 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 301–374 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 8112 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 375–385 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1325 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 386–407 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2468 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 408–453 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 4882 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 457–505 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 5629 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 506–520 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 1855 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 532–552 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2308 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 553–608 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 6474 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 624–642 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 2061 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 649–679 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 3314 Dalton. Das Peptid, das durch die Aminosäuren 680–714 der SEQ ID NO: 2 kodiert wird, hat ein Molekulargewicht von etwa 3877 Dalton.
Folglich erzeugt die Spaltung des SVPH1-8 Polypeptids durch enzymatische Behandlung mit der Achromobacter Protease I ein einzigartiges Set an SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern. Die einzigartige und bekannte Aminosäuresequenz dieser fragmentierten Peptide erlaubt die Bestimmung des Molekulargewichts dieser SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker. In dem speziellen Fall haben diese SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker Molekulargewichte von etwa 5130; 1665; 6451; 2702; 2023; 2316; 3794; 6173; 1966; 8112; 1325; 2468; 4882; 5629; 1855; 2308; 6474; 2061; 3314 und 3877 Dalton.
Abermals können die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker zusammen mit einem Testprotein mit Hilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch konventionelle Mittel in zwei getrennten Spuren eines Gels, das Natriumdodecylsulfat und eine Acrylamidkonzentration zwischen 10–20% enthält, aufgetrennt werden. Die Proteine auf dem Gel können unter Verwendung eines herkömmlichen Färbeverfahrens visualisiert werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können als Molekulargewichtsmarker bei der Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts eines Testproteins verwendet werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eignen sich besonders gut als Molekulargewichtsmarker für die Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die scheinbare Molekulargewichte nahe 5130; 1665; 6451; 2702; 2023; 2316; 3794; 6173; 1966; 8112; 1325; 2468; 4882; 5629; 1855; 2308; 6474; 2061; 3314 oder 3877 Dalton aufweisen. Die Verwendung dieser fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker erlaubt eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von Proteinen, die scheinbaren Molekulargewicht nahe 5130; 1665; 6451; 2702; 2023; 2316; 3794; 6173; 1966; 8112; 1325; 2468; 4882; 5629; 1855; 2308; 6474; 2061; 3314 oder 3877 Dalton aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform kann das Testprotein und das SVPH1-8 Polypeptid gleichzeitig, jedoch getrennt voneinander mit Achromobacter Protease I unter konventionellen Bedingungen, die zu einer Fragmentierung des Testproteins und des SVPH1-8 Polypeptids durch spezifische Hydrolyse auf der Carboxylseite der Lysinreste innerhalb des Testproteins und des SVPH1-8 Polypeptids führen, behandelt werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker und die fragmentierten Peptide, die von dem Testprotein stammen, werden mit Hilfe von denaturierender Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch herkömmliche Mittel in zwei getrennten Spuren eines Gels, das Natriumdodecylsulfat und eine Acrylamidkonzentration zwischen 10–20% enthält, aufgetrennt. Fragmentierte Peptide auf dem Gel können unter Verwendung ei nes konventionellen Färbeverfahrens visualisiert werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können als Molekulargewichtsmarker bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts des Testproteins verwendet werden. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eignen sich besonders gut als Molekulargewichtsmarker für die Beurteilung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte nahe 5130; 1665; 6451; 2702; 2023; 2316; 3794; 6173; 1966; 8112; 1325; 2468; 4882; 5629; 1855; 2308; 6474; 2061; 3314 oder 3877 Dalton aufweisen. Die Verwendung dieser SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker erlaubt eine höhere Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts von fragmentierten Peptiden, die scheinbare Molekulargewichte nahe 5130; 1665; 6451; 2702; 2023; 2316; 3794; 6173; 1966; 8112; 1325; 2468; 4882; 5629; 1855; 2308; 6474; 2061; 3314 und 3877 Dalton haben. Das Ausmaß der Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids wird weiterhin als Kontrolle verwendet, um die Bedingungen zu bestimmen, die für die vollständige Fragmentierung des Testproteins erwartet werden. Es versteht sich natürlich, dass viele Enzyme verwendet werden könnten, um SVPH1-8 Polypeptide zu fragmentieren und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung beschränkt.
In einer weiteren Ausführungsform können monoklonale und polyklonale Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide erzeugt werden. Balb/c-Mäusen kann zweimalig in drei-Wochen-Intervallen 10 μg isoliertes und gereinigtes SVPH1-8 Polypeptid oder Peptide basierend auf der Aminosäuresequenz der SVPH1-8 Polypeptide in Anwesenheit des RIBI-Adjuvans (RIBI Corp., Hamilton, Montana) intraperitoneal injiziert werden. Die Maus-Seren werden anschließend durch konventionelle Dot-Blot-Methoden oder Antibody-Capture (ABC) untersucht, um zu bestimmen, welches Tier am besten für die Fusion geeignet ist. Drei Wochen später wird den Mäusen ein intravenöser Boost von 3 μg des SVPH1-8 Polypeptids oder Peptiden verabreicht, das in sterilem PBS suspendiert ist. Drei Tage später werden die Mäuse geopfert und Milzzellen werden mit Ag8.653 Myelomzellen (ATCC) unter Berücksichtigung etablierter Protokolle fusioniert. Kurz beschrieben, werden Ag8.653-Zellen mehrere Male in serumfreiem Medium gewaschen und mit Milzzellen der Maus in einem Verhältnis von drei Milzzellen zu einer Myelomzelle fusioniert. Das Fusionsmittel ist 50% PEG: 10 DMSO (Sigma). Die Fusion wird auf zwanzig 96-Well-Platten mit flachem Boden (Corning), die HAT-ergänztes DMEM-Medium enthalten, ausplattiert und acht Tage lang wachsen gelassen. Die Überstände der resultierenden Hybridome werden gesammelt und für 60 Minuten zu einer 96-Well-Platte gegeben, die zunächst mit Ziege-anti-Maus Ig beschichtet wurde. Im Anschluss an Waschschritte wird ¹²⁵I-SVPH1-8 Polypeptid oder Peptide zu jedem Well dazugegeben, 60 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und viermal gewaschen. Positive Wells können anschließend durch Autoradiografie bei –70°C unter Verwendung von Kodak X-Omat S Filmen detektiert werden. Positive Klone können in Massenkultur wachsen gelassen werden, und Überstände werden anschließend über eine Protein A Säule (Pharmacia) gereinigt. Es versteht sich natürlich, dass viele Methoden verwendet werden könnten, um Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide und fragmentierte Peptide davon zu erzeugen und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung beschränkt.
In einer weiteren Ausführungsform werden Antikörper gegen SVPH1-8 und fragmentierte Peptide davon erzeugt, die in Kombination mit SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern verwendet werden können, um die Genauigkeit bei der Verwendung dieser Molekulargewichtsmarker zur Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes eines Proteins zu erhöhen. SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierte Peptid-Molekulargewichtsmarker können mit einem molaren Überschuss eines Testproteins gemischt werden, und die Mischung kann mit Hilfe von zweidimensionaler Elektrophorese durch konventionelle Mittel aufgetrennt werden. Die Polypeptide können durch konventionelle Mittel auf eine geeignete Proteinbindungsmembran, wie z.B. Nitrocellulose, transferiert werden.
Die Polypeptide auf der Membran können unter Verwendung von zwei verschiedenen Verfahren visualisiert werden, die eine Unterscheidung zwischen dem Testprotein und den Molekulargewichtsmarkern erlauben. SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierte Peptid-Molekulargewichtsmarker können unter Verwendung von Antikörpern, die gegen diese Marker erzeugt wurden und konventionellen Immunblotting-Methoden visualisiert werden. Dieser Nachweis wird unter konventionellen Bedingungen durchgeführt, die nicht zu einer Detektion des Testproteins führen. Es versteht sich, dass es nicht möglich sein kann, Antikörper gegen sämtliche SVPH1-8 Polypeptid-Fragmente zu erzeugen, da kleine Peptide keine immunogenen Epitope enthalten könnten. Es versteht sich weiterhin, dass nicht alle Antikörper in diesem Assay funktionieren werden; jedoch können solche Antikörper, die fähig sind, SVPH1-8 Polypeptide und Fragmente zu binden, unter Verwendung konventioneller Methoden einfach bestimmt werden.
Das Testprotein wird unter Verwendung eines konventionellen Färbeverfahrens visualisiert. Der molare Überschuss an Testprotein gegenüber SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern ist derart, dass das herkömmliche Färbeverfahren in erster Linie das Testprotein detektiert. Die Mengen an SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarkern ist so, dass durch das herkömmliche Färbeverfahren nur eine geringe oder keine Detektion dieser Marker ermöglicht wird. Der bevorzugte molare Überschuss an Testproteinen gegenüber SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern liegt zwischen 2- und 100000-fach. Bevorzugter liegt der bevorzugte molare Überschuss an Testprotein zu SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern zwischen 10- und 10000-fach und insbesondere zwischen 100- und 1000-fach.
Die SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker können als Marker für das Molekulargewicht und den isoelektrischen Punkt bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts und isoelektrischen Punktes des Testproteins verwendet werden. Die SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eignen sich besonders gut als Molekulargewichtsmarker und Marker für den isoelektrischen Punkt für die Abschätzung der scheinbaren Molekulargewichte und isoelektrischen Punkte von Testproteinen, die scheinbare Molekulargewichte und isoelektrische Punkte haben, die nahe denen der SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker liegen. Die Fähigkeit, gleichzeitig die SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker und das Testprotein unter identischen Bedingungen aufzutrennen, ermöglicht eine erhöhte Genauigkeit bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und isoelektrischen Punktes des Testproteins. Dies ist von besonderem Interesse bei Methoden, wie z.B. der zweidimensionalen Elektrophorese, wo die Eigenschaft des Verfahrens vorschreibt, dass irgendwelche Marker gleichzeitig mit dem Testprotein aufgetrennt werden sollten.
In einer weiteren Ausführungsform können die SVPH1-8 Polypeptid- oder fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker als Molekulargewichtsmarker und Marker für den isoelektrischen Punkt bei der Abschätzung des scheinbaren Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes von fragmentierten Peptiden, die durch Behandlung mit einem Spaltungsmittel von einem Testprotein abgeleitet wurden, verwendet werden. Es versteht sich natürlich, dass viele Methoden verwendet für die Bestimmung des Molekulargewichts und isoelektrischen Punktes eines Testproteins und fragmentierter Peptide davon unter Verwendung der SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker und Peptidfragmente davon werden können und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung beschränkt.
Die SVPH1-8 Polypeptid-Molekurgewichtsmarker, die von der Erfindung umfasst sind, können variable Molekulargewichte haben, abhängig von der Wirtszelle, in denen sie exprimiert werden. Die Glycosylierung von SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarkern und Peptid-Fragmenten davon in verschiedenen Zelltypen kann zu Abweichungen in dem Molekulargewicht dieser Marker führen, abhängig von dem Ausmaß der Modifikation. Die Größe der SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker kann am heterogensten bei Fragmenten des SVPH1-8 Polypeptids sein, die von dem extrazellulären Teil des Polypeptids abgeleitet sind. Konsistente Molekulargewichtsmarker können durch Verwendung von Polypeptiden, die ausschließlich von den Transmembran- und cytoplasmatischen Regionen stammen, durch Vorbehandlung mit N-Glycanase, um Glycosylierung zu entfernen, oder durch Exprimieren der Polypeptide in bakteriellen Wirten erhalten werden.
Die Interaktion zwischen SVPH1-8 und dessen Gegenstruktur ermöglicht das Screening nach kleinen Molekülen, die mit der SVPH1-8/SVPH1-8 Gegenstruktur-Verbindung interferieren und die Aktivität von SVPH1-8 oder dessen Gegenstruktur inhibieren. Zum Beispiel kann das Yeast Two-Hybrid-System, das an der SUNY entwickelt wurde (beschrieben in US-Patent Nr. 5,283,173 von Fields et al.), verwendet werden, um nach Inhibitoren für SVPH1-8 wie folgt zu Screenen. SVPH1-8 und dessen Genstruktur oder Teile davon, die für ihre Interaktion verantwortlich sind, können an die Gal4 DNA-Bindungsdomäne bzw. die Gal4-Transkriptionsaktivierungsdomäne fusioniert werden und in einen Stamm eingeführt werden, der für das Wachstum auf Platten, denen Histidin fehlt, von der Gal4-Aktivität abhängig ist. Verbindungen, die das Wachstum verhindern, können gescreent werden, um IL-1 Inhibitoren zu identifizieren. Alternativ kann das Screening modifiziert werden, so dass die SVPH1-8/SVPH1-8 Gegenstruktur-Interaktion Wachstum inhibiert, so dass die Inhibition der Interaktion das Auftreten von Wachstum erlaubt. Ein weiterer, in vitro, Ansatz zum Screenen nach SVPH1-8 Inhibitoren wäre das Immobilisieren einer der Komponenten (entweder SVPH1-8 oder dessen Gegenstruktur) in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte und das Koppeln eines leicht zu detektierenden Indikators an die andere Komponente. Ein Inhibitor der Interaktion wird identifiziert durch die Abwesenheit des detektierbaren Indikators in der Vertiefung.
Außerdem sind die SVPH1-8 Polypeptide gemäß der Erfindung nützlich für die strukturbasierte Entwicklung eines SVPH1-8 Inhibitors. Solch eine Entwicklung würde die Schritte des Bestimmens der dreidimensionalen Struktur eines solchen SVPH1-8 Polypeptids; das Analysieren der dreidimensionalen Struktur hinsichtlich möglicher Bindungsstellen des Substrats; das Synthetisieren eines Moleküls, das eine vorhergesagte Reaktionsstelle beinhaltet; und das Bestimmen der Inhibierungsaktivität des Moleküls umfassen.
Antikörper, die mit SVPH1-8 Polypeptiden immunologisch reagieren und insbesondere monoklonale Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide werden jetzt durch die Erfindung verfügbar gemacht. Solche Antikörper können nützlich für das Inhibieren der SVPH1-8 Polypeptid-Aktivität in vivo und für das Detektieren des Vorhandenseins von SVPH1-8 Polypeptiden in einer Probe sein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck "SVPH1-8 Polypeptide" auf eine Gattung von Polypeptiden, die weiterhin Proteine umfasst, welche die Aminosäuresequenz 1–722 der SEQ ID NO: 2 umfassen, ebenso wie solche Proteine, die einen hohen Grad an Ähnlichkeit (wenigstens 90% Identität) mit solchen Aminosäuresequenzen aufweisen und biologisch aktiv sind. Außerdem bezieht sich SVPH1-8 Polypeptide auf die Genprodukte der Nukleotide 1–2169 der SEQ ID NO: 1.
Das isolierte und gereinigte SVPH1-8 Polypeptid gemäß der Erfindung hat ein Molekulargewicht von etwa 80766 Dalton in Abwesenheit von Glycosylierung. Es versteht sich, dass das Molekulargewicht von SVPH1-8 Polypeptiden durch Fusionieren zusätzlicher Peptidsequenzen sowohl an die amino- als auch carboxyl-terminalen Enden von SVPH1-8 Polypeptiden variiert werden kann. Fusionen von zusätzlichen Peptidsequenzen an die amino- und carboxyl-terminalen Enden von SVPH1-8 Polypeptiden können verwendet werden, um die Expression der SVPH1-8 Polypeptide zu verstärken oder bei der Reinigung des Proteins behilflich zu sein.
Es versteht sich, dass Fusionen von zusätzlichen Peptidsequenzen an die amino- und carboxyl-terminalen Enden von SVPH1-8 Polypeptiden einige, jedoch im Allgemeinen nicht alle fragmentierten Peptide des SVPH1-8 Polypeptids, die durch enzymatische oder chemische Behandlung erzeugt wurden, ändern.
Es versteht sich, dass Mutationen in die SVPH1-8 Polypeptide unter Verwendung von Routinemethoden und bekannten Verfahren der Molekularbiologie eingeführt werden können. Es versteht sich weiterhin, dass eine Mutation so konstruiert werden kann, dass sie eine proteolytische Spaltungsstelle eines spezifischen Enzyms oder eine Spaltungsstelle für ein spezifisches chemisch induziertes Fragmentierungsverfahren eliminieren kann. Es versteht sich außerdem, dass die Eliminierung der Stelle den Peptid-Fingerprint der SVPH1-8 Polypeptide nach der Fragmentierung mit dem spezifischen Enzym oder chemischen Verfahren ändern wird.
Der Ausdruck "isoliert und gereinigt" wie hierin verwendet bedeutet, dass die SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker oder Fragmente davon im Wesentlichen frei von Assoziierungen mit anderen Proteinen oder Polypeptiden sind, z.B. als Reinigungsprodukt einer rekombinanten Wirtszellkultur oder als gereinigtes Produkt aus einer nicht rekombinanten Quelle. Der Ausdruck "im Wesentlichen gereinigt" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Mischung, die SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker oder Fragmente davon enthält und im Wesentlichen frei von Assoziierungen mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ist, mit Ausnahme der Präsenz von bekannten Proteinen, die unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers entfernt werden können, und wobei die im Wesentlichen gereinigten SVPH1-8 Polypeptide oder Fragmente davon als Molekulargewichtsmarker verwendet werden können. Der Ausdruck "gereinigt" bezieht sich entweder auf die "isolierte und gereinigte" Form der SVPH1-8 Polypeptide oder die "im Wesentlichen gereinigte" Form der SVPH1-8 Polypeptide, wie sie beide hierin beschrieben werden.
Eine "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf ein Polynukleotidmolekül in Form eines separaten Fragmentes oder als eine Komponente eines größeren Nukleinsäure-Konstruktes, das von DNA oder RNA abgeleitet wurde, die zumindest einmal in im Wesentlichen reiner Form (d.h. frei von kontaminierendem endogenem Material) und in einer Quantität oder Konzentration isoliert wurde, welche die Identifizierung, Manipulation und Gewinnung der Nukleotidsequenzen-Bestandteile durch biochemische Standardverfahren erlaubt (wie durch die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschriebenen). Solche Sequenzen werden vorzugsweise in Form eines offenen Leserahmens zur Verfügung gestellt, der nicht durch interne nicht-translatierte Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryontischen Genen auftreten, unterbrochen ist. Sequenzen von nicht-translatierter DNA können 5' oder 3' eines offenen Leserahmens präsent sein, wo sie nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Region interferieren.
Eine SVPH1-8 Polypeptid "Variante", wie hierin verwendet, bezeichnet eine Polypeptid, das im Wesentlichen homolog zu den nativen SVPH1-8 Polypeptiden ist, jedoch eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von den nativen SVPH1-8 Polypeptiden (human, murin oder von einer anderen Säugerspezies) aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheidet. Die Variante hat eine Aminosäuresequenz, die vorzugsweise wenigstens 80% identisch mit einer nativen SVPH1-8 Polypeptid-Aminosäuresequenz ist, am Bevorzugtesten wenigstens 90% identisch ist. Die Prozentidentität kann, z.B., durch Vergleichen der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP Computerprogramms, Version 6,0, beschrieben von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984) und erhältlich von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) bestimmt werden. Das GAP Programm verwendet das Alignment-Verfahren nach Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970), wie von Smith und Waterman überarbeitet (Adv. Appl. Math 2: 482, 1981). Die bevorzugten Default-Parameter für das GAP-Programm beinhalten: (1) Eine unäre Vergleichsmatrix (enthaltend einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, wie von Schwartz und Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Seiten. 353–358, 1979 beschrieben; (2) einen Abzug (penalty) von 3,0 für jede Lücke (gap) und einen weiteren 0,10 Abzug für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keinen Abzug für Endlücken (end gaps).
Die Varianten können konservativ substituierte Sequenzen umfassen, was bedeutet, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest mit ähnlichen physiochemischen Eigenschaften ersetzt wird. Beispiele für konservative Substitutionen schließen Substitutionen eines aliphatischen Restes für einen anderen, wie z.B. Ile, Val, Leu oder Ala füreinander, oder Substitutionen eines polaren Restes für einen anderen, wie z.B. zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn, ein. Weitere solcher konservativen Substitutionen, z.B. Substitutionen von ganzen Regionen, die ähnliche hydrophobe Eigenschaften aufweisen, sind wohlbekannt. Natürlich vorkommende SVPH1-8 Varianten sind ebenfalls von der Erfindung umfasst. Beispiele für solche Varianten sind Proteine, die aus einem alternativen mRNA Splicing-Ereignis oder aus der proteolytischen Spaltung der SVPH1-8 Polypeptide hervorgehen. Variationen, die der Proteolyse zuzuschreiben sind, schließen z.B. Unterschiede in den N- oder C-Termini bei Expression in verschiedenen Arten von Wirtszellen aufgrund der proteolytischen Entfernung einer oder mehrerer terminaler Aminosäuren von den SVPH1-8 Polypeptiden (im Allgemeinen zwischen 1–5 terminale Aminosäuren) ein.
Wie oben angegeben, stellt die Erfindung isolierte und gereinigte, oder homogene, SVPH1-8 Polypeptide, sowohl rekombinant als auch nicht-rekombinant, zur Verfügung. Varianten und Derivate nativer SVPH1-8 Polypeptide, die als Molekulargewichtsmarker verwendet werden können, können durch Mutationen der Nukleotidsequenzen, die für native SVPH1-8 Polypeptide kodieren, erhalten werden. Änderungen der nativen Aminosäuresequenz können durch jedes der vielen herkömmlichen Verfahren erreicht werden. Mutationen können an bestimmten Loci durch Synthetisieren von Oligonukleotiden, die eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, um die Ligation mit Fragmenten der nativen Sequenz zu ermöglichen, eingeführt werden. Im Anschluss an die Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analog, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, -Substitution oder -Deletion aufweist.
Alternativ können Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagenese-Verfahren verwendet werden, um ein geändertes Gen, in dem zuvor bestimmte Codons durch Substitution, Deletion oder Insertion geändert sein können, zur Verfügung zu stellen. Beispielhafte Verfahren zur Herstellung der oben dargelegten Änderungen sind von Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37: 73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488, 1985) Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154: 367, 1987); und die US-Patente Nr. 4,518,584 und 4,737,462, die alle durch ihre Referenz eingeschlossen sind, offenbart.
SVPH1-8 Polypeptide können durch Bilden kovalenter oder aggregativer Konjugate mit anderen chemischen Resten, wie z.B. Glycosylgruppen, Polyethylenglycol (PEG)-Gruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und dergleichen modifiziert werden, um SVPH1-8 Polypeptid-Derivate zu erzeugen. Kovalente Derivate von SVPH1-8 Polypeptiden können durch Verbinden der chemischen Einheiten mit funktionellen Gruppen auf SVPH1-8 Polypeptid-Aminosäureseitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines SVPH1-8 Polypeptids oder dessen extrazellulärer Domäne hergestellt werden. Weitere Derivate von SVPH1-8 Polypeptiden innerhalb des Umfangs dieser Erfindung schließen kovalente oder aggregative Konjugate von SVPH1-8 Polypeptiden oder Peptidfragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie z.B. durch Synthese in rekombinanten Kulturen als N-terminale oder C-terminale Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz (z.B. den α-Faktor-Leader von Saccharomyces) an dem N-Terminus eines SVPH1-8 Polypeptids enthalten. Das Signal- oder Leader-Peptid steuert co-translational oder post-translational den Transfer des Konjugates von dem Ort seiner Synthese zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder der Zellwand.
SVPH1-8 Polypeptid-Konjugate können Peptide umfassen, die angefügt sind, um die Reinigung oder Identifizierung der SVPH1-8 Polypeptide zu erleichtern. Solche Peptide schließen z.B. Poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in US-Patent Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 beschrieben sind, ein.
Die Erfindung schließt weiterhin SVPH1-8 Polypeptide mit oder ohne assoziiertem nativem Glycosyfierungsmuster ein. SVPH1-8 Polypeptide, die in Hefe- oder Säuger-Expressionssystemen (z.B. COS-1- oder COS-7-Zellen) exprimiert werden, können ein ähnliches Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster oder ein signifikant unterschiedliches Molekulargewicht und Glycosylierungsmuster zu einem nativen SVPH1-8 Polypeptid aufweisen, abhängig von der Wahl des Expressionssystems. Die Expression von SVPH1-8 Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie z.B. E. coli, stellt nicht-glycosylierte Moleküle zur Verfügung. Glycosylgruppen können durch konventionelle Verfahren, insbesondere durch solche, die Glycopeptidase verwenden, entfernt werden. Im Allgemeinen können glycosylierte SVPH1-8 Polypeptide mit einem molaren Überschuss an Glycopeptidase (Boehringer Mannheim) inkubiert werden.
Äquivalente DNA-Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder -sequenzen oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen kodieren, sind von der Erfindung umfasst. Zum Beispiel können N-Glycosylierungsstellen in der extrazellulären Domäne des SVPH1-8 Polypeptids modifiziert werden, um Glycosylierung zu verhindern, was die Expression eines reduzierten Kohlenhydratanalogs in Säuger- und Hefe-Expressionssystemen erlaubt. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind gekennzeichnet durch ein Aminosäuretriplet Asn X-Y, wobei X jede Aminosäure außer Pro ist und Y Ser oder Thr ist. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen in der Nukleotidsequenz, welche diese Triplets kodiert, resultiert in der Vermeidung eines Anfügens von Kohlehydratresten an die Asn-Seitenkette. Die Änderungen eines einzelnen Nukleotids, so gewählt, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist z.B. ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu inaktivieren. Bekannte Verfahren zur Inaktivierung von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen solche wie in US-Patent 5,071,972 und EP 276,846 ein, die hierdurch durch Referenz eingeschlossen sind.
In einem weiteren Beispiel können Sequenzen, die Cys-Reste kodieren, die nicht essentiell für die biologische Aktivität sind, so verändert werden, dass die Cys-Reste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, was die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfid-Brücken bei der Renaturierung verhindert. Weitere Äquivalente werden durch Modifikation von benachbarten dibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen, in denen die KEX2-Protease Aktivität vorhanden ist, zu verstärken. EP 212,914 offenbart die Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese zur Inaktivierung der KEX2-Protease-Prozessierungsstellen in einem Protein. Die KEX2-Protease-Prozessierungsstellen werden durch Deletieren, Addieren oder Substituieren von Resten zur Veränderung von Arg-Arg-, Arg-Lys- und Lys-Arg-Paaren zur Entfernung des Vorkommens dieser benachbarten basischen Reste inaktiviert. Lys-Lys-Paarungen sind erheblich weniger empfindlich gegen die KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg zu Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz zur Inaktivierung von KEX2-Stellen dar.
Die Erfindung umfasst weiterhin isolierte Fragmente und Oligonukleotide, die von der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 abgeleitet sind, einschließlich der Nukleotide 1–78, 79–594, 595–1191, 1192–1503, 1504–2040, 2041–2121 und 2122–2166. Die Erfindung umfasst außerdem Polypeptide, die von diesen Fragmenten und Oligonukleotiden kodiert werden.
Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Umfangs der Erfindung schließen isolierte DNA- und RNA-Sequenzen ein, die mit den nativen SVPH1-8 Nukleotidsequenzen, die hierin offenbart werden, unter Bedingungen moderater oder hoher Stringenz hybridisieren und die SVPH1-8 Polypeptide kodieren. Wie hierin verwendet, schließen Bedingunen moderater Stringenz, wie den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und wie von Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Band. 1, Seiten 1101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) definiert, die Verwendung einer Vorwaschlösung für die Nitrocellulosefilter mit 5 × SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), Hybridisierungsbedingungen von 50% Formamid, 6 × SSC bei 42°C (oder einer ähnlichen Hybridisierungslösung, wie z.B. der Stark's-Lösung, in 50% Formamid bei 42°C) und Waschbedingungen von etwa 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS ein. Bedingungen hoher Stringenz sind wie die oben angegebenen Hybridisierungsbedingungen definiert und mit einem Waschschritt bei 68°C, 0,2 × SSC, 0,1% SDS. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und die Salzkonzentration der Waschlösung wie benötigt an Faktoren, wie z.B. die Länge der Probe, angepasst werden können.
Aufgrund der bekannten Degenerierung des genetischen Codes, worin mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure kodieren kann, kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NO: 1 gezeigten abweichen und trotzdem ein SVPH1-8 Polypeptid kodieren, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist. Solche abweichenden DNA-Sequenzen können aus stummen Mutationen resultieren (z.B. Mutationen, die während der PCR-Amplifikation auftreten), oder sie können das Produkt einer vorsätzlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die Erfindung stellt folglich äquivalente isolierte DNA-Sequenzen zur Verfügung, die SVPH1-8 Polypeptide kodieren, die ausgewählt sind aus: (a) einer DNA, die von der kodierenden Region eines nativen Säuger- SVPH1-8 Gens abgeleitet ist; (b) einer cDNA, welche die Nukleotidsequenz 1–2169 der SEQ ID NO: 1 umfasst; (c) einer DNA, die fähig zur Hybridisierung mit einer DNA gemäß (a) unter Bedingungen moderater Stringenz ist und SVPH1-8 Polypeptide kodiert; und (d) einer DNA, die als Ergebnis des genetischen Codes im Vergleich zu einer in (a), (b) oder (c) definierten DNA degeneriert ist und SVPH1-8 Polypeptide kodiert. SVPH1-8 Polypeptid, die von solchen äquivalenten DNA-Sequenzen kodiert werden, sind von der Erfindung umfasst.
DNA, die äquivalent zu der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1 sind, werden unter moderat stringenten Bedingungen an die doppelsträngige native DNA-Sequenz binden, die Polypeptide kodiert, welche die Aminosäuresequenzen 1–722 der SEQ ID NO: 2 umfassen. Beispiele für SVPH1-8 Polypeptide, die von solchen DNA kodiert werden, schließen SVPH1-8 Polypeptid-Fragmente und SVPH1-8 Polypeptide ein, die inaktivierte N-Glycosylierungsstelle(n), inaktivierte Protease-Prozessierungsstelle(n) oder konservative Aminosäureaustausch(e), wie oben beschrieben, umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. SVPH1-8 Polypeptide, die von DNA kodiert werden, die von anderen Säugerspezies abgeleitet ist, wobei die DNA mit dem Komplement der DNA der SEQ ID NO: 1 hybridisiert, sind ebenfalls umfasst.
SVPH1-8 Polypeptid bindende Proteine, wie z.B. die anti-SVPH1-8 Polypeptid-Antikörper gemäß der Erfindung, können auf einer festen Phase, wie z.B. einer Säulenchromatografiematrix oder einem ähnlichen Substrat, das zur Identifizierung, Trennung oder Reinigung von Zellen, die SVPH1-8 Polypeptide auf ihrer Oberfläche exprimieren, geeignet sind, gebunden werden. Zum Beispiel deutet die Expression von SVPH1-8 in Hoden darauf hin, dass anti-SVPH1-8 Polypeptid-Antikörper verwendet werden könnten, um Hodenzellen unter Verwendung konventioneller Methoden zu identifizieren, zu trennen oder zu reinigen. Die Adhärenz von SVPH1-8 Polypeptid bindenden Proteinen mit einer Feste Phase-Kontaktoberfläche könnte durch jegliche Mittel, z.B. magnetische Mikrosphären, die mit SVPH1-8 Polypeptid bindenden Proteinen beschichtet werden und in dem Inkubationsgefäß über ein magnetisches Feld festgehalten werden, erreicht werden. Suspensionen von Zellmischungen werden mit der festen Phase, die darauf befindliche SVPH1-8 Polypeptid bindende Proteine aufweist, in Kontakt gebracht. Zellen, die SVPH1-8 Polypeptide auf ihre Oberfläche aufweisen, binden an das fixierte SVPH1-8 Polypeptid bindende Protein, und ungebundene Zellen werden weggewaschen. Dieses Affinitäts-Bindungsverfahren ist nützlich für die Reinigung, zum Screenen oder Abtrennen solcher SVPH1-8 Polypeptid exprimierenden Zellen aus Lösungen. Verfahren zur Freisetzung der positiv selektierten Zellen von der festen Phase sind auf dem Gebiet bekannt und umfassen z.B. die Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise nicht toxisch und nicht schädigend für die Zellen und sind vorzugsweise auf die Spaltung der Zelloberflächen-Bindungspartner gerichtet.
Alternativ können die Zellmischungen, von denen vermutet wird, dass sie SVPH1-8 Polypeptid exprimierende Zellen enthalten, zunächst mit einem biotinylierten SVPH1-8 Polypeptid bindenden Protein inkubiert werden. Die Inkubationszeiten haben typischerweise eine Dauer von wenigstens einer Stunde, um eine ausreichende Bindung an die SVPH1-8 Polypeptide sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird anschließend über eine Säule gegeben, die mit Avidin-beschichteten Kügelchen gepackt ist, wobei die hohe Affinität von Biotin zu Avidin die Bindung der SVPH1-8 Polypeptid bindenden Zellen an die Kügelchen zur Verfügung stellt. Die Verwendung von Avidin-beschichteten Kügelchen ist auf dem Gebiet bekannt. Siehe Berenson, et al. J. Cell. Biochem., 10D: 239 (1986). Das Wegwaschen ungebundenen Materials und die Freisetzung der gebundenen Zellen wird unter Verwendung konventioneller Verfahren durchgeführt.
In den oben beschriebenen Verfahren handelt es sich bei den SVPH1-8 Polypeptid bindenden Proteinen, um anti-SVPH1-8 Polypeptid-Antikörper und andere Proteine, die fähig sind, die SVPH1-8 Polypeptide mit hoher Affinität zu binden. Ein bevorzugtes SVPH1-8 Polypeptid bindendes Protein ist ein anti-SVPH1-8 Polypeptid monoklonaler Antikörper.
SVPH1-8 Polypeptide können als Oligomere vorliegen, wie z.B. als kovalent verbundene oder nicht-kovalent verbundene Dimere oder Trimere. Oligomere können durch Disulfidbrücken, die zwischen den Cysteinresten auf verschiedenen SVPH1-8 Polypeptiden ausgebildet werden, verbunden sein. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein SVPH1-8 Polypeptid-Dimer durch Fusionieren von SVPH1-8 Polypeptiden an die Fc-Region eines Antikörpers (z.B. IgG1) auf eine Weise, die nicht die biologische Aktivität der SVPH1-8 Polypeptide beeinträchtigt, erzeugt werden. Das Fc-Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen SVPH1-8 Polypeptids (das nur die extrazelluläre Domäne umfasst) fusioniert. Die allgemeine Herstellung von Fusionsproteinen, welche die heterologen Polypeptide fusioniert an verschiedene Teile von Polypeptiden, die von Antikörpern abgeleitet sind (einschließlich der Fc-Domäne) umfasst, wurde z.B. durch Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991) und Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990) beschrieben, die hierin durch Referenz eingeschlossen sind. Eine Genfusion, die das SVPH1-8 Polypeptid:Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. SVPH1-8:Fc-Fusionsproteinen wird gestattet, dass sie sich ähnlich wie Antikörpermoleküle zusammensetzen, woraufhin Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Polypeptiden ausgebildet werden, was zu divalenten SVPH1-8 Polypeptiden führt. Werden die Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt, ist es möglich, ein SVPH1-8 Polypeptid-Oligomer zu bilden, das nicht weniger als vier extrazelluläre Regionen von SVPH1-8 Polypeptiden aufweist. Alternativ kann man zwei lösliche SVPH1-8 Polypeptid-Domänen mit einem Peptid-Linker verbinden.
Rekombinante Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäuresequenz enthält, die SVPH1-8 Polypeptide kodiert, können unter Verwendung wohlbekannter Verfahren hergestellt werden. Die Expressionsvektoren schließen eine SVPH1-8 DNA-Sequenz ein, die funktionell mit geeigneten transkriptionellen oder translationellen regulatorischen Nukleotidsequenzen verbunden ist, wie z.B. solche, die von einem Säuger-, mikrobiellen, viralen oder Insekten-Gen stammen. Beispiele für regulatorische Sequenzen schließen transkriptionelle Promotoren, Operatoren oder Enhancer, eine mRNA ribosomale Bindungsstelle und geeignete Sequenzen, welche die Initiation und Termination der Transkription und Translation kontrollieren, ein. Nukleotidsequenzen sind "funktionell verbunden", wenn die regulatorische Sequenz funktionell mit der SVPH1-8 DNA-Sequenz in Beziehung steht. Folglich ist eine Promotor-Nukleotidsequenz funktionell mit einer SVPH1-8 DNA-Sequenz verbunden, wenn die Promotor-Nukleotidsequenz die Transkription der DNA-Sequenz kontrolliert. Die Fähigkeit zur Replikation in den gewünschten Wirtszellen, die im Allgemeinen durch einen Replikationsursprung verliehen wird und ein Selektionsgen, mit dessen Hilfe Transformanten identifiziert werden können, können zusätzlich in den Expressionsvektor eingeschlossen werden.
Außerdem können Sequenzen, die geeignete Signalpeptide kodieren, die nicht natürlicherweise mit SVPH1-8 Polypeptiden assoziiert sind, in die Expressionsvektoren eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann eine DNA-Sequenz für ein Signalpeptid (sekretorischer Leader) im Leserahmen (in-frame) mit der SVPH1-8 Nukleotidsequenz fusioniert werden, so dass das SVPH1-8 Polypeptid zunächst als Fusionsprotein translatiert wird, welches das Signalpeptid umfasst. Ein Signalpeptid, das in den vorgesehenen Wirtszellen funktionsfähig ist, begünstigt die extrazelluläre Sekretion des SVPH1-8 Polypeptids. Das Signalpeptid kann von dem SVPH1-8 Polypeptid bei Sekretion des SVPH1-8 Polypeptids aus der Zelle abgespalten werden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von SVPH1-8 Polypeptiden schließen prokaryotische Zellen, Hefezellen oder Zellen höherer Eukaryonten ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren für die Verwendung mit bakteriellen, Pilz-, Hefe- und Säuger-Zellwirten sind z.B. in Pouwels et al. CloningVectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme könnten außerdem zur Herstellung der SVPH1-8 Polypeptide unter Verwendung von RNAs, die von den hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind, verwendet werden.
Prokaryoten schließen gramnegative oder grampositive Organismen, z.B. E. coli oder Bacilli ein. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen z.B. E. coli oder Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der genera Pseudomonas, Streptomyces und Staphylocccus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie z.B. E. coli kann ein SVPH1-8 Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest zur Erleichterung der Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle enthalten. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten SVPH1-8 Polypeptid abgespalten werden.
Expressionsvektoren für die Verwendung in prokaryotischen Wirtszellen umfassen im Allgemeinen ein oder mehrere phänotypische selektierbare Markergene. Ein phänotypisches selektierbares Markergen ist z.B. ein Gen, das ein Protein kodiert, das eine Antibiotikumresistenz verleiht oder das einen autotrophischen Bedarf deckt. Beispiele für geeignete Expressionsvektoren für prokaryotische Wirtszellen schließen solche ein, die von den kommerziell erhältlichen Plasmiden, wie z.B. dem Klonierungsvektor pBR322 (ATCC 37017) abgeleitet sind. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt folglich ein einfaches Mittel zur Identifizierung der transformierten Zellen zur Verfügung. Um einen Expressionsvektor unter Verwendung von pBR322 zu konstruieren, werden eine geeignete Promotor- und eine SVPH1-8 DNA-Sequenz in den pBR322 Vektor insertiert. Andere kommerziell erhältliche Vektoren schließen z.B. pKK233-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) und pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA) ein. Weitere kommerziell erhältliche Vektoren schließen solche ein, die spezifisch für die Expression von Proteinen entwickelt wurden; diese würden pMAL-p2 und pMAL-c2 Vektoren einschließen, die für die Expression von Proteinen verwendet werden, welche Maltose-Bindungsprotein (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) fusioniert sind.
Promotorsequenzen, die häufig für Expressionsvektoren rekombinanter prokaryotischer Wirtszellen verwendet werden, schließen β-Lactamase (Penicillinase), das Lactose-Promotorsystem (Chang et al., Nature 275: 615, 1978; und Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980; und EP-A-36776) und den Tac-Promotor (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 412, 1982) ein. Ein besonders nützliches Expressionssystem für prokaryotische Wirtszellen verwendet einen Phagen λ P_L-Promotor und eine cl857ts thermolabile Repressorsequenz. Plasmidvektoren, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind und Derivate des λ P_L-Promotors enthalten, schließen das Plasmid pHUB2 (vorhanden in dem E. coli Stamm JMB9 (ATCC 37092)) und pPLc28 (vorhanden in E. coli RR1 (ATCC 53082)) ein.
Die SVPH1-8 DNA kann im Leserahmen in die verschiedenen Klonierungsstellen eines gewöhnlichen bakteriellen Expressionsvektors kloniert werden. Im idealen Fall würde der Vektor einen induzierbaren Promotor stromaufwärts der Klonierungsstelle enthalten, so dass das Hinzufügen eines Induktors zu einer Produktion des rekombinanten Proteins in großen Mengen zu einer von dem Forscher gewählten Zeit führt. Bei einigen Proteinen können die Expressions-Level durch Einfügen von Codons, die einen Fusionspartner (wie z.B. Haxahistidin) kodieren, zwischen den Promotor und das Gen von Interesse verstärkt werden. Das resultierende "Expressionsplasmid" kann in einer Vielzahl von E. coli-Stämmen propagiert werden.
Für die Expression des rekombinanten Proteins werden die Bakterienzellen in Wachstumsmedium vermehrt, bis eine zuvor bestimmte optische Dichte erreicht ist. Die Expression des rekombinanten Proteins wird anschließend induziert, z.B. durch Zugabe von IPTG (Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid), welches die Expression von Proteinen von Plasmiden, die einen Lac-Operatur/Promotor enthalten, aktiviert. Nach der Induktion (typischerweise 1–4 Stunden lang) werden die Zellen durch Pelletieren in einer Zentrifuge, z.B. bei 5000 × G, für 20 Minuten bei 4°C, geerntet.
Zur Gewinnung des exprimierten Proteins können die pelletierten Zellen in einer 10-fachen Menge von 50 mM Tris-HCl (pH 8)/1 M NaCl resuspendiert und anschließend zwei oder drei mal durch eine French-Press gegeben werden. Die meisten stark exprimierten rekombinanten Proteine bilden unlösliche Aggregate, die als Einschlusskörper bekannt sind. Einschlusskörper können von den löslichen Proteinen durch Pelletieren in einer Zentrifuge bei 5000 × G für 20 Minuten bei 4°C abgetrennt werden. Das Pellet der Einschlusskörper wird mit 50 mM Tris-HCl (pH 8)/1% Triton X-100 gewaschen und anschließend in 50 mM Tris-HCl (pH 8)/8 M Harnstoff/0,1 M DTT gelöst. Sämtliches Material, das nicht gelöst werden kann, wird durch Zentrifugation (10000 × G für 20 Minuten, 20°C) entfernt. Das Protein von Interesse wird, in den meisten Fällen, das am reichlichsten vorhandene Protein in dem resultierenden geklärten Überstand sein. Dieses Protein kann durch Dialyse gegen 50 mM Tris-HCl (pH 8)/5 mM CaCl/5 mM Zn(OAc)/1 mM GSSG/0,1 mM GSH in eine aktive Konformation "renaturiert" werden. Nach der Renaturierung kann die Reinigung durch eine Vielzahl von chromatografischen Verfahren ausgeführt werden, wie z.B. dem Ionenaustausch oder der Gelfiltration. In einigen Protokollen kann die initiale Reinigung vor der Renaturierung ausgeführt werden. Als ein Beispiel können Hexahistidin-markierte Fusionsproteine partiell auf immobilisiertem Nickel gereinigt werden.
Während die vorstehenden Reinigungs- und Renaturierungsmethoden davon ausgehen, dass das Protein am besten aus den Einschlusskörpern gewonnen wird, werden sich die Fachleute auf dem Gebiet der Proteinreinigung bewusst sein, dass viele rekombinante Proteine am besten aus der löslichen Fraktion der Zell-Lysate gereinigt werden. In diesen Fällen ist häufig eine Renaturierung nicht erforderlich, und die Reinigung durch chromatografische Standardverfahren können direkt durchgeführt werden.
SVPH1-8 Polypeptide können alternativ in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise von der Gattung Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae). Weitere Hefegattungen, wie z.B. Pichia, K. lactis oder Kluyveromyces, können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden häufig eine Replikationsursprungssequenz von einem 2 μ Hefeplasmid aufweisen, eine autonome Replikationssequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für die Polyadenylierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein Gen für einen selektierbaren Marker. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionin, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978), wie z.B. Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Weitere geeignete Vektoren und Promotoren für die Verwendung bei der Hefeexpression werden weiter in Hitzeman, EPA-73,657 oder in Fleer et. al., Gene, 107: 285–195 (1991); und van den Berg et. al., Bio/Technology, 8: 135–139 (1990) beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) und Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können durch Insertieren von DNA-Sequenzen aus pBR322 für die Selektion und Replikation in E. coli (Amp'-Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren konstruiert werden.
Die Hefe α-Faktor Leader-Sequenz kann für die Vermittlung der Sekretion eines SVPH1-8 Polypeptids verwendet werden. Die α-Faktor Leader-Sequenz wird häufig zwischen die Promotorsequenz und die Sequenz des strukturellen Gens insertiert. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984; US-Patent 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leader-Sequenzen, die für die Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefezellen geeignet sind, sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eine Leader-Sequenz kann nahe seinem 3' Ende modifiziert werden, so dass sie ein oder mehrere Restriktionsstellen enthält. Dies wird die Fusion der Leader-Sequenz mit dem strukturellen Gen erleichtern.
Protokolle zur Transformation von Hefe sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Eines dieser Protokolle wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 beschrieben. Das Protokoll von Hinnen et al. selektiert Trp⁺-Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67% Hefe-Stickstoff-Base, 0,5% Casaminosäuren, 2% Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die mit Vektoren, die eine ADH2-Promotorsequenz enthalten, transformiert wurden, können zum Induzieren der Expression in einem "reichen" Medium wachsen gelassen werden. Ein Beispiel für ein reiches Medium ist eines, das aus 1% Hefeextrakt, 2% Pepton und 1% Glucose, ergänzt mit 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Die Dereprimierung des ADH2-Promotors erfolgt, wenn die Glucose in dem Medium verbraucht ist.
Säuger- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme können ebenfalls verwendet werden, um rekombinante SVPH1-8 Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme für die Herstellung von heterologen Proteinen in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47 (1988) besprochen. Etablierte Zelllinien mit Säugerherkunft können ebenfalls verwendet werden. Beispiele für geeignete Säugerwirtszelllinien schließen die COS-7- Linie aus Nierenzellen des Affen (ATCC CRL1651) (Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO)Zellen, HeLa-Zellen und BHK-Zelllinien (ATCC CRL 10) sowie die CV1/EBNA-1-Zelllinie (ATCC CRL 10478) ein, die aus der Nierenzelllinie CVI (ATCC CCL 70) der afrikanischen grünen Meerkatze stammt, wie von McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) beschrieben.
Etablierte Verfahren zum Einführen von DNA in Säugerzellen wurden beschrieben (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, Seiten 15–69). Zusätzliche Protokolle, die kommerziell erhältliche Reagenzien verwenden, wie z.B. Lipofectamin (Gibco/BRL) oder Lipofectamin Plus, können zur Transfektion von Zellen verwendet werden (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7417, 1987). Außerdem kann die Elektroporation verwendet werden, um Säugerzellen unter Verwendung herkömmlicher Methoden zu transfizieren, wie z.B. den in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Band 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschriebenen. Die Selektion von stabilen Transformanten kann unter Verwendung von Resistenzen gegenüber cytotoxischen Arzneimitteln als Selektionsverfahren durchgeführt werden. Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487–511, 1990, beschreibt mehrere Selektionsschemata, wie z.B. die Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Resistenz. Ein geeigneter Wirtsstamm für die DHFR-Selektion kann der CHO-Stamm DX-B11 sein, der eine Defizienz in DHFR aufweist (Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216–4220, 1980). Ein Plasmid, das die DHFR cDNA exprimiert, kann in den Stamm DX-B11 eingeführt werden, und nur Zellen, die das Plasmid enthalten, können in dem entsprechenden selektiven Medium wachsen. Weitere Beispiele für selektierbare Marker, die in einen Expressionsvektor eingeschlossen werden können, schließen cDNAs ein, die Resistenz gegen Antibiotika wie z.B. G418 und Hygromycin B verleihen. Zellen, die den Vektor enthalten, können auf Basis der Resistenz gegen diese Verbindungen selektiert werden.
Transkriptionelle und translationelle Kontrollsequenzen für Säugerwirtszell-Expressionsvektoren können aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Enhancer-Sequenzen stammen vom Polyomavirus, Adenovirus 2, Simianvirus 40 (SV40) und dem menschlichen Cytomegalovirus. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40 viralen Genom stammen, z.B. der SV 40 Origin, der frühe und späte Promotor, Enhancer, Splice- und Polyadenylierungsstellen, können verwendet werden, um weitere genetische Elemente für die Expression einer strukturellen Gensequenz in einer Säugerwirtszelle zur Verfügung zu stellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virusgenom als ein Fragment erhalten werden können, das außerdem einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie die etwa 250 Basenpaar lange Sequenz, die sich von der Hind III-Stelle bis zur Bgl I-Stelle, die in dem SV40 viralen Replikationsursprung lokalisiert sind, umfasst ist.
Zusätzliche Kontrollsequenzen, von denen gezeigt wurde, dass sie die Expression heterologer Gene von Säugerexpressionsvektoren verbessern, schließen Elemente wie das Expressions-verstärkende Sequenzelement (expression augmenting sequence element, EASE), das aus CHO-Zellen stammt (Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, Seiten 529–534) und die Tripartit-Leader (TPL)- und VA-Gen-RNAs aus dem Adenovirus 2 (Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475–13491, 1982) ein. Die interne Ribosomeintrittstelle (IRES)-Sequenzen viralen Ursprungs erlauben die effiziente Translation von dicistronischen mRNAs (Oh und Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295–300, 1993; Ramesh et al., Nucleic Acids Research 24: 2697 2700, 1996). Von der Expression einer heterologen cDNA als Teil einer dicistronischen mRNA, gefolgt von dem Gen für einen selektierbaren Marker (z.B. DHFR), wurde gezeigt, dass sie die Transfizierbarkeit des Wirtes und die Expression der heterologen cDNA verbessert (Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990). Beispielhafte Expressionsvektoren, die dicistronische mRNAs verwenden, sind der pTR-DC/GFP, der von Mosser et al., Biotechniques 22: 150–161, 1997 beschrieben wurde und der p2A5I, der von Morris et al., Animal Cel Technology, 1997, Seiten 529–534, beschrieben wurde.
Ein nützlicher Vektor für starke Expression, pCAVNOT, wurde von Mosley et al., Cell 59: 335–348, 1989, beschrieben. Weitere Expressionsvektoren für die Verwendung in Säugerwirtszellen können wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3: 280, 19983) beschrieben konstruiert werden. Ein nützliches System für die starke Expression von Säuger cDNAs in C127 murinen Säugerepithelzellen kann wie im Wesentlichen von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein geeigneter Vektor zur starken Expression, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312: 768, 1984, wurde als ATCC 39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säuger-Expressionsvektoren sind in EP-A-0367566 und in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/701,415, eingereicht am 16. Mai 1991, die hierin durch Referenz eingeschlossen sind, beschrieben. Die Vektoren können von Retroviren stammen. Anstelle der nativen Signalsequenz kann eine heterologe Signalsequenz angefügt werden, wie z.B. die Signalsequenz für IL-7, die in dem US-Patent 4,965,195 beschrieben wird; die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, die in Cosman et al., Nature 312: 768 (1984), beschrieben ist; das IL-4-Signalpeptid, das in EP 367,566 beschrieben ist; das Signalpeptid des Typ I IL-1-Rezeptors, das in dem US-Patent 4,968,607 beschrieben ist; und das Signalpeptid des Typ II IL-1-Rezeptors, das in EP 460,846 beschrieben ist.
Ein isolierter und gereinigter SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker gemäß der Erfindung kann durch rekombinante Expressionssysteme wie oben beschrieben hergestellt oder aus natürlich vorkommenden Zellen gereinigt werden. SVPH1-8 Polypeptide können substanziell gereinigt werden, wie durch eine einzige Proteinbande bei der Analyse mit Hilfe von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) angezeigt.
Ein Verfahren zur Herstellung von SVPH1-8 Polypeptiden umfasst die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurde, der eine Sequenz umfasst, die ein SVPH1-8 Polypeptid kodiert, unter Bedingungen, die ausreichen, um die Expression von SVPH1-8 Polypeptid zu fördern. Das SVPH1-8 Polypeptid wird an schließend aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten gewonnen, abhängig davon, welches Expressionssystem verwendet wird. Wie dem Fachmann bekannt ist, werden die Methoden zur Reinigung eines rekombinanten Proteins abhängig von Faktoren wie der Art der Wirtszelle, die verwendet wird und ob das rekombinante Protein in das Kulturmedium sezerniert wird oder nicht, variieren. Zum Beispiel kann das Kulturmedium, wenn Expressionssysteme verwendet werden, die das rekombinante Protein sezernieren, zunächst unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, z.B. einer Amicon oder Millipore Pellicon-Ultrafiltrationseinheit, konzentriert werden. Im Anschluss an den Konzentrierungsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix, wie z.B. ein Gelfrationsmedium, aufgetragen werden. Alternativ kann ein Anionaustauschharz verwendet werden, z.B. eine Matrix oder ein Substrat, das funktionelle (pendant) Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen aufweist. Die Matrizes können Acrylamid, Agarose, Dextran, Cellulose oder andere Arten sein, die im Allgemeinen bei der Proteinreinigung verwendet werden. Alternativ kann ein Kationaustauschschritt angewendet werden. Geeignete Kationaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizes ein, die Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen umfassen. Sulfopropylgruppen sind bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere reverse Phase-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatografie (reversed-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC)-Schritte, die hydrophobe RP-HPLC-Medien verwenden (z.B. Silicagel oder Polymerharze, die funktionelle Methyl- oder andere aliphatische Gruppen aufweisen) verwendet werden, um die SVPH1-8 Polypeptide weiter zu reinigen. Einige oder alle der voranstehenden Reinigungsschritte, in verschiedenen Kombinationen, sind wohlbekannt und können verwendet werden, um ein isoliertes und gereinigtes rekombinantes Protein zur Verfügung zu stellen.
Es ist möglich, eine Affinitätssäule, die ein SVPH1-8 Polypeptid bindendes Protein enthält, wie z.B. einen monoklonalen Antikörper, der gegen SVPH1-8 Polypeptide erzeugt wurde, zu verwenden, um die exprimierten SVPH1-8 Polypeptide über Affinität zu reinigen. Die SVPH1-8 Polypeptide können von einer Affinitätssäule unter Verwendung konventioneller Methoden, z.B. in einem hochsalzigen Elutionspuffer, entfernt werden und anschließend zur Verwendung in einen Niedrigsalzpuffer dialysiert werden, oder durch Verändern des pH oder anderer Komponenten, abhängig von der verwendeten Affinitätsmatrix.
Rekombinantes Protein, das in Bakterienkultur hergestellt wurde, wird gewöhnlich durch ein erstes Aufschließen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus den Zellpellets, wenn es sich um ein unlösliches Polypeptid handelt oder aus der Überstandsflüssigkeit, wenn es sich um ein lösliches Polypeptid handelt, gefolgt von ein oder zwei Konzentrierungs-, Aussalzungs-, Ionenaustausch-, Affinitätsreinigungs- oder Größenausschluss-Chromatografie-Schritten, isoliert. Schließlich kann RP-HPLC für letzte Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch jedes herkömmliche Verfahren aufgeschlossen werden, einschließlich dem Wechsel zwischen Einfrieren und Auftauen (freeze-thaw cycling), Ultraschallbehandlung, mechanischem Ausschluss oder die Verwendung von zelllysierenden Mitteln.
Transformierte Hefewirtszellen werden vorzugsweise zur Expression von SVPH1-8 Polypeptiden als sekretierte Polypeptide verwendet, um die Reinigung zu vereinfachen. Von einer Hefewirtszell-Fermentation sezerniertes rekombinantes Polypeptid kann durch Verfahren, die den von Urdal et al. beschriebenen entsprechen, gereinigt werden (J. Chromatog. 296: 171, 1984). Urdal et al. beschreibt zwei sequenzielle, reverse Phase HPLC-Schritte für die Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 auf einer präparativen HPLC-Säule.
SVPH1-8 Polypeptid-Molekulargewichtsmarker können durch Verfahren, einschließlich der Sedimentation, Gelelektrophorese, Chromatografie und Massenspektrometrie analysiert werden. SVPH1-8 Polypeptide können als Molekulargewichtsmarker unter Verwendung von Analyseverfahren, die bei der Bestimmung des Molekulargewichts eines Testproteins behilflich sind, dienen. Eine Bestimmung des Molekulargewichts des Testproteins ist bei der Identifizierung des Testproteins hilfreich.
Die SVPH1-8 Polypeptide können einer Fragmentierung in Peptide durch chemische und enzymatische Mittel unterzogen werden. Die chemische Fragmentierung schließt die Verwendung von Cyanbromid zur Spaltung unter neutralen oder sauren Bedingungen ein, so dass die spezifische Spaltung an Methioninresten auftritt (E. Gross, Methods in Enz. 11: 238–255, 1967). Dies kann weiterhin zusätzliche Schritte enthalten, wie z.B. einen Carboxymethylierungsschritt zur Umwandlung der Cysteinreste in nicht reagierende Spezies. Die enzymatische Fragmentierung schließt die Verwendung einer Protease, wie z.B. Asparaginylendopeptidase, Arginylendopeptidase, Achromobacter Protease I, Trypsin, Staphlococcus aureus V8 Protease, Endoproteinase Asp-N oder Endoproteinase Lys-C unter konventionellen Bedingungen ein, um eine Spaltung an spezifischen Aminosäureresten zu erzeugen. Die Asparaginylendopeptidase kann spezifisch auf der Carboxylseite der Asparaginreste, die in den SVPH1-8 Polypeptiden vorhanden sind, spalten. Die Arginylendopeptidase kann spezifisch auf der Carboxylseite der Agininreste, die innerhalb der SVPH1-8 Polypeptide vorhanden sind, spalten. Die Achromobacter Protease I kann spezifisch auf der Carboxylseite der Lysinreste, die innerhalb der SVPH1-8 Polypeptide vorhanden sind, spalten (Sakiyama und Nakat, US-Patent Nr. 5,248,599; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 44–50, 181; T. Masaki et al., Biochim. Biophys. Acta 660: 51–55, 1981). Trypsin kann spezifisch auf der Carboxylseite der Aginin- und Lysinreste, die innerhalb der SVPH1-8 Polypeptide vorhanden sind, spalten. Die V8 Protease Staphylococcus aureus kann spezifisch auf der Carboxylseite der Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste, die in den SVPH1-8 Polypeptiden vorhanden sind, spalten (D. W. Cleveland, J. Biol. Chem. 3: 1102–1106, 1977). Die Endoproteinase Asp-N kann spezifisch auf der Aminoseite der Asparaginreste, die in den SVPH1-8 Polypeptiden vorhanden sind, spalten. Die Endoproteinase Lys-C kann spezifisch auf der Carboxylseite der Lysinreste, die innerhalb der SVPH1-8 Polypeptide vorhanden sind, spalten. Weitere enzymatische und chemische Behandlungen können in ähnlicher Weise verwendet werden, um die SVPH1-8 Polypeptide spezifisch in ein einzigartiges Set an spezifischen Peptid-Molekulargewichtsmarkern zu fragmentieren.
Die resultierenden fragmentierten Peptide können durch Verfahren, einschließlich der Sedimentation, Elektrophorese, Chromatografie und Massenspektrometrie, analysiert werden. Die fragmentierten Peptide, die von den SVPH1-8 Polypeptiden abgeleitet sind, können als Molekulargewichtsmarker unter Verwendung von Analysemethoden, die bei der Bestimmung des Molekulargewichts eines Testproteins behilflich sind, dienen. Solch eine Bestimmung des Molekulargewichts ist bei der Identifizierung des Testproteins behilflich. Die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker haben vorzugsweise eine Größe zwischen 10 und 721 Aminosäuren. Bevorzugter haben die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eine Größe zwischen 10 und 100 Aminosäuren. Noch bevorzugter haben die SVPH1-8 fragmentierten Peptid-Molekulargewichtsmarker eine Größe zwischen 10 und 50 Aminosäuren und insbesondere zwischen 10 und 35 Aminosäuren. Am bevorzugtesten sind SVPH1-8 fragmentierte Peptid-Molekulargewichtsmarker mit einer Größe zwischen 10 und 20 Aminosäuren.
Darüber hinaus kann die Analyse der fortschreitenden Fragmentierung der SVPH1-8 Polypeptide in spezifische Peptide (D. W. Cleveland et al., J. Biol. Chem. 252: 1102–1106, 1977), wie z.B. durch Veränderung der Zeit oder Temperatur der Fragmentierungsreaktion, als Kontrolle für das Ausmaß der Spaltung eines Testproteins verwendet werden. Zum Beispiel erlaubt die Spaltung derselben Menge SVPH1-8 Polypeptid und Testprotein unter identischen Bedingungen einen direkten Vergleich des Ausmaßes der Fragmentierung. Bedingungen, die zu der vollständigen Fragmentierung des SVPH1-8 Polypeptids führen, können auch zu der vollständigen Fragmentierung des Testproteins führen.
Darüber hinaus besitzen SVPH1-8 Polypeptide und fragmentierte Peptide davon einzigartige Ladungseigenschaften und können daher als spezifische Marker zur Unterstützung bei der Bestimmung des isoelektrischen Punktes eines Testproteins oder fragmentierten Peptids unter Verwendung von Methoden wie z.B. der isoelektrischen Fokussierung dienen. Die Methode der isoelektrischen Fokussierung kann weiterhin mit anderen Methoden, wie z.B. der Gelelektrophorese kombiniert werden, um ein Protein auf Grundlage des Molekulargewichts und der Ladung aufzutrennen. Ein Beispiel für solch eine Kombination ist das der zweidimensionalen Elektrophorese (T. D. Brock und M. T. Madigan, Biology of Microorganisms 76–77 (Prentice Hall, 6d ed. 1991)). Die SVPH1-8 Polypeptide und fragmentierten Peptide davon können in solchen Analysen als Marker verwendet werden, um bei der Bestimmung sowohl des isoelektrischen Punktes als auch des Molekulargewichts eines Testproteins oder fragmentierten Peptids behilflich zu sein.
Kits, die bei der Bestimmung des scheinbaren Molekulargewichts und isoelektrischen Punktes eines Testproteins behilflich sind, können aus den SVPH1-8 Polypeptiden und Peptidfragmenten davon zusammengestellt werden. Kits dienen außerdem dazu, den Grad der Fragmentierung eines Testproteins zu bestimmen. Die Bestandteile solcher Kits können unterschiedlich sein, enthalten jedoch typischerweise SVPH1-8 Polypeptid und fragmentierte Peptid-Molekulargewichtsmarker. Außerdem können solche Kits SVPH1-8 Polypeptide enthalten, in denen eine für die Fragmentierung notwendige Stelle entfernt worden ist. Darüber hinaus können die Kits Reagenzien für die spezifische Spaltung von SVPH1-8 und dem Testprotein durch chemische oder enzymatische Spal tung enthalten. Die Kits können darüber hinaus Antikörper enthalten, die gegen SVPH1-8 Polypeptide oder Fragmente davon gerichtet sind.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide, die eine einzelsträngige Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) umfassen, die fähig ist, an eine SVPH1-8 mRNA Sequenz zu binden (um eine Duplex zu bilden) oder an die SVPH1-8 Sequenz in der doppelsträngigen DNA Helix (um eine Trippel-Helix zu bilden), können gemäß der Erfindung hergestellt werden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide gemäß der Erfindung umfassen ein Fragment des kodierenden Bereichs der SVPH1-8 cDNA (SEQ ID NO: 1). Solch ein Fragment umfasst im Allgemeinen wenigstens etwa 14 Nukleotide, vorzugsweise etwa 14 bis etwa 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Antisense- oder Sense-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz für ein bestimmtes Protein zu erzeugen, wird z.B. in Stein und Cohen, Cancer Res. 48: 2659, 1988 und van der Krol et al., BioTechniques 6: 958, 1988 beschrieben.
Die Bindung von Antisense- oder Sense-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zu der Bildung von Komplexen, welche die Translation (RNA) oder Transkription (DNA) auf eine von verschiedenen Weisen blockiert, einschließlich der verstärkten Degradation der Duplizes, der vorzeitigen Termination der Transkription oder Translation oder auf andere Arten. Die Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können folglich verwendet werden, um die Expression von SVPH1-8 Polypeptiden zu blockieren. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide umfassen weiterhin Oligonukleotide, die modifizierte Zucker-Phosphodiester-Rückgrade aufweisen (oder andere Zuckerverbindungen, wie z.B. die in WO 91/06629 beschriebenen), und worin solche Zuckerverbindungen resistent gegenüber endogenen Nukleasen sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind stabil in vivo (d.h. fähig, der Degradation durch Enzyme zu widerstehen), behalten jedoch die Sequenzspezifität zur Fähigkeit zur Bindung an die Ziel-Nukleotidsequenzen bei. Weitere Beispiele für Sense- oder Antisense-Oligonukleotide schließen solche Oligonukleotide ein, die kovalent mit organischen Resten verbunden sind, z.B. solche wie in WO 90/10448 beschrieben, sowie anderen Resten, die die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz erhöhen, wie z.B. Poly-(L-lysin). Noch darüber hinaus können interkalierende Agenzien, wie z.B. Ellipticin und alkylierende Agenzien oder Metallkomplexe an die Antisense- oder Sense-Oligonukleotide angefügt werden, um die Bin dungsspezifitäten der Antisense- oder Sense-Oligonukleotide für die Zielnukleotidsequenz zu modifizieren.
Antisense- oder Sense-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch jedes beliebige Gentransferverfahren, einschließlich z.B. CaPO₄-vermittelter DNA Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren, wie z.B. dem Epstein-Barr-Virus, eingeführt werden. Antisense- oder Sense-Oligonukleotide werden vorzugsweise in eine Zelle, die eine Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Insertion des Antisense- oder Sense-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor und anschließendes Inkontaktbringen der Zelle mit dem retroviralen Vektor, der die insertierte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo eingeführt. Geeignete retrovirale Vektoren schließen das murine Retrovirus M-MuLV, N2 (ein Retrovirus, der von M-MuLV abgeleitet ist) oder die Double-Copy-Vektoren, die DCT5A, DCT5B und DCT5C genannt werden (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656) ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Sense- oder Antisense-Oligonukleotide können außerdem durch Bildung eines Konjugates mit einem Liganden-bindenden Molekül, wie in WO 91/04753 beschrieben, in eine Zelle eingeführt werden. Geeignete Liganden-bindende Moleküle schließen Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, weitere Cytokine oder andere Liganden, die an Zelloberflächenrezeptoren binden, ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Vorzugsweise beeinträchtigt die Konjugation des Liganden-bindenden Moleküls die Fähigkeit des Liganden-bindenden Moleküls, an dessen entsprechendes Molekül oder Rezeptor zu binden, nicht wesentlich oder blockiert den Eintritt der Sense- oder Antisense-Oligonukleotide oder dessen konjugierter Version in die Zelle nicht.
Alternativ kann ein Sense- oder Antisense-Oligonukleotid durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes, wie in WO 90/10488 beschrieben, in eine Zelle eingeführt werden. Der Sense- oder Antisense-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Isolierte und gereinigte SVPH1-8 Polypeptide oder Fragmente davon können auch selbst nützlich sein als therapeutisches Mittel zur Inhibierung des IL-1- und TNF-Signaling. Die SVPH1-8 Polypeptide werden mit Hilfe von wohlbekannten Mitteln, wie z.B. durch Einschließen des Proteins in Liposomen oder dessen Kopplung an einen monoklonalen Antikörper, der einen spezifischen Zelltyp bindet, in die intrazelluläre Umgebung eingeführt.
SVPH1-8 DNA, SVPH1-8 Polypeptide und Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide können als Reagenzien in einer Vielzahl von Forschungsprotokollen verwendet werden. Eine Auswahl an solchen Forschungsprotokollen sind in Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Band. 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) angegeben.
Zum Beispiel können diese Reagenzien als Marker für die zellspezifische oder gewebsspezifische Expression von RNA oder Proteinen dienen. Die Expression der SVPH1-8 RNA nur in Hoden deutet darauf hin, dass die Expression der SVPH1-8 RNA und Polypeptide in von Hoden abgeleiteten Zelllinien oder testikulären Geweben direkt mit den Reagenzien gemäß der Erfindung detektiert werden kann. Folglich können diese Reagenzien als Marker für die zellspezifische oder gewebsspezifische Expression verwendet werden. Solche Marker können bei der Detektion und der Reinigung von spezifischen Zelltypen und bei der Analyse von verschiedenen Krankheiten, die mit Hoden assoziiert sind, verwendet werden (Schmoll et al., Semin Oncol 25: 174–185, 1998. Wahren et al., J. Natl. Cancer Inst 58: 489–98; 1977; Beckstead, J. H., Am J. Surg Pathol 7: 341–9, 1983; Burke et al., Mod Pathol 1: 475–479, 1988; Rajpert-De Meyts et al., Int J. Androl 17: 85–92, 1994; Mead et al., J. Clin Oncol 10: 85–94, 1992). In einer Ausführungsform kann die Identifizierung testikulärer Zellen in testikulären Biopsien durch Reagenzien gemäß der Erfindung den Nachweis und die Prognose von Hodenkrebs erleichtern. Zum Beispiel können Hodenzellen unter Verwendung von Sonden von SVPH1-8 Nukleinsäuren mit Hilfe konventioneller Verfahren, einschließlich Northern Blots und in situ RNA Hybridisierung (zusammengefasst in Jin et al., J. Clin Lab Anal 11: 2–9, 1997; McNicol et al., J. Pathol 182: 250–261, 1997; Luke et al., Cell Vis 5: 49–53, 1998) detektiert werden. Es versteht sich natürlich, dass viele verschiedene Methoden für die Identifizierung und Reinigung von SVPH1-8 exprimierenden Zellen verwendet werden können und dass diese Ausführungsform in keinster Weise den Umfang der Erfindung beschränkt.
In ähnlicher Weise können diese Reagenzien verwendet werden, um die konstitutive und transiente Expression von SVPH1-8 RNA oder Polypeptiden zu untersuchen. Die SVPH1-8 DNA kann verwendet werden, um die chromosomale Lokalisierung der SVPH1-8 DNA zu bestimmen und um Gene in Bezug auf diese chromosomale Lokalisierung zu kartieren. Die SVPH1-8 DNA kann außerdem verwendet werden, um die genetische Heterogenität und Herkunft unter Verwendung von Methoden, wie z.B. dem genetischen Fingerabdruck, zu untersuchen, ebenso wie zur Identifizierung von Risiken, die mit genetischen Störungen assoziiert sind. Die SVPH1-8 DNA kann weiterhin zur Identifizierung zusätzlicher Gene verwendet werden, die mit der SVPH1-8 DNA verwandt sind sowie zur Etablierung evolutionärer Stammbäume auf der Grundlage des Vergleichs von Sequenzen. Die SVPH1-8 DNA und SVPH1-8 Polypeptide können verwendet werden, um solche Gene oder Proteine, die zu der SVPH1-8 DNA oder Polypeptiden homolog sind, mit Hilfe von positiven Screening-Verfahren, wie z.B. Southern Blotting und Immunblotting und mit Hilfe von negativen Screening-Verfahren, wie z.B. Subtraktion, zu selektieren.
Die SVPH1-8 Proteinase kann als Reagens bei der Analyse mit anderen Proteinasen verwendet werden, um die Substratspezifität und Aktivität der Proteinasen zu vergleichen. Chimere Proteinasen können durch Austausch von Fragmenten der SVPH1-8 Proteinase mit anderen Proteinasen erzeugt werden. Solche chimeren Proteinasen können in Hinblick auf eine veränderte Aktivität und Spezifität analysiert werden.
Die Proteinaseaktivität von SVPH1-8 kann als Zusatz in Reinigungsmitteln zur Entfernung von Flecken, die einen Proteinanteil haben, ähnlich der Verwendung von Proteasen, wie in US-Patent Nr. 5,599,400 und US-Patent Nr. 5,650,315 beschrieben, verwendet werden. Die Reinigungszusammensetzung kann weitere bekannte Bestandteile von Reinigungsmitteln haben, wie z.B. Tenside, Schaumverstärker, Füllmittel, Enzymstabilisatoren, Chlorbleichenabsorber, andere proteolytische Enzyme, Bakteriozide, Farbstoffe, Parfüme, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel und andere geeignete Inhaltsstoffe. Die Reinigungszusammensetzung enthält vorzugsweise zwischen 0,001% bis 10% SVPH1-8 Proteinase. Die SVPH1-8 Proteinase kann in einer Reinigungszusammensetzung enthalten sein oder mit anderen Bestandteilen zum Zeitpunkt der Verwendung als ein Zusatz kombiniert werden. Der Reinigungszusatz kann als eine Flüssigkeit, Puder, Granulat, Brei oder andere herkömmliche Form eines Reinigungsmittelzusatzstoffs formuliert sein.
Die SVPH1-8 Polypeptide können außerdem als Reagens zur Identifizierung (a) irgendeines Proteins, das SVPH1-8 Polypeptid reguliert und (b) anderer Proteine, mit denen es interagieren könnte, zu identifizieren. Die SVPH1-8 Polypeptide könnten durch Koppeln des rekombinanten Proteins an eine Affinitätsmatrix oder durch ihre Verwendung als Bait in dem 2-Hybridsystem verwendet werden.
Wenn sie als therapeutische Mittel verwendet werden, können die SVPH1-8 Polypeptide gemäß bekannter Verfahren in pharmazeutische Zusammensetzungen formuliert werden. Die SVPH1-8 Polypeptide können entweder als einziger aktiver Stoff oder mit anderen bekannten aktiven Stoffen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), Konservierungsmittel (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Löslichmachern, Adjuvanzien und/oder Trägerstoffen in einer Mischung kombiniert werden. Geeignete Trägerstoffe und deren Formulierungen sind in Remigton's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Co. beschrieben. Darüber hinaus können solche Zusammensetzungen SVPH1-8 Polypeptide enthalten, die mit Polyethylenglycol (PEG) oder Metallionen komplexiert sind oder in polymere Verbindungen, wie z.B. Polyacetansäure, Polyglycolsäure, Hydrogele usw. eingefügt sind oder in Liposomen, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellären oder multilamellären Vesikeln, erythrocyte ghosts oder Sphäroblasten aufgenommen wurden. Solche Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, Stabilität, in vivo Freisetzungsrate und in vivo Clearance-Rate der SVPH1-8 Polypeptide beeinflussen.
In einem Aspekt der Erfindung können SVPH1-8 Polypeptide und Peptide, die auf den Aminosäuresequenzen von SVPH1-8 basieren, verwendet werden, um Antikörper herzustellen, die spezifisch an SVPH1-8 Polypeptide binden. Der Begriff "Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, Fragmente davon, wie z.B. F(ab')2- und Fab-Fragmente, ebenso wie jegliche rekombinant hergestellte Bindungspartner einschließen. Antikörper sind als spezifisch bindend definiert, wenn sie SVPH1-8 Polypeptide mit einer K_a größer als oder gleich etwa 10⁷M^–1 binden. Affinitäten von Bindungspartnern oder Antikörpern können unter Verwendung konventioneller Methoden leicht bestimmt werden, z.B. solcher wie von Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) beschrieben.
Polyklonale Antikörper können einfach aus einer Vielzahl von Quellen erzeugt werden, z.B. aus Pferden, Kühen, Ziegen, Hunden, Hühnern, Kaninchen, Mäusen oder Ratten, unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Im Allgemeinen werden die gereinigten SVPH1-8 Polypeptide, oder ein Peptid, das auf der Aminosäuresequenz der SVPH1-8 Polypeptide basiert, das in geeigneter Weise konjugiert ist, dem Wirtstier typischerweise über eine parenterale Injektion verabreicht. Die immunogenizität der SVPH1-8 Polypeptide kann durch Verwendung eines Adjuvans, z.B. des Freund's kompletten oder inkompletten Adjuvans, verstärkt werden. Im Anschluss an Booster-Immunisierungen werden kleine Serumproben gewonnen und auf Reaktivität mit SVPH1-8 Polypeptiden getestet. Beispiele für verschiedene Assays, die für solche Bestimmungen nützlich sind, schließen die in: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 beschriebenen ein; ebenso wie Verfahren, wie z.B. die Gegenstrom-Immunelektrophorese (countercurrent immunoelectrophoresis, CIEP), Radioimmunassay, Radioimmunpräzipitation, Festphasen-Immunassays (enzyme-linked immuno-sorbent assays, ELISA), Dot-Blot-Assays und Sandwich-Assays, siehe US-Patente Nr. 4,376,110 und 4,486,530.
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung wohlbekannter Verfahren leicht hergestellt werden, siehe z.B. die Verfahren, die in den US-Patenten Nr. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol (eds.), 1980, beschrieben sind. Kurz beschrieben wird den Wirtstieren, wie z.B. Mäusen, intraperitoneal wenigstens einmal und vorzugsweise wenigstens zweimal in etwa 3-Wochen-Intervallen isolierte und gereinigte SVPH1-8 Polypeptide oder konjugierte SVPH1-8 Polypeptide injiziert, optional in Anwesenheit eines Adjuvans. Maus-Seren werden anschließend mit Hilfe konventioneller Dot-Blot-Verfahren oder Antibody capture (ABC) untersucht, um zu bestimmen, welches Tier am besten zur Fusion geeignet ist. Etwa zwei bis drei Wochen später wird den Mäusen ein intravenöser Boost an SVPH1-8 Polypeptiden oder konjugierten SVPH1-8 Polypeptiden verabreicht. Die Mäuse werden später geopfert und die Milzzellen werden mit kommerziell erhältlichen Myelomzellen, wie z.B. Ag8.653 (ATCC), gemäß etablierten Protokollen fusioniert. Kurz beschrieben werden die Myelomzellen mehrere Male in Medium gewaschen und mit Maus-Zellen in einem Verhältnis von etwa drei Milzzellen zu einer Myelomzelle fusioniert. Das Fusionsmittel kann jedes beliebige geeignete auf dem Gebiet verwendete Mittel sein, z.B. Polyethylenglycol (PEG). Die Fusion wird auf Platten ausplattiert, die Medium enthalten, welches das selektive Wachstum der fusionierten Zellen erlaubt. Die fusionierten Zellen können anschließend etwa acht Tage lang wachsen gelassen werden. Die Überstände aus den resultierenden Hybridomen werden gesammelt und auf eine Platte gegeben, die zunächst mit einem Ziegen-anti-Maus Ig beschichtet wird. Im Anschluss an das Waschen wird ein Marker, wie z.B. ¹²⁵I-SVPH1-8 Polypeptide zu jeder Vertiefungen gegeben und anschließend erfolgt eine Inkubation. Positive Vertiefungen können anschließend mit Hilfe von Autoradiografie detektiert werden. Positive Klone können in Großkulturen wachsen gelassen werden, und die Überstände werden anschließend über eine Protein A Säule (Pharmacia) gereinigt.
Die monoklonalen Antikörper gemäß der Erfindung können unter Verwendung alternativer Methoden, wie z.B. den von Alting-Mees et al. beschrieben "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1–9 (1990), hiermit durch Referenz eingeschlossen, hergestellt werden. In ähnlicher Weise können Bindungspartner unter Verwendung rekombinanter DNA Methoden konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens, das einen spezifischen bindenden Antikörper kodiert, einzufügen. Solch ein Verfahren ist in Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) beschrieben.
Andere Arten von "Antikörpern" können unter Verwendung der hierin zur Verfügung gestellten Informationen in Verbindung mit dem Stand des Wissens auf dem Gebiet hergestellt werden. Zum Beispiel sind Antikörper, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie Elemente humaner Antikörper enthalten, die fähig sind, SVPH1-8 Polypeptide spezifisch zu binden, ebenfalls von der Erfindung umfasst.
Sobald sie isoliert und gereinigt wurden, können die Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide verwendet werden, um die Anwesenheit von SVPH1-8 Polypeptiden in einer Probe unter Verwendung etablierter Assay-Protokolle detektiert werden. Zum Beispiel können die Antikörper gegen SVPH1-8 Polypeptide verwendet werden, um SVPH1-8 exprimierende Zellen, wie z.B. Hodenzellen, durch konventionelle Methoden zu detektie ren oder zu reinigen. Weiterhin können die Antikörper gemäß der Erfindung therapeutisch verwendet werden, um an SVPH1-8 Polypeptide zu binden und deren Aktivität in vivo zu inhibieren.
Die gereinigten SVPH1-8 Polypeptide gemäß der Erfindung werden die Entdeckung von Inhibitoren von SVPH1-8 Polypeptiden erleichtern. Die Verwendung eines gereinigten SVPH1-8 Polypeptids bei dem Screening nach potenziellen Inhibitoren davon ist wichtig und kann die Möglichkeit von störenden Reaktionen mit Kontaminanten eliminieren oder reduzieren.
Darüber hinaus können die SVPH1-8 Polypeptide für die strukturbasierte Entwicklung von SVPH1-8 Polypeptid-Inhibitoren verwendet werden. Eine solche strukturbasierte Entwicklung ist auch als "rationale Wirkstoffentwicklung" (rational drug design) bekannt. Die SVPH1-8 Polypeptide können dreidimensional, z.B. durch Röntgenstrahlen-Kristallografie, Kernspinresonanz oder Homologie-Modeling (homology modeling), alles wohlbekannte Verfahren, analysiert werden. Die Verwendung der strukturellen Information des SVPH1-8 Polypeptids in Software-Systemen zum molekularen Modeling zur Unterstützung bei der Inhibitorenentwicklung und Inhibitor-SVPH1-8 Polypeptid-Interaktion ist ebenfalls von der Erfindung umfasst. Solch ein computergestütztes Modeling und Arzneistoffentwicklung kann Informationen wie die Analyse der chemischen Konformation, das elektrostatische Potenzial der Moleküle, die Proteinfaltung usw. verwenden. Zum Beispiel hat sich die Entwicklung von klassenspezifischen Inhibitoren von Metalloproteasen zumeist auf Versuche konzentriert, das katalytische Zinkatom zu chelatieren oder zu binden. Synthetische Inhibitoren werden im Allgemeinen so konstruiert, dass sie eine negativ geladene Komponente enthalten, an die eine Reihe anderer Gruppen angefügt werden können, die entwickelt wurden, um in die Spezifitätstaschen der jeweiligen Protease zu passen. Ein besonderes Verfahren gemäß der Erfindung umfasst das Untersuchen der dreidimensionalen Struktur der SVPH1-8 Polypeptide auf mögliche Bindungsstellen für Substrate, das Synthetisieren eines neuen Moleküls, das eine vorausgesagte Reaktionsstelle beinhaltet und das Untersuchen des neuen Moleküls wie oben beschrieben.
Die Beschreibung wird am besten in Anbetracht der Lehren der in der Beschreibung zitierten Referenzen verstanden. Die Ausführungsformen in der Beschreibung stellen eine Veranschaulichung der Ausführungsformen gemäß der Erfindung dar und sollten nicht als den Umfang der Erfindung beschränkend ausgelegt werden. Der Fachmann erkennt viele weitere Ausführungsformen, die von der beanspruchten Erfindung umfasst sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der DNA-Sequenz der SEQ ID NO: 1; (b) einem Nukleinsäuremolekül, das die Sequenz der Nukleotide 595–1191 der SEQ ID NO: 1 umfasst; (c) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die Sequenz der SEQ ID NO: 2 umfasst; (d) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Aminosäuresequenz kodiert, welche die Aminosäuren 199–397 der SEQ ID NO: 2 umfasst; (e) einem Nukleinsäuremolekül, das mit einem von beiden Strängen einer denaturierten, doppelsträngigen DNA, welche die Nukleinsäure gemäß (a), (b), (c) oder (d) umfasst, unter Bedingungen moderater Stringenz in 50% Formamid und 6 × SSC, bei 42°C und bei Waschbedingungen von 60°C, 0,5 × SSC, 0,1% SDS hybridisiert, wobei das genannte Nukleinsäuremolekül eine Aminosäuresequenz kodiert, die wenigstens 80% Identität mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 aufweist und Proteinaseaktivität hat; und (f) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment des Polypeptids der SEQ ID NO: 2 kodiert und Proteinaseaktivität hat.
Expressionsvektor, der das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 umfasst.
Isoliertes Polypeptid, das durch das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 kodiert wird.
Das isolierte Polypeptid gemäß Anspruch 3, das ein Molekulargewicht von etwa 81 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, hat.
Das isolierte Polypeptid gemäß Anspruch 3, wobei das Polypeptid nicht glykosyliert ist.
Isolierter Antikörper, der an ein Polypeptid gemäß Anspruch 3 bindet.
Der isolierte Antikörper gemäß Anspruch 6, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 2 transfiziert oder transduziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines SVPH1-8 Polypeptids, das die Kultivierung der Wirtszelle gemäß Anspruch 8 unter Bedingungen umfasst, welche die Expression des genannten Polypeptids erlauben.
Das Verfahren gemäß Anspruch 9, das weiterhin die Gewinnung des Polypeptids umfasst.
Verfahren zum Nachweis von Hodenzellen, umfassend: das Inkubieren von Zellen mit einer Sonde, die das Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1 umfasst; das Waschen der genannten Zellen zum Entfernen ungebundener Sonde; und das Detektieren der Zellen, an die die genannte Probe gebunden hat.
Verfahren zum Nachweis von Hodenzellen, umfassend: das Inkubieren von Zellen mit einem Antikörper gemäß Anspruch 6; das Waschen der genannten Zellen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen; und das Detektieren der Zellen, an die der genannte Antikörper gebunden hat.
Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) Aminosäuren 1–26 der SEQ ID NO: 2 (b) Aminosäuren 1–397 der SEQ ID NO: 2: (c) Aminosäuren 1–501 der SEQ ID NO: 2; (d) Aminosäuren 1–680 der SEQ ID NO: 2; (e) Aminosäuren 2–76 der SEQ ID NO: 2; (f) Aminosäuren 27–198 der SEQ ID NO: 2; (g) Aminosäuren 27–245 der SEQ ID NO: 2; (h) Aminosäuren 27–397 der SEQ ID NO: 2; (i) Aminosäuren 27–501 der SEQ ID NO: 2; (j) Aminosäuren 27–680 der SEQ ID NO: 2; (k) Aminosäuren 172–245 der SEQ ID NO: 2; (l) Aminosäuren 199–397 der SEQ ID NO: 2; (m) Aminosäuren 199–501 der SEQ ID NO: 2; (n) Aminosäuren 199–680 der SEQ ID NO: 2; und (o) einem Fragment der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2, das Proteinaseaktivität hat.
Isoliertes Polypeptid, das 80% Aminosäure-Identität mit dem Polypeptid der SEQ ID NO: 2 aufweist und Proteinaseaktivität hat.
Polypeptid, hergestellt gemäß dem Verfahren gemäß Anspruch 9.
Verfahren zum Screenen nach Inhibitoren von SVPH1-8 Polypeptidaktivität, umfassend: (a) das Inkontaktbringen einer SVPH1-8 Gegenstruktur mit einem Polypeptid gemäß Anspruch 3 oder 15 in der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Inhibitor-Testverbindung, und (b) das Vergleichen der Mengen an Komplexen, die in Anwesenheit und Abwesenheit der genannten Testverbindung gebildet wurden, wobei eine geringere Menge an Komplexen in der Anwesenheit der genannten Testprobe auf die Anwesenheit eines Inhibitors in der genannten Testprobe hinweist.
Das Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei das genannte Verfahren ein Yeast Two-Hybrid Assay ist.
Verfahren zur strukturbasierten Konstruktion eines SVPH1-8 Inhibitors, umfassend: (a) das Bestimmen der dreidimensionalen Struktur eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 3, 13 oder 15; und (b) das Synthetisieren eines SVPH1-8 Inhibitors.