DE69918933T2 - Hemmung von durch sulfat-reduzierende bakterien vermitteltem abbau durch verwendung von bakterien, die antimirkobrobielle stoffe ausscheiden - Google Patents

Hemmung von durch sulfat-reduzierende bakterien vermitteltem abbau durch verwendung von bakterien, die antimirkobrobielle stoffe ausscheiden Download PDF

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Description

  • Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Fachgebiet der Verhinderung oder Hemmung des Abbaus von Oberflächen, die für einen Abbau anfällig sind, durch die Verwendung von Bakterien, die antimikrobielle chemische Zusammensetzungen ausscheiden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Bakterien, die entweder von Natur aus oder durch die Verwendung der Rekombinations-Technik chemische Zusammensetzungen ausscheiden, welche das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien auf Metallen, Beton, Mörtel und anderen Oberflächen hemmen, bei denen eine Korrosion oder ein Abbau stattfindet.
  • Stand der Technik
  • Schäden durch Abbau und Korrosion verursachen auf der ganzen Welt enorme Kosten. Alleine in den Vereinigten Staaten wurden die jährlichen Kosten der Korrosionsschäden auf 4,2% des Bruttosozialprodukts geschätzt (Martinez, L., J. Metals 45: 21 (1993)) (nachstehend: Martinez, 1993). Diese großen Kosten könnten durch eine bessere und weitreichendere Verwendung von Korrosionsschutz-Techniken deutlich reduziert werden.
  • Mikroorganismen sind signifikant an Abbau- und Korrosionsschäden beteiligt. Wenn Oberflächen und insbesondere Metalle natürlichen Umgebungen ausgesetzt werden, werden sie rasch von aeroben Bakterien besiedelt, die in der großen Masse der flüssigen Phase vorliegen (Geesey, G. G., „What is biocorrosion? Presented at the international workshop on industrial biofouling and biocorrosion", Stuttgart, Deutschland; Springer Verlag, New York (1990)) (nachstehend: Geesey 1990). Die oberen Schichten dieses Biofilms sind aerob, während die Bereiche in der Nähe der Metalloberfläche aufgrund des Sauerstoffverbrauchs durch den Biofilm keinen Sauerstoff enthalten (Blenkinsopp, S., A., et al., Trends Biotechnol. 9: 138–143 (1991); Bryers, J. D., et al., Biotech. Prog. 3: 57–67 (1987)). Sulfatreduzierende Bakterien („SRB") können diese anaeroben Nischen besiedeln und somit auch in einer aeroben Umgebung zur Korrosion beitragen (Hamilton, W. A., Sulphate-reducing bacteria and their role in biocorrosion. Presented at the international workshop on industrial biofouling and biocorrosion", Stuttgart, Deutschland; Springer Verlag (1990)) (nachstehend: Hamilton, 1990).
  • Die SRB wurden mit der Schädigung von Metallen in einem großen Spektrum von Umgebungen in Verbindung gebracht (Borenstein, S. W., „Microbiologically influenced corrosion handbook"; Woodhead Publishing Limited, Cambridge, England (1994) (nachstehend: Borenstein, 1994); Hamilton, W. A., Ann. Rev. Microbiol. 39: 195–217 (1985) (nachstehend: Hamilton, 1985); Hamilton, W. A., Trends. Biotechnol. 1: 36–40 (1983); Hamilton, 1990). Rohrleitungen und Offshore-Ölbohrtürme in der Öl- und Schifffahrtindustrie (Hamilton, W. A., Trends. Biotechnol. 1: 36–40 (1983)), Kühlwasserkreisläufe in industriellen Systemen (Borenstein, 1994; Miller, J. D., Metals, S. 150–201; in: Rose, A. H., (Hrsg.), „Microbial Deterioration", Academic Press, New York (1981)) (nachstehend: Miller, 1981), Anlagen und Rohrleitungen zur Abwasserbehandlung (Hamilton, 1985); Odom, J. M., ASM NEWS 56: 473–476 (1990)), Düsenflugzeug-Treibstofftanks in der Luftfahrtindustrie (Miller, 1981) und die Industrie zur Energieerzeugung (Licina, G. J., Mater. Perform. 28: 55–60 (1989)) (nachstehend: Licina, 1989) wurden alle durch das Wachstum und die Besiedelung von SRB nachteilig beeinflusst. Die SRB können bei einem großen Spektrum von Metallen Korrosion verursachen, hierzu zählen z.B. Kohlenstoff-Stähle mit geringem Kohlenstoffgehalt (z.B. Borshchevskii, A. M., et al., Prot. Metals 30: 313–316 (1994); Cheung, C. W. S., und Beech, I. B., Biofouling 9: 231–249 (1996) (nachstehend: Cheung und Beech, 1996); Dubey, R. S., et al., Ind. J. Chem. Tech. 2: 327–329 (1995); Gaylarde, C. C., Int. Biodet. Biodeg. 30: 331–338 (1992)) (nachstehend: Gaylarde, 1992); Lee et al., Biofouling 7: 197–216 (1993); Edelstähle (Benbouzid-Rollet, N., et al., J. Appl. Bacteriol. 71: 244–251 (1991); Mollica, A., Int. Biodet. Biodeg. 29: 213–229 (1992); Newman, R. C., et al., ISIJ International 3: 201–209 (1991)); Oritz et al., Int. Biodet. 26: 315–326 (1990)); und Kupferlegierungen (Licina, 1989; Wagner, P., und Little, B., Mater. Perform. 32: 65–68 (1993) (nachstehend: Wagner und Little, 1993), die alle häufig in der Verfahrenstechnik, Schifftahrts- und Energieindustrie verwendet werden. Die SRB sind auch wesentlich am Abbau von nicht-metallischen Teilen der Infrastruktur der Welt beteiligt. Die SRB erzeugen Hydrogensulfid, das dann durch schwefeloxidierende Organismen, z.B. Thiobacillus, zu Schwefelsäure metabolisiert wird. Es wurde gefunden, dass der Schwefelsäureabbau aufgrund von Bakterien z.B. die Lebensdauer von Betonrohrleitungen in Wassersystemen dramatisch verkürzt. Es wurde geschätzt, dass Korrosionsschäden aufgrund von SRB nur bei Metallen in den Vereinigten Staaten einen Betrag von 4 bis 6 Milliarden $ pro Jahr ausmachen (Beloglazov, S. M., et al., Prot. Met. USSR 27: 810–813 (1991)) (nachstehend: Beloglazov, 1991).
  • Herkömmliche Strategien zur Hemmung der Korrosion umfassten eine Modifikation des pH-Werts, des Redoxpotentials und des spezifischen Widerstands des Bodens, in dem die Vorrichtungen installiert werden sollen (Iverson, W. P., Adv. Appl. Microbiol. 32: 1–36 (1987)) (nachstehend: Iverson, 1987), anorganische Beschichtungen, einen kathodischen Schutz und Biozide (Jack, T. R., et al., Control in Industrial Settings, S. 265–292; in: Barton, L. L., (Hrsg.), Sulfate-reducing Bacteria; Plenum Press, New York (1995)) (nachstehend: Jack et al., 1995). Anorganische Schutzüberzüge, z.B. Anstriche und Epoxidharze, wurden in der Vergangenheit verbreitet eingesetzt; jedoch sind sie nicht dauerhaft, und die Kosten, die dadurch verursacht werden, dass sie instand gehalten und ersetzt werden müssen, sind erheblich (Jayaraman, A., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 47: 62–68 (1997)) (nachstehend: Jayaraman et al., 1997a); Martinez, 1993). Mit einem kathodischen Schutz wird die kathodische Reaktion auf der Metalloberfläche stimuliert, indem sie mit einer Opferanode verbunden wird, die aus Magnesium oder Zink besteht, oder indem ein vorgegebener Strom aus einer externen Energiequelle über eine korrosionsresistente Anode angelegt wird. Der galvanische oder vorgegebene Strom setzt das elektrochemische Potential überall auf der Metalloberfläche herab, so dass sich keine Metallkationen bilden und keine Auslösung stattfindet ((Iverson, 1987); Little, B. J., et al., Mater. Perform. 32: 16–20 (1993)). Wagner und Little (1993) berichten jedoch, dass bei Verwendung von kathodischen Potentialen bis zu –1074 mV diese nicht in der Lage waren, die Bildung eines Biofilms zu verhindern.
  • Außerdem wurden Biozide eingesetzt, um die Korrosionsreaktion in geschlossenen Systemen, z.B. Kühltürmen und Lagertanks, zu verzögern (Iverson, 1987), und es handelt sich bei ihnen möglicherweise um das gebräuchlichste Verfahren zum Bekämpfen der Biokorrosion (Boivin, J., Mater. Perform. 34: 65–68 (1995) (nachstehend: Boivin, 1995)); Brunt, K. D., Biocides for the oil industry, S. 201–207; in: Hill, E. C., Shennan, J. L., Watkinson, R. J., (Hrsg.), „Microbial Problems in the Offshore Oil Industry", John Wiley and Sons, Chichester, England (1986); Cheung, C. W. S., et al., Biofouling 9: 231–249 (1996) (nachstehend: Cheung, 1996). Saleh et al. (J. Appl. Bacteriol. 27: 281–293 (1964)) (nachstehend: Saleh et al., 1964) stellen einen Überblick über die Verwendung von nahezu 200 Verbindungen dar, die bakterizid oder bakteriostatisch gegen SRB wirken. Oxidierende Biozide, wie Chlor, Chloramine und chlorierende Verbindungen, werden in Süßwassersystemen verwendet (Boivin, 1995, vorstehend). Chlorverbindungen sind die in der Praxis am besten anwendbaren Biozide; jedoch hängt ihre Aktivität vom pH-Wert des Wassers und vom Ausmaß an Licht sowie von der Höhe der Temperatur ab (Keevil, C. W., et al., Int. Biodet. 26: 169–179 (1990)) (nachstehend: Keevil et al., 1990), außerdem sind sie gegen Biofilm-Bakterien nicht sehr wirksam (Boivin, 1995, vorstehend). Nicht-oxidierende Biozide, wie quartäre Salze (Beloglazov, 1991), Amintyp-Verbindungen, Anthrachinone (Cooling III, F. B., et al., Appl. Environ. Microbiol. 62: 2999–3004 (1996)) (nachstehend: Cooling et al., 1996) und Aldehyde (Boivin, 1995) sind stabiler und können in den verschiedensten Umgebungen eingesetzt werden. Die Verwendung dieser Biozide hat jedoch eine Reihe von ernsten Nachteilen, hierzu zählen nicht nur die Kosten der Biozide selbst, sondern auch die Kosten für die Umwelt, wenn große Mengen an anorganischen Verbindungen in die Wasserversorgung freigesetzt werden.
  • Ein weiteres Problem stellt die Organisation des Biofilms auf der Materialoberfläche dar. Die Glykokalyx (Brown, M. L., et al., Appl. Environ. Microbiol. 61: 187–193 (1995); Hoyle, B. D., et al., J. Antimicrob. Chemother. 26: 1–6 (1990); Suci, P. A., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 38: 2125–2133 (1994)), phänotypische Änderungen, die im Biofilm stattfinden, z.B. die Expression des Gens algC in P. aeruginosa (Costerton, W. J., et al., Ann. Rev. Microbiol. 49: 711–745 (1995)) (nachstehend: Costerton, 1995), und die Wirkung der Chemie der Oberfläche auf den metabolischen Zustand des Biofilms (Keevil et al., 1990) können alle dazu dienen, die Widerstandsfähigkeit von Organismen in einem Biofilm gegenüber antimikrobiellen Mitteln über das Niveau zu erhöhen, das bei planktonischen Bakterien festgestellt wird (Brown, M. R. W., et al., J. Appl. Bacteriol. Symp. Suppl. 74: 87S-97S (1993)). Eine Kombination aus einem organischen Film-Korrosioninhibitor, einem Polyacrylat/Phosphonat und zwei Bioziden wurde erfolgreich eingesetzt, um die Korrosion in einem Kühlwassersystem zu kontrollieren (Iverson, vorstehend). Jedoch sind die SRB von sich aus gegen ein großes Spektrum von antimikrobiellen Mitteln resistent (Saleh et al., 1964, vorstehend), und außerdem reduziert die raue anaerobe Umgebung (die durch die Korrosionsprodukte erzeugt wird), in der die SRB gedeihen, die Wirksamkeit der antimikrobiellen Mittel (Cheung, 1996; Iverson, vorstehend). Nachdem sich die SRB in ihrer Nische fest etabliert haben, ist es schwierig, sie aus einem System zu entfernen, ohne dieses zu zerlegen (Boivin, 1995, vorstehend).
  • Eine weitere Strategie zum Kontrollieren einer durch Mikroorganismen induzierten Korrosion besteht darin, das Wachstum der schädlichsten Mikroorganismen durch eine Manipulation der verfügbaren Nährstoffe zu unterdrücken und dadurch einen besser verträglichen Biofilm zu erzeugen (Jack et al., 1995). Kürzlich beschrieben Jansen und Kohnen (J. Ind. Microb. 15: 391–396 (1995)) die Verringerung der Anheftung von Staphylococcus epidermis KH6 an Oberflächen, indem sie die Polymeroberfläche durch Ionenbindung von Silberionen an die Oberfläche modifizierten, wobei sie nahelegten, dass die Entwicklung von antimikrobiellen Polymeren die Anheftung von Bakterien verhindert. Wood, P., et al., (1996) (Appl. Environ. Microbiol. 62: 2598–2602) berichteten, dass die Erzeugung von Kaliummonopersulfat und Wasserstoffperoxid auf der Oberfläche durch Katalyse die Aktivität dieser Biozide gegenüber einem P. aeruginosa-Biofilm um das 150-Fache verstärkte. Dieses Verfahren beruhte darauf, dass ein Kunststoff mit den erforderlichen chemischen Mitteln durchdrungen wird, wobei hierdurch weitreichende, wesentliche und kostspielige Änderungen in Herstellungsverfahren erforderlich gemacht würden.
  • Schließlich legten die Arbeiten von anderen Autoren nahe (Pedersen und Nermannsson, Biofouling 1: 313–322 (1989), und Biofouling 3: 1–11 (1991)), und außerdem bestätigten unsere eigenen Arbeiten kürzlich (Jayaraman et al., 1997a; und Jayaraman et al., J. Ind. Microb. 18: 396–401 (1997) (nachstehend: Jayaraman et al., 1997b), dass aerobe Bakterien in einem Biofilm die elektrochemische Korrosion von Metall um das Zwei- bis Vierzigfache hemmen können, dies beruht möglicherweise zum Teil auf der Tatsache, dass atmende Bakterien in einem Biofilm auf einem Metall einen Teil des Sauerstoffs verbrauchen, der anderenfalls zum Oxidieren dieses Metalls verfügbar wäre. Wie vorstehend angegeben, bietet diese Erniedrigung des Sauerstoffspiegels jedoch auch eine Gelegenheit für SRB, die anaerob sind, das Metall zu besiedeln. Somit wird in der Praxis die Wirksamkeit von Biofilmen als Mittel zum Hemmen der elektrochemischen Korrosion dadurch herabgesetzt, dass hierauf die Steigerung der Rate der mit SRB zusammenhängenden Korrosion folgt.
  • Was jedoch in diesem Fachgebiet benötigt wird, ist ein wirksames und billigeres Verfahren, um die durch SRB verursachte Korrosion oder den durch SRB verursachten Abbau zu verhindern oder zu hemmen, wobei durch das Verfahren eine geringere Freisetzung von toxischen Mitteln in die Umgebung erfolgt. Die vorliegende Erfindung stellt diese und andere Vorteile bereit.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Fachgebiet der Verhinderung oder Hemmung von Korrosion durch die Verwendung von Bakterien, die antimikrobielle chemische Zusammensetzungen ausscheiden. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Bakterien, die entweder von Natur aus oder durch die Verwendung der Rekombinations-Technik chemische Zusammensetzungen ausscheiden, die das Wachstum von sulfatreduzierenden Bakterien auf Metallen, Beton, Mörtel und anderen Oberflächen hemmen, bei denen eine Korrosion oder ein Abbau stattfindet.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Hemmen des Wachstums von SRB auf einem korrosions- oder abbauempfindlichen Material bereit. Das Verfahren umfasst das Aufbringen eines Bakteriums, das eine chemische Zusammensetzung in einer Menge ausscheidet, die zur Hemmung des Wachstums von SRB auf dem Material ausreichend ist, auf das korrosions- oder abbauempfindliche Material. Das korrosionsempfindliche Material kann ein Metall, z.B. Eisen, Aluminium, Titan, Kupfer, oder Legierungen davon sein. Z.B. kann das Metall Weichstahl oder einer der verschiedenen Edelstähle sein. Das abbauempfindliche Material kann ein Material, z.B. Beton, Stahlbeton oder Zement, sein. Das Bakterium kann ein Aerobier sein, und es kann z.B. ein Vertreter der Gattung Pseudomonas oder Bacillus sein. Die chemische Zusammensetzung, die durch das Bakterium ausgeschieden wird, kann eine Zusammensetzung sein, die durch ein Wildtyp-Mitglied der Art dieses Bakteriums normalerweise nicht ausgeschieden wird, und sie kann ein Antibiotikum sein, z.B. Gramicidin S, Indolicidin, Polymixin oder Bactenecin, sie kann eine Polyaminosäure sein, z.B. Polyaspartat oder Polyglutamat, oder sie kann ein Siderophor sein.
  • Weiterhin stellt die Erfindung ein System zur Hemmung der Korrosion bereit, umfassend ein korrosions- oder abbauempfindliches Material mit einem Biofilm auf seiner Oberfläche, wobei der Biofilm ein Bakterium umfasst, das eine chemische Zusammensetzung in einer Menge ausscheidet, die zur Hemmung des Wachstums von SRB auf dem Material ausreichend ist. Das korrosionsempfindliche Material kann ein Metall sein, z.B. diejenigen, die im vorstehenden Abschnitt aufgezählt sind; das abbauempfindliche Material kann ein Material, z.B. Zement, Beton oder Stahlbeton, sein. Die Bakterien können ein Aerobier sein, insbesondere der Gattung Pseudomonas oder der Gattung Bacillus. Die chemische Zusammensetzung, die durch das Bakterium ausgeschieden wird, kann eine Zusammensetzung sein, die durch ein Wildtyp-Mitglied der Art dieses Bakteriums normalerweise nicht ausgeschieden wird, und sie kann ein Antibiotikum sein, z.B. Gramicidin S, Indolicidin, Polymixin oder Bactenecin, sie kann eine Polyaminosäure sein, z.B. Polyaspartat oder Polyglutamat, oder sie kann ein Siderophor sein.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Clonierung und Expression von Indolicidin und Bactenecin. S = Serin und A = Alanin. Nur relevante Restriktionsstellen sind angegeben.
  • 1a: Schematische Darstellung des Expressionssystems, das für die Clonierung und Sekretion von Indolicidin und Bactenecin verwendet wurde.
  • 1b: Komplementäre Oligonucleotide, die für die Clonierung von Indolicidin verwendet wurden.
  • 1c: Komplementäre Oligonucleotide, die für die Clonierung von Bactenecin verwendet wurden.
  • 2: Clonierung und Expression von Bactenecin mit einer schützenden Pro-Barnase (pro)-Region.
  • 2a: Schematische Darstellung des Expressionssystems, das für die Clonierung und Sekretion von Pro-Bactenecin verwendet wurde. Der Ein-Buchstaben-Aminosäure-Code stellt die Pro-Region und das Bactenecin-Gen dar. SP bedeutet das alkalische Protease-Signalpeptid.
  • 2b: Relevante Nucleotide für die Clonierung von Pro-Bactenecin. S = Serin und A = Alanin. Nur die relevanten Restriktionsstellen sind angegeben.
  • 3: Impedanzspektren von Edelstahl 304 in modifiziertem Baar-Medium mit zweifachen Kulturen (außer für den Kontrolllauf) von B. subtilis BE1500 (mit Plasmid pBE92 in Abwesenheit (leere Quadrate) und in Gegenwart (gefüllte Quadrate) von SRB, pBE92-Ind (Indolicidin) (gefüllte Rauten), pBE92-Bac (Bactenecin) (leere Dreiecke) und pBE92-ProBac (Bactenecin mit einer Pro-Region) (leere Kreise)) und den Kontrollbakterien P. fragi K (gefüllte Sechsecke) und den repräsentativen SRB D. vulgaris. Die Ergebnisse stammen aus einem repräsentativen Experiment.
  • 3a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 3b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • Anmerkung zur Interpretation der Impedanzspektren, die in den 3 bis 9 dargestellt sind
  • Die elektrochemische Impedanz-Spektroskopie ist ein Verfahren der Werkstoffwissenschaft, das zur Untersuchung der Korrosion eingesetzt wird. Das obere Diagramm in den 3 bis 9 (die Figur „a") ist jeweils eine graphische Darstellung, bei der der Logarithmus der Impedanz des angegebenen Metalls, das, wie für diese Figur angegeben, behandelt wurde, über einem Bereich von Frequenzen aufgetragen ist. Das Plateau der Impedanz bei niedrigen Frequenzen wird der Polarisationswiderstand genannt und ist zur Korrosionsrate umgekehrt proportional; wenn also die Impedanz bei niedrigen Frequenzen ansteigt, zeigt dies an, dass die Korrosionsrate abgenommen hat. Das Instrument schwingt zwar über dem auf dem Diagramm angegebenen Frequenzbereich, der Teil des Diagramms, der für die Korrosionsstudien als relevant angesehen wird, ist jedoch das Ergebnis bei der niedrigsten Frequenz. Somit wird die Wirkung einer Änderung im Experiment auf die Korrosionsrate aus den Werten bestimmt, die im äußersten linken Teil der Figur dargestellt sind. Da auf der Y-Achse des Diagramms „a" Ziffern angegeben sind, die eine logarithmische Funktion darstellen, stellt der Unterschied zwischen den Ziffern auf der Y-Achse jeweils einen zehnfachen Unterschied dar. Demgemäß spiegeln kleine Unterschiede in der relativen Position des Messpunkts für die entsprechenden Linien wesentliche Unterschiede in der Korrosionsrate wider. Weitere Informationen über Polarisationswiderstand, Impedanzspektren und andere Verfahren zur Messung der Korrosion finden sich in Baboian, R., Hrsg., „Corrosion Tests and Standards: Application and Interpretation", American Society for Testing and Materials, Philadelphia (1995).
  • Das untere Diagramm in jeder Figur (die Figur „b") ist ein Diagramm, in dem Phasenverschiebungen der Impedanzantwort aufgetragen sind. Diese Diagramme bestätigen für jedes Experiment, dass die in der Figur „a" aufgetragene Impedanz eine einzelne Zeitkonstante widerspiegelt und dass das Plateau in der Impedanz bei niedrigen Frequenzen der Polarisationswiderstand ist.
  • Auf der X-Achse ist bei allen Diagrammen der 3 bis 9 (sowohl „a" als auch „b") die Frequenz in Hertz aufgetragen.
  • 4: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Edelstahl 304 in modifiziertem Baar-Medium mit doppelten Kulturen von B. subtilis WB600 (mit Plasmid pBE92, in Abwesenheit (leere Quadrate) und in Gegenwart (gefüllte Quadrate) von SRB, pBE92-Ind (Indolicidin), gefüllte Rauten, pBE92-Bac (Bactenecin), leere Dreiecke, und pBE92-ProBac (Bactenecin mit einer Pro-Region), leere Kreise, und P. fragi K, gefüllte Sechsecke). „SRB" steht für das repräsentative SRB D. vulgaris. Die Werte stammen aus einem Experiment.
  • 4a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 4b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 5: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Edelstahl 304 in modifiziertem Baar-Medium mit doppelten Kulturen von B. polymyxa (mit Plasmid pBE92 in Abwesenheit (leere Dreiecke) und in Gegenwart (gefüllte Kreise) von SRB, pBE92-Bac (Bactenecin) (leere Quadrate), und Kontrollbakterium P. fragi K (gefüllte Sechsecke), mit dem repräsentativen SRB D. vulgaris. Die Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus zwei unabhängigen Experimenten).
  • 5a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 5b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 6: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Weichstahl SAE 1018 in modifiziertem Baar-Medium, wobei das gereinigte antimikrobielle Ampicillin zu Kulturen von P. fragi K vor und nach Zugabe von SRB zugefügt wurde. Kontrollkultur von P. fragi K leere Kreise, P. fragi und SRB (D. vulgaris): gefüllte Rauten, P. fragi und SRB, wobei Ampicillin nach SRB zugefügt wurde: gefüllte Dreiecke, P. fragi, wobei Ampicillin vor SRB zugefügt wurde: leere Quadrate. Die Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten).
  • 6a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 6b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 7: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Edelstahl 304 in modifiziertem Baar-Medium, wobei das gereinigte antimikrobielle Ampicillin vor und nach Zugabe von SRB zugefügt wurde. Kontrollkultur von P. fragi K leere Kreise, P. fragi und SRB (D. vulgaris): gefüllte Rauten, P. fragi und SRB, wobei Ampicillin nach SRB zugefügt wurde: gefüllte Dreiecke, P. fragi, wobei Ampicillin vor SRB zugefügt wurde: leere Rauten. Die Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten).
  • 7a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 7b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 8: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Edelstahl 304 in modifiziertem Baar-Medium, wobei das gereinigte antimikrobielle Gramicidin S vor der Zugabe von SRB zugefügt wurde und Gramicidin S in situ durch den rekombinanten Biofilm erzeugt wurde.
  • Gefüllte Kreise: Kontrollbakterien P. fragi und SRB; leere Rauten: P. fragi und Gramicidin S und SRB D. vulgaris (Gramicidin S wurde vor SRB zugegeben); leere Quadrate: der Gramicidin S-überproduzierende Stamm B. brevis 18; gefüllte Quadrate: B. brevis 18 und SRB. Die Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten).
  • 8a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 8b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 9: Obere und untere Abbildung: Impedanzspektren von Weichstahl SAE 1018 in modifiziertem Baar-Medium, wobei das gereinigte antimikrobielle Gramicidin S vor der Zugabe von SRB zugefügt wurde und Gramicidin S in situ durch den rekombinanten Biofilm erzeugt wurde. Die Legende entspricht der von 8. Die Werte stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten).
  • 9a: Y-Achse: Logarithmus der Impedanz; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • 9b: Y-Achse: Phasenwinkel in Grad; X-Achse: Frequenz in Hertz.
  • Genaue Beschreibung
  • I. Einleitung
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Hemmung des Abbaus von Materialien und außerdem ein System zur Hemmung des Abbaus bereit. Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Vorliegen von aeroben Biofilmen auf Metallen die Korrosion um das 2- bis 40-Fache herabsetzen kann (Jayaraman et al., 1997a; und Jayaraman et al., 1997b). Diese Hemmung kann zum Teil auf einer Erniedrigung der Sauerstoffspiegel an der Oberfläche des Metalls aufgrund der bakteriellen Atmung beruhen. In natürlichen Umgebungen bietet diese Erniedrigung des Sauerstoffspiegels jedoch auch die Möglichkeit für die Besiedelung des Metalls durch sulfatreduzierende Bakterien oder „SRB". Obwohl die Wirkung von SRB in Jayaraman et al., 1997a oder 1997b, nicht untersucht wurde, kann man erwarten, dass SRB die Korrosionsrate wesentlich über die Werte erhöhen, die in diesen Studien berichtet wurden. Demgemäß demonstrierten die Studien von Jayaraman et al., 1997a und 1997b, zwar, dass aerobe Biofilme als ein Mittel zur Hemmung der Korrosion dienen können, sie stellten jedoch keine Anleitung bereit, wie die Wirkung der durch SRB vermittelten Korrosion verringert werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem. Sie erhöht somit deutlich den Nutzen von aeroben Biofilmen als Mittel zur Hemmung des Abbaus. Kurz gesagt umfasst die Erfindung die Anwendung von Bakterien, die antimikrobielle Substanzen ausscheiden. Wir haben nun gezeigt, dass es möglich ist, Biofilme aus aeroben Bakterien zu erzeugen, die Substanzen ausscheiden, die das Wachstum von SRB hemmen. Die Substanzen können solche sein, die von Natur aus durch Wildtyp-Bakterien ausgeschieden werden, die in dem Biofilm normalerweise nicht vorliegen, in den die Bakterien eingeführt werden (umfassend die Sekretion von Substanzen in Spiegeln, die aufgrund einer Mutation höher sind als normal). Das Bakterium kann auch rekombinant verändert sein, so dass es eine Substanz überexprimiert, die durch den Organismus von Natur aus ausgeschieden wird, oder so dass es ein antimikrobielles Mittel sezerniert, das durch Wildtyp-Mitglieder der Bakterienart nicht exprimiert wird, oder beides kann der Fall sein.
  • Korrosion ist ein Problem, das Metalle angreift. Jedoch werden auch andere Materialien durch einen Abbau schwer beeinträchtigt, der mit einer Besiedelung des Materials mit SRB zusammenhängt. SRB erzeugen Hydrogensulfid als Produkt ihres Stoffwechsels. Sulfid greift Eisen, seine Legierungen, umfassend Edelstähle, an und oxidiert Kupfer und seine Legierungen. Das Hydrogensulfid ist verfügbar und kann von einer Reihe von schwefeloxidierenden Organismen, z.B. Thiobacillus, zu Sulfat oxidiert werden, wobei diese Organismen Schwefelsäure produzieren. Es wurde gefunden, dass die auf diese Weise erzeugte Schwefelsäure z.B. für den Abbau von Wasserkanälen aus Beton in Los Angeles verantwortlich ist und dass dadurch die erwartete Lebensdauer des Wassersteuersystems aus Beton dramatisch verkürzt wurde.
  • Während die Erfindung besonders gegen eine mit SRB zusammenhängende Korrosion oder einen mit SRB zusammenhängenden Abbau angewendet werden kann, eignen sich das Verfahren und das System der Erfindung auch für andere Organismen, die die Korrosion und den Abbau von Materialien steigern. Z.B. kontaminieren Pilze, wie Hormoconis resinae, Düsenflugzeug-Treibstoffe und erzeugen organische Säuren, welche die Korrosion von Aluminiumlegierungen in dem Treibstoffsystem verstärken. Vgl. z.B. H. A. Videla, Manual of Biocorrosion (CRC Lewis Pub., New York (1996), auf S. 129 (nachstehend: „das Handbuch", wobei die Gesamtheit des Handbuchs hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Die Verwendung von Bakterien, die Antipilzmittel ausscheiden oder die so verändert wurden, dass sie diese ausscheiden, oder beides, kann die Korrosion verringern, die durch diese Organismen verursacht wird. Genauso verstärkt das Wachstum von Pseudomonas in Düsenflugzeug-Treibstoffen die Korrosion, während gefunden wurde, dass Serratia marcescens einen Schutz bewirkt. Id. auf S. 129 bis 132. Die vorliegende Erfindung würde das Verändern von S. marcescens umfassen, so dass es eine oder mehrere antimikrobielle Substanzen ausscheidet, welche das Wachstum von Pseudomonas und außerdem von SRB oder anderen Mikroorganismen hemmen, für die möglicherweise gefunden wird, dass sie Korrosion verursachen.
  • Die Hemmung einer durch SRB vermittelten Korrosion oder eines durch SRB vermittelten Abbaus und außerdem einer Korrosion, die durch andere Bakterien (z.B. Pseudomonas) oder durch Pilze verursacht wird, durch dieses Verfahren ist sehr wünschenswert. Da Bakterien sich selbst reproduzieren, ergänzt sich die Population der Organismen, die das antimikrobielle Mittel ausscheiden, im Lauf der Zeit von selbst. Auf diese Weise kann eine einzelne Anwendung einen langen Zeitraum wirksam sein, im Gegensatz zur Anwendung von organischen oder anorganischen Chemikalien, die üblicherweise häufig wiederholt werden muss. Außerdem stellt die Sekretion des Mittels im Biofilm selbst automatisch die höchste Konzentration des Mittels an seinem Wirkort bereit, anders als bei äußerlich angewendeten Chemikalien, die typischerweise in großen Mengen angewendet werden, um sicherzustellen, dass eine ausreichende Dosis die SRB oder einen anderen vorgesehenen Zielorganismus erreicht. Weiterhin ist der Mechanismus, durch den die SRB Energie gewinnen, energetisch nur schwach begünstigt, so dass das Wachstum der Organismen durch Mittel gehemmt werden kann, die andere Organismen nicht ernsthaft beeinträchtigen. Somit kann die Sekretion von antimikrobiellen Mitteln durch umgebende Mikroorganismen die Resistenz von SRB gegenüber anderen Mitteln entweder vollständig hemmen oder verringern, so dass es möglich wird, die mit SRB zusammenhängende Korrosion oder den mit SRB zusammenhängenden Abbau durch die äußerliche Anwendung von Bioziden und anderen toxischen Mitteln in viel geringeren Spiegeln zu hemmen, als in denen, die anderenfalls erforderlich wären.
  • Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass sogar dann, wenn der Biofilm an einigen wenigen Stellen aufgrund einer Flüssigkeitsströmung oder aufgrund von Abrieb beschädigt oder entfernt ist, die fortgesetzte Zufuhr des Inhibitors durch die benachbarten Bereiche die Neubesiedelung des exponierten Metalls oder einer anderen exponierten Oberfläche durch die den Hemmstoff produzierenden Bakterien bevorzugt begünstigen würde. Da Biofilme sich auf exponierten Oberflächen rasch bilden können (Costerton, 1995), kann die wohlüberlegte Auswahl eines Bakteriums den Ausschluss anderer Bakterienarten aus dem Biofilm zur Folge haben.
  • Schließlich kann die Abbau- oder Korrosions-hemmende Wirkung eines Biofilms noch weiter gesteigert werden, indem Bakterien eingeführt werden, die Abbau- oder Korrosions-hemmende Mittel ausscheiden, und zwar entweder getrennt oder in Kombination mit antimikrobiellen Mitteln. Solche Abbau- oder Korrosions-hemmende Mittel können Polypeptide, z.B. Polyaspartat und Polyglutamat, und außerdem Siderophore, z.B. Parabactin und Enterobactin, umfassen.
  • Der folgende Text zeigt einige der vielen Verwendungen der Erfindung und außerdem, wie sie durchgeführt werden kann. Zuerst werden im Text Begriffe definiert, anschließend wird im Text die Steigerung des antikorrosiven Effekts eines aeroben Biofilms durch die Verwendung von Organismen diskutiert, die Anti-SRB- oder Anti-Pilz-Mittel ausscheiden, umfassend sowohl Organismen, die von Natur aus solche Mittel ausscheiden, als auch diejenigen, die genetisch so verändert sind, dass sie dies tun. Außerdem wird die Verwendung von Anti-Korrosions- und Anti-Abbau-Mitteln, z.B. Polypeptiden und Siderophoren, beschrieben, um die Anti-Korrosions-Wirkung noch weiter zu steigern. Weiterhin wird im Text beschrieben, wie ein geeigneter Organismus für die Verwendung im Verfahren oder im System der Erfindung ausgewählt werden kann und wie bestimmt werden kann, ob der Organismus Substanzen produziert (vor oder nach einer Veränderung), die das Wachstum des SRB, des Pilzes oder eines anderen Zielorganismus hemmen. Anschließend werden Verfahren zum Aufbringen der Organismen, bevor oder nachdem das Material, das geschützt werden soll, in Betrieb genommen wird, diskutiert, und außerdem werden Anwendungen für das Verfahren und für das System beschrieben. Schließlich werden noch Beispiele dargestellt.
  • II. Definitionen
  • „Weichstahl" bezieht sich in der Verwendung hier auf einen billigen Stahl von niedriger Qualität, der häufig für Rohrleitungen und dergleichen verwendet wird.
  • „Stahl SAE 1018" ist eine besondere Qualität von Weichstahl, die einen durch die Society of Automotive Engineers aufgestellten Industriestandard erfüllt.
  • „Edelstahl 304" oder „304 Edelstahl" bezieht sich in der Verwendung hier auf eine bestimmte Qualität von Edelstahl, die den Industriestandard für diese Bezeichnung erfüllt.
  • Der Begriff „Metall-Kupon" bezieht sich auf eine kleines dünnes Rechteck oder rundes Plättchen aus Metall. Solche „Kupons" werden vom Fachmann routinemäßig verwendet, um Korrosionseigenschaften verschiedener Metalle, Mittel und Inhibitoren zu vergleichen.
  • „Korrosionsempfindliches Material" umfasst in der Verwendung hier alle Metalle, bei denen eine Korrosion stattfindet, insbesondere Eisen, Aluminium, Titan, Kupfer, Nickel und Legierungen von jedem dieser Stoffe, umfassend Weichstahl und Edelstähle.
  • „Korrosion" bezieht sich spezifisch auf eine Schädigung von Metallen, während „Abbau" eine Schädigung anderer Materialien, z.B. Beton, Zement, Mörtel und ähnlicher Stoffe, betrifft. Somit ist ein „abbauempfindliches Material" in der Verwendung hier ein Nicht-Metall, bei dem eine Schädigung durch mit Bakterien zusammenhängende Ursachen erfolgt. Der Einfachheit der Bezugnahme halber kann jedoch der hier verwendete Begriff „Korrosion" auch eine Schädigung von Materialien umfassen, die keine Metalle sind, sofern durch den Zusammenhang nichts anderes angegeben ist. Auch Zahnimplantate können ein „abbauempfindliches" Material sein.
  • Der hier verwendete Begriff „chemische Zusammensetzung" bedeutet eine Chemikalie, die eine wachstumshemmende Wirkung auf einen Mikroorganismus ausübt, der die Korrosion eines Metalls oder den Abbau eines nicht-metallischen Materials verursachen kann. Der Begriff wird im Allgemeinen hier synonym mit dem Begriff „antimikrobielles Mittel" verwendet, dies muss jedoch nicht der Fall sein.
  • Der Begriff „Aufbringen" soll ein beliebiges Verfahren umfassen, das durch eine Handlung eines Menschen vermittelt oder ermöglicht wird, wodurch Bakterien mit der Oberfläche in Kontakt kommen, und umfasst, wie es im Zusammenhang geeignet ist, Inkontaktbringen, Sprühen, Aufstreichen, Aufspritzen oder Auftropfen von Bakterien oder eines Gemisches, das Bakterien enthält, auf das korrosions- oder abbauempfindliche Material. Er soll außerdem die Zugabe von Bakterien, die eine antimikrobielle Zusammensetzung, z.B. eine Anti-SRB-Zusammensetzung, ausscheiden, in anfängliche Ladung von Wasser umfassen, die man am Anfang z.B. durch ein Rohr, eine Leitung, einen Kühlturm oder ein Wassersystem laufen lässt, wenn das Rohr, die Leitung, der Turm oder das System erstmals in Betrieb genommen wird. Außerdem soll er das physikalische Plazieren von Bakterien auf einer Oberfläche umfassen, mit oder ohne Abschaben der Oberfläche, um einen Raum innerhalb eines vorliegenden Biofilm zu schaffen.
  • Die Bezeichnung „in einer Menge, die für die Hemmung des Wachstums von sulfatreduzierenden Bakterien ausreichend ist," bedeutet eine Menge, die ausreichend ist, um das Wachstum solcher Bakterien in einer statistisch signifikanten Weise im Vergleich zu einer Kontrollpopulation zu reduzieren. Der Bereich kann so niedrig wie der Wert der Nachweisgrenze eines statistisch signifikanten Unterschieds bis zur vollständigen Hemmung sein. Vorzugsweise beträgt der Grad der Hemmung mindestens etwa 10%, dies bedeutet, dass das Wachstum solcher Bakterien mindestens etwa 10% geringer ist als das Wachstum der Kontrollpopulation. Stärker bevorzugt beträgt der Grad der Hemmung etwa 30 bis 50%. Noch stärker bevorzugt beträgt der Grad der Hemmung etwa 50 bis 90%. Am stärksten bevorzugt beträgt der Grad der Hemmung 90% oder mehr.
  • III. Steigerung der Anti-Korrosions-Effekte von Biofilmen
  • A. Steigerung der antikorrosiven Wirkung eines Biofilms durch Bakterien die antimikrobielle Mittel ausscheiden
  • 1. Allgemeines
  • Oberflächen, die natürlichen Umgebungen ausgesetzt sind, werden rasch durch aerobe Bakterien besiedelt. An Metallen und anderen Oberflächen entwickeln sich daran haftende mikrobielle Populationen, die von einer Polysaccharidhülle umgeben sind, die als eine Glykokalyx bekannt ist (Costerton, 1995). Wie im Stand der Technik angemerkt, haben die kürzlichen Arbeiten der Erfinder bestätigt, dass Biofilme eine schützende Wirkung auf Oberflächen ausüben, wenn sie als eine Mono- (oder „axenische") Kultur gewachsen sind. In der Natur wachsen Organismen jedoch selten in Monokulturen, und die sauerstofffreien Bereiche, die in der Nähe der Oberfläche des Metalls oder eines anderen Materials aufgrund des Sauerstoffverbrauchs durch die aeroben Bakterien im Biofilm vorliegen, bietet die Möglichkeit zur Besiedelung des Materials durch sulfatreduzierende Bakterien oder „SRB". Diese Bakterien sind somit auch in einer aeroben Umgebung für die Korrosion verantwortlich (Hamilton, 1990).
  • Die schützenden Effekte des Biofilms können gesteigert werden, indem in einen vorliegenden Biofilm ein oder mehrere Bakterien eingeführt werden, die antimikrobielle Mittel ausscheiden, die das Wachstum von SRB hemmen. In einer Ausführungsform kann es sich um Bakterien handeln, die entweder normalerweise oder als Ergebnis einer Mutation ein Mittel, welches das Wachstum von SRB hemmt, natürlich erzeugen und ausscheiden. Andererseits können die Bakterien durch die Rekombinations-Technik so verändert werden, dass sie entweder antimikrobielle Mittel ausscheiden, die durch die nicht-veränderten Mitglieder ihrer Art nicht ausgeschieden werden, oder dass sie ein Mittel in höheren Spiegeln oder kontinuierlich ausscheiden, das normalerweise in niedrigeren Spiegeln oder nur zu bestimmten Zeiten ausgeschieden wird.
  • 2. Natürliche bakterielle Ausscheider
  • Einige Bakterien produzieren von Natur aus Mittel, die wirksam das Wachstum von Mikroorganismen, z.B. SRB, welche die Korrosion verursachen, hemmen. Die Biologie von Bakterien wurde seit Jahrzehnten untersucht, wobei ein beachtlicher Wissensstand erreicht wurde, der Informationen umfasst, die verschiedene Bakterien betreffen, die dafür bekannt sind, dass sie antimikrobielle Mittel ausscheiden. Ein solches Bakterium, welches als Ergebnis einer induzierten Mutation das antibakterielle Mittel Gramicidin S überexprimiert, wird in den nachstehenden Beispielen noch weiter beschrieben und auf seine Fähigkeit getestet, die SRB-vermittelte Korrosion zu hemmen (Bakterien, die ein Mittel als Ergebnis einer chemischen Mutation überexprimieren, werden für die vorliegenden Zwecke als natürliche Ausscheider des Mittels angesehen). Andere Bakterien, von denen man weiß, dass sie antimikrobielle Mittel ausscheiden, können einfach getestet werden, um die Wirksamkeit ihrer Sekretionen gegen Mikroorganismen, z.B. SRB oder den Pilz Hormoconis resinae, die Korrosion verursachen, gemäß den Tests zu bestimmen, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben sind, oder wie es dem Fachmann bekannt ist.
  • 3. Rekombinant veränderte Ausscheider
  • a) Chemikalien, die durch das Bakterium, das als Ausscheider eingesetzt werden soll, nicht von Natur aus produziert werden
  • Es wird nicht immer der Fall sein, dass ein Bakterium gefunden werden kann, das von Natur aus ein bestimmtes antimikrobielles Mittel ausscheidet, oder dass die Bakterien, die das für eine bestimmte Anwendung gewünschte antimikrobielle Mittel von Natur aus ausscheiden, in der bestimmten Umgebung gedeihen können, der sie dann ausgesetzt wären. In diesen und anderen Fällen kann ein Bakterium, welches das in Frage kommende antimikrobielle Mittel nicht von Natur aus ausscheidet, durch Techniken der Rekombinations-Biologie so verändert werden, dass es das gewünschte antimikrobielle Mittel ausscheidet.
  • b) Chemikalien, die durch das Bakterium zwar von Natur aus produziert werden, jedoch jetzt in größeren Mengen oder konstitutiv
  • Rekombinations-Techniken können auch eingesetzt werden, um die Eigenschaften von Bakterien, die normalerweise antimikrobielle Mittel ausscheiden, gegen die SRB-vermittelte Korrosion zu verbessern, indem sie mit Konstrukten transfiziert werden, die das Gen für das Mittel in funktioneller Verknüpfung mit einem starken konstitutiven Promotor umfassen, um die Menge des ausgeschiedenen Mittel zu erhöhen oder um eine kontinuierliche Produktion eines Mittels bereitzustellen, das normalerweise diskontinuierlich oder nur als Antwort auf bestimmte Bedingungen der Umwelt oder auf bestimmte metabolische Bedingungen erzeugt wird. Andererseits kann das Gen, welches das antimikrobielle Mittel codiert, durch das Konstrukt unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden, so dass die Sekretion des Mittels gesteuert werden kann.
  • c) Einführen von DNA-Konstrukten in Bakterienzellen
  • Selbstverständlich sind dem Fachmann verschiedene Techniken zum Einführen einer DNA, die eine heterologe DNA umfasst, in Bakterienzellen bekannt. Ein Beispiel eines Verfahrens für diesen Zweck ist in den nachstehenden Beispielen beschrieben. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens zum Einführen einer solchen DNA in Bakterien und zum Erhalten ihrer Expression ist für die Durchführung der vorliegenden Erfindung nicht kritisch.
  • B. Auswahl einer antimikrobiellen Zusammensetzung
  • 1. Antimikrobielle Mittel
  • Dem Fachmann sind verschiedene antimikrobielle Mittel bekannt, die durch Bakterien produziert werden können. Nisin, z.B., ein aus 34 Aminosäuren bestehendes Peptid, das durch das Bakterium Lactococcus lactis ausgeschieden wird, wird als ein Konservierungsmittel von Nahrungsmitteln eingesetzt. Für ein 1700-Aminosäuren-Polypeptid, das durch das marine Bakterium sezerniert wird, das als D2 bekannt ist, wurde gezeigt, dass es eine allgemeine antimikrobielle Aktivität besitzt. Beliebige Vertreter dieser antimikrobiellen Mittel, die den Zielorganismus oder Organismen, z.B. SRB, hemmen, können in der Erfindung eingesetzt werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das antimikrobielle Mittel ein Peptidantibiotikum. Antimikrobielle Peptide können klein sein (typischerweise 10 bis 35 Aminosäuren), wobei kleine Substanzen einfacher in Bakterien cloniert werden können als viele herkömmliche Antibiotika, für die große Operons oder mehrere Stoffwechselwege erforderlich sein können, um die Expression eines einzigen Antibiotikums zu erreichen. Zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Stoffen sind dem Fachmann eine Reihe von Peptidantibiotika bekannt, z.B. Gramicidin S und D (die in den nachstehenden Beispielen besprochen werden). Jedoch können auch größere antibiotische Zusammensetzungen eingesetzt werden, wenn dies für die bestimmte, in Frage kommende Anwendung gewünscht wird, so lange sie in Bakterien in ausreichenden Mengen exprimiert werden können.
  • Außerdem können andere kleine Peptide verwendet werden, die normalerweise nicht als Antibiotika angesehen werden, die jedoch antimikrobielle Effekte aufweisen. Z.B. sind Indolicidin und Bactenecin kationische antimikrobielle Peptide aus Rinder-Neutrophilen, die dafür bekannt sind, dass sie gegen ein großes Spektrum von Organismen aktiv sind (ausführliche Informationen über diese Verbindungen, umfassend Referenzen auf die Literatur, sind in den nachstehenden Beispielen angegeben). Indolicidin ist das kleinste bekannte lineare antimikrobielle Peptid.
  • Die Auswahl der bestimmten antimikrobiellen Chemikalie liegt in der Entscheidung des Praktikers und hängt ab vom Zielorganismus, vom Organismus, der zum Ausscheiden des antimikrobiellen Mittels ausgewählt wurde, und von der Anwendung, in der der sezernierende Organismus eingesetzt werden soll. Das gewählte antimikrobielle Mittel sollte den Zielorganismus hemmen (z.B. sollte es Pilzwachstum hemmen, wenn der Zielorganismus ein Pilz ist, es sollte das Wachstum von Pseudomonas hemmen, wenn der Zielorganismus ein Pseudomonade ist, usw.. Beispielhafte Tests zum Bestimmen der Hemmwirkung von antimikrobiellen Mitteln auf Mitglieder einer Gruppe von Organismen sind in den Beispielen angegeben). Um die fortgesetzte Produktion des antimikrobiellen Mittels langfristig möglich zu machen, wirkt das gewählte antimikrobielle Mittel typischerweise stärker hemmend auf den Zielorganismus als auf den Organismus, der das antimikrobielle Mittel ausscheidet (manchmal als „Wirtsorganismus" bezeichnet, wenn der Organismus ein eingeführtes Gen exprimiert). Ein beispielhafter Test zum Bestimmen der Empfindlichkeit des Wirtsorganismus gegenüber einem antimikrobiellen Mittel ist in den Beispielen angegeben. Unter bestimmten Umständen kann es jedoch sein, dass eine fortgesetzte Produktion des antimikrobiellen Mittels nicht erforderlich ist, dass kein anderer Organismus verfügbar ist, der ein bestimmtes antimikrobielles Mittel ausscheidet oder dass es wünschenswert ist, die produzierende Art etwa zum gleichen Zeitpunkt zu entfernen, an dem die Zielart eliminiert oder gehemmt wird. In diesen Situationen kann ein antimikrobielles Mittel gewählt werden, das sowohl den Wirtsorganismus als auch den Zielorganismus hemmt.
  • Schließlich hängt die Auswahl des antimikrobiellen Mittels zum Teil von der vorgesehenen Anwendung ab. Indolicidin und Bactenecin sind z.B. antimikrobielle Mittel, die aus Rinder-Neutrophilen stammen. Ihre Freisetzung in die Umgebung könnte somit zur Entwicklung von Bakterienstämmen führen, die gegenüber diesen natürlichen antimikrobiellen Mitteln, die mindestens im Immunsystem von Rindern vorliegen, resistent sind, und könnte möglicherweise zur Entwicklung von Stämmen führen, die gegen ähnliche antimikrobielle Stoffe im menschlichen Immunsystem stärker resistent sind. Aus diesem Grund sind Indolicidin und Bactenecin keine bevorzugten antimikrobiellen Mittel für die Verwendung in offenen Systemen (d.h. in Systemen, in denen der sezernierende Organismus oder die sezernierten antimikrobiellen Mittel typischerweise in die Umgebung freigesetzt werden, z.B.
  • Wasserleitungen, Wasserableitungsrohren und dergleichen). Jedoch können diese Verbindungen in geschlossenen Systemen verwendet werden, d.h. in Systemen, bei denen die Organismen und die ausgeschiedenen antimikrobiellen Mittel typischerweise nicht in die Umgebung freigesetzt werden.
  • 2. Antikorrosive Mittel
  • a) Polypeptide
  • Aminosäuren, und insbesondere Glycin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, sind dafür bekannt, dass sie als Korrosionsinhibitoren wirken. Vgl. z.B. Kalota und Silverman, Corrosion 50(2): 138–145 (1994) (nachstehend: Kalota und Silverman) und dort zitierte Referenzen. Viele Aminosäuren tendieren jedoch dazu, mehr als nur eine Säure-Basen-Konstante sowie mehrere pK-Werte und unterschiedliche Ladungen zu haben, die vom pH-Wert ihrer Umgebung abhängig sind. Kalota und Silverman fanden, dass die Fähigkeit von Aminosäuren mit niedrigem Molekulargewicht, die Korrosion zu hemmen, vom pH-Wert abhängig war und dass die Korrosionsrate nur bei einem hohen pH-Wert (pH ≥ 10) signifikant reduziert war.
  • Wenn man sich auf Kalota und Silverman bezieht, wäre es wünschenswert, die Bakterien so zu verändern, dass sie Polyaspartat, Polyglutamat oder Polyglycin oder Polypeptide, die aus diesen drei Aminosäuren bestehen, als Korrosionsinhibitoren ausscheiden, wobei sie nur in Umgebungen verwendet werden, in denen der pH-Wert etwa 10 oder höher ist. Dies würde zwar bei einigen industriellen Anwendungen zutreffen, die Zahl der Fälle, in denen ein solch hoher pH-Wert vorliegt, ist jedoch wahrscheinlich ziemlich begrenzt.
  • Unsere eigenen Studien widersprechen Kalota und Silverman. Wir haben gefunden, dass z.B. Polyaspartat und Polyglutamat ein Metall bei so niedrigen pH-Werten wie pH 7 vor Korrosion schützen. Gemäß unseren Ergebnissen ist somit eine Hemmung der Korrosion möglich, wenn Bakterien Polypeptide ausscheiden, z.B. Polyaspartat, Polyglutamat (oder ihre entsprechenden Säuren oder Salze), Polyglycin oder Gemische dieser Aminosäuren, wenn der erwartete oder gemessene pH-Wert der Umgebung des Metalls etwa 7 oder höher ist. Demgemäß wird es die korrosionshemmende Wirkung eines aeroben Biofilms verstärken, wenn Organismen im Biofilm diese Polypeptide ausscheiden, wenn der pH-Wert etwa 7 oder höher ist.
  • b) Siderophore
  • Siderophore, z.B. Parabactin (isoliert aus Paracoccus denitrificans) und Enterobactin (isoliert aus E. coli), sind chelatbildende Mittel mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht, die durch Bakterien erzeugt und ausgeschieden werden, um Eisen(III)-ionen für den Transport in ihre Zellen zu solubilisieren (McCafferty und McArdle, J. Electrochem. Soc. 142: 1447–1453 (1995)). Diese Mittel wurden getestet, und dabei wurde gefunden, dass sie die Korrosion von Eisen hemmen. Id. Um die antikorrosive Wirkung eines Biofilms zu steigern, können die Gene für diese Mittel unter die Kontrolle eines starken konstitutiven Promotors gestellt und in höheren Raten als normal exprimiert werden, oder sie können in Bakterien eingeführt werden, die sie normalerweise nicht ausscheiden.
  • 3. Kombinationen von antimikrobiellen Mitteln, antikorrosiven Mitteln oder beiden
  • Es ist so zu verstehend, dass ein Bakterium, das in der Erfindung verwendet wird, so gestaltet werden kann, dass es mehr als ein antimikrobielles Mittel ausscheidet. Z.B. umfasste eine der in den Beispielen beschriebenen Studien die Verwendung eines Bacillus, der als Ergebnis einer Mutation Gramicidin S überexprimiert und der außerdem genetisch so verändert war, dass er ein weiteres antimikrobielles Mittel produziert. Die Verwendung von Bakterien, die zwei oder mehr antimikrobielle Mittel ausscheiden, ist wahrscheinlich vorteilhaft, da es hierdurch für den korrosionsverursachenden Zielorganismus (sei es ein SRB oder ein Pilz) schwieriger wird, eine Resistenz zu entwickeln.
  • Außerdem kann die Fähigkeit, die Korrosion zu hemmen, eines Bakteriums, das ein antimikrobielles Mittel ausscheidet, gesteigert werden, indem es so verändert wird, dass es auch ein antikorrosives Mittel produziert, z.B. Polyaspartat, Polyglutamat, Polypeptide, die aus diesen zwei Peptiden bestehen, oder Parabactin, Enterobactin oder ein anderes Siderophor. Als Anhaltspunkt für die Praxis kann gelten, dass die Begrenzung der Zahl von antimikrobiellen und antikorrosiven Mitteln, zu deren Produktion das Bakterium verändert werden kann, wahrscheinlich eine Kombination ist aus allen toxischen Effekten der antimikrobiellen Mittel auf die Wirtszelle und der Belastung des Stoffwechsels für die Wirtszelle beim Herstellen der ausgeschiedenen Substanzen. Da verschiedene Organismen unterschiedliche metabolische Wirkungsgrade aufweisen und da die Verfügbarkeit von Nährstoffen in der Umgebung wahrscheinlich eine Rolle spielt, kann die Bestimmung, wie viele Mittel durch die ausgewählten Bakterien ausgeschieden werden können, üblicherweise empirisch durchgeführt werden. Solche Bestimmungen können einfach durchgeführt werden, indem die Bakterien mit den gewünschten antimikrobiellen und antikorrosiven Mitteln in einem Medium, das die Nährstoffe enthält, die für die Stelle der vorgesehenen Verwendung erwartet werden, seriell transformiert werden, bis ein Punkt erreicht ist, an dem die Zielzellen vollständig gehemmt sind, und indem dann die beste Kombination ausgewählt wird aus (1) der Wettbewerbsfähigkeit der Wirtszellen in Bezug auf die natürliche Population des Biofilms und (2) der Fähigkeit der Wirtszellen, eine gewünschte Zahl von Mitteln auszuscheiden.
  • C. Bestimmung eines geeigneten Organismus für die vorgesehene Verwendung
  • 1. Selektion von Bakterien die bezüglich der Umgebung der vorgesehenen Verwendung exogen sind
  • Im Allgemeinen werden Organismen gemäß der vorgesehenen Verwendung so ausgewählt, dass sie antimikrobielle Mittel gegen SRB, Pilze oder andere Zielmikroorganismen ausscheiden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass aerobe Bakterien Oberflächen vor Korrosion und Abbau schützen; demgemäß sollte der gewählte Organismus ein Aerobier sein. Weiterhin muss der Organismus in der Lage sein, in der Umgebung der vorgesehenen Verwendung zu leben. Wenn z.B. die Aufgabe darin besteht, Stahl und Beton einer Brücke zu schützen, die in Meerwasser verankert ist und sich darüber erstreckt, sollte ein Organismus gewählt werden, der in der Lage ist, in Meerwasser oder Salzsprühnebel zu wachsen. Wenn andererseits die Aufgabe darin besteht, Rohre oder Leitungen zu schützen, die Süßwasser enthalten, das industrielle Abfälle umfasst, sollte der Organismus in der Lage sein, in Süßwasser und bei Vorliegen der zu erwartenden Abwässer zu wachsen. Zusätzlich sollte der Organismus in der Lage sein, bei den zu erwartenden Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen der vorgesehenen Umgebung zu wachsen. Da Bakterien nun schon fast hundert Jahre gründlich untersucht wurden, sind die Bedürfnisse und Toleranzen bezüglich Temperatur, pH-Wert und anderen Umweltfaktoren der meisten Arten bekannt und in der Literatur verfügbar.
  • Vorzugsweise sollte der Organismus in der Lage sein, unter den zu erwartenden Umwelt-Bedingungen eine schützende Wirkung gegen Korrosion auszuüben. Wir haben die Ergebnisse einer Studie veröffentlicht, in der wir die Effekte, Metall zu schützen, von 15 verschiedenen Bakterien, die sieben verschiedene Gattungen repräsentierten, in zwei unterschiedlichen Medien verglichen, von denen das eine Meerwasser und das andere ein Süßwassermedium nachahmte, das stark mit Nährstoffen belastet war, Jayaraman et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 48: 11–17 (1997c) (nachstehend: Jayaraman et al., 1997c). Das Ausmaß der Korrosionshemmung variierte zwischen den zwei Medien bei einigen der Bakterien deutlich, während zehn der getesteten Organismen das Metall in beiden Medium ausnehmend gut schützten. Id. auf S. 397. Ein Fachmann kann unter Verwendung der Tests dieser Studie einfach feststellen, ob eine bestimmte Bakterienart, die für die Verwendung in dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren oder als Teil des vorliegenden erfindungsgemäßen Systems vorgesehen ist, in der Lage sein wird, in dem von der vorgesehenen Umgebung präsentierten Medium zu wachsen, und ob der Organismus unter diesen Bedingungen gegen Korrosion schützen wird.
  • Außerdem ist es bevorzugt, wenn der Organismus in der Lage ist, in einem Biofilm zu wachsen. Häufig sind dies Organismen, die zum „Schleimen" in der Lage sind. Solche Gattungen sind z.B. Bacillus, Pseudomonas, Serratia und Escherichia (wobei jedoch Pseudomonas-Arten nicht für die Verwendung in Umgebungen, wie Kraftstofftanks der Luftfahrt, gewählt werden sollten, wo gefunden wurde, dass diese Organismen Korrosion verursachen, vgl. z.B. das Handbuch, vorstehend, auf S. 129). Ein beispielhaftes Verfahren, mit dem die Fähigkeit von ausgewählten Organismen bestimmt werden kann, Biofilme zu bilden, ist in Jayaraman et al., 1997c, vorstehend, beschrieben.
  • 2. Selektion von Bakterien, die bezüglich der Umgebung der vorgesehenen Verwendung endogen sind
  • Ein bevorzugtes Verfahren zum Selektieren geeigneter Bakterien in Verbindung mit Installationen, die bereits in Betrieb sind, besteht darin, die Natur dies tun zu lassen. Da Biofilme in der Natur überall vorhanden sind, werden Rohre, Leitungen, Wasserkühltürme, Kraftwerkreservoirs und ähnliche Einrichtungen und Installationen wahrscheinlich bereits vorliegende Biofilme aufweisen, die aus Organismen bestehen, die in der Natur schon auf ihre Fähigkeit selektiert wurden, in dieser Umgebung zu wachsen. Eine Probe dieser Organismen kann entnommen werden (z.B. durch Abschaben des Biofilms), sodann kann sie durch herkömmliche Verfahren gezüchtet und anschließend identifiziert werden. Wenn die identifizierten Arten anderweitig geeignet sind (sie sind z.B. einfach genetisch zu modifizieren, und es ist nicht bekannt, ob sie die Korrosion eher fördern als hemmen), können sie selbst modifiziert werden, so dass sie das gewünschte antimikrobielle Mittel ausscheiden. Jedoch können gegebenenfalls auch reine Kulturen der an der Stelle gefundenen Organismen käuflich erworben oder aus einer Stammkultur gezüchtet werden, statt dass Kulturen verwendet werden, die aus den an der Stelle gefundenen Organismen gezüchtet wurden.
  • Sobald die Organismen so modifiziert wurden, dass sie das ausgewählte antimikrobielle Mittel ausscheiden, können sie in die Leitung, das Rohr, den Turm oder eine andere Installation eingeführt werden. Die Einführung in die Installation kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren erfolgen, z.B. indem die Oberfläche in bestimmten Abständen abgeschabt wird, um einen Zwischenraum im Biofilm zu erzeugen, und ein Aliquot der Kultur auf die abgeschabte Stelle pipettiert wird. In einem bevorzugten Verfahren werden die Bakterien eingeführt, indem man einfach einen Wasser-„Stöpsel" (d.h. eine Ladung Wasser), enthaltend eine hohe Konzentration von Bakterien, über das Material laufen lässt, das geschützt werden soll. Die Bakterien werden sich überall dort, wo das Wasser vorbeiläuft, an den Biofilm anheften, und sie werden somit zu einem Teil des Biofilms, oder sie bilden einen Biofilm aus, falls noch keiner vorliegt.
  • D. Verfahren der Anwendung
  • 1. Anwendung von Organismen, bevor die Installation in Betrieb genommen wird
  • Unsere Forschungsarbeiten haben gezeigt, dass die Verringerung des mit SRB zusammenhängenden Abbaus einer Oberfläche erfolgreicher ist, wenn die Besiedelung der Oberfläche durch SRB verhindert wird, als wenn versucht wird, die Besiedelung, die bereits stattgefunden hat, zu entfernen. Demgemäß besteht ein bevorzugtes Verfahren zum Durchführen der Erfindung darin, ein korrosions- oder abbauempfindliches Material mit Bakterien zu behandeln, die geeignete antimikrobielle Mittel ausscheiden, z.B. solche, die für die Hemmung des Wachstums von SRB geeignet sind, und zwar bevor die Ausrüstung, das System oder die Installation in Betrieb genommen wird.
  • Wenn das ausgewählte Bakterium ein Sporenbildner ist, kann der Organismus unter Bedingungen gezüchtet werden, die eine Sporenbildung auslösen, die Sporen können sodann vor der Verwendung auf die trockene Oberfläche der Installation aufgetragen werden und die Oberfläche kann dann, direkt bevor die Installation in Betrieb genommen wird, benetzt werden, um die Sporen zu aktivieren. Wenn das Bakterium kein Sporenbildner ist oder wenn es z.B. aufgrund von Zeitmangel ungünstig ist, das sporenbildende Bakterium erst dazu zu bringen, Sporen zu bilden, können Medien, die die Bakterien enthalten, durch ein beliebiges geeignetes Verfahren auf die Oberfläche aufgebracht werden, z.B. durch Aufstreichen, Aufsprühen, Vernebeln, Pipettieren, Spritzen oder Tröpfeln der Kultur auf die Oberfläche.
  • Wenn die Oberfläche unregelmäßig ist oder Kerben und Risse aufweist, ist das Besprühen oder Benebeln der Oberfläche bevorzugt, da hierdurch eine bessere Beimpfung der Kerben und Risse ermöglicht wird. Einige Installationen, z.B. Springbrunnen im Freien, Wasserkühltürme, Heizungs- und Kühlsysteme und dergleichen, sind so gestaltet, dass Wasser, Öl oder andere Flüssigkeiten durch das System zirkulieren. Solche Installationen können bequem beimpft werden, indem zuerst eine Ladung Wasser beimpft wird, die dann zum Füllen oder Durchspülen des Systems verwendet wird. Auch andere Systeme, z.B. Rohre, die offen sind oder die in das System eingebrachte Flüssigkeit in anderer Art nicht zirkulieren, können auf diese Weise beimpft werden.
  • 2. Anwendung von Organismen, nachdem die Installation in Betrieb genommen wurde
  • Es ist schwierig, SRB zu entfernen, die sich bereits in einem Biofilm etabliert haben. In einigen Fällen kann es möglich sein, die Gesamtheit oder einen Teil einer Apparatur, Ausrüstung oder Installation abzubauen und die Gesamtheit oder einen Teil der Oberfläche z.B. mit konzentrierten Bioziden oder mit "frei durchströmendem" ("live") Dampf zu sterilisieren. In anderen Fällen ist es möglich, dass Installationen, die nicht abgebaut werden können, mit starken Bioziden oder mit frei durchströmendem Dampf durchgespült werden, um den Biofilm abzutöten. Installationen, die auf diese Weise behandelt wurden, können dann durch die gleichen Verfahren beimpft werden, die im vorstehenden Abschnitt zur Behandlung vor der Verwendung beschrieben sind.
  • Für Installationen, die so nicht behandelt werden können oder in denen der Biofilm nicht wirksam entfernt werden kann, kann der vorliegenden Biofilm zum Vorteil genutzt werden, indem die bereits vorliegenden Organismen so modifiziert werden, dass sie die gewünschten antimikrobiellen Mittel ausscheiden, wie vorstehend beschrieben. Die Bakterien, welche die gewünschten Mittel sezernieren, können sodann wieder in den Biofilm eingeführt werden. Gegebenenfalls können die Organismen einfach in die Flüssigkeit oder andere Medien zugegeben werden, oder sie können auf die Oberfläche aufgestrichen oder aufgesprüht werden. Die Bakterien können erfolgreicher eingeführt werden, indem der Biofilm vor dem Einführen der neuen Bakterien abgeschabt oder auf andere Weise aufgerissen wird, um einen Raum zu schaffen, in dem sie sich selbst etablieren können.
  • E. Verwendung der Erfindung
  • 1. Geschlossene Systeme
  • Es gibt eine große Zahl von geschlossenen Systemen (d.h. Systeme, die ihren Inhalt nicht routinemäßig in die Umwelt abgeben), die in der Industrie, im Handel und Versorgungsunternehmen in Verwendung sind. Beispiele umfassen Vorratsgefäße aus Stahl, die üblicherweise an Ort und Stelle druckgetestet werden und dann zur langfristigen Lagerung von Flüssigkeiten eingesetzt werden, Wasserkühltürme, die sowohl in Kraftwerken als auch in Heizungs- und Kühlsystemen von Werken, Bürogebäuden und anderen gewerblichen Gebäuden verwendet werden, Wärmetauscher (von denen schon bekannt war, dass sie aufgrund einer mit SRB zusammenhängenden Korrosion versagen) und Feuerbekämpfungssysteme. In diesen Systemen werden typischerweise Rohrleitungen und Lagerbehälter aus Metall verwendet. Aerobe Bakterien, die geeignete antimikrobielle Mittel oder Anti-Korrosions-Mittel oder beides ausscheiden, können in diesen Vorrichtungen verwendet werden, um einen Biofilm mit einer gesteigerten Fähigkeit zur Hemmung einer mit SRB zusammenhängenden Korrosion zu bilden. Behälter, die zur Lagerung von Flüssigkeiten verwendet werden, die für den menschlichen Verzehr bestimmt sind, z.B. Milch und Bier, und die regelmäßig sterilisiert werden, z.B. durch Kontakt mit frei durchströmendem Dampf, werden jedoch typischerweise nicht durch die Verwendung der Erfindung gegen Korrosion geschützt.
  • Auch Luftfahrt- und andere Kraftstofftanks stellen geschlossene Systeme dar. Wie schon früher angemerkt, kann die Korrosion in diesen Systemen durch eine Verunreinigung durch Bakterien (Pseudomonaden) oder Pilze verursacht werden. In dieser Verwendung kann ein Bakterium, z.B. Serratia, das so modifiziert ist, dass es ein Anti-Pilz-Mittel oder ein antimikrobielles Mittel ausscheidet, das den Zielorganismus hemmt (z.B. einen Pseudomonaden), eingeführt werden, um die durch diese Ursachen ausgelöste Korrosion zu reduzieren. Für einen fortgesetzten Schutz des Systems ist es im Allgemeinen wünschenswert, dass das für die Sekretion gewählte antimikrobielle Mittel für den Organismus, der es ausscheidet, weniger toxisch ist als für den Pilz, Pseudomonaden oder anderen Zielorganismus.
  • 2. Offene Systeme
  • Systeme, die routinemäßig oder regelmäßig ihren Inhalt in die Umwelt abgeben (mit oder ohne eine zwischenzeitliche Behandlung), können als offene Systeme angesehen werden. Solche Systeme umfassen kommunale Abwasseranlagen, Regenwasserableitungssysteme und Wasserableitungssysteme, die typischerweise Leitungen aus Beton umfassen, die relativ lang oder wiederholt in Wasser oder anderen Flüssigkeiten getaucht oder einem Kontakt mit diesen ausgesetzt sind. An solchen Leitungen findet eine mit SRB zusammenhängende Korrosion statt, die auf der Bildung von Schwefelsäure durch schwefeloxidierende Bakterien aus dem durch SRB erzeugten Hydrogensulfid beruht. Demgemäß kann die Hemmung von SRB in diesen und ähnlichen Betonleitungen durch die Erfindung die Korrosion dieser Strukturen herabsetzen.
  • 3. Strukturen, die der Umgebung ausgesetzt sind
  • Eine große Zahl von Metall- und Betonstrukturen, z.B. Brücken, Eisenbahnbrücken, Straßenüberführungen und dergleichen, sind der Umgebung ausgesetzt, wobei ein häufiger oder dauernder Kontakt mit Wasser vorliegt, wodurch die Entwicklung von Biofilmen auf der Oberfläche ermöglicht wird. Eine mit SRB zusammenhängende Korrosion dieser Strukturen kann durch die Verwendung der Erfindung gehemmt werden.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sollen lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen und sie in keiner Weise einschränken.
  • Beispiel 1: Architektur des Biofilms und Korrelation zur Hemmung der Korrosion
  • Die Hauptaufgaben der vorliegenden Studie bestanden darin, die Architektur des schützenden Biofilms zu charakterisieren und den Zusammenhang zwischen den Bestandteilen des Biofilms und der Hemmung der Korrosion aufzuklären. Biofilme wurden auf lebende Zellen, tote Zellen und Exopolysaccharide angefärbt, sodann unter Verwendung der konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie („confocal scanning laser microscopy", „CSLM") sichtbar gemacht und quantitativ bestimmt, so dass Tiefenprofile erhalten wurden. Die Wirkung von steigenden Temperaturen und Salzgehalt des Wachstumsmediums sowohl auf die Zusammensetzung des Biofilms als auch auf die Hemmung der Korrosion wurde untersucht.
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme, Wachstumsmedien und Kulturbedingungen
  • Eine Kanamycin-resistente Transposon-Mutante des aus verdorbenem Fleisch stammenden Bakteriums P. fragi ATCC 4973 („P. fragi K") (Jayaraman, A., et al., 1997a) und ein Tetracyclin-resistentes Enterobakterium, E. coli DH5α (pKMY319) (Jayaraman, A., et al., 1997a) wurden aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen verwendet (Parolis, L. A. S., et al., Carbohydrate Research 216: 495–504 (1991); Huang, C.-T., et al., Biotechnology and Bioengineering 41: 211–220 (1993)). Beide Stämme wurden ohne Schütteln bei 23°C oder bei 30°C in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben zusammen mit mehreren Kupons aus dem Metall SEA 1018 in 35 ml Luria-Bertani-Medium (nachstehend „LB") (Maniatis, T., et al., „Molecular Cloning: A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1982)) (nachstehend: Maniatis et al., 1982) und Vaatanen-Neun-Salze-Lösung („VNSS", Hernandez, G., et al., Corrosion 50: 603–608 (1994)) (nachstehend: Hernandez et al., 1994), angereichert mit 50 μm/ml Kanamycin (Jayaraman, A., et al., 1997a) oder 25 μg/ml Tetracyclin (Yen, K.-M., Journal of Bacteriology 173: 5328–5335 (1991)) gezüchtet. Alle Stämme stammten von einer bei –85°C gehaltenen Glycerin-Stammkultur und wurden auf LB-Agarplatten mit geeigneten Antibiotika ausgestrichen. Danach wurde eine Einzelkolonie herausgegriffen und zum Beimpfen von 10 ml Wachstumsmedium mit geeigneten Antibiotika verwendet und anschließend über Nacht bei 30°C und 250 UpM gezüchtet (Schüttler der Serie 15, New Brunswick Scientific Edison, NJ). Für die Korrosionsexperimente wurde zum Entwickeln von Biofilmen eine 0,1% Impfkultur (350 μl) verwendet. Das Medium wurde ergänzt, indem das alte Medium langsam entfernt und frisches Medium vorsichtig entlang der Wände des Erlenmeyer-Kolbens zugegeben wurde.
  • Herstellung der Metallkupons und Bestimmung des Massenverlusts
  • Kupons aus dem Stahl SEA 1018 mit einem Gewicht von 5,1 Gramm und einem Durchmesser von 25,5 mm und einer Dicke von 1,2 mm wurden aus einer Stammplatte ausgeschnitten, mit einem Schleifpapier mit Körnungsnummer 240 (Buehler, Lake Bluff, IL) fein abgeschliffen und dann, wie früher beschrieben, zubereitet (Jayaraman et al., 1997a). Der festgestellte spezifische Massenverlust (mg/cm2) wurde bestimmt, indem der Wert durch den gesamten Oberflächenbereich des Kupons (11,18 cm2) geteilt wurde, und diente sodann als ein Indikator des Ausmaßes der Korrosion (Jayaraman et al., 1997a). Alle Korrosionsexperimente wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
  • Konfokale Laser-Raster-Mikroskopie (CSLM) und Bestimmung der Dicke des Biofilms
  • Metallkupons mit den an der Oberfläche haftenden Biofilmen wurden aus den Erlenmeyer-Kolben entnommen und einmal in 0,85% NaCl eingetaucht, um die Hauptmasse der im Überstand vorliegenden Zellen zu entfernen. Die Zellen und das Polysaccharid wurden 30 Minuten gleichzeitig in 4 ml Färbelösung angefärbt, wobei das Protokoll des Kits des Live/Dead Baclit-Tests auf Lebensfähigkeit der Bakterien (1,125 μl/ml von jeder Färbekomponente, Molecular Probes (Eugene, OR)) und Calcofluor (300 μg/ml, Sigma (St. Louis, MO), Stewart et al., 1995) verwendet wurde. Das Live/Dead-Lebensfähigkeitskit unterscheidet lebende und tote Zellen aufgrund der Membranintegrität; lebende Zellen mit intakten Membranen werden grün gefärbt, während tote Zellen mit beschädigen Membranen rot gefärbt werden. Die gefärbten Kupons wurden auf den Objekttisch eines konfokalen Laser-Raster-Mikroskops (MRC 600, Bio-Rad, Hercules, CA) gelegt, das mit einem Krypton/Argon-Laser und einer 60x 1,4 NA Ölimmersionslinse ausgestattet war. Um die Beschädigung des Biofilms beim Überführen auf den Objekttisch des Umkehrmikroskops möglichst gering zu halten, wurde ein Deckgläschen mit 1,8 cm Durchmesser (runde Deckgläschen Nr. 1, 1,3 bis 1,7 cm dick, Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) vorsichtig auf den Kupon gelegt (gehalten durch Kapillarwirkung), und der Kupon (2,55 cm Durchmesser) wurde durch die ringförmige Blende des Mikroskops (Durchmesser 2,0 cm) im Bereich außerhalb des Deckgläschens festgehalten. Der mittlere Bereich des Biofilms wurde durch das Gewicht des Kupons nicht zusammengedrückt, und nur dieser Bereich wurde mikroskopisch abgebildet.
  • Die Probe wurde bei 488 nm angeregt und das fluoreszierende Licht unter Verwendung einer K1/K2-Filterblock-Kombination abgebildet. Die Biofilme wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops MRC 1024 (Bio-Rad, Hercules, CA) mit einer T1/E2-Mehrzweck-Filterkombination analysiert. Dünne optische Schnitte (horizontale Schnitte) von 0,5 bis 1,0 μm wurden über die ganze Dicke des Biofilms gelegt, um eine repräsentative Position auszuwählen (ausgewählt als eine von vier ähnlichen Positionen im Biofilm auf dem gleichen Kupon). Die Dicke des Biofilms wurde bestimmt, indem auf den oberen und den unteren Rand des Biofilms fokussiert wurde, wobei der zurückgelegte Abstand um den Brechungsindex korrigiert wurde (Bakke, R., und Olsson, P. Q., Journal of Microbiological Methods 6: 93–98 (1986)), und die Dicke wurde als Durchschnitt der vier ähnlichen Positionen bestimmt wurde, die auf dem gleichen Kupon analysiert wurden.
  • Bildanalyse
  • Die Bildbearbeitung und Bildanalyse aller Biofilme erfolgten mit der COMOS-Software, die auf dem Bio-Rad MRC600 verfügbar ist. Optische Schnitte wurden aufgrund von Pixel-Intensitäten differenziert, so dass lebende und tote Zellen, Polysaccharid und Leerraum unterschieden werden konnten. Danach wurde der prozentuale Anteil jeder Schnittfläche, die von einem bestimmten Bereich von Pixel-Intensitäten bedeckt war, gemessen, um die relativen Anteile der Komponente in jedem Abschnitt zu erhalten; diese relativen Anteile von jeder Komponente wurden als Funktion der normalisierten Tiefe aufgetragen (Tiefe, bei der das Bild erhalten wurde, geteilt durch die Gesamtdicke des Biofilms). Demgemäß stellt die Position 0,0 die Grenzfläche von Flüssigkeit und Biofilm dar, und die Position 1,0 stellt die Grenzfläche von Biofilm und Metall dar.
  • Ergebnisse
  • Hemmung der Korrosion mit P. fragi und E. coli
  • Der Massenverlust in LB-Medium und in VNSS-Medium mit P. fragi K oder E. coli DH5α (pKMY319) wurde acht Tage in stationären Batch-Kulturen bei 23°C und bei 30°C untersucht, wobei das Wachstumsmedium entweder täglich ergänzt oder acht Tage unverändert belassen wurde. Die in den Bakteriensuspensionen eingelegten Metallkupons zeigten im Vergleich zu Kupons, die in sterilen Medien eingelegt waren, nach acht Tagen eine 2,3- bis 6,9-fache Abnahme im Massenverlust. Diese Ergebnisse stimmten gut mit denen von Jayaraman et al. (1997a) und Pedersen und Hermansson (1989) überein, die von einer achtfachen Reduktion der Korrosion von Stahl SIS 1146 unter Verwendung von Pseudomonas S9 und Serratia marcescens nach 19 Tagen Exposition in VNSS-Medium berichteten. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass kein Unterschied in der Korrosion von Stahlkupons SAE 1018 in sterilem frischem LB-Medium und in gebrauchtem filtriertem LB-Medium vorlag (Jayaraman, 1997a).
  • Der in acht Tagen erfolgte Massenverlust, der mit P. fragi K und mit E. coli DH5α festgestellt wurde, variierte mit dem Wachstumsmedium und der Züchtungstemperatur. Der gesamte Massenverlust war bei der niedrigeren Temperatur für beide Medien geringer; jedoch war die Hemmung der Korrosion (als prozentuale Reduktion im Massenverlust der sterilen Kontrolle) bei der höheren Temperatur in beiden Medien vergleichbar oder höher. Der Massenverlust war mit beiden Stämmen bei beiden Temperaturen in LB-Medium geringer als in VNSS-Medium. Die tägliche Ergänzung des Mediums beeinflusste die Hemmung der Korrosion nicht signifikant, mit Ausnahme von P. fragi K in VNSS-Medium bei 30°C, wo die Korrosion fast 2,3-fach stärker gehemmt wurde. Unabhängig von einer Ergänzung des Mediums führte E, coli DH5α (pKMY319) bei 23°C zu einem höheren Massenverlust als P. fragi K, während der Massenverlust in Gegenwart der beiden Stämme bei 30°C vergleichbar war. Sterile Kontrollen korrodierten im gleichen Ausmaß, unabhängig davon, ob das Medium täglich ersetzt wurde.
  • Metallkupons korrodierten in den meisten Bakteriensuspensionen während der ersten vier Tage mit einer Rate von etwa 0,03 bis 0,06 mg/cm2 pro Tag. Die Korrosionsrate nahm nach vier Tagen ab. Sterile Kontrollen korrodierten in VNSS-Medium bei beiden Temperaturen mit einer etwas schnelleren Rate als in LB-Medium, wobei die Korrosionsrate im ganzen Zeitraum von acht Tagen relativ gleichmäßig war.
  • Bestimmung der Dicke des Biofilms durch CSLM
  • Mehrere Kupons wurden nach zwei, drei, vier und acht Tagen aus dem Medium entnommen, auf Zellen und Polysaccharid gleichzeitig angefärbt und durch CSLM analysiert. Die Biofilme zeigten unter einer 100 × Vergrößerung (kein Deckgläschen) und einer 600 × Vergrößerung (mit Deckgläschen) ein ähnliches Tiefenprofil von lebenden und toten Zellen und von Polysaccharid.
  • Sowohl P. fragi K- als auch E. coli DH5α(pKMY319)-Biofilme entwickelten sich innerhalb der ersten 48 Stunden des Kontakts mit Wachstumsmedien zu einer nachweisbaren Dicke (etwa 10 bis 15 μm) (Ergebnisse nicht dargestellt). P. fragi K-Biofilme variierten bei unterschiedlichen Temperaturen, Medien und bei der Ergänzung des Mediums nicht signifikant in der Dicke, und der Biofilm war nach vier Tagen etwa 14 μm dick; die Dicke des Biofilms betrug nach acht Tagen Kontakt etwa 12 μm. E. coli DH5α (pKMY319) zeigte eine ähnliche Tendenz, wobei ein vier Tage alter Biofilm (13 μm) etwas dicker war als ein acht Tage alter Biofilm (etwa 11 μm).
  • Charakterisieren der Biofilme
  • P. fragi K- und E. coli DH5α (pKMY319)-Biofilme in LB- und in VNSS-Medium mit und ohne Ergänzung des Mediums bei 23°C und bei 30°C wurden charakterisiert und analysiert, wobei die Bildanalyse verwendet wurde, um normalisierte Vier-Tage-Tiefenprofile zu erzeugen.
  • Als Kontrollexperiment, um zu bestätigen, dass die Lebend/Tot-Färbung verwendet werden kann, um Populationen mit lebenden und toten Zellen quantitativ zu bestimmen, wurden 200 μg/ml Kanamycin zu einer 12-Stunden-Kultur von P. fragi K-Wildtyp zugegeben und nach 48 Stunden mit CSLM visualisiert. Die Probe war hauptsächlich rot (etwa 75%), mit einigen wenigen grünen und gelben Zellen. Außerdem wurde die Biofilm-Probe auf LB-Agarplatten ausgestrichen, und ein minimales Wachstum konnte entlang der Linie des Hauptstrichs festgestellt werden (wohingegen Zellen, die keinem Antibiotikum ausgesetzt worden waren, als ein Rasen von Bakterien entlang des Hauptstrichs wuchsen). Somit kann die Färbung zum Identifizieren und quantitativen Bestimmen von toten Zellen verwendet werden.
  • Horizontale Tiefenschnitte wurden mit dem konfokalen Mikroskop von P. fragi K- und E. coli DH5α (pKMY319)-Biofilmen alle 0,1 μm Tiefe aufgenommen, und die Verteilung von lebenden Zellen, toten Zellen, Exopolysaccharid (EPS) und Leerräumen wurde bestimmt. Sowohl P. fragi K- als auch E. coli DH5α (pKMY319)-Biofilme bestanden in der Nähe der Metalloberfläche aus gleichmäßigen Schichten von Zellen und Polysaccharid (sofern es vorlag). Das Verhältnis der zellulären Substanz (lebenden oder toten Zellen) zu der nicht-zellulären Substanz (Polysaccharid und Wasserkanäle) variierte bei allen Biofilmen mit der Tiefe. Biofilme von beiden Stämmen zeigten eine pyramidenförmige Architektur, mit einer dichten Konzentration von Zellen in der Nähe des Bodens des Biofilms (Grenzfläche von Biofilm und Metall) und einer spärlichen Verteilung von Zellen in der Nähe der Grenzfläche von Biofilm und Flüssigkeit. Dies stimmt mit Lawrence et al., J. Bacteriol. 173: 6558–6567 (1991), überein, die eine ähnliche pyramidenförmige Struktur für P. fluorescens- und P. aeruginosa-Biofilme beschrieben, die sich auf Glasobjektträgern in komplexem und minimalem Medium mit kontinuierlichen Kulturen entwickelt hatten. In der hier beschriebenen Arbeit bestanden die oberen Schichten des Biofilms hauptsächlich aus lebenden Zellen, und die Dichte der lebenden Zellen nahm in der Nähe der Metalloberfläche ab. Polysaccharid (sofern es vorlag) wurde üblicherweise in der Nähe des Bodens des Biofilms nachgewiesen (typischerweise 3 μm von der Metalloberfläche entfernt). Dicke Klumpen von lose assoziierten lebenden und toten Zellen (15 bis 40 μm dick) lagen oben auf dem Biofilm vor (an der Grenzfläche von Biofilm und Flüssigkeit) und wurden bei der Bestimmung der Dicke des Biofilms nicht berücksichtigt. E. coli DH5α (pKMY319)-Biofilme wiesen außerdem eine dünne Schicht mit Schleim auf, die die Metallkupons nach acht Tagen Kontakt mit Wachstumsmedium bedeckte und die während des Färbeverfahrens nicht oben auf dem Metallkupon erhalten werden konnte.
  • Die Vier-Tage-Tiefenprofile von P. fragi K in LB- und in VNSS-Medium bei 30°C wurden bestimmt. Mehr Zellen wurden in P. fragi K- und E. coli DH5α Biofilmen nachgewiesen, die bei 30°C in LB-Medium gewachsen waren, als in denen, die in VNSS-Medium gewachsen waren. Außerdem wurde mehr Zellmasse mit P. fragi K bei höheren Temperaturen in LB-Medium gebildet, da bei 23°C 50% des Biofilms aus lebenden und toten Zellen bestand, wohingegen Biofilme, die bei 30°C gewachsen waren, 90% lebende und tote Zellen aufwiesen. In Biofilmen, die sich in VNSS-Medium entwickelt hatten, machte das Polysaccharid etwa 10 bis 55% des Biofilms aus, während in LB-Medium weniger als 5% EPS nachgewiesen wurde.
  • Durch tägliches Ersetzen des Mediums änderten sich die relativen Anteile der Bestandteile des Biofilms signifikant; typischerweise wurden unter allen Bedingungen im Biofilm mehr lebende Zellen nachgewiesen. Auch die Architektur des Biofilms ändert sich mit der täglichen Zugabe von frischem Medium, wobei in allen Tiefen des Biofilms nahezu gleiche Anteile von Zellen anstatt einer pyramidenförmigen Architektur festgestellt wurden. Das Verhältnis von zellulärem Material zu nicht- zellulärem Material blieb im ganzen Biofilm für die meisten Bedingungen relativ konstant, und das Polysaccharid wurde nur in VNSS-Medium festgestellt. Das Ausmaß der Polysaccharid-Produktion (sofern es vorlag) war größer, wenn das Medium ergänzt wurde. An den oberen Schichten des Biofilms wurde ein geringeres Verklumpen festgestellt, und auch der Anteil von lebenden Zellen nahm in Richtung zum Boden des Biofilms nicht signifikant ab.
  • Schlussfolgerung
  • Die CSLM-Bildanalyse der Biofilme und die quantitative Bestimmung der relativen Verhältnisse von lebenden Zellen, toten Zellen, EPS und Leerraum zeigten, dass die maximale Zelldichte (lebende und tote Zellen) nach vier Tagen Kontakt erhalten wurde und dass sie jenseits der vier Tage abnahm. Deshalb wurden Biofilme aus vier Tage alten Batch-Kulturen von P. fragi K und E. coli DH5α (pKMY319), die in LB-Medium und in VNSS-Medium auf Metallkupons gewachsen waren, für die weitere Charakterisierung und für den Vergleich mit vier Tage alten Biofilmen ausgewählt, die unter täglichem Ergänzen des Medium gewachsen waren.
  • Die Zusammensetzung der Biofilme hing vom Wachstumsmedium, von der Züchtungstemperatur und vom Ergänzen des Mediums ab. Die Entwicklung von Biofilmen in LB-Medium jenseits von vier Tagen zeigte eine Abnahme der Zellzahl; dies legt nahe, dass die Abwesenheit einer Polysaccharid-Matrix eine Ablösung der Zellen verursacht. In VNSS-Medium waren die Zellen in einer Polysaccharid-Matrix eingebettet und zeigten eine geringere Tendenz, sich von der Metalloberfläche abzulösen, wenn sie länger als acht Tage Kontakt hatten (nicht gezeigt). Dies stimmt gut mit Dewanti und Wong, Int'I. J. Food. Microbiol. 26: 147–164 (1995), überein, die eine ähnliche Biofilmstruktur mit E. coli O157:H7 feststellten, der in Trypticase-Sojabrühe und Minimalmedium gezüchtet wurde. Weiterhin war die Physiologie und Zellmorphologie der Biofilmbakterien in Biofilmen unterschiedlich, die sich in verschiedenen Medien und bei verschiedenen Temperaturen entwickelt hatten. P. fragi K- und E. coli-Biofilme, die sich in LB-Medium entwickelt hatten, wurden als kleine und getrennte Zellen festgestellt; im Gegensatz dazu lagen die Biofilme in VNSS-Medium verlängert und in Klumpen vor, möglicherweise als Antwort auf den Stress der Umgebung.
  • Das tägliche Ergänzen von Wachstumsmedium verursachte über die ganze Tiefe des Biofilms eine kleine Abnahme des Gehalts an Zellen, und außerdem wurde ein geringeres Klumpen festgestellt. Die kontinuierliche Verfügbarkeit von Nährstoffen könnte möglicherweise die Anlagerung von metabolisch aktiven Zellen an den Biofilm verstärken, so dass an der Oberfläche des Biofilms Zellen zugefügt werden, wodurch die verlorenen Zellen ersetzt werden; dies stimmt mit den Beobachtungen von Costerton (1995) überein. Dass kein Verklumpen an der Grenzfläche von Biofilm und Flüssigkeit stattfindet, könnte auch durch die minimale Störung der Biofilm-Architektur durch die tägliche Zugabe von frischem Wachstumsmedium und das Färbungsverfahren erklärt werden.
  • Die Eigenschaften des Biofilms (festgestellt durch CSLM) zeigen im Vergleich zu den Korrosionsergebnissen, dass ein Ansteigen der Gesamtzellen im Biofilm die Hemmung der Korrosion steigert. Ein Erhöhen der Temperatur von 23°C auf 30°C führte bei der sterilen Kontrolle zu einem Anstieg der Korrosion von 100% und bei sechs von acht untersuchten Bedingungen (zwei Bakterien, zwei Medien und zwei Temperaturen) zu einem 1,6- bis 4,1-fachen Anstieg der Zellmasse (berechnet als Durchschnitt der gesamten lebenden und toten Zellen im gesamten Tiefenprofil des Biofilms). Entsprechend diesem Anstieg in der Zellmasse und Temperatur gab es bei sechs von acht Biofilm-Bedingungen nur einen Anstieg der Korrosion von 22% (für E. coli DH5α in VNSS-Medium mit täglichem Ergänzen stieg die Korrosion um 100 an; und für P. fragi K in VNSS-Medium ohne Ergänzen stieg die Korrosion um 230 an). Somit nahm bei steigenden Temperaturen im Allgemeinen die Zellmasse zu, und der Anstieg der Korrosion war bei Kupons, die durch Biofilme geschützt waren, viel geringer als der Anstieg, der bei sterilen Medien festgestellt wurde (22% gegenüber 100%).
  • Frühere Arbeiten in unserem Labor über die Hemmung der Korrosion mit sieben sich stark unterscheidenden Bakteriengattungen (mit unterschiedlichen Graden der Biofilm-Bildung) bestätigen, dass ein homogener Biofilm erforderlich ist (Jayaraman et al., 1997b): Metallkupons, die mit Bakteriensuspensionen von Streptomyces in Kontakt gebracht wurden (der einen spärlichen Biofilm bildete, wobei die Zellen in Klumpen verteilt waren), korrodierten mit einer Rate, die mit sterilen Kontrollen vergleichbar war. Da jedoch das Verhältnis der Korrosion in dieser Studie nach vier Tagen mit P. fragi zu der Korrosion in einer ähnlichen sterilen Kontrolle bei 23°C und bei 30°C in LB-Medium und in VNSS-Medium vergleichbar ist, wird durch den Biofilm eine ähnliche Hemmung der Korrosion geboten, auch wenn die Dicke, Zusammensetzung und Eigenschaften des Biofilms unter den vier Bedingungen extrem verschieden sind. Somit scheint, dass für die Hemmung der Korrosion eine bestimmte Mindestdicke oder Mindestdichte des Biofilms erforderlich ist. Ähnliche Ergebnisse wurden mit E. coli in VNSS-Medium bei 30°C erhalten.
  • Wenn das Wachstumsmedium täglich ergänzt wurde, war es interessant festzustellen, dass nur in VNSS-Medium bei 30°C signifikante Unterschiede in der Hemmung der Korrosion zu sehen waren. Abgesehen von einem Zunehmen oder Abnehmen der Dicke des Biofilms besteht einer der Hauptunterschiede, der beim Austauschen des Mediums festgestellt wurde, in der Zunahme der Gleichförmigkeit der Verteilung der Zellen im ganzen Biofilm und in einem Anstieg des relativen Mengenverhältnisses der lebenden Zellen. Diese gleichförmige Schicht von Zellen könnte die Menge an Sauerstoff herabsetzen, der an der Metalloberfläche für den Korrosionsprozess verfügbar ist, und dadurch die Korrosion hemmen. Die fehlende signifikante Änderung der Korrosionshemmung im Vergleich zu nicht ergänztem Medium bei anderen Bedingungen legt außerdem nahe, dass es für die Korrosionshemmung durch ein bestimmtes Bakterium eine obere Grenze gibt, die in einem gleichmäßigen Biofilm durch eine Mindestzahl von aktiv atmenden Zellen schnell erreicht wird.
  • Beispiel 2: Biofilme können die Korrosion von Kupfer und Aluminium hemmen
  • Dieses Beispiel zeigt, dass Biofilme die Korrosion von Kupfer und Aluminium hemmen können.
  • Die Toxizität von Kupfer gegenüber Mikroorganismen hat zu der Annahme geführt, dass eine durch Mikroorganismen induzierte Korrosion (MIC) von Kupfer nicht signifikant ist (Iverson, 1987). Jedoch kann das durch Mikroorganismen erzeugte Ammoniak und die durch Thiobacillus und sulfatreduzierende Bakterien (SRB) hergestellte Schwefelsäure die Korrosion von Kupferlegierungen verursachen (Iverson, 1987; Wagner und Little, 1993). Wagner und Little stellten fest, dass das Vorliegen eines Biofilms auf Kupfer charakteristische Belüftungszellen und Chloridgradienten erzeugt, die Lochfraß auslösen können (Wagner und Little, 1993). Die Korrosion von Kupferlegierungen ist ein Problem in Wärmtauscher-Rohren, Meerwasser-Leitungen von Schiften und Kraftstofftanks von Flugzeugen (Iverson, 1987; Miller, 1981). Iverson erwähnt außerdem, dass die Korrosion von Kupfer in Süßwasser und in Meerwasser durch die Zugabe von Bakterien gehemmt wurde und dass die Korrosion zunahm, nachdem die Bakterien abgestorben waren (Iverson, 1987).
  • Die Bildung eines passiven Oxidfilms durch Aluminium erhöht seine Resistenz gegenüber Korrosion (Iverson, 1987; Wanger und Little, 1993). Pseudomonas und Cladosporium wurden allgemein mit der MIC von Aluminium und seinen Legierungen assoziiert (Iverson, 1987). Durch die Produktion von korrosiven organischen Verbindungen durch P. aeruginosa können Zink und Magnesium aus Aluminium und Legierungen entfernt werden und dadurch die Korrosion ausgelöst werden. Der Lochfraß von Aluminium durch drei Stämme von SRB wurde beschrieben, wobei eine 100-fache Zunahme des Gewichtsverlusts im Vergleich zu sterilen Kontrollen festgestellt wurde (Iverson, 1987).
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme und Wachstumsmedium
  • P. fragi K ist ein Kanamycin-resistentes Derivat von P. fragi (Jayaraman, A., et al., 1997a), und B. brevis 18 ist ein Gramicidin-S-überproduzierender Stamm (Azuma, T., et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 173–178 (1992)) (nachstehend: Azuma et al., 1992). Biofilme auf Metalloberflächen wurden in kontinuierlichen Reaktoren mit modifiziertem Baar-Medium, wie früher von Jayaraman et al. beschrieben (Jayaraman, A., et al., 1997c), entwickelt, da dieses Medium das Wachstum von Aerobiern und SRB fördert.
  • Herstellung der Proben
  • Platten aus nicht-legiertem Kupfer und der Aluminiumlegierung 2024 (Quadrate von 7,5 cm × 7,5 cm, 1,2 cm dick) wurden aus einer Stammplatte ausgeschnitten, mit einem Schleifpapier mit Körnungsnummer 240 (Buehler, Lake Bluff, IL) fein abgeschliffen und, wie früher beschrieben, aufbewahrt (Jayaraman, A., et al., 1997c).
  • Kontinuierliche Korrosionsrate unter Verwendung von EIS
  • Impendanzdaten (aus mindestens zwei Experimenten) wurden unter Verwendung einer elektrochemischen Messeinheit Solarton-Schlumberger (SI 1280, Schlumberger Technical Instruments Division, San Jose, CA) erhalten, die an einen Macintosh-Computer angeschlossen war (PowerMac 7100/80, Apple Computers, Cupertino, CA), auf dem die EISIS-Software für elektrochemische Experimente („EISIS electrochemical experimentation software") lief (University of California, Irvine) (eine gleichwertige Software, THALES Impedance Measurement and Equivalent Circuit Synthesis/Simultation/Fitting Software, ist kommerziell verfügbar von Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN) (hier nachstehend THALES-Software). Die Reaktorkonfiguration und Betriebsbedingungen waren, wie früher beschrieben (Borenstein, 1994, vorstehend).
  • Ergebnisse und Diskussion
  • Der Polarisationswiderstand Rp, die Kapazität C und das Korrosionspotential Ecorr aller Experimente mit Kupfer und Aluminium sind in Tabelle I zusammengestellt. Die Korrosion mit nicht-legiertem Kupfer in modifiziertem Baar-Medium bei 30°C wurde unter Verwendung kontinuierlicher Reaktoren untersucht, wobei die Impedanzspektren erhalten wurden. Sterile Reaktoren (fünf unabhängige Experimente) hatten nach zehn Tagen Kontakt einen maximalen Phasenwinkel von etwa 56°. Ein P. fragi K-Biofilm, der auf Kupfer gewachsen war (fünf unabhängige Experimente), erhöhte die Impedanz bei der niedrigsten gemessenen Frequenz (1,4 × 103 Hz) im gleichen Zeitraum um das 21-Fache, dies zeigt eine Abnahme der Korrosion an. Diese Abnahme der Korrosion wurde auch durch einen Anstieg des Phasenwinkels bestätigt (vgl. 56° gegenüber 71°). Ähnliche Impedanzspektren (zwei unabhängige Experimente) wurden auch festgestellt, wenn ein Biofilm von B. brevis 18 auf Kupfer entwickelt wurde.
  • Die Impedanzspektren, die mit sterilem modifiziertem Baar-Medium mit der Aluminiumlegierung 2024 in kontinuierlichen Reaktoren erhalten wurden (zwei unabhängige Experimente), zeigten bei den niedrigen Frequenzen nach zehn Tagen Exposition einen maximalen Phasenwinkel von 71°. Wenn ein P. fragi K-Biofilm auf der Aluminiumlegierung sechs Tage entwickelt wurde (fünf unabhängige Experimente), stieg der maximale Phasenwinkel auf 78°, und außerdem wurde ein achtfacher Anstieg in Rp festgestellt. Wie mit nicht-legiertem Kupfer festgestellt wurde, war auch ein Biofilm von B. brevis 18 (drei unabhängige Experimente) in der Lage, den Rp von Aluminium 2024 unter ähnlichen Bedingungen um das Fünffache und den Phasenwinkel um 7° zu erhöhen.
  • Die festgestellten Anstiege von Rp und die Änderungen in den Impedanzspektren sind ähnlich wie die Beobachtungen von Jayaraman et al., 1997c, die bei einem axenischen P. fragi K-Biofilm im Vergleich zu sterilen Kontrollen eine 40-fache Abnahme in RP und einen Anstieg im Phasenwinkel von 35° bei Weichstahl SAE 1018 berichteten.
  • Tabelle I Polaristationswiderstand Rp, Kapazität C und Korrosionspotential Ecorr von nicht-legiertem Kupfer und der Aluminiumlegierung 2024 in modifiziertem Baar-Medium bei 30°C. Die Daten stammen aus einem repräsentativen Experiment (aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten).
    Figure 00340001
    • Anm. 1: Es ist nicht möglich, die Parameter aufgrund von verfügbaren äquivalenten Schaltkreismodellen zu ermitteln.
    • Anm. 2: Impedanz weist auf Lochfaß hin (C = 8,1 × 10–5 F/cm2, Rp = 2,97 × 105 Ohm cm2, Rpit/F = 3,52 × 103 Ohm).
  • Beispiel 3: Antimikrobielle Peptide hemmen das Wachstum von SRB
  • Dieses Beispiel zeigt, dass antimikrobielle Peptide das Wachstum von SRB hemmen.
  • Antimikrobielle Peptide sind klein (Marahiel, M., et al., Mol. Microbiol. 7: 631–636 (1993); Nakano, M. M., und Zuber, P., Crit. Rev. Biotechnol. 10: 223–240 (1990)), können einfach in Biofilm-bildende aerobe Bakterien cloniert werden, und sie können durch Proteintechniken optimiert werden (Piers, K. K., et al., Gene 134: 7–13 (1993)) (nachstehend: Piers, 1993); somit sind sie attraktive Kandidaten dafür, SRB aus Biofilmen auszuschließen.
  • Saleh et al. (1964) und Postgate (Postgate, J. R., „The sulphate-reducing bacteria", Cambridge University Press, New York (1984)) (nachstehend: Postgate, 1984) haben Listen von antimikrobiellen Mitteln zusammengestellt, die auf verschiedene SRB hemmend wirken, umfassend das Polypeptid Polymyxin B (das D. vulgaris bei 100 μg/ml hemmt). Die vorliegende Studie beschreibt die Hemmung der repräsentativen SRB D. vulgaris und D. gigas in Suspensionskulturen durch die antimikrobiellen Peptide Gramicidin S (ein aus 10 Aminosäuren bestehendes ringförmiges Peptid aus B. brevis (Azuma et al., 1992)), Gramicidin D (ein aus 15 Aminosäuren bestehendes lineares Peptid aus B. brevis (van Döhren, H., Peptides, in: L. C. Vining und C. Stuttard (Hrsg.), „Genetics and Biochemistry of Antibiotic Production", Butterworth-Heinemann, Boston (1995)), amidiertes und nicht-amidiertes Indolicidin (ein aus 13 Aminosäuren bestehendes lineares Peptid aus Rinder-Neutrophilen (Falla, T. J., et al., J. Biol. Chem. 271: 19298–19303 (1996) (nachstehend: Falla et al., 1996); Selsted, M. E., et al., J. Biol. Chem. 267: 4292–4295 (1992)) (nachstehend Selsted et al., 1992), Bactenecin (ein aus 12 Aminosäuren bestehendes zyklisches Peptid aus Rinder-Neutrophilen (Romeo, D., et al., J. Biol. Chem. 263: 9573–9575 (1988)) (nachstehend: Romeo et al., 1988) und Polymyxin B (ein aus 10 Aminosäuren bestehendes verzweigtes ringförmiges Dekapeptid aus Bacillus polymyxa (Fujita-Ichikawa, Y., und K. Tochikubo, Microbiol. Immunol. 37: 935–941 (1993)).
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme und Wachstumsmedium
  • D. vulgaris (ATCC 29579) und D. gigas (ATCC 19364) wurden von der American Type Culture Collection erhalten und in 15-ml-Röhrchen mit Schraubkappen in 10 ml modifiziertem Baar-Medium (ATCC Medium 1249) gezüchtet, das mit jeweils 100 μl der Sauerstoff-Scavenger 4% Natriumsulfid und Oxyrase (Oxyrase Inc., Mansfeld, OH) angereichert war. Die Anfangskulturen wurden aus den bei –85°C gehaltenen Glycerin-Stammkulturen gezüchtet; alle anschließenden Kulturen wurden mit einer 3% Impfkultur aus der Anfangskultur gezüchtet, die bei 30°C ohne Schütteln gehalten wurde. Beide SRB wurden routinemäßig in fest verschlossenen Röhrchen mit Schraubkappen gezüchtet und in Laminarabzugshauben dem Sauerstoff ausgesetzt (wodurch die Kultivierung nicht gehemmt wurde, wie früher durch Angell, P., und White, D. C., J. Ind. Microb. 15: 329–332 (1995), gezeigt wurde). Die SRB wurden auch regelmäßig wiederkehrend in Gegenwart von 0,1% Eisen(II)-ammoniumsulfat gezüchtet, und das Vorliegen dieser sulfatreduzierenden Organismen wurde durch den Nachweis von schwarzem Eisensulfid in den Kulturröhrchen bestätigt. Außerdem wurde der Desulfoviridin-Test nach jedem MPN-Test durchgeführt, wobei das Vorliegen von D. vulgaris oder D. gigas durch ihre rote Farbe unter UV-Licht aufgrund der Freisetzung des Chromophors des pigmentierten Desulfoviridin bestätigt wurde (Postgate, 1984).
  • Antimikrobielle Peptide
  • Indolicidin (als amidierte Form und freie Säureform) wurde freundlicherweise von Prof. Michael E. Selsted von UC Irvine zur Verfügung gestellt, und die freie Säureform wurde durch Genosys Biotechnologies Inc. (The Woodlands, TX) mit einer Reinheit von 76% synthetisiert. Gramicidin S (Reinheit von 96,5%), Gramicidin D (Reinheit von 100%) und Polymyxin B (Reinheit von 100%) wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Bactenecin wurde durch Genosys Biotechnologies Inc. mit einer Reinheit von 32% synthetisiert und in Gegenwart von Dithiothreit („DTT") (< 0,1%) geliefert. Die Molekulargewichte des synthetisierten Indolicidin (Säureform, 1907 Da) und Bactenecin (1486 Da) wurden unter Verwendung eines MALDI-Flugzeit [(TOF); Time of Flight]-Massenspektrometers (Voyager DE 5-2386-00, Perseptive Biosystems, MA) bestätigt.
  • Eine Vydac C18-Säule (Vydac, Hesperia, CA) wurde für eine Umkehrphasen-HPLC eingesetzt (Virian Vista Serie 5000, Sugar Land, TX), um das restliche DTT aus dem Bactenecin zu entfernen (und die Bildung einer Disulfidbindung zwischen den Resten 3 und 11 zu erleichtern). Eine mobile Phase aus Acetonitril/0,1 Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser (20:80) wurde eingesetzt, um das DTT zu eluieren, worauf eine schrittweise Umstellung folgte, bis ein System aus 50:50 Acetonitril/0,1% TFA in Wasser erhalten wurde, mit dem Bactenecin eluiert wurde. Diese Fraktion wurde als frei von DTT angesehen und für die antimikrobiellen Tests verwendet.
  • Tests zur Hemmung von SRB
  • Um die Indices der Lebensfähigkeit von SRB zu bestimmen (Romeo et al., 1988), wurde eine Kultur in der späten exponentiellen Phase (OD600 = 0,16 bis 0,19, dies entspricht einer Anfangs-Zellzahl von 5 bis 9 × 104 Zellen/ml) verschiedenen Konzentrationen von antimikrobiellen Substanzen eine Stunde bei 30°C ausgesetzt. Ein ml der Zellen wurde geerntet, einmal in frischem modifiziertem Baar-Medium gewaschen, um die Zelltrümmer zu entfernen, und in 1 ml frischem modifiziertem Baar-Medium resuspendiert, das mit jeweils 10 μl Oxyrase (Oxyrase Inc., Mansfeld, OH) und 4% Natriumsulfid angereichert war. Aliquots zu 450 μl wurden in sterile Eppendorf-Röhrchen à 500 μl überführt, sodann wurden geeignete Mengen der antimikrobiellen Substanzen zugegeben und bei 30°C inkubiert. Die Wirksamkeit der Behandlung wurde durch die MPN-Fermentationstechnik auf die wahrscheinlichste Anzahl (MPN, "most probable number") unter Verwendung mehrerer Röhrchen ermittelt. (Anonym; Multiple-tube fermentation technique for members of the coliform group, S. 9–45 bis 9–51; in: A. E. Grennberg, L. S. Clesceri und A. D. Eaton (Hrsg.), „Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", 18. Aufl., American Public Health Association, American Water Works Association, und Water Pollution Control Federation, New York (1992)) (nachstehend: Grennberg, 1992).
  • Der MPN-Test zum Zählen der SRB wurde in drei 12-ml-Röhrchen mit einer SRB-Impfkultur von 1000 μl, drei 12-ml-Röhrchen mit einer Impfkultur von 500 μl und drei 12-ml-Röhrchen mit einer Impfkultur von 100 μl durchgeführt. Alle neun Röhrchen enthielten ein Endvolumen von 10 ml modifiziertem Baar-Medium, angereichert mit jeweils 100 μl von 4% Natriumsulfid und Oxyrase (Oxyrase Inc., Mansfeld, OH). Die Röhrchen wurden 72 Stunden überwacht, um die Zahl der Röhrchen zu bestimmen, die für Wachstum positiv waren. Das Wachstum wurde durch den Anstieg der Trübung der Kultur bestimmt, und der MPN-Index/ml wurde unter Verwendung der Thomas-Formel errechnet (Greenberg, 1992).
  • Ergebnisse und Diskussion
  • D. vulgaris und D. gigas wurden in Gegenwart von verschiedenen antimikrobiellen Peptiden inkubiert und ihre Lebensfähigkeit nach einstündigem Kontakt bestimmt. Ampicillin wurde als positive Kontrolle für D. vulgaris verwendet, da für diese Substanz und Chloramphenicol gefunden wurde, dass sie diesen Stamm bei 20 μg/ml hemmen; dies stimmte mit früheren Berichten überein (Odom und Singleton, „The sulfate-reducing bacteria: Contemporary perspectives", Springer Verlag, New York (1993) (nachstehend: Odom und Singleton, 1993); jedoch hemmten weder Ampicillin noch Chloramphenicol wirksam D. gigas bei 100 μg/ml. Außerdem wurde die Empfindlichkeit der beiden SRB gegenüber mehreren weiteren Antibiotika (Kanamycin, Tetracyclin, Thiostrepton, Penicillin G und Naladixinsäure), anorganischen Substanzen (Ammoniummolybdat, Natriummolybdat und Anthrachinon) und Peptiden (Nisin und Polymyxin B) unter Verwendung von SRB-Kulturen der stationären Phase getestet. D. gigas wurde durch Anthrachinon bei 100 μg/ml gehemmt (Cooling et al., 1996), und beide SRB wurden durch Natriummolybdat bei 100 μg/ml gehemmt. Dies entspricht der Beobachtung von Saleh et al., 1964, die nahezu 200 Verbindungen auf ihre SRB-hemmende Aktivität prüften und feststellten, dass SRB einen hohen Resistenzgrad gegenüber hemmenden Verbindungen zeigen (Id.).
  • Unter Verwendung des MPN-Tests wurde der Lebensfähigkeits-Index von D. gigas und D. vulgaris für die antimikrobiellen Peptide bestimmt. Bei D. gigas waren sowohl Gramicidin S als auch die amidierte Form von Indolicidin, Ind-NH2, wobei es sich um die in Rinder-Neutrophilen von Natur aus vorkommende Form handelt (Falla et al., 1996; Selsted et al., 1992), in der Lage, die Lebensfähigkeit einer Kultur in der späten exponentiellen Phase nach einer einstündigen Exposition bei 25 μg/ml um 92 bis 96% zu reduzieren. Bei D. vulgaris war Ind-NH2 bei 25 μg/ml beim Hemmen des Wachstums etwas wirksamer (Lebensfähigkeit reduziert um 99,3%), während Gramicidin S weniger wirksam war und die Lebensfähigkeit bei 100 μg/ml um 93 reduzierte. Die Säureform von Indolicidin (Ind-OH) war bei 25 μg/ml gegen D. gigas zehnfach weniger wirksam als die amidierte Form von Indolicidin, und gegen D. vulgaris war sie 174-fach weniger wirksam. Dies ist nicht erstaunlich, da man davon ausgeht, dass die posttranslationale Amidierung die Wirksamkeit von Indolicidin verstärkt (Falla et al., 1996). Die antimikrobiellen Peptide Gramicidin D, Polymyxin B und Bactenecin (Postgate, 1984) waren auch in der Lage, bei 100 μg/ml die Lebensfähigkeit von D. vulgaris und D. gigas um etwa 90% herabzusetzen. Diese MPN-Testergebnisse wurden auch durch die ähnlichen Ergebnisse bestätigt, die erhalten wurden, wenn D. vulgaris eine Stunde Gramicidin S, Gramicidin D, Indolicidin und Bactenecin ausgesetzt wurde, auf Desulfovibrio-Agar (ATCC Medium 42) plattiert wurde und in anaeroben GasPak-Kammern inkubiert wurde (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA).
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass antimikrobielle Peptide wie Gramicidin S, Indolicidin, Polymyxin B und Bactenecin zur Hemmung des Wachstums von SRB und zur Abschwächung der mikrobiell beeinflussten Korrosion von Stahl verwendet werden können. Indolicidin ist in der Lage, Escherichia coli und Staphylococcus aureus bei 5 bis 25 μg/ml um 99,9% zu hemmen (Romeo et al., 1988; Selsted et al., 1992); jedoch zeigten D. gigas und D. vulgaris in dieser Studie eine größere Resistenz gegenüber Indolicidin. Bactenecin hemmt E. coli bei 100 μg/ml um 95 (Romeo et al., 1988) und zeigte in dieser Studie eine vergleichbare Hemmung von D. gigas und D. vulgaris (90%). Auch Gramicidin S war dafür bekannt, dass es bei 3 bis 12,5 μg/ml das Wachstum von Gram-negativen Bakterien vollständig hemmt (Kondejewski, L., et al., Int. J. Peptide Protein Res. 47: 460–466 (1996)), und es zeigte in dieser Studie bei 50 bis 100 μg/ml eine Hemmwirkung gegen die beiden Gram-negativen SRB. Aufgrund ihrer Aktivität gegen SRB in Suspensionskulturen waren alle in dieser Studie getesteten antimikrobiellen Peptide bei vergleichbaren Konzentrationen wirksamer als die kommerziell verfügbaren Antibiotika, z.B. Kanamycin, Naladixinsäure und Tetracyclin, und anorganische Substanzen, z.B. Natriummolybdat und Anthrachinon.
  • Beispiel 4: Ausschluss von SRB aus Biofilmen unter Verwendung von Bakterien, die clonierte antimikrobielle Mittel sezernieren
  • Dieses Beispiel zeigt die Clonierung und Expression von antimikrobiellen chemischen Substanzen in Bakterien und ihre Verwendung zum Ausschluss von SRB aus einem Biofilm auf Edelstahl.
  • Antimikrobielle Peptide wurden aus mehreren Bakterien (Hancock, R. E. W., et al., Adv. Microb. Physiol. 37: 135–175 (1995)), Pflanzen (Hancock, R. W., et al., „Cationic peptides: a class of antibiotics able to access the self-promoted uptake pathway across the Pseudomonas aeruginosa outer membran", S. 441–450; in: T. Nakazawa (Hrsg.), „Molecular Biology of Pseudomonads", ASM Press, Washington D. C. (1996)) (nachstehend: Hancock et al., 1996), Insekten (Boman, H. G., et al., Eur. J. Biochem. 20: 23–31 (1991)) und Säugern (Frank, R. W., et al., J. Biol. Chem. 265 (31): 18871–18874 (1990); Lehrer, R. I., et al., Annu. Rev. Immunol. 11: 105–128 (1993); Zasloff, M., Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 5449–5453 (1987)) (nachstehend Zasloff, 1987) identifiziert und isoliert. Diese Peptide können grob klassifiziert werden in Magainine (Zasloff, 1987), Defensine (Cullor, J. S., et al., Arch. Ophthalmol. 108: 861–864 (1990)) (nachstehend: Cullor et al., 1990), Cecropine (Calloway, J. W., et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37: 1614–1619 (1993)) (nachstehend: Calloway et al., 1993); Melittine (Piers, K. L., et al., Mol. Microbiol. 12 (6): 951–958 (1994)) (nachstehend: Piers et al., 1994), und es wurde gezeigt, dass sie eine antimikrobielle Aktivität gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien und außerdem gegen Hefe und Pilze aufweisen (Hancock et al., 1996). Die meisten kationischen Peptide besitzen mehrere Lysin- und Argininreste sowie hydrophile und hydrophobe Oberflächenbereiche (Hancock et al., 1996), und sie töten Mikroorganismen, indem sie die Permeabilität der bakteriellen Zellmembran erhöhen oder indem sie die DNA-Synthese hemmen (Hancock et al., 1996; Romeo et al., 1988).
  • Indolicidin (Cullor et al., 1990); Del Sal, G., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187 (1): 467–472 (1992)) und Bactenecin (Frank, R. W., et al., J. Biol. Chem. 265 (31): 18871–18874 (1990); Romeo et al., 1988)) sind kationische antimikrobielle Peptide, die aus Rinder-Neutrophilen isoliert wurden (Lehrer, R. I., et al., Annu. Rev. Immunol. 11: 105–128 (1993)). Indolicidin ist ein Tridekapeptid, das zur Familie der Defensine gehört (Selsted et al., 1992) und aus nur sechs verschiedenen Aminosäuren besteht, wobei es den höchsten Anteil an Tryptophan (39%) eines bisher bekannten Proteins aufweist (Falla et al., 1996). Indolicidin ist außerdem das kleinste bekannte lineare antimikrobielle Peptid, und in seiner natürlich vorkommenden Form ist sein Carboxylende amidiert (Falla et al., 1996; Selsted et al., 1992). Bactenecin ist ein Arginin-reiches ringförmiges Dodekapeptid und enthält eine Disulfidbindung, die die ringförmige Struktur aufrechterhält (Romeo et al., 1988).
  • Bisher wurden wenige Versuche unternommen, antimikrobielle Peptide in prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssystemen für kommerzielle Anwendungen zu produzieren. Piers et al. (Piers et al., 1993, und Piers et al., 1994) haben Verfahren zum Synthetisieren und Reinigen des menschlichen Neutrophilen-Peptids 1 (HNP-1) und eines Hybridpeptids aus Cecropin und Melittin in Bakterien unter Verwendung eines Staphylococcus aureus-Expressionssystems beschrieben. Diese Peptide wurden als Fusionen mit Protein A synthetisiert, ins Medium ausgeschieden und unter Verwendung von Affinitätschromatographie gereinigt (Piers et al., 1993). Calloway (Calloway et al., 1993) versuchte, Cecropin A in E. coli zu exprimieren und folgerte hieraus, dass für eine hohe antimikrobielle Aktivität eine posttranslationale Modifikation des Carboxylendes erforderlich war. Hara und Yamakawa (Hara, S., und M. Yamakawa, Biochem. Biophys. Res. Comm. 224 (3): 877–878 (1996)) haben das Peptid Moricin in E. coli als Fusion mit dem Maltose-bindenden Protein produziert und fanden eine Aktivität, die mit dem nativen Protein vergleichbar war. Haught et al. (Biotechnol. Bioeng. 57: 55–61 (1998)) haben die Produktion des rekombinanten antimikrobiellen Antisense-Peptids P2 in E. coli als Einschlusskörper unter Verwendung einer Fusion mit Rinder-Prochymosin beschrieben; hohe Spiegel des Proteins wurden exprimiert (annähernd 16% des gesamten Zellproteins). Pang et al. (Gene 116: 165–172 (1992)) (nachstehend: Pang et al., 1992) haben versucht, das Insektentoxin I5A des Skorpions in Bakterien, Hefen und Tabakpflanzen zu exprimieren und sezernieren (keine messbare Aktivität wurde nachgewiesen). Alle diese Ansätze hatten als Ziel eine billige Produktion im großen Maßstab von gereinigten antimikrobiellen Produkten und nicht in vivo-Anwendungen.
  • Im vorherigen Beispiel zeigten wir, dass die gereinigten antimikrobiellen Peptide Indolicidin, nicht-amidiertes Indolicidin und Bactenecin anaerobe SRB in Suspensionskulturen hemmen. Dieses Beispiel zeigt, dass die SRB durch die Produktion von antimikrobiellen Peptiden in aeroben Biofilm-produzierenden Bakterien aus den Biofilmen ausgeschlossen werden können und die durch SRB induzierte Korrosion von Metall gehemmt werden kann. Insbesondere zeigt dieses Beispiel die Expression der kationischen antimikrobiellen Peptide Indolicidin und Bactenecin in dem Gram-positiven Bacillus und ihre Verwendung zum Ausschluss von SRB aus Biofilmen auf Edelstahl 304. Indolicidin und Bactenecin wurden als Fusionen mit der Signalsequenz der alkalischen Protease (apr) cloniert und unter Verwendung des apr-Promotors konstitutiv exprimiert. Auch die Pro-Region von Barnase (eine extrazelluläre RNase aus B. amyloliquefaciens) wurde eingesetzt, um Bactenecin als ein Präpro-Peptid in Bacillus zu produzieren. Die Fähigkeit dieser Stämme wurde beschrieben, in kontinuierlichen Reaktoren das Wachstum von SRB auf Weichstahl SAE 1018 und auf Edelstahl 304 zu hemmen.
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme, Plasmide und Wachstumsmedien
  • E. coli XL1 (Blue) {recA1 endA1 gnA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lablq ZDM15 Tn10 (Tetr)]} wurde von Statagene (LaJolla, CA) bezogen. B. subtilis BE1500 {trpC2, met810, lys-3, ΔaprE66, Δnpr-82, ΔsacB::ermC} und das Plasmid pBE92, enthaltend den alkalische Protease (apr)-Promotor, die alkalische Phosphatase (apr)-Signalsequenz und das alkalische Phosphatase-Reporter-Gen, wurden von E. I. du Pont de Nemours Inc. (Wilmington, DE) bezogen. Der Protease-defiziente Stamm B. subtilis WB600 (Wu, X.-C., et al., J. Bacteriol. 173 (16): 4952–4958 (1991)) (nachstehend: Wu et al., 1991) {trpC2, ΔnprE, ΔaprA, Δepr, Δbpf , Δmpr, ΔnprB} wurde von Dr. Sui-Lam Wong erhalten (University of Calgary, Alberta, Kanada). B. polymyxa wurde von der American Type Culture Collection (ATCC 10401) erhalten. D. vulgaris (ATCC Stamm 29579) wurde in dieser Studie als Referenz-SRB verwendet. Alle Korrosionsexperimente mit B. subtilis BE1500 und P. fragi K (Jayaraman, A., et al., 1997a) wurden in modifiziertem Baar-Medium (ATCC Medium 1249) für sulfatreduzierende Bakterien durchgeführt. Korrosionsexperimente mit B. polymyxa wurden in modifiziertem Baar-Medium durchgeführt, das mit 1/10tel Volumen von 10 × TY-Medium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt in 100 ml H2O) angereichert war.
  • Enzyme und Chemikalien
  • Alle Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase und Taq-Polymerase wurden von Promega (Madison, WI) bezogen. BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) wurde von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) geliefert. Indolicidin (freie Säureform, Reinheit von 76%) und Bactenecin (Reinheit von 32%) wurden von Genosys Biotechnologies Ind. (The Woodlands, TX) synthetisiert.
  • Konstruktion der Plasmide
  • Die Verfahren der DNA-Rekombinations-Technik wurden durchgeführt, wie von Maniatis (Maniatis, T., et al., 1982) und Rodriguez und Tait (Rodriguez, R. L., et al., „Recombinant DNA techniques, An introduction", The Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., Menlo Park, CA (1983)) beschrieben. Plasmid-DNA wurde aus Bacillus isoliert, gemäß dem Verfahren von Bramucci und Nagarajan (Bramucci, M. G., und V. Nagarajan, Appl. Environ. Microbiol. 62 (11): 3948–3953 (1996)) (nachstehend: Bramucci, 1996). Die Aminosäuresequenzen für nicht-amidiertes Indolicidin [NH2-Ile-Leu-Pro-Trp-Lys-Trp-Pro-Trp-Trp-Pro-Trp-Arg-Arg-OH] (Selsted et al., 1992) und Bactenecin [NH2-Arg-Leu-Cys-Arg-Ile-Val-Val-Ile-Arg-Val-Cys-Arg-OH] (Romeo et al., 1988) wurden verwendet, um Oligonucleotide zu entwerfen, die die Gene für diese Peptide codieren. Das Plasmid pBE92-Ind wurde so entworfen, dass es das nicht-amidierte Indolicidin als ein 12-Aminosäuren-Peptid, fusioniert an die apr-Signalsequenz, exprimierte, pBE92-Bac wurde so entworfen, dass es Bactenecin als ein 13-Aminosäuren-Peptid, fusioniert an die apr-Signalsequenz, exprimierte, und pBE92-ProBac wurde so entworfen, dass es Bactenecin, fusioniert an die Pro-Region der extrazellulären RNase der Barnase von B. amyloliquefaciens (Paddon, C. J., et al., J. Bacteriol. 171 (2): 1185–1187 (1989)) (nachstehend: Paddon et al., 1989) und die apr-Signalsequenz exprimierte.
  • Die synthetischen Oligos (1) wurden von Gibco-BRL Life Technologies (Long Island, NY) in einem Maßstab von 200 nMol mit Reinigung durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) synthetisiert. Die Oligos wurden mit flankierenden Hind III- und Nhe I-Restriktionsstellen mit zusätzlichen sechs Basen an beiden Enden für eine effiziente Restriktionsspaltung synthetisiert. Zwei vollständig komplementäre Oligos jedes Konstrukts wurden in TE-Puffer resuspendiert (50 ng/μl), in äquimolaren Verhältnissen gemischt und drei Minuten in kochendem Wasser inkubiert. Die Oligos anelierten im Wasserbad, als sie bei Raumtemperatur abkühlten (etwa zwei Stunden). Die anelierten Oligos wurden mit Hind III und Nhe I über Nacht gespalten, mit Ethanol bei –85°C eine Stunde ausgefällt und in entionisiertem destilliertem Wasser resuspendiert. Der Plasmidvektor pBE92 wurde aus Zellextrakten von E. coli XL1 (Blue) unter Verwendung eines Plasmid-Midi-Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA) isoliert und die DNA gleichzeitig mit Hind III, Nhe I und Sal I 14 Stunden bei 37°C gespalten. Der dreifach gespaltene Vektor und das antimikrobielle Gen-Insert wurden sodann 17 Stunden bei 16°C bei einem molaren Verhältnis von Insert zu Vektor von 28:1 ligiert. Das Ligierungsgemisch wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) extrahiert, mit Ethanol ausgefällt und in 30 μl ddH2O resuspendiert.
  • Pro-Bactenecin wurde als zwei Oligo-Stränge mit einer aus 21 Basenpaaren bestehenden komplementären Region mit Hind III- und Nhe I-Restriktionsstellen an den Enden der zwei Stränge synthetisiert (2). Außerdem wurde eine Not I-Stelle stromabwärts des Stopp-Codons hergestellt, die zum Einführen einer einmaligen Stelle in pBE92 diente. Die zwei Stränge wurden, wie vorstehend beschrieben, aneliert und die komplementären Regionen unter Verwendung der Taq-Polymerase vervollständigt (ein Zyklus, 30 Sekunden bei 94°C, gefolgt von 30 Sekunden bei 55°C, und zwei Stunden bei 72°C), durchgeführt mit einem Perkin-Elmer-Thermozykler N801-0150 (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Das Endprodukt wurde mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert, mit Ethanol bei –85°C in Gegenwart von 1 mM MgCl2 eine Stunde ausgefällt und in 50 μl ddH2O resuspendiert.
  • Transformanten wurden durch Restriktionsspaltungen mit Bgl I (Indolicidin), BssH II (Bactenecin) und Not I (Pro-Bactenecin) identifiziert und bestätigt, wobei eine Modifikation des Kolonie-Abzieh-Tests von Boehringer Mannheim verwendet wurde.
  • 200 ng der Plasmid-DNA (aus Minipräparaten von mutmaßlichen E. coli-Transformanten mit antimikrobiellen Genen) wurden auf positiv geladene Nylonmembranen getüpfelt (Produkt Nr. 1209272, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung der synthetischen Oligo-DNA des antimikrobiellen Gens (1), markiert unter Verwendung des Zufallspriming-DNA-Markierungsprotokolls von Boehringer Mannheim, getestet.
  • Transformation von E. coli und Bacillus
  • Zellen von E. coli XL1 (Blue) wurden gemäß dem Verfahren von Smith und Iglewski elektrokompetent gemacht (Smith, A W., et al., Nucl. Acids. Res. 17: 10509 (1989)). 10 μl des Ligierungsgemisches wurden für die Elektroporation der Bakterien verwendet (1,2 kV/cm, 200 Ohm, 25 μF), wobei ein Gen-Pulser/Pulskontrollgerät (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) verwendet wurde, anschließend wurden die Clone, die das korrekte Insert enthielten (pBE92-Indolicidin, pBE92-Bactenecin und pBE92-Pro-Bactenecin), auf LB-Agarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin und 40 μg/ml BCIP enthielten, unter Verwendung eines Blau/Weiß-Selektionsverfahrens selektiert (Transformanten mit dem korrekten Insert erzeugten weiße Kolonien, während der wieder geschlossene Vektor zu blauen Kolonien führte).
  • B.subtilis BE1500 wurde kompetent gemacht und transformiert, wobei das zweistufige Verfahren von Cutting und Vander Horn verwendet wurde (Genetic analysis, S. 27–74; in: C. R. Harwood und S. Cutting, M., (Hrsg.), „Molecular biological methods for Bacillus", John Wiley & Sons, New York (1990)). Kompetente Zellen der späten exponentiellen Phase wurden mit der Plasmid-DNA (etwa 1 μg, isoliert aus E. coli XL1 (Blue)) 30 Minuten inkubiert. Die Kulturen wurden mit 1 ml eines 10% Hefeextraktes verdünnt und auf einem Kreisschüttler (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, Schüttler Serie 25) bei 37°C inkubiert und anschließend auf LB-Agarplatten plattiert, die 25 μg/ml Kanamycin enthielten. Kompetente Zellen von B. polymyxa wurden gemäß dem Verfahren von Rosado et al. zubereitet (J. Microbiol. Meth. 19: 1–11 (1994)). Etwa 1 μg DNA (pBE92-basierte Konstrukte), isoliert aus B. subtilis BE1500 (Najarajan, V., et al., Gene 114: 121–126 (1992)), wurde unter Verwendung des Verfahrens von Bramucci und Nagarajan (Bramucci, 1996) zur Elektroporation von B. polymyxa verwendet (6,25 kV/cm, 200 Ohm, 25 μF). Anschließend wurden die Zellen drei Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert und auf LB-Agarplatten, die 150 μg/ml Kanamycin enthielten, selektiert.
  • SDS-PAGE
  • B. subtilis BE1500, enthaltend die auf Plasmid pBE92 basierenden Konstrukte, welche die Gene des antimikrobiellen Peptids exprimierten, wurde in 25 ml LB-Medium bei 37°C bis zur späten exponentiellen Phase (OD600 = 0,70 bis 1,0) gezüchtet. Die Zellen wurden zehn Minuten bei 10 000 × g bei 4°C abzentrifugiert und der Überstand unter Verwendung eines SpeedVac-Konzentrators (Modell 200 H, Savant Instruments Inc., Holbrook, NY) 25-fach eingeengt. Der eingeengte Überstand wurde mit einem 2X-Probenpuffer (0,125 M Tris-Base, 0,4% SDS, 20 Glycerin und 0,1 ml von 1 mg/ml Bromphenolblau, wobei 5 μl 2-Mercaptoethanol pro 100 μl 2X-Puffer zugegeben wurden) gemischt, fünf Minuten gekocht und auf einem Gel mit 16,5% Tris-Tricine (Bio-Rad, Hercules, CA) einer Elektrophorese unterworfen.
  • Kontinuierliche Korrosionsexperimente
  • Batch-Kultur-Korrosionsexperimente unter Verwendung von Kupons aus Weichstahl SAE 1018 (2,5 cm Durchmesser, 1,2 mm dick) wurden in dreifacher Ausführung in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben bei 30°C ohne Schütteln, wie früher beschrieben, durchgeführt (Jayaraman et al., 1997a). Außerdem wurde ein kontinuierlicher Reaktor verwendet (Jayaraman et al., (1997c), um Biofilme auf Edelstahl 304 zu entwickeln und die Korrosion unter Verwendung der elektrochemischen Impedanz-Spektroskopie (EIS) in mindestens zwei unabhängigen Reaktoren zu überwachen, wobei eine elektrochemische Solarton-Schlumberger-Messeinheit (SI 1280, Schlumberger Technical Instruments Division, San Jose, CA) verwendet wurde, die an einen Macintosh-Computer angeschlossen war (PowerMac 7100/80, Apple Computers, Cupertino, CA), auf dem die EISIS-Software für elektrochemische Experimente („EISIS electrochemical experimentation software") lief (University of California, Irvine) (hierfür kann auch eine ähnliche kommerzielle Software, THALES, verwendet werden). Das Potential des geöffneten Schaltkreises (OCP) wurde als das Potential zwischen der Metallprobe und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode gemessen, und der Polarisationswiderstand (Rp) wurde als Wert der Impedanz bei niederer Frequenz bestimmt (wo der imaginäre Teil der Impedanz Null oder vernachlässigbar war). Die Korrosionsraten der kontinuierlichen Kultur wurden als Umkehrwert des Polarisationswiderstands bestimmt (Macdonald, D. D., und M. C. H. McCubre, „Applications of impedance spectroscopy", S. 262–267; in: J. R. Macdonald (Hrsg.), „Impedance spectroscopy: Emphasizing solid materials and systems", John Wiley & Sons, New York (1987); Stern, M., Journal of Electrochemical Society 105 (11): 638–647 (1958)).
  • Antimikrobielle Tests
  • Um die Empfindlichkeit der Wirte B. subtilis BE1500 und B. polymyxa gegenüber die exprimierten antimikrobiellen Mitteln zu bestimmen, wurden diese Stämme aus einer Einzelkolonie in 25 ml LB-Medium unter Schütteln bei 37°C bis zu OD600 = 0,40 bis 0,45 gezüchtet. Aliquots zu 1 ml wurden gesammelt, mit frischem LB-Medium gewaschen und in 100 μl frischem LB-Medium in sterilen Eppendorf- Röhrchen resuspendiert. Die antimikrobiellen Stoffe Indolicidin und Bactenecin wurden zugegeben (50 bis 100 μg/ml) und die Röhrchen eine Stunde bei 30°C ohne Schütteln inkubiert. Sodann wurden geeignete Verdünnungen auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert, um das Ausmaß der überlebenden Kulturen zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden anhand von zwei unabhängigen Experimenten bestätigt.
  • Die Expression von Indolicidin und Bactenecin in Bacillus wurde in doppelter Ausführung bestimmt, indem E. coli BK6 in Suspension eingeengten Kulturüberständen ausgesetzt wurde. E. coli BK6 wurde bis zu einer OD600 von 0,20 bis 0,25 gezüchtet, sodann bei Raumtemperatur sedimentiert und in verschiedenen Volumina (50 oder 100 μl) des eingeengten Überstands resuspendiert. Die Zellsuspension wurde eine Stunde bei 30°C ohne Belüftung inkubiert und anschließend geeignete Verdünnungen auf LB-Agarplatten plattiert, um die antimikrobielle Aktivität des Überstands zu bestimmen.
  • Die Fähigkeit des Überstands von den B. subtilis-Konstrukten, die SRB in Suspension zu hemmen, wurde bestimmt, indem 500 μl einer D. vulgaris-Kultur in später exponentieller Phase (OD600 = 0,15 bis 0,20) in einem gleichen Volumen eines 25-fach eingeengten Kulturüberstands von B. subtilis BE1500 mit den antimikrobiellen Konstrukten unter anaeroben Bedingungen, wie im vorherigen Beispiel beschrieben, resuspendiert wurden. Die Zellen wurden eine Stunde bei 30°C inkubiert und die überlebenden SRB unter Verwendung des Tests auf die wahrscheinlichste Anzahl (MNP) unter Verwendung von drei Röhrchen gezählt (Greenberg, 1992).
  • Um die Zahl der lebensfähigen SRB im Biofilm durch den Drei-Röhrchen-MPN-Test unter Verwendung von drei Röhrchen zu bestimmen, wurde der Biofilm einmal in sterilem Wasser gespült, um die lose angehefteten Zellen zu entfernen, sodann von den Kupons aus Edelstahl 304 (2,5 cm Durchmesser, 1,2 mm dick) abgeschabt, resuspendiert und in frischem modifiziertem Baar-Medium unter anaeroben Bedingungen, wie von Jayaraman et al. beschrieben, seriell verdünnt. Die Zahl der aeroben Bakterien im Biofilm wurde bestimmt, indem geeignete Verdünnungen auf LB-Agarplatten plattiert wurden.
  • Ergebnisse
  • Empfindlichkeit der Expressionswirte gegenüber den antimikrobiellen Peptiden
  • B. subtilis BE1500 und B. subtilis WB600 zeigten nach einer einstündigen Exposition bei 30°C eine mehrere tausendfach stärkere Empfindlichkeit gegenüber dem gereinigten antimikrobiellen Peptid Indolicidin (nicht-amidierte Form, 50 und 100 μg/ml), und eine mehrere hundertfach stärkere Empfindlichkeit gegenüber dem gereinigten Peptid Bactenecin (50 μg/ml) als B. polymyxa (vgl. Tabelle II). Deshalb ist B. polymyxa ein besserer Wirt für die Expression der getesteten antimikrobiellen Peptide als die anderen getesteten Arten, da er sowohl gegenüber dem nicht-amidierten Indolicidin als auch gegenüber Bactenecin resistent ist.
  • Tabelle II Empfindlichkeit von Wirtsstämmen gegenüber gereinigten antimikrobiellen Mitteln nach einer Stunde Exposition bei 30°C
    Figure 00460001
  • Clonierung von antimikrobiellen Peptiden unter Verwendung eines E. coli-Shuttle-Vektors
  • Bakterielle Expressionssysteme wurden unter Verwendung des E. coli-Bacillus-Shuttle-Vektors pBE92 konstruiert, wodurch pBE92-Ind, pBE92-Bac und pBE92-ProBac hergestellt wurden, die den apr-Promotor und die apr-Signalsequenz nutzen, um die antimikrobiellen Peptide in Bacillus konstitutiv zu exprimieren und zu sezernieren. Das Gen der alkalischen Phosphatase in pBE92 wurde durch ein Nhe I-Hind III-Insert ersetzt, das die letzten drei Aminosäuren (Ser-Ala-Ser) der apr-Signalsequenz und das vollständige antimikrobielle Gen enthielt.
  • Nachweis von antimikrobiellen Peptiden, die durch Bacillus ausgeschieden werden
  • Gereinigtes Indolicidin (nicht-amidierte Form) wurde durch Coomassie-Färbung nachgewiesen, wenn es mit 230 ng/Vertiefung eingefüllt war, es wurde jedoch nicht nachgewiesen, wenn es mit 23 ng/Vertiefung eingefüllt war. Auch konnten gereinigtes Indolicidin und Bactenecin bei 250 ng/Vertiefung nicht unter Verwendung einer Silberfärbung nachgewiesen werden. Western-Blots mit polyclonalen Antikörpern, die im Kaninchen gegen Indolicidin hergestellt worden waren (Verdünnung von 1:250), wobei Kulturüberstände von B. subtilis BE1500 (pBE92-Ind) (25-fach eingeengt) verwendet wurden, zeigten keine Bande, die dem Indolicidin entsprach; jedoch war der Antikörper nicht spezifisch für Indolicidin und band an zahlreiche zelluläre Proteine. Die primäre Aminosäuresequenz von Bactenecin wies beim Erzeugen von polyclonalen Antikörpern signifikante Schwierigkeiten auf (Dr. Shing-Erh Yen, Zymed Laboratories Inc., persönliche Mitteilungen); somit wurden keine polyclonalen Antikörper gegen dieses Peptid synthetisiert.
  • Antimikrobielle Aktivität von Indolicidin und Bactenecin in Kulturüberständen von Bacillus gegen E. coli und D. vulgaris in Suspensionskulturen und in Biofilmen
  • Die Fähigkeit von eingeengten Kulturüberständen von B. subtilis BE1500 mit dem antimikrobiellen Plasmid E. coli BK6 und D. vulgaris abzutöten, wurde bestimmt. Für die Experimente mit der negativen Kontrolle, in denen Überstände von B. subtilis BE1500 (pBE92) und B. subtilis BE1500 (pBE92-Ind) verwendet wurden, wurde keine Reduktion der Lebensfähigkeit von E. coli BK6 und D. vulgaris nachgewiesen (Tabelle III); dagegen wurde mit den Überständen von B. subtilis BE1500 (pBE92-Bac) und B. subtilis BE1500 (pBE92-ProBac) eine Abtötung von E. coli BK6 von annähernd 93% und eine Abtötung von D. vulgaris von 83% festgestellt. Dieses Ergebnis zeigt, dass Bactenecin exprimiert und in den Kulturüberstand ausgeschieden wurde und dass die Disulfidbindung in der extrazellulären Umgebung richtig prozessiert war, so dass das ringförmige aktive Bactenecin gebildet wurde. (E. coli wurde in diesen Studien als positive Kontrolle verwendet, um zu zeigen, dass das Peptid exprimiert wurde und aktiv war, und um außerdem zu zeigen, dass die Hemmung der SRB auf diesem Peptid beruhte und nicht auf der Exposition gegenüber Sauerstoff oder anderen exogenen Ursachen.)
  • Die Zahl der lebensfähigen SRB nach fünf Tagen in einem Biofilm auf Edelstahl 304 mit B. subtilis BE1500, der die clonierten antimikrobiellen Stoffe exprimierte, wurde durch den Drei-Röhrchen-MPN-Test gezählt (Tabelle IV). In dem Biofilm, der durch B. subtilis BE1500 (pBE92-Bac) gebildet wurde, waren etwa 60-mal weniger SRB vorhanden als in Biofilmen, die durch B. subtilis BE1500 (pBE92) und B. subtilis BE1500 (pBE92-Ind) gebildet wurden, während bei B. subtilis BE1500 (pBE92-ProBac) zehnfach weniger SRB gefunden wurden.
  • Tabelle III Empfindlichkeit von E. coli BK6 und D. vulgaris in eingeengten Kulturüberständen von B. subtilis BE1500, der antimikrobielle Stoffe exprimierte. Die Werte sind der Durchschnitt von zwei unabhängigen Experimenten
    Figure 00480001
  • Tabelle IV Hemmung von SRB (bestimmt durch den MPN-Test) in einem aeroben Biofilm von B. subtilis BE1500, der die antimikrobiellen Plasmide exprimierte, auf Edelstahl 304 nach fünf Tagen. Die Werte stammen aus einem Biofilm aus zwei unabhängigen Experimenten
    Figure 00480002
  • Korrosionsstudien mit Batch- und kontinuierlichen Kulturen mit Bacillus-Stämmen, die ein cloniertes antimikrobielles Peptid produzieren
  • Die Fähigkeit der Konstrukte, die antimikrobielle Substanzen produzierten, das Wachstum von SRB auf Weichstahl SAE 1018 zu hemmen, wurde in ruhenden Schüttelkolben untersucht. Bei Zugabe von SRB (OD600 = 0,16 bis 0,20) zu einer keine antimikrobiellen Stoffe produzierenden Kultur von P. fragi K, wurde in weniger als 18 Stunden ein starker Geruch nach Hydrogensulfid nachgewiesen. Hiermit ging die Bildung eines schwarzen Eisensulfid-Niederschlags einher; dies zeigt das Wachstum und die Besiedelung von SRB in dem aeroben Biofilm an, der auf der Metalloberfläche wuchs. B. subtilis BE1500 war in der Lage, den Beginn der SRB-Korrosion im Vergleich zu P. fragi K um 36 bis 48 Stunden zu verzögern (dies wurde dadurch deutlich, dass das Auftreten des Eisensulfid-Niederschlags und des Geruchs nach Hydrogensulfid verzögert wurde).
  • Alle drei Konstrukte in B. subtilis BE1500, die antimikrobielle Mittel produzierten, waren in der Lage, den Beginn der SRB-Korrosion im Vergleich zu P. fragi K und B. subtilis BE1500 um 96 bis 120 Stunden zu verzögern. Das Ergänzen des Wachstumsmediums nach sieben Tagen führte jedoch dazu, dass innerhalb von 36 Stunden bei allen Stämmen ein schwarzer Niederschlag auftrat.
  • Die Zugabe von SRB zu einem kontinuierlichen Reaktor aus Edelstahl-304 mit P. fragi K senkte den Impedanzwert bei der niedrigsten gemessenen Frequenz (1,4 × 10–3 Hz) innerhalb von 36 Stunden nach der SRB-Zugabe um das Fünffache ab. Mit dieser Abnahme ging auch der Geruch nach Hydrogensulfid aus der Abluft des Reaktors einher, und außerdem wurde der Reaktor aufgrund der Bildung von Eisensulfid grau. Der Niederfrequenz-Phasenwinkel nahm auch ab (vgl. 82° gegenüber 68°). Eine ähnliche Änderung in den Impedanzspektren wurde auch mit den negativen Kontrollen B. subtilis BE1500 (Werte nicht dargestellt) und B. subtilis BE1500 (pBE92) (3) festgestellt, wobei jedoch die Änderung weiterhin um 24 Stunden verzögert war. Im Gegensatz dazu waren die drei Konstrukte, die antimikrobielle Mittel produzierten, in der Lage, das Ausmaß der Änderung der Impedanzspektren herabzusetzen (3). Das Indolicidin-Konstrukt war bei der Hemmung von SRB am wenigsten wirksam, wobei der Niederfrequenz-Phasenwinkel sich von 80° auf 69° änderte; dies war jedoch immer noch weniger als das Ergebnis, das mit der Kontrolle pBE92 festgestellt wurde (80° auf 61°). Die Bactenecin-Konstrukte (mit und ohne die Pro-Region) waren wirksamer als das Indolicidin-Konstrukt, wobei der Niederfrequenz-Phasenwinkel nur auf 76° abfiel. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Wachstum von SRB auf Edelstahl 304 durch die Bactenecin-Konstrukte signifikant gehemmt worden war.
  • Ähnliche Ergebnisse wurden auch mit B. subtilis WB600 erhalten (einem Stamm, dem sechs extrazelluläre Proteasen fehlten) (Wu et al., 1991), der die clonierten antimikrobiellen Mittel exprimierte (4). Die Zugabe von SRB zu B. subtilis WB600 (pBE92)- und B. subtilis WBN600 (pBE92-Ind)-Biofilmen auf Edelstahl 304 erniedrigte den Niederfrequenz-Phasenwinkel um 35° bzw. 17°; entsprechend nahm die Impedanz bei niederen Frequenzen auch 7-fach bzw. 5,5-fach ab. Jedoch wurde bei beiden Bactenecin-exprimierenden Biofilmen keine solche Abnahme festgestellt, obwohl das Bactenecin-Konstrukt etwas mehr Wirkung zeigte als das Pro-Bactenecin-Konstrukt (4). Dies legt nahe, dass die Prozessierung der Pro-Region zur Freisetzung des reifen Bactenecins in diesem Protease-defekten Stamm unwirksam war.
  • Korrosionsstudien in Batch- und kontinuierlichen Kulturen mit einem Bacillus-Stamm, der zusätzlich zu einem natürlich produzierten antimikrobiellen Stoff noch einen clonierten antimikrobiellen Stoff produzierte
  • Die Fähigkeit von B. polymyxa ATCC 10401 (der das antimikrobielle Peptid Polymyxin produziert), die Besiedelung von SRB auf Weichstahl zu hemmen, wurde in Batch- und kontinuierlichen Kulturen untersucht. In Batch-Kulturen war B. polymyxa in der Lage, den Beginn der SRB-Korrosion im Vergleich zu P. fragi K, der kein antimikrobielles Mittel produzierte, um 60 Stunden zu verzögern. Das Ergänzen des Wachstumsmediums führte nicht zu einer unmittelbaren Besiedelung des Metalls durch SRB (wie es sowohl mit P. fragi K als auch mit B. subtilis BE1500 zu sehen war) und kein schwarzer Niederschlag wurde innerhalb von 72 Stunden nachgewiesen. Somit war der Polymyxin produzierende B. polymyxa in der Lage, das Wachstum von SRB in Batch-Kulturen zu verzögern.
  • In kontinuierlichen Reaktoren mit Edelstahl 304 führte die Zugabe von SRB innerhalb von fast 250 Stunden zu keiner Veränderung der Impedanzspektren (im Gegensatz zu 36 Stunden für die Änderung der Impedanzspektren mit P. fragi K, 5). Kein Sulfid-Geruch wurde in der Abluft des Reaktors nachgewiesen, und im Reaktor nahm die Trübung nicht zu, wie es mit P. fragi K, B. subtilis BE1500 und B. subtilis WB600 festgestellt wurde. Deshalb war B. polymyxa in der Lage, das Wachstum von SRB auf Edelstahl 304 in kontinuierlichen Reaktoren zu hemmen. Eine ähnliche Korrosionshemmung wurde auch mit dem B. polymyxa festgestellt, der die antimikrobiellen Konstrukte aufwies (5), wobei das Ausmaß der Hemmung nicht von dem des Wildtypstamms zu unterscheiden war.
  • Diskussion
  • Die kationischen antimikrobiellen Peptide Indolicidin und Bactenecin wurden in B. subtilis BE1500 als Fusionen mit dem Signalpeptid der extrazellulären alkalischen Protease (apr) konstitutiv exprimiert, wobei ein ähnliches Verfahren wie das von Piers et al., 1993, und von Pang et al., 1992, verwendet wurde. Die synthetischen Oligos für Indolicidin und Bactenecin wurden als exakte Fusionen mit der Signalsequenz entworfen, so dass am N-Terminus des Peptids keine weiteren Aminosäuren angefügt wurden. Hierdurch wurde sichergestellt, dass das exprimierte Peptid maximal aktiv ist, und außerdem wurde die ungeeignete Prozessierung vermieden, die von Pang et al., 1992, festgestellt wurde, deren Expressionssystem sieben Aminosäuren an den N-Terminus des Skorpion-Insektentoxins I5A anfügte. Bactenecin wurde auch als ein Präpro-Peptid produziert, indem die DNA-Sequenz für den Pro-Teil der Barnase aus B. amyloliquefaciens (Paddon et al., 1989) zwischen dem Signalpeptid- und dem Bactenecin-Gen eingefügt wurde. Eine ähnliche Fusion von Präpro-Defensin führte zu einer vollständigen Verhinderung des proteolytischen Abbaus des ausgeschiedenen Peptids in S. aureus (Piers et al., 1993) und wurde auf die Bildung einer Sekundärstruktur zwischen der anionischen Pro-Region und dem kationischen Peptid zurückgeführt.
  • Indolicidin wurde in Bacillus als die Säureform exprimiert, wohingegen es in seiner natürlich vorkommenden Form in Rinder-Neutrophilen am C-Terminus amidiert ist. Die Lebensfähigkeit von B. subtilis wurde durch Indolicidin um vier Größenordnungen herabgesetzt, wohingegen B. polymyxa kein ähnliches Ausmaß an Empfindlichkeit gegenüber Indolicidin zeigte. Dies legt nahe, dass B. subtilis ein idealer Expressionswirt für die Expression von Indolicidin in Biofilmen wäre, insbesondere da Indolicidin in einem Biofilm nicht so stark wegdiffundieren würde wie in einer Suspensionskultur und somit die Wirtszellen angreifen könnte.
  • Die Empfindlichkeit von E. coli BK6 gegenüber eingeengten Kulturüberständen von B. subtilis BE1500 wurde als ein Indikator für die antimikrobielle Aktivität des Überstands eingesetzt, da dieses Bakterium üblicherweise verwendet wird, um die antimikrobielle Aktivität von kationischen Peptiden zu testen (Romeo et al., 1988; Selsted et al., 1992). Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Überstand von B. subtilis BE1500 (pBE92-Ind) keine Hemmung gegenüber E. coli zeigte, während der Überstand von B. subtilis BE1500 (pBE92-Bac) und von B. subtilis BE1500 (pBE92-ProBac) wirksam die Lebensfähigkeit von E. coli BK6 reduzierten.
  • In unseren Experimenten mit den kontinuierlichen Reaktoren stellten wir keinen Unterschied im Wachstum von B. subtilis BE1500 (pBE92) und B. subtilis BE1500 (pBE92-Ind) fest, wodurch eine schwache Expression von Indolicidin nahegelegt wird. Dies wurde auch durch die mit diesem Konstrukt in kontinuierlichen Reaktoren festgestellte fehlende Hemmung von SRB bestätigt, wie aus den Änderungen in den Impedanzspektren abgeleitet wurde (3). B. subtilis BE1500 war gegen Bactenecin um einen Faktor von 60 stärker resistent als gegen Indolicidin, dies könnte die Fähigkeit der Bactenecin-Konstrukte erklären, SRB auf Edelstahl zu hemmen.
  • Die Experimente in kontinuierlichen Reaktoren mit Edelstahl 304 zeigten deutlich, dass das Wachstum von SRB gehemmt war (dies beruhte sowohl auf qualitativen Indikatoren wie Geruch nach Hydrogensulfid und Niederschlag von Eisensulfid als auch auf der quantitativen Abnahme des Polarisationswiderstands Rp). Die Bactenecin-Konstrukte waren wirksamer als das Indolicidin-Konstrukt, das Wachstum von SRB zu hemmen; dies legt nahe, dass Bactenecin richtig exprimiert und prozessiert wurde, so dass eine Disulfidbindung erzeugt wurde, denn Defensine sind normalerweise inaktiv, wenn die Disulfidbindung nicht richtig prozessiert wird (Piers et al., 1993). Jedoch war es offensichtlich, dass die SRB nicht vollständig aus dem Biofilm ausgeschlossen wurden, denn alle Reaktoren wurden bei Zugabe von SRB stärker trüb, und außerdem war bei einem Reaktor mit B. subtilis BE1500 (pBE92-Bac) noch ein schwacher Sulfid-Geruch nachweisbar. Die Hemmung von SRB bei dem Bactenecin-produzierenden Konstrukt im Vergleich zur Kontrolle pBE92 wurde auch durch die 36-fache Abnahme der lebensfähigen SRB bestätigt, wie sie in einem siebentägigen Batch-Kultur-Biofilm auf Edelstahl 304 auftrat (Tabelle IV). Jedoch wurden sogar in Gegenwart von Bactenecin etwa 1 × 104 SRB/ml nachgewiesen, dies bestätigt, dass die SRB durch die clonierten antimikrobiellen Peptide nicht vollständig abgetötet wurden.
  • Ein Polymyxin produzierender B. polymyxa (Wildtyp) war auch in der Lage, das Wachstum von SRB (und den Beginn der durch SRB induzierten Korrosion) in Batch-Kulturen auf Weichstahl um 60 Stunden zu verzögern. Durch die Zugabe von Plasmiden, die antimikrobielle Mittel produzierten, zu B. polymyxa konnte seine Fähigkeit, SRB auf Weichstahl abzutöten, nicht signifikant verbessert werden. Jedoch war B. polymyxa, der auf Edelstahl 304 in kontinuierlichen Reaktoren gezüchtet wurde, in der Lage, das Wachstum von SRB vollständig zu hemmen (bis zu 275 Stunden). Unsere Beobachtungen, dass D. vulgaris nicht in der Lage ist, als Monokultur auf Edelstahl zu wachsen (wohingegen er dies auf Weichstahl kann), könnte auch die Wirksamkeit dieser antimikrobiellen Stoffe zur Hemmung von SRB nur auf Edelstahl erklären.
  • Die in diesem Beispiel dargestellten Ergebnisse zeigen, dass das Wachstum von SRB auf Edelstahl 304 durch die Erzeugung von antimikrobiellen Peptiden innerhalb des Biofilms eingeschränkt werden kann, und zeigen deren Potential zur Verhinderung der mikrobiell beeinflussten Korrosion von Stahl. Die Wirksamkeit von B. polymyxa, das Wachstum von SRB zu hemmen, stellt die Grundlage bereit, ein doppeltes Abtötungssystem zum Bekämpfen der durch SRB induzierten Korrosion zu optimieren, wobei niedrige Spiegel von zwei antimikrobiellen Stoffen (dem natürlich produzierten Stoff und dem clonierten antimikrobiellen Mittel) gleichzeitig wirken könnten, um die SRB zu hemmen.
  • Beispiel 5
  • Hemmung einer SRB-Besiedelung und Korrosion auf Weichstahl und auf Edelstahl durch Bakterien, die antimikrobielle Mittel ausscheiden
  • Dieses Beispiel zeigt die Hemmung einer SRB-Besiedelung und einer anaeroben Korrosion in Biofilmen auf Weichstahl und auf Edelstahl durch die Verwendung von Bakterien, die antimikrobielle Stoffe ausscheiden.
  • Das üblicherweise verwendete Antibiotikum Ampicillin wurde in dieser Studie als antimikrobielle Referenzsubstanz eingesetzt, um zu zeigen, das die Zugabe eines antimikrobiellen Mittels vor der SRB-Besiedelung einen brauchbaren Ansatz darstellen kann, um die durch SRB induzierte Korrosion zu reduzieren. Wie im vorherigen Beispiel gezeigt wurde, hemmt das aus zehn Aminosäuren bestehende ringförmige Peptid Gramicidin S SRB und wurde auch von außen als ein Modell-Peptidantibiotikum zugegeben, um die Möglichkeit der Produktion von antimikrobiellen Peptiden in Biofilmen zur Hemmung der Korrosion von Weichstahl und von Edelstahl zu zeigen. Weiterhin wurde ein Gramicidin-S-überproduzierender Bacillus brevis 18-Stamm (Azuma et al., 1992) eingesetzt, um einen Biofilm zu etablieren, der Gramicidin S ausscheidet und SRB auf Edelstahl hemmt.
  • Material und Methoden
  • Bakterienstämme, Medium und Wachstumsbedingungen
  • Alle aeroben Bakterien wurden aus einer Einzelkolonie in 10 ml modifiziertem Baar-Medium (ATCC Medium 1249) bei 30°C und 250 UpM (Schüttler Serie 25, New Brunswick Scientific, Edison, NJ) gezüchtet und sodann als Impfkultur für die Entwicklung von Biofilmen eingesetzt. D, vulgaris wurde in 15-ml-Röhrchen mit Schraubkappen gezüchtet, die 10 ml modifiziertes Baar-Medium enthielten, das mit jeweils 100 μl der Sauerstoff-Scavenger 4% Natriumsulfid und Oxyrase (Oxyrase (Oxyrase Inc., Mansfeld, OH) angereichert war. Die Anfangskulturen wurden aus den bei –85°C gehaltenen Glycerin-Stammkulturen gezüchtet; alle anschließenden Kulturen wurden mit einer 3% Impfkultur aus der Anfangskultur bei 30°C ohne Schütteln gezüchtet. D. vulgaris wurde routinemäßig in fest verschlossenen Röhrchen mit Schraubkappen gezüchtet und dem Luftsauerstoff ausgesetzt, ohne dass eine Schwierigkeit bei der Züchtung auftrat, wie von Angell und White (1995, vorstehend) gezeigt wurde. Die D. vulgaris-Kulturen wurden außerdem in bestimmten Zeitabständen in Gegenwart von 0,1% Eisen(II)-ammoniumsulfat gezüchtet, und das Vorliegen von sulfatreduzierenden Organismen wurde durch den Nachweis von schwarzem Eisensulfid in den Kulturröhrchen bestätigt. Außerdem wurde der Desulfoviridin-Test (Postgate, 1984) routinemäßig durchgeführt, wobei der Nachweis einer rosa Farbe unter UV-Licht das Vorliegen von D. vulgaris bestätigte. Gramicidin S wurde von Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Chloramphenicol von Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) und Ammoniummolybdat von Alrich Chemical Company (St. Louis, MO) bezogen.
  • Herstellung von Metallkupons
  • Kupons aus Weichstahl SAE 1018 für die Experimente mit den Batch-Kulturen (25,5 mm Durchmesser, 1,2 mm dick) und Platten aus Weichstahl SAE 1018 und Edelstahl 304 für die Experimente mit kontinuierlichen Kulturen (Quadrate von 7,5 × 7,5 cm, 1,2 mm dick) wurden aus einer Stammplatte ausgeschnitten und, wie früher beschrieben, zubereitet (Jayaraman et al., 1997a).
  • Korrosionsexperimente mit Batch-Kulturen
  • Korrosionsexperimente mit Batch-Kulturen wurde in 250 ml Erlenmeyer-Kolben bei 30°C ohne Schütteln, wie früher beschrieben, durchgeführt (Jayaraman et al., 1997a). Die dem D. vulgaris ausgesetzten Kupons aus Weichstahl (in dreifacher Ausführung) wurden gereinigt, indem die Oberfläche mit 0,01% Chromsäure abgerieben wurde, worauf wiederholte Waschgänge in warmem Wasser folgten; alle anderen Kupons wurden, wie früher beschrieben, gereinigt (Jayaraman et al., 1997a). Der spezifische Massenverlust (in mg/cm2 für den gesamten Oberflächenbereich des Kupons, 11,18 cm2) wurde als Indikator des Ausmaßes der Korrosion verwendet, von der angenommen wurde, dass sie gleichmäßig war. Das Wachstumsmedium wurde alle sieben Tage ergänzt, wobei es durch vorsichtige Zugabe entlang der Wände der Kolben ersetzt wurde (zusammen mit den geeigneten Antibiotika). Nach drei Tagen aerober Biofilm-Entwicklung wurde zu den Kolben eine SRB-Impfkultur von 3% (Vol./Vol.) zugegeben.
  • Korrosionsexperimente mit kontinuierlichen Kulturen unter Verwendung von EIS
  • Ein kontinuierlicher Reaktor wurde, wie früher beschrieben (Jayaraman et al., 1997c), verwendet, um Biofilme auf Metalloberflächen zu entwickeln. Anhand der elektrochemischen Impedanz-Spektroskopie (EIS) wurden die Impedanzdaten in mindestens zweifach durchgeführten Experimenten erhalten, wobei eine elektrochemische Solarton-Schlumberger-Messeinheit (SI 1280, Schlumberger Technical Instruments Division, San Jose, CA) verwendet wurde, die an einen Macintosh-Computer angeschlossen war (PowerMac 7100/80, Apple Computers, Cupertino, CA), auf dem die EISIS-Software für elektrochemische Experimente („EISIS electrochemical experimentation software") lief (University of California, Irvine) (hierfür kann auch eine ähnliche kommerzielle Software, THALES, verwendet werden). Das Potential des geöffneten Schaltkreises (OCP) wurde als das Potential zwischen der Metallprobe und der Referenzelektrode (Ag/AgCl) gemessen, und der Polarisationswiderstand wurde als DC-Grenzwert der Impedanz unter Verwendung der ANALEIS-Software bestimmt, die von Mansfeld et al. entwickelt wurde (ASTM Special Technical Protocol 1154: 186 (1992)). Die Korrosionsraten in kontinuierlicher Kultur wurden aus dem experimentellen Polarisationswiderstand Rp an Hand der Stern-Geary-Gleichung Rp = B/Icorr bestimmt, wobei B ein Parameter ist, der von den Tafel-Steigungen abhängt, und Icorr die Korrosions-Stromdichte darstellt, die unter Verwendung des Faradayschen Gesetzes in eine Korrosionsrate umgewandelt werden kann (Mansfeld, F., „The polarization resistance technique for measuring corrosion currents"; in: Fontana, M. G., Staehle, R. W., (Hrsg.), „Advances in Corrosion Science and Technology", Plenum Press, New York (1976)).
  • Eine 3% (Vo./Vol.) SRB-Impfkultur (Alter der Kultur 24 bis 48 Stunden) wurde nach drei bis fünf Tagen aerober Biofilm-Entwicklung zu dem Reaktor zugegeben. Basierend auf den minimalen Hemmkonzentrationen, die aus der Literatur verfügbar sind (Saleh et al., 1964), und auch auf den Ergebnissen über die Empfindlichkeit von SRB in Suspensionskulturen gegenüber verschiedenen anorganischen und antimikrobiellen Mitteln, die in diesem Labor erhalten wurden, wurden in einem Versuch, die SRB zu hemmen, Ampicillin (200 μg/ml), Chloramphenicol (200 μg/ml), sowohl Ampicillin (200 μg/ml) als auch Chloramphenicol (100 μg/ml) und sowohl Ampicillin (200 μg/ml) als auch Ammoniummolybdat (200 μg/ml) zu den Reaktoren zugegeben (bevor oder nachdem die SRB das Metall besiedelt hatten). Alle mikrobiellen Stoffe wurden gleichzeitig zu den Nährstoffen und zum Reaktor in geeigneten Konzentrationen zugefügt.
  • Zählen der lebensfähigen SRB in Biofilmen
  • Aerobe Biofilme wurden auf Kupons aus Edelstahl 304 (25,5 mm Durchmesser, 1,2 mm dick) in 250-ml-Erlenmeyer-Kolben zwei Tage mit modifiziertem Baar-Medium bei 30°C entwickelt. Eine 1,0% (Vol./Vol.) Impfkultur von D. vulgaris (OD600 = 0,16 bis 0,18) wurde zugegeben, und man ließ sie weitere vier Tage den Biofilm besiedeln. Die Metallkupons wurden sorgfältig aus den Kolben entnommen und zweimal durch Eintauchen in destilliertes Wasser gespült, um die lose angehefteten Zellen zu entfernen. Danach wurde der Biofilm mit einem sterilen Spatel abgeschabt und in 500 μl modifiziertem Baar-Medium resuspendiert. Aerobe Bakterien wurden durch Zählung der Platten bestimmt, und lebensfähige SRB wurden durch den Drei-Röhrchen-MPN-Test gezählt (Greenberg, 1992, vorstehend).
  • Ergebnisse
  • Batch- und kontinuierliche Korrosion mit dem keinen antimikrobiellen Stoff produzierenden P. fragi K und D. vulgaris auf Weichstahl SAE 1018
  • Der Massenverlust der Kupons aus Weichstahl SAE 1018 in modifiziertem Baar-Medium in Gegenwart von P. fragi K und D. vulgaris wurde 28 Tage in stationären Batch-Kulturen bei 30°C untersucht. Immer wenn D. vulgaris im Biofilm vorlag, waren die Kupons mit einer dicken schwarzen Ablagerung bedeckt, und es war schwierig, sie zu reinigen. Eine doppelte Kultur von P. fragi K und D. vulgaris erzeugte nach 21 Tagen Exposition im Vergleich zu einer Monokultur von P. fragi K eine 1,8-fache Zunahme der Korrosionsrate; jedoch war die in beiden Fällen festgestellte Korrosionsrate immer niedriger als diejenige, die mit sterilem modifiziertem Baar-Medium ermittelt wurde (Tabelle V). Die Korrosionsrate, die mit einer Monokultur von D. vulgaris auf SAE 1018-Stahl festgestellt wurde, war nach 14 Tagen (1,4-fach) und nach 21 Tagen (2,5-fach, extrapoliert aus Tabelle V) höher als diejenige in sterilem Medium. Wenn man Ampicillin (100 μg/ml) zu den Kolben zufügte, bevor man D. vulgaris den Metallkupon besiedeln ließ, war der festgestellte Massenverlust 40% (eine Woche) bis 14% (drei Wochen) geringer als derjenige, der festgestellt wurde, wenn Ampicillin nach den SRB zugegeben wurde (Tabelle V). Die makroskopische Untersuchung der mit D. vulgaris in Kontakt gebrachten Metallkupons zeigte bei allen diesen Experimenten das Vorliegen zahlreicher Löcher.
  • Der anaerobe D. vulgaris wuchs in kontinuierlichen Reaktoren mit einer Belüftungsrate von 200 ml/Min. in den Luftraum des Reaktors als Monokultur, dies wurde durch die Entwicklung eines schwarzen Eisensulfid-Niederschlags und durch einen Geruch nach Hydrogensulfid aus der Abluft der Reaktors gezeigt. Das Wachstum von D. vulgaris in kontinuierlichen Reaktoren erhöhte Rp nach 72 Stunden im Vergleich zu sterilen Kontrollen um das 90-Fache. Die Zugabe von 200 μg/ml Ampicillin nach 240 Stunden SRB-Wachstum veränderte Rp nicht, und der Reaktor blieb schwarz mit dem charakteristischen Geruch nach Sulfid aus der Abluft (Tabelle VI). Eine Kombination von 200 μg/ml Ampicillin und 200 μg/ml Ammoniummolybdat nach 320 Stunden klärte den Reaktorüberstand auf; jedoch wurde der Sulfid-Geruch immer noch nachgewiesen; dies zeigt, dass die Korrosionsrate nicht abnahm und das Wachstum der SRB nicht gehemmt war.
  • Die Zugabe von D. vulgaris zu einem kontinuierlichem P. fragi K-Reaktor erhöhte Rp von Weichstahl nach 36 Stunden um das Dreifache und veränderte die Frequenzabhängigkeit des Phasenwinkels; der Reaktor wurde schwarz, und der Sulfid-Geruch wurde in der Abluft des Reaktors nachgewiesen (Tabelle VI und 6). Vor der Zugabe von D. vulgaris erreichte die Impedanz bei niedriger Frequenz asymptotisch einen gleichbleibenden Wert (4,52 × 104 Ohm·cm2); jedoch wurde der Reaktor innerhalb von 24 Stunden nach der Zugabe von SRB schwarz, der Sulfid-Geruch wurde nachgewiesen und die Impedanz verhielt sich bei der niedrigsten Frequenz (1,4 × 10–3 Hz) nicht mehr asymptotisch. Durch Zugabe von 200 μg/ml Ampicillin (Tabelle VI) und einer Kombination von 100 μg/ml Ampicillin und 25 μg/ml Chloramphenicol nach 120 und 150 Stunden SRB-Wachstum (Werte nicht gezeigt) wurde der Rp auch nicht auf seinen Wert vor der Zugabe der SRB gebracht; dies zeigt, dass keine Hemmung von SRB erfolgte.
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001
  • Kontinuierliche Korrosionsraten mit dem keinen antimikrobiellen Stoff produzierenden P. fragi K und D. vulgaris auf Edelstahl S.S. 304
  • Kein Unterschied wurde zwischen den Impedanzspektren für steriles Baar-Medium und mit P. fragi K auf Edelstahl 304 nach etwa 900 Stunden Exposition festgestellt. D. vulgaris wuchs nicht als Monokultur auf Edelstahl 304, und die Zugabe von D. vulgaris zu einem P. fragi K-Reaktor änderte die Frequenzabhängigkeit der Impedanz bei niedrigeren Frequenzen innerhalb von 48 Stunden (7). Der Phasenwinkel zeigte bei Zugabe von SRB einen minimalen Wert; dies macht das Auftreten einer neuen Zeitkonstante bei sehr niedrigen Frequenzen deutlich (7), außerdem nahm der maximale Wert des Phasenwinkels von 81° auf 69° ab.
  • Wenn Änderungen in den Impedanzspektren auftraten, war auch der Sulfid-Geruch in der Abluft des Reaktors nachweisbar, außerdem wurde der Reaktor grau. Die Zugabe von 200 μg/ml Ampicillin (7), von sowohl 200 μg/ml Ampicillin als auch 100 μg/ml Chloramphenicol (Tabelle VII, zweite Spalte) oder von sowohl 200 μg/ml Ampicillin als auch 200 μg/ml Ammoniummolybdat (Werte nicht dargestellt) zu einem Doppelkultur-Reaktor veränderte die Impedanzspektren nicht zu dem vor der Zugabe von D. vulgaris festgestellten Verhalten mit einfacher Einmal-Zeitkonstante („one-time-constant") (7) oder dahingehend, dass die Produktion von Hydrogensulfid oder Eisensulfid aufhörte; dies macht deutlich, dass die SRB nicht abgetötet worden waren.
  • Figure 00600001
  • Kontinuierliche Korrosionsraten mit dem Biofilm, der vor der Zugabe von D. vulgaris gereinigten SRB-hemmenden antimikrobiellen Mitteln ausgesetzt wurde Um festzustellen, ob antimikrobielle Mittel die Hemmung von SRB bewirken, wenn sie vor der SRB-Besiedelung zugegeben werden, wurden P. fragi K-Biofilme, die kein antimikrobielles Mittel produzierten, auf Weichstahl SAE 1018 und auf Edelstahl 304 mit 100 μg/ml Ampicillin oder Gramicidin S 24 Stunden in Kontakt gebracht, bevor D. vulgaris zugegeben wurde. P. fragi K wuchs in Suspensionskulturen, die 100 μg/ml der beiden antimikrobiellen Mittel enthielten, über Nacht bis zur Sättigung; somit wurde der Organismus durch Zugabe dieser antimikrobiellen Stoffe nicht beeinträchtigt.
  • Wenn D. vulgaris zu Weichstahl- oder Edelstahl-Reaktoren nach der Zugabe von Ampicillin zugefügt wurde, wurde innerhalb von bis zu 100 Stunden keine Änderung in den Impedanzspektren und von Rp festgestellt (6 und 7, Tabellen VI und VII). Kein Sulfid-Geruch wurde in der Abluft des Reaktors nachgewiesen; somit wurde D. vulgaris in den Reaktoren durch diese antimikrobiellen Stoffe vollständig gehemmt. Auch die Zugabe des ringförmigen antimikrobiellen Dekapeptids Gramicidin S zu 100 μg/ml von außen bewirkte in den Experimenten mit Edelstahl 304 die vollständige Hemmung des Wachstums von D. vulgaris, wie durch die kapazitive Eigenschaft der Impedanzspektren gezeigt wurde (7 und Tabelle VI); jedoch wurde der Reaktor mit Weichstahl nach 80 Stunden SRB-Exposition grau, obwohl kein Anstieg im Rp auftrat (8 und Tabelle VII). Somit war der Beginn einer durch D. vulgaris induzierten Korrosion von Weichstahl im Vergleich zu P. fragi K und D. vulgaris ohne vorliegendes Gramicidin S verzögert.
  • Batch- und kontinulierliche Korrosionsraten mit den antimikrobielle Stoffe produzierenden Bacilli und D. vulgaris auf Weichstahl SAE 1018 und Edelstahl 304
  • Batch-Korrosionsstudien an Kupons aus SAE 1018-Stahl mit D. vulgaris und antimikrobielle Stoffe produzierenden Bacillus-Biofilmen (basierend auf ihrer beschriebenen Produktion von antimikrobiellen Peptiden, Tabelle V) zeigten, dass alle Bacilli in der Lage waren, die Besiedelung von D. vulgaris bis zu eine Woche einzuschränken (deutlich gemacht durch die kleineren, 1,2- bis 1,4-fachen Anstiege der Korrosionsrate, im Vergleich zu einem größeren, 1,8-fachen Anstieg für P. fragi K in modifiziertem Baar-Medium, Tabelle V, und außerdem dadurch, dass keine schwarze Färbung und kein Sulfid-Geruch entstanden). Wenn jedoch das Medium nach sieben Tagen ergänzt wurde, wurden alle Kolben außer denjenigen mit B. brevis 18 schwarz, und außerdem wurde Eisensulfid innerhalb von 24 Stunden nachgewiesen. Der Anstieg der Korrosionsrate mit D. vulgaris in Gegenwart der Bacilli (1,2- bis 1,5-facher Anstieg) war mit dem vergleichbar, der mit P. fragi K und D. vulgaris zu sehen war (1,6-facher Anstieg). Der mit B. brevis 18 und SRB festgestellte Massenverlust war mit dem mit P. fragi K alleine erhaltenen vergleichbar und fast zweimal besser als derjenige, der mit P. fragi K und SRB erhalten wurde (Tabelle V). Während des ganzen Experiments wurde kein Sulfid-Geruch festgestellt. Die Wirksamkeit von Gramicidin S, das Wachstum von SRB in Batch-Kulturen zu hemmen, wurde auch durch die in drei Größenordnungen erfolgte Abnahme der lebensfähigen SRB bestätigt, die in einem B. brevis 18-Biofilm auf Edelstahl 304 nach vier Tagen Wachstum im Vergleich zu einem P. fragi K-Biofilm, der kein antimikrobielles Mittel produzierte, nachgewiesen wurde (durch den Drei-Röhrchen-MPN-Test) (vgl. 5,47 × 102/m1 gegenüber 8,47 × 105/ml).
  • Die Korrosionsraten in kontinuierlicher Kultur mit B. brevis 18, einem Gramicidin-S-überproduzierenden Stamm (Azuma et al., 1992), wurden in Gegenwart von D. vulgaris auf Weichstahl SAE 1018 erhalten (9 und Tabelle VI); der Anstieg im Rp, der bei Zugabe von D. vulgaris zu P. fragi K auf Weichstahl festgestellt wurde, war um 24 Stunden verzögert. Schließlich scheinen die SRB den Biofilm besiedelt zu haben, wie durch den Geruch von Hydrogensulfid aus der Abluft des Reaktors gezeigt wurde: jedoch blieb Rp bei 5,78 × 104 Ohm·cm2 konstant, im Gegensatz zu 3,43 × 104 Ohm·cm2 vor der Zugabe der SRB.
  • 8 und Tabelle VII zeigen, dass die Zugabe von D. vulgaris zu einem B. brevis 18-Biofilom auf Edelstahl Typ 304 den Rp nach 120 Stunden nicht erniedrigte, auch wenn der Geruch von Sulfid in der Abluft des Reaktors 48 Stunden nach Zugabe von D. vulgaris nachgewiesen wurde. Somit war der Gramicidin-S-produzierende B. brevis 18 in der Lage, die Besiedelung von SRB auf Edelstahl 304 zu hemmen, während er das Wachstum von SRB auf Weichstahl SAE 1018 nur verzögern konnte.
  • Diskussion
  • D. vulgaris wurde als repräsentatives sulfatreduzierendes Bakterium ausgewählt, um die Wirksamkeit von in situ-produzierten antimikrobiellen Stoffen zu testen, die anaerobe Korrosion zu hemmen, da berichtet wurde, dass es die Korrosion beschleunigt (Gaylarde, 1992) und dass Stämme dieser Art die Fähigkeit besitzen, einem Sauerstoffstress zu widerstehen (Hardy, J. A., Hamilton, W. A., Curr. Microbiol. 6: 259–262 (1981)). D. vulgaris zeigte eine deutliche Beständigkeit, als eine Monokultur in stationären Batch-Kulturen und in kontinuierlichen Reaktoren mit einem darin enthaltenen sauerstoffgesättigten Luftraum zu wachsen und Kupons aus Weichstahl zu korrodieren, wie durch die schwarze Verfärbung des Mediums gezeigt wurde (Gaylarde, 1992, vorstehend). Außerdem war D. vulgaris in der Lage, innerhalb eines aeroben Biofilms in Schüttelkolben unter Bedingungen mit Sauerstoffsättigung im Luftraum über der Flüssigkeit und außerdem in kontinuierlichen Reaktoren bei einer Belüftungsrate in den Luftraum des Reaktors von 200 ml/Min. zu wachsen. Die Wachstumsbedingungen für D. vulgaris waren in dieser Studie sehr ähnlich wie diejenigen, die von Gaylarde (1992, vorstehend) und auch von Hamilton und Lee (1995) verwendet wurden (Biocorrosion, S. 243–264; in: Barton, L. L., (Hrsg.), „Sulfat-reducing Bacteria", Plenum Press, New York), und sie wurden dann als besonders aggressiv bezeichnet, wenn eine kleine Menge Sauerstoff in einer SRB-Kultur vorliegt, wobei dies zu maximalen Korrosionsraten führt.
  • Kupons aus Weichstahl, die Batch-Kulturen mit P. fragi K und D. vulgaris ausgesetzt wurden, zeigten im Vergleich zu einer Exposition gegenüber Monokulturen von P. fragi K einen Anstieg der Korrosionsraten, ähnlich, wie im Bericht von Jack et al. (Corr. Sci. 33: 1843–1853 (1992) und Gaylarde (1992, vorstehend) beschrieben. Die Zugabe von verschiedenen Kombinationen von Antibiotika zu Batch-Kulturen zur Hemmung des Wachstums von D. vulgaris erwies sich zur Hemmung der Korrosion nicht als erfolgreich (Tabelle V). Jedoch waren Batch-Kulturen von Bacilli, die einen antimikrobiellen Stoff produzierten, in der Lage, den Beginn einer durch SRB induzierten Korrosion im Vergleich zu einer Monokultur an bis zu sieben Tage zu verzögern. Dieser SRB-hemmende Effekt nahm bei den meisten Bacilli deutlich ab, nachdem das Wachstumsmedium ergänzt worden war. Da die meisten antimikrobiellen Mittel sekundäre Metaboliten sind (Bailey, J. E., Ollis, D. F., „Biochemical Engineering Fundamentals", 2. Aufl., McGraw-Hill Publishing Company, New York, (1986)) und während der stationären Wachstumsphase produziert werden (Doi, R. H., McGlouglin, M., 1992, „Biology of Bacilli"; Application to industry; Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992)), könnte durch das Ergänzen des Wachstumsmediums nach sieben Tagen der größte Teil des im Biofilm vorliegenden antimikrobiellen Stoffs entfernt worden sein und dadurch für D. vulgaris die Möglichkeit geschaffen worden sein, die Metalloberfläche zu besiedeln, bevor wieder hemmende Spiegel des antimikrobiellen Mittels erzeugt wurden. Jedoch hemmte B. brevis 18 das Wachstum von SRB bis zu 28 Tage vollständig, dies beruhte auf der Überproduktion von Gramicidin S, die ein Ergebnis der zur Herstellung dieses Stamms verwendeten Mutagenese war (Azuma et al., 1992). Dieses Ergebnis zeigte die Fähigkeit von Gramicidin S, die SRB abzutöten, und machte nicht nur deutlich, dass antimikrobielle Mittel vor der Besiedelung mit SRB erfolgreich mit Hilfe von anderen Bakterien in den Biofilm eingeführt werden konnten, sondern auch, dass die auf diese Weise eingeführten antimikrobiellen Verbindungen das Wachstum von SRB hemmten.
  • Anhand der Impedanzspektren von Weichstahl und von Edelstahl wurde das Korrosionsverhalten charakterisiert, das mit diesen Metallen in kontinuierlichen Kulturen festgestellt wurde. Die Zugabe von D. vulgaris zu P. fragi K auf SAE 1018 in den Weichstahl-Reaktoren erhöhte den Rp; dies zeigt, dass die Korrosionsrate reduziert wurde. Diese anscheinend widersprüchliche Feststellung könnte dadurch erklärt werden, dass sich auf der Metalloberfläche eine Oxidschicht bildet; da modifiziertes Baar-Medium einen pH-Wert von 7,5 (neutral) aufweist, löst sich die gebildete Rostschicht nicht auf, wie es in einer saureren Umgebung zu erwarten wäre. Dieser Aufbau von Rost könnte einen Anstieg im Rp und eine apparente Abnahme in der Korrosionsrate verursachen. Die Gültigkeit der Schlussfolgerungen aus der EIS hinsichtlich der Hemmung von SRB kann dadurch verifiziert werden, dass eine gute Übereinstimmung besteht zwischen den Rp Werten, die aus den Experimenten des Massenverlusts in Batch-Kulturen berechnet wurden, und den Werten, die mit EIS für Weichstahl erhalten wurden (Tabelle VI).
  • Eine einfache Einmal-Zeitkonstante (OTG; "one-time-constant") wurde mit P. fragi K und P. fragi K plus Ampicillin plus SRB (6) auf Weichstahl festgestellt, die für eine gleichmäßige Korrosion in neutralen Medien typisch ist (Mansfeld, F., Lorenz, W. J., „Electrochemical impedance spectroscopy (EIS): Application in corrosion science and technology"; in: Varma, R., Selman, J. R., (Hrsg.), „Techniques for charaterization of electrodes and electrochemical processes", John Wiley & Sons, New York (1991)) (nachstehend: Mansfeld und Lorenz, 1991), und außerdem waren die für diese zwei Experimente erhaltenen Rp- und Kapazitäts-Werte (C) ähnlich (Tabelle VII). Für P. fragi K plus SRB auf Weichstahl legt die Frequenzabhängigkeit des Phasenwinkels φ bei den niedrigsten Frequenzen nahe, dass eine neue Zeitkonstante vorliegt; dies könnte für den Lockfraß verantwortlich sein, während die symmetrische Frequenzabhängigkeit von φ für P. fragi K plus SRB plus Ampicillin und die Verschiebung der gesamten Impedanzkurve im Vergleich zu der für P. fragi K aufgrund eines höheren Rp zustande kommen könnten (6). Ähnliche Kapazitätswerte wurden in den Spektren für P. fragi K plus SRB und P. fragi K plus SRB plus Ampicillin auf Weichstahl gefunden; jedoch war es nicht möglich, diesen Spektren einem einfachen äquivalenten Schaltkreis zuzuordnen und quantitative Werte von Rp und C zu ermitteln. Die Impedanzspektren für B. brevis 18, B. brevis 18 plus SRB und P. fragi K plus Gramicidin S plus SRB auf Weichstahl zeigten die Frequenzabhängigkeit, die üblicherweise bei einer gleichmäßigen Korrosion festzustellen ist, und Rp könnte für den DC-Grenzwert (φ = 0°) des Impedanzmoduls |Z| verantwortlich sein (9).
  • Auch Edelstahlproben, die in Reaktoren mit sterilem Medium exponiert waren, erreichten keinen gleichbleibenden Impedanzwert bei niedriger Frequenz. Der fehlende Unterschied in den Impedanzspektren zwischen sterilen Kontrollen und Reaktoren mit Edelstahl 304 mit P. fragi K oder B. brevis zeigt, dass während des Zeitraums eine sehr geringe Korrosion stattfand. Diese Ergebnis ist ähnlich wie die Beobachtung von Hernandez et al., 1994, die in einer Lösung mit neun Salzen in 20 Tagen keinen gleichbleibenden Impedanzwert bei niedriger Frequenz bei Weichstahl feststellten und dies einer nicht vorhandenen Korrosion zuschrieben.
  • Die Spektren von Edelstahl 304 für P. fragi K und P. fragi K plus Ampicillin plus SRB waren mit hohen Rp-Werten von etwa 2 × 107 Ohm·cm2 und Kapazitätswerten zwischen 100 und 200 μF/cm2 kapazitiv; dies weist auf eine gleichmäßige Korrosion hin, die für Edelstahl in neutralen Medien typisch ist (Mansfeld und Lorenz, 1991). Eine Abweichung von einem rein kapazitiven Verhalten, ähnlich wie beim Weichstahl, wurde mit P. fragi K plus SRB und P. fragi K plus SRB plus Ampicillin auf Edelstahl 304 festgestellt (7), wobei es nicht möglich war, diese Impedanzdaten einem einfachen EC zuzuordnen. Für P. fragi K plus SRB wurde eine neue Zeitkonstante ermittelt, wie aus dem Minimum von φ bei etwa 0,01 Hz zu erkennen war (7). Diese Impedanzspektren für B. brevis 18, B. brevis 18 plus SRB, und P. fragi K plus Gramicidin S plus SRB waren alle kapazitiv, und die mit B. brevis 18 und B. brevis 18 plus SRB festgestellten Rp- und C-Werte waren ähnlich wie diejenigen, die mit P. fragi K ermittelt wurden (8).
  • Obwohl das Ausmaß der Änderungen in den Korrosionsraten für alle Expositionsbedingungen nicht genau bestimmt werden kann, ohne die experimentellen Werte geeigneten äquivalenten Schaltkreisen zuzuordnen, kann man doch hieraus folgern, dass die Korrosionsraten aufgrund der Produktion von Hydrogensulfid bei der Zugabe von SRB anstiegen. Genauso lassen die Änderungen im Phasenwinkel von Edelstahl 304 bei der Zugabe von SRB erkennen (7b), dass weitere elektrochemische Prozesse auftreten, und sie legen eine örtliche Korrosion nahe (Mansfeld und Lorenz, 1991). Somit machen die fehlenden Änderungen in den Impedanzspektren, wenn gereinigte antimikrobielle Stoffe vor der Zugabe von SRB vorlagen oder wenn Gramicidin S durch den Biofilm erzeugt wurde, deutlich, dass die SRB auf Edelstahl gehemmt wurden (8).
  • Von Ampicillin und Chloramphenicol weiß man, dass sie Suspensionskulturen von D. vulgaris bei 1 μg/ml bzw. 3 μg/ml hemmen (Odom und Singleton, 1993). Da bekannt ist, dass Biofilme gegen Biozide 10 bis 1000-mal resistenter sind (Cheung und Beech, 1996), wurden in dieser Studie bis zu 200 μg/ml der beiden Antibiotika eingesetzt. Wenn diese Zusätze jedoch zugegeben wurden, nachdem SRB die Metalloberfläche besiedelt hatten, konnte dadurch auf beiden Stahltypen die weitere Produktion von Sulfid nicht gestoppt oder die Korrosionsraten nicht herabgesetzt werden. Dies stimmt mit den Beobachtungen von Franklin et al. (1991) (Corrosion 47: 128–134) überein, die feststellten, dass SRB in der Lage sein können, die Exposition gegenüber Halogen-Bioziden mindestens 26 Stunden zu überleben, und es stimmt auch mit den Ergebnissen von Franklin et al., (1989) („An analogue MIC system with specific bacterial consortia, to test effectiveness of materials selection and countermeasures", vorgestellt auf der Corrosion 89, New Orleans, LA, National Association of Corrosion Engineers, Houston, TX) überein, die berichteten, dass bei Zusatz eines Biozids in einer Biofilm-Population eine Abnahme von drei bis vier Größenordnungen stattfand, die jedoch anmerkten, dass die Population innerhalb von 24 Stunden nach Beendigung der Biozid-Dosis ihre vor der Behandlung vorliegende Dichte wieder erreicht hatte. Eine ähnliche Beobachtung wurde in dieser Studie mit Weichstahl-Reaktoren gemacht; wenn die Zugabe des Ampicillin-enthaltenden Mediums eingestellt wurde, kam es innerhalb von 36 Stunden zum Beginn einer SRB-induzierten Korrosion.
  • Beispiel 6
  • Verwendung des Verfahrens zum Beimpfen von Wasserkühltürmen gegen eine mit SRB zusammenhängende Korrosion
  • Diese Beispiel zeigt die Verwendung der Erfindung zum „Beimpfen" eines Wasserkühlturms gegen eine mit SRB zusammenhängende Korrosion. Ein neuer Wasserkühlturm wird in einem Energieunternehmen installiert. Wenn der Turm fertig ist, um in Betrieb genommen zu werden, wird eine Kultur von Bacillus polymyxa, der rekombinant verändert wurde, so dass er Bactenecin in einer Konzentration von etwa 1 bis 10 μg/ml ausscheidet, in die Wasserversorgung in einer Konzentration von etwa 103 bis etwa 106 Zellen/ml zugegeben, vorzugsweise in einer verdünnten billigen komplexen Nährbrühe, z.B. Luria Bertani, die sodann durch den Wasserturm zirkuliert wird. Bevor das zum „Beimpfen" des Turms verwendete Wasser trocknet, wird der Turm an die normale Wasserversorgung angeschlossen und ganz normal in Betrieb genommen.
  • Beispiel 7
  • Verwendung des Verfahrens zum Schutz einer bereits vorliegenden Struktur
  • Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des Verfahrens zur Behandlung einer Rohrleitung, die bereits in Betrieb ist. An einem feuchten Teil der Rohrleitung wird die Oberfläche abgeschabt und die im Biofilm der Rohrleitung vorliegenden Bakterien gezüchtet. Eine oder mehrere der gezüchteten Gram-positiven Bakterienarten (bevorzugt, da solche Bakterien nur eine einzelne Zellmembran besitzen, durch die sie antimikrobielle oder antikorrosive Mittel oder beide ausscheiden können) werden anhand bestimmter Kriterien ausgewählt, z.B. der Einfachheit und der Verlässlichkeit der genetischen Transformation und Züchtung. Danach werden die ausgewählten Gram-positiven Bakterien durch Konjugation mit einem chromosomalen Insertionsvektor transformiert, z.B. pCNB5, der das Gen für Bactenecin codiert. Die transformierten Bakterien werden gezüchtet und danach getestet, um die Sekretion des Anti-SRB-Mittels zu bestätigen. Anschließend werden die Kulturen, die positiv auf die Sekretion des Anti-SRB-Mittels getestet wurden, in großen Mengen gezüchtet und Aliquots der resultierenden Kultur in bestimmten Abständen in die Rohrleitung eingeführt, so dass Konzentrationen von 103 bis etwa 106 Zellen/ml erhalten werden.
  • Obwohl die vorstehende Erfindung in einer gewissen Ausführlichkeit anhand von Erläuterungen und anhand von Beispielen beschrieben wurde, um zum besseren Verständnis beizutragen, ist es für den Fachmann aus den Angaben der vorliegenden Erfindung ersichtlich, dass auch bestimmte Veränderungen und Modifikationen davon durchgeführt werden können.

Claims (72)

  1. Verfahren zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines aeroben Bakteriums umfasst, das eine chemische Zusammensetzung in einer Menge sezerniert, die zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreichend ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Metall Stahl ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Stahl Weichstahl ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, worin der Stahl Edelstahl ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Metall Aluminium oder eine Aluminiumlegierung ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Metall Kupfer oder eine Kupferlegierung ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Titan, Nickel, einer Titanlegierung und einer Nickellegierung.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, worin das abbauempfindliche Material Beton ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, worin das abbauempfindliche Material Stahlbeton ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das abbauempfindliche Material Zement ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium von der Gattung Pseudomonas stammt.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium von der Gattung Bacillus stammt.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, worin es sich bei der chemischen Zusammensetzung um eine handelt, die nicht durch Wildtyp-Mitglieder der auf das Material aufgebrachten Bakterienspezies sezerniert wird.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium zur Sekretion der chemischen Zusammensetzung in höheren Konzentrationen als von den Wildtyp-Mitgliedern seiner Spezies rekombinant verändert wurde.
  16. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Zusammensetzung ein Antibiotikum ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, worin das Antibiotikum aus der Gruppe Gramicidin S, Indolicidin, Polymyxin und Bactenecin ausgewählt ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Zusammensetzung Polyaspartat ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Zusammensetzung Polyglutamat ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Zusammensetzung Polyglycin ist.
  21. Verfahren nach Anspruch 1, worin die chemische Zusammensetzung ein Siderophor ist.
  22. System zur Inhibition der Korrosion eines Materials, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, umfassend ein Material mit einem Biofilm auf seiner Oberfläche, wobei der Biofilm ein Bakterium umfasst, das eine chemische Zusammensetzung in einer Menge sezerniert, die zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreichend ist.
  23. System nach Anspruch 22, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  24. System nach Anspruch 23, worin das Metall Stahl ist.
  25. System nach Anspruch 24, worin der Stahl Weichstahl ist.
  26. System nach Anspruch 24, worin der Stahl Edelstahl ist.
  27. System nach Anspruch 23, worin das Metall Aluminium oder eine Aluminiumlegierung ist.
  28. System nach Anspruch 23, worin das Metall Kupfer oder eine Kupferlegierung ist.
  29. System nach Anspruch 23, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Titan, Nickel, einer Titanlegierung und einer Nickellegierung.
  30. System nach Anspruch 22, worin das abbauempfindliche Material Beton ist.
  31. System nach Anspruch 22, worin das abbauempfindliche Material Stahlbeton ist.
  32. System nach Anspruch 22, worin das abbauempfindliche Material Zement ist.
  33. System nach Anspruch 22, worin das Bakterium von der Gattung Bacillus stammt.
  34. System nach Anspruch 22, worin das Bakterium von der Gattung Pseudomonas stammt.
  35. System nach Anspruch 22, worin es sich bei der chemischen Zusammensetzung um eine handelt, die nicht durch Wildtyp-Mitglieder der auf das Material aufgebrachten Bakterienspezies sezerniert wird.
  36. System nach Anspruch 22, worin das Bakterium zur Sekretion der chemischen Zusammensetzung in höheren Konzentrationen als von den Wildtyp-Mitgliedern seiner Spezies rekombinant verändert wurde.
  37. System nach Anspruch 22, worin die chemische Zusammensetzung ein Antibiotikum ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, worin das Antibiotikum aus der Gruppe Gramicidin S, Indolicidin, Polymyxin und Bactenecin ausgewählt ist.
  39. System nach Anspruch 22, worin die chemische Zusammensetzung aus der Gruppe Polyaspartat, Polyglutamat, Polyglycin und der Siderophoren ausgewählt ist.
  40. Verfahren zur Inhibition des Wachstums von sulfatreduzierenden Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines Bakteriums umfasst, das zur Sekretion einer chemische Zusammensetzung in höheren Mengen als von den Wildtyp-Mitgliedern seiner Spezies rekombinant verändert wurde, welche von dem Bakterium sezernierte Mengen zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreichend sind.
  41. Verfahren nach Anspruch 40, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  42. Verfahren nach Anspruch 41, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, einem Stahl, Aluminium, einer Aluminiumlegierung, Kupfer, einer Kupferlegierung, Titan, einer Titanlegierung, Nickel und einer Nickellegierung.
  43. Verfahren nach Anspruch 40, worin das abbauempfindliche Material aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Beton, Stahlbeton und Zement.
  44. Verfahren nach Anspruch 40, worin das Bakterium ein Aerobier ist.
  45. Verfahren nach Anspruch 44, worin das Bakterium von einer Gattung stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas und Bacillus.
  46. Verfahren nach Anspruch 40, worin die chemische Zusammensetzung ein Antibiotikum ist.
  47. Verfahren nach Anspruch 40, worin die chemische Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polyaspartat, Polyglutamat, Polyglycin und einem Siderophor.
  48. Verfahren zur Inhibition des Wachstums von sulfatreduzierenden Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines Bakteriums einer Spezies umfasst, welches Bakterium zur Sekretion einer chemischen Zusammensetzung, welche das Wachstum sulfatreduzierender Bakterien inhibiert, rekombinant verändert ist, welche chemische Zusammensetzung nicht durch Wildtyp-Mitglieder der Spezies sezerniert wird.
  49. Verfahren nach Anspruch 48, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  50. Verfahren nach Anspruch 49, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, einem Stahl, Aluminium, einer Aluminiumlegierung, Kupfer, einer Kupferlegierung, Titan, einer Titanlegierung, Nickel und einer Nickellegierung.
  51. Verfahren nach Anspruch 48, worin das abbauempfindliche Material aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Beton, Stahlbeton und Zement.
  52. Verfahren nach Anspruch 48, worin das Bakterium ein Aerobier ist.
  53. Verfahren nach Anspruch 52, worin das Bakterium von einer Gattung stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas und Bacillus.
  54. Verfahren nach Anspruch 48, worin die chemische Zusammensetzung ein Antibiotikum ist.
  55. Verfahren nach Anspruch 54, worin das Antibiotikum aus der Gruppe Gramicidin S, Indolicidin, Polymyxin und Bactenecin ausgewählt ist.
  56. Verfahren nach Anspruch 48, worin die chemische Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Polyaspartat, Polyglutamat, Polyglycin und einem Siderophor.
  57. Verfahren zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, welches Material der Umwelt ausgesetzt ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines Bakteriums umfasst, welches eine chemische Zusammensetzung in einer Menge sezerniert, die zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreicht.
  58. Verfahren nach Anspruch 57, welches Material ein Teil eines Wasserkanals aus Beton, von Wasserleitungsrohren, eines Wasserkühlturms, eines Wasserversorgungssystems, eines Kraftwerkreservoirs, eines Springbrunnens im Freien, eines Heizungs- und Kühlsystems, eines Stahlvorratsbehälters, eines Metallvorratsbehälters, eines Wärmeaustauschers, eines Feuerbekämpfungssystems, eines Kraftstoffsystems, einer Abwasseranlage, eines Regenwasserableitungssystems, eines kommunalen Wasserableitungssystems, einer Brücke, einer Eisenbahnbrücke oder einer Straßenüberführung ist.
  59. Verfahren nach Anspruch 57, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  60. Verfahren nach Anspruch 59, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, einem Stahl, Aluminium, einer Aluminiumlegierung, Kupfer, einer Kupferlegierung, Titan, einer Titanlegierung, Nickel und einer Nickellegierung.
  61. Verfahren nach Anspruch 57, worin das abbauempfindliche Material aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Beton, Stahlbeton und Zement.
  62. Verfahren nach Anspruch 57, worin das Bakterium ein Aerobier ist.
  63. Verfahren nach Anspruch 62, worin das Bakterium von einer Gattung stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas und Bacillus.
  64. Verfahren zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines konosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, welches Material ein Teil eines Wasserkanals aus Beton, von Wasserleitungsrohren, eines Wasserkühlturms, eines Wasserversorgungssystems, eines Kraftwerkreservoirs, eines Springbrunnens im Freien, eines Heizungs- und Kühlsystems, eines Stahlvorratsbehälters, eines Metallvorratsbehälters, eines Wärmeaustauschers, eines Feuerbekämpfungssystems, eines Kraftstoffsystems, einer Abwasseranlage, eines Regenwasserableitungssystems, eines kommunalen Wasserableitungssystems, einer Brücke, einer Eisenbahnbrücke oder einer Straßenüberführung ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines Bakteriums umfasst, welches eine chemische Zusammensetzung in einer Menge sezerniert, die zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreicht.
  65. Verfahren nach Anspruch 64, worin das korrosionsempfindliche Material ein Metall ist.
  66. Verfahren nach Anspruch 65, worin das Metall aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Eisen, einem Stahl, Aluminium, einer Aluminiumlegierung, Kupfer, einer Kupferlegierung, Titan, einer Titanlegierung, Nickel, und einer Nickellegierung.
  67. Verfahren nach Anspruch 64, worin das abbauempfindliche Material aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Beton, Stahlbeton und Zement.
  68. Verfahren nach Anspruch 64, worin das Bakterium ein Aerobier ist.
  69. Verfahren nach Anspruch 68, worin das Bakterium von einer Gattung stammt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Pseudomonas und Bacillus.
  70. Verfahren zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf einem Material, das aus der Gruppe eines korrosionsempfindlichen Materials und eines abbauempfindlichen Materials ausgewählt ist, welches Material ein Teil einer Rohrleitung ist, wobei das Verfahren das Aufbringen auf das Material eines Bakteriums umfasst, welches eine chemische Zusammensetzung in einer Menge sezerniert, die zur Inhibition des Wachstums sulfatreduzierender Bakterien auf dem Material ausreicht.
  71. Verfahren nach Anspruch 70, worin das Bakterium ein Aerobier ist.
  72. Verfahren nach Anspruch 71, worin das Bakterium grampositiv ist.
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