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Die
Erfindung betrifft Pektine. Insbesondere betrifft die Erfindung
Aloe-Pektine, ein
Isolierverfahren und ihre Verwendung.
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Die
folgenden Abkürzungen
werden verwendet:
Ab, Antikörper;
AG, Arabinogalactan; APase, alkalische Phosphatase; CDTA, trans-1,2-Diaminocyclohexan-N,N,N',N'-tetraessigsäure; Da,
Dalton; DAc, Acetylierungsgrad; DM, Methylierungsgrad; EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure; Gal,
Galactose; Gal A, Galacturonsäure;
GalNAc, N-acetyliertes Galactosamin; Glc, Glucose; Glc A, Glucuronsäure; HM,
High Methoxyl; HMW, hochmolekular; HPSEC, Hochleistungsgrößenausschlusschromatographie;
HR, haarige Region; HT, Erhitzen; kDa, Kilodalton; LM, Low Methoxyl;
LMW, niedermolekular; Man, Mannose; MWCO, Molekulargewichtsausschluss;
PBS, Phosphat-gepufferte Salzlösung
(10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,4); RG, Rhamnogalacturonan;
RT, Raumtemperatur; SEC, Größenausschlusschromatographie;
SF, superkritisches Fluid; SR, glatte Region; TMS, Trimethylsilyl;
TN-Puffer, 25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4.
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Pektin
ist eine pflanzliche Zellwandkomponente. Die Zellwand ist in drei
Schichten aufgeteilt, die Mittellamelle, die erste Zellwand und
die zweite Zellwand. Die Mittellamelle ist am pektinreichsten. Pektine
werden während
des Zellwachstums produziert und abgelagert. Besonders reichlich
sind Pektine in weichen Pflanzengeweben, unter den Bedingungen eines
schnellen Wachstums und eines hohen Feuchtigkeitsgehalts vorhanden.
In den Zellwänden
liegen die Pektine in Form eines Calciumkomplexes vor. Die Beteiligung
einer Calciumvernetzung wird durch die Tatsache untermauert, dass
Chelatbildner die Freisetzung von Pektin aus den Zellwänden erleichtern.
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Pektin
ist ein komplexes Polysaccharid, das mit den pflanzlichen Zellwänden assoziiert
ist. Es besteht aus einer 1,4-α-verknüpften Polygalacturonsäure-Hauptkette, mit Rhamnoseresten
dazwischen und modifiziert mit Neutralzucker-Seitenketten und Nichtzucker-Komponenten,
wie Acetyl-, Methyl- und Ferulasäuregruppen.
In 1 ist die allgemeine Struktur von Pektinen oder
pektischen Substanzen auf der Basis des derzeitigen Verständnisses
gezeigt. Die Gesamtstruktur ist oben gezeigt, während die ausführliche
Struktur unten gezeigt ist. Die Neutralzucker-Seitenketten, die
Arabinan- und Arabinogalactane (Typen I und II) einschließen, sind
an die Rhamnosereste in der Hauptkette in der O-3- oder O-4-Position
gebunden. Die Rhamnosereste neigen an der Hauptkette zur Clusterbildung.
Angesichts der angeknüpften
Seitenketten wird diese Region als haarige Region bezeichnet, und
der Rest der Hauptkette wird daher als glatte Region bezeichnet.
Die Rhamnosereste sind mit den Gal-A-Resten in der Hauptkette 1,2-verknüpft, und
die Konfiguration dieser Verknüpfung
wurde nun als α bestimmt.
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Pektine
werden seit jeher als Nahrungszusatzstoffe eingesetzt. Allerdings
hat sich ihre Verwendung auch in pharmazeutische Bereiche ausgedehnt.
Seit langem werden Pektine als Abführmittel verwendet und können die
Darmfunktionen verbessern. Es wird davon ausgegangen, dass die abführende Wirkung
zum Teil auf der antimikrobiellen Wirkung des Pektins beruht.
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Pektine
sind auch gegen Magen-Darm-Ulzera und Enterokolitis wirksam. Pektine
beeinflussen auch die Zellproliferation in den Eingeweiden. Sie besitzen
auch eine Blutcholesterin-senkende Wirkung und zeigen eine Hemmung
der Atherosklerose. Diese Wirkung ist das Ergebnis von Wechselwirkungen
zwischen Pektinen und Gallensalzen. Es wurde auch gezeigt, dass
Pektine das Fibrinnetzwerk bei hypercholesterinämischen Individuen beeinflusst.
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Die
Fähigkeit
zur Wechselwirkung mit vielen zweiwertigen Metallionen macht Pektine
zu einem starken Entgiftungsmittel. Es wurde gezeigt, dass Pektine
bei der Entfernung von Blei und Quecksilber aus dem Verdauungstrakt
und aus den Atemwegen wirksam sind. Neuerdings wurde festgestellt,
dass Pektine zur Behandlung des durch einen sauren Ösophagusreflux
verursachten Sodbrennens wirksam sind.
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Unlängst wurde
festgestellt, dass die so genannten modifizierten Citrus-Pektine, die kleine
Moleküle (ca.
10 kDa) sind, die durch einen alkalischen Abbau erhalten werden,
bei Labortieren bei der Prävention
von Krebszellenmetastasen wirksam sind.
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Aufgrund
der Gegenwart von Neutralzucker-Seitenketten und einigen anderen
Nichtzuckerkomponenten ist die Struktur von Pektinen sehr komplex;
im Wesentlichen haben keine zwei Moleküle identische Strukturen, was
der Grund dafür
ist, warum Pektin oft unter Verwendung des Begriffs "pektische Substanzen" beschrieben wird.
Pektische Substanzen werden im Allgemeinen verwendet, um Pektin,
Pektinsäure
und ihre Salze (Pektate) und bestimmte neutrale Polysaccharide (Arabinan,
Arabinogalactan und Galactan) einzuschließen. Pektinsäuren oder
Pektate sind entesterte Pektine.
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Rhamnose,
Galactose, Arabinose und Xylose sind die häufigsten Neutralzuckerkomponenten
der Pektine. Die weniger häufigen
sind Glucose, Mannose und Fucose. Einige der Xylosereste sind vereinzelt
mit Gal-A-Resten
in der O-3-Postion verknüpft.
In Pektinen wurden drei Typen von Neutralzucker-Seitenketten identifiziert.
Arabinan besteht aus 1,5-α-verknüpfter Arabinose.
Arabinogalactan I besteht aus 1,4-β-verknüpfter Galactose mit kurzen
Arabinanketten, die an O-3 gebunden sind. In Arabinogalactan II
ist Galactose in der 1,3&6-β-Verknüfung mit
Arabinose verknüpft.
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Die
Methylierung erfolgt an den Carboxylgruppen der Gal-A-Reste. Der
Methyl-Versterungsgrad ist als der Prozentsatz von Carboxylgruppen
(Gal-A-Reste) definiert,
die mit Methanol verestert sind. Ein Pektin mit einem Methylierungsgrad
("DM") von über 50%
wird als High Methoxyl ("HM")-Pektin betrachtet, und eines mit einem
DM von < 50% wird
als Low Methoxyl ("LM")-Pektin bezeichnet.
Die meisten natürlichen
Pektine sind HM, mit einigen Ausnahmen, wie Sonnenblumen-Pektin.
Der Acetylierungsgrad (DAc) ist als der Prozentsatz von Gal-A-Resten
definiert, die mit einer Acetylgruppe verestert sind. Es wird angenommen,
dass nur die Hydroxylgruppen acetyliert sind. Da jeder Gal-A-Rest
mehr als eine Hydroxylgruppe aufweist, kann der DAc über 100%
liegen. Der DAc ist im Allgemeinen in nativen Pektinen, mit Ausnahme
von einigen, wie Zuckerrüben-Pektin,
gering.
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Pektin
kann einige Nichtzuckerkomponenten enthalten. In Zuckerrüben-Pektin wurden Ferulasäureester
festgestellt. Sie sind mit den Arabinose- und Galactoseresten in
der Neutralzucker-Seitenkette verknüpft.
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Pektine
sind in Wasser löslich
und in den meisten organischen Lösungsmitteln
unlöslich.
Pektine mit einen sehr geringen Methyl-Veresterungsgrad und Pektinsäuren sind
nur als Kalium- oder Natriumsalz löslich. Bezüglich anderer Polymere besteht
für Pektine
keine Sättigungsgrenze,
allerdings ist es schwierig, eine echte Lösung mit Konzentrationen von
höher als
3–4% zu
erhalten. Handelsübliche
Pektine weisen einen Größenbereich
von 7–14 × 104 Da auf. Citrus-Pektine sind größer als
Apfel-Pektine. Die Viskosität
von Pektinlösungen ist
im Allgemeinen gering, und so werden Pektine selten als Verdickungsmittel
eingesetzt. Die Viskosität
hängt direkt
mit der Größe, dem
pH-Wert und auch mit der Gegenwart von Gegenionen zusammen. Die
Zugabe von einwertigen Kationen vermindert die Viskosität.
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Pektine
können
mit mehreren zweiwertigen Metallionen wechselwirken. Die Reihenfolge
der Selektivität
ist Cu ca. Pb >> Zn > Cd ca. Ni ≥ Ca. Diese
Aktivität
ist die Grundlage für
die entgiftende Wirkung des Pektins.
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Die
Gal-A-Reste in der Pektinhauptkette sind 1,4-α-verknüpft. Beide Hydroxylgruppen
von D-Gal A an den Kohlenstoffatomen 1 und 4 befinden sich in der
axialen Position. Darum ist die resultierende Verknüpfung trans-1-4. Dieser Typ von
Verknüpfung
führt zu
einer erhöhten
Kettensteifigkeit des Polymers. So sind Pektine mit einem Flexibilitätsparameter
B zwischen 0,072–0,017
starre Moleküle.
Es wurde vorgeschlagen, dass der Einbau von Rhamnoseresten in die
Hauptkette zu einem T-förmigen
Knick in der Hauptkette führt.
Eine Zunahme im Rhamnosegehalt führt
zu biegsameren Molekülen.
Pektine können
als Zickzackpolymer mit langen, starren und glatten Regionen und
biegsamen haarigen Regionen (Rhamnosereich), die als rotierende
Gelenke dienen, betrachtet werden. Der DM hat auch bestimmte Auswirkungen
auf die Kettenflexibilität.
In Lösung
hat sich gezeigt, dass Pektinmoleküle eine rechtshändische
Helix-Struktur einnehmen.
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Pektine
sind bei pH 3–4
am stabilsten. Unterhalb von pH 3 werden die Methoxyl- und Acetylgruppen und
die Neutralzucker-Seitenketten entfernt. Bei erhöhten Temperaturen werden diese
Reaktionen beschleunigt, und die Spaltung der glycosidischen Bindungen
in der Galacturonan-Hauptkette erfolgt. Unter neutralen und alkalischen
Bedingungen werden die Methylestergruppen verseift, und die Polygalacturonan-Hauptkette bricht über die β-Eliminierung-Spaltung
von glycosidischen Bindungen an den nicht reduzierenden Enden der methoxylierten
Galacturonsäurereste
auseinander. Diese Reaktionen laufen mit zunehmender Temperatur auch
schneller ab. Pektinsäuren
und LM-Pektine sind gegenüber
neutralen und alkalischen Bedingungen resistent, da keine oder nur
eine begrenzte Anzahl von Methylestergruppen vorhanden ist.
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Es
gibt viele Enzyme, die die Pektinmoleküle spezifisch modifizieren
und abbauen können.
Diese Enzyme umfassen endo- und exo-Polygalacturonase (EC 3.2.1.15 und EC
3.2.1.67), Pektatlyase (EC 4.2.2.10), Pektinmethylesterase (EC 3.1.1.11),
Pektinacetylesterase und Rhamnogalacturonase. Endo-Polygalacturonase
ist auf die nicht veresterten 1,4-α-verknüpften Gal-A-Reste spezifisch
und erfordert zur Funktion vier nebeneinander liegende nicht veresterte
Gal-A-Reste. Dieses Enzym kann von Pflanzen, Fungi und Bakterien
produziert werden.
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Sowohl
HM- als auch LM-Pektine können
Gele bilden, allerdings durch vollkommen verschiedene Mechanismen.
HM-Pektine bilden die Gele in Gegenwart von hohen Konzentrationen
mitgelöster
Stoffe (Saccharose) bei niedrigem pH. LM-Pektine bilden die Gele
in Gegenwart von Calcium. Zusätzlich
kann das Zuckerrüben-Pektin über Vernetzung
der ferulierten Gruppen Gele bilden.
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Das
Calcium-LM-Pektin-Gelnetzwerk wird durch die Bildung der "egg box"-Verknüpfungszonen aufgebaut, in denen
Ca++-Ionen die Vernetzung der beiden Strecken
von Polygalacturonsäuren
bewirken. In Apfel- und Citrus-Pektin
wurden die Strecken der Polygalacturonsäuren ohne die Rhamnose-Insertion auf eine
Länge von
bis zu 72–100
Resten geschätzt.
Die Zone wird durch den Rhamnoserest in der Hauptkette terminiert.
Das Calcium-LM-Pektingel
ist thermoreversibel. Darum kann das Calcium am Siedepunkt zugesetzt
werden, und die Gelbildung tritt beim Abkühlen ein. Es ist möglich, mit
0,5% Pektin und 30–60
mg/g Ca++ ein festes elastisches Gel zu
erhalten. Ein hoher Pektingehalt mit wenig Calcium ergibt ein elastisches
Gel, wohingegen eine hohe Calciumkonzentration mit möglichst
wenig Pektin zu einem spröden
Gel führt.
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Die
Zugabe von einwertigen Gegenionen verstärkt die Calcium-LM-Pektin-Gelbildung, d.h.
zur Gelbildung ist weniger Calcium erforderlich.
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Die
im Handel erhältlichen
Pektine werden hauptsächlich
aus Apfeltrester oder Orangenschalen unter heißen, sauren Bedingungen und
durch anschließende
alkoholische Fällung
extrahiert. Zuerst werden die Rohmaterialien blanchiert, anschließend zur
Inaktivierung von endogenen Enzymen, die in der Lage sind, Pektine
abzubauen, und zur Entfernung von Pigmenten gewaschen. Ein übliches
Verfahren zur Enzym-Inaktivierung ist die Alkoholbehandlung, d.h.
die Zellwandfasern werden als so genannte Alkohol-unlösliche Reste ("AlR") oder Alkohol-unlösliche Feststoffe
("AlS") präpariert.
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Zur
Isolierung von Pektinen aus pflanzlichen Zellwänden wurden verschiedene Extraktionsbedingungen
eingesetzt. Diese umfassen die Verwendung von Chelatbildnern, wie
EDTA, CDTA, Natriumhexametaphosphat und Ammoniumoxalat, bei pH 3–6,5, heiße verdünnte Säure (HCl,
pH 1,5–3)
und kalte verdünnte Base
(NaOH und Na2CO3;
pH 10). Die Extraktion wird zur Ausbeutenerhöhung oft bei erhöhten Temperaturen (60–100°C) durchgeführt. Im
Handel erhältliche
Citrus- und Apfel-Pektine werden mit heißer verdünnter Säure extrahiert. Da Pektine
bei einem pH von < 3
leicht abgebaut werden, dauert das Extraktionsverfahren üblicherweise
je nach angewandter Temperatur nur kurz. Der pH von 3–6,5, bei
dem die Chelatbildner verwendet werden, liegt unterhalb des für ihre optimale
Chelatbildungswirkung benötigten
pH-Werts, er wird jedoch angewandt, um den Pektinabbau über β-Eliminierung
zu minimieren. Wie die heiße
verdünnte
Säureextraktion
kann die alkalische Extraktion einen ausgiebigen Abbau hervorrufen.
Er wird nur bei 0–4°C durchgeführt, um
den Abbau über β-Eliminierung
möglichst
gering zu halten. Die kalte alkalische Extraktion wird oft als letzte
Stufe einer sequenziellen Extraktion zur Entfernung derjenigen Pektine,
die fest an die Zellwände
gebunden sind, eingesetzt.
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Auch
Enzyme wurden zur Pektinextraktion überprüft. Sie umfassen Arabinase,
Galactanase, Polygalacturonase und Rhamnogalacturonase. Die Polygalacturonase
produzierenden Hefezellen wurden ebenfalls schon direkt zur Pektinextraktion
eingesetzt.
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Die
Merkmale von unter verschiedenen Bedingungen extrahierten Pektinen
können
variieren. Pektine, die bei erhöhten
Temperaturen extrahiert wurden, sind kleiner als diejenigen, die
bei Raumtemperatur erhalten wurden, und reicher an Neutralzuckern.
Die kleinere Größe ist das
Ergebnis des Abbaus unter rigideren Bedingungen. Die Ausbeute ist
allerdings bei erhöhter.
Temperatur viel höher.
Diejenigen Pektine, die mit einem Chelatbildner erhalten wurden,
weisen im Allgemeinen einen höheren
Gal-A-Gehalt auf. Die unter den kalten alkalischen Bedingungen erhaltenen
Pektine weisen im Allgemeinen einen verminderten Gal-A- und einen
höheren
Neutralzuckergehalt auf.
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Industrielle
Pektine, entweder HM oder LM, werden hauptsächlich aus Apfel und Citrus
durch Säure-Extraktion
und alkoholische Fällung
erhalten. LM-Pektine
werden aus den HM-Pektinen durch chemische Entesterung erhalten.
Als Lebensmittelzusatzstoffe besitzen Pektine einen günstigen
regulatorischen Status. Sie werden als Generally Recognized As Safe
("GRAS") in den USA und
als Acceptable Daily Intake ("ADI") in Europa klassifiziert.
Das heißt,
ihre Verwendung wird nur durch die current Good Manufacturing Practice ("cGMP")-Anforderungen eingeschränkt, um
bestimmte Spezifikationen zur erfüllen. Diese Spezifikationen umfassen
einen minimalen Gal-A-Gehalt von 65% (Gew./Gew.).
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HM-Pektin
kann in einen unterschiedlichen Typ von LM-Pektin, d.h. amidiertes
Pektin, umgewandelt werden. Dies wird durch Behandeln von HM-Pektin
mit Ammoniak unter alkalischer Bedingung in alkoholischen Suspensionen
erreicht. Die Methylestergruppen werden durch Amidgruppen ersetzt.
Das amidierte Pektin besitzt in Gegenwart von Calcium im Vergleich
zu regulärem
LM-Pektin ein besseres Gelbildungsvermögen.
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Viele
andere pflanzliche Quellen wurden ebenfalls bereits auf die Pektinproduktion überprüft. Zwei
von ihnen, Zuckerrübenpulpe
und Sonnenblumenblüten,
werden bereits ausgiebig studiert. Beide sind als Rohmaterialien
reichlich vorhanden. Allerdings besitzt Zuckerrüben-Pektin ein schlechtes Gelbildungsvermögen, weitgehend
aufgrund seines hohen Acetylgruppengehalts und seiner geringen Molekülgröße (ca.
5 × 104 Da). Die Sonnenblumenpektine sind von Natur
aus LM und können
mit Chelatbildnern wirksam extrahiert werden. Sie besitzen oft den
Nachteil qualitativ schlechter Rohmaterialien und schlechter Farbqualität (im Allgemeinen hellbraun)
der Pektin-Endprodukte.
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Pektine
aus verschiedenen pflanzlichen Quellen besitzen verschiedene Merkmale.
Im Allgemeinen weisen sämtliche
im Handel erhältliche
Pektine, einschließlich
derjenigen, die eine Weitervearbeitung erfahren haben, als Endprodukt
einen bestimmten Verfärbungsgrad
auf. Die Färbung
reicht von hellgelb/braun (Citrus-Pektin) bis dunkelbraun (Apfel-
und Sonnenblumenpektine). Die Färbung
beruht auf der Kombination zweier Faktoren: natürliche Farbe (Pigmentierung)
der Rohmaterialien und ihr Gehalt an Polyphenolen. Chemisch gesehen
weist Sonnenblumenblüten-Pektin einen sehr
hohen Gal-A-Gehalt auf und ist von Natur aus ein LM-Pektin, wohingegen
Zuckerrüben-Pektin
einen relativ geringen Gal-A-Gehalt und einen sehr hohen Gehalt an
Acetyl- und Ferulasäuregruppen
aufweist. Die Strukturen von Apfel- und Citrus-Pektin sind einander
sehr ähnlich.
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Für die Pektinanalyse
wurde eine Reihe von Techniken entwickelt. Der Gal-A-Gehalt wird durch
das Verfahren unter Verwendung von m-Hydroxyldiphenyl zur Farbbildung bestimmt.
Dieser Test ist einfacher als die bisherigen Tests mit minimaler
Beeinträchtigung
durch Neutralzucker auf. Andere Tests für die Gal-A-Bestimmung wurden
ebenfalls bereits beschrieben. Die Zuckerzusammensetzungen werden
durch GLC oder GC-MS
unter Verwendung von Alditolacetat- oder Trimethylsilylether ("TMS")-Derivatisierung analysiert. Am häufigsten
werden GLC-Verfahren zur Bestimmung des Methylestergehalts angewandt,
die die Verseifung mit Base (0,5 N) und die Messung des Methanols
durch GLC auf einer Poropak-Q-Säule bei
120°C oder
einer Carbowax 1500-Säule
bei 125°C
umfassen. Auch ein Kapillarelektrophoreseverfahren wurde bereits
zur Bestimmung von DE von Pektinen überprüft. Zur Messung der Acetylgruppen
wird ein schneller und empfindlicher kolorimetrischer Test angewandt.
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Die
Größenbestimmung
wird durch verschiedene Mittel erreicht, die Viskosität, HPSEC,
und Gelpermeationschromatographie umfassen. Neuerdings wurde die
Lichtstreuung als exakteres Verfahren vorgeschlagen. Die intrinsische
Viskosität
von Pektinen wird oft unter Verwendung des Ubbelohde-Viskometers
bestimmt. Dies erfolgt aufgrund der elektrolytischen Natur der Pektinmoleküle in Gegenwart
von 0,1–0,15
M NaCl.
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Die
Aufreinigung von Pektinen wird meistens durch Ionenaustauscherchromatographie
und Kupfer(II)-Fällung
erreicht. Für
die Ionenaustauscherchromatographie werden am breitesten die DEAE-Sepharose CL-6B-Matrix
und Acetatpuffer (pH 4,8) eingesetzt. Der Neutralzuckergehalt von
Pektinen wird nach der Reinigung mit diesen Verfahren bestimmt.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft im weiten Sinn eine pektische
Substanz aus Aloe Vera mit einem 3-O-Methylrhamnosegehalt von etwa
0,1 bis etwa 5 Mol-%, die in der Lage ist, in Gegenwart einer Lösung eines
Calciumsalzes ein Gel zu bilden, und gegebenenfalls mindestens eine
der folgenden Eigenschaften aufweist: Methylierungsgrad von weniger
als etwa 50 Mol-%; Rhamnosegehalt von etwa 2 bis etwa 15 Mol-%;
wobei die pektische Substanz aus dem Blatt von Aloe Vera durch Extraktion
erhältlich
ist, wobei die Extraktion mit einem superkritischen Fluid, einem
wasserlöslichen
organischen Lösungsmittel,
einer Säure,
einem Alkali, einem Chelatbildner, einem Bakterium, einem Enzym
oder einer Kombination davon erreicht wird.
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Erfindungsgemäß werden
Pektine aus Gel- und Rindenzellwandfasern von Aloe Vera extrahiert,
isoliert und identifiziert. Die serielle Behandlung von Aloe-Fasern
mit einem Chelatbildner, wie EDTA, bei einem pH von etwa 7 bis etwa
8,5, ist das wirksamste Extraktionsverfahren. Durch eine weitere
Behandlung des Aloe-Pektins mit einem Ionenaustauscherharz werden
die aufgereinigten Aloe-Pektine erhalten. Aloe-Pektine enthalten
Galacturonsäure,
einen ungewöhnlich
hohen Gehalt an Rhamnose, und 3-OMe-Rhamnose.
Zwei Klassen von Aloe-Pektin, die durch die Größe unterschieden werden, werden
erhalten: ein hochmolekulares (HMW)-Pektin, das durch die Raumtemperatur-Extraktion
erzeugt wurde, wohingegen die Extraktion unter Erhitzen ein niedermolekulares
(LMW)-Pektin erzeugte. Aloe-Pektine besitzen von Natur aus einen
geringen Methoxyl-(LM)-Gehalt. Sowohl HMW- als auch LMW-Pektine
sind zur Gelbildung in Gegenwart von Calcium in der Lage. Zusätzlich bilden
Aloe-Pektine, insbesondere das HMW-Pektin, bei niedrigen Temperaturen
Gele auf der Basis einwertiger Kationen, die sich wieder in eine
Lösung
verwadeln, wenn sie auf Raumtemperatur gebracht werden. Das HMW-Aloe-Pektin-Calciumgel
ist ein äußerst wirksames
Verkapselungsmittel, das zur kontrollierten Freisetzung von pharmakologischen
Substanzen, wie Proteine, Antikörper
und Impfstoffe, geeignet ist. Aloe-Pektine bilden eine Matrix für Antigen-Antikörper-Fällungsreaktionen. Andere Aloe-Pektine
bilden eine Speichermatrix für
pharmakologische Substanzen. Aloe-Pektine aus Pulpe weisen eine
schmutzigweiße Pulverfarbe
auf und erzeugten beim Auflösen
in Wasser klare Lösungen.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
eine allgemeine Struktur der Pektine oder pektischen Substanzen,
wobei "HR" für haarige Region
steht, "SR" für glatte
Region steht, "AG" für Arabinogalactan
steht und "RG" für Rhamnogalacturonan steht.
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2 ist
eine schematische Querschnittsdarstellung der Aloe-Vera-Blattstruktur.
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3 zeigt
die strukturellen Komponenten von Aloe-Vera-Pulpe-Mesophyllzellen.
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4 ist
ein Flussdiagramm der sequenziellen Aloe-Pektinextraktion (bei Raumtemperatur
und hoher Temperatur) unter Verwendung von EDTA als Chelatbildner.
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5 zeigt die Verwendung von Aloe-Pektin
als Verkapselungsmittel zur kontrollierten Freisetzung. Die relativen
Mengen des aus den Pektinperlen freigesetzten Enzyms wurden mit
dem Substrat PNPP gemessen:
- (a) spontane Freisetzung
in Wasser in Relation zu den Pektinkonzentrationen, gezeigt mit
APase-Ab-Konjugatperlen;
- (b) spontane Freisetzung in Wasser in Relation zu den Größen der
Aloe-Pektine, gezeigt
mit APase-Ab-Konjugatperlen, hergestellt mit 10 mg/ml Aloe-Pektinen;
und
- (c) Wirkung von pH und NaCl (150 mM) bei der Auslösung der
Freisetzung, gezeigt mit APase-Perlen, hergestellt mit 15 mg/ml
Aloe-Pektin (1,36 × 106 Da). TN, 25 mM Tris und 150 mM NaCl, pH
7,4; Salzlösung, 150
mM NaCl.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
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Aloe
wird seit langem als Arzneipflanze eingesetzt. Sie ist eine succulente
Pflanze, die an das Leben unter ariden und semiariden Bedingungen
angepasst ist. Die Succulenten sind durch ihren Besitz an reichlich vorhandenen
Wasserspeichergeweben gekennzeichnet. Die Aloe-Vera-Blätter bestehen
aus zwei Teilen, der grünen
Rinde und einer klaren Pulpe (d.h. das innere Gel oder das fleischige
innere). Letzteres ist das Wasserspeichergewebe und wird für medizinische
Zwecke sehr breit eingesetzt. Aufgrund seines klaren und schleimigen
Aussehens wird die Pulpe oft als schleimiges Gel bezeichnet, das
weitgehend als homogene Einzeleinheit behandelt wurde.
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Pektine
oder pektische Substanzen aus Aloe Vera und ihre Extraktion wurden
bisher noch nicht ausführlich
beschrieben. Eine an Gal A reiche pektische Substanz wurde bereits
als Pulpe-Polysaccharid-Hauptkomponente
beschrieben. Dieses Polysaccharid mit einem Gal-A-Gehalt von 85% wurde
nach der Heißwasserextraktion
der alkoholischen Niederschläge
aus der klaren Pulpe isoliert. Die Neutralzucker-Zusammensetzungsanalyse, hat Galactose,
Rhamnose, Arabinose und 5 Spurenmengen von Mannose, Glucose und
Xylose nachgewiesen. Diese Feststellung wurde als Ergebnis pflanzlicher
Schwankung innerhalb der Aloe-Vera-Spezies
und der speziellen örtlichen
Bedingungen im Vergleich zu der Tatsache, dass die meisten anderen
Studien Mannose-reiche Polysaccharide als Polysaccharid-Hauptkomponente
in der Aioe-Vera-Pulpe identifizierten, interpretiert. Ein Gal-A-reiches
Polysaccharid wurde durch Heißwasser-
und Ammoniumoxalatextraktion aus ganzen Blattmaterialien, die zuvor
mit siedendem Methanol behandelt worden waren, erhalten. Der Gal-A-Gehalt
wurde auf 55% geschätzt,
bezogen auf Papier- und Gas-Flüssigkeitschromatographie.
Dieses Polysaccharid wurde durch Pektinase abgebaut und daher als
Pektin identifiziert, das wiederum als Hauptpolysaccharid von Aloe
Vera beansprucht wurde. Bei allen oben genannten Studien wurden
keine Verknüpfungsstudien mit
Neutralzuckern und keinerlei ausführliche Charakterisierung von
anderen chemischen und physikalischen Eigenschaften (z.B. Größe, DM,
DAc und Gelbildung) der isolierten Polysaccharide durchgeführt.
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Eine
Ausführungsform
dieser Erfindung ging von der klaren Pulpe oder dem fleischigen
inneren Gel des Aloe-Vera-Blattes aus. Die Isolierung der verschiedenen
Teile des Aloe-Blattes wurde in den U.S.-Patentschriften Nrn. 4,735,935,
4,851,224, 4,917,890, 4,959,214 und 4,966,892 beschrieben, wobei
jeweils der gesamte Inhalt dieser Patente hier durch Bezugnahme
eingeschlossen ist. Das klare Gel enthält große Mesophyll-(Wasserspeicher)-Zellen mit einer
sehr begrenzten Anzahl von degenerierten Zellorganellen, und die grüne Rinde
enthält
viel kleinere Zellen, die reich an Zellorganellen sind, wie Mitochondrien
und Chloroplasten. Es wurde festgestellt, dass die Pulpe nach der
Homogenisierung in zwei Hauptteile, löslich und unlöslich, aufgetrennt
werden konnte. Der lösliche
Teil erwies sich als reich an 1,4-β-verknüpfter Mannose. Der unlösliche Teil
bestand hauptsächlich
aus klaren Zellwänden
oder Zellwandfasern (bezogen auf ihr mikroskopisches Aussehen unter
geringer Vergrößerung nach
der Homogenisierung). Die Zellwandkomponente in den Aloe-Vera-Pulpeextrakten
wurde bisher noch nicht beschrieben. Die Zellwandfasern enthielten
einen hohen Gehalt an Gal A (34% Gew./Gew.), wohingegen der lösliche Teil < 5% (Gew./Gew.)
Gal A enthielt. Diese Daten legen eindeutig nahe, dass diese Zellwandfasern
potentiell reich an Pektin waren. Verifizierungsexperimente zeigten, dass
aus diesen Pulpezellwandfasern eine große Menge an Pektin (bis zu
50% Gew./Gew., mit einem durchschnittlichen Gal-A-Gehalt von > 70% (Gew./Gew.) extrahiert
werden konnte. Eine große
Menge an Pektin, das auch reich ist an Gal A, konnte auch aus den
aus der Rinde isolierten Zellwandfasern extrahiert werden. Diese Pektine
aus Pulpe oder Rindenfasern wurden als Aloe-Pektine bezeichnet.
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Die
Zellwandfasern wurden durch Zentrifugation oder Filtration und anschließend Homogenisierung der
Pulpe oder Rinde isoliert und ohne weitere Behandlung, außer Waschen
in Wasser, direkt zur Pektinextraktion verwendet. Das Aloe-Pektin
konnte aus diesen Fasern unter Anwendung von bereits beschriebenen Verfahren,
d.h. heiße
Säure bei
einem pH von ca. 1,5, kaltes Alkali (NaOH oder Na2CO3), bei einem pH von ca. 10 und Chelatbildner
(EDTA, Natriumhexametaphosphat) bei einem pH von 4,0–6,5 extrahiert
werden. Allerdings wurde festgestellt, dass das wirksamste Extraktionsverfahren,
das die höchste
Ausbeute ergab, in der Verwendung eines Chelatbildners bei einem
pH von über
7 (7–8,5)
bestand. Der verwendete Chelatbildner war EDTA. Die Einzigartigkeit
dieses Extraktionsverfahrens war der höhere pH (7–8,5), der eingesetzt wurde,
da bei allen anderen bisherigen Studien der Chelatbildner immer
bei einem pH von ≤ 6,5
eingesetzt wurde, um den Abbau durch β-Eliminierung möglichst
gering zu halten. Der Grund hinter der Verwendung dieses höheren pH-Wertes liegt darin,
dass Aloe-Pektine natürlicherweise
LM (siehe nachstehend) sind, eine Form von Pektin, die gegenüber der β-Eliminierung
unter alkalischen Bedingungen resistent ist, und dass EDTA am wirksamsten bei
einem pH oberhalb von 7 funktioniert.
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Ein
zweistufiges sequenzielles Extraktionsverfahren maximierte die Verwendung
von Fasern und ergab zwei Typen von Pektin, die sich in Größe, HMW
und LMW unterschieden. Die Fasern wurden zuerst bei RT und anschließend durch
eine weitere Extraktion unter HT (bis zu 80°C) extrahiert. Die RT-Extraktion
erzeugte das HMW-Pektin mit einem mittleren MW von 1,1 × 106 Da, und die HT-Extraktion erzeugte das LMW-Pektin
mit einem mittleren MW von 1,9 × 105 Da. Das MW stand in direkter Korrelation
zu den intrinsischen Viskositäten;
das HMW-Pektin zeigte eine intrinsische Viskosität von × 550 ml/g und bis zu 978 ml/g. MW
und intrinsische Viskosität
von HMW-Aloe-Pektin waren viel höher
als diejenigen der im Handel erhältlichen
Pektine.
-
Das
Aloe-Pektin wies einige distinkte Merkmale in den Zuckerzusammensetzungen
auf. Sie enthielten einen hohen Gehalt an Rhamnose; der Rhamnosegehalt
in den Aloe-Pektinen war mindestens zwei Mal so hoch wie derjenige
in anderen Pektinen, hauptsächlich
Citrus, Apfel, Zuckerrüben
und Sonnenblumen. Rhamnose ist ein Schlüsselzucker in der Pektinhauptkette,
dessen Gehalt die Biegsamkeit des Moleküls beeinflusst. Aloe-Pektine
wiesen auch einen seltenen Zucker auf, 3-OMe-Rhamnose, der bisher
in keinem anderen Pektin beschrieben wurde. Aloe-Pektin wurde als
von Natur aus LM festgestellt, mit einem DM von im Allgemeinen < 30% und oft < 10%. Sie waren
in Gegenwart von Calcium zur Gelbildung in der Lage. Einmaligerweise
konnten Aloe-Pektine, insbesondere die HMW-Pektine, bei niedriger
Temperatur (4°C)
bei einer sehr niedrigen Pektinkonzentration (1 mg/ml) ein reversibles
auf einwertigen Kationen (NaCl)-basierendes Gel bilden. Eine solche Kaltgelierung
wurde bisher für
kein anderes Pektin beschrieben.
-
Die
grünen
Rinden von Aloe-Vera-Blättern
werden im Allgemeinen während
der Herstellung der auf Pulpe basierenden Produkte als Abfall entfernt.
Diese Rinden mit geringen Mengen von ihnen anhaftender Pulpe machen
ca. 60% (Gew./Gew., nass) des ganzen Blattes aus. Es wurde festgestellt,
dass die aus diesen Rinden hergestellten Zellwandfasern eine Aloe-Pektinausbeute
entsprechend denjenigen aus der Pulpe hervorbrachten. Die Aloe-Pektine
aus Rinde waren ebenso reich an Gal A und wiesen die gleichen Eigenschaften wie
die Pulpe auf, d.h. sie sind natürlicherweise
LM, hoch im MW und hoch in der intrinsischen Viskosität (für HMW-Pektine)
und zur Calciumgelbildung sowie zur einwertigen Kationen-basierenden
Gelbildung bei niedriger Temperatur (4°C) in der Lage.
-
Aloe-Pektine
aus den Pulpefasern sind schmutzigweiße Pulver als Endprodukte und
erzeugten im Vergleich zu den gelben bis hellbraunen Pulvern und
den trüben
Lösungen
der derzeit im Handel erhältlichen
und experimentellen Pektine aus Citrus, Apfel, Zuckerrübe und Sonnenblume
klare Lösungen.
Diejenigen aus den Rindenfasern waren hellgrün-bräunliche Pulver und erzeugten
Lösungen,
die trüb
waren, allerdings in geringerem Maße als die besten Citrus-Pektine.
Pulverfarbe und Lösungsklarheit
der Aloe-Pektine aus Rindenfasern konnten durch ein zusätzliches
Spülen
mit Alkohol wesentlich verbessert werden.
-
Zusammengenommen
sind die Aloe-Pektine einzigartige Pektine und könnten von den anderen Pektinen,
d.h. Citrus, Apfel, Zuckerrübe
und Sonnenblume, durch ein oder mehrere der folgenden Merkmale unterschieden
werden:
- 1) hohes Molekulargewicht (> 1 × 106 Da)
und hohes intrinsische Viskosität
(> 550 ml/g).
- 2) hoher Rhamnosegehalt
- 3) sie weisen 3-OMe-Rhamnose auf
- 4) sie sind von Natur aus LM
- 5) sie sind zur Calciumgelbüdung
in der Lage
- 6) sie sind zur einwertigen Kationen-basierenden Gelbüdung bei
niedriger Temperatur (4°C)
in der Lage
- 7) schmutzigweiße
Pulver und klare Lösungen
(Aloe-Pektin aus Pulpe).
-
MATERIALIEN UND METHODEN
-
Materialien
-
Aloe
Vera (Aloe Barberdensis Miller)-Pflanzen (10'')
wurden von H&P
Sales, Inc (Vista, California) über den
Löwe-Einzelhandel
erhalten. Masseacetyliertes Mannan (BAM) ist ein Aloe-Vera-Pulpeextrakt
von Carrington Laboratories, Inc. Verschiedene im Handel erhältliche
Pektine und Polygalacturonsäure
wurden verwendet. Sie umfassen HM-Citrus (P-9561 mit einem DM von
92% und P-9436 mit einem DM von 64%), LM-Citrus (P-9311 mit einem DM
von 28%), Polygalacturonsäure
(P-1879) von Sigma Chemical Co., HM-Citrus (PE100 mit einem DM von
67%) von Spectrum Chemical Co., und HM-Citrus (CU401) und HM-Apfel
(AU201) von Herbstreith-Fox KG. Die folgenden Reagentien wurden
ebenfalls von Sigma Chemical Co. erhalten: Dinatrium-EDTA, Tetranatrium-EDTA,
Endo-Polygalacturonase,
alkalische Phosphatase, alkalische Phosphatase-Antikörper-(IgG)-Konjugat, Folin-Ciocalteu-Reagans,
Imidazol und sämtliche
verwendeten neutralen und sauren Zucker. Das alkalische Phosphatasesubstrat
pNPP wurde von Pierce erhalten. Natriumhexametaphosphat wurde von
Fluka Chemie AG erhalten.
-
Im
Allgemeinen kann BAM aus Aloe Vera-Blättern, wie folgt, hergestellt
werden:
- 1. Die Aloe-Blätter werden gewaschen, aufgeschlitzt
und zur Entfernung der Blattrinde filetiert. Das reine (im Wesentlichen
anthrachinonfrei) innere Gel wird zurückbehalten, während die
grüne Rinde
verworfen wird.
- 2. Das filetierte Material wird homogenisiert (Creparo) und
mit einem Finisher Model 75 (FMC, Chicago, Illinois) ausgiebig filtriert,
um den größten Teil
der Pulpe zu entfernen.
- 3. Das klare viskose Gel wird mit verdünnter HCl auf einen pH von
etwa 3,2 angesäuert.
- 4. Sodann wird das angesäuerte
Gel mit vier Volumina 95% Ethanol bei Umgebungstemperatur extrahiert. Das
Schwebematerial wird entfernt, anschließend wird das Alkohol/Wassergemisch
abgesaugt, während der
feste Niederschlag durch Zentrifugation gesammelt wird. Der größte Teil
der Alkohol/Wasser-löslichen Substanzen,
wie organische Säuren, Oligosaccharide,
Monosaccharide, Anthrachinone und anorganische Salze, wird durch
das alkoholische Extraktionsverfahren entfernt.
- 5. Anschließend
wird der feste Aloe-Vera-Extrakt mit frischem Alkohol gewaschen,
zentrifugiert, gefriergetrocknet und zu einem weißen Pulver
vermahlen.
-
Das
Produkt ist in gefriergetrockneter Form mehrere Jahre bei Raumtemperatur
stabil, sofern es vor zusätzlicher
Feuchtigkeit geschützt
wird. Die ausführlichen
Verfahrensweisen zur Herstellung von im Wesentlichen Anthrachinon-freiem
Aloe-Gel, zur Herstellung von im Wesentlichen Antrachinon-freiem
Aloe-Saft, zur Extraktion aktiver chemischer Substanzen) aus einem
Aloe-Blatt, zur Herstellung von BAM und zur Extraktion aus einem
Aloe-Blatt von im Wesentlichen, nicht abbaubaren lyophilisierten,
geordneten, linearen Mannose-Polymeren wurden bereits in den U.S.-Patentschriften
von Carrington Nrn. 4,735,935, 4,851,224, 4,917,890, 4,957,907,
4,959,214 und 4,966,892, deren gesamter Inhalt jeweils hier durch
Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Die Verwendungen der
Aloe-Produkte wurden bereits in den U.S.-Patentschriften von Carrington
Nrn. 5,106,616, 5,118,673, 5,308,838, 5,409,703, 5,441,943 und 5,443,830
beschrieben, deren gesamter Inhalt hier jeweils durch Bezugnahme
eingeschlossen ist.
-
BEISPIEL 1
-
Licht- und
Elektronenmikroskopie der Blattschnitte
-
Frische
Aloe-Vera-Blätter
wurden mit einem Skalpell in 2–3
mm dicke Stücke
geschnitten. Die Schnitte wurden direkt unter dem Lichtmikroskop
(Olympus BH-2) beobachtet. Zur histologischen Analyse wurden die frischen
Aloe-Vera-Blätter in
10% Formalin in PBS fixiert, und die Schnitte wurden mit Toluidinblau
angefärbt.
-
Die
Protokolle zur Gewebefixierung und Anfärbung für die Elektronenmikroskopie
befolgten das von Trachtenberg (Annuals of Botany, 1984, 53, Ss.
227–236)
Beschriebene. Kurz gesagt, wurden frische Pulpegewebeblöcke bei
Raumtemperatur in 4% Glutaraldehyd in 0,2 M Cacodylat-HCl-Puffer
(pH 7,2) 2 h fixiert, mit anschließender Fixierung für 2 h in
2% Osmiumtetroxid in dem gleichen Puffer. Die Gewebe wurden entwässert und
nach Einbetten in Harz geschnitten. Die Gewebsschnitte wurden mit
Uranylacetat angefärbt
und unter Verwendung eines Zeiss-10C-Elektronenmikroskops überprüft. Die
Lichtmikroskopie der Blattschnitte zeigte, dass die Pulpe (3)
aus großen
klaren Mesophyllzellen bestand, die eine hexagonale Form zeigten
(2). Die Größe dieser
Zellen war sehr groß,
oft mehr als 300 μm
breit. Die Wände
dieser Zellen waren klar und durchscheinend. Die Zellen in der Rinde
(1) waren im Vergleich zu denjenigen in der Pulpe (3)
viel kleiner (2). Die elektronenmikroskopischen Überprüfungen ergaben,
zusätzlich
zu den Zellwänden
(6), ein Flüssiggel
(7), nur die Zellmembranen in der Pulpe zusammen mit einer
sehr beschränkten
Anzahl von degenerierten Zellorganellen (8) (3).
Nuklei, Chloroplasten und weitere Zellorganellen, wie Mitochondrien,
wurden nur in der grünen
Rinde und in dem vaskulären
Bündeln
(2) (2) beobachtet.
-
BEISPIEL 2
-
Lichtmikroskopie der Zellwandfasern
-
BAM
wurde in Wasser bei 2 mg/ml gelöst.
Die Lösungen
wurden bei Raumtemperatur 3 h oder bei 4°C über Nacht gerührt. Anschließend wurden
sie bei niedriger Geschwindigkeit (1000 U/min oder 180 g) 15 min zentrifugiert
(Beckman TJ-6). Das Pellet wurde gesammelt, einmal mit Wasser gewaschen
und getrocknet (Centrivap, Labconco). Das Pelletgewicht wurde nach
dem Trocknen bestimmt. Eine kleine Probe des Pellets wurde unter
dem Lichtmikroskop (Olympus BH-2) überprüft. Die unlöslichen Pelletmaterialien aus
den Pulpeextrakten waren bei geringer Vergrößerung (4×) anscheinend Fasern und bei
stärkerer
Vergrößerung (10× und 40×) klare
durchscheinende Lagen mit einem Aussehen, das demjenigen der oben
beschriebenen klaren Pulpezellwände
entsprach. Mit einer weniger ausgiebigen Homogenisierung behielten
einige dieser Fasern immer noch die ursprünglichen Strukturmerkmale der
Mesophyllzellen bei. Diese Feststellungen zusammen geben an, dass
die unlöslichen
Fasern aus den Pulpemesophyllzellwänden stammten.
-
BEISPIEL 3
-
Extraktion der Aloe-Pektine
-
Herstellung
von Zellwandfasern Zwei Typen von Zellwandfasern wurden verwendet,
Alkohol-behandelt und nicht Alkohol-behandelt. Die Alkohol-behandelten Fasern
wurden aus BAM durch Zentrifugation isoliert. BAM wurde bei 2 mg/ml
in Wasser gelöst.
Anschließend
wurde die Lösung
bei 180 × g
10 min zentrifugiert. Das Pellet, das aus den Zellwandfasern bestand,
wurde geerntet und vor dem Trocknen dreimal mit Wasser gewaschen.
Da mit BAM bereits die alkoholische Fällung durchgeführt wurde,
sind diese Fasern darum den Alkohol-unlöslichen Resten oder Feststoffen
(AlS) ähnlich,
die üblicherweise
zur Extraktion von Pektinen aus anderen Pflanzengeweben hergestellt
werden.
-
Die
nicht Alkohol-behandelten Fasern umfassen die Rohpulpe- und Rindenfasern.
Die Rohpulpefasern waren diejenigen, die durch die Grobfiltration
während
der BAM-Herstellung und anderer auf Pulpebasierender Produkte zurückblieben.
Sie sind die gleichen wie diejenigen, die in BAM vorkommen, mit
der Ausnahme, dass sie größer und
nicht Alkohol-behandelt
sind. Sie wurden mit einem Sieb Nr. 18 (Öffnung 1 mm) unter minimalem
Verlust gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Die grüne Rinde,
die ca. 60% des Nassgewichts des gesamten Blattes ausmachte, wird
vom Hersteller im Allgemeinen als Abfall verworfen. Er enthielt
die eigentliche grüne
Rinde sowie etwas Pulpe, die nach dem Filetieren zurückblieb.
Die Fasern wurden daraus auf ähnliche
Weise wie aus der Pulpe nach der Homogenisierung isoliert. Sie wurden
ausgiebig, mindestens dreimal, mit Wasser gewaschen, anschließend getrocknet
und vor der Verwendung für
die Pektinextraktion bei Raumtemperatur aufbewahrt.
-
Extraktion
Der Chelatbildner EDTA wurde zur Extraktion der Aloe-Pektine aus
den Zellwandfasern verwendet. Die Fasern wurden bei 0,2–2% (Gew./Vol.)
in Wasser suspendiert. Die EDTA-Stammlösung wurde bei 0,5 M und einem
pH von 7,0 oder 8,0 hergestellt und der Fasersuspension zugesetzt.
Die verwendete EDTA-Endkonzentration betrug 25 mM. Der End-pH der Fasersuspensionen
wurde mit NaOH auf die angegebenen Werte eingestellt. Die Extraktion
erfolgte unter Rühren
entweder bei RT oder unter HT oder sequenziell – RT-Extraktion und anschließende HT-Extraktion.
HT wurde bei bis zu 80°C
durchgeführt
und anschließend
vor dem Trennschritt gestoppt. Bei der sequenziellen Extraktion
wurden die verbleibenden Fasern nach der RT-Extraktion in dem gleichen
Volumen Wasser ohne Waschen resuspendiert, und frisches EDTA wurde
in der gleichen Konzentration wie für die RT-Extraktion zugesetzt
(4). Nach der Extraktion wurden die restlichen
Fasern durch Zentrifugation (500 g, 15 min) oder durch Filtrieren
mit einem Sieb Nr. 18 und anschließende Gazeschwamm-Filtration
entfernt. Von den Gazeschwämme
(4 × 4,
8 Lagen) wurden drei Stück
zusammen verwendet und auf einen Scheibenfilterhalter aufgelegt.
Die Schwämme
wurden vor der Verwendung mit Wasser gewaschen. Die Gazeschwammfiltration
war bei der Entfernung von kleinen Faserresten nach der Siebfiltration äußerst wirksam.
Wenn nötig,
wurde der Extrakt zweimal über
das Schwammfilter gegeben. Das Filtrat war im Wesentlichen klar.
Für die
quantitativen Studien bezüglich
der Ausbeuten aus der sequenziellen Extraktion wurden die Fasern
nach dem ersten Extraktionsdurchgang bei RT immer durch Zentrifugation
entfernt. Dem klaren Überstand
oder dem Filtrat wurde Alkohol (Ethanol) bis zu einer Endkonzentration
von 75% (Vol./Vol.) zugesetzt. Die Niederschläge wurden durch Zentrifugation
(500 g, 15 min) oder mit dem Sieb Nr. 18 gesammelt und zweimal mit
75% Alkohol gewaschen. Der Alkohol-Waschschritt war notwendig, um
restliches EDTA zu entfernen. Anschließend wurden die Niederschläge zur Entfernung
von Alkohol gepresst, getrocknet und vor der Verwendung bei RT gelagert.
-
Es
wurde festgestellt, dass die Extraktion der Aloe-Pektine mit dem
Chelatbildner EDTA hochwirksam war. Es konnte eine Ausbeute bis
zu 50% (Gew./Gew.) erhalten werden. Die erhaltenen Pektine besaßen einen mittleren
Galacturonsäuregehalt
von über
70% (Gew./Gew.) (Tabelle 1). Es wurde festgestellt, dass der pH-Wert
auf die Pektinausbeute mit EDTA-Extraktion
eine große
Wirkung (Tabelle 2) besaß.
Eine 5 mg/ml-Fasersuspension
in Wasser besaß einen
pH-Wert von ca. 3,7 (3–4).
Der pH-Wert der
Fasersuspension betrug nach Zugabe von EDTA-Stammlösung, pH
8,0, bis zu einer Endkonzentration von 25 mM 7,7 (7,5–8,0). Ein pH-Wert
von 6,4 (6,3–6,5)
wurde erhalten, wenn eine EDTA-Stammlösung, pH 7,0, verwendet wurde,
um eine Endkonzentration von 25 mM zu ergeben. Der pH-Wert wurde
unter Verwendung eines Natriumacetatpuffers, pH 5,0, bei einer Endkonzentration
von 20 mM, eine für
die Pektinextraktion übliche
Bedingung, erhalten. Es wurde festgestellt, dass nach der RT-Extraktion
bei einem pH von 5,0 bis 7,7 (Tabelle 2) kein größerer Unterschied in der Ausbeute
bestand. Allerdings wurde eine Hauptwirkung des pH-Wertes während der
HT-Extraktion festgestellt. Eine Ausbeutezunahme um > 20% wurde bei einem
pH von 7,7, im Vergleich zu pH 5,0 oder pH 6,4, während der
HT-Extraktion der frischen Fasern verzeichnet (Tabelle 2). Außerdem wurde
eine nahezu zweifache Zunahme in der Ausbeute verzeichnet, wenn
die aus dem ersten Durchgang der RT-Extraktion verbleibenden Fasern
unter HT, wobei frisches EDTA, pH 8,0, zugegeben wurde, im Vergleich
zur Verwendung von EDTA, pH 7,0, extrahiert wurden (Tabelle 2).
Die pH-Werte der Fasersuspensionen veränderten sich am Ende der RT-Extraktion
nicht wesentlich (Tabelle 3). Nach dem Resuspendieren in Wasser
und Zugeben von frischem EDTA war der pH (ca. 8,5) der Suspensionen
tatsächlich
höher als
derjenige der EDTA-Stammlösungen
(pH 8,0) (Tabelle 3). Außerdem
wurde unter Verwendung der frischen Fasern bei der HT-Extraktion
festgestellt, dass die pH-8,5-Extraktion doch eine viel höhere Ausbeute
ergab, mehr als doppelt so hoch wie diejenige bei pH 5,0 und ca.
40% höher
als diejenige bei pH 7,7 (Tabelle 4). Die Erhöhung des pH-Wertes auf 9,0 verbesserte
allerdings die Ausbeute im Vergleich zu pH 8,5 nicht viel weiter
(< 10%). Verifizierungsexperimente zeigten
auch, dass eine wesentliche Zunahme (20%) in der Ausbeute auch mit
einer RT-Extraktion bei pH 8,5 erhalten wurde (Tabelle 4).
-
RT
war während
der Extraktion weniger wirksam als HT. Die Ausbeute zwischen diesen
beiden Bedingungen war ähnlich,
mit der Maßgabe,
dass die RT-Extraktion zeitlich verlängert war. Die Ausbeute durch
die RT-Extraktion
näherte
sich nach ca. 4 h dem Maximum. Eine weitere Ausdehnung der Extraktionsdauer
verbesserte die Ausbeute nicht nennenswert. Die Ausbeute der zweiten
Extraktion mit HT schwankte in Abhängigkeit von der Dauer der
ersten RT-Extraktion; darum war die Ausbeute mit HT höher, wenn
die RT-Extraktion nur 1 h durchgeführt wurde, oder geringer, wenn
die RT-Extraktion 4 h oder länger
durchgeführt
wurde (Tabelle 2).
-
Die
wiederholte Extraktion unter den gleichen Bedingungen brachte eine
schrittweise geringere Ausbeute hervor. Die Ausbeute nahm bei jeder
Extraktion um etwa die Hälfte
ab. Die restlichen Fasern können darum
in der Hälfte
des Volumens aus der vorhergehenden Extraktion suspendiert werden.
-
EDTA
und die Faserkonzentrationen beeinflussten ebenfalls den Extraktionswirkungsgrad.
Wenn 25 mM EDTA mit einer 2 mg/ml Fasersuspension verwendet wurde,
konnte mit einer einzigen Extraktion unter HT eine Ausbeute zwischen
50–60%
erhalten werden. Bei Verwendung einer 5 mg/ml Fasersuspension mit
der gleichen EDTA-Konzentration
nahm die Ausbeute auf ca. 30% ab. Mit der sequenziellen RT-dann-HT-Extraktion,
wie in 4 gezeigt, konnte leicht eine Gesamtausbeute von
40–50%
erhalten werden. Kein Unterschied in der Ausbeute wurde zwischen
Alkohol-behandelten und nicht Alkoholbehandelten Fasern festgestellt.
-
Auch
andere Chelatbildner wurden zur Aloe-Pektin-Extraktion betrachtet.
Ammoniumoxalat wurde nicht verwendet, da es als toxisches Mittel
angesehen wird. Unter Verwendung von Natriumhexametaphosphat wurde
eine beträchtliche
Ausbeute erhalten; allerdings war dieses Mittel aufgrund der Niederschlagsbildung
in alkoholischer Lösung
schwer zu entfernen, und ein Säure
(HCl oder HNO3)-Fällungsschritt war vor der alkoholischen
Wäsche
erforderlich.
-
Auch
andere Bedingungen wurden für
die Aloe-Pektin-Extraktion überprüft. Heiße verdünnte Säurelösungen und
kalte alkalische Lösungen
sind zwei andere für
die Pektin-Extraktion übliche
Bedingungen. Beide von ihnen können
einen ausgedehnten Abbau hervorrufen. Im Handel erhältliche
Pektine aus Citrus und Apfel wurden unter der Bedingung heißer verdünnter Säure extrahiert.
Unter Anwendung dieser Bedingung auf das Aloe-Pektin wurde der pH-Wert
der Fasersuspensionen mit HCl auf 1,5 eingestellt, gefolgt von HT
bis zu 80°C. Die
erhaltene Ausbeute ist im Vergleich zu der Verwendung der EDTA-Extraktion
viel geringer (Tabelle 5). Die Extraktion durch HT in Wasser allein
ergab praktisch keine Alkohol-ausfällbaren Materialien. Renault
und Thibault (Renault und Thibault, Carbohydrate Research, 1993,
244, Ss. 99–114)
berichteten, dass die Extraktion von Apfel- und Zuckerrübenfasern in PBS (pH 6,5) mit
HT (80°C)
eine hohe Ausbeute, entsprechend derjenigen der EDTA-Extraktion,
hervorbrachte. Unter Anwendung dieser Bedingung wurde aus den Aloe-Vera-Pulpefasern
nur eine geringe Ausbeute (Tabelle 5) erhalten. Die kalte alkalische
Extraktion wurde mit 50 mM NaOH oder 50 mM Na2CO3 bei 4°C
durchgeführt.
Der pH-Wert in Suspension
betrug 11,5 mit 50 mM NaOH und 10,5 mit 50 mM Na2CO3. Nach 1 h bei 4°C wurde eine sehr geringe Ausbeute
mit 50 mM Na2CO3 erhalten. Mit
50 mM NaOH wurden keine Alkohol-fällbaren Materialien erhalten.
Wenn die Extraktion 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt wurde,
wurde mit keinem der beiden Reagentien eine Ausbeute erhalten, was
nahe legt, dass die Pektine unter diesen Bedingungen schnell abgebaut
wurden.
-
Zusammengenommen
zeigten diese Ergebnisse, dass die Extraktion mit EDTA bei pH 7,0–8,5 die wirksamste
Extraktionsmethode für
Aloe-Pektin ist. Mit dem in 4 gezeigten
sequenziellen RT-dann-HT-Extraktionsschema konnte eine hohe Ausbeute
(40–50%,
Gew./Gew.) verbunden mit der Herstellung von sowohl HMW- als auch
LMW-Aloe-Pektinen erhalten werden. Die Einzigartigkeit dieses Extraktionsverfahrens
war der höhere
pH-Wert, der eingesetzt
wurde (7,0–8,5).
Der Grund für
diesen höheren
pH-Wert besteht darin, dass die Aloe-Pektine von Natur aus LM (siehe
nachstehend) sind, die gegenüber
der β-Eliminierung
unter alkalischen Bedingungen beständiger sind, und dass EDTA
bei einem pH über
7,0 besonders wirksam funktioniert. Zusätzlich ist EDTA bei einem pH über 7,0
löslicher
und kann darum während
der alkoholischen Fällung
und der Waschschritte leichter entfernt werden.
-
Die
grünen
Rindenfasern brachten im Vergleich zu den Pulpe-Fasern bei Extraktion
mit dem pH-8,0-EDTA eine ähnliche
Ausbeute von Pektin hervor (Tabelle 6). Dieses Rindenpektin war
genauso reich an Gal A (Tabelle 1). Die Menge von aus der Rinde
erhaltenen Fasern war 10 Mal höher
als diejenige aus der Pulpe (pro Einheit von Blättern) (Tabelle 6). Dies steht
im Einklang mit der Tatsache, dass die Rinden, verglichen mit der
Pulpe, aus viel kleineren Zellen bestanden (2 und 3).
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass aus dem Rindenteil
des Blattes, der derzeit von einigen Herstellern als Abfallmaterialien verworfen
wird, eine sehr große
Menge an Aloe-Pektin erhalten werden kann.
-
Zur
Extraktion von LM/HMW-Aloe-Pektinen mit EDTA bei etwa Raumtemperatur
liegt der pH-Arbeitsbereich anscheinend zwischen etwa 5 und etwa
8,5, vorzugsweise etwa 8–8,5.
Zur Extraktion von LM/LMW-Aloe-Pektin
mit EDTA bei erhöhter
Temperatur, beispielsweise bei etwa 80°C, liegen die pH-Arbeitsbereiche
anscheinend zwischen etwa 5 und etwa 8,5, vorzugsweise bei etwa
8,0. Bei einem pH von über
6,5 würde
die EDTA-Extraktion
der HM-Pektine aus anderen Quellen bei erhöhter Temperatur zum Abbau der
Produkte führen.
Zur Extraktion von Pektinen aus anderen pflanzlichen Quellen unter
Verwendung von EDTA oder anderen Chelatbildnern betragen die angegebenen
pH-Bereiche 4–6,5.
-
BEISPIEL 4
-
Pektinreinigung
durch Ionenaustauscherchromatographie
-
Die
Ionenaustauscherchromatographie wurde auf eine Pharmacia Biotech
AKTA Explorer Chromatographiesystem durchgeführt. Die Säule waren drei Pharmacia Hi-trap
Q 5-ml-Patronen, die hintereinander geschaltet waren. Die Aloe-Pektine
wurden in Wasser bei 1 mg/ml gelöst
und bei einer Fließgeschwindigkeit
von 1 ml/min auf die Säule
geladen. Nach Waschen mit 15 ml Wasser wurden die gebundenen Materialien
mit einem linearen Gradienten von NaCl (0–1,0 M) eluiert. Das Säuleneluat
wurde durch UV-Absorption
bei 215, 254 und 280 nm kontrolliert. Die Fraktionen, die Pektin
enthielten, bildeten Niederschläge,
die durch Niedergeschwindigkeitszentrifugation gesammelt, vereinigt
und wieder in Wasser gelöst
wurden. Anschließend
wurden sie durch Aufgeben auf eine Sephadex G-25-Säule entsalzt.
Die Pektin-enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, getrocknet
und bei Raumtemperatur gelagert.
Tabelle
2: die unter verschiedenen Extraktionsbedingungen erhaltene Aloe-Pektin-Ausbeute (%,
Gew./Gew.)
- * Die 5 mg/ml-Rohpulpefasersuspensionen
wurden verwendet. Die Zahlen in Klammern geben den pH-Wert der Fasersuspensionen
nach EDTA-Zugabe
an.
- + RT, Raumtemperatur; HT, Erhitzen.
- # DM, Methylierungsgrad
Tabelle
3: pH-Wert der Fasersuspensionen vor und nach Extraktion mit EDTA - * Die 5 mg/ml-Rohpulpefasersuspensionen
wurden verwendet, die einen pH von 3,5 aufwiesen. RT, Raumtemperatur;
HT, Erhitzen.
Tabelle
4: Weitere Bewertung der Auswirkung des pH-Werts auf die Aloe-Pektin-Ausbeute (%,
Gew./Gew.) mit EDTA-Extraktion - * Die 5 mg/ml-Fasersuspensionen wurden
verwendet.
- + RT, Raumtemperatur; HT, Erhitzen.
- # DM, Methylierungsgrad
Tabelle
5: Aloe-Pektin-Ausbeuten, erhalten mit einer Nicht-EDTA-Extraktion - * Die 5 mg/ml-Rohpulpefasersuspensionen
wurden verwendet.
Tabelle
6: Extraktion von Aloe-Pektin aus grünen Rindenfasern - * Die Fasern wurden bei 5 mg/ml extrahiert,
und die RT-Extraktion wurde 1 h gerührt.
-
BEISPIEL 5
-
Uronsäuretest
-
Der
Uronsäuretest
auf m-Hydroxyldiphenyl-Basis wurde durchgeführt wie von Blumenkranz und
Asboe-Hansen (1973, Analytical Biochemistry 54, Ss. 484–489 beschrieben.
Kurz gesagt, wurden die Proben oder Standards in 200 μl pyrogenfreiem
Wasser mit 1,2 ml konzentrierter H2SO4, die 0,0125 M Natriumtetraborat enthielten,
vermischt und sodann sofort auf Eis gegeben. Die Proben wurden 5
min in siedendem Wasser gehalten und anschließend in einem Wasser-Eisbad
abgekühlt.
Jeder Umsetzung wurden anschließend
20 μl 0,15%
(Gew./Vol.) m-Hydroxyldiphenyl in 0,5% NaOH zugesetzt. Nach dem
Mischen wurden die Proben 30 min bei Raumtemperatur gehalten. Dann
wurde die Extinktion bei 520 nm bestimmt. Gal A wurde zur Erstellung einer
Standardkurve (0, 1, 2, 4, 6, 8 und 10 μg) verwendet. Mannose wurde
als Neutralzucker-Kontrolle verwendet. Sämtliche Proben wurden bei 20 μg oder weniger
getestet.
-
Der
durchschnittliche Gal-A-Gehalt der verschiedenen Aloe-Pektine lag
oberhalb von 70% (Tabelle 1). Es exisiterten keine wesentlichen
Unterschiede zwischen dem Gal-A-Gehalt von unter verschiedenen Bedingungen
extrahierten Pektinen.
-
BEISPIEL 6
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Zuckerzusammensetzung
und Verknüpfungsanalyse
-
Fluorophore-Assisted
Carbohydrate Electrophoresis ("FACE") ist als schnelle
und einfache Technik zur Zuckerzusammensetzungsanalyse bekannt.
Sie erlaubt die anfängliche Überprüfung und
den Vergleich verschiedener Proben und wurde nach dem Verfahren
durchgeführt,
das mit dem FACE-Zuckerzusammensetzungs-Analysekit
(Glyco, Inc.) bereitgestellt wurde. Kurz gesagt wurden die Polysaccharide
mit 2 N Trifluoressigsäure
(TFA) bei 100°C
5 h hydrolysiert und sodann mit einem fluoreszierenden Farbstoff
(AMAC, 2-Aminoacridon) markiert und elektrophoresiert. Die Kohlehydratbanden
wurden unter einem UV-Licht (Fotodyne 3-3000) sichtbar gemacht.
Neben den Neutralzuckerstandards, die in dem Kit bereitgestellt
waren, wurden auch Gal A und Glc A verwendet.
-
Zusammensetzungsanalyse
durch TMS-Derivatisierung
-
Die
Proben wurden in 2 N TFA 6 h bei 105°C einer wässrigen Vorhydrolyse unterzogen.
TFA wurde durch Eindampfen unter Stickstoff entfernt, und mit dem
teilweise hydrolysierten Kohlehydrat-Rückstand wurde eine Methanolyse
in 2 N methanolischer HCl 16 h bei 80°C zur vollständigen Hydrolyse unter Bildung
von Methylglycosiden durchgeführt.
Die methanolische HCl wurde unter Stickstoff entfernt, und mit den
Methylglycosiden wurde eine N-Acetylierung in Methanol-Pyridin-Essigsäureanhydrid
6 h bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Lösungsmittel
wurden eingedampft, und die Rückstände wurden
unter Verwendung von Tri-Sil bei 80°C 20 min trimethylsilyliert.
Die resultierende TMS-Methylglycoside wurden durch GC-MS unter Verwendung einer
30 m DB-5-Kapillarsäule,
ausgestattet mit einem selektiven Massendetektor, analysiert.
-
Verknüpfungsanalyse
-
Es
wurde das Hakomori-Verfahren (Hakomori, Journal of Biochemistry,
1984, 55, Ss. 205–212)
zur Methylierung mit superdeuterierter Reduktion verwendet. Die
Proben wurden in DMSO suspendiert und bei 60°C für 36 h einer Ultrabeschallung
in einem Ultraschallbad unterzogen. Die Proben wurden anschließend unter
Verwendung von Kaliummethylsulfonylcarbanion (3,6 M) methyliert,
und anschließend
wurde ein 50- bis 100-facher Überschuss
von Methyliodid zugesetzt. Das teilweise methylierte Material wurde
durch UmkehrphasenPatronenchromatographie isoliert und einer Carboxylreduktion
unterzogen. Sodann wurden die Proben gereinigt und nach dem Hakomori-Verfahren
der Remethylierung unterzogen. Anschließend wurden die Proben hydrolysiert und
in teilweise methylierte Alditolacetate übergeführt. Die resultierenden PMAA-Derivate wurden
unter Verwendung einer 30 m SP-2300 Kapillarsäule durch GC-MS analysiert.
-
Die
Zuckerzusammensetzungsanalyse unter Verwendung von FACE zeigte,
dass das extrahierte Pektin im Vergleich zu den Zellwandfasern reicher
an Gal A war. Die ausführlichen
Zusammensetzungen wurden mit TMS-Derivatisierung
und GC-MS-Analyse erhalten. In Tabelle 7 sind die Zuckerzusammensetzungen
von drei Proben AP 10679, AP 10679 (gereinigt wie in Beispiel 4
beschrieben) und AP97-1 dargestellt (siehe auch Tabelle 1). Die
Probe AP 10679 wurde durch HT-Extraktion aus Alkohol-behandelten
Fasern, wie in Beispiel 3 beschrieben, erhalten. Probe AP97-1 war
eine Versuchsprobe, extrahiert aus nicht Alkohol-behandelten Rohfasern.
Die Fasern wurden zweimal bei Raumtemperatur und durch eine anschließende HT-Extraktion
extrahiert. Die unter den beiden Extraktionsbedingungen erhaltenen
Pektine wurden vereinigt, und das Verhältnis der bei RT extrahierten
Pektine zu denjenigen der HT-Extraktion betrug ca. 2:1. Tabelle
7. Zuckerzusammensetzungen (%, Mol/Mol) Aloe-Pektine
- * Die Zahl in Klammer ist die Bezugsziffer.
Siehe Liste der Literaturhinweise am Ende von Tabelle 12.
-
Die
Zuckerzusammensetzungsanalyse zeigte, dass Gal A der Hauptzucker
war, 67% in AP 10679 und 63,2% in AP 97-1. Rhamnose und Galactose
sind die am reichlichsten vorhandenen Neutralzucker, die 10 bis 11%
bzw. 8,5 bis 14,8% ausmachen. Unter den kleineren Neutralzuckern
wurde ein modifizierter Zucker, 3-OMe-Rhamnose, nachgewiesen, der
etwa 10% der gesamten Rhamnose ausmachte. Die Zuckerzusammensetzungen
waren zwischen den beiden Proben sehr ähnlich, mit Ausnahme einer
kleinen Menge (< 0,5%) GalNAc
und Glycerin, das in AP 10679 nachgewiesen wurde.
-
Das
gereinigte AP 10679 zeigte einen angereicherten Gal-A-Gehalt und
einen verminderten Neutralzuckergehalt, was nahe legt, dass einige
der in der ungereinigten Probe nachgewiesenen Neutralzucker nicht mit
dem Pektin assoziiert sein können.
Rhamnose und Galactose war immer noch die am reichlichsten vorhandenen
Neutralzucker. Die 3-OMe-Rhamnose war ebenfalls noch vorhanden und
machte wiederum ca. 10% der gesamten Rhamnose aus.
-
Die
Zuckerverknüpfungsdaten
für AP
10679 und AP 97-1 sind in den Tabellen 8 und 9 gezeigt. Die nachgewiesenen
Hauptverknüpfungen
waren 1,4-verknüpftes
Gal A und 1,2-verknüpfte
Rhamnose. Die 1,4-Verknüpfung
für Gal
A ist die Gleiche wie für
die anderen Pektine. Für
Gal A wurde keine andere Verknüpfung
nachgewiesen (Tabellen 8 und 9). Neben der 1,2-Verknüpfung waren die Rhamnosereste
auch 1,2,4-verknüpft,
mit einem kleinen Teil (0,6 oder 0,7%), der 1,2,3-verknüpft war.
Die Rhamnose mit den 1,2- und 1,2,4-Verknüpfungen machte den Hauptteil
der gesamten Rhamnosereste aus, was nahe legt, dass sich der größte Teil
der nachgewiesenen Rhamnosereste in der Pektinhauptkette befindet.
Da die 1,2,4-verknüpfte Rhamnose
in beiden Proben viel häufiger
vorkam als die 1,2,3-verknüpfte,
sind darum die Neutralzucker-Seitenketten am wahrscheinlichsten
mit der Hauptkette in der O-4-Position der Rhamnosereste verknüpft.
-
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-
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-
-
Die
Verknüpfungsexperimente
wiesen auch Glc A nach, die nicht in den Zusammensetzungsexperimenten
nachgewiesen wurde, da ihr Peak durch diejenigen des viel stärkeren Gal-A-Peaks überlagert
wurde (Tabellen 8–9).
Bei anderen Zuckern war Galactose entweder 1,3,4- oder terminal
verknüpft,
wobei ein kleiner Teil 1,3,6- oder 1,4,6-verknüpft war, Arabinose(fur) war
entweder 1,5- oder terminal verknüpft, Arabinose(pyr) war 1,2-verknüpft, Fucose
1,3,4-verknüpft,
Xylose 1,4-verknüpft,
Mannose hauptsächlich
1,4-verknüpft, Glucose
1,4-verknüpft
und Glc A 1,2-verknüpft.
Die 1,4-verknüpfte
Mannose ist in der Verknüpfung
dem Mannan ähnlich,
das in dem Flüssiggel
im Inneren von Pulpe-Mesophyllzellen gefunden wurde. Somit konnte
die Gegenwart von 1,4-verknüpfter
Mannose das Ergebnis eines flüssigen
Restgels sein, das immer noch mit den Mesophyllzellwandfasern assoziiert
war.
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BEISPIEL 7
-
Saure Polysaccharid-Gelelektrophorese
-
Die
Gelelektrophorese zur Auftrennung von sauren Polysacchariden wurde
wie von Misevic (Misevic, Methods in Enzymology, 1989, 179, Ss.
95–110)
beschrieben unter Verwendung des Bio-Rad-Minigelgeräts durchgeführt. Tris-Borsäure (pH
9,0) wurde sowohl als Gel- als auch als Laufpuffer verwendet. Ein
15%iges Polyacrylamidgel wurde als optimal befunden. Die Gele wurden
mit Alcianblau angefärbt
und mit 2% (Vol./Vol.) Essigsäure
entfärbt.
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BEISPIEL 8
-
Enzymabbau von Aloe-Pektin
-
Aloepektin
wurde in 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) gelöst. Endopolygalactunorase (EC3.2.1.15) wurde
in verschiedenen Konzentrationen (0,25–25 mU) zugesetzt. Nach 1 h
Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Proben sofort mit dem Probenpuffer
(pH 9,0) gemischt und durch saure Polysaccharid-Gelelektrophorese
wie vorstehend beschrieben aufgetrennt.
-
Endo-Polygalactunorase
ist auf 1,4-α-verknüpfte Gal-A-Reste
in Pektine spezifisch. Die Ergebnisse zeigten, dass dieses Enzym
Aloe-Pektin dosisabhängig
abbaute, je höher
die Enzymkonzentration desto kleiner die Größe der Pektin-Restmoleküle, wie
durch die schnellere Wanderung in dem Gel gezeigt. Es wurde keine
Wirkung auf Heparin, eine Nichtpektinkontrolle, festgestellt. Dieses
Ergebnis bestätigte
die 1,4-Verknüpfung
zwischen den Gal-A-Resten in Aloe-Pektin und zeigte auch, dass die
Konfiguration dieser Verknüpfung α ist.
-
BEISPIEL 9
-
Acetytierung, Methylierung
und Gesamtphenol
-
Acetylierung und Methylierung
-
Die
Acetylgruppen wurden durch Derivatisierung mit Hydroxylamin·HCl und
Fe(III)/Säure
nachgewiesen. Acetylcholin (0,001–0,0005 N) wurde als Standard
verwendet. Die Proben wurden in verschiedenen Konzentrationen (0,2–0,8 mg/ml)
getestet. Sowohl Proben als auch Standards wurden in 1 ml 0,001
N Acetatpuffer hergestellt und mit 2 ml Hydroxylamin-HCl-Reagens
(2 M Hydroxylamin-HCl, gemischt 1:1 mit 3,5 N NaOH) gemischt. Nach
etwa 1 min wurde 1 ml 4 N HCl zugesetzt. Nach einer weiteren Minute
wurde 1 ml 0,037 Eisen(III)-chlorid (0,1 N HCl) zugesetzt. Nach
dem Mischen wurde die Extinktion bei 540 nm gemessen. Die Menge
an Acetylgruppen in Mol wurde durch Extrapolieren gegen die lineare
Regressionskurve des Standards bestimmt. Der Acetylierungsgrad (DAc)
der Pektine wurde als % (Mol/Mol) von Gal A ausgedrückt.
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Der
Methylierungsgrad (DM) wurde unter Verwendung des selektiven Reduktionsverfahrens,
das von Maness beschrieben wird (Maness, Analytical Biochemistry,
1990, 185, Ss. 346–352),
mit Modifikationen bestimmt. Die Pektinproben wurden in 1 M Imidazol-HCl-Puffer
(pH 7,0) hergestellt. Für
jeden Test wurde 1 mg Probe in 400 μl verwendet. NaBH4 (40
mg) wurde zugesetzt, und die Probe wurde 1 h auf Eis gehalten, um
die Methyl-veresterten Gal-A-Reste selektiv zu reduzieren. Anschließend wurde
zur Entfernung des restlichen NaBH4 0,1
ml Essigsäure
zugesetzt. Die Probe wurde mit 0,5 ml Wasser verdünnt, und
die Pektine wurden mit 4 Volumina 95% Ethanol ausgefällt. Nach
dem Trocknen wurde die Probe in Wasser gelöst, und der Gal-A-Gehalt wurde
wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Kontrolle durchlief die
gleichen Schritte, mit der Ausnahme der Zugabe von NaBH4.
DM wurde durch die folgende Formel bestimmt: DM = [(Mole von Gal
A in der Kontrolle-Mole von Gal A, reduziert)/Mole von Gal A in
der Kontrolle] × 100.
-
Es
wurde festgestellt, dass die alkoholische Fällung und die Trocknungsschritte
weggelassen werden konnten, ohne die Ergebnisse zu beeinflussen.
Somit wurden nach Zugabe von Essigsäure 9,5 ml Wasser zugesetzt,
was eine Pektinkonzentration von 0,1 mg/ml oder 20 μg/200 μl – die obere
Grenze für
den Uronsäuretest – ergab.
-
Bestimmung des Gesamtphenols
-
Das
von Rombouts und Thibault beschriebene Verfahren (Carbohydrate Research,
1986, 282, Ss. 271–284)
wurde verwendet. Die Pektinproben wurden in 0,6 ml Wasser mit 0,6
ml Folin-Ciocalteu-Reagens gemischt. Nach 3 min wurde 0,6 ml 1 M
Natriumcarbonat zugesetzt. Die Gemische wurden 1 h bei Raumtemperatur
belassen, bevor die 750-nm-Extinktionswerte bestimmt wurden. Ferulasäure wurde
als Standard zugesetzt. Nachdem die Pektinproben mit den Reagentien
gemischt waren, bildeten sich einige Niederschläge. Sie waren anscheinend farblos
und wurden durch Zentrifugation bei 3000 U/min 15 min vor der Extinktionsmessung
bei 750 nm entfernt.
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Methylierung, Acetylierung
und Gesamtphenol
-
Die
mit der selektiven Reduktionsmethode erhaltenen Ergebnisse zeigten,
dass Aloe-Pektine einen DM unter 40% und oft < 10% aufwiesen (Tabelle 1). Die DM
von 2 Pektinproben (Citrus LM und Citrus HM) von Sigma Chemical
Co. wurden durch dieses Verfahren als 24% (±3,5) und 58% (±3,5) bestimmt,
was mit den Werten (28% bzw. 64%) im Einklang stand, die von der
Lieferfirma bereitgestellt wurden.
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Es
wurde festgestellt, dass Aloe-Pektine, die durch RT-Extraktion erhalten
wurden, einen DM aufwiesen, der im Vergleich zu denjenigen, die
durch HT-Extraktion
erhalten wurden, um 5–10%
niedriger war (Tabelle 1). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass
die RT-Extraktion bei pH 7,7 Pektin mit einem im Vergleich zu demjenigen
durch RT-Extraktion bei pH 5,0 oder 6,4 einen um ca. 10% niedrigeren
DM erzeugte (Tabelle 2). Diese letztere Feststellung stand anscheinend
mit der Tatsache im Einklang, dass ein zunehmender pH bei RT die
Demethylierungsreaktion gegenüber
der β-Eliminierung
begünstigt.
Es wurde kein Unterschied festgestellt, wenn die HT-Extraktion bei
verschiedenen pH-Werten (5,0 bis 8,5) durchgeführt wurde (Tabelle 4).
-
Das
Rindenpektin war ebenfalls LM (Tabelle 1). In der Tat zeigten sie
durchgehend einen DM unter 10% (Tabellen 1 und 4). Dies legt nahe,
dass die Rindenpektine natürlicherweise
einen noch niedrigeren DM im Vergleich zu denjenigen der Pulpepektine
aufweisen können.
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Die
Acetylierung wurde mit einem chemischen Verfahren, wie vorstehend
beschrieben, nachgewiesen. AP 10679 und AP 97-1 zeigte einen DAc
von 9,0% bzw. 9,1%, allerdings wurde der DAc von gereinigtem AP
10679 als < 2,8%
festgestellt. Dies legt nahe, dass das Aloe-Pektin ebenfalls einen
geringen Acetylierungsgrad besaß (Tabelle
7).
-
Aloepektine
besaßen
eine sehr geringe Menge an Phenolen (0 bis 0,22%, Gew./Gew.)(Tabelle
1).
-
BEISPIEL 10
-
Molekulargewichtsbestimmung
durch Größenausschlusschromatographie
(SEC)
-
Die
SEC wurde unter Verwendung von einer TSK-Gel G5000 PWXL-Säule (Toso
Haas) durchgeführt. Die
Proben wurden bei 0,3 mg/ml in Wasser mit 0,05% (Gew./Vol.) Natriumacid
hergestellt. 50 μl
der Probe wurden injiziert und mit 0,05% Natriumacid bei 1 ml/min
eluiert. Der Brechungsindex wurde on line gemessen. Pullulane (4,04 × 105, 7,88 × 105 und 1,66 × 105 Da)
wurden als Standards verwendet. Das Molekulargewicht wurde gegen
die lineare Regressionskurve der Standards berechnet.
-
Die
Aloe-Pektine zeigten im Allgemeinen nur einen Hauptpeak. Dies steht
mit der Feststellung über andere
Pektine im Einklang. Aloe-Pektine, die durch RT-Extraktion erhalten
wurden, besaßen
ein mittleres Molekulargewicht von 1,1 × 106 (0,785
bis 1,36 × 106 Da), das ca. 5 Mal größer war als die mittlere Größe 1,9×105 (0,375–6,08 × 105 Da) der durch HT-Extraktion erhaltenen.
Die mit HT aus den Restfasern der RT-Extraktion extrahierten Pektine
besaßen
eine ähnliche
Molekülgröße wie diejenigen,
die mit HT aus frischen Fasern extrahiert wurden.
-
Die
Größe der Pektine
wurde ebenfalls durch saure Polysaccharid-Gelelektrophorese analysiert. Die aus
der Gelelektrophorese erhaltenen Profile standen mit den durch Größenausschlusschromatographie
erhaltenen Ergebnissen im Einklang, d.h. die Größe der durch RT-Extraktion
erhaltenen Pektine waren viel größer (wanderten
viel langsamer im Gel) als diejenige der HT-Extraktion. Unter Verwendung
dieser Technik wurde auch festgestellt, dass mit HT bei niedrigem
pH (5,0) extrahierte Pektine eine mit denjenigen vergleichbare Größe aufwiesen,
die durch RT-Extraktion erhalten wurden. Dies legt nahe, dass der
pH der besonders wichtige Faktor bei der Bestimmung der Größe der erhaltenen
Pektine ist, obwohl das Erhitzen ebenfalls wichtig ist. Diese Feststellungen
stehen im Einklang mit den allgemeinen Eigenschaften der Pektine,
d.h. sie sind bei niedrigem pH (3–4) und niedriger Temperatur
am stabilsten.
-
Zusammen
werden die durch RT-Extraktion oder HT-Extraktion bei niedrigem
pH (5,0) erhaltenen Pektine als hochmolekulare (HMW) Pektine und
diejenigen, die durch HT-Extraktion bei pH 7,0 oder darüber erhalten
wurden, werden als niedermolekulare (LMW) Pektine klassifiziert.
Somit können
leicht 2 Klassen von Pektinen, die durch die Größe unterschieden werden, durch
Veränderung
der Extraktionstemperatur erhalten werden. Dies konnte am Besten
durch das folgende in 4 ausgeführte sequentielle Extraktionsschema
erreicht werden.
-
Die
mittlere Größe von HWM-Aloe-Pektinen
(1,1 × 106 Da) ist viel größer als diejenige von handelsüblichen
Pektinen (0,7–1,4 × 105 Da), was derjenigen von LM-Aloepektinen
nahe kommt. Zur Bestätigung
dieses Größenunterschiedes
wurden 3 handelsübliche
Citrus-Pektinproben, eine LM (P-9311, Charge 74H1092; Sigma Chemical
Co.) und zwei HM (P-9436, Charge 96H0788; Sigma Chemical Co. und
PE100, Charge JR071, Spectrum Chemical Co.) unter den gleichen Bedingungen
durch SEC analysiert. Ihre Größen reichten
von 2,0–4,6 × 105 Da, was viel niedriger war als diejenigen
der HMW-Aloe-Pektine. Die Größe der Citrus-Pektine ist
in der Regel größer als
diejenigen von Apfel-Pektinen (Pilnik und Voragen, Advances in Plant
Biochemistry and Biotechnology, 1992, 99, Ss. 219–270).
-
BEISPIEL 11
-
Viskosität
-
Die
intrinsischen Viskositäten
wurden unter Verwendung des Ubbelhode-Viskometers (Nr. 2) bestimmt. Die Pektine
wurden in 0,1 M NaCl bei einer Konzentration von 0,005–0,2% (Gew./Vol.)
bestimmt (Owens, Journal of the American Chemical Society, 1946,
68, Ss. 1628–1632;
Axelos, International Journal of Biological Macromolecules, 1989,
11, Ss. 186–191).
Die intrinsische Viskosität
(η) wurde
unter Verwendung der doppelten Huggins (ηsp/c
= η + k1η2c) und Kraemer ((Inηrel]/c
= η + k''η2c)-Extrapolation (auf die Konzentration
0) (Axelos und Thibault, International Journal of Biological Macromolecules,
1989, 11, Ss. 186–191;
Doublier und Cuvelier, Carbohydrates in Food, Hrsg. A. C. Eliasson,
Marcel Dekker, New York, 1996, Ss. 283–318) berechnet. Die Mittelwerte
der mit diesen beiden Gleichungen erhaltenen Zahlen sind in Tabelle
13 im Vergleich mit MW dargestellt.
-
Die
höchste
intrinsische Viskosität
(978 ml/g) wurde mit einem Rindenpektin, das durch RT-Extraktion erhalten
wurde, festgestellt. Die intrinsischen Viskositäten von HMW-Aloepektinen waren
im Allgemeinen höher
als diejenigen von LMW-Pektinen. Die intrinsischen Viskositäten von
HMW-Aloepektinen
waren ebenfalls im Allgemeinen höher
als diejenigen der handelsüblichen
Citrus- und Apfel-Pektine, die hier getestet wurden. Dies steht
ebenfalls im Einklang mit den unterschiedlichen Molekulargewichten
von HMW-Aloepektinen und handelsüblichen
Pektinen. Tabelle
13. Intrinsische Viskositäten
von Aloe-Pektinen
-
BEISPIEL 12
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Calciumgelbildung
-
Aloepektine
in verschiedenen Konzentrationen in Wasser wurden mit Calciumchloridlösung bei
verschiedenen Konzentrationen zusammen mit handelsüblichen
LM- und HM-Pektinen gemischt. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur
für bis
zu 24 h wurden die Röhrchen
umgekehrt. Wenn die Probe unschwer floss, wurde davon ausgegangen,
dass keine Gelbildung eingetreten ist. Wenn die Probe nicht floss
oder sich nicht unter ihrem Eigengewicht verformte, war die Gelbildung
eingetreten. Wenn die Probe nicht floss sondern sich verformte (d.h.
die Oberfläche
hielt keine gerade Linie senkrecht zu der Seite des Röhrchens,
wenn die Röhrchen
in horizontaler Position gehalten wurden) wurde das System als weiches
Gel angesehen. Die Ergebnisse zeigten, dass Aloe-Pektin, das entweder
durch RT- oder HT-Extraktion aus entweder Pulpe- oder Rindenfasern erhalten
worden war, in Gegenwart von Calcium feste Gele bildete, ebenso
wie das LM-Citrus-Pektin und die Polygalacturonsäure (Tabelle 14). Unter den
gleichen Bedingungen bildete HM-Citrus-Pektin keine Gele. Dies steht
mit der Tatsache im Einklang, dass das Aloe-Pektin ein LM-Pektin
ist. Pektine aus Citrus und Apfel sind natürlicherweise HM-Pektine. LM-Pektine
werden durch Demethylierung der HM-Pektine erhalten. Da während der
Extraktion der Aloe-Pektine, insbesondere mit der RT-Extraktion,
keine rigiden Bedingungen angewandt wurden, ist das Aloe-Pektin
ein natürliches
LM-Pektin.
-
Mit
einer 0,2% Aloe-Pektinlösung
wurde die minimale erforderliche Konzentration an Calciumchlorid zur
Gelbildung als 1–2
mM (50–100
mg CaCl2/g Pektin) bestimmt. Mit zunehmenden
Konzentrationen von Pektin und/oder Calciumchlorid wurden die Gele
nach und nach fester. Es wurde festgestellt, dass die HMW-Aloepektine
insofern schneller Gele bildeten als LMW-Aloepektine, als sie weniger
Zeit zur Gelbildung benötigten und
das Gel fester erschien.
-
Die
Zunahme der Ionenstärke
erleichterte die Calciumgelbildung. Die Geschwindigkeit der Gelbildung erhöhte sich
nach und nach mit zunehmenden NaCl-Konzentrationen (0–0,2 M)
nach Zugabe einer feststehenden Menge an Calciumchlorid.
-
BEISPIEL 13
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Einwertige
Kationen-basierende Gelbildung
-
Aloepektine
wurden in Wasser bei verschiedenen Konzentrationen gelöst. Die
Pektinlösungen
wurden bei RT mit gleichen Volumina 0,3 M NaCl (2 Salzlösung), 0,3
M NaCl und 40 mM Natriumacetat (pH 5,0) oder 2 × PBS (pH 7,4) gemischt. Die
Endvolumina waren 1 oder 2 ml. Die Röhrchen (12 × 75 mm) wurden sodann bei
4°C in einen
Kühlschrank
oder auf Eis (0°C)
verbracht. Die Gelbildung wurde wie in Beispiel 12 beschrieben bewertet.
Die Röhrchen
wurden anschließend
wieder auf RT gebracht, um zu bestimmen, ob sich das Gel wieder
in eine Lösung
verwandelte. Verschiedene NaCl-Konzentrationen
(0,05–1
M) wurden für
die Gelbildung getestet. Das Kaliumsalz (KCl) wurde ebenfalls getestet.
Die Salz- und Pektinlösungen
waren immer in den gleichen Volumina (1:1) gemischt. Zur Bestimmung
der Auswirkung von Endo-Polygalacturonase auf die Gelbildung wurde
den Pektinlösungen
pH-5,0-Acetatpuffer bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt.
Anschließend
wurde das Enzym in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Nach
Stehen bei Raumtemperatur für
30 min wurden die Lösungen
mit gleichen Volumina von 0,3 M NaCl gemischt und anschließend auf Eis
verbracht. Die Gelbildung wurde wie vorstehend überprüft.
-
Wurde
eine Aloe-Pektinlösung
in 0,15 M NaCl (physiologische Salzlösung) auf 4°C abgekühlt, wurde ein Gel erhalten.
Das Gel war fest und frei stehend, wenn es wie das Calciumgel sofort
bei 4°C
gehalten wurde. Es verwandelte sich schnell wieder in eine Lösung, wenn
es auf RT (22°C)
gebracht wurde. Dieser reversible Lösung-Gel-Übergang konnte durch Änderung
der Temperatur viele Male wiederholt werden.
-
Im
Gegensatz zur Gelbildung in Gegenwart von Calcium, die wirksam sowohl
mit HMW- als auch LMW-Aloepektinen eintrat, trat die einwertige
Kationenbasierende Gelbildung nur wirksam mit HMW-Aloepektinen auf,
die entweder aus Pulpe- oder Rindenfasern erhalten wurden. Die Probe
AP 97-1 und ähnliche,
die Molekulargewichte von > 1 × 106 Da aufwiesen, konnten feste Gele bei Konzentrationen
von so niedrig wie 1 mg/ml in Gegenwart von 0,15 M NaCl erzeugen.
Solche Gele waren auch klar, wenn die Pektinkonzentrationen 5 mg/ml
oder weniger betrugen. Mit höheren
Pektinkonzentrationen (> 5
mg/ml) waren die Gele fester und etwas trübe. Mit einem 1-ml-Volumen
konnte sich in ca. 15 min nach Verbringen des Röhrchens auf Eis ein Gel bilden,
und es wurde in etwa der gleichen Zeit wieder zur Lösung, nachdem
es wieder auf RT gebracht wurde. Das Gel verwandelte sich allerdings
bei einer Temperatur von so hoch wie 15°C nicht wieder in eine Lösung. Das
Gel konnte sich bei pH 5,0 (in Salzlösung mit 20 mM pH 5,0 Natriumacetat)
sowie pH 7,4 (in PBS) bilden.
-
Die
LMW (0,375–6,08 ×105 Da)-Aloe-Pektine bildeten solche nur Gele
bei höheren
Konzentrationen (≥ 5
mg/ml). Bei 1 mg/ml konnten nur weiche Gele mit einigen der LMW-Proben
in 0,15 M NaCl erhalten werden. Die kleinste Aloe-Pektinprobe (0,375 × 105 Da) bildete bei 1 mg/ml in 15 M NaCl kein
Gel. Nur mit dieser Probe wurde bei einer Pektinkonzentration von
10 mg/ml in 0,2 M NaCl ein weiches Gel erhalten. Dies legt nahe,
dass die Wirksamkeit der einwertigen Kationen-basierenden Gelbildung
von der Größe der Pektinmoleküle abhängt. Wie
in Beispiel 8 gezeigt, konnte Aloe-Pektin durch Endo-Polygalacturonase
abgebaut werden. Somit wurden 300 μl 2 mg/ml AP 97-1 Pektinlösung in
20 mM pH 5 Natriumacetat mit diesem Enzym bei verschiedenen Konzentrationen
vor dem Mischen mit einem gleichen Volumen von 0,3 M NaCl abgebaut
und auf Eis verbracht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kontrolle
(kein Enzym zugesetzt) ein Gel bildete und die Probe mit der höchsten Enzymkonzentration
eine Lösung
blieb (Tabelle 15). Zwischen der Kontrolle und der höchsten Enzymkonzentration
war der Übergang
von der Lösung
zum Gel offensichtlich, d.h. das Gel wurde weicher mit einer Zunahme
in der Enzymkonzentration, bis bei der höchsten Enzymkonzentration eine
vollständige
Lösung erhalten
wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Größe der Aloe-Pektinmoleküle ein bedeutender
Faktor bei der einwertigen Kationen-basierenden Gelbildung ist.
-
Die
Gelbildung war auch von der NaCl-Konzentration abhängig. In
0,1 M NaCl wurden nur weiche Gele mit Proben wie AP 97-1 erhalten.
Die festen Gele bildeten sich nur in 0,15 M und 0,2 M NaCl, wohingegen
das Gel, das sich bei 0,15 M NaCl bildete, vollständig reversibel
war, wenn das Gel wieder auf RT gebracht wurde, das bei 0,2 M NaCl
gebildete Gel war, insbesondere für die HMW-Aloepektine, nicht
leicht reversibel. Nach Stehen bei Raumtemperatur für 1 h oder
länger
traten bei dem mit 0,2 M NaCl gebildeten Gel oft Syneresen auf,
d.h. die Flüssigkeit
trennte sich vom Gel. Mit höheren
NaCl-Konzentrationen (≥ 0,4
M) bildeten sich bei RT Niederschläge. Die Niederschläge waren
bei hohen NaCl-Konzentrationen (0,6–1 M) weiß und amorph und waren bei
0,4 M NaCl anscheinend feine Körnchen.
-
Eine
solche Kaltgelierung ist auch gegenüber der Spezies von verwendeten
einwertigen Kationen empfindlich. Mit KCl (0,05–1 M) trat keine Kaltgelierung
auf, obwohl sich bei höheren
KCl-Konzentrationen (≥ 0,4
M) bei RT Niederschläge
bildeten.
-
Die
Fällung
von Pektinen bei hohen Salzkonzentrationen wurde bereits beobachtet.
Allerdings wurde ein solche reversible einwertige Kationen (NaCl)-basierende
Kaltgelierung unter physiologischer Bedingung (0,15 N NaCl, pH 7,4)
bisher noch nicht mit anderen Pektinen beschrieben. Bis jetzt wurde
mit keinen anderen Polymeren oder Substanzen aus der Literatur ein
derartiges Gelbildungssystem identifiziert. Unter Verwendung von
handelsüblicher
Polygalacturonsäure,
LM- und HM-Pektinen wurde keine derartige einwertige Kaltgelierung
erhalten.
-
BEISPIEL 14
-
Verwendung
von Aloe-Pektin als Verkapselungsmittel zur kontrollierten Freisetzung
-
Das
APase-und-APase-Antikörper(APase-Ab)-Konjugat
wurde zur Verkapselung verwendet. Sie wurden gewählt, da die relative Aktivität direkt
unter Verwendung des APase-Substrat pNPP gemessen werden kann. Aloe-Pektine bei 10 oder
15 mg/ml in Wasser wurden mit APase oder APase-Ab bei einer Endkonzentration
von 10 bis 20 μg/ml
gemischt. Das Gemisch bei RT wurde während etwa 30 min in ein 200
mM CaCl2-Bad getropft, um Perlen, ca. 1
mm Durchmesser, herzustellen. Die durch Abdekantieren isolierten
Perlen wurden gewaschen und in Wasser bei 4°C gehalten. Zuerst wurde in
Relation zur Pektinkonzentration und der Größe von Pektinmolekülen eine
spontane Freisetzung überprüft. Für die Freisetzungsexperimente
wurde die gleiche Anzahl von Perlen (3–5) bei Raumtemperatur in 100
ml Wasser, Salzlösung
(150 mM NaCl), TN-Puffer oder Puffer ohne NaCl bei verschiedenen
pH-Werten 2 h inkubiert. Der pH von 3–5 wurde mit 10 mM Natriumacetatpuffer
erreicht, und der pH von 6–8
wurde mit Tris-Puffer erreicht. Am Ende der Inkubation wurden 10 μl des Inkubationsmediums
entnommen und mit 100 μl
des APase-Substrats (pNPP) vermischt. Nach 15 min wurde die Umsetzung
mit 50 μl
2 M NaOH gestoppt, und die Extinktion bei 405 nm wurde gemessen.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass eine Pektinkonzentration von über 10 mg/ml
die spontane Freisetzung wirksam hemmen konnte und größere Pektine
das Ziel-Mittel wirksamer einschließen (5a und 5b). Anschließend wurden
die Bedingungen zur Auslösung
der Freisetzung überprüft. Es wurde
festgestellt, dass die eingeschlossenen Enzyme nur in Salzlösung (150
mM NaCl) oder bei einem pH von 7,0 oder darüber (5c) freigesetzt
wurden. Die Kombination dieser beiden Bedingungen, wie durch TN-Puffer
(25 mM Tris 150 mM NaCl, pH 7,4) dargestellt, ergab die wirksamste
Freisetzung (5c).
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Obwohl
die Proteinmoleküle,
die bei den vorliegenden Experimenten eingesetzt wurden, groß sind (APase,
140 kDa; APase-IgG, ca. 350 kDa), zeigen diese Ergebnisse eindeutig,
dass in dem Aloe-Pektin-Calciumgel ein durch die Salzkonzentration
und den pH kontrollierter Freisetzungsmechanismus besteht. Somit sollte
die physiologische Bedingung (150 mM NaCl und pH 7,0–7,4) die
Freisetzung sofort starten, wenn die Perlen in vivo abgegeben werden,
wohingegen unter den Aufbewahrungsbedingungen keine oder nur eine
minimale Freisetzung eintritt. Dieses Aloe-Pektin- Calciumgel-Verkapselungssystem
sollte für
Proteinmoleküle, wie
Antikörper
und Impfstoffe, geeignet sein.
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Tabelle
14. Gelbildung und Methylierungsgrad (DM) von Aloe-Pektin
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Tabelle
15. Wirkung von Endo-Polygalactoronase auf die Kaltgelierung von
Aloe-Pektin in Gegenwart von einwertigen Kationen (NaCl)
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BEISPIEL 15
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Verwendung
eines Pektingels auf der Basis einwertiger Kationen als neue Matrix
für eine
Antigen-und-Antikörperfällungsreaktion
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Der
Fällungstest
ist ein übliches
Diagnoseverfahren zum Nachweis von pathogen spezifischen Antigenen
oder Antikörpern.
Er umfasst das sorgfältige Überschichten
der Antikörperlösung mit
der Antigenlösung oder
umgekehrt. Der Überschichtungsschritt
ist wichtig, und es muss darauf geachtet verwendet werden, dass es
zwischen den zwei Lösungen
nicht zu Verwirbelungen kommt. Die Bildung einer weißen Niederschlagslinie zwischen
den zwei Lösungen
als Ergebnis von Diffusion zeigt ein positives Ergebnis an. Alternativ
wird dieser Test in Agar durchgeführt, der als Agar-Diffusionstest bezeichnet
wird. Dieser Test umfasst die Herstellung von Agar und dauert länger um
Ergebnisse zu sehen.
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Die
Fähigkeit
von HMW-Aloe-Pektin zur Bildung eines Gels in PBS bei 4°C stellt
eine Gelegenheit zur Entwicklung eines neuen, einfacheren Tests
bereit. Eine Lösung
wird im festen Zustand bei 4°C
gehalten, so dass eine andere Lösung
leicht und zusammenhängend
darüber
geschichtet werden kann. Wenn das Gel wieder auf Raumtemperatur
gebracht wird, geht es wieder in eine nicht viskose Lösung über und
erlaubt den Eintritt der Diffusion.
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Um
diese potentielle Anwendung zu testen, wurden Maus-IgG (Antigen)
und Anti-Maus-IgG-Antikörper
(Antikörper)
verwendet. 10 μl
des Antigens bei verschiedenen Konzentrationen wurden mit 0,4 ml
1 mg/ml AP 97-1 in PBS vermischt. Sodann wurden die Teströhrchen auf
Eis gehalten, und wenn sich ein Gel bildete, wurden 200 μl der Antikörperlösung in
PBS direkt auf das Gel gegeben. Dann wurden die Teströhrchen wieder auf
Raumtemperatur gebracht. Nach 30 min trat zwischen den beiden Lösungen eine
Fällungslinie
auf. Wenn der Antikörperlösung das
Antigen mit oder ohne Pektin bei Raumtemperatur zugesetzt wurde,
wurde keine oder nur diffuse Fällungslinien
festgestellt. Dies legt nahe, dass unter Verwendung des Aloe-Pektingels als Matrix
ein solcher Antigen-und-Antikörperfällungstest
nicht nur vereinfacht, sondern auch seine Empfindlichkeit verstärkt werden
kann.
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BEISPIEL 16
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Extraktion
durch superkritisches Fluid
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Die
Zellwandfasern (wie in Beispiel 3 erhalten) werden in die superkritische
Fluid(SF)-Extraktionszelle gepackt, die dann versiegelt wird. Der
SF-Generator wird
eingeschaltet, und nach Erreichen der gewünschten Bedingungen von Temperatur
und Druck wird SF in die Extraktionszelle mit der entsprechenden
Fließgeschwindigkeit
gepumpt. Das pektinreiche austretende Fluid wird in der Dekompressionskammer
abkühlen
gelassen. Anschließend
wird das abgekühlte
Fluid zur Isolierung des Pektins behandelt. Ein Isolierungsverfahren besteht
im Ausfällen
des Pektins durch Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels,
vorzugsweise Ethanol, zu dem Fluid oder zu dem teilweise verdampften
Fluid. Das ausgefällte
Material wird anschließend
durch Filtration oder Zentrifugation abgetrennt und getrocknet.
Das Pektin kann auch von dem Fluid durch Entfernung des Fluids über Gefriertrocknen
oder Verdampfen abgetrennt werden. Das für die SF-Extraktion zu verwendende
Fluid kann Wasser oder eine wässrige
Lösung
sein, die eine Säure
oder eine Base oder ein Puffersalz oder einen wasserlöslichen
organischen Modifizierer oder eine beliebige Kombination der zuvor genannten
Hilfsstoffe enthält.
Das Verfahren kann bei Temperaturen zwischen etwa 300 und etwa 800°C und bei
Drücken
zwischen etwa 200 atm. und etwa 1000 atm. betrieben werden.
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BEISPIEL 17
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Extraktion
von Aloe-Pektinen mit Enzymen
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Zellwandfasern
werden mit Wasser gewaschen und in einem Puffer bei einer entsprechenden
Konzentration suspendiert, bei der sich die maximale Aktivität des Enzyms
(der Enzyme) anwenden lässt.
Die Enzyme, die verwendet werden können, umfassen Endo-Arabinase,
Endo-Galactanase und Rhamnogalacturonase. Die Endo-Polygalacturonase,
obgleich für
die von Natur aus HM-Pektine brauchbar, ist für Aloe-Pektin nicht geeignet,
da es natürlicherweise
LM ist. Das Enzym wird dann zugesetzt. Die Fasersuspension wird
für eine bestimmte
Zeitdauer (1–24
h) bei 20–37°C gehalten.
Die zurückbleibenden
Fasern werden durch Filtration entfernt. Die Pektine werden mit
Alkohol ausgefällt
und getrocknet.
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BEISPIEL 18
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Extraktion
von Aloe-Pektinen mit Mikroben
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Zellwandfasern
werden mit Wasser gewaschen und in Wasser bei einer entsprechenden
Konzentration suspendiert. Mikroben, entweder Bakterien oder Fungi,
die Enzyme produzieren, die in der Lage sind, Pektine aus Zellwänden freizusetzen,
werden der Fasersuspension zugesetzt. Bacillus subtilis ist ein
Beispiel für ein
solches Bakterium. Die erzeugten Enzyme umfassen Endo-Arabinase,
Endo-Galactanase, Endo-Polygalactorunase und/oder Rhamnogalacturonase.
Die Mikroben, die hauptsächlich
Endo-Polygalacturonase
produzieren, werden vermieden, da das Aloe-Pektin von Natur aus
ein LM-Pektin ist. Die Extraktion dauert bei 20–37°C eine bestimmte Zeit (5–24 h).
Die zurückbleibenden
Fasern werden durch Grobfiltration entfernt. Sodann wird das Filtrat über ein
feines Filter passiert, um die Mikroben zu entfernen. Das Endfiltrat
wird mit Alkohol (Ethanol) vermischt. Die Pektinniederschläge werden
gesammelt und getrocknet.
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BEISPIEL 19
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Verwendung
von Gel auf der Basis einwertiger Kationen als Speichermatrix für pharmakologische
Mittel
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Pharmakologische
Mittel werden oft in gepufferter oder nicht gepufferter physiologischer
Salzlösung (0,15
M NaCl) bei 0–8°C gelagert.
Ein pharmakologisches Mittel ist jedes Material, das auf ein biologisches System,
entweder ein Tier oder eine Pflanze, eine physiologische Wirkung
ausübt.
Ein Problem, das oft bei dieser Lagerungsform angetroffen wird,
ist die zeitabhängige
Aggregatbildung und Fällung.
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Das
thermoreversible Aloe-Pektin-Gel auf der Basis einwertiger Kationen
kann unter physiologischen Bedingungen (0,15 M NaCl, pH 7,4) bei
niedriger Temperatur (4°C)
mit einer sehr niedrigen Pektinkonzentration (1 mg/ml) gebildet
werden. Die Einarbeitung von pharmakologischen Mitteln in das Gel
würde eine
Matrix bereitstellen, die eine mögliche
Aggragation reduzieren würde.
Das Gel auf der Basis einwertiger Kationen geht schnell wieder in
Lösung
zurück,
nachdem es wieder auf RT (22°C)
gebracht wurde, so dass das gespeicherte Mittel in Lösungsform
verwendet werden kann.
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Das
Modellprotein Rinderserumalbumin (BSA), das in physiologischer Salzlösung (0,15
M NaCl) gelöst
ist, wurde mit einem gleichen Volumen von 2 mg/ml Aloe-Pektin in
0,15 M NaCl vermischt. Die BSA-Endkonzentration betrug 20 mg/ml
und die Aloe-Pektin-Endkonzentration betrug 1 mg/ml. Das Gemisch
wurde anschließend
auf Eis gehalten. Nach ca. 15 min wurde ein Gel gebildet. Dies zeigte,
dass das auf einwertigen Kationen basierende Gel das Aufnahmevermögen für hohe Konzentrationen
von biologischen Mitteln besitzt.
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Schwarze
indische Tinte wird aus winzigen Kohlenstoffpartikeln hergestellt,
die zum zeitabhängigen Ausfallen
neigen, wenn die Suspension ungestört stehen gelassen wird. Um
die Fähigkeit
des Gels auf der Basis einwertiger Kationen zur Verhinderung des
Ausfällens
zu zeigen, wurde schwarze indische Tinte in das Gelsystem eingebracht.
Die schwärze
indische Tinte (Higgins, Faber-Castell Corporation, NJ) wurde in
0,15 M NaCl 1000-fach verdünnt.
Sodann wurde die verdünnte
Tinte mit gleichen Volumina von 2 mg/ml Aloe-Pektin in 0,15 M NaCl
oder nur mit 0,15 NaCl als Kontrolle vermischt. Die Gemische wurden
auf Eis gestellt. Das Gemisch mit Pektin bildete schnell ein Gel,
und die Kontrolle blieb eine Lösung.
Beide Proben wurden sodann bei 4°C
gelagert. Nach 48 h war es offensichtlich, dass der obere Teil der
Kontrolllösung
im Vergleich zu dem unteren Teil nicht so dunkel war und dass sich
am Boden ein kompakter schwarzer Bereich gebildet hat. Dies zeigt,
dass die Fällung
der indischen Tinteteilchen erfolgt war. Andererseits war das Gel
gleichmäßig dunkel, und
am Boden des Röhrchens
wurde kein kompakter schwarzer Bereich festgestellt. Wenn sich das
Gel bei Rückkehr
auf Raumtemperatur wieder in die Lösung verwandelte, war die Lösung ebenfalls
gleichmäßig dunkel.
Dies zeigte, dass das Gel die Fällung
der Mittel verhindern konnte, die aus der Aggregation herrühren könnten.
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BEISPIEL 20
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Physikalische
und chemische Charakterisierung von Aloe-Pektinen
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Aussehen
der Endprodukte und Lösungen
Das getrocknete aus Pulpefasern stammende Aloe-Pektin besaß ein schmutzig-weißes Aussehen.
Diese Farbe stand im scharfen Gegensatz zu den derzeit im Handel erhältlichen
Pektinen sowohl von Citrus als auch Apfel, einschließlich von
Polygalacturonsäure,
die aus Citrus-Pektin hergestellt wird, und anderen derzeit unter
Entwicklung befindlichen Pektinen, wie Sonnenblumenpektin, entwickelt
werden. Sowohl Apfel- als auch Sonnenblumenpektin sind hellbraun,
und Citrus-Pektine besaßen
eine hellgelbe-braune Farbe. Die überlegene Farbqualität des Aloe-Pektins
aus der Pulpe beruht wahrscheinlich auf der klaren und farbfreien
Natur der Pulpe.
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Bei
Auflösung
in Wasser waren die Aloe-Pektinlösungen
bei einer Konzentration von 5 mg/ml im Wesentlichen klar, wohingegen
die Handelsüblichen
Produkte zu verschiedenen Ausmaßen
trübe waren,
wobei die Apfel-Pektine die trübsten
waren. Diese Feststellung wurde durch Messen der Extinktion bei
600 nm bestätigt
(Tabelle 16). Die Extinktion bei 600 nm von aus Pulpefasern extrahierten
Aloe-Pektinen war mindestens zweimal geringer als von jedem anderen
Pektin.
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Die
Aloe-Pektine aus grünen
Rindenfasern zeigten eine hellgrüne
braune Pulverfarbe in einem den Citrus-Pektinen entsprechenden Ausmaß. Ihre
Lösung
war im Vergleich zu den Pulpepektinen weniger klar, allerdings war
sie so klar wie die besten Citrus-Pektine (Tabelle 16).
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Tabelle
16. Trübung
der Pektinlösungen
in Wasser, wie gemessen bei OD 600 nm
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MERKMALE-ÜBERSICHT
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Im
Vergleich zu anderen Pektinen zeigte das Aloe-Pektin einige einzigartige
Merkmale. Erstens besaß das
Aloe-Pektin einen viel höheren
Rhamnose-Gehalt.
Dies wurde sowohl mit ungereinigtem als auch gereinigtem Aloe-Pektin im Vergleich
zu den handelsüblichen
Pektinen und den experimentellen in der Literatur beschriebenen
Pektinen gezeigt (Tabellen 10 und 11). Dies wurde auch gezeigt,
wenn die Extraktionsbedingungen betrachtet wurden, d.h. mit EDTA
extrahiertes Aloe-Pektin wurde mit anderen auf ähnliche Weise extrahierten
(mit einem Chelatbildner) Pektinen verglichen (Tabelle 12). Der
Rhamnose-Gehalt in Aloe-Pektin ist in ungereinigten Proben mehr
als drei Mai so hoch oder in gereinigten Proben mehr als zwei Mai
so hoch im Vergleich zu den entsprechenden Formen der anderen Pektine.
Dieser Unterschied wurde weiter durch die Tatsache belegt, dass
die Rhamnose/Gal-A-Verhältnisse
in Aloe-Pektin ebenfalls höher
waren. Rhamnose, die ein Hauptkettenzucker ist, besitzt eine kritische
Wirkung auf die Hauptkettenflexibilität. Je mehr Rhamnose vorhanden
ist, desto biegsamer ist das Molekül. Somit wird erwartet, dass
Aloe-Pektine im Vergleich zu anderen Pektinen biegsamer sind. Dies
kann dem Aloe-Pektin gewisse distinkte Theologische Eigenschaften
verleihen.
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Aloe-Pektine
enthielten auch einen seltenen Zucker, 3-OMe-Rhamnose (Tabelle 7).
Er wurde in sämtlichen
Proben, einschließlich
des gereinigten AP 10679, nachgewiesen. Er machte ca. 10% der gesamten Rhamnose
aus. Die Gegenwart dieses modifizierten Zuckers wurde bisher bei
keinen anderen Pektinen berichtet. Die erfindungsgemäßen Aloe-Pektine
sind relativ frei von Faser. Die Fasergehalte der so erhaltenen Aloe-Pektine
betragen weniger als etwa 20 Gew.-%, vorzugsweise weniger als etwa
5 Gew.-% und noch mehr bevorzugt weniger als etwa 1 Gew.-%.
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Eine
Zusammenfassung der anderen Eigenschaften der Aloe-Pektine, die
aus Rohpulpe und Rindenfasern extrahiert wurden, ist in Tabelle
17 angegeben.
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Obgleich
die Zusammensetzung von isolierten Aloe-Pektinen und die bevorzugten
Verfahren zum Erhalt und zur Verwendung von ihnen offenbart worden
sind, ist es für
die Fachwelt klar, dass im Hinblick auf die obige Lehre zahlreiche
Modifikationen und Änderungen
möglich
sind. Es sollte von der Fachwelt auch erkannt werden, dass solche
Modifikationen und Änderungen
nicht vom Geist und Umfang der Erfindung, wie sie in den beigefügten Ansprüchen dargelegt
sind, abweichen.
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