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Technischer Bereich
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein neues Verfahren der Flüssig-Chromatographie mit
einer Folge von Schritten, von denen mindestens zwei aufeinander
folgende Schritte (Schritt 1 und Schritt 2) im Wirbelbett- bzw.
Flüssigbettmodus
durch die Verwendung einer Aufwärtsströmung ablaufen.
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Bezüglich der verschiedenen Erscheinungsformen
der Erfindung wird auf die ebenfalls vorgenommene Internationale
Patentanmeldung verwiesen, die sich aus SE 9803813-6 und SE 9803737-7
ableitet. Diese Internationale Patentanmeldung wird hiermit durch
Verweis aufgenommen.
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Hintergrundtechnologie
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Flüssig-chromatographische Prozesse
werden auf Teilchenmatrizen in Form von Fest- oder Wirbel- bzw.
Flüssigbetten
angewendet. Die Prozesse enthalten im typischen Fall mindestens
einen Schritt nach Typ b) unten und einen oder mehrere funktionale
Schritte, die unter den übrigen
Schritten (a, c, d, e, f) ausgewählt werden.
- a) Ausgleichen der Teilchen mit einer Flüssigkeit,
mit der die Teilchen für
Einfang/Bindung konditioniert werden,
- b) Einfang einer oder mehrerer, in einer Flüssigkeitsprobe vorhandener
Verbindungen durch die Teilchen,
- c) Waschen der Teilchen, an die die vorerwähnten einzelnen oder mehreren
Verbindungen gebunden worden sind,
- d) Abtrennung von mindestens einer der vorerwähnten einzelnen
oder mehreren Verbindungen von den Teilchen,
- e) Reinigen der Teilchen, und
- f) Regenerieren der Teilchen.
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Der Einfangschritt (Typ b) definiert
zusammen mit den ausgewählten
Schritten eine tatsächliche
Folge in einem bestimmten chromatographischen Prozess. In einer
tatsächlichen
Folge kann es auch andere als die oben angeführten (a–f) geben. Eine typische Folge
besteht aus den Schritten a, b, c, d, e, f(a), b, c, d, e, f(a), ...,
möglicherweise
mit zusätzlich
in die gegebene Folge eingefügten
Schritten. f(a) bedeutet, dass Schritt a und Schritt f zusammenfallen
können
und dass chromatographische Prozesse zyklisch ablaufen können.
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Bei jedem Schritt werden die Teilchen
mit einer geeigneten Flüssigkeit
(Lösung/
Puffer) behandelt, die wässerig
oder nicht wässerig
ist.
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Der Begriff „Einfang" schließt ein, dass die Verbindung
an die Teilchen gebunden wird. Die Bindung kann über die Bildung von Affinitätsbindungen,
kovalenten Bindungen, Einschluss in die Teilchen usw. erfolgen.
Beispiele für
Affinität
sind Bioaffinität,
Ionenwechselwirkung, hydrophobische Wechselwirkung usw. Die eingefangene
Verbindung kann eine Verbindung sein, die gereinigt werden soll,
oder eine verunreinigende Substanz, die man von einer anderen Verbindung
abtrennen oder aus der Flüssigkeit
entfernen möchte,
die beim Einfangschritt verwendet wird.
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Die im Abtrennschritt verwendete
Flüssigkeit
enthält
im typischen Fall ein Mittel, das die eingefangene Verbindung, z.
B. einen Puffer, der einen geeigneten pH-Wert erzeugt, ein Salz,
das eine geeignete ionische Stärke
ergibt, und eine(n) Affinitätsliganden/-struktur
auf den Teilchen, abtrennt. Der Begriff „abtrennen" schließt das Ablösen durch Aufbrechen der Affinitätsbindungen,
kovalenten Bindungen usw. ein. Kovalente Bindungen können durch
chemische Reaktionen oder enzymatisch aufgebrochen werden.
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Die Flüssigkeit, die in einem Schritt
verwendet wird, kann sich kontinuierlich oder stufenweise während eines
Schrittes ändern.
Die Abtrennung mit Hilfe eines Gradienten z. B. ist typisch für Elution
an Festbetten, ist aber bisher selten bei Flüssigbetten (Shiloach et al.,
Sep. Sci. Techn 34(1)(1999) 29–40).
Ein weiteres Beispiel ist das Ändern
einer Waschlösung
während
eines Waschschritts.
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In Festbetten kann der Abtrennschritt
typischerweise aus einem oder mehreren Teilschritten bestehen. Zum
Beispiel kann der Einfangschritt das Einfangen von zwei oder mehr
Verbindungen bedeuten, die sich unterschiedlich an die Teilchen
binden. Zum Beispiel können
die Verbindungen unterschiedliche Bedingungen und unterschiedliche
Zusammensetzungen der Flüssigkeit
erfordern.
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Schritte können ganz oder teilweise zusammenfallen.
Zum Beispiel bezieht sich der Regenerationsschritt in erster Linie
auf die Regeneration der Teilchen, die in einem zweiten Zyklus des
Prozesses verwendet werden sollen, und fällt dann mit dem Ausgleichschritt
des zweiten Durchlaufs zusammen. Der Einfangschritt kann bedeuten,
dass die Verbindung nur gehemmt wird, was darauf hinweist, dass
der Ablöseschritt
zur selben Zeit abläuft.
Falls ein verunreinigender Stoff von den Teilchen eingefangen wird,
möglicherweise
in Verbindung mit dem Durchlauf durch die zu reinigende Verbindung,
kann die Abtrennung während
des Reinigungsschritts erfolgen.
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Reinigungsschritte werden oft cip
(= Reinigung am Ort) genannt. Cip-Schritte sind normalerweise mit einer
hohen Konzentration der gelösten
Substanz, wie z. B. NaOH, in der verwendeten Flüssigkeit verbunden. Das bedeutet,
dass die zum Reinigen verwendete Flüssigkeit oft die höchste Dichte
in einer tatsächlichen
Folge besitzt.
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Jeder Schritt kann im Flüssig- oder
Festbettmodus mit vertikaler Strömung
durchgeführt
werden, die entweder nach oben oder nach unten verläuft. Die
Strömungsrichtung
kann zwischen den verschiedenen Schritten wechseln. Pfropfenströmung ist
oft von Vorteil in der Chromatographie, insbesondere bei den Einfangschritten.
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Für
die verschiedenen Schritte einer tatsächlichen Folge kann dasselbe
Gefäß oder können verschiedene
Gefäße verwendet
werden.
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Während
der verschiedenen Schritte werden die Teilchen so in ein Gefäß eingebracht,
wie dies im Fachgebiet bekannt ist. Siehe WO 9520427 (Amersham Pharmacia
Biotech AB), WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB), unsere
ebenfalls eingereichte Internationale Patentanmeldung, die aus SE
9803813-6 und SE 9803737-7 usw. abgeleitet ist. Geeignete Gefäße haben
eine Einlass- und eine Auslassseite. Das Gefäß wird im typischen Fall senkrecht
aufgestellt, wobei der Auslass an der Oberseite senkrecht nach oben
zeigt und der Einlass an der Unterseite senkrecht nach unten zeigt.
Die Verhältnisse
können
auch umgedreht sein. Der Einlass bzw. Auslass können eine oder mehrere Öffnungen
mit Verbindung ins Innere des Gefäße umfassen.
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Hintergrundpublikationen
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Dichteunterschiede zwischen den bei
den aufeinander folgenden Schritten verwendeten Flüssigkeiten sind
vorher in Modellexperimenten zur Flüssigbettreinigung genutzt worden.
Diese Experimente beinhalteten verschiedene Konzentrationen von
Glycerol in der Waschlösung
für Flüssigbettbehandlungen
in kleinem Maßstab.
Der Zweck bestand darin, die Viskosität und möglicherweise auch die Dichte
der Waschlösung
im Vergleich zur Lösung
zu erhöhen,
die für
den Adsorptions-/Einfangschritt verwendet wurde. Siehe Draeger & Chase, Bioseparation
2(1991) 67–80;
Chase et al., Sep. Sci. Techn. 27 (1992) 2021–2039; Chase et al. J. Chromatogr.
597 (1992) 129–145;
Chase et al., 6. Europäischer-Kongress
für Biotechnologie
(ECB 6), Florenz, Italien, 13.–17.
Juni 1999; Chase, TIBTECH 12 (1994) 296–303; Chang et al., Biotechn.
Bioengin. 48 (1995) 355–366,
und Chang et al., Biotechn. Bioengin. 49 (1998) 204–216). Die
Artikel diskutieren, dass es bestimmte Nachteile beim nachfolgenden
Elutions-(Abtrenn-)Schritt auf Grund der Viskosität gibt,
die durch das hinzugefügte
Glycerol erzeugt wird, und diese Nachteile dadurch vermieden werden
können,
dass der nachfolgende Abtrennschritt im Festbettmodus ausgeführt wird.
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Bei der Flüssigbett-Chromatographie sind
oft Flüssigkeiten
mit erhöhten
Dichtewerten verwendet worden, wenn man von einem Ausgleichsschritt
zu einem Einfangschritt weitergeht (die Proben haben oft eine relativ
hohe Dichte).
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Vor kurzem wurde die Gradientenelution
in der Flüssigbett-Chromatographie
angewendet. Siehe Shiloach et al., Sep. Sci. Techn 34(1) (1999)
29–40.
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Nachteile
bisheriger Verfahren
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Bei dem Abtrennschritt einer tatsächlichen
oben definierten Folge enthält
die verwendete Flüssigkeit ein
Mittel, das eine eingefangene Verbindung von den Teilchen ablöst. Das
bedeutet, dass die Dichte einer Flüssigkeit sich tendenziell während des
Abtrennschritts erhöht.
Falls das Bett durch eine Aufwärtsströmung fluidisiert
wird, besteht die Tendenz, dass Flüssigkeit, die die abgelöste Verbindung
enthält,
abwärts
transportiert wird, während
gleichzeitig die Front der Ablöseflüssigkeit
nach oben wandert. Das Ergebnis ist eine Verdünnung der abgelösten Verbindung
und vielfach eine ungünstige
Vergrößerung des
Volumens der zu handhabenden Flüssigkeit
bei der nachfolgenden Verarbeitung der abgetrennten Verbindung.
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Waschflüssigkeiten können relativ
leicht sein. Wenn eine Waschflüssigkeit
eine niedrigere Dichte als die Flüssigkeit des vorhergehenden
Schrittes besitzt, verursacht das Turbulenzen und verringert die
Wirksamkeit des Waschschritts. Dies ist besonders ausgeprägt bei Waschschritten,
die auf einen Einfangschritt folgen, weil die im Einfangschritt
verwendete Flüssigkeit
relativ mehrfach dichter ist.
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Diese Nachteile können in Gefäßen ausgeprägter auftreten, die keinen
beweglichen Auslassanschluss besitzen im Vergleich zu Gefäßen, die
diese Art von Adapter besitzen.
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Die Erfindung.
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Die Erfindung wird in ihrer weitesten
Form durch die Methode nach Anspruch 1 dargestellt. Bevorzugte Formen
werden in den angehängten
unselbständigen
Ansprüchen
beschrieben.
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Die Erfindung ist eine Methode zur
Verarbeitung einer flüssigen
Probe, die eine oder mehrere Verbindungen enthält, welche durch Einfang mindestens
einer derselben durch Teilchen entfernt werden sollen, die in Kontakt
mit der Probe gebracht werden. Die Methode umfasst eine tatsächliche
Folge wie oben definiert, die aus einer Teilfolge von mindestens
zwei aufeinander folgenden Schritten (Schritt 1 und Schritt 2) besteht,
bei der die Teilchen fluidisiert werden. Schritt 1 geht Schritt
2 voraus.
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Man weiß jetzt vollkommen zu schätzen, dass
die oben erwähnten
Nachteile dieser Art von Teilfolgen minimiert werden können, wenn
die Dichte der in einem Flüssigbett
verwendeten Flüssigkeit
geringer ist als die Dichte der im nachfolgenden Wirbel- bzw. Flüssigbettschritt
verwendeten Flüssigkeit.
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Das charakteristische Merkmal der
Methode ist, dass die Dichte der in Schritt 2 verwendeten Flüssigkeit
(Flüssigkeit
2) höher
ist als die Dichte der in Schritt 1 verwendeten Flüssigkeit
(Flüssigkeit
1). Das Bett wird während
der zwei Schritte in fluidisiertem Zustand gehalten. Die Tatsache,
dass Flüssigkeiten
mit steigender Dichte für
die beiden aufeinander folgenden Schritte verwendet werden, bedeutet,
dass die Schritte im selben Gefäß ausgeführt werden,
wobei Flüssigkeit
2 Flüssigkeit
1 ersetzt.
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Mit dem Ausdruck „das Bett wird während der
zwei Schritte in fluidisiertem Zustand gehalten" ist gemeint, dass bei Schritt 1 und
2 im wesentlichen Pfropfenströmung
aufrecht erhalten werden soll. Das bedeutet, dass die Plattenzahl
im wesentlichen während
des ganzen Zeitabschnitts, der durch die zwei Schritte festgelegt
ist, ≥5,
vorzugsweise ≥10
oder ≥20
sein sollte. Die Plattenzahl kann entsprechend der Beschreibung
im experimentellen Teil von WO 9717132 gemessen werden.
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Die Dichte der in einem Schritt verwendeten
Flüssigkeit
ist die Dichte der Flüssigkeit,
wie sie auf das fluidisierte Bett angewendet wird, d. h. ohne die
Dichteänderung,
die während
eines Schritts auftreten kann.
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Zusätzlich zu Schritt 1 und Schritt
2 können
ein oder mehrere Schritte in der tatsächlichen verwendeten Folge
vorliegen. Diese zusätzlichen
Schritte können
unter Ausgleichsschritten, Einfangschritten, Waschschritten, Trennschritten,
Reinigungsschritten und Regenerationsschritten und beliebigen anderen
verfügbaren
Schritten ausgewählt
werden. Ein oder mehrere bis alle zusätzlichen Schritte können im
fluidisierten Modus liegen, der vorzugsweise im selben Gefäß wie die
Teilfolge aus Schritt 1 und 2 ausgeführt wird. Bei Schritten, die
nicht im fluidisierten Modus ausgeführt werden, wird angenommen,
dass sie im Festbettmodus ausgeführt werden.
Typische Schritte, die im Festbettmodus ausgeführt werden, sind Trennschritte
und Regenerationsschritte und Ausgleichsschritte und kombinierte
Regenerations-/Ausgleichsschritte. Schritte im Festbettmodus können entweder
mit Aufwärts-
oder Abwärtsströmung ausgeführt werden,
wie allgemein für
diese Art von Betten bekannt ist. Schritt 1 kann gemeinsam mit einem
Flüssigbettschritt
oder einer Folge von aufeinander folgenden Flüssigbettschritten aufeinander
folgen, die zusammen mit Schritt 1 und Schritt 2 eine Folge bilden, welche
Flüssigkeiten
steigender Dichte verwendet. In ähnlicher
Weise kann Schritt 2 einen unmittelbar nachfolgenden Flüssigbettschritt
oder eine unmittelbar nachfolgende Folge von Flüssigbettschritten aufweisen,
die zusammen mit Schritt 1 und 2 eine Folge bilden, welche Flüssigkeiten
steigender Dichte nutzt.
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Das erfindungsgemäße Konzept ist vorzugsweise
anwendbar, wenn mindestens einer von Schritt 1 oder Schritt 2 ein
funktioneller Schritt ist, der z. B. aus a–f oben ausgewählt wird.
Beispiele für
Teilfolgen, in denen sowohl Schritt 1 als auch Schritt 2 funktionelle
schritte sind, sind folgende:
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Die Tabelle setzt voraus, dass die
Flüssigkeiten
so ausgewählt,
wurden, dass Schritt 2 eine höhere Dichte
als Schritt 1 aufweist.
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Dichte reduzierender Schritt: Die
Eigenschaft, Flüssigbettschritte
zu besitzen, bei denen eine dichtere Flüssigkeit vor einer leichteren
Flüssigkeit
kommt, kann Vorteile beim Umgang mit dichten viskosen Flüssigkeiten
haben, z. B. Einfangflüssigkeiten.
In diesen Fällen
kann es schwierig sein, die Dichte weiter zu erhöhen. Dies wird dadurch überwunden,
dass man eine Zone mit einer leichteren Flüssigkeit (Flüssigkeit
1, Schritt 1) hat, z. B. eine „Waschlösung", die das Bett durchlaufen
soll, und dann im nächsten
Schritt (Schritt 2) die Dichte der Flüssigkeit (Flüssigkeit
2) erhöht.
Der Nachteil ist, dass sich die Gefahr von Bettturbulenzen erhöht, aber die
Flüssigkeit,
die das Bett verlässt,
trotzdem leichter als die dichte Flüssigkeit sein wird, die vor
Flüssigkeit
1 verwendet wurde. Flüssigkeit
2 kann zum Beispiel eine echte Waschflüssigkeit sein, mit einer relativ
zur „Wasch"-Lösung erhöhten Dichte.
Bezogen auf diesen Schritt, der Schritt 1 vorausgeht, ist dieses
Prinzip auf jeden der Schritte a–f anwendbar, insbesondere
aber auf Schritt 1, der ein Einfangschritt ist.
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Der Anstieg der Dichte beim Fortschreiten
von Schritt 1 zu Schritt 2 schließt auch den Zusatz von Dichte
erhöhenden
Mitteln zur Flüssigkeit
ein, die in Schritt 1 („Wasch"-Lösung) verwendet
wird. Diese Mittel sollten nicht die Bindung der Verbindung an die
Teilchen verringern. Typische Mittel sind ladungsfreie lösliche Verbindungen,
wie z. B. ladungsfreie Verbindungen, die eine Kohlenhydratstruktur
besitzen. Siehe unten.
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Schritt 2 kann dazu verwendet werden,
die im vorhergehenden Schritt (Schritt 1) und im nachfolgenden Schritt
(Schritt 3) verwendete Flüssigkeit
im verwendeten Gefäß physisch
voneinander getrennt zu halten. Bei dieser Variante können Schritt
1 und 3 unter den Schritten a–f
oben ausgewählt
werden. Durch Anwendung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung
wird die in Schritt 2 verwendete Flüssigkeit eine Dichte besitzen,
die zwischen den Dichten in Schritt 1 und Schritt 3 liegt. Diese
Variante der Erfindung ist besonders nützlich, wenn Schritt 1 ein
Trennschritt ist. Während
eines Trennschritts erhöht
sich die Dichte der verwendeten Flüssigkeit, was wiederum zu einer
Verdünnung
der Probe und zu einem erhöhten
Volumen führt.
Es kann daher vorteilhaft sein, mit einer dichteren Flüssigkeit
unmittelbar nach dem Trennschritt zu eluieren, d. h. vor dem Reinigungsschritt
oder bevor eine zweite Verbindung abgetrennt wird, möglicherweise
mit einem anderen Trennmittel und/oder mit einer Flüssigkeit
mit höherer
Dichte, die dasselbe Trennmittel enthält. Die Flüssigkeit, die in Schritt 2
dieser Variante verwendet wird, kann dieselbe wie die in Schritt
1 verwendete sein, aber mit einer hinzugesetzten, die Dichte erhöhenden Substanz.
Diese Substanz kann dieselbe sein wie das in Flüssigkeit 1 verwendete Trennmittel
oder ein anderes. Andere Alternativen für Dichte erhöhende Mittel
sind Glycerol, andere Kohlenhydrate, Salze usw.
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Ein Schritt des Festbettmodus kann
in die tatsächliche
verwendete Folge eingefügt
werden, wenn eine Notwendigkeit besteht, die Dichte der Flüssigkeit
eines nachfolgenden Schrittes herabzusetzen. Zum Beispiel kann es
nach einem bestimmten Schritt nicht machbar oder praktikabel sein,
die Dichte weiter zu erhöhen.
Diese Verwendung von Schritten des Festbettmodus liefert einen einfachen
und praktischen Weg, einen Prozess entsprechend der Erfindung zyklisch
zu machen. Die Flüssigkeit,
die bei dieser Art von Schritten des Festbettmodus verwendet wird,
hat vorzugsweise eine geringere Dichte als die zwei Flüssigkeiten,
die bei den benachbarten Schritten verwendet werden. Sobald die
Dichte der Flüssigkeit
für einen
Schritt verringert wurde, können
Flüssigkeiten
mit erhöhten
Dichten in aufeinander folgenden Schritten verwendet werden. Grundsätzlich kann
ein Schritt a–f
oben im Festbettmodus ausgeführt
werden, wie in diesem Abschnitt beschrieben. Sehen Sie wegen typischer
Schritte im Festbettmodus oben nach.
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Ein anderer Weg zur Realisierung
zyklischer Prozesse besteht in der Verwendung von Teilfolge VI aus der
Tabelle oben, vorausgesetzt, dass die Flüssigkeit in Schritt 1 eine
ausreichend niedrige Dichte besitzt. In der Praxis bedeutet das,
dass ein Wirbelbett bei diesem Schritt akzeptiert werden muss.
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Große Vorteile entstehen, wenn
Schritt 1 ein Wasch- oder Trennschritt ist.
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Ein Anstieg der Dichte kann durch
Erhöhen
der Konzentration einer Substanz erreicht werden, die in der verwendeten
Flüssigkeit
löslich
ist und eine Dichte erhöhende
Wirkung auf die Flüssigkeit
besitzt. Typische Beispiele von Substanzen für wässerige Lösungen sind Salze, wie z. B.
Halogenide (typischerweise Chloride), Phosphate, Sulfate usw., zum
Beispiel deren lösliche
Metall- und Ammoniumsalze, und ladungsfreie Substanzen, wie z. B.
lösliche
Kohlenhydrate, zum Beispiel Glycerol und andere Mono- oder Oligosaccharide.
Was organische Verbindungen angeht, sollten sie in der Regel eine
Dichte besitzen, die größer als
die der Flüssigkeit ist,
um beim Hinzufügen
zur Flüssigkeit
eine höhere
Dichte zu erreichen. Im typischen Fall sollten sie ein großes Molekurlargewicht
besitzen, was sich z. B. in der Zahl der Kohlenstoffatome von ≥3 widerspiegelt,
wie z.B, in Kohlenhydraten mit ≥4
Kohlenstoffatomen.
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Es ist wichtig, das die Dichte erhöhende Mittel
so auszuwählen,
dass die Bindung zwischen der Verbindung und den an dem Schritt
beteiligten Teilchen nicht in einer unerwünschten Weise gestört wird.
In Schritten, die einem Trennschritt vorausgehen, darf das Mittel
nicht als Trennmittel zur Ablösung
im Schritt oder in einem anderen nachfolgenden Trennschritt wirken.
In Trennschritten darf das Mittel nicht in der Lage sein, der beabsichtigten
Trennung entgegenzuwirken.
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Der erforderliche relative Dichteunterschied
zwischen zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten hängt von
verschiedenen Faktoren ab, zum Beispiel von der gewünschten
Zahl theoretischer Platten. Diese Zahl wiederum hängt von
der Säulenkonstruktion,
einschließlich
Verteilerkonstruktion, ab. Unsere bisherigen Ergebnisse deuten darauf
hin, dass die relative Erhöhung
der Dichte immerhin lediglich 1/10000 zwischen zwei aufeinander
folgenden Flüssigbettschritten
betragen kann, vorausgesetzt, das System ist für Pfropfenströmung entsprechend >35 theoretischen Platten
im fluidisierten/erweiterten Bett optimiert. Der relative Zuwachs an
Dichte für
jeden aufeinander folgenden Flüssigbettschritt
kann ≥1/10000,
wie z. B. ≥1/1000
oder ≥1/100 oder ≥1/10, der
Dichte der Flüssigkeit
betragen, die in dem unmittelbar vorhergehenden Flüssigbettschritt
(zum Beispiel ausgewählt
aus den oben definierten Schritten a–f) verwendet wird. Je nach
dem verwendeten System kann die Zahl der theoretischen Platten bis
hinunter zu 5 betragen, vorausgesetzt, der relative Dichteunterschied
für die
Flüssigkeiten
zwischen zwei aufeinander folgenden Flüssigbettschritten ist ausreichend
groß. Daher
können
also Systeme, die z. B. ≥5,
wie z. B. ≥15
und ≥35 theoretische
Platten im Flüssigbett
liefern, verwendet werden.
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Ein Anstieg der Dichte wird oft von
einem Anstieg der Viskosität
begleitet. Einige Substanzen besitzen eine stärker ausgeprägte Fähigkeit,
die Viskosität
von anderen zu erhöhen.
Das kann sich ungünstig
in Flüssigbettsystem
auswirken. Es kann daher vorteilhaft sein, von einer Substanz mit
einem ausgeprägten
zu einer mit einem weniger ausgeprägten die Viskosität erhöhenden Effekt überzugehen,
wenn man die Dichte der fluidisierenden Flüssigkeit zwischen zwei Flüssigbettschritten
erhöht.
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In absoluten Zahlen sollte die Dichte
der verwendeten Flüssigkeit
höher als
die der reinen Flüssigkeit ohne
alle zugesetzten, die Dichte erhöhenden
Mittel sein. Die obere Grenze wird durch die Dichte der Teilchen und/oder
praktische Erwägungen,
wie z. B. Kosten für
Dichte erhöhende
Materialien, bestimmt. Für
wässerige Flüssigkeiten
bedeutet das, dass die Dichte der Flüssigkeiten für aufeinander
folgende Flüssigbettschritte
sich innerhalb des Intervalls von 0,98 bis 1,20 oder bis 1,50 g/cm3 ändern
kann, mit einer Bevorzugung für
1,00 bis 1,15 g/cm3. Die untere Grenze von
0,98 g/cm3 erklärt sich durch die Tatsache,
dass die Dichte verringernde Mittel zugesetzt werden können, wie
z. B. mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, z.B: Methanol, Ethanol
usw. Durch die Verwendung von schwereren Teilchen, zum Beispiel
mit Dichten von ≥1,20
g/cm3, kann die obere Grenze möglicherweise
nach oben verschoben werden, und dementsprechend könnten Flüssigkeiten
mit größerer Dichte
verwendet werden. Das bedeutet, dass wässerige Flüssigkeiten, die in zwei aufeinander
folgenden Flüssigbettschritten
gemäß der Erfindung
verwendet werden, einen Dichteunterschied im Bereich von gerade
einmal etwas über
0 bis mindestens 0,52 g/cm3, mit der Bevorzugung
von mindestens 0,22 g/cm3, haben können. Analoge
Bereiche können
aufgestellt werden, falls man sich entschließt, nichtwässerige Flüssigkeiten zu verwenden.
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Die Dichte der Teilchen sollte ≥1,05 g/cm3, vorzugsweise ≥1,14 g/cm3 und
sogar ≥1,20
g/cm3, wie z. B. ≥1,30 g/cm3 sein.
Man kann sich einen oberen Grenzwert von 5–6 g/cm3 vorstellen.
Geeignete Teilchen werden in WO 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech
AB); WO 9717132 9218237 (Amersham Pharmacia Biotech AB); WO 9893572
(Amersham Pharmacia Biotech AB) und WO 9200799 (Kem-En-Tek/Upfront
Chromatography A/S) beschrieben. Geeignete Teilchen enthalten oft
anorganisches Material als Dichte erhöhendes Material. Geeignete
Teilchen können
auch synthetische Polymere enthalten. Polymere können in rein synthetische Polymere,
halbsynthetische Polymere und Biopolymere eingeteilt werden. Synthetische
Polymere können
monomerische Einheiten enthalten, die aus Acrylamiden, Methacrylamiden,
Hydroxyalkylacrylaten, Hydroxyalkylmethacrylaten, Styrenen, Divinylbenzenen
usw. ausgewählt
werden. Halbsynthetische Polymere umfassen zum Beispiel vernetzte
Biopolymere und deren Copolymerisate und Graftpolymere, die aus
Biopolymeren stammende Strukturen zeigen. Biopolymere umfassen Polysaccharide,
wie z. B. Dextran, Agarose, Zellulose, Stärke und Pullulan. Gut bekannte
Teilchen, die für
Flüssig- bettanwendungen eingesetzt
wurden, werden unter dem Warenzeichen Streamline (Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden) vertrieben und gehören zu einer
Gruppe von Teilchen, die sowohl Dichte erhöhendes Material, oft anorganisch,
wie auch hydrophiles organisches, im typischen Fall polymeres, Material
umfassen.
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Die Verfahrenstemperatur für verschiedene
betroffene Schritte hängt
unter anderem von der verwendeten Flüssigkeit und der einzufangenden
Verbindung ab. Für
wässerige
Lösungen
kann die Verfahrenstemperatur von 0°C bis z. B. 70–90°C betragen,
obwohl die Temperatur aus praktischen Erwägungen oft im Intervall von
0 bis 50°C
liegt. Für
andere Flüssigkeiten
können
andere Bereiche zutreffen.
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Die erfindungsgemäße Methode findet ihre größte Anwendung
in Prozessen mit relativ großer
Produktivität.
Das bedeutet, dass die verwendeten Fließgeschwindigkeiten mindestens
70–3000
cm/h, vorzugsweise 80–90
cm/h und mehr betragen sollten. Das Gefäß sollte eine Querschnittsfläche haben,
die typischerweise der Fläche
eines Quadrates mit der Kantenlänge
von mindestens 10 cm entspricht, wie z. B. mindestens 15 cm. Die
genannte Querschnittsfläche
steht senkrecht zur Flüssigkeitsströmung, die
die Teilchen fluidisiert.
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Wie oben angeführt, kann die tatsächliche
Folge einen oder mehrere Schritte umfassen, die am besten im Festbettmodus
ausgeführt
werden, möglicherweise
durch Umkehren der Strömung
relativ zu den Teilchen. Beim Start mit einem Schritt im Flüssigmodus
in einem herkömmlichen
Gefäß kann man
dies dadurch erreichen, dass man sich die Teilchen zu einem „Festbett" absetzen lässt und
dann eine Aufwärts-
oder Abwärtsströmung durch
das Gefäß anwendet.
Eine Alternative verwendet ein schrägstellbares Gefäß, das beim
Wechsel des Bettmodus um 180° gekippt
werden kann. Siehe Bild 7a–b
unserer ebenfalls anhängigen
Internationalen Patentanmeldung, die sich aus SE 9803813-8 und SE
ableitet. Diese An der Änderung
der Strömungsrichtung
kann besonders nützlich
sein, falls die Teilchen regeneriert werden sollen, zum Beispiel
um in einem zweiten Durchlauf desselben Prozesses verwendet zu werden.
Die Vorteile leiten sich aus der Tatsache ab, dass der Reinigungsschritt
oft die Flüssigkeit
mit der höchsten
Dichte verwendet, während
ein kombinierter Regenerations-/Ausgleichsschritt eine Flüssigkeit
mit niedriger Dichte nutzt. Eine Alternative zu einem Schritt nach dem
Festbettmodus, zum Beispiel durch Kippen, kann darin bestehen, eine
reduzierte Plattenzahl während des
Trennschritts zu akzeptieren und den Schritt unter Fluidisierungsbedingungen
mit einer Flüssigkeit
durchzuführen,
die eine niedrigere Dichte als die im vorherigen Schritt verwendete
besitzt. Siehe oben.
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Festbettschritte können mit
Flüssigbettschritten
in dafür
vorgesehenen Geräten
kombiniert werden. Siehe die. ebenfalls anhängige Internationale Patentanmeldung
mit Vorrang von SE 9803813-6 und SE 9803737-7. Daher kann die vollständige tatsächliche
Folge des erfindungsgemäßen Verfahrens
in einem gemeinsamen Gerät
durchgeführt
werden, in dem der Kollektor während
der aufeinander folgenden Flüssigbettschritte
in einem festen Abstand vom Verteiler gehalten wird. Die bevorzugte
An von Gefäßen kann
also fest montierte Kollektor- und Verteileranordnungen besitzen.
Das schließt
nicht aus, dass die voll ständige
Folge auch in einem Gefäß ausgeführt werden
kann, das einen beweglichen Auslassadapter besitzt, wie z. B. in
WO 9520427 (Amersham Pharmacia Biotech AB) und WO 9218237 (Amersham
Pharmacia Biotech AB) beschrieben. Dies schließt auch nicht ein System von
Gefäßen aus,
in dem verschiedene Gefäße den Flüssigbettschritten
bzw. Festbettschritten zugeordnet sind (siehe Bild 8–10 in der
ebenfalls anhängigen
Internationalen Patentanmeldung, die sich von SE 9803818-6 und SE
9803737-7 ableitet).
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Die oben erwähnten Dichtebereiche für Flüssigkeiten
beziehen sich auf Dichten, die bei der tatsächlichen Verfahrenstemperatur
gemessen wurden. Bei Teilchen beziehen sich die Dichten auf Teilchen
im Feuchtzustand, die mit der reinen verwendeten Flüssigkeit,
z. B. Wasser, getränkt
sind. Plattenzahlen beziehen sich auf diejenigen, die mit der in
WO 9717132 beschriebenen Methode bestimmt wurden.
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Anwendungen, bei denen
die Erfindung eingesetzt werden kann.
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Die Erfindung wird in erster Linie
bei Flüssig-Chromatographieverfahren
eingesetzt. Beispiele sind Ausschlusschromatographie (Gelpermeationschromatographie)
und Adsorptionsverfahren und Verfahren, die die Bildung kovalenter
Bindungen zwischen den Teilchen und der aus der Flüssigkeit
zu entfernenden Verbindung beinhalten. Adsorptionsverfahren werden
auch Affinitätschromatographie
genannt. Die wichtigen Varianten sind Ionenaustauschchromatographie
und Verfahren, die auf anderen Affinitätsprinzipien beruhen, wie z. B.
Bioaffinität,
hydrophobe Wechselwirkung (HIC), chelatbildende Wechselwirkung usw.
Die Struktur auf den Teilchen, die Adsorption bewirkt, wird oft
Affinitätsligand
oder Affinitätsstruktur
genannt.
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Die auf den Teilchen einzufangenden
Verbindungen können
Ionen, zum Beispiel Metallionen, und anorganische und organische
Verbindungen, wie z. B. Biomoleküle,
beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Fette, Aminosäuren, Hormone
usw. sein. Im Fall der Proteine können diese in Wirtszellen (zum
Beispiel Bakterien, Hefen, Säugetier-,
Pflanzen- und Insektenzellen)
neu kombiniert, durch in vitro-Proteinsynthese oder in transgenen
Tieren, wie z. B. transgenen Säugetieren
und transgenen Vögeln,
z. B. Wellesittichen, gebildet worden sein. Insbesondere kann die
Produktion von Humanproteinen in Kühen, Schafen, Ziegen, Pferden
usw. genannt werden. Wichtige Proteine sind native oder rekombinante
Formen von Plasmaproteinen, wie z. B. Blutgerinnungsfaktoren, Immunglobuline,
ATIII, α1-Antitrypsin, Serumalbumin usw., Milchserumproteine,
wie z. B. Lactoferin und Lactoperoxidase; Enzyme; Peptide oder Proteinhormone,
wie z. B. Wachstumshormone, Insulin usw.; Erythropoetin; Proteinantigene
und ihre zu verwendenden Fragmente, zum Beispiel als Impfstoffe
oder Mittel in der Hyposensibilisierungstherapie, und andere Proteine,
die von therapeutischem Interesse sind. Bei den Blutgerinnungsfaktoren
können
FVIII, FVII, FIX usw. genannt werden. Unter den Immunglobulinen
können verschiedene
Formen von monoklonalen Antikörpern
(IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) einschließlich der Fragmente und fusionierte
Formen derselben genannt werden. Industrielle Enzyme, wie z. B.
diejenigen, die in Waschpulvern und in anderen, zum Reinigen bestimmten
Zusammensetzungen verwendet werden, sind von potentieller Bedeutung.
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Die Proben, die auf das Flüssigbett
anzuwenden sind, sind Flüssigkeiten,
die die Verbindung enthalten, welche im Einfangschritt an die Teilchen
zu binden ist. Dazu gehören
Fermentierungsbrühen
und andere biologische Flüssigkeiten,
die von Tieren, wie z. B. Säugetieren
und anderen Wirbeltieren und Wirbellosen, gewonnen werden. Insbesondere
schließt
dies transgene Tiere ein, wie oben diskutiert. Besondere biologische Flüssigkeiten
von Tieren sind Blut, Serum, Urin, Milch (einschließlich Milchserum)
usw. und Proben, die andere oben angeführte Biomoleküle zusammen
mit klebrigen und/oder partikelförmigen
Komponenten enthalten.
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Die ursprüngliche Probe kann eine Reihe
von Vorbehandlungsschritten durchlaufen haben, bevor sie im Einfangschritt
angewendet wird. Vorbehandlungsschritte können Verdünnung, Konzentration, Entsalzung, Entfernung
spezifischer Komponenten, Zentrifugation, Filtration, Dialyse, Ultrafiltration,
pH-Werteinstellungen usw. sein. Ein typisches Verfahren besteht
darin, die Probe in einem Puffer zu verdünnen, was dieselben Bedingungen
wie bei dem Puffer liefert, der im Ausgleichsschritt verwendet wird.
Eine Alternative besteht darin, diese Teilchen ins Gleichgewicht
mit den Bedingungen zu bringen, die von der Probe geliefert werden.
Diese Verfahren werden im typischen Fall nach den geeigneten Vorbehandlungen
einer ursprünglichen
Probe ausgeführt.
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Die Erfindung wird Anwendung in einer
großen
Vielfalt von technischen Bereichen finden, wie z. B. der Lebensmittelindustrie,
Wasserreinigung and Wasserentionisierung, Medikamentenherstellung,
dem Frischen von Metallen usw.
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Ein besonders wichtiger Aspekt der
Verwendung von Dichteunterschieden, wie hier beschrieben, ist der
der Verarbeitung einer Verbindung aus einer Probe, die aus einer
biologischen Flüssigkeit
von einem Tier, insbesondere einem transgenen Tier, gewonnen wurde.
Bei dieser Form umfasst der Prozess als solcher eine tatsächliche
Folge von Schritten mit charakteristischen Merkmalen, wie oben definiert.
Die betreffenden biologischen Flüssigkeiten
und ihr Ursprung sind oben diskutiert worden. Die betreffenden biologischen
Flüssigkeiten
sind in erster Linie diejenigen, die partikelförmige und/oder klebrige Komponenten
enthalten und/oder mehr oder weniger hochviskos sind, zum Beispiel
Blut, Serum, Plasma, Milch, Milchserum usw. Die Verbindungen sind
dieselben wie oben diskutiert.
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Die bevorzugten Erscheinungsformen
der Erfindung verwenden Gefäße und Systeme,
wie in der ebenfalls anhängigen
Internationalen Patentanmeldung beschrieben, die aus SE 9803613-6
und SE 9803737-7 abgeleitet ist.
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Die Erfindung wird nun im experimentellen
Teil erläutert.
Die Erfindung wird weiter durch die angehängten Patentansprüche definiert.
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EXPERIMENTELLER TEIL
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Test zur Verwendung von
Dichteuaterschieden bei der Vermeidung der Vermischung von nacheinander
einströmenden
Flüssigkeiten
in einem Flüssigkeitsbett
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Der Hintergrund dieses Tests besteht
darin, dass man die Säule
im erweiterten Modus betreiben können
muss, ohne Leistung auf Grund von Instabilität des Bettes (Vermischung,
Kanalbildung usw.) einzubüßen. Die
Theorie besagte, dass die Dichte der Flüssigkeiten, und nicht die Viskosität der Flüssigkeiten,
der Schlüsselfaktor
ist, der entscheidet, ob zwei verschiedene Flüssigkeiten sich in einem Flüssigkett
vermischen oder nicht. Das bedeutet, dass eine schwere Flüssigkeit,
die in eine expandierte Bettsäule
gepumpt wird (gleichmäßige Verteilung
von Flüssigkeit),
welche eine leichtere Flüssigkeit
enthält,
eine scharfe Grenze zwischen den zwei Flüssigkeiten erzeugt, und dass
keine Vermischung auftritt, während
andererseits eine leichte Flüssigkeit, die
in eine schwere Flüssigkeit
gepumpt wird, eine starke Vermischung hervorruft. Durch die Verwendung
steigender Dichten von Flüssigkeit
zu Flüssigkeit
tritt keine Vermischung auf, und dadurch wird ein minimaler Verbrauch
an Puffer erreicht.
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Experiment
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Es wurde eine herkömmliche
Säule (200
mm Durchmesser und 1000 mm hoch) mit der vorhandenen Verteileranordnung
verwendet (Lochplatte mit Maschengewebe; Streamline, Amersham Pharmacia
Biotech AB, Uppsala, Schweden). Bei diesem Experiment wurde Streamline-DEAE-Gel
verwendet. Fünf
verschiedene Flüssigkeiten
wurden (mit 300 cm/h) in die Säule
von unten nach oben in folgender Reihenfolge gepumpt:
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Das Ergebnis waren scharfe Grenzen
zwischen den verschiedenen Flüssigkeiten
in Gegenwart eines Flüssigbettes
und dadurch keine Vermischung der Flüssigkeiten.
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Dieses Experiment bewies, dass die
Flüssigkeitsdichte
der entscheidende Faktor ist, wenn es um das stabile Verhalten bei
der Nichtvermischung von verschiedenen Flüssigkeiten, auch in der Gegenwart
eines Flüssigbettes,
geht.