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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Hochexpressionsvektoren für die Expression
von heterologen Genen in Bakterien wie zum Beispiel Escherichia
coli.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
Fähigkeit,
große
Mengen an rekombinanten Proteinen zu exprimieren ist, in vielen
Anwendungen wünschenswert
und für
viele Industriezweige eine ökonomisch
Notwendigkeit. Das stimmt besonders für Produkte, die einen geringeren
Wert haben, Produkte mit geringer Gewinnmarge, technische Enzyme
(z. B. Proteasen und Lipasen für
Detergentien) und Proteine für
in vivo-Diagnostik (Cholesterinoxidase, Penicillin-G-Acylase). Es
gibt mehrere Expressionssysteme, die für die Expression von heterologen
Genen verfügbar sind.
Das wertvollste, vielfältigste
und vielleicht beste System für
die Expression von heterologen Proteinen ist jedoch Escherichia
coli. Es gibt viele Veröffentlichungen über die
wesentlichen Elemente, die benötigt
werden, um heterologe Proteine in hohen Mengen zu exprimieren. Eines
der wesentlichsten Elemente ist der Promotor, der für die Expression
heterologes Gene verwendet wird. Der verwendete Promotor sollte
stark sein. Manche der häufiger
benutzten starken Promotoren für
die Expression von heterologen Genen sind die Promotoren von PL, tac, trp, trc und der T7 Promotor, der
durch Studier et al. beschrieben wurde. Die verwendeten Promotoren
sind in der Regel regulierbar. Dieses Merkmal ist wesentlich, wenn
das Zielprotein, das exprimiert werden soll, für den Wirt toxisch ist. Im
Allgemeinen gilt, je stärker
der Promotor, desto mehr RNA wird von der DNA transkribiert werden,
was zur Akkumulation von Boten-RNA führt. Neben starken regulierbaren
Promotoren sind auch andere Elemente an der Expression von heterologen
Genen beteiligt. Die Translationseffizienz ist an der Maximierung
der Expression von heterologen Genen beteiligt. Die Translationseffizienz
kann durch die 5'-Terminus-Sequenzen
der mRNA beeinflusst werden, sowie durch die Haarnadelstruktur am
5'-Ende der mRNA.
Im Allgemeinen ist eine funktionelle Ribosomenbindungsstelle, die
eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz enthält, die richtig positioniert
zu einem AUG-Codon ist, für
eine effiziente Translation wesentlich. Man weiß, dass Variationen in der
Distanz zwischen der SD-Sequenz und dem AUG-Codon die mRNA-Translation
beeinflussen. Studien haben auch gezeigt, dass, wenn die SD-Sequenz
oder das AUG-Initiationscodon in einer doppelsträngigen Region der mRNA komplexiert
ist, die Translation aufgrund der Blockierung der Zugänglichkeit dieser
Sequenzen für
das Ribosom weniger effizient ist. Manche andere Faktoren, von welchen
berichtet worden ist, dass sie die effiziente Expression von heterologen
Genen beeinflussen, sind die Stabilität der Boten-RNAs, die Empfindlichkeit
der Proteinprodukte für
Proteolyse und der Effekt des genetischen Hintergrunds des Wirtes.
Obwohl es eine Fülle
an Informationen über
die Elemente gibt, welche die gesamte Effizienz von einer Plasmid-basierenden
Expression beeinflussen, gibt es andere Elemente, die nicht untersucht
worden sind und die an der Expression von heterologen Genen beteiligt
sein können.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist auf einen Expressionsvektor gerichtet,
umfassend funktionell miteinander verbunden:
- (a)
einen tac-Promotor, gefolgt von
- (b) einer groESL-intergenischen DNA-Region, die im E. coli-Genom
die Region zwischen dem Terminationscodon des groES-Gens und dem
Start-Codon des groEL-Gens ist, gefolgt von
- (c) einem Startcodon, gefolgt von
- (d) einer Restriktionsstelle,
wobei dieser Expressionsvektor
nicht mehr als die ersten sieben Codons des groEL-Gens enthält. In einer bevorzugten
Ausführungsform
umfasst der Vektor der Erfindung weiterhin:
- (e) groES-DNA.
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In
einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine prokaryontische
Wirtszelle, die einen Expressionsvektor, wie vorstehend definiert,
enthält.
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In
einem anderen Aspekt ist die vorliegende Erfindung auch auf ein
Verfahren zur Erzeugung eines heterologen Proteins gerichtet, umfassend
die Züchtung
einer Wirtszelle der Erfindung, wobei der Expressionsvektor eine
DNA enthält,
die das heterologe Protein codiert und funktionell mit regulatorischen
DNA-Sequenzen verbunden ist, in einem geeigneten Medium unter Bedingungen,
die für
die Expression des Proteins geeignet sind.
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Kurze Beschreibung der Abbildungen:
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1. Konstruktion von pBMS1000.
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2.
Konstruktion von pBMS1000GroESL.
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3.
Konstruktion von pBMS2000H.
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4.
Konstruktion von pBMS2000, pBMS2001, pBMS2002.
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5.
Konstruktion von pBMS2000.103 und pBMS2000.75.
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6.
Konstruktion von pBMS1999GCA und pBMS2000GCA.
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7. Konstruktion von pBMS2000.103GCA, pBMS2000.75GCA
und pBMS2000HGCA.
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8. Konstruktion von pBMS1000PGA, pET9dPGA
und pBMS2000HPGA.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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Escherichia
coli-GroES und -GroEL sind Chaperon-Proteine, welche die richtige
Faltung einer großen Auswahl
an Polypeptiden vermitteln und die oligomere Zusammenlagerung des
Proteins erleichtern, indem sie vorzeitige, interne, intramolekulare
Interaktionen verhindern, die zu einer Aggregation oder einer falschen
Faltung führen
können.
Die GroES und die GroEL-Proteine werden von der gleichen mRNA transkribiert.
Die Expressionsvektoren der Erfindung basieren auf dem GroESL-Operon.
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Nützliche
Expressionsvektoren in der vorliegenden Erfindung liegen oft in
Form von „Plasmiden" vor, die sich auf
zirkuläre
doppelsträngige
DNA-Schleifen beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom
gebunden sind.
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Die
Vektoren der Erfindung sind im Stande, heterologe Gene in großen Mengen
in Escherichia coli zu exprimieren. Zusätzlich zu anderen Merkmalen
haben die Vektoren der Erfindung einen Replikationsursprung und
vorzugsweise eine Nucleinsäuresequenz,
die einen selektierbaren Marker codiert. Der bestimmte selektierbare
Marker, der verwendet wird, ist nicht entscheidend, vorausgesetzt,
dass der Marker eine phänotypische
Selektion in transformierten Wirtszellen ermöglicht. Bevorzugte selektierbare
Marker stellen Antibiotikaresistenz dar. Beispiele von Antibiotikaresistenzmarkern
umfassen Ampicillin, Tetracyclin, Chloramphenicol, Kanamycin, Gentamycin,
Nalidixinsäure,
Rifampicin, Spectinomycin, Streptomycin, Neomycin-Phosphotransferase
und ähnliches.
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In
den Vektoren der Erfindung folgt auf den tac-Promotor (d. h. er
ist stromaufwärts
davon) die gesamte Gensequenz des groES-Gens, auf welche die intergenische
Region zwischen dem Terminationscodon des groES-Gens folgt, auf
die das Start-Codon des groEL-Gens folgt (hierin als die „groESL-intergenische
Region" bezeichnet),
auf welche eine Restriktions-Clonierungsstelle folgt. Die Clonierungsrestriktionsstelle
kann sofort nach dem Startcodon des groEL-Gens oder an der RsaI-Stelle
in die codierende Region des groEL-Gens eingeführt werden. Das heterologe
Gen, das in die ersteren Expressionsvektoren cloniert wird, wird
als das native Protein exprimiert werden, während das heterologe Gen, das
in die letzteren Expressionsvektoren codiert wird, als ein Fusionsprotein
mit den ersten 7 Aminosäuren
des groEL-Gens exprimiert werden wird. Die Clonierungs-Restriktionsstellen
stellen das ATG-Codon bereit, das für die Initiation der Translation
benötigt
wird.
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Die
Vektoren der Erfindung können
in zwei Klassen kategorisiert werden, jene, die das groES-Gen enthalten,
und jene ohne das groES-Gen. Die erste Vektorenklasse enthält den starken
regulierbaren Promotor tac, gefolgt von den Codons, die für das GroES-Gen
codieren. In den Vektoren der Erfindung wird eine Clonierungsstelle
in die RsaI-Stelle des Gens eingeführt, das das GroEL codiert,
oder eine Clonierungsstelle wird unmittelbar vor dem Startcodon
des GroEL-Gens eingeführt.
Wie vorstehend festgestellt, wird im ersten Fall das Genprodukt
ein Fusionsprotein sein, das ungefähr 7 Aminosäuren des GroEL-Gens am Aminoterminus
enthält;
im letzteren Fall wird das Genprodukt das native Protein sein, das
am Aminoterminus die Aminosäure
Methionin enthält.
In beiden Arten des Konstrukts werden alle GroEL-Sequenzen nach
der eingeführten
Restriktionsstelle entfernt. In der zweiten Vektorenart enthalten
die Vektoren den tac Promotor, gefolgt von den intergenischen Sequenzen
zwischen dem groES- und dem groEL-Gen und einer Restriktionsstelle,
welche das Initiationscodon für
die Clonierung der heterologen Gene bereitstellen. Das groES-Gen
ist entfernt worden.
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Die
Deletion der groES-Gen-Sequenzen kann in manchen Fällen vorteilhaft
sein. Die Co-Expression des groES-Proteins in großen Mengen
kann mit der nachfolgenden Verarbeitung wie zum Beispiel der Immobilisierung
der Enzyme an einen festen Träger
interferieren. In anderen Fällen
kann es jedoch vorteilhaft sein, einen Expressionsvektor zu benützen, der
die Gensequenzen für
das groES-Gen (z. B. pBMS2000) enthält, da es die Transkripte stabilisieren
kann und die Anwesenheit von groES das heterologe, exprimierte Protein stabilisieren
kann.
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Die
Vektoren der Erfindung können
wahlweise auch Sequenzen enthalten, die den lac-Rezeptor codieren,
um die Transkription vom lac-Promotor zu regulieren; das erlaubt
die Expression des heterologen Gens, das durch Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) oder Lactose kontrolliert werden soll.
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In
einer Variation der vorstehend erwähnten Expressionsvektoren exprimieren
die hierin genannten Vektoren wahlweise heterologe Gene konstitutiv.
Das wird durch Entfernung der Operatorsequenzen aus der Promotorregion
erreicht. Ein Beispiel eines solchen Vektors ist Plasmid pBMS2000H.
Vorteile bei der Verwendung eines konstitutiven Expressionsvektors
umfassen die Eliminierung der Notwendigkeit einen Induktor hinzuzufügen, um
das System zu induzieren, die heterologen Genprodukte zu exprimieren.
Das kann die Warenkosten vermindern und den Fermentationsprozess
vereinfachen, indem ein Fermentationsparameter, der untersucht werden
musste, wie zum Beispiel die optimale IPTG-Konzentration und der
optimale Zeitpunkt, den Induktor hinzuzufügen, um die optimale Expression
des Genproduktes zu ergeben, eliminiert wird. Es ist in manchen
Fällen
möglich,
dass die Clonierung von heterologen Genen in konstitutiven Expressionsvektoren mehr
heterologe Genprodukte erbringen wird, da die Genprodukte ganz vom
Beginn des Zellwachstums an angereichert werden.
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Die
regulatorischen DNA-Sequenzen der Vektoren der Erfindung, wie zum
Beispiel der Promotor und Repressor sind funktionell mit der DNA-Sequenz
verbunden, welche die gesamte oder einen Teil der heterologen Gensequenz
codiert, von der gewünscht
wird, dass sie exprimiert wird. Wie in diesem Zusammenhang verwendet,
bedeutet der Begriff „funktionell
verbunden", dass
die regulatorischen DNA-Sequenzen im Stande sind die Replikation
und/oder die Expression der DNA- Sequenz
zu lenken, die das gesamte oder ein Teil des Proteins codiert, von
dem gewünscht
wird, dass es exprimiert wird.
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Die
Vektoren der Erfindung können
verwendet werden, um eine große
Vielzahl von heterologen Genen zu exprimieren. Beispiele von heterologen
Genen, die unter Verwendung der Vektoren der Erfindung exprimiert werden
können,
umfassen das D-Aminosäure-Oxidasegen
von Trignopsis variabilis; Gene, die Immuntoxine codieren, wie zum
Beispiel G28.5sFv-PE40 und BR110sFv-PE40; das Gen, das Penicillin
G-Amidase codiert, das Gen, das Glutaryl-Cephalosporin-Amidase (GCA) codiert,
und ähnliches.
Wie im Beispielabschnitt gezeigt, ergeben die Vektoren der Erfindung
höhere
Titer an exprimierten Enzymen (z. B. GCA), im Vergleich mit anderen
Vektoren, die im Fachgebiet bekannt sind, wie zum Beispiel auf T-7
RNA-Polymerase basierende pET-Vektoren.
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Die
Expressionsvektoren der Erfindung können auch andere im Fachgebiet
bekannte DNA-Sequenzen umfassen, zum Beispiel Stabilitäts-Leadersequenzen,
welche die Stabilität
des Expressionsproduktes bereitstellen, sezernierende Leadersequenzen,
welche die Sekretion des Expressionsproduktes gewährleisten, Stabilitätselemente,
welche die mitotische Stabilität
des Plasmids gewährleisten,
und andere Sequenzen, die zusätzliche
Stellen für
die Spaltung durch Restriktions-Endonucleasen
bereitstellen. Die Eigenschaften des eigentlichen, verwendeten Expressionsvektors
müssen
mit der Wirtszelle, die eingesetzt werden soll, kompatibel sein.
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Die
Sequenz für
den tac-Promotor wird zum Beispiel in Weiss et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 81, S. 6019–6023,
1984 beschrieben.
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Geeignete
Expressionsvektoren, welche die gewünschten Codierungs- und Kontrollsequenzen
enthalten, können
unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Techniken, wie sie
hierin gelehrt werden oder wie sie im Fachgebiet bekannt sind, konstruiert
werden; viele davon werden beschrieben in T. Maniatis et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1982.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem Wirtszellen, die einen
Expressionsvektor der Erfindung enthalten. Geeignete Wirtszellen
sind prokaryontische Zellen, die vorzugsweise biologisch rein sind.
Geeignete prokaryontische Wirtszellen umfassen zum Beispiel Escherichia
coli-, Bacillus subtilis- und Salmonella typhimurium-Zellen. Die
am meisten bevorzugte Wirtszelle der Erfindung ist E. coli. DH5α mcr, die
auch als ATCC 98563 bezeichnet wird. E. coli ATCC 98563 wurde bei
der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland, U.S.A. 20852 am 28. Oktober 1997 unter den Bestimmungen
des Budapester Vertrages hinterlegt. E. coli ATCC 98563 enthält Plasmid
pBMS2000.
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Die
Expressionsvektoren können
in die Wirtszellen durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren
eingeführt
werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Wirtszellen mit Expressionsvektoren
durch das Calcium-Phosphat-Ausfällungsverfahren
durchgeführt
werden. Andere Verfahren zum Einführen von Expressionsvektoren
in Wirtszellen, zum Beispiel Elektroporation, biolistische Fusion,
liposomale Fusion, nucleare Injektion, virale oder Phagen-Infektion
oder Protoplastenfusion, können
auch eingesetzt werden.
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Wurde
ein Expressionsvektor einmal in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, kann
die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet werden, welche die Expression
des gewünschten
Proteins oder Polypeptids erlauben.
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Wirtszellen,
die einen Expressionsvektor der Erfindung enthalten, können durch
einen oder mehrere der folgenden sechs allgemeinen Ansätze identifiziert
werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung; (b) die Anwesenheit oder Abwesenheit
von Markergenfunktionen; (c) Bewertung der Transkriptionsmengen,
wie gemessen durch die Produktion von hTOPI-mRNA-Transkripte in
Wirtszellen; (d) den immunologischen Nachweis des Genproduktes;
(e) Komplementationsanalyse; und (f) Enzymtest; Enzymtest stellt
das bevorzugte Identifikationsverfahren dar.
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Im
ersten Ansatz kann die Anwesenheit einer DNA-Sequenz, die das gewünschte heterologe
Protein codiert, durch DNA-DNA oder RNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von
Sonden nachgewiesen werden, die komplementär zur DNA-Sequenz sind.
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Im
zweiten Ansatz kann das rekombinante Expressions-Vektor-Wirtssystem
basierend auf der Anwesenheit oder der Abwesenheit von bestimmten
Markergenfunktionen (z. B. Thymidin-Kinaseaktivität, Resistenz gegenüber Antibiotika,
Uracil-Prototrophy usw.) identifiziert und ausgewählt werden.
Ein Markergen kann in das gleiche Plasmid wie die DNA-Sequenz, die
das heterologe Gen codiert, unter der Regulation des gleichen oder
eines unterschiedlichen Promotors platziert werden, der verwendet
wird, um die heterologe Proteinproduktion zu regulieren. Die Expression
des Markergens in Antwort auf Induktion oder Selektion zeigt die
Expression der DNA-Sequenz an, die das heterologe Protein codiert.
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Im
dritten Ansatz kann die Produktion von heterologen Gen-mRNA-Transkripten durch
Hybridisierungstests bewertet werden. Zum Beispiel kann RNA durch
Northern-Blottverfahren oder Nuclease-Schutztest unter Verwendung
einer Sonde isoliert und analysiert werden, die komplementär zu der
RNA-Sequenz ist. Alternativ können
die gesamten Nucleinsäuren
der Wirtszelle extrahiert und auf eine Hybridisierung an solche Sonden,
getestet werden.
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Im
vierten Ansatz kann die Expression des heterologen Gens immunologisch
bewertet werden, zum Beispiel durch Western-Blottverfahren.
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Im
fünften
Ansatz kann die Expression des heterologen Gens durch Komplementationsanalyse
bewertet werden. Zum Beispiel kann in Zellen, von welchen bekannt
ist, dass ihnen ein Enzym von Interesse fehlt, die Expression der
Enzymaktivität
durch verbessertes Wachstum der Zellen unter Wachtstumslimitierenden Bedingungen
abgeleitet werden.
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Im
sechsten Ansatz kann die Expression der heterologen DNA durch Testen
auf Enzymaktivität
unter Verwendung von bekannten Verfahren gemessen werden. Zum Beispiel
kann der in Y. Pommier, J. Biol. Chem. 265, Seiten 9418–9422, 1990
beschriebene Test angewandt werden.
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Die
DNA-Sequenzen der Expressionsvektoren, Plasmide oder der DNA-Moleküle der vorliegenden
Erfindung können
durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren bestimmt werden.
Zum Beispiel kann das Didesoxy-Kettenterminationsverfahren,
wie beschrieben in Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, Seiten
5463–5467,
1977, oder das Maxam-Gilbert-Verfahren, wie beschrieben in Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, Seiten 560–564, 1977, eingesetzt werden.
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Es
sollte natürlich
selbstverständlich
sein, dass nicht alle Expressionsvektoren und alle regulatorischen
DNA-Sequenzen gleich gut wirken werden, um die DNA-Sequenzen der vorliegenden
Erfindung zu exprimieren. Auch alle Wirtszellen werden nicht gleich
gut mit dem gleichen Expressionssystem funktionieren. Ein Fachmann
wird jedoch unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung
ohne übermäßiges Experimentieren
und ohne vom Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen
unter den Expressionsvektoren, regulatorischen DNA-Sequenzen und den
Wirtszellen eine Auswahl treffen können.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Erzeugung eines
heterologen Proteins gerichtet, umfassend das Züchten einer Wirtszelle der
Erfindung unter Bedingungen, die für die Expression des Proteins
geeignet sind.
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Züchtung der
Wirtszellen kann durch einen Fachmann durch die Verwendung eines
geeigneten Mediums erzielt werden. Geeignete Medien zum Züchten von
Wirtszellen umfassen jene, die Nährstoffe
bereitstellen, die für
das Wachstum der Zellen notwendig sind. Ein typisches Wachstumsmedium
umfasst notwendige Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Spurenelemente.
Induktoren können
auch hinzugefügt
werden. Der Begriff „Induktor", wie er hierin verwendet
wird, umfasst jede Verbindung, welche die Bildung des gewünschten Proteins
oder Peptids verstärkt.
Kohlenstoffquellen können
Zucker wie zum Beispiel Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose,
Raffinose und ähnliches
umfassen, Stickstoffquellen umfassen Hefeextrakt, Casaminosäuren, N-Z-Amin,
Bacto-Trypton und ähnliches.
Ein bevorzugtes Medium umfasst 2,4% Hefeextrakt, 1,2% Bacto-Trypton,
0,4% Glycerin, 0,72 M Dikaliumhydrogenphosphat und 0,17 M Kaliumdihydrogenphosphat.
Der pH-Wert des
Mediums wird vorzugsweise auf etwa 6,8 bis 7,5 eingestellt, stärker bevorzugt
auf etwa 7,0.
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Der
Prozess der vorliegenden Erfindung wird unter Bedingungen durchgeführt, die
für die
Expression des gewünschten
Peptids geeignet sind. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise
zwischen etwa 7,0 und 7,5 und am stärksten bevorzugt zwischen etwa
7,0 und 7,2 während
des Wachstums der Wirtszellen beibehalten. Ein geeigneter Temperaturbereich
für den
Prozess der Erfindung ist von etwa 25°C bis etwa 37°C. Es ist nicht
bekannt, dass Druck für
die Ausübung
der Erfindung entscheidend ist, und der Einfachheit halber wird üblicherweise
etwa atmosphärischer
Druck eingesetzt. Der Prozess der Erfindung wird vorzugsweise unter
aeroben Bedingungen durchgeführt.
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Das
folgende Beispiel dient zur Veranschaulichung der Erfindung, sollte
aber nicht als eine Einschränkung
darauf interpretiert werden.
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Beispiel
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MIKROBIELLE STAMME UND PLASMIDE
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Die
Plasmide und Escherichia coli-Stämme
werden in Tabelle 1 aufgelistet Tabelle
1
Stämme und
Plasmide | Relevante
Eigenschaften |
BL21 | F-ompT hsdSB(rB -mB -) gal dcm |
BL21(DE3) | F-ompT hsdSB(rB -mB -) gal dcm (λDE3) |
DH5αMCR | F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS |
| mcrBC)f80lacZΔM15(lacZYA-argF |
| U169endA1recA1deoRthi-1 |
| supE44l-gyrA96relA1 |
UM262 | recA
KatG::Tn10 pro leu rspL hsdR |
| endl
lacY |
W3110(ATCC
27325) | λ-,F-; prototroph |
pBM11M5 | Kanadisches
Patent # 1335357 |
pBMS1000 | NeoR, 4.2 Kb |
pBMS1000GroESL | NeoR, 6.2 Kb |
pBMS2000 | NeoR, 4.6 Kb |
pBMS2001 | NeoR, 4.6 Kb |
pBMS2002 | NeoR, 4.6 Kb |
pBMS2000.75 | NeoR, 4.2 Kb |
pBMS2000.103 | NeoR, 4.2 Kb |
pBMS2000H | NeoR, 4.2 Kb |
pBMS1000GCA | NeoR, 6.15 Kb |
pBMS1999GCA | NeoR, 6.6 Kb |
pBMS2000GCA | NeoR, 6.55 Kb |
pBMS2000.103GCA | NeoR, 6.2 Kb |
pBMS2000.75GCA | NeoR, 6.2 Kb |
pBMS2000HGCA | NeoR, 6.2 Kb |
pBMS1000PGA | NeoR, 6.9 Kb |
pBMS2000PGA | NeoR, 7.3 Kb |
pET9dPGA | NeoR, 7.0 Kb |
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Puffer und Medien
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- Lauria-Brühe:
1% Difco-Bacto-Trypton, 0,5% Difco-Bacto-Hefeextrakt, 0,5% Natriumchlorid
- Lauria-Agar: Lauria Brühe,
ergänzt
mit 1,5% Difco Bacto-Agar
- T-Brühe:
1,2% Difco-Bacto-Trypton, 2,4% Difco-Bacto-Hefeextrakt, 0,72 M Dikaliumhydrogenphosphat,
0,17 M Kaliumdihydrogenphosphat, 0,4% Glycerin
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PCR-Amplifikation von promotorlosen groES-
und groEL-Genen
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Die
Vorwärts-
und Rückwärts-PCR-Primer
wurden mit dem ABI 391-DNA-Synthesegerät synthetisiert. Der
Vorwärts-Primer
(5'CTCAAAGGAGAGTTATCCATGGATATTCGTCC3') (SEQ ID NO: 1)
wurde entworfen, um eine NcoI-Restriktionsstelle am Startcodon des
groES-Gens einzuführen.
Der Rückwärts-Primer
(5'CAGACATTTCTGCCCGGGGGTTTGTTTATTTC3') (SEQ ID NO: 2)
wurde entworfen, um ungefähr
23 Basen vom groEL-Translations-Terminationscodon zu liegen, das
eine natürliche
SmaI-Stelle enthält.
Die DNA von Escherichia coli XG44 wurde in einer 50 μl-Reaktion
amplifiziert, die Standard-PCR-Puffer enthielt. Die Reaktionen wurden
auf dem GeneAmpRPCR-System 2400 DNA Thermocycler
(Perkin-Elmer) DNA-Thermal-Zyklus unter Verwendung von 0,25 ml Mikroröhrchen durchgeführt. Die
PCR-Bedingungen bestanden aus dem anfänglichen Denaturierungsschritt
bei 95°C
für 4 Minuten,
gefolgt von 32 Zyklen von Denaturierung bei 95°C für 45 Sekunden, Primeranlagerung
bei 58°C
für 1 Minute
und Primer-Verlängerung
bei 72°C
für 3 Minuten. Nach
der letzten Verlängerung
der Zyklusschritte wurde eine endgültige Verlängerung bei 72°C für 20 Minuten durchgeführt, bevor
die Reaktion bei 4°C
gelagert wurde. Die resultierenden PCR-Produkte wurden mit den Restriktionsenzymen
NcoI und SmaI gespalten und auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt.
Das gewünschte 2,0
kb DNA-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert
und mit Ethanol präzipitiert.
Die gereinigte DNA wurde für
anschließendes
clonieren verwendet.
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PCR-Amplifikation des Penicillin G-Amidasegens
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Das
Penicillin G-Amidasegen wurde aus genomischer E. coli XG44-DNA durch
PCR unter Verwendung des spezifischen Vorwärtsprimers
(CAGAGGATATCATGAAAAAT) (SEQ ID NO: 3),
der eine BspHI Restriktionsstelle einführt, und des Rückwärtsprimers
(ACCAGGATCCAACATCACAATACCTG) (SEQ
ID NO: 4), der eine BamHI-Restriktionsstelle
einführt,
amplifiziert. Die PCR-Bedingungen bestanden aus dem anfänglichen
Denaturierungsschritt bei 95°C
für 2 Minuten, gefolgt
von 33 Zyklen der Denaturierung bei 94°C für 1 Minute, Primer-Anlagerung
bei 55°C
für 1 Minute
und Primer-Verlängerung
bei 72°C
für 2 Minuten.
Nach der letzten Verlängerung
der Zyklusschritte wurde eine letzte Verlängerung bei 72°C für 5 Minuten
durchgeführt,
bevor die Reaktion bei 4°C
gelagert wurde.
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Induktion von bakteriellen Kulturen für die Expression
von heterologen Genen
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Die
Zellen, welche die rekombinanten Gene beherbergen, wurden über Nacht
in der Anwesenheit von 30 μg/ml
an Neomycinsulfat in T-Brühe
gezüchtet.
Am nächsten
Tag wurden die Kulturen 1:10 mit T-Brühe verdünnt, das mit geeignetem Antibiotikum
ergänzt
war. Die Zellen wurden bei 30°C
in einem sich drehenden Inkubator für 4 Stunden und/oder bis zur
optischen Dichte von 2,0 bei 600 nm gezüchtet; zu dieser Zeit wurde die
geeignete Konzentration von Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zur Kultur
hinzugefügt.
Die Kulturen wurden weiterhin in der Anwesenheit von IPTG bei 30°C für weitere
4 Stunden gezüchtet.
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Test von Glutarylcephalosporin-Amidase
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Der
Nachweis von Glutarylcephalosporin-Amidase (GCA) basierte auf der
Umwandlung von Glutaryl-7-aminoadipylcephalosporansäure (Glutaryl-7ADCA)
zu 7-Aminoadipylcephalosporansäure (7-ADCA).
Die Zellen, welche die Glutarylcephalosporin-Amidase exprimieren,
wurden durch Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets wurden in
Wasser resuspendiert und die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen.
Zelluläre
Trümmer
wurden durch Zentrifugation entfernt und der geklärte Überstand
wurde für
Tests verwendet. Der geklärte Überstand,
verdünnt
auf die geeignete Konzentration bei einem Volumen von 250 μl, wurde
zu einem gleichen Volumen an vorgewärmten 20 mg/ml Glutaryl-7-ADCA
in 0,3 M Tris-Puffer, pH-Wert 8,0 hinzugefügt. Die Reaktionsgemische wurden
in einem sich drehenden Inkubator bei 37°C bei 330 UpM für 30 Minuten
inkubiert. Die Reaktion wurde durch das Hinzufügen von 4 ml 25 ml H2SO4 gestoppt. Die
Reaktionsgemische wurden durch Zentrifugation geklärt und 5 μl der Probe
wurden in eine 5 Mikron-Phenosphere C18-Säule
injiziert und die Produkte mit 95% 60 mM Ammoniumacetat und 5% Acetonitril
eluiert.
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Test von Penicillin G-Amidaseaktivität
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Die
Zellen, welche die Penicillin G-Amidase exprimieren, wurden durch
Zentrifugation geerntet und die Zellpellets wurden in Wasser resuspendiert.
Die Zellen wurden durch Ultraschall aufgebrochen und die Zelllysate
auf Penicillin G-Amidaseaktivität untersucht.
1 ml des entsprechend verdünnten Überstands
wurde zu 1 ml vorgewärmtem
4,5% Kalium-Penicillin-G hinzugefügt, das in 200 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH-Wert 7,5, erzeugt war. Die Reaktionsgemische wurden in einem
sich drehenden Inkubator bei 37°C
für 15
Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von
1 ml 99,0% CH3CN und 1,0% HOAC gestoppt,
gemischt und durch Zentrifugation geklärt. 1 ml des Reaktionsgemisches
wurde mit 0,33 ml p-Dimethylaminobenzaldehyd (PDAB)-Reagens gemischt:
ein Teil 1% PDAB in Methanol plus 6 Teile Natriumacetatpuffer (1000 ml
Eisessig, 475 ml deionisiertes Wasser und 25 ml 1 N Natriumhydroxid).
Nach der Inkubation für
4 Minuten bei Raumtemperatur wird die Absorption bei 415 nm gemessen,
von welcher die molare Konversion berechnet wird.
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Konstruktion von pBMS1000
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Plasmid
pBM11M5 wurde mit PvuI und ClaI gespalten. Der 3'-Überhang
und 5'-Überhang
wurden durch Behandlung mit T4-Polymerase bzw. Klenow-Fragment entfernt.
Das 4,4 kb-Fragment wurde elektroeluiert und ligiert. Das daraus
resultierende Plasmid, bezeichnet als pBM11M5 (Cla/Pvu), wurde einer
teilweisen HindIII-Spaltung unterzogen. Das linearisierte Fragment
wurde elektroeluiert, der 5'-Überhang mit dem Klenow-Fragment
aufgefüllt
und ligiert. Restriktionsanalysen wurden durchgeführt, um
das Plasmid auszuwählen, bei
dem die HindIII-Stelle an der richtigen Position eliminiert war.
Das daraus resultierende Plasmid, bezeichnet als pBM11M5(Cla/Pvu/H3),
wurde mit HindIII und BamHI gespalten. Das 3,35 kb-Fragment wurde eluiert und
an den 90 bp-tac-Promotor ligiert, der durch die Spaltung von Plasmid
pDR540 mit HindIII und BamHI erhalten wurde. Das resultierende Plasmid,
bezeichnet als pBM11tac, wurde mit EcoRI und HindIII gespalten, wobei
sich ein 2,9 kb-Fragment ergab, das an das 1,3 kb-lac
IQ-Fragment
ligiert wurde, das durch die Spaltung von pUC19lac
IQ mit
EcoRI und HindIII erhalten wurde. Um das Clonieren von heterologen
Genen zu erleichtern, wurde eine NcoI-Clonierungsstelle gleich nach
der BamHI-Stelle des tac-Promotors durch Insertion des Adapters
in die BamHI-Stelle von Plasmid
pBM11taclac eingeführt.
Das daraus resultierende 4,2 kb-Plasmid wurde pBMS1000 genannt.
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Konstruktion von pBMS1000GroESL
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Plasmid
pBMS1000 wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und SmaI gespalten.
Das resultierende 4,2 kb-Fragment wurde in das groELS-Gen ligiert,
das über
PCR-Amplifikationen erhalten wurde und mit NcoI und SmaI wie vorstehend
beschrieben, gespalten wurde. Das resultierende 6,2 kb-Plasmid wurde
als pBMS1000GroESL bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS1999GCA
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Plasmid
pBM11taclacλN203GCA
ist ein Fusions-Expressionsplasmid, das aus pBMS1000 stammt und
DNA enthält,
welche die ersten 33 Aminosäuren
des Phagen-λ-N-Proteins
codiert, verbunden mit dem Aminoterminus des 203 Glutarylceph-Amidasegens
(203GCA). Der λ-N-Protein-Fusionsteil
kann durch Spaltung mit NcoI (5'-Ende)
und BspH1 (3'-Ende)
entfernt werden. Plasmid pBM11taclacλN203GCA wurde mit BspHI gespalten
und der 5'-Überhang
mit dem Klenow-Fragment aufgefüllt,
gefolgt durch Spaltung mit NcoI. Das 6,1 kb-Fragment wurde elektroeluiert
und an das 403 Basenpaar-Fragment ligiert, welches die komplette
Gensequenz für
das groES-Gen und die ersten 7 Aminosäuren des groEL-Gens enthielt. Das
GCA-Protein ist daher ein Fusionsprodukt des groEL-Gens. Dieses
Fragment wurde durch Spaltung von Plasmid pBM11taclacGroESL mit
den Restriktionsenzymen NcoI und RsaI erzeugt, gefolgt durch Elektroelution.
Das daraus resultierende 6,5 kb Plasmid wurde als pBMS1999GCA bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS2000GCA und pET9dGCA
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Plasmid
pBMS1999 wurde mit MfeI und BspHI gespalten. Das 6,43 kb-Fragment wurde aus
dem Gel durch Elektroelution gereinigt und an den folgenden synthetischen
Adapter ligiert:
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Das
daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2000GCA bezeichnet. Dieses
Plasmid weist das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen
dem groES- und groEL-Gen, gefolgt von der Sequenz, welche das 203
Glutarylceph-Amidasegen codiert, auf.
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Plasmid
pET9d (bezogen von Novogen) wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI
und BamHI gespalten. Die linearisierte 4,3 kb-Plasmid-DNA wurde
aus dem Agarosegel durch Elektroelution gereinigt und an das 2 kb
Glutarylcephalosporin-Amidasegen
ligiert, das durch Spaltung von einem Plasmid, welches das GCA203-Gen, enthielt, mit
BspHI und BamHI, erhalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde
als pET9dGCA bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS2000
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Plasmid
pBMS2000 stammte aus Plasmid pBMS2000GCA. Plasmid pBMS2000GCA wurde
mit den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten, um das GCA-Gen
zu entfernen. Das daraus resultierende 4,53 kb-Fragment wurde an
das folgende Oligomer ligiert:
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Das
daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2000 bezeichnet. Dieses
Plasmid enthält
das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und
groEL und die BspHI- und BamHI-Restriktionsstellen für die Genclonierung.
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Konstruktion von pBMS2001
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Plasmid
pBMS2001 stammte aus Plasmid pBMS2000. Plasmid BMS2000 wurde mit
den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten. Das daraus resultierende
4,53 kb-Fragment wurde dann in das folgende Oligomer ligiert:
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Das
daraus resultierende Plasmid wurde als pBMS2001 bezeichnet. Dieses
Plasmid enthält
das intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und
groEL, gefolgt von den Restriktionsstellen NcoI und BamHI für die Genclonierung.
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Konstruktion von pBMS2002
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Plasmid
pBMS2002 stammte aus Plasmid pBMS2000. Plasmid BMS2000 wurde mit
den Restriktionsenzymen MfeI und BamHI gespalten. Das daraus resultierende
4,53 kb-Fragment wurde an das folgende Oligomer ligiert:
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Das
daraus resultierende 4,6 kb-Plasmid wurde als pBMS2002 bezeichnet.
Dieses Plasmid enthält das
intakte groES-Gen, die intergenische Region zwischen groES und groEL,
gefolgt von den Restriktionsstellen NcoI und BamHI für die Genclonierung.
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Konstruktion von pBMS2000.103
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Plasmid
pBMS2000.103 stammte aus Plasmid pBMS2000. Ihm fehlt die Sequenz,
die das groES-Gen codiert, aber es behält die intergenischen Sequenzen
zwischen den groES/geoEL-Genen bei. Plasmid pBMS2000 wurde mit den
Restriktionsenzymen HindIII und BspHI gespalten. Dieser Prozess
entfernt den tac-Promotor,
den lac-Operator, das groES-Gen und die intergenische groES/groEL-Region. Das daraus
resultierende 4,12 kb-Fragment wurde an ein chemisch synthetisiertes
Oligomer ligiert, das die Sequenzen des tac-Promotors, des lac-Operators und der
intergenischen groES/groEL-Region enthält.
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Das
daraus resultierende Plasmid wird als pBMS2000.103 bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS2000.75
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Plasmid
pBMS2000.75 ist ähnlich
dem Plasmid pBMS2000.103. Es enthält nur partielle intergenische groES/groEL-Sequenzen
anstatt der gesamten intergenischen Sequenzen, wie in Plasmid pBMS2000.103. Plasmid
pBMS2000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und BspHI gespalten.
Dieser Prozess entfernt den tac-Promotor, das groES-Gen und die
intergenische groES/groEL-Region.
Das daraus resultierende 4,1 kb-Fragment wurde an ein chemisch synthetisiertes
Oligomer ligiert, das die Sequenzen des tac-Promotors, des lac-Operators und der
intergenischen groES/groEL-Region enthält.
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Das
daraus resultierende 4,2 kb-Plasmid wird als pBMS2000.75 bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS2000H
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Plasmid
pBMS1000 wurde mit den Restriktionsenzymen HindIII und NcoI gespalten.
Das 4,1 kb-Fragment wurde isoliert, elektroeluiert und an das folgende
Oligomer ligiert
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Das
daraus resultierende, als pBMS2000H bezeichnete Plasmid enthält den tac-Promotor,
gefolgt von den intergenischen Abstandssequenzen zwischen dem groES-
und groEL-Gen. Es enthält
keine Operatorsequenzen und ermöglicht
so, dass jedes heterologe Gen, das in diesem Vektor cloniert wird,
konstitutiv exprimiert werden kann.
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Konstruktion von pBMS1000PGA, pET9d und
pBMS2000PGA
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Das
resultierende PCR-Produkt aus der Amplifikation des PGA-Gens wurde
mit den Restriktionsenzymen BspHI und BamHI gespalten und zwischen
die NcoI- und BamHI-Stellen
von pBMS1000, die NcoI- und BamHI-Stellen von pET9d (bezogen von
Novogen) und die BspHI- und BamHI-Stellen von pBMS2000 cloniert; dies
resultierte in pBMS1000PGA, pET9dPGA bzw. pBMS2000PGA.
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Konstruktion von pBMS2000HGCA
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Plasmid
pBMS2000H wurde mit den Restriktionsenzymen NcoI und BamHI gespalten.
Das 4,2 kb-Fragment wurde durch Elektroelution isoliert und an das
2 kb-Glutaryl-cephalosporin-Amidasegen
ligiert, das durch Spaltung eines Plasmids, welches das GCA203-Gen
enthielt, mit BspHI und BamHI erhalten wurde. Das daraus resultierende
6,2 kb-Plasmid wurde als pBMS2000GCA bezeichnet.
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Konstruktion von pBMS2000.103GCA und pBMS2000.75GCA
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Plasmid
pBMS2000.103 und pBMS2000.75 wurden mit den Restriktionsenzymen
BspHI und BamHI gespalten. Das 4,2 kb-Fragment wurde elektroeluiert
und in das 2 kb-Glutarylcephalosporin-Amidasegen ligiert, das durch
Spaltung eines Plasmids, welches das GCA203-Gen enthielt, mit BspHI
und BamHI erhalten wurde. Das daraus resultierende 6,2 kb-Plasmid
wurde als pBMS2000.103GCA und pBMS2000.75GCA bezeichnet. Tabelle
II Expression
von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Plasmiden
Plasmid
IE/ml | |
pBMS1000INGCA203 | 1,7 |
pET9GCA203 | 6,7 |
pBMS2000GCA203 | 8,4 |
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Übernacht-Kulturen
von E. coli, die GCA203 beherbergen, wurden 1:10 in T-Brühe verdünnt, die
mit 30 μg/ml
an Neomycinsulfat ergänzt
war. Die Kulturen wurden bei 30°C
bei 300 UpM für
4 Stunden gezüchtet, oder
bis OD
550 = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt wurden
60 μM IPTG
zu den Kulturen hinzugefügt,
um die Expression von GCA zu induzieren. Tabelle
III Expression
von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Plasmiden
in Fermentationstanks
Plasmid
IE/ml | |
| Gefäßgröße | |
| 2
l | 4000
l |
pBMS1000GCA | 54 | 20 |
pET9GCAGCA | 120 | 50 |
pBMS2000GCA | 280 | 150 |
Tabelle
IV Expression
von Fusions- und nativem GCA in Schüttelflaschen und 1 Liter-Fermentoren.
Titer des
Plasmids in der Schüttelflasche | |
| IE/ml | 1
Litertiter IE/ml |
pBMS1999GCA | 5,2 | 100 |
pBMS2000GCA | 8,4 | 220 |
Tabelle
V Vergleich
der Penicillin G-Amidase-Expression in pBMS2000 mit dem pET-Vektor
Plasmid
IE/ml | |
pET9PGA | 1,0 |
pBMS2000PGA | 3,3 |
-
Übernacht-Kulturen
von E. coli, welche die Penicillin G-Amidase beherbergen, wurden
in T-Brühe
1:10 verdünnt,
die mit 30 μg/ml
Neomycinsulfat ergänzt
war. Die Kulturen wurden bei 30°C
bei 300 UpM für
4 Stunden gezüchtet,
oder bis OD
550 = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt
wurden 60 μM
IPTG zu den Kulturen hinzugefügt, um
die Expression von Penicillin G-Amidase zu induzieren. Tabelle
VI Expression
von Glutarylcephalosporin-Amidase 203 in verschiedenen Derivaten
des Plasmids pBMS2000
Plasmid | IE/ml |
pBMS2000GCA | 11 |
pBMS2000.103GCA | 9 |
pBMS2000HGCA | 11 |
-
Übernacht-Kulturen
von E. coli, die GCA203 beherbergen, wurden 1:10 in T-Brühe verdünnt, die
mit 30 μg/ml
Neomycinsulfat ergänzt
war. Die Kulturen wurden bei 30°C
bei 300 UpM für
4 Stunden gezüchtet, oder
bis OD
550 = 2,0. Zu diesem Zeitpunkt wurden
60 μM IPTG
zu den Kulturen hinzugefügt,
um die Expression von GCA zu induzieren. SEQUENZPROTOKOLL