DE69911987T2

DE69911987T2 - Flavonoide aus citrusschalen als kollageninduzierte inhibitoren der blutplättchen-aggregation

Info

Publication number: DE69911987T2
Application number: DE69911987T
Authority: DE
Inventors: Song Hae Bok; Tae Sook Jeong; Han Ik Cho; Dong Soon Lee
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 1999-08-19
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2019-08-20
Also published as: CA2345618A1; WO2001014396A1; EP1123304A1; DE69911987D1; JP2003507486A; CN1322209A; EP1123304B1

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Flavonoiden, die aus Zitrusschalen stammen, zur Hemmung einer kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung in einem Säugetier. Die Flavonoide können dem Säugetier in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Lebensmittelzusammensetzung verabreicht werden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die US-A-4842859 beschreibt eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche Pflanzenextrakte aufweist, in welchen Flavonoide mit den Bezeichnungen Aurapten und Scoparone die Blutplättchenverklumpung reduzieren. Diese Flavonoide werden aus Zitrusschalen extrahiert.
Das Dokument "An. R. Acad. Farm. (1986), 52(3), Seiten 497–504)" betrifft die Verwendung von Hesperidin zum Zwecke des Hemmens von Blutplättchenverklumpung. Die darin verwendeten Flavonoide werden aus Zitrusschalen extrahiert.
Blutplättchenverklumpung in einem Blutgefäß wird durch verschiedene Faktoren hervorgerufen, z. B. Kollagen, Adenosindiphosphat(ADP), Thrombin, Epinephrin, Ristocetin und Arachidonsäure. Zum Beispiel wird, wenn Epithelzellen eines Blutgefässes beschädigt werden, das Kollagen unterhalb der Epithelzellen dem Blutstrom und aktivierten Blutplättchen ausgesetzt. Die Aktivierung von Blutplättchen löst eine Kaskadenreaktion aus, welche in einer Thrombogenese und Blutplättchenverklumpung in dem Blutgefäß resultiert, welche ernsthafte Kreislauferkrankungen hervorrufen kann, z. B. Thrombose, Arteriosklerose, Hirnschlag und Koronarthromboseembolie.
Bis jetzt sind verschiedene Arzneimittel entwickelt worden, z. B. Thromboxan A2-Hemmer, PGG/H-Synthasehemmer, Thromboxan-Synthasehemmer, Thromboxan A2-Receptor Antagonist, Ticlopidin, GP Hb-IHa-Hemmer und Serotonin-Antagonist, um eine solche Blutplättchenverklumpung zu verhindern. Jedoch haben diese Arzneimittel verschiedene unerwünschte Nebeneffekte auf die inneren Organe sowie hemorrhagenische bzw. Blutungen hervorrufende Eigenschaften.
Ticlopidin und Analogons davon, z. B. Clopidogrel, hemmen selektiv die ADP-induzierte Blutplättchenverklumpung in vivo und es ist bekannt, dass sie bei der Behandlung eines instabilen, ischämischen Hirnschlags und peripherarterialen oder ischämischen Herzerkrankungen effektiv sind (Hass, W. K. et al., N. Engl. J. Med., 21, 501(1989); und Easton, J. D., Drugs, 42, 39(1991)). Es wurde jedoch berichtet, dass diese Arzneimittel solche unerwünschten Nebeneffekte wie myeloische Suppression, Erhöhung des gesamten Cholesterinniveaus, Durchfall, Ausschläge und Neutropenie haben (McTavish, E. et al., 2Drugs, 40, 238(1990); Hass, W. K. et al., supra; und Dunn C. D. R., Scrip. Reports, Stroke: Trends, Treatments and Markets, PJB Publications Ltd., Seiten 133–139(1995)).
Demzufolge bestand eine kontinuierliche Notwendigkeit, einen Blutplättchenverklumpungshemmer zu entwickeln, welcher eine in hohem Maße selektiv wirkende Hemmungsaktivität auf die kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung hat, ohne nachteilige Nebeneffekte hervorzurufen.
Es ist bekannt, dass aus Zitrusschalen extrahierte Flavonoide, z. B. Naringin, Naringenin, Hesperidin und Hesperetin, Aktivitäten bezüglich des Verbesserns des Lipidhaushalts aufweisen, um kardiovaskuläre Krankheiten zu verhindern, als auch Antikrebs- und Antivirenaktivitäten. Insbesondere wurde berichtet, dass sowohl Hesperidin als auch Hesperetin kapillarverbessernde, permeabilitätsreduzierende, entzündungshemmende, gegen einen Virus wirkende und Blutdruck- und Cholesterinsenkende Wirkungen besitzen (Meyer, O. C., Angiology, 45, 579–584(1994); Struckmann, J. R. et al., Angiol., 45, 419–428 (1994); Matsubara, Y. et al., Japan Organic Synthesis Chem. Association Journal, 52, 318– 327(1994. Mar.); Galati, E. J. et al., Farmaco., 51(3), 219–221 (1996, Mar.); Monforte, M. T. et al., Farmaco., 50(9), 595–599 (1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Galati, E. M. et al., Farmaco., 40(11), 709–712 (1994, Nov.); und Emim, J. A. et al., J. Pharm. Pharmacol., 46(2), 118–122(1994)). Des weiteren wurde berichtet, dass sowohl Naringin als auch Naringenin Antikrebs-, gegen ein Geschwür wirkende und Cholesterin absenkende Wirkungen aufweisen (Monforte, M. T. et al., Farmaco., 50(9), 595–599 (1995, Sep.); JP 95-86929; JP 95-86930; Felicia, V. et al., Nutr. Cancer, 26, 167–181 (1996); EP 0352147 A2 (1990.1.24); und Martin, M. J. et al., Parmacol., 49, 144–150 (1994)).
In jüngster Zeit wurde des weiteren berichtet, dass Naringenin von einer Arachidonsäure hervorgerufene Blutplättchenverklumpung hemmt (Corcazier, E. et al., Biochimica Biophysica Acta, 835, 315–321 (1985)).
Es gab jedoch keinen Bericht bezüglich der selektiv hemmenden Wirkung von aus Zitrusschalen stammenden Flavonoiden auf eine kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Hemmstoff für eine kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung zu schaffen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung eines Flavonoids, welches aus Zitrusschalen stammt, zur Hemmung einer kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung geschaffen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung können Flavonoide, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Naringin, Naringenin, Hesperetin und einer Mischung daraus besteht, zur Herstellung eines Medikaments einem Säugetier in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Lebensmittelzusammensetzung verabreicht werden.
Diese Flavonoide können auch gemäß den von Zemplen, Bognar, Ber., 75, 1043 (1943) und Seka, Prosche, Monatsh., 69, 284 (1936) beschriebenen Verfahren synthetisch hergestellt werden. Des weiteren können Naringenin and Hesperitin durch die Hydrolyse von Naringin bzw. Hesperidin hergestellt werden.
Die Flavonoide üben einen selektiven Hemmeffekt auf eine kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung und auf eine Thrombogenese aus.
Des weiteren zeigen die Flavonoide trotz ihrer hohen Wirksamkeit eine geringe Toxizität oder Mitogenizität bei Tierversuchen. Genauer gesagt zeigen die Flavonoide keine Toxizität, wenn sie einer Maus mit einer Dosis von 1.000 mg/kg, was einer oral verabreichten Dosis von 3 bis 10 g pro kg Körpergewicht entspricht, verabreicht werden. Des weiteren üben die Flavonoide keine nachteiligen Effekte auf die Leberfunktion aus.
Die vorliegende Erfindung schafft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Hemmung einer kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung, welche eine effektive Menge eines aus Zitrusschalen gewonnenen bzw. stammenden Flavonoids als einen aktiven Inhaltsstoff zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln aufweist.
Die pharmazeutische Formulierung kann durch Verwendung jedes konventionellen Verfahrens hergestellt werden. Beim Herstellen der Formulierung wird der aktive Inhaltsstoff vorzugsweise mit einem Trägerstoff vermischt oder verdünnt oder in einem Trägerstoff eingeschlossen, welcher in Form einer Kapsel, eines Kissens oder eines anderen Behälters sein kann. Wenn der Trägerstoff als ein Verdünnungsmittel dient, kann es sich um einen Feststoff, einen Semi-Feststoff oder ein flüssiges Material handeln, welches als ein Bindemittel, Träger oder Medium für den aktiven Inhaltsstoff dient. Somit kann die Formulierung in der Form einer Tablette, Pille, Pulver, Kissen, Elixier, Suspension, Emulsion, Lösung, Sirup, Aerosol, weiche oder harte Gelatinekapseln, sterile injizierbare Lösung, steriles abgepacktes Pulver und ähnliches sein.
Beispiele von geeigneten Trägerstoffen, Trägern und Verdünnungsmitteln sind Laktose, Dextrose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, Stärke, Gummiarabicum, Alginate, Gelatine, Kalziumphosphat, Kalziumsilikat, Zellulose, Methylzellulose, mikrokristalline Zellulose, Polyvinylpryrrolidon, Wasser, Methylhydroxybenzoate, Propyl hydroxybenzoate, Talg, Magnesiumsterat und Mineralöl. Die Formulierungen können des weiteren Füllstoffe, agglutinationshemmende Mittel, Schmiermittel, Befeuchtungsmittel, Geschmacksverstärker, Emulgatoren, Konservierungsmittel und ähnliches aufweisen. Die Zusammensetzungen der Erfindung können so formuliert werden, dass sie eine schnelle, langanhaltende oder verzögerte Freigabe des aktiven Inhaltsstoffs nach ihrer Verabreichung an ein Säugetier durch Verwendung eines beliebigen, aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrens schaffen.
Die pharmazeutische Formulierung der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen Wegen einschließlich oraler, transdermaler, subkutaner, intravenöser und intramuskulärer Einführung verabreicht werden. Im Falle von Menschen kann eine typische Tagesdosis von Flavonoid in einem Bereich von ungefähr 0,5 bis 100 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 2 bis 10 mg/kg Körpergewicht, liegen und kann in einer einzelnen Dosis oder in aufgeteilten Dosen verabreicht werden. Es sollte jedoch deutlich sein, dass die Menge des tatsächlich verabreichten aktiven Inhaltsstoffes unter Berücksichtigung verschiedener relevanter Faktoren einschließlich des zu behandelnden Zustandes, des ausgewählten Weges der Verabreichung, des Alters, des Geschlechts und des Körpergewichts des individuellen Patienten und der Schwere der Symptome des Patienten festgelegt werden sollte; und die oben genannte Dosis sollte deshalb nicht so angesehen werden, dass sie den Bereich der Erfindung in irgendeiner Weise beschränkt.
Des weiteren kann das Flavonoid in Lebensmitteln als ein Additiv oder eine Diätzugabe zum Zwecke der Verhinderung der kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung enthalten sein. Demzufolge stellt die vorliegende Erfindung auch eine Lebensmittelzusammensetzung zum Verhindern der kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung zur Verfügung, welche eine effektive Menge des Flavonoids enthält. Die Lebensmittel können Fleisch; Schokolade; Snacks; Backwaren; Pizza; aus Getreidemehl hergestellte Lebensmittel, wie z. B. Brote, Kuchen, Kräcker, Kekse, Biskuits, Nudeln und ähnliches; Gummibonbons; Milchprodukte, wie z. B. Milch, Käse, Joghurt und Eiscreme; Suppen; Fleischbrühe; Pasten, Ketschups und Soßen; Vitaminkomplexe; und verschiedene Gesundheits-Nahrungsmittel beinhalten. In diesem Fall kann sich der Anteil des Flavonoids in einem Lebensmittel in einem Bereich von 0,1 bis 50 Gewichts-% bewegen.
Wie oben beschrieben, kann das Flavonoid als ein effektives, nicht toxisches, pharmazeutisches Mittel zum Verhindern der kollageninduzierten Blutplättchenverklumpung verwendet werden.
Die folgenden Beispiele sind dafür vorgesehen, die vorliegende Erfindung weiter darzustellen, ohne ihren Schutzbereich zu beschränken.
Des weiteren sind die unten angegebenen Prozentsätze für Feststoff in Feststoffmischung, Flüssigkeit in Flüssigkeit und Feststoff in Flüssigkeit auf einer Gewichts-/Gewichts-, Volumen-/Volumen- und Gewichts-/Volumenbasis angegeben und alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn dies nicht spezifisch anders angegeben ist.
Beispiel 1: Aktivität von Flavonoid bei der Verhinderung von Blutplättchenverklumpung
Verhindernde bzw. hemmende Aktivität der Zitrusschalen-Flavonoide auf die Blutplättchenverklumpung wurde wie nachfolgend beschrieben, in Übereinstimmung mit den Verfahren von O'Brein (O'Brein JR., J. Clin., Pathol., 15, 452(1962)) und Aok ermittelt (Aok, H. et al., anesthesiology, 88, 362(1998)).
9 ml menschlichen Bluts wurde zu 1 ml von 3,8% Natriumzitrat hinzugefügt und die Mischung wurde bei 1.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert. Das Überstands(Plasma) wurde mit phosphatgepuffertem Salz (PBS) auf eine Konzentration von 200.000 bis 400.000 Blutplättchen/mm³ verdünnt. Jede 450 μl des verdünnten Plasmas wurden in die Küvetten eingebracht und 5 μl einen Flavonoidlösung, wobei Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin in Dimethylsulfoxid bei einer Konzentration von 10 mg/l aufgelöst war, wurde hinzugefügt, mit Ausnahme einer Kontrollküvette. Die Mischung wurde bei 37°C für 3 Minuten in einem Blutplättchenaggrometer (Blutplättchenaggrecoder II, PA-3220, Chronolog, U.S.A.) erwärmt. Dann wurden 50 μl einer Aggregationsverstärkungslösung, d. h. 2 mg/ml Kollagenlösung, 100 μM ADP, 200 μM Epinephrin oder 15 mg/ml Ristcetin hinzugefügt. Die sich ergebende Mischung wurde bei 37°C für 3 Minuten reagiert und dann wurde die optische Dichte davon festgestellt. Um die Grundlinie zu ermitteln, wurde blutplättchenfreies Plasma verwendet.
Folglich zeigten Naringin, Naringenin, Hesperidin und Hesperetin alle eine hemmende Aktivität auf die kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung, während sie keine von ADP-, Epinephrin- und Ristocetin-induzierte Blutplättchenverklumpung verhindern. Naringin, Naringenin, Hesperidin und Hesperetin verhinderten die kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung um 59 bis 85 %, 30 bis 87%, 59 bis 93% und 15 bis 93%. Das Ergebnis zeigt, dass das aus Zitrusschalen gewonnene Flavonoid die kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung selektiv verhindert.
Beispiel 2: Toxizität von oral verabreichten, aus Zitrusschalen gewonnenen Flavonoiden
7 bis 8 Wochen alte, spezifisch erregerfreie ICR weibliche Mäuse (8 Stück), welche jeweils ungefähr 25 bis 29 g wogen, und männliche Mäuse (8 Stück), welche jeweils ungefähr 34 bis 38 g wogen, wurden unter den Bedingungen einer Temperatur von 22 +/– 1°C, Feuchtigkeit 55 +/– 5% und Photoperiode 12L/12D gezüchtet. Futter (Cheiljedang Co., Mäuse- und Rattenfutter) und Wasser wurden sterilisiert und an die Mäuse verfüttert.
Ein aus Zitrusschalen stammendes Flavonoid, Naringin oder Hesperidin, wurde in 0,5% Tween 80 mit einer Konzentration von 100 mg/ml aufgelöst und die Lösung wurde den Mäusen in einer Menge von 0,2 ml pro 20 g des Körpergewichts der Mäuse verabreicht. Die Lösung wurde einmal verabreicht und die Mäuse wurden für 10 Tage auf Zeichen von Nebenwirkungen oder Tod gemäß dem folgenden Schema überwacht: 1, 4, 8 und 12 Stunden nach der Verabreichung und jede 12 Stunden danach. Die Gewichtsveränderungen der Mäuse wurden jeden Tag aufgezeichnet, um den Effekt der aus Zitrusschalen stammenden Flavonoiden zu prüfen. Des weiteren wurden die Mäuse am 10. Tag getötet und die inneren Organe wurden auf Sicht überprüft.
Am Tag 10 waren alle Mäuse am Leben und das aus Zitrusschalen stammende Flavonoid zeigte bei einer Dosis von 1.000 mg/kg keine Toxizität. Die Autopsie ergab, dass die Mäuse keinerlei pathologische Abnormalität entwickelten und es wurde während der zehntägigen Testperiode kein Gewichtsverlust festgestellt. Daraus folgt, dass das aus Zitrusschalen stammende Flavonoid nicht toxisch ist, wenn es einem Tier oral verabreicht wird.
Beispiel 3: Pharmazeutische Formel, welche aus Zitrusschalen stammende Flavonoide enthält
Harte Gelatinekapseln wurden unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt:

Menge (mg/Kapsel)

Aktiver Inhaltsstoff (Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin) 200

Vitamin C 100

Getrocknete Stärke 180

Magnesiumstearat 20

Gesamtmenge 500 mg
Beispiel 4: Lebensmittel, welche aus Zitrusschalen stammendes Flavonoid enthalten
Lebensmittel, welche ein aus Zitrusschalen stammendes Flavonoid enthalten, wurden wie folgt hergestellt.
(1) Herstellung von Tomatenketschup und Soße
Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin wurde zu einem Tomatenketschup oder einer Soße in einer Menge hinzugefügt, welche sich in einem Bereich von 0, 01 bis 5 Gew.-% bewegte, um ein gesundheitsverbesserndes Tomatenketschup oder eine Soße zu erlangen.
(2) Herstellung von Weizenmehllebensmittel
Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin wurde zu einem Weizenmehl in einer Menge hinzugefügt, welche sich in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-% bewegte, und Brote, Kuchen, Kekse, Kräcker und Nudeln wurden unter Verwendung der Mischung hergestellt, um gesundheitsverbessernde Lebensmittel zu erlangen.
(3) Herstellung von Suppen und Bratensoßen
Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin wurde zu Suppen und Bratensoßen in einer Menge hinzugefügt, welche sich in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-% bewegte, um gesundheitsverbessernde Suppen und Bratensoßen zu erlangen.
(4) Herstellung von Hackfleisch
Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin wurde zu Hackfleisch in einer Menge hinzugefügt, die sich in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-% bewegte, um ein gesundheitsverbesserndes Hackfleisch zu erlangen.
(5) Herstellung von Milchprodukten
Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin wurde zu Milch in einer Menge hinzugefügt, die sich in einem Bereich von 0,01 bis 5 Gew.-% bewegte, und verschiedene Milchprodukte, wie z. B. Butter und Eiscreme, wurden unter Verwendung dieser Milch hergestellt.
Im Falle der Herstellung von Käse wurde jedoch Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin zu dem geronnen Milchprotein hinzugefügt; und im Falle der Herstellung von Joghurt wurde Naringin, Naringenin, Hesperidin oder Hesperetin zu dem nach der Fermentation erlangten, geronnen Milchprotein hinzugefügt.
Während die Erfindung unter Bezugnahme auf die oben genannten speziellen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte klar sein, dass durch den Fachmann an der Erfindung verschiedene Modifikationen und Änderungen vorgenommen werden können, welche ebenfalls in den Schutzbereich der Erfindung fallen, wie er durch die beigefügten Ansprüche definiert ist.

Claims

Verwendung eines Flavonoids, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Naringin, Naringenin, Hesperetin und einer Mischung daraus besteht, zur Herstellung eines Medikamentes, welches eine kollageninduzierte Blutplättchenverklumpung in einem Säugetier hemmt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Flavonoid in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder einer Lebensmittelzusammensetzung verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die wirksame Menge des Flavonoids, welches in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten ist, in einem Bereich von 0,5 bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag liegt.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der Gehalt des Flavonoids in der Lebensmittelzusammensetzung in einem Bereich von 0,1 bis 50 Gewichts-% liegt.