DE69838681T2

DE69838681T2 - Escherichia coli hochexpressionsvektor

Info

Publication number: DE69838681T2
Application number: DE69838681T
Authority: DE
Inventors: Suo W. Manlius LIU; Thomas Cicero FRANCESCHINI
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1997-12-16
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2008-08-28
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: CA2314396C; JP2002508946A; DE69838681D1; ES2296350T3; WO1999031220A1; CA2314396A1; AU743599B2; EP1040184A4; AU1723399A; EP1040184B1; US6068991A; ATE377648T1; JP4446600B2; EP1040184A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Hochexpressionsvektoren für die Expression von heterologen Genen in Bakterien wie zum Beispiel Escherichia coli.
Hintergrund der Erfindung
Die Fähigkeit, große Mengen an rekombinanten Proteinen zu exprimieren ist, in vielen Anwendungen wünschenswert und für viele Industriezweige eine ökonomisch Notwendigkeit. Das stimmt besonders für Produkte, die einen geringeren Wert haben, Produkte mit geringer Gewinnmarge, technische Enzyme (z. B. Proteasen und Lipasen für Detergentien) und Proteine für in vivo-Diagnostik (Cholesterinoxidase, Penicillin-G-Acylase). Es gibt mehrere Expressionssysteme, die für die Expression von heterologen Genen verfügbar sind. Das wertvollste, vielfältigste und vielleicht beste System für die Expression von heterologen Proteinen ist jedoch Escherichia coli. Es gibt viele Veröffentlichungen über die wesentlichen Elemente, die benötigt werden, um heterologe Proteine in hohen Mengen zu exprimieren. Eines der wesentlichsten Elemente ist der Promotor, der für die Expression heterologes Gene verwendet wird. Der verwendete Promotor sollte stark sein. Manche der häufiger benutzten starken Promotoren für die Expression von heterologen Genen sind die Promotoren von P_L, tac, trp, trc und der T7 Promotor, der durch Studier et al. beschrieben wurde. Die verwendeten Promotoren sind in der Regel regulierbar. Dieses Merkmal ist wesentlich, wenn das Zielprotein, das exprimiert werden soll, für den Wirt toxisch ist. Im Allgemeinen gilt, je stärker der Promotor, desto mehr RNA wird von der DNA transkribiert werden, was zur Akkumulation von Boten-RNA führt. Neben starken regulierbaren Promotoren sind auch andere Elemente an der Expression von heterologen Genen beteiligt. Die Translationseffizienz ist an der Maximierung der Expression von heterologen Genen beteiligt. Die Translationseffizienz kann durch die 5'-Terminus-Sequenzen der mRNA beeinflusst werden, sowie durch die Haarnadelstruktur am 5'-Ende der mRNA. Im Allgemeinen ist eine funktionelle Ribosomenbindungsstelle, die eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz enthält, die richtig positioniert zu einem AUG-Codon ist, für eine effiziente Translation wesentlich. Man weiß, dass Variationen in der Distanz zwischen der SD-Sequenz und dem AUG-Codon die mRNA-Translation beeinflussen. Studien haben auch gezeigt, dass, wenn die SD-Sequenz oder das AUG-Initiationscodon in einer doppelsträngigen Region der mRNA komplexiert ist, die Translation aufgrund der Blockierung der Zugänglichkeit dieser Sequenzen für das Ribosom weniger effizient ist. Manche andere Faktoren, von welchen berichtet worden ist, dass sie die effiziente Expression von heterologen Genen beeinflussen, sind die Stabilität der Boten-RNAs, die Empfindlichkeit der Proteinprodukte für Proteolyse und der Effekt des genetischen Hintergrunds des Wirtes. Obwohl es eine Fülle an Informationen über die Elemente gibt, welche die gesamte Effizienz von einer Plasmid-basierenden Expression beeinflussen, gibt es andere Elemente, die nicht untersucht worden sind und die an der Expression von heterologen Genen beteiligt sein können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf einen Expressionsvektor gerichtet, umfassend funktionell miteinander verbunden:

(a) einen tac-Promotor, gefolgt von
(b) einer groESL-intergenischen DNA-Region, die im E. coli-Genom die Region zwischen dem Terminationscodon des groES-Gens und dem Start-Codon des groEL-Gens ist, gefolgt von
(c) einem Startcodon, gefolgt von
(d) einer Restriktionsstelle, wobei dieser Expressionsvektor nicht mehr als die ersten sieben Codons des groEL-Gens enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor der Erfindung weiterhin:
(e) groES-DNA.

In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine prokaryontische Wirtszelle, die einen Expressionsvektor, wie vorstehend definiert, enthält.
In einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auch auf ein Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins gerichtet, umfassend die Züchtung einer Wirtszelle der Erfindung, wobei der Expressionsvektor eine DNA enthält, die das heterologe Protein codiert und funktionell mit regulatorischen DNA-Sequenzen verbunden ist, in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins geeignet sind.
Kurze Beschreibung der Abbildungen:
1. Konstruktion von pBMS1000.
2. Konstruktion von pBMS1000GroESL.
3. Konstruktion von pBMS2000H.
4. Konstruktion von pBMS2000, pBMS2001, pBMS2002.
5. Konstruktion von pBMS2000.103 und pBMS2000.75.
6. Konstruktion von pBMS1999GCA und pBMS2000GCA.
7. Konstruktion von pBMS2000.103GCA, pBMS2000.75GCA und pBMS2000HGCA.
8. Konstruktion von pBMS1000PGA, pET9dPGA und pBMS2000HPGA.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Escherichia coli-GroES und -GroEL sind Chaperon-Proteine, welche die richtige Faltung einer großen Auswahl an Polypeptiden vermitteln und die oligomere Zusammenlagerung des Proteins erleichtern, indem sie vorzeitige, interne, intramolekulare Interaktionen verhindern, die zu einer Aggregation oder einer falschen Faltung führen können. Die GroES und die GroEL-Proteine werden von der gleichen mRNA transkribiert. Die Expressionsvektoren der Erfindung basieren auf dem GroESL-Operon.
Nützliche Expressionsvektoren in der vorliegenden Erfindung liegen oft in Form von „Plasmiden" vor, die sich auf zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleifen beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind.
Die Vektoren der Erfindung sind im Stande, heterologe Gene in großen Mengen in Escherichia coli zu exprimieren. Zusätzlich zu anderen Merkmalen haben die Vektoren der Erfindung einen Replikationsursprung und vorzugsweise eine Nucleinsäuresequenz, die einen selektierbaren Marker codiert. Der bestimmte selektierbare Marker, der verwendet wird, ist nicht entscheidend, vorausgesetzt, dass der Marker eine phänotypische Selektion in transformierten Wirtszellen ermöglicht. Bevorzugte selektierbare Marker stellen Antibiotikaresistenz dar. Beispiele von Antibiotikaresistenzmarkern umfassen Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Kanamycin, Gentamycin, Nalidixinsäure, Rifampicin, Spectinomycin, Streptomycin, Neomycin-Phosphotransferase und ähnliches.
In den Vektoren der Erfindung folgt auf den tac-Promotor (d. h. er ist stromaufwärts davon) die gesamte Gensequenz des groES-Gens, auf welche die intergenische Region zwischen dem Terminationscodon des groES-Gens folgt, auf die das Start-Codon des groEL-Gens folgt (hierin als die „groESL-intergenische Region" bezeichnet), auf welche eine Restriktions-Clonierungsstelle folgt. Die Clonierungsrestriktionsstelle kann sofort nach dem Startcodon des groEL-Gens oder an der RsaI-Stelle in die codierende Region des groEL-Gens eingeführt werden. Das heterologe Gen, das in die ersteren Expressionsvektoren cloniert wird, wird als das native Protein exprimiert werden, während das heterologe Gen, das in die letzteren Expressionsvektoren codiert wird, als ein Fusionsprotein mit den ersten 7 Aminosäuren des groEL-Gens exprimiert werden wird. Die Clonierungs-Restriktionsstellen stellen das ATG-Codon bereit, das für die Initiation der Translation benötigt wird.
Die Vektoren der Erfindung können in zwei Klassen kategorisiert werden, jene, die das groES-Gen enthalten, und jene ohne das groES-Gen. Die erste Vektorenklasse enthält den starken regulierbaren Promotor tac, gefolgt von den Codons, die für das GroES-Gen codieren. In den Vektoren der Erfindung wird eine Clonierungsstelle in die RsaI-Stelle des Gens eingeführt, das das GroEL codiert, oder eine Clonierungsstelle wird unmittelbar vor dem Startcodon des GroEL-Gens eingeführt. Wie vorstehend festgestellt, wird im ersten Fall das Genprodukt ein Fusionsprotein sein, das ungefähr 7 Aminosäuren des GroEL-Gens am Aminoterminus enthält; im letzteren Fall wird das Genprodukt das native Protein sein, das am Aminoterminus die Aminosäure Methionin enthält. In beiden Arten des Konstrukts werden alle GroEL-Sequenzen nach der eingeführten Restriktionsstelle entfernt. In der zweiten Vektorenart enthalten die Vektoren den tac Promotor, gefolgt von den intergenischen Sequenzen zwischen dem groES- und dem groEL-Gen und einer Restriktionsstelle, welche das Initiationscodon für die Clonierung der heterologen Gene bereitstellen. Das groES-Gen ist entfernt worden.
Die Deletion der groES-Gen-Sequenzen kann in manchen Fällen vorteilhaft sein. Die Co-Expression des groES-Proteins in großen Mengen kann mit der nachfolgenden Verarbeitung wie zum Beispiel der Immobilisierung der Enzyme an einen festen Träger interferieren. In anderen Fällen kann es jedoch vorteilhaft sein, einen Expressionsvektor zu benützen, der die Gensequenzen für das groES-Gen (z. B. pBMS2000) enthält, da es die Transkripte stabilisieren kann und die Anwesenheit von groES das heterologe, exprimierte Protein stabilisieren kann.
Die Vektoren der Erfindung können wahlweise auch Sequenzen enthalten, die den lac-Rezeptor codieren, um die Transkription vom lac-Promotor zu regulieren; das erlaubt die Expression des heterologen Gens, das durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) oder Lactose kontrolliert werden soll.
In einer Variation der vorstehend erwähnten Expressionsvektoren exprimieren die hierin genannten Vektoren wahlweise heterologe Gene konstitutiv. Das wird durch Entfernung der Operatorsequenzen aus der Promotorregion erreicht. Ein Beispiel eines solchen Vektors ist Plasmid pBMS2000H. Vorteile bei der Verwendung eines konstitutiven Expressionsvektors umfassen die Eliminierung der Notwendigkeit einen Induktor hinzuzufügen, um das System zu induzieren, die heterologen Genprodukte zu exprimieren. Das kann die Warenkosten vermindern und den Fermentationsprozess vereinfachen, indem ein Fermentationsparameter, der untersucht werden musste, wie zum Beispiel die optimale IPTG-Konzentration und der optimale Zeitpunkt, den Induktor hinzuzufügen, um die optimale Expression des Genproduktes zu ergeben, eliminiert wird. Es ist in manchen Fällen möglich, dass die Clonierung von heterologen Genen in konstitutiven Expressionsvektoren mehr heterologe Genprodukte erbringen wird, da die Genprodukte ganz vom Beginn des Zellwachstums an angereichert werden.
Die regulatorischen DNA-Sequenzen der Vektoren der Erfindung, wie zum Beispiel der Promotor und Repressor sind funktionell mit der DNA-Sequenz verbunden, welche die gesamte oder einen Teil der heterologen Gensequenz codiert, von der gewünscht wird, dass sie exprimiert wird. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, bedeutet der Begriff „funktionell verbunden", dass die regulatorischen DNA-Sequenzen im Stande sind die Replikation und/oder die Expression der DNA- Sequenz zu lenken, die das gesamte oder ein Teil des Proteins codiert, von dem gewünscht wird, dass es exprimiert wird.
Die Vektoren der Erfindung können verwendet werden, um eine große Vielzahl von heterologen Genen zu exprimieren. Beispiele von heterologen Genen, die unter Verwendung der Vektoren der Erfindung exprimiert werden können, umfassen das D-Aminosäure-Oxidasegen von Trignopsis variabilis; Gene, die Immuntoxine codieren, wie zum Beispiel G28.5sFv-PE40 und BR110sFv-PE40; das Gen, das Penicillin G-Amidase codiert, das Gen, das Glutaryl-Cephalosporin-Amidase (GCA) codiert, und ähnliches. Wie im Beispielabschnitt gezeigt, ergeben die Vektoren der Erfindung höhere Titer an exprimierten Enzymen (z. B. GCA), im Vergleich mit anderen Vektoren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel auf T-7 RNA-Polymerase basierende pET-Vektoren.
Die Expressionsvektoren der Erfindung können auch andere im Fachgebiet bekannte DNA-Sequenzen umfassen, zum Beispiel Stabilitäts-Leadersequenzen, welche die Stabilität des Expressionsproduktes bereitstellen, sezernierende Leadersequenzen, welche die Sekretion des Expressionsproduktes gewährleisten, Stabilitätselemente, welche die mitotische Stabilität des Plasmids gewährleisten, und andere Sequenzen, die zusätzliche Stellen für die Spaltung durch Restriktions-Endonucleasen bereitstellen. Die Eigenschaften des eigentlichen, verwendeten Expressionsvektors müssen mit der Wirtszelle, die eingesetzt werden soll, kompatibel sein.
Die Sequenz für den tac-Promotor wird zum Beispiel in Weiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, S. 6019–6023, 1984 beschrieben.
Geeignete Expressionsvektoren, welche die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen enthalten, können unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Techniken, wie sie hierin gelehrt werden oder wie sie im Fachgebiet bekannt sind, konstruiert werden; viele davon werden beschrieben in T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Wirtszellen, die einen Expressionsvektor der Erfindung enthalten. Geeignete Wirtszellen sind prokaryontische Zellen, die vorzugsweise biologisch rein sind. Geeignete prokaryontische Wirtszellen umfassen zum Beispiel Escherichia coli-, Bacillus subtilis- und Salmonella typhimurium-Zellen. Die am meisten bevorzugte Wirtszelle der Erfindung ist E. coli. DH5α mcr, die auch als ATCC 98563 bezeichnet wird. E. coli ATCC 98563 wurde bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, U.S.A. 20852 am 28. Oktober 1997 unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages hinterlegt. E. coli ATCC 98563 enthält Plasmid pBMS2000.
Die Expressionsvektoren können in die Wirtszellen durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren eingeführt werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Wirtszellen mit Expressionsvektoren durch das Calcium-Phosphat-Ausfällungsverfahren durchgeführt werden. Andere Verfahren zum Einführen von Expressionsvektoren in Wirtszellen, zum Beispiel Elektroporation, biolistische Fusion, liposomale Fusion, nucleare Injektion, virale oder Phagen-Infektion oder Protoplastenfusion, können auch eingesetzt werden.
Wurde ein Expressionsvektor einmal in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, kann die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet werden, welche die Expression des gewünschten Proteins oder Polypeptids erlauben.
Wirtszellen, die einen Expressionsvektor der Erfindung enthalten, können durch einen oder mehrere der folgenden sechs allgemeinen Ansätze identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) die Anwesenheit oder Abwesenheit von Markergenfunktionen; (c) Bewertung der Transkriptionsmengen, wie gemessen durch die Produktion von hTOPI-mRNA-Transkripte in Wirtszellen; (d) den immunologischen Nachweis des Genproduktes; (e) Komplementationsanalyse; und (f) Enzymtest; Enzymtest stellt das bevorzugte Identifikationsverfahren dar.
Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit einer DNA-Sequenz, die das gewünschte heterologe Protein codiert, durch DNA-DNA oder RNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die komplementär zur DNA-Sequenz sind.
Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Expressions-Vektor-Wirtssystem basierend auf der Anwesenheit oder der Abwesenheit von bestimmten Markergenfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika, Uracil-Prototrophy usw.) identifiziert und ausgewählt werden. Ein Markergen kann in das gleiche Plasmid wie die DNA-Sequenz, die das heterologe Gen codiert, unter der Regulation des gleichen oder eines unterschiedlichen Promotors platziert werden, der verwendet wird, um die heterologe Proteinproduktion zu regulieren. Die Expression des Markergens in Antwort auf Induktion oder Selektion zeigt die Expression der DNA-Sequenz an, die das heterologe Protein codiert.
Im dritten Ansatz kann die Produktion von heterologen Gen-mRNA-Transkripten durch Hybridisierungstests bewertet werden. Zum Beispiel kann RNA durch Northern-Blottverfahren oder Nuclease-Schutztest unter Verwendung einer Sonde isoliert und analysiert werden, die komplementär zu der RNA-Sequenz ist. Alternativ können die gesamten Nucleinsäuren der Wirtszelle extrahiert und auf eine Hybridisierung an solche Sonden, getestet werden.
Im vierten Ansatz kann die Expression des heterologen Gens immunologisch bewertet werden, zum Beispiel durch Western-Blottverfahren.
Im fünften Ansatz kann die Expression des heterologen Gens durch Komplementationsanalyse bewertet werden. Zum Beispiel kann in Zellen, von welchen bekannt ist, dass ihnen ein Enzym von Interesse fehlt, die Expression der Enzymaktivität durch verbessertes Wachstum der Zellen unter Wachtstumslimitierenden Bedingungen abgeleitet werden.
Im sechsten Ansatz kann die Expression der heterologen DNA durch Testen auf Enzymaktivität unter Verwendung von bekannten Verfahren gemessen werden. Zum Beispiel kann der in Y. Pommier, J. Biol. Chem. 265, Seiten 9418–9422, 1990 beschriebene Test angewandt werden.
Die DNA-Sequenzen der Expressionsvektoren, Plasmide oder der DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung können durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden. Zum Beispiel kann das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren, wie beschrieben in Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, Seiten 5463–5467, 1977, oder das Maxam-Gilbert-Verfahren, wie beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, Seiten 560–564, 1977, eingesetzt werden.
Es sollte natürlich selbstverständlich sein, dass nicht alle Expressionsvektoren und alle regulatorischen DNA-Sequenzen gleich gut wirken werden, um die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu exprimieren. Auch alle Wirtszellen werden nicht gleich gut mit dem gleichen Expressionssystem funktionieren. Ein Fachmann wird jedoch unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung ohne übermäßiges Experimentieren und ohne vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen unter den Expressionsvektoren, regulatorischen DNA-Sequenzen und den Wirtszellen eine Auswahl treffen können.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins gerichtet, umfassend das Züchten einer Wirtszelle der Erfindung unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins geeignet sind.
Züchtung der Wirtszellen kann durch einen Fachmann durch die Verwendung eines geeigneten Mediums erzielt werden. Geeignete Medien zum Züchten von Wirtszellen umfassen jene, die Nährstoffe bereitstellen, die für das Wachstum der Zellen notwendig sind. Ein typisches Wachstumsmedium umfasst notwendige Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Spurenelemente. Induktoren können auch hinzugefügt werden. Der Begriff „Induktor", wie er hierin verwendet wird, umfasst jede Verbindung, welche die Bildung des gewünschten Proteins oder Peptids verstärkt. Kohlenstoffquellen können Zucker wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Raffinose und ähnliches umfassen, Stickstoffquellen umfassen Hefeextrakt, Casaminosäuren, N-Z-Amin, Bacto-Trypton und ähnliches. Ein bevorzugtes Medium umfasst 2,4% Hefeextrakt, 1,2% Bacto-Trypton, 0,4% Glycerin, 0,72 M Dikaliumhydrogenphosphat und 0,17 M Kaliumdihydrogenphosphat. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 6,8 bis 7,5 eingestellt, stärker bevorzugt auf etwa 7,0.
Der Prozess der vorliegenden Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, die für die Expression des gewünschten Peptids geeignet sind. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise zwischen etwa 7,0 und 7,5 und am stärksten bevorzugt zwischen etwa 7,0 und 7,2 während des Wachstums der Wirtszellen beibehalten. Ein geeigneter Temperaturbereich für den Prozess der Erfindung ist von etwa 25°C bis etwa 37°C. Es ist nicht bekannt, dass Druck für die Ausübung der Erfindung entscheidend ist, und der Einfachheit halber wird üblicherweise etwa atmosphärischer Druck eingesetzt. Der Prozess der Erfindung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Das folgende Beispiel dient zur Veranschaulichung der Erfindung, sollte aber nicht als eine Einschränkung darauf interpretiert werden.
Beispiel
MIKROBIELLE STAMME UND PLASMIDE

Die Plasmide und Escherichia coli-Stämme werden in Tabelle 1 aufgelistet Tabelle 1

Stämme und Plasmide	Relevante Eigenschaften
BL21	F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-) gal dcm
BL21(DE3)	F^-ompT hsdS_B(r_B ^-m_B ^-) gal dcm (λDE3)
DH5αMCR	F^-mcrAΔ(mrr-hsdRMS
	mcrBC)f80lacZΔM15(lacZYA-argF
	U169endA1recA1deoRthi-1
	supE44l-gyrA96relA1
UM262	recA KatG::Tn10 pro leu rspL hsdR
	endl lacY
W3110(ATCC 27325)	λ^-,F^-; prototroph
pBM11M5	Kanadisches Patent # 1335357
pBMS1000	Neo^R, 4.2 Kb
pBMS1000GroESL	Neo^R, 6.2 Kb
pBMS2000	Neo^R, 4.6 Kb
pBMS2001	Neo^R, 4.6 Kb
pBMS2002	Neo^R, 4.6 Kb
pBMS2000.75	Neo^R, 4.2 Kb
pBMS2000.103	Neo^R, 4.2 Kb
pBMS2000H	Neo^R, 4.2 Kb
pBMS1000GCA	Neo^R, 6.15 Kb
pBMS1999GCA	Neo^R, 6.6 Kb
pBMS2000GCA	Neo^R, 6.55 Kb
pBMS2000.103GCA	Neo^R, 6.2 Kb
pBMS2000.75GCA	Neo^R, 6.2 Kb
pBMS2000HGCA	Neo^R, 6.2 Kb
pBMS1000PGA	Neo^R, 6.9 Kb
pBMS2000PGA	Neo^R, 7.3 Kb
pET9dPGA	Neo^R, 7.0 Kb

Puffer und Medien

Lauria-Brühe: 1% Difco-Bacto-Trypton, 0,5% Difco-Bacto-Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid
Lauria-Agar: Lauria Brühe, ergänzt mit 1,5% Difco Bacto-Agar
T-Brühe: 1,2% Difco-Bacto-Trypton, 2,4% Difco-Bacto-Hefeextrakt, 0,72 M Dikaliumhydrogenphosphat, 0,17 M Kaliumdihydrogenphosphat, 0,4% Glycerin

PCR-Amplifikation von promotorlosen groES- und groEL-Genen
Die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer wurden mit dem ABI 391-DNA-Synthesegerät synthetisiert. Der Vorwärts-Primer
(5'CTCAAAGGAGAGTTATCCATGGATATTCGTCC3') (SEQ ID NO: 1) wurde entworfen, um eine NcoI-Restriktionsstelle am Startcodon des groES-Gens einzuführen. Der Rückwärts-Primer
(5'CAGACATTTCTGCCCGGGGGTTTGTTTATTTC3') (SEQ ID NO: 2) wurde entworfen, um ungefähr 23 Basen vom groEL-Translations-Terminationscodon zu liegen, das eine natürliche SmaI-Stelle enthält. Die DNA von Escherichia coli XG44 wurde in einer 50 μl-Reaktion amplifiziert, die Standard-PCR-Puffer enthielt. Die Reaktionen wurden auf dem GeneAmp^RPCR-System 2400 DNA Thermocycler (Perkin-Elmer) DNA-Thermal-Zyklus unter Verwendung von 0,25 ml Mikroröhrchen durchgeführt. Die PCR-Bedingungen bestanden aus dem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 95°C für 4 Minuten, gefolgt von 32 Zyklen von Denaturierung bei 95°C für 45 Sekunden, Primeranlagerung bei 58°C für 1 Minute und Primer-Verlängerung bei 72°C für 3 Minuten. Nach der letzten Verlängerung der Zyklusschritte wurde eine endgültige Verlängerung bei 72°C für 20 Minuten durchgeführt, bevor die Reaktion bei 4°C gelagert wurde. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI gespalten und auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt. Das gewünschte 2,0 kb DNA-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und mit Ethanol präzipitiert. Die gereinigte DNA wurde für anschließendes clonieren verwendet.
PCR-Amplifikation des Penicillin G-Amidasegens
Das Penicillin G-Amidasegen wurde aus genomischer E. coli XG44-DNA durch PCR unter Verwendung des spezifischen Vorwärtsprimers
(CAGAGGATATCATGAAAAAT) (SEQ ID NO: 3), der eine BspHI Restriktionsstelle einführt, und des Rückwärtsprimers
(ACCAGGATCCAACATCACAATACCTG) (SEQ ID NO: 4), der eine BamHI-Restriktionsstelle einführt, amplifiziert. Die PCR-Bedingungen bestanden aus dem anfänglichen Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 Minuten, gefolgt von 33 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Primer-Anlagerung bei 55°C für 1 Minute und Primer-Verlängerung bei 72°C für 2 Minuten. Nach der letzten Verlängerung der Zyklusschritte wurde eine letzte Verlängerung bei 72°C für 5 Minuten durchgeführt, bevor die Reaktion bei 4°C gelagert wurde.
Induktion von bakteriellen Kulturen für die Expression von heterologen Genen
Die Zellen, welche die rekombinanten Gene beherbergen, wurden über Nacht in der Anwesenheit von 30 μg/ml an Neomycinsulfat in T-Brühe gezüchtet. Am nächsten Tag wurden die Kulturen 1:10 mit T-Brühe verdünnt, das mit geeignetem Antibiotikum ergänzt war. Die Zellen wurden bei 30°C in einem sich drehenden Inkubator für 4 Stunden und/oder bis zur optischen Dichte von 2,0 bei 600 nm gezüchtet; zu dieser Zeit wurde die geeignete Konzentration von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zur Kultur hinzugefügt. Die Kulturen wurden weiterhin in der Anwesenheit von IPTG bei 30°C für weitere 4 Stunden gezüchtet.
Test von Glutarylcephalosporin-Amidase
Der Nachweis von Glutarylcephalosporin-Amidase (GCA) basierte auf der Umwandlung von Glutaryl-7-aminoadipylcephalosporansäure (Glutaryl-7ADCA) zu 7-Aminoadipylcephalosporansäure (7-ADCA). Die Zellen, welche die Glutarylcephalosporin-Amidase exprimieren, wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets wurden in Wasser resuspendiert und die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen. Zelluläre Trümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und der geklärte Überstand wurde für Tests verwendet. Der geklärte Überstand, verdünnt auf die geeignete Konzentration bei einem Volumen von 250 μl, wurde zu einem gleichen Volumen an vorgewärmten 20 mg/ml Glutaryl-7-ADCA in 0,3 M Tris-Puffer, pH-Wert 8,0 hinzugefügt. Die Reaktionsgemische wurden in einem sich drehenden Inkubator bei 37°C bei 330 UpM für 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 4 ml 25 ml H₂SO₄ gestoppt. Die Reaktionsgemische wurden durch Zentrifugation geklärt und 5 μl der Probe wurden in eine 5 Mikron-Phenosphere C18-Säule injiziert und die Produkte mit 95% 60 mM Ammoniumacetat und 5% Acetonitril eluiert.
Test von Penicillin G-Amidaseaktivität
Die Zellen, welche die Penicillin G-Amidase exprimieren, wurden durch Zentrifugation geerntet und die Zellpellets wurden in Wasser resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und die Zelllysate auf Penicillin G-Amidaseaktivität untersucht. 1 ml des entsprechend verdünnten Überstands wurde zu 1 ml vorgewärmtem 4,5% Kalium-Penicillin-G hinzugefügt, das in 200 mM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5, erzeugt war. Die Reaktionsgemische wurden in einem sich drehenden Inkubator bei 37°C für 15 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von 1 ml 99,0% CH₃CN und 1,0% HOAC gestoppt, gemischt und durch Zentrifugation geklärt. 1 ml des Reaktionsgemisches wurde mit 0,33 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd (PDAB)-Reagens gemischt: ein Teil 1% PDAB in Methanol plus 6 Teile Natriumacetatpuffer (1000 ml Eisessig, 475 ml deionisiertes Wasser und 25 ml 1 N Natriumhydroxid). Nach der Inkubation für 4 Minuten bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 415 nm gemessen, von welcher die molare Konversion berechnet wird.
Konstruktion von pBMS1000
Plasmid pBM11M5 wurde mit PvuI und ClaI gespalten. Der 3'-Überhang und 5'-Überhang wurden durch Behandlung mit T4-Polymerase bzw. Klenow-Fragment entfernt. Das 4,4 kb-Fragment wurde elektroeluiert und ligiert. Das daraus resultierende Plasmid, bezeichnet als pBM11M5 (Cla/Pvu), wurde einer teilweisen HindIII-Spaltung unterzogen. Das linearisierte Fragment wurde elektroeluiert, der 5'-Überhang mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt und ligiert. Restriktionsanalysen wurden durchgeführt, um das Plasmid auszuwählen, bei dem die HindIII-Stelle an der richtigen Position eliminiert war. Das daraus resultierende Plasmid, bezeichnet als pBM11M5(Cla/Pvu/H3), wurde mit HindIII und BamHI gespalten. Das 3,35 kb-Fragment wurde eluiert und an den 90 bp-tac-Promotor ligiert, der durch die Spaltung von Plasmid pDR540 mit HindIII und BamHI erhalten wurde. Das resultierende Plasmid, bezeichnet als pBM11tac, wurde mit EcoRI und HindIII gespalten, wobei sich ein 2,9 kb-Fragment ergab, das an das 1,3 kb-lac^IQ-Fragment ligiert wurde, das durch die Spaltung von pUC19lac^IQ mit EcoRI und HindIII erhalten wurde. Um das Clonieren von heterologen Genen zu erleichtern, wurde eine NcoI-Clonierungsstelle gleich nach der BamHI-Stelle des tac-Promotors durch Insertion des Adapters
in die BamHI-Stelle von Plasmid pBM11taclac eingeführt. Das daraus resultierende 4,2 kb-Plasmid wurde pBMS1000 genannt.
Konstruktion von pBMS1000GroESL
Plasmid pBMS1000 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI gespalten. Das resultierende 4,2 kb-Fragment wurde in das groELS-Gen ligiert, das über PCR-Amplifikationen erhalten wurde und mit NcoI und SmaI wie vorstehend beschrieben, gespalten wurde. Das resultierende 6,2 kb-Plasmid wurde als pBMS1000GroESL bezeichnet.
Konstruktion von pBMS1999GCA
Plasmid pBM11taclacλN203GCA ist ein Fusions-Expressionsplasmid, das aus pBMS1000 stammt und DNA enthält, welche die ersten 33 Aminosäuren des Phagen-λ-N-Proteins codiert, verbunden mit dem Aminoterminus des 203 Glutarylceph-Amidasegens (203GCA). Der λ-N-Protein-Fusionsteil kann durch Spaltung mit NcoI (5'-Ende) und BspH1 (3'-Ende) entfernt werden. Plasmid pBM11taclacλN203GCA wurde mit BspHI gespalten und der 5'-Überhang mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt, gefolgt durch Spaltung mit NcoI. Das 6,1 kb-Fragment wurde elektroeluiert und an das 403 Basenpaar-Fragment ligiert, welches die komplette Gensequenz für das groES-Gen und die ersten 7 Aminosäuren des groEL-Gens enthielt. Das GCA-Protein ist daher ein Fusionsprodukt des groEL-Gens. Dieses Fragment wurde durch Spaltung von Plasmid pBM11taclacGroESL mit den Restriktionsenzymen NcoI und RsaI erzeugt, gefolgt durch Elektroelution. Das daraus resultierende 6,5 kb Plasmid wurde als pBMS1999GCA bezeichnet.
Konstruktion von pBMS2000GCA und pET9dGCA
Plasmid pBMS1999 wurde mit MfeI und BspHI gespalten. Das 6,43 kb-Fragment wurde aus dem Gel durch Elektroelution gereinigt und an den folgenden synthetischen Adapter ligiert:
Das daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2000GCA bezeichnet. Dieses Plasmid weist das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen dem groES- und groEL-Gen, gefolgt von der Sequenz, welche das 203 Glutarylceph-Amidasegen codiert, auf.
Plasmid pET9d (bezogen von Novogen) wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI gespalten. Die linearisierte 4,3 kb-Plasmid-DNA wurde aus dem Agarosegel durch Elektroelution gereinigt und an das 2 kb Glutarylcephalosporin-Amidasegen ligiert, das durch Spaltung von einem Plasmid, welches das GCA203-Gen, enthielt, mit BspHI und BamHI, erhalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde als pET9dGCA bezeichnet.
Konstruktion von pBMS2000
Plasmid pBMS2000 stammte aus Plasmid pBMS2000GCA. Plasmid pBMS2000GCA wurde mit den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten, um das GCA-Gen zu entfernen. Das daraus resultierende 4,53 kb-Fragment wurde an das folgende Oligomer ligiert:
Das daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2000 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und groEL und die BspHI- und BamHI-Restriktionsstellen für die Genclonierung.
Konstruktion von pBMS2001
Plasmid pBMS2001 stammte aus Plasmid pBMS2000. Plasmid BMS2000 wurde mit den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten. Das daraus resultierende 4,53 kb-Fragment wurde dann in das folgende Oligomer ligiert:
Das daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2001 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und groEL, gefolgt von den Restriktionsstellen NcoI und BamHI für die Genclonierung.
Konstruktion von pBMS2002
Plasmid pBMS2002 stammte aus Plasmid pBMS2000. Plasmid BMS2000 wurde mit den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten. Das daraus resultierende 4,53 kb-Fragment wurde an das folgende Oligomer ligiert:
Das daraus resultierende 4,6 kb-Plasmid wurde als pBMS2002 bezeichnet. Dieses Plasmid enthält das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und groEL, gefolgt von den Restriktionsstellen NcoI und BamHI für die Genclonierung.
Konstruktion von pBMS2000.103
Plasmid pBMS2000.103 stammte aus Plasmid pBMS2000. Ihm fehlt die Sequenz, die das groES-Gen codiert, aber es behält die intergenischen Sequenzen zwischen den groES/geoEL-Genen bei. Plasmid pBMS2000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BspHI gespalten. Dieser Prozess entfernt den tac-Promotor, den lac-Operator, das groES-Gen und die intergenische groES/groEL-Region. Das daraus resultierende 4,12 kb-Fragment wurde an ein chemisch synthetisiertes Oligomer ligiert, das die Sequenzen des tac-Promotors, des lac-Operators und der intergenischen groES/groEL-Region enthält.
Das daraus resultierende Plasmid wird als pBMS2000.103 bezeichnet.
Konstruktion von pBMS2000.75
Plasmid pBMS2000.75 ist ähnlich dem Plasmid pBMS2000.103. Es enthält nur partielle intergenische groES/groEL-Sequenzen anstatt der gesamten intergenischen Sequenzen, wie in Plasmid pBMS2000.103. Plasmid pBMS2000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BspHI gespalten. Dieser Prozess entfernt den tac-Promotor, das groES-Gen und die intergenische groES/groEL-Region. Das daraus resultierende 4,1 kb-Fragment wurde an ein chemisch synthetisiertes Oligomer ligiert, das die Sequenzen des tac-Promotors, des lac-Operators und der intergenischen groES/groEL-Region enthält.
Das daraus resultierende 4,2 kb-Plasmid wird als pBMS2000.75 bezeichnet.
Konstruktion von pBMS2000H
Plasmid pBMS1000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NcoI gespalten. Das 4,1 kb-Fragment wurde isoliert, elektroeluiert und an das folgende Oligomer ligiert
Das daraus resultierende, als pBMS2000H bezeichnete Plasmid enthält den tac-Promotor, gefolgt von den intergenischen Abstandssequenzen zwischen dem groES- und groEL-Gen. Es enthält keine Operatorsequenzen und ermöglicht so, dass jedes heterologe Gen, das in diesem Vektor cloniert wird, konstitutiv exprimiert werden kann.
Konstruktion von pBMS1000PGA, pET9d und pBMS2000PGA
Das resultierende PCR-Produkt aus der Amplifikation des PGA-Gens wurde mit den Restriktionsenzymen BspHI und BamHI gespalten und zwischen die NcoI- und BamHI-Stellen von pBMS1000, die NcoI- und BamHI-Stellen von pET9d (bezogen von Novogen) und die BspHI- und BamHI-Stellen von pBMS2000 cloniert; dies resultierte in pBMS1000PGA, pET9dPGA bzw. pBMS2000PGA.
Konstruktion von pBMS2000HGCA
Plasmid pBMS2000H wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI gespalten. Das 4,2 kb-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert und an das 2 kb-Glutaryl-cephalosporin-Amidasegen ligiert, das durch Spaltung eines Plasmids, welches das GCA203-Gen enthielt, mit BspHI und BamHI erhalten wurde. Das daraus resultierende 6,2 kb-Plasmid wurde als pBMS2000GCA bezeichnet.
Konstruktion von pBMS2000.103GCA und pBMS2000.75GCA
Plasmid pBMS2000.103 und pBMS2000.75 wurden mit den Restriktionsenzymen BspHI und BamHI gespalten. Das 4,2 kb-Fragment wurde elektroeluiert und in das 2 kb-Glutarylcephalosporin-Amidasegen ligiert, das durch Spaltung eines Plasmids, welches das GCA203-Gen enthielt, mit BspHI und BamHI erhalten wurde. Das daraus resultierende 6,2 kb-Plasmid wurde als pBMS2000.103GCA und pBMS2000.75GCA bezeichnet. Tabelle II Expression von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Plasmiden

Plasmid IE/ml

pBMS1000INGCA203 1,7

pET9GCA203 6,7

pBMS2000GCA203 8,4
Übernacht-Kulturen von E. coli, die GCA203 beherbergen, wurden 1:10 in T-Brühe verdünnt, die mit 30 μg/ml an Neomycinsulfat ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 30°C bei 300 UpM für 4 Stunden gezüchtet, oder bis OD₅₅₀ = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt wurden 60 μM IPTG zu den Kulturen hinzugefügt, um die Expression von GCA zu induzieren. Tabelle III Expression von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Plasmiden in Fermentationstanks

Plasmid IE/ml

Gefäßgröße

2 l 4000 l

pBMS1000GCA 54 20

pET9GCAGCA 120 50

pBMS2000GCA 280 150

Tabelle IV Expression von Fusions- und nativem GCA in Schüttelflaschen und 1 Liter-Fermentoren.

Titer des Plasmids in der Schüttelflasche

IE/ml 1 Litertiter IE/ml

pBMS1999GCA 5,2 100

pBMS2000GCA 8,4 220

Tabelle V Vergleich der Penicillin G-Amidase-Expression in pBMS2000 mit dem pET-Vektor

Plasmid IE/ml

pET9PGA 1,0

pBMS2000PGA 3,3
Übernacht-Kulturen von E. coli, welche die Penicillin G-Amidase beherbergen, wurden in T-Brühe 1:10 verdünnt, die mit 30 μg/ml Neomycinsulfat ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 30°C bei 300 UpM für 4 Stunden gezüchtet, oder bis OD₅₅₀ = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt wurden 60 μM IPTG zu den Kulturen hinzugefügt, um die Expression von Penicillin G-Amidase zu induzieren. Tabelle VI Expression von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Derivaten des Plasmids pBMS2000

Plasmid IE/ml

pBMS2000GCA 11

pBMS2000.103GCA 9

pBMS2000HGCA 11
Übernacht-Kulturen von E. coli, die GCA203 beherbergen, wurden 1:10 in T-Brühe verdünnt, die mit 30 μg/ml Neomycinsulfat ergänzt war. Die Kulturen wurden bei 30°C bei 300 UpM für 4 Stunden gezüchtet, oder bis OD₅₅₀ = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt wurden 60 μM IPTG zu den Kulturen hinzugefügt, um die Expression von GCA zu induzieren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Expressionsvektor, welcher, funktionell miteinander verknüpft, umfasst: (a) einen Tac-Promotor, gefolgt von (b) einer groESL-intergenischen Region, welche im E. coli-Genom die Region zwischen dem Terminationscodon des groES-Gens und dem Startcodon des groEL-Gens ist, gefolgt von (c) einem Startcodon, gefolgt von (d) einer Restriktionsschnittstelle, wobei der Expressionsvektor nicht mehr als die ersten sieben Codons des groEL-Gens enthält.
Expressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin umfassend groES-DNA.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, welcher anstatt des Startcodons die ersten sieben Codons von groEL umfasst, und wobei die Restriktionsschnittstelle in die RsaI-Schnittstelle des Gens, welches groEL codiert, eingeführt ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Restriktionsschnittstelle unmittelbar vor dem Startcodon eingeführt ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, weiterhin umfassend eine DNA-Sequenz, welche einen selektierbaren Marker codiert.
Expressionsvektor nach Anspruch 5, wobei der selektierbare Marker eine Antibiotikaresistenz ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei der selektierbare Marker Neomycinresistenz ist.
Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, weiterhin umfassend Sequenzen, welche den Lac-Repressor codieren.
Prokaryontische Wirtszelle, welche den Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
Prokaryontische Wirtszelle nach Anspruch 9, welche E. coli ist.
Prokaryontische Wirtszelle nach Anspruch 10, welche E. coli-Stamm ATCC 98563 ist.
Verfahren zum Exprimieren eines heterologen Proteins in einer prokaryontischen Wirtszelle, umfassend das Züchten der prokaryontischen Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11 in einem geeigneten Medium unter Bedingungen, welche für die Expression des heterologen Proteins geeignet sind, wobei der Expressionsvektor eine DNA enthält, welche das heterologe Protein codiert, und welche funktionell mit regulatorischen DNA-Sequenzen verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das heterologe Protein Glutarylcephalosporinamidase oder Penicillin G-Amidase ist.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, welches bei einer Temperatur von 25°C bis 37°C und einem pH-Wert von 7,0 bis 7,2 durchgeführt wird.
Verwendung des Expressionsvektors nach einem der Ansprüche 1 bis 8, oder der prokaryontischen Wirtszelle nach einem der Ansprüche 9 bis 11, für die Expression eines heterologen Proteins.