DE69838613T2

DE69838613T2 - Gene, welche den phytat-metabolismus kontrollieren und daraus entstehende anwendungen

Info

Publication number: DE69838613T2
Application number: DE69838613T
Authority: DE
Inventors: Susan J. Ankeny MARTINO-CATT; Hongyu Urbandale WANG; Larry R. Des Moines BEACH; Benjamin A. Des Moines BOWEN; Xun San Diego WANG
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1997-07-22
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2008-08-07
Anticipated expiration: 2018-07-18
Also published as: BR9810807A; TR200000209T2; AU8487598A; CA2296051A1; EP0990040A1; AR012511A1; DE69838613D1; EP0990040B1; ES2296337T3; AU745464B2; WO1999005298A1; ATE376592T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Tierernährung. Spezifisch bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Identifizierung und Verwendung von Genen, die für verschiedene Enzyme kodieren, welche im Metabolismus von Phytat in Pflanzen involviert sind, und auf die Verwendung dieser Gene und von Mutanten davon, um in Nahrungsmitteln und Futtermitteln die Phytatkonzentrationen zu verringern und/oder die Konzentrationen an Nicht-Phytat-Phosphor zu erhöhen.
Hintergrund der Erfindung
Die Rolle von Phosphor in der Tierernährung ist gut anerkannt. Achtzig Prozent des Phosphors im Körper von Tieren wird im Skelett, das dem Tier die Struktur bereitstellt, gefunden. Zwanzig Prozent des Phosphors in Tieren kann in Weichteilen gefunden werden, wo es eine Bestandteilsverbindung ist und daher in einer großen Reihe von biochemischen Reaktionen involviert ist. Zum Beispiel ist Phosphor für die Synthese und Aktivität von DNA, RNA, Phospholipiden und einigen B-Vitaminen erforderlich.
Obgleich Phosphor für gesunde Tiere essentiell ist, ist auch anerkannt, dass nicht der gesamte Phosphor in Futter bioverfügbar ist. Phytinsäuresalze (d. h. Phytate) sind die Hauptspeicherform von Phosphor in Pflanzen. Siehe z. B. „Chemistry and Application of Phytic Acid: an Overview", Phytic Acid: Chemistry and Application; Graf, Hrsg.; Pilatus Press: Minneapolis, MN, S. 1–21; (1986). Phytate sind die Hauptform von Phosphor in Samen, wobei sie typischerweise 50% bis 80% des Samen-Gesamtphosphors ausmachen.
In Mais und Sojabohnen macht Phytat etwa 60% bis 80% des gesamten Phosphors aus. Wenn Nahrung auf Samenbasis von Nicht-Wiederkäuern verzehrt wird, bildet die verzehrte Phytinsäure mit mehreren nutritional wichtigen Mineralstoffen im Intestinaltrakt Salze. Eine Ausscheidung dieser Salze reduziert die Retention und Nutzung, d. h. die Bioverfügbarkeit des Phosphor- und Mineralstoffgehalts der Nahrung. Folglich kann dies zu Mineralmangel sowohl bei Menschen als auch bei Tieren, die die oben genannten Samen als Nahrung verwenden, führen. Siehe z. B. McCance, et al., Biochem. J., 29: 4269 (1935); Edman, Cereal Chem., 58: 21 (1981).
Phytat, eine wichtige Phosphorquelle, wird von monogastrischen Tieren nicht metabolisiert. Phytinsäure wird in der Tat als anti-nutritionaler Faktor angesehen, da sie die Bioverfügbarkeit von Proteinen und Mineralstoffen durch Chelatbildung reduziert; siehe z. B. Cheryan, „Phytic Acid Interactions in Food Systems", CRC Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 13: 297–335 (1980).
Phytat verursacht nicht einfach eine Verringerung bei der Nährstoffverfügbarkeit. Der Phytat-gebundene Phosphor in Tierabfall trägt zur Oberflächen- und Grundwasserverschmutzung bei. Siehe z. B. Jongbloed, et al., Nether. J. Ag. Sci. 38: 567 (1990).
Da der Phytatgehalt von Samen einen Einfluss auf Nahrungs-, Phosphor- und Mineralstoffretention und auf die Umgebung hat, wurden mehrere Ansätze vorgeschlagen, um diesen negativen Einfluss zu reduzieren. Ansätze umfassen die Entfernung von Nahrungsmittelphytat durch Intervention nach der Ernte und genetische Reduzierung des Samenphytatgehalts.
Verfahren zur Nahrungsmittelprozessierung nach der Ernte, die Phytinsäure entweder physikalisch oder durch Fermentation entfernen, werden z. B. von Indumadhavi, et al., Int. J. Food Sci. Tech. 27: 221 (1992) offenbart. Das Hydrolysieren von Phytinsäure ist ein nützlicher Ansatz, um den Nährwert vieler Pflanzennahrungsmittel zu erhöhen. Phytasen, wie unten ausführlicher diskutiert wird, katalysieren die Umwandlung von Phytinsäure in Inositol und anorganisches Phosphat. Phytase-produzierende Mikroorganismen umfassen Bakterien und Hefen. Siehe z. B. Power, et al., J. Bacteriol. 151: 1102–1108 (1982); Segueilha, et al., Biotechnol. Lett. 15(4): 399–404 (1993) und Nayini, et al., Lebensm. Wiss. Technol. 17: 24–26 (1984). Die Verwendung von Phytasen, Phytinsäure-spezifischen Phosphohydrolasen, typischerweise mikrobieller Herkunft, als Nahrungsergänzungsmittel wird von Nelson, et al., J. Nutr. 101: 1289 (1971) offenbart. Alle derzeitig bekannten Nach-Ernte-Techniken involvieren zusätzliche Arbeitssschritte und Ausgaben, um die mit Phytat verbundenen Probleme zu umgehender genetische Ansatz involviert eine Entwicklung von Nutzpflanzengermplasma, das vererbbare Reduktionen bei der Samenphytinsäure besitzt. Eine vererbbare quantitative Variation bei der Samenphytinsäure wurde unter Linien mehrerer Nutzpflanzenspezies beobachtet. Siehe Raboy, in: Inositol Metabolism in Plants, Moore D. J., et al., (Herausg.) Alan R. Liss, New York, S. 52–73; (1990).
Allerdings wurde festgestellt, dass diese Variation in hohem Maße und positiv mit einer Variation bei weniger wünschenswerten Charakteristika korreliert ist; daher könnte eine Züchtung auf reduzierte Samen-Phytinsäure unter Verwendung traditioneller Züchtungsverfahren in Germplasma mit unerwünschten korrelierten Charakteristika resultieren. Bis heute gab es keine Berichte über kommerziell akzeptables Maisgermplasma mit niedrigem Phytinsäuregehalt, das durch einen solchen Ansatz produziert wurde.
Bei der genetischen Veränderung von Phytat wurde eine natürliche Variabilität für Phytat und freiem Phosphor untersucht. Siehe Raboy, V. und D. B. Dickinson, Crop Sci. 33: 1300–1305 (1993) und Raboy, V. et al., Maydica 35: 383–390 (1990). Während eine gewisse Variabilität für Phytinsäure beobachtet wurde, gab es keine entsprechende Änderung beim Nicht-Phytat-Phosphor. Außerdem wurde eine sortenabhängige Variabilität, die nur zwei Prozent der Variation darstellte, beobachtet, wohingegen 98% der Variation beim Phytat Umweltfaktoren zugeschrieben wurde.
Wie oben erwähnt wurde, haben Studien mit Sojabohnen und anderen Nutzpflanzen gezeigt, dass eine Veränderung der genetischen Expression von Phytat durch Züchtungsverfahren mit rekurrenter Selektion mit unerwünschten Resultaten korreliert sein kann. Siehe Raboy, V. D. B. Dickinson und F. E. Below, Crop Sci. 24: 431–434 (1984); Raboy, V., F. E. Below und D. B.
Dickinson; J. Hered. 80: 311–315 (1989); Raboy, V., M. M. Noaman, G. A. Taylor und S. G. Pickett: Crop. Sci. 31: 631–635; (1991).
Obgleich vorgeschlagen wurde, dass eine Blockierung bei der Phytinsäureakkumulation bei der Herstellung von Germplasma mit niedrigem Phytinsäuregehalt ohne die Einführung der unerwünschten korrelierten Reaktionen wertvoll sein könnte (Siehe Raboy, et al., Crop. Sci. 33: 1300 (1993)), zeigte die Verwendung eines solchen traditionellen Mutantenselektionsansatzes in einigen Fällen, dass sich Homozygozitie für Mutanten, die mit substantiellen Reduktionen bei der Phytinsäure assoziiert sind, auch als letal erweist.
Myoinositol wird in drei Schritten aus Glucose produziert, wobei die Enzyme Hexokinase (EC 2.7.1.1), L-Myoinositol-1-phosphat-Synthase (EC 5.5.1.4) und L-Myoinositol-1-phosphat-Phosphatase (EC 3.1.3.25) involviert sind. Der Biosyntheseweg, der zu Phytat führt ist komplex und nicht vollständig geklärt. Ohne eine Bindung an eine bestimmte Theorie der Phytatbildung eingehen zu wollen, wird angenommen, dass die Synthese durch eine Reihe von einer oder mehreren aus ADP-Phosphotransferasen, ATP-abhängigen Kinasen und Isomerasen vermittelt sein kann. Es wurde eine Reihe von Zwischenprodukten isoliert, einschließlich z. B. 2- und 3-Monophosphate, 1,3- und 2,6-Diphosphate, 1,3,5- und 2,5,6-Triphosphate, 1,3,5,6- und 2,3,5,6-Tetraphosphate und 1,2,4,5,6- und 1,2,3,4,6-Pentaphosphate. Es wurden einige unbedeutende Zyklen der Dephosphorylierung und Rephosphorylierung der P₅- und P₆-Formen beschrieben, ebenso wie ein Zyklus, der G6P → Myoinositol-1-phosphat → Myoinositol involviert; der letzte Schritt ist vollständig reversibel, was anzeigt, dass die Kontrolle des metabolischen Flusses durch diesen Weg bedeutend ist. Diese Erfindung unterscheidet sich von den voran gehenden Ansätzen dahingehend, dass sie Werkzeuge und Reagenzien bereitstellt, die es dem Fachmann durch die Anwendung von inter alia transgenen Methodologien ermöglichen, den metabolischen Fluss bezüglich des Phytinsäurewegs zu beeinflussen. Dieser Einfluss kann entweder anabolisch oder katabolisch sein, womit gemeint ist, dass der Einfluss zur Verringerung des Flusses, der aus der Biosynthese von Phytinsäure resultiert, und/oder zur Erhöhung des Abbaus (d. h. Katabolismus von Phytinsäure) wirken kann. Durch diese Erfindung wird eine Kombination beider Ansätze in Betracht gezogen.
Wie oben erwähnt wurde, kann einmal gebildetes Phytat durch Phosphohydrolasen, insbesondere 3-Phytasen, die typischerweise in Mikroorganismen gefunden werden, und 6-Phytasen, die dominante Form in Pflanzen, dephosphoryliert werden.
Nach dem anfänglichen Ereignis sind beide Enzyme fähig, Phytat sukzessive zu freiem Inositol zu dephosphorylieren.
Dementsprechend gab es auch Berichte, dass Pflanzen mit Konstrukten transformiert werden können, welche ein Gen umfassen, das für Phytase kodiert. Siehe Pen, et al., PCT-Publikation WO 91/14782 . Transgene Samen oder Pflanzengewebe, die Phytasen exprimieren, können dann als Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Allerdings wurde diese Anmeldung nicht gemacht, um Samen-Phytinsäure zu reduzieren.
Basierend auf dem Vorangehenden gibt es den Bedarf, den nutritionalen Gehalt von Pflanzen, insbesondere von Mais und Sojabohnen, zu verbessern, indem Nicht-Phytat-Phosphor erhöht wird und Samenphytat verringert wird, und zwar ohne andere offensichtliche oder substantielle nachteilige Wirkungen.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, Pflanzen, insbesondere transgenen Mais, bereitzustellen, die erhöhte Konzentrationen an Nicht-Phytat-Phosphor ohne die entsprechenden schädlichen Wirkungen haben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzen, insbesondere von transgenem Mais, die reduzierte Konzentrationen an Phosphor in der Form von Phytat ohne entsprechende schädliche Wirkungen haben.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von transgenen Pflanzenlinien mit dominanten, vererbbaren Phänotypen, die in Züchtungsprogrammen einsetzbar sind, die zur Produktion kommerzieller Produkte mit verbesserter Phosphorverfügbarkeit und reduziertem Phytat konzipiert sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Verbesserung der Tierleistung durch Fütterung von Tieren mit Pflanzen und Teilen davon, insbesondere mit Samen, mit erhöhtem nutritionalem Wert.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung von Pflanzensamen, insbesondere Getreidesamen bzw. Maissamen und dem resultierenden Essen, die in einer geringeren Umweltkontamination resultieren, wenn sie ausgeschieden werden, als dies derzeit verwendete Samen tun.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung leicht ersichtlich werden.
Isoliertes Polynucleotid, kodierend für ein Polypeptid mit Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität und umfassend

(a) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz SEQ ID NO: 11 umfasst oder ein Komplement davon;
(b) eine Polynucleotidsequenz mit einer Nucleinsäuresequenz, amplifiziert aus einer Zea-mays-Nucleinsäurebibliothek unter Verwendung der Primer von SEQ ID NOs: 12–13;
(c) ein Polynucleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 10, wobei die %-Sequenzidentität auf der gesamten kodierenden Region basiert und durch das GAP-Programm bestimmt wird, wobei Gap Creation Penalty = 50 und Gap Extension Penalty = 3; und
(d) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Fragment eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 kodiert, wobei das Fragment eine Deletion von 1 bis 10 Aminosäuren hat; oder ein Komplement von (a) oder (c).

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Polypeptide, die als neue Phytat-Biosyntheseenzyme identifiziert wurden, bereitgestellt.
Es wird ein isoliertes Polypeptid bereitgestellt, das Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität hat und eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 11 hat, wobei diese Prozent-Sequenzidentität auf der gesamten Sequenz basiert und durch das GAP-Programm bestimmt wird, wobei Gap Creation Penalty = 12 und Gap Extension Penalty = 4.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darüber hinaus darin, Polynucleotide bereitzustellen, die für Mais-Myoinositol-1-phosphat-Synthase kodieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung umfasst das Polynucleotid die Regionen, die für Myoinositol-1-phosphat-Synthase kodieren.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Polypeptide aus Zea Mays isoliert.
Gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polynucleotid bereitgestellt, das eine Sequenz einer Nucleinsäure hat, amplifiziert aus einer Zea mays-Nucleinsäurebibliothek unter Verwendung der Primer von SEQ ID NOs: 12–13.
Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für Myoinositol-1-phosphat-Synthaseenzyme, insbesondere solche aus Zea mays, kodieren, mRNAs, cDNAs, genomische DNAs und in weiteren Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung biologisch nützliche Varianten, Analoga oder Derivate davon oder Fragmente davon, einschließlich Fragmente der Varianten, Analoga und Derivate, bereitgestellt.
Weitere Ausführungsformen der Erfindung sind natürlich auftretende allelische Varianten der Nucleinsäuremoleküle in der Sequenz, vorausgesetzt sie kodieren für Myoinositol-1-phosphat-Synthase.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der Polypeptide, Polypeptidfragmente, Varianten und Derivate, Fragmenten der Varianten und Derivate und Analoga der vorstehenden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung werden Verfahren zur Herstellung der Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Polypeptide bereitgestellt, umfassend Kultivieren von Wirtszellen, die exprimierbar darin eingebaut ein Polynucleotid haben, unter Bedingungen zur Expression von Myoinositol-1-phosphat-Synthaseenzymen im Wirt und dann Gewinnen des exprimierten Polypeptids.
Gemäß einer anderen Aufgabe der Erfindung werden Produkte, Zusammensetzungen, Verfahren und Methoden, die die vorstehend genannten Polypeptide und Polynucleotide verwenden, zu Zwecken, die Forschungszwecke, biologische Zwecke und landwirtschaftliche Zwecke einschließen, bereitgestellt.
Weitere Aufgaben, Merkmale, Vorzüge und Aspekte der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der folgenden Beschreibung klar werden. Es sollte jedoch selbstverständlich sein, dass die folgende Beschreibung und die spezifischen Beispiele, obgleich sie bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschreiben, lediglich zum Zwecke der Erläuterung angeführt werden. Verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und des Umfangs der offenbarten Erfindung werden dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung und beim Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung klar werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Diese Anmeldung beansprucht gemäß 35 U.S.C. 120 die Priorität der U.S. Ser. Nrn. 60/053,371, eingereicht am 18. Juli 1997; 60/053,944, eingereicht am 28. Juli 1997; 60/055,526, eingereicht am 8. August 1997, 60/055,446 und 60/085,852, eingereicht am 18. Mai 1998.
Diese Erfindung bezieht sich zum Teil auf neu identifizierte Polynucleotide und Polypeptide; Varianten und Derivate dieser Polynucleotide und Polypeptide; Verfahren zur Herstellung dieser Polynucleotide und dieser Polypeptide und auf Varianten und Derivate und Antagonisten dieser Polypeptide und auf Verwendungen dieser Polynucleotide, Polypeptide, Varianten, Derivate und Antagonisten. In dieser Hinsicht und in anderer Hinsicht bezieht sich die Erfindung insbesondere auf Polynucleotide und Polypeptide des Phytat-Stoffwechselwegs, insbesondere bezüglich Myoinositol-1-phosphat-Synthase und Gene, die dieselbe kodieren.
Übersicht über Ausdrücke
Die folgenden veranschaulichenden Erläuterungen werden angeführt, um das Verständnis bestimmter Ausdrücke, die hierin häufig verwendet werden, insbesondere in den Beispielen, zu erleichtern. Die Erläuterungen werden aus Gründen der Zweckdienlichkeit angeführt und sind für die Erfindung nicht beschränkend.
PHYTAT-BIOSYNTHESEENZYM-BINDUNGSMOLEKÜL, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle oder Ionen, die spezifisch an Phytat-Biosyntheseenzym-Polypeptide oder -Polynucleotide der vorliegenden Erfindung binden oder mit diesen Wechselwirken, einschließlich z. B. Enzymsubstrate, Zellmembrankomponenten und klassische Rezeptoren. Die Bindung zwischen Polypeptiden der Erfindung und solchen Molekülen, einschließlich Bindungs- oder Wechselwirkungsmoleküle, kann ausschließlich für Polypeptide der Erfindung sein, was bevorzugt ist oder kann für Polypeptide der Erfindung hochspezifisch sein, was auch bevorzugt ist, oder kann für eine Gruppe von Proteinen hochspezifisch sein, welche Polypeptide der Erfindung beinhaltet, was bevorzugt ist, oder sie kann für mehrere Gruppen von Proteinen, von denen wenigstens eine ein Polypeptid der Erfindung umfasst, spezifisch sein. Bindungsmoleküle umfassen auch Antikörper und von Antikörpern abgeleitete Reagenzien, die spezifisch an Polypeptide der Erfindung binden.
GENETISCHES ELEMENT, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich im Allgemeinen auf ein Polynucleotid, das eine Region umfasst, die für ein Polypeptid kodiert, oder auf eine Polynucleotidregion, die die Replikation, Transkription oder Translation oder andere Prozesse, die für die Expression des Polypeptids in einer Wirtszelle wichtig sind, reguliert, oder ein Polynucleotid, das sowohl eine Region, die für ein Polypeptid kodiert, als auch eine Region, die funktionell damit verknüpft ist, die die Expression steuert, umfasst. Genetische Elemente können in einem Vektor enthalten sein, der als episomales Element repliziert, d. h. als ein Molekül, das physikalisch vom Wirtszellgenom unabhängig ist. Sie können innerhalb von Plasmiden enthalten sein. Genetische Elemente können auch in einem Wirtszellgenom umfasst werden, nicht in ihrem natürlichen Zustand, sondern stattdessen nach Manipulation z. B. unter anderem Isolierung, Klonierung und Einführung in eine Wirtszelle in der Form von gereinigter DNA oder in einem Vektor.
WIRTSZELLE, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist eine Zelle, die durch eine exogene Polynucleotidsequenz transformiert oder transfiziert wurde, oder zur Transformation oder Transfektion fähig ist. Exogene Polynucleotidsequenz ist so definiert, dass sie eine nicht natürlicherweise in der Zelle vorkommende Sequenz bezeichnet. Diese beinhaltet eine Transformation, um zusätzliche Kopien eines endogenen Polynucleotids einzuarbeiten.
IDENTITÄT und SIMILARITÄT, wie die Ausdrücke hierin verwendet werden und wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, sind Beziehungen zwischen zwei Polypeptidsequenzen oder zwei Polynucleotidsequenzen, wie sie durch Vergleichen der Sequenzen bestimmt werden. Auf dem Fachgebiet bedeutet Identität auch den Sequenz-Verwandtheitsgrad zwischen zwei Polypeptid- oder zwei Polynucleotidsequenzen, wie der durch Übereinstimmung zwischen zwei Strängen solcher Sequenzen bestimmt wird. Sowohl Identität als auch Similarität können in einfacher Weise errechnet werden (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Herausg. Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Herausg. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Herausg. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J. Herausg., M Stockton Press, New York, 1991). Verfahren, die üblicherweise eingesetzt werden, um Identität oder Similarität zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die, die in Carillo, H. und Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988) offenbart sind. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität sind so konzipiert, dass sie die größte Übereinstimmung zwischen den zwei untersuchten Sequenzen ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Similarität sind in Computerprogramme eingearbeitet. Typische Computerprogramm-Verfahren zur Bestimmung von Identität und Similarität zwischen zwei Sequenzen umfassen das GCG-Programm Paket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984); BLASTP, BLASTN, FASTA und TFASTA (Atschul, S. F. et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)).
Für Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung wird das Gap-Programm verwendet. Der für das Gap-Programm verwendete Algorithmus ist der von Needleman und Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443–453 [1970]). Die verwendeten Parameter sind wie folgt: für Nucleotid vergleiche ist die Gap Creation Penalty = 50, Gap Extension Penalty = 3; für Aminosäurevergleiche ist die Gap Creation Penalty = 12, die Gap Extension Penalty = 4.
ISOLIERT, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet „durch Menschenhand" aus dem natürlichen Zustand verändert, d. h. dass sie (eine Sequenz), wenn sie in der Natur auftritt, verändert wurde oder aus ihrer ursprünglichen Umgebung entfernt wurde oder beides. Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynucleotid oder Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Organismus in seinem natürlichen Zustand ist, nicht „isoliert", allerdings ist dasselbe Polynucleotid oder Polypeptid, das von den gleichzeitig vorliegenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt ist, nach dem hierin verwendeten Ausdruck „isoliert". Was z. B. Polynucleotide angeht, so bedeutet der Ausdruck isoliert, dass das Polynucleotid aus dem Chromosom und der Zelle in dem/der es natürlicherweise auftritt, abgetrennt ist. Als Teil der Isolierung oder nach der Isolierung können solche Polynucleotide an andere Polynucleotide, z. B. DNAs, für eine Mutagenese angefügt werden, um Fusionsproteine zu bilden, und beispielsweise zur Reproduktion oder Expression in einem Wirt. Die isolierten Polynucleotide können, allein oder verknüpft mit anderen Polynucleotiden, z. B. Vektoren, in Wirtszellen in Kultur oder in ganzen Organismen eingeführt werden. Eingeführt in Wirtszellen, in Kultur oder in ganze Organismen, werden solche DNAs noch isoliert sein, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, da sie nicht in ihrer natürlich vorkommenden Form oder Umgebung wären. Entsprechend können die Polynucleotide und Polypeptide in einer Zusammensetzung, z. B. Mediumformulierungen, Lösungen zur Einführung von Polynucleotiden oder Polypeptiden, z. B. in Zellen, Zusammensetzungen oder Lösungen für chemische oder enzymatische Reaktionen, die z. B. keine natürlich vorkommenden Zusammensetzungen sind, auftreten und darin isolierte Polynucleotide oder Polypeptide innerhalb der Bedeutung dieses Ausdrucks, wie er hierin verwendet wird, bleiben.
LIGATION, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Prozess der Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen zwei oder mehr Polynucleotiden, die am häufigsten doppelsträngige DNAs sind. Techniken zur Ligation sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und Protokolle zur Ligation werden in Standardlaborhandbüchern und Literaturstellen beschrieben, z. B. in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) und Maniatis et al., S. 146, die unten zitiert werden.
OLIGONUCLEOTID(E), wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich auf kurze Polynucleotide. Oft bezieht sich der Ausdruck auf einzelsträngige Desoxyribonucleotide, er kann sich aber ebenso auf einzel- oder doppelsträngige Ribonucleotide, RNA:DNA-Hybride und doppelsträngige DNAs unter anderen beziehen. Oligonucleotide, z. B. einzelsträngige DNA-Sonden-Oligonucleotide, werden oft durch chemische Verfahren, z. B. solche, die an automatisierten Oligonucleotid-Synthesizern durchgeführt werden, synthetisiert. Allerdings können Oligonucleotide durch eine Vielzahl anderer Verfahren hergestellt werden, einschließlich in vitro-DNA-Rekombination-vermittelte Techniken und durch Expression von DNAs in Zellen und Organismen. Zunächst werden chemisch synthetisierte DNAs typischerweise ohne 5'-Phosphat erhalten. Die 5'-Enden solcher Oligonucleotide sind keine Substrate für Phosphodiesterbindungsbildung durch Ligationsreaktionen, die DNA-Ligasen verwenden, die typischerweise zur Bildung von rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden. Wenn eine Ligation von solchen Oligonucleotiden erwünscht ist, kann ein Phosphat durch Standardtechniken, z. B. solche, die eine Kinase und ATP verwenden, angefügt werden. Das 3'-Ende eines chemisch synthetisierten Oligonucleotids hat im Allgemeinen eine freie Hydroxylgruppe und wird in Gegenwart einer Ligase, z. B. T4-DNA-Ligase leicht eine Phosphodiesterbindung mit einem 5'-Phosphat eines anderen Polynucleotids, z. B. eines anderen Oligonucleotids, bilden. Wie gut bekannt ist, kann diese Reaktion selektiv verhindert werden, wenn dies gewünscht ist, indem die 5'-Phosphate des anderen Polynucleotids (der anderen Polynucleotide) vor Ligation entfernt werden.
PLASMIDE, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, werden hierin im Allgemeinen mit dem kleinen Buchstaben p, der vorgestellt ist und/oder auf den Großbuchstaben und/oder Nummern folgen, nach Standardkonventionen der Namensgebung, die dem Fachmann geläufig sind, bezeichnet. Ausgangsplasmide, die hierin offenbart sind, sind entweder im Handel verfügbar, allgemein zugänglich oder können aus verfügbaren Plasmiden durch Routineanwendung gut bekannter veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Viele Plasmide und andere Klonierungs- und Expressionsvektoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind dem Fachmann gut bekannt und in einfacher Weise verfügbar. Darüber hinaus können Fachleute in einfacher Weise eine Reihe von anderen Plasmiden, die zur Verwendung in der Erfindung geeignet sind, konstruieren. Die Eigenschaften, die Konstruktion und die Verwendung solcher Plasmide sowie anderer Vektoren in der vorliegenden Erfindung werden dem Fachmann aus der vorliegenden Offenbarung klar werden.
POLYNUCLEOTID(E), wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht sich im Allgemeinen auf ein beliebiges Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. So beziehen sind Polynucleotide, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, unter anderem auf einzel- und doppelsträngige DNA, DNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen oder einzel-, doppel- und tripelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, die ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, auf Hybridmoleküle, die DNA und RNA umfassen, die einzelsträngig oder typischer doppelsträngig oder tripelsträngig, oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann. Außerdem bezieht sich Polynucleotid, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, auf Tripelstrang-Regionen, die RNA oder DNA, oder beide, RNA und DNA, umfassen. Die Stränge in solchen Regionen können aus demselben Molekül oder aus verschiedenen Molekülen gebildet sein. Die Regionen können alle aus einem oder mehreren der Moleküle umfassen, involvieren aber typischerweise nur eine Region aus einigen der Moleküle. Eines der Moleküle einer Tripelhelix-Region ist oft ein Oligonucleotid. Wie der Aus druck Polynucleotid hierin verwendet wird, umfasst er DNAs oder RNAs, wie sie oben beschrieben wurden, die eine oder mehrere modifizierte Basen enthalten. Somit sind DNAs oder RNAs mit Hauptketten, die aus Gründen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert sind, „Polynucleotide", wie der Ausdruck hierin beabsichtigt ist. Darüber hinaus sind DNAs oder RNAs, die ungewöhnliche Basen, z. B. Inosin, oder modifizierte Basen, z. B. tritylierte Basen, um gerade zwei Beispiele zu nennen, umfassen, Polynucleotide entsprechend der Verwendung des Ausdruckes hierin. Es wird anerkannt werden, dass eine große Vielzahl von Modifikationen an DNA und RNA durchgeführt wurden, die vielen den Fachmann bekannten nützlichen Zwecken dienen. Der Ausdruck Polynucleotid, wie er hierin verwendet wird, umfasst solche chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierten Formen von Polynucleotiden, wie auch die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen, einschließlich inter alia, einfache und komplexe Zellen, charakteristisch sind.
POLYPEPTIDE, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, umfasst alle Polypeptide, wie sie unten beschrieben werden. Die Grundstruktur von Polypeptiden ist gut bekannt und wurde in unzähligen Lehrbüchern und anderen Publikationen des Fachgebiets beschrieben. In diesem Kontext wird der Ausdruck hierin verwendet, um ein beliebiges Peptid oder Protein zu benennen, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die in einer linearen Kette durch Peptidbindungen aneinander gebunden sind. Der Ausdruck, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf kurze Ketten, die üblicherweise auf dem Fachgebiet auch als Peptide, Oligopeptide und Oligomere bezeichnet werden, als auch auf längere Ketten, die im Allgemeinen auf dem Fachgebiet als Proteine, von denen es viele Typen gibt, bezeichnet werden. Es wird einzusehen sein, dass Polypeptide oft andere Aminosäuren als die 20 Aminosäuren, die üblicherweise als die 20 natürlich auftretenden Aminosäuren bezeichnet werden, enthalten und dass viele Aminosäuren, einschließlich der terminalen Aminosäuren, in einem gegebenen Polypeptid entweder durch natürliche Prozesse, z. B. Prozessierung und andere post-translationale Modifikationen, aber auch durch chemische Modifikationstechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, modifiziert sein können. Selbst die üblichen Modifikationen, die natürlicherweise in Polypeptiden auftreten, sind zu zahlreich, um hier erschöpfend aufgelistet zu werden, sie sind allerdings in Basistexten und in detaillierteren Monographien sowie in der umfangreichen Forschungsliteratur gut beschrieben und sie sind dem Fachmann gut bekannt. Unter den bekannten Modifikationen, die in Polypeptiden der Erfindung vorliegen können, sind, um einige wenige typische zu nennen, Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Bindung von Flavin, kovalente Bindung einer Häm-Gruppierung, kovalente Bindung eines Nucleotids oder Nucleotidderivats, kovalente Bindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Bindung von Phosphatdiylinositol, Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung, Bildung von kovalenten Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Anker-Bildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Ra cemisierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine, z. B. Arginylierung, und Ubiquitinierung. Solche Modifikationen sind dem Fachmann gut bekannt und sind detailliert in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben. Einige besonders gängige Modifikationen, Glycosylierung, Lipidbindung, Sulfatierung, gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung z. B. sind in den meisten Grundlagentexten, z. B. in PROTEINS – STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES; 2. Ausgabe, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) beschrieben. Über dieses Thema sind viele detaillierte Übersichtsartikel verfügbar, z. B. jene, die von Wold F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS; B: C. Johnson, Herausg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992) bereitgestellt wurden. Es wird einzusehen sein, wie es auch bekannt und wie es oben angegeben wurde, dass Polypeptide nicht immer ganz linear sind. Zum Beispiel können Polypeptide als Resultat einer Ubiquitinierung verzweigt sein und sie können mit oder ohne Verzweigung ringförmig sein, im Allgemeinen als Resultat posttranslationaler Ereignisse, einschließlich eines natürlichen Prozessierungsereignisses, und Ereignisse, die aus menschlicher Manipulation resultieren, die nicht natürlich auftreten. Ringförmige, verzweigte und verzweigte ringförmige Polypeptide können durch einen nicht-translationalen natürlichen Prozess und auch durch vollständig synthetische Verfahren synthetisiert werden. Modifikationen können irgendwo in einem Polypeptid, einschließlich der Peptidhauptkette, der Aminosäureseitenketten und des Amino- oder Carboxylterminus, auftreten. In der Tat ist eine Blockierung der Amino- oder Carboxylgruppe in einem Polypeptid oder von beiden durch eine kovalente Modifikation bei natürlich vorkommenden und synthetischen Polypeptiden gängig und solche Modifikationen können auch in Polypeptiden der vorliegenden Erfindung vorliegen. Beispielsweise wird der Amino-terminale Rest von Polypeptiden, die in E. coli oder anderen Zellen hergestellt werden, vor einer proteolytischen Prozessierung fast invariabel N-Formylmethionin sein. Während einer posttranslationalen Modifikation des Peptids kann ein Methioninrest am NH₂-Terminus deletiert werden. Dementsprechend zieht diese Erfindung die Verwendung sowohl der Methionin-enthaltenden als auch der Methionin-freien Amino-terminalen Varianten des Proteins der Erfindung in Betracht. Die Modifikationen, die in einem Polypeptid auftreten, werden oft eine Funktion dessen sein, wie es hergestellt wird. Für Polypeptide, die durch Exprimieren eines klonierten Gens in einem Wirt hergestellt werden, werden die Natur und das Ausmaß der Modifikationen zum großen Teil z. B. durch die post-translationale Modifikationskapazität der Wirtszelle und die in der Polypeptidaminosäuresequenz vorliegenden Modifikationssignale bestimmt werden. Wie es z. B. gut bekannt ist, tritt eine Glycosylierung oft nicht in Bakterienwirten, wie z. B. E. coli, auf. Wenn demnach eine Glycosylierung gewünscht wird, sollte ein Polypeptid in einem glycosylierenden Wirt, im Allgemeinen in einer Eukaryotenzelle, exprimiert werden. Ähnliche Betrachtungen finden auf andere Modifikationen Anwendung. Es wird einzusehen sein, dass derselbe Modifikationstyp zu demselben Grad oder zu variierendem Grad an mehreren Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorliegen kann. Ein gegebenes Polypeptid kann auch viele Modifikationstypen enthalten. Im Allgemeinen umfasst der Ausdruck Polypeptid, wie er hierin verwendet wird, alle derartigen Modifikationen, insbesondere solche, die in Polypeptiden vorliegen, die durch Exprimieren eines Polynucleotids in einer Wirtszelle synthetisiert werden.
Der Ausdruck TRANSFORMATION, wie er hierin verwendet wird, ist das Verfahren, durch welches eine Zelle durch exogene DNA „transformiert" wird, wenn solche exogene DNA ins Innere der Zellmembran eingeführt wurde. Exogene DNA kann in chromosomale DNA, die das Genom der Zelle bildet, integriert (kovalent gebunden) werden oder nicht. In Prokaryoten und Hefen z. B. kann die exogene DNA an einem episomalen Element, z. B. einem Plasmid, gehalten werden. Was höhere eukaryotische Zellen angeht, so ist eine stabil transformierte oder transfizierte Zelle eine, in welcher die exogene DNA in das Chromosom so integriert wurde, dass sie durch Tochterzellen durch Chromosomenreplikation vererbt wird. Diese Stabilität wird durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle, Zelllinien oder Klone zu entwickeln, die aus einer Population von Tochterzellen bestehen, die die exogene DNA enthalten, bewiesen.
VARIANTE(N) von Polynucleotiden oder Polypeptiden, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, sind Polynucleotide oder Polypeptide, die sich von einem Referenz-Polynucleotid bzw. -Polypeptid unterscheiden. Varianten in diesem Sinne werden unten und an anderer Stelle in der vorliegenden Offenbarung detaillierter beschrieben. Was Polynucleotide angeht, so sind im Allgemeinen Differenzen so limitiert, dass die Nucleotidsequenzen der Referenz und der Variante insgesamt ziemlich ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Wie unten angegeben ist, können Änderungen in der Nucleotidsequenz der Variante stumm sein. D. h., sie können die Aminosäuren, die durch das Polynucleotid kodiert werden, nicht verändern. Wenn Veränderungen auf stumme Änderungen dieses Typs begrenzt sind, wird eine Variante ein Polypeptid mit derselben Aminosäuresequenz wie die Referenz kodieren. Wie auch unten angegeben ist, können Änderungen in der Nucleotidsequenz der Variante die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynucleotid kodiert wird, ändern. Solche Nucleotidänderungen können in Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und in Verkürzungen des durch die Referenzsequenz kodierten Polypeptids resultieren, wie es unten diskutiert werden wird. Was Polypeptide im Allgemeinen angeht, sind Differenzen so limitiert, dass die Sequenzen der Referenz und der Variante insgesamt ziemlich ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Ein variantes Polypeptid und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen, Fusionen und Verkürzungen, die in beliebiger Kombination vorliegen können, unterscheiden.
Der Ausdruck GERMPLASMA, wie er hierin verwendet wird, bedeutet einen Satz von genetischen Einheiten, die in einem herkömmlichen Züchtungsprogramm unter Entwicklung neuer Pflanzenvarietäten verwendet werden können.
Der Ausdruck TRANSGEN MIT HOHEM PHOSPHORGEHALT, wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Einheit, die als Resultat einer rekombinanten genetischen Manipulation Samen mit einer vererbbaren Verringerung beim prozentualen Gehalt an Phytinsäure und/oder Erhöhung des prozentualen Gehalts an Nicht-Phytat-Phosphor produziert.
PHYTINSÄURE, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet Myoinositol-Tetraphosphorsäure, Myoinositol-Pentaphosphorsäure und Myoinositol-Hexaphosphorsäure. Als Salz mit Kationen ist Phytinsäure „Phytat".
NICHT-PHYTAT-PHOSPHOR, wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bedeutet Gesamtphosphor minus Phytatphosphor.
NICHT-WIEDERKÄUER-TIER bedeutet ein Tier mit einem einfachen Magen, aufgeteilt in die Ösophagus-, Kardia-, Fundus- und Pylorus-Regionen. Ein Nicht-Wiederkäuer-Tier umfasst außerdem eine Tierspezies ohne einen funktionellen Pansen. Ein Pansen ist ein Abschnitt des Verdauungssystems, in dem Futtermittel/Nahrung eingeweicht wird und einem Verdau durch Mikroorganismen unterworfen wird, bevor es/sie durch den Verdauungstrakt geht. Dieses Phänomen tritt bei einem Nicht-Wiederkäuer-Tier nicht auf. Der Ausdruck Nicht-Wiederkäuer-Tier umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Menschen, Schweine, Geflügel, Katzen und Hunde.
Wie oben angegeben wurde, bezieht sich die vorliegende Erfindung unter anderem auf neue Phytinsäure-Stoffwechselpolypeptide und Polynucleotide, die dieselben kodieren, wie es detaillierter unten beschrieben wird. Polypeptide, die für die Praxis dieser Erfindung besonders nützlich sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, D-Myoinositol-3-phosphat-Synthase, Myoinositol-1-phosphat-Synthase (auch als INO1 bezeichnet), Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-Kinase, Signal -transduzierende Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase (SIP-110), Myoinositol-monophosphatase-3, Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5/6-Kinase, 1D-Myoinositoltrisphosphat-3-Kinase B, Myoinositolmonophosphatase-1, Inositolpolyphosphat-5-Phosphatase, 1D-Myoinositoltrisphosphat-3-Kinase, Phosphatidylinositol-3-Kinase, Phosphatidylinositol-4-Kinase, Phosphatidylinositolsynthase, Phosphatidylinositol-Transferprotein, Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-5-Phosphatase, Myoinositol-Transporter, Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C und Maisphytase.
Die Nucleinsäuren und Fragmente davon, die für die oben genannten Enzyme kodieren, sind einsetzbar, um Enzym-defiziente Transgene zu erzeugen. Zum Beispiel kann ein einzelnes Gen oder Genfragment (oder Kombinationen von verschiedenen Genen) in eine geeignete Expressionskassette eingebaut werden (unter Verwendung z. B. des Globulin-1-Promotors für eine Embryo-bevorzugte Expression oder des nativen Promotors, assoziiiert mit dem für das Enzym kodierenden Gen) und zusammen mit einem geeigneten selektierbaren Marker (z. B. des Herbizid-PAT) so in Mais transformiert werden, dass die Expression der endogenen Gene verstummt.
Relevante Literatur, die die Anwendung von Homologie-abhängigen Gen-Silencing beschreibt, umfasst: Jorgensen, Trends Biotechnol 8 (12): 340–344 (1990), Flavell, Proc. Nat'l.
Acad. Sci. (USA) 91: 3490–3496 (1994); Finnegan et al., Bio/Technology 12: 883–888 (1994); Neuhuber et al., Mol. Gen. Genet. 244: 230–241 (1994). Alternativ kann ein anderer Ansatz zum Gen-Silencing der unter Verwendung der Antisense-Technik sein (Rothstein et al. in Osf. Surv. Plant Mol. Cell. Biol. 6: 221–246 (1989)).
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf Polypeptide und Polynucleotide von neuen Phytat-Biosyntheseenzymgenen. Die Erfindung bezieht sich speziell auf Zea mays-Phytat-Biosyntheseenzyme, die die Nucleotid- bzw. Aminosäuresequenzen, die unten angegeben sind, haben.
Polynucleotide
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung werden isolierte Polynucleotide bereitgestellt, die für die Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, die die unten angegebene abgeleitete Aminosäuresequenz haben.
Unter Verwendung der hierin bereitgestellten Information, z. B. die unten angegebenen Polynucleotidsequenzen, kann ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, das für Phytat-Biosyntheseenzympolypeptide kodiert, unter Verwendung von Standard-Klonierungs- und Screening-Verfahren erhalten werden. Um das Polynucleotid, das für das Protein kodiert, unter Verwendung der unten angegebenen DNA-Sequenzen zu erhalten, können Oligonucleotidprimer synthetisiert werden, die komplementär zu der bekannten Polynucleotidsequenz sind. Diese Primer können dann in einer PCR eingesetzt werden, um das Polynucleotid aus einer Matrize zu amplifizieren, welche von mRNA oder genomischer DNA, isoliert aus Pflanzenmaterial, stammt. Die resultierenden amplifizierten Produkte können dann in im Handel erhältliche Klonierungsvektoren, z. B. die TA-Reihe von Vektoren von InVitrogen, kloniert werden. Durch Sequenzieren der einzelnen so identifizierten Klone mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Sequenz entwickelt wurden, ist es dann möglich, die Sequenz in beide Richtungen auszudehnen, um die Vollgensequenz zu bestimmen. Eine derartige Sequenzierung wird unter Verwendung von denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, welche aus einem Plasmidklon hergestellt wurde. Geeignete Techniken sind in Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrock, J. in MOLECULAR CLONING, A Laboratory Manual (2. Aufl. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory. Siehe Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70) beschrieben. Abs veranschaulichend für die Erfindung wurden die unten angegebenen Polynucleotide aus einer cDNA-Bibliothek zusammengefügt, welche z. B. aus keimenden Maissamen stammt.
Myoinositol-1-phosphat-Synthase der vorliegenden Erfindung ist strukturell mit anderen Proteinen der Myoinositol-1-phosphat-Synthasefamilie verwandt, wie es durch Vergleichen der vorliegenden Sequenz, die Myoinositol-1-phosphat-Synthase kodiert, mit in der Literatur angegebenen Sequenzen gezeigt wird. Eine bevorzugte DNA-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes Leseraster, das für ein Protein von etwa 510 Aminosäureresten mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 59,7 kDa (berechnet als die Anzahl der Aminosäurereste X 117) kodiert. Das Protein weist größte Homologie zu Myoinositol-1-phosphat-Synthase auf. Die vorliegende Myoinositol-1-phosphat-Synthase hat etwa 88% Identität und etwa 92% Similarität mit der Aminosäuresequenz von Myoinositol-1-phosphat-Synthase aus Mesembryantherium cristallium und 78,7% Identität auf dem Nucleinsäurelevel (diese Prozentangaben basieren aus einem Vergleich lediglich der kodierenden Sequenz voller Länge, d. h. ATG bis Stoppkodon).
Myoinositolmonophosphatase-3 ist strukturell mit anderen Proteinen der Myoinositolmonophosphatase-3-Familie verwandt, die durch Vergleichen der vorliegenden Sequenz, die für Myoinositolmonophosphatase-3 kodiert, mit der in der Literatur angegebenen Sequenz gezeigt wird. Eine DNA-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes Leseraster, das für ein Protein mit etwa 267 Aminosäureresten mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 31,2 kDa (berechnet als die Anzahl der Aminosäurereste X 117) kodiert. Eine neue Myoinositolmonophosphatase-3, die durch Homologie zwischen der unten angegebenen Aminosäuresequenz und bekannten Aminosäuresequenzen von anderen Proteinen, z. B. Myoinositolmonophosphatase-3 aus Lycopersicum esulentum, identifiziert wurde, hatte 76,1% Identität/81,1% Similarität auf dem Aminosäurelevel und 67,9% Identität auf dem Nucleinsäurelevel (diese Prozentangaben basieren auf einem Vergleich nur der kodierenden Sequenz voller Länge, d. h. ATG bis Stoppkodon).
Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase ist strukturell mit anderen Proteinen der Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinasefamilie verwandt, die durch einen Vergleich der Sequenz, die für die vorliegende Inositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase kodiert, mit der in der Literatur angegebenen Sequenz gezeigt wird. Unten ist eine DNA-Sequenz gezeigt. Sie enthält ein offenes Leseraster, das für ein Protein mit etwa 353 Aminosäureresten mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 41,3 kDA kodiert (berechnet als die Anzahl von Aminosäureresten X 117). Das Protein weist größte Homologie zu Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase aus Homo sapiens auf. Die unten angegebene Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase hat etwa 34% Identität und etwa 43,4% Similarität mit der Aminosäuresequenz von Myoinositol-1,3,4-trisphosphat-5/6-Kinase aus Homo sapiens. (Die oben offenbarten Prozentangaben basieren auf einem Vergleich lediglich der kodierenden Sequenz voller Länge, d. h. ATG bis Stoppkodon).
Eine Phosphatidylinositol-3-Kinase-Sequenz ist unten angegeben. Sie enthält ein offenes Leseraster, das für ein Protein mit etwa 803 Aminosäureresten mit einem abgeleiteten Molekulargewicht von etwa 94,1 kDa (berechnet als die Anzahl an Aminosäureresten X 117) kodiert. Das Protein weist größte Homologie zu Phosphatidylinositol-3-Kinase aus Glycine max. auf. Homologie zwischen Aminosäuresequenzen, die in den folgenden Sequenzen angegeben sind und bekannten Aminosäuresequenzen von anderen Proteinen, z. B. Phosphatidylinositol-3-Kinase aus Glycine max. ist 78% Identität/84% Similarität auf dem Aminosäurelevel und 73% Identität auf dem Nucleinsäurelevel (diese Prozentangaben basieren auf einem Vergleich lediglich der kodierenden Sequenz voller Länge, d. h. ATG bis Stoppkodon), basierend auf dem unten definierten Gap-Programm.
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können in Form von RNA, z. B. mRNA, oder in Form von DNA, einschließlich z. B. cDNA und genomischer DNA, erhalten durch Klonierung oder produziert durch chemische Synthesetechniken oder durch eine Kombination davon, sein. Die DNA kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein. Einzelsträngige DNA kann der kodierende Strang sein, auch bekannt als der Sense-Strang, oder kann der nicht-kodierende Strang, auch als der Antisense-Strang bezeichnet, sein.
Die kodierende Sequenz, die das Polypeptid kodiert, kann identisch zu der kodierenden Sequenz der unten gezeigten Polynucleotide sein. Sie kann auch ein Polynucleotid mit einer unterschiedlichen Sequenz sein, das als Resultat der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes die unten gezeigten Polypeptide kodiert. Wie unten noch ausgiebiger diskutiert werden wird, sind diese alternativen kodierenden Sequenzen eine wichtige Quelle für Sequenzen zur Kodonoptimierung.
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung, die für die unten aufgelisteten Polypeptide kodieren, können umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: die kodierende Sequenz für das reife Polypeptid selbst; die kodierende Sequenz für das reife Polypeptid und zusätzliche kodierende Sequenzen, z. B. solche, die für eine Leader- oder sekretorische Sequenz, z. B. eine Pre- oder Pro- oder Prepro-Proteinsequenz, kodieren; die kodierende Sequenz des reifen Polypeptids mit oder ohne die vorstehend genannten zusätzlichen kodierenden Sequenzen zusammen mit zusätzlichen nicht-kodierenden Sequenzen, einschließlich z. B., aber nicht beschränkt auf, nicht-kodierende 5'- und 3'-Sequenzen, z. B. die transkribierten, nicht-translatierten Sequenzen, die bei der Transkription (einschließlich Terminierungssignale zum Beispiel), Ribosomenbindung eine Rolle spielen, mRNA-Stabilitätselemente und zusätzliche kodierende Sequenzen, die zusätzliche Aminosäure kodieren, z. B. solche, die zusätzliche Funktionalitäten bereitstellen.
Die DNA kann auch Promotorregionen umfassen, die die Funktion haben, die Transkription der mRNA, welche Phytat-Biosyntheseenzyme der Erfindung kodiert, zu steuern. Solche Promotoren können unabhängig nützlich sein, um die Transkription von heterologen Genen in rekombinanten Expressionssystemen zu steuern. Heterolog ist als eine Sequenz definiert, die nicht natürlicherweise mit der Promotorsequenz auftritt. Während die Nucleotidsequenz für die Promotorsequenz heterolog ist, kann sie für den Pflanzenwirt homolog oder nativ oder heterolog oder fremd sein.
Darüber hinaus kann das Polypeptid an eine Markersequenz, z. B. ein Peptid, fusioniert sein, welches eine Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid, z. B. das tag, das in dem pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) und der pET-Reihe von Vektoren (Novagen), unter anderen, von denen viele im Handel erhältlich sind, bereitgestellt wird. Wie bei Gentz et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 86: 821–824 (1989) zum Beispiel beschrieben wird, sorgt Hexahistidin für eine zweckdienliche Reinigung des Fusionsproteins. Das Ha-tag kann auch verwendet werden, um Fusionsproteine zu erzeugen, und entspricht einem Epitop, das vom Influen za-Hämagglutininprotein abgeleitet ist, das zum Beispiel in Wilson et al., Cell 37: 767 (1984) beschrieben wurde.
Nach dem Vorstehenden umfasst der Ausdruck „Polynucleotid, das für ein Polypeptid kodiert", wie er hierin verwendet wird, Polynucleotide, welche eine Sequenz, die für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, insbesondere einer Pflanze und in ganz besonderer Weise für Zea mays-Phytat-Biosyntheseenzyme mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz, kodiert. Der Ausdruck umfasst Polynucleotide, umfassend eine einzelne kontinuierliche Region oder diskontinuierliche Regionen, die für das Polypeptid kodieren, (z. B. unterbrochen durch integrierte Phagen- oder Insertionssequenz oder Editing) zusammen mit zusätzlichen Regionen, die auch kodierende und/oder nicht-kodierende Sequenzen enthalten können.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Varianten der vorliegenden Polynucleotide, die für Fragmente, Analoga und Derivate der Polypeptide mit der unten angegebenen abgeleiteten Aminosäuresequenz kodieren. Eine Variante des Polynucleotids kann eine natürlich vorkommende Variante, z. B. eine natürlich vorkommende allelische Variante, sein oder kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, dass sie natürlich vorkommt. Solche nicht-natürlich vorkommenden Varianten des Polynucleotids können durch Mutagenesetechniken einschließlich solcher, die auf Polynucleotide, Zellen oder Organismen angewendet werden, hergestellt werden.
Unter Varianten sind in dieser Hinsicht Varianten, die sich von den vorstehend genannten Polynucleotiden durch Nucleotidsubstitutionen, -deletionen oder -additionen unterscheiden. Die Substitutionen können ein Nucleotid oder mehrere Nucleotide involvieren. Die Varianten können in kodierenden oder nicht-kodierenden Regionen oder beiden verändert sein. Veränderungen in den kodierenden Regionen können konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -additionen produzieren.
Unter den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind in dieser Hinsicht Polynucleotide, die für Polypeptide mit den unten angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren, Varianten, Analoga, Derivate und Fragmente davon.
Bevorzugter in dieser Hinsicht sind Polynucleotide, die für Phytat-Biosyntheseenzym-Varianten, -analoga, -derivate und Fragmente und Varianten, Analoga und Derivate der Fragmente kodieren, die die unten angebenen Aminosäuresequenzen haben, in denen mehrere, wenige, 1 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, deletiert oder addiert sind, und zwar in beliebiger Kombination. Besonders bevorzugt unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die die Eigenschaften und Aktivitäten der Phytat-Biosyntheseenzyme nicht verändern. Diesbezüglich besonders bevorzugt sind konservative Substitutionen. Am stärksten bevorzugte sind Polynucleotide, die für Polypeptide mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz kodieren, und zwar ohne Substitutionen.
Weiter bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynucleotide, die zu wenigstens 90% identisch zu einem Polynucleotid sind, das für Myoinositol-1-phosphat-Synthase- polypeptid mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz kodiert, und Polynucleotide, die zu solchen Polynucleotiden komplementär sind. Unter diesen besonders bevorzugten Polynucleotiden sind solche mit wenigstens 95%, 98% oder wenigstens 99% besonders bevorzugt.
Darüber hinaus sind besonders bevorzugte Ausführungsformen diesbezüglich Polynucleotide, welche für Polypeptide kodieren, die im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid, das durch die unten angegebenen Polynucleotide kodiert wird, beibehalten oder sogar eine Verringerung bei der biologischen Funktion oder Aktivität aufweisen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Polynucleotide, die an die oben beschriebenen Sequenzen hybridisieren. Diesbezüglich bezieht sich die vorliegende Erfindung speziell auf Polynucleotide, die unter stringenten Bedingungen an die hier oben beschriebenen Polynucleotide hybridisieren. Der Ausdruck „stringente Bedingungen", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine Hybridisierung nur auftreten wird, wenn es mindestens 95% und vorzugsweise mindestens 97% Identität zwischen den Sequenzen gibt.
Die Ausdrücke „stringente Bedingungen" oder „stringente Hybridisierungsbedingungen" umfassen eine Bezugnahme auf Bedingungen, unter denen eine Sonde zu einem detektierbar größeren Grad als andere Sequenzen (z. B. wenigstens 2fach über dem Hintergrund) an ihre Targetsequenz hybridisieren wird. Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter verschiedenen Umständen unterschiedlich sein. Indem die Stringenz der Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen kontrolliert wird, können Targetsequenzen identifiziert werden, die zu 100% komplementär zu der Sonde sind (homologous probing). Alternativ können Stringenzbedingungen so eingestellt werden, dass sie eine gewisse Fehlpaarung in den Sequenzen zulassen, so dass niedrigere Similaritätsgrade detektiert werden (heterologous probing). Im Allgemeinen hat eine Sonde eine Länge von weniger als etwa 1000 Nucleotiden, vorzugsweise weniger als 500 Nucleotiden.
Typischerweise werden stringente Bedingungen solche sein, in denen die Salzkonzentration kleiner als etwa 1,5 M Na-Ionen, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ionenkonzentration (oder Konzentration anderer Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens etwa 30°C für kurze Sonden (z. B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden (z. B. größer als 50 Nucleotide) ist. Stringente Bedingungen können auch mit Zusatz von Destabilisierungsmitteln, z. B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen Hybridisierung unter Verwendung einer Pufferlösung mit 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und einen Waschschritt in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen moderater Stringenz umfassen Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,5 × bis 1 × SSC bei 55 bis 60°C. Beispiele für Bedingungen hoher Stringenz umfassen Hybridisierung in 50% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschschritt in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C.
Spezifität ist typischerweise die Funktion von Nach-Hybridisierungs-Waschschritten, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und die Temperatur der Endwaschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl genähert werden:
Anal. Biochem., 138: 267–284 (1984): T_m = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) – 0,61 (%Form) – 500/L, worin M die Molarität von einwertigen Kationen ist, %GC der prozentuale Anteil von Guanosin- und Cytosin-Nucleotiden in der DNA ist, %Form der Prozentwert an Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. T_m ist die Temperatur (bei definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Targetsequenz an eine perfekt passende Sonde hybridisieren. T_m wird um etwa 1°C für jedes 1% Fehlpaarung reduziert; so können T_m Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen so eingestellt werden, dass eine Hybridisierung an Sequenzen der gewünschten Identität erfolgt. Wenn z. B. Sequenzen mit ≥ 90% Identität gesucht werden, kann die T_m 10°C gesenkt werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und bei definiertem pH sind. Allerdings können stark stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) nutzen; Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder einen Waschschritt 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) verwenden. Unter Verwendung der Gleichung, Hybridisierungs- und Waschzusammensetzungen und der gewünschten T_m wird der Fachmann verstehen, dass Variationen bei der Stringenz der Hybridisierung und/oder Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Wenn der gewünschte Grad der Fehlpaarung in einer T_m von kleiner als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration zu erhöhen, so dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine ausgiebige Anleitung für die Hybridisierung von Nucleinsäuren wird in Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil 1, Kapitel 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); und Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2, Ausubel, et al., Herausg., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) gefunden.
Wie außerdem hierin bezüglich Polynucleotidassays der Erfindung diskutiert wurde, können z. B. Polynucleotide der Erfindung, wie sie oben diskutiert wurden, als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um Volllängen cDNAs und genomische Klone, die Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, zu isolieren und um cDNA und genomische Klone von anderen Genen, die hohe Sequenzsimilarität zu den Genen haben, zu isolieren. Solche Sonden werden im Allgemeinen wenigstens 15 Basen umfassen. Vorzugsweise werden solche Sonden wenigstens 30 Basen haben und können wenigstens 50 Basen haben. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 30 Basen haben und werden 50 Basen oder weniger haben.
Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung können als Forschungsreagenzien und Materialien zur Entdeckung von transgenen Maispflanzen mit hohem Phosphorgehalt verwendet werden. Die Polynucleotide der Erfindung sind Oligonucleotide, die sich von den unten angegebenen Sequenzen ableiten, die als PCR-Primer in dem hierin beschriebenen Verfahren zur Bestimmung, ob die hierin identifizierten Gene ganz oder teilweise in Phytinsäure-akkumulierendem Gewebe transkribiert werden oder nicht, verwendet werden.
Die Polynucleotide können für ein Polypeptid, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale Aminosäuren oder Aminosäuren im Inneren des reifen Polypeptids (z. B. wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat) ist, kodieren. Solche Sequenzen können unter anderem eine Rolle beim Prozessieren eines Proteins von einem Vorläufer bis zu einer reifen Form spielen, können den Proteintransport ermöglichen, können die Proteinhalbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können eine Manipulation eines Proteins für einen Assay oder für eine Produktion erleichtern. Die zusätzlichen Aminosäuren können durch celluläre Enzyme aus dem reifen Protein prozessiert werden, wie es im Allgemeinen in vivo der Fall ist.
Ein Vorläuferprotein, das die reife Form des Polypeptids an eine Prosequenz oder mehrere Prosequenzen fusioniert hat, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer im Allgemeinen aktiviert. Einige der Prosequenzen oder alle Prosequenzen können vor Aktivierung entfernt werden. Im Allgemeinen werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusammengefasst, ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann für ein reifes Protein, ein reifes Protein plus eine Leadersequenz (was als Preprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer Prosequenz oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leadersequenzen eines Preproteins sind, oder ein Preprotein, welches ein Vorläufer für ein Proprotein ist, das eine Leadersequenz und eine oder mehrere Prosequenzen hat, die im Allgemeinen während Prozessierungsschritten entfernt werden, welche aktive und reife Formen des Polypeptids produzieren, kodieren.
Polypeptide
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Polypeptide, die die unten angegebenen abgeleiteten Aminosäuresequenzen haben.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Fragmente, Analoga und Derivate dieser Polypeptide. Die Ausdrücke „Fragment", „Derivat" und „Analogon" bedeuten, wenn sie sich auf die Polypeptide beziehen, ein Polypeptid, das im Wesentlichen dieselbe biologische Funktion oder Aktivität wie ein solches Polypeptid beibehält. Fragmente, Derivate und Analoga, die wenigstens 90% der Aktivität der nativen Phytat-Biosyntheseenzyme beibehalten, sind bevorzugt. Fragmente, Derivate und Analoga, die wenigstens 95% der Aktivität der nativen Polypeptide beibehalten, sind bevorzugt. Somit umfasst ein Analogon ein Proprotein, das durch Abspaltung des Proproteinteils unter Produktion eines aktiven reifen Polypeptids aktiviert werden kann.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinantes Polypeptid, ein natürliches Polypeptid oder ein synthetisches Polypeptid sein. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist es ein rekombinantes Polypeptid.
Das Fragment, Derivat oder Analogon der Polypeptide unten kann sein: (i) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem konservierten oder nicht-konservierten Aminosäurerest (vorzugsweise einem konservierten Aminosäurerest) ersetzt ist/sind und ein solcher ersetzter Aminosäurerest kann durch den genetischen Code kodiert sein oder nicht, oder (ii) eines, in dem einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfasst/umfassen oder (iii) einer, in dem das reife Polypeptid mit einer anderen Verbindung verbunden ist, z. B. einer Verbindung zur Erhöhung der Halbwertszeit des Polypeptids (z. B. Polyethylenglykol) oder (iv) eines, in dem die zusätzlichen Aminosäuren mit dem reifen Polypeptid fusioniert sind, z. B. eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die zur Reinigung des reifen Polypeptids verwendet wird, oder eine Proproteinsequenz. Es wird davon ausgegangen, dass solche Fragmente, Derivate und Analoga von einem Fachmann nach den Lehren hierin erhalten werden können.
Nach den besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung in dieser Hinsicht sind Polypeptide, die die Aminosäuresequenz von Phytat-Biosyntheseenzymen haben, die unten angegeben ist, Varianten, Analoga, Derivate und Fragmente davon sowie Varianten, Analoga und Derivate der Fragmente.
Unter bevorzugten Varianten sind solche, die sich von einer Referenz durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden. Derartige Substitutionen sind solche, die eine gegebene Aminosäure in einem Polypeptid durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen Charakteristika ersetzen. Als konservative Substitutionen bzw. Austausche werden Austausche untereinander unter den aliphatischen Aminosäuren Ala, Val, Leu und Ile angesehen. Ein gegenseitiger Austausch der Hydroxylreste Ser und Thr, der Austausch der sauren Reste Asp und Glu, ein Austausch zwischen den Amidresten Asn und Gln, ein Austausch der basischen Reste Lys und Arg und Austausch unter den aromatischen Resten Phe, Tyr.
In dieser Hinsicht sind außerdem Varianten, Analoga, Derivate und Fragmente sowie Varianten, Analoga und Derivate der Fragmente besonders bevorzugt, die die unten angegebene Aminosäuresequenz haben, in denen mehrere, wenige, 1 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste ersetzt, deletiert oder addiert sind, und zwar in beliebiger Kombination. Unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen speziell bevorzugt, welche die Eigenschaften und Aktivitäten der Phytat-Biosyntheseenzyme nicht verändern. Besonders bevorzugt in dieser Hinsicht sind konservative Substitutionen. Am stärksten bevorzugt sind Polypeptide mit den unten angegebenen Aminosäuresequenzen ohne Substitutionen bzw. Austausche.
Die Polypeptide und Polynucleotide der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise in einer isolierten Form bereitgestellt und sind vorzugsweise bis zur Homogenität gereinigt.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen Myoinositol-1-phosphat-Synthasepolypeptid (insbesondere das reife Polypeptid), wie auch Polypeptide, die eine größere als 95%ige Identität (98% Similarität) zu dem Polypeptid haben, wie es oben bei Needleman und Wunsch beschrieben wird, und die bevorzugter wenigstens 98% haben und auch Teile von solchen Polypeptiden umfassen, bei denen ein solcher Teil des Polypeptids im Allgemeinen wenigstens 30 Aminosäuren und bevorzugter wenigstens 50 Aminosäuren enthält.
Vektoren, Wirtszellen, Expression
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Vektoren, die die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, auf Wirtszellen, die die Vektoren der Erfindung einarbeiten, und auf die Produktion von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken bzw. Rekombinationstechniken.
Wirtszellen können genetisch manipuliert werden, so dass sie die Polynucleotide einarbeiten und Polypeptide der vorliegenden Erfindung exprimieren. Beispielsweise können die Polynucleotide unter Verwendung gut bekannter Techniken der Infektion, Transduktion und Transfektion, Transvektion und Transformation in Wirtszellen eingeführt werden. Die Polynucleotide können allein oder mit anderen Polynucleotiden eingeführt werden. Solche anderen Polynucleotide können unabhängig eingeführt werden, co-eingeführt oder verbunden mit den Polynucleotiden der Erfindung eingeführt werden.
So können z. B. Polynucleotide der Erfindung mit einem anderen, getrennten Polynucleotid, das für einen selektierbaren Marker kodiert, unter Verwendung von Standardtechniken für Co-Transfektion und Selektion in zum Beispiel Pflanzenzellen in Wirtszellen transfiziert werden. In diesem Fall werden die Polynucleotide im Allgemeinen stabil in das Wirtszellgenom eingebaut werden.
Alternativ können die Polynucleotide an einen Vektor, der einen selektierbaren Marker enthält, zur Vermehrung in einer Wirtszelle gebunden werden. Das Vektorkonstrukt kann auch durch die vorstehend erwähnten Techniken in Wirtszellen eingeführt werden. Im Allgemeinen wird ein Plasmidvektor als DNA in einem Präzipitat, z. B. ein Calciumphosphatpräzipitat, oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid eingeführt. Eine Elektroporation kann auch verwendet werden, um Polynucleotide in einen Wirt einzuführen. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann es in vitro gepackt werden oder kann in eine Verpackungszelle eingeführt werden und das verpackte Virus kann in Zellen transduziert werden. Es ist eine weite Vielzahl von Techniken, die zur Herstellung von Polynucleotiden und zur Einführung von Polynucleotiden in Zellen entsprechend diesem Aspekt der Erfindung geeignet sind, gut bekannt und für einen Fachmann Routine. Solche Techniken sind in Sambrook et al., oben zitiert, das für viele Laborhandbücher, die diese Techniken detailliert darstellen, beispielhaft ist, ausführlich als Übersicht dargestellt.
Vektoren
Nach diesem Aspekt der Erfindung kann der Vektor z. B. ein Plasmidvektor, ein einzelsträngiger oder doppelsträngiger Phagenvektor, ein einzelsträngiger oder doppelsträngiger RNA- oder DNA-Virusvektor sein. Solche Vektoren können als Polynucleotide, vorzugsweise DNA, durch gut bekannte Techniken zur Einführung von DNA und RNA in Zellen eingeführt werden. Die Vektoren können im Fall von Phagenvektoren und viralen Vektoren als verpacktes oder eingekapseltes Virus durch gut bekannte Techniken zur Infektion und Transduktion in Zellen eingeführt werden und vorzugsweise wird dies durchgeführt. Virale Vektoren können Replikations-kompetent oder Replikations-defektiv sein. In dem letztgenannten Fall wird im Allgemeinen eine virale Vermehrung nur in komplementierenden Wirtszellen erfolgen.
In bestimmter Hinsicht sind unter Vektoren die zur Expression von Polynucleotiden und Polypeptiden der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Im Allgemeinen umfassen solche Vektoren cis-wirkende Kontrollregionen, die zur Expression in einem Wirt wirksam sind, funktionell mit dem zu exprimierenden Polynucleotid verknüpft. Geeignete trans-wirkende Faktoren werden entweder durch den Wirt geliefert, durch einen komplementierenden Vektor geliefert oder durch den Vektor selbst nach Einführung in den Wirt geliefert.
In bestimmten diesbezüglich bevorzugten Ausführungsformen sorgen die Vektoren für eine bevorzugte Expression. Eine solche bevorzugte Expression kann eine induzierbare Expression oder eine Expression vornehmlich in bestimmten Zelltypen oder beides, induzierbar und Zell-bevorzugt, sein. Unter induzierbaren Vektoren sind Vektoren, die zur Expression durch Umweltfaktoren, die leicht zu manipulieren sind, z. B. Temperatur und Nährstoffadditive, induziert werden können, besonders bevorzugt. Eine Vielzahl von Vektoren, die nach diesem Aspekt der Erfindung geeignet sind, einschließlich konstitutiver und induzierbarer Expressionsvektoren zur Verwendung in prokaryotischen und eukaryotischen Wirten, sind gut bekannt und werden routinemäßig vom Fachmann verwendet. Solche Vektoren umfassen unter anderen chromosomale, episomale und von Virus abgeleitete Vektoren, z. B. Vektoren, die von bakteriellen Plasmiden, Bakteriophagen, Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, z. B. Baculoviren, Papova-Viren, z. B. SV40, Vaccinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabis-Virus und Retroviren, abgeleitet sind und Viren, die von Kombinationen davon abgeleitet sind, z. B. solche die von Plasmid und Bakteriophagen-genetischen Elementen, z. B. Cosmiden und Phagemiden, abgeleitet sind, und binäre Elemente, die für Agrobacterium-vermittelte Transformationen eingesetzt werden. Alle können zur Expression gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Im Allgemeinen kann ein beliebiger Vektor, der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression von Polynucleotiden geeignet ist, zur Expression eines Polypeptids in einem Wirt zur Expression in dieser Hinsicht eingesetzt werden.
Die folgenden Vektoren, die im Handel verfügbar sind, werden als Beispiele angeführt. Unter Vektoren, die zur Verwendung in Bakterien bevorzugt sind, sind pQE70, pQE60 und pQE-9, erhältlich von Qiagen; pBS-Vektoren, Phagescript-Vektoren, Bluescript-Vektoren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, verfügbar von Stratagene; und ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5, erhältlich von Pharmacia. Unter bevorzugten eukaryotischen Vektoren sind pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG, erhältlich von Stratagene; und pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL, erhältlich von Pharmacia. Verwendbare binäre Pflanzenvektoren umfassen BIN19 und seine Derivate, erhältlich von Clontech. Diese Vektoren werden lediglich zur Erläuterung der vielen im Handel verfügbaren und gut bekannten Vektoren, die dem Fachmann zur Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung zur Verfügung stehen, aufgelistet. Es wird einzusehen sein, dass jedes andere Plasmid oder jeder andere Vektor, das/der z. B. zur Einführung, Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression eines Polynucleotids oder Polypeptids der Erfindung in einem Wirt geeignet ist, nach diesem Aspekt der Erfindung eingesetzt werden kann.
Im Allgemeinen werden Expressionskonstrukte Stellen zur Transkriptionsinitiation und -termination und in der transkribierten Region einer Ribosomenbindungsstelle zur Translation enthalten. Der kodierende Teil der reifen Transkripte, die durch die Konstrukte exprimiert werden, wird ein die Translation initiierendes AUG am Beginn und ein Terminationskodon, das geeigneterweise am Ende des Polypeptids, das translatiert werden soll, positioniert ist, umfassen.
Außerdem können die Konstrukte Kontrollregionen enthalten, die eine Expression regulieren wie auch hervorrufen. In Übereinstimmung mit vielen allgemein praktizierten Verfahren werden solche Regionen im Allgemeinen wirken, indem sie die Transkription steuern, z. B. unter anderen Transkriptionsfaktoren, Repressorbindungsstellen und Terminierung. Zur Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extracelluläre Umgebung können geeignete Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingebaut werden. Diese Signale können für das Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
Im Allgemeinen werden rekombinante Expressionsvektoren Replikationsursprünge, einen Promotor, der von einem hoch exprimierten Gen abgeleitet ist, um die Transkription einer stromabwärts gelegenen Struktursequenz zu steuern, und einen selektierbaren Marker, um eine Isolierung von Vektor-enthaltenden Zellen nach Exposition gegenüber dem Vektor zu erlauben, umfassen.
Die Transkription der DNA, die für die Polypeptide der vorliegenden Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten kann erhöht werden, indem eine Enhancersequenz in den Vektor insertiert wird. Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp, die zur Erhöhung der transkriptionalen Aktivität eines Promotors in einem gegebenen Wirtszelltyp wirken. Beispiele für Enhancer umfassen den SV40-Enhancer, der an der späten Seite des Replikationsursprungs bei bp 100 bis 270 lokalisiert ist, den Enhancer des Cytomegalovirusearly-Promotors, den Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und die Adenovirus-Enhancer. Weitere Enhancer, die in der Erfindung einsetzbar sind, um die Transkription des eingeführten DNA-Segments zu erhöhen, umfassen inter alia virale Enhancer wie die innerhalb des 35S-Promotors, wie bei Odell et al., Plant Mol. Biol. 10: 263–72 (1988) beschrieben, und einen Enhancer aus einem Opingen, wie von Fromm et al., Plant Cell 1: 977 (1989) beschrieben.
Unter den bekannten eukaryotischen Promotoren, die in dieser Hinsicht geeignet sind, sind der CMV-immediate-early-Promotor, der HSV-Thymidinkinase-Promotor, die frühen und späten SV40-Promotoren, die Promotoren von retroviralen LTRs, z. B. die des Rous-Sarkoma-Virus („RSV"), Metallothionein-Promotoren, z. B. der Maus-Metallothionein-I-Promotor, und verschiedene Pflanzenpromotoren, z. B. Globulin-1. Wenn verfügbar, können die nativen Promotoren der Phytat-Biosyntheseenzymgene verwendet werden.
Wie oben erwähnt wurde, ist die DNA-Sequenz im Expressionsvektor funktionell mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz bzw. mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen, einschließlich z. B. einem Promotor zur Steuerung der mRNA-Transkription, verknüpft. Typische Beispiele für prokaryotische Promotoren umfassen den Phage lambda PL-Promotor, die E. coli lac-, trp- und tac-Promotoren, um nur wenige der gut bekannten Promotoren zu nennen.
Was Pflanzen angeht, so umfassen Beispiele für samenspezifische Promotoren Promotoren von Samenspeicherproteinen, welche diese Proteine in hoch regulierter Weise in Samen exprimieren (Thompsen et al., BioEssays; 10: 108; (1989), z. B. für dicotyledone Pflanzen, Bohnen-β-phaseolin-Promotor, einen Napin-Promotor, einen β-Conglycinin-Promotor und einen Sojabohnenlecithin-Promotor. Z. B. für monocotyledone Pflanzen umfassen Promotoren, die in der Durchführung der Erfindung nützlich sind, allerdings ohne Beschränkung darauf, einen Mais-15-kD-Zein-Promotor, einen 22 kD-Zein-Promotor, einen γ-Zein-Promotor, einen Wachspromotor, einen Shrunken-1-Promotor, einen Globulin-1-Promotor und den Shrunken-2-Promotor. Dem Fachmann sind jedoch noch andere Promotoren, die bei der Durchführung der Erfindung einsetzbar sind, bekannt.
Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Promotor für die kleine Untereinheit von Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylase, Promotoren aus tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens, z. B. die Nopalinsynthase- und Octopinsynthase-Promotoren und virale Promotoren, z. B. die Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-19S- und -35S-Promotoren oder der Braunwurz-Mosaikvirus-35S-Promotor.
Es wird einzusehen sein, dass zahlreiche nicht erwähnte Promotoren zur Verwendung gemäß diesem Aspekt der Erfindung geeignet sind und gut bekannt sind und von einem Fachmann in einer Weise, die durch die Diskussion und die Beispiele hierin veranschaulicht ist, verwendet werden können. Beispielsweise zieht diese Erfindung die Verwendung der nativen Phytat-Biosyntheseenzym-Promotoren in Betracht, um die Expression des Enzyms in einer rekombinanten Umgebung zu steuern.
Vektoren zur Vermehrung und Expression werden im Allgemeinen selektierbare Marker umfassen. Solche Marker können auch zur Amplifikation geeignet sein oder die Vektoren können zusätzliche Marker zu diesem Zweck enthalten. In dieser Hinsicht enthalten die Expressionsvektoren vorzugsweise ein oder mehrere selektierbare Markergene, um ein phänotypisches Merkmal zur Selektion von transformierten Wirtszellen bereitzustellen. Bevorzugte Marker umfassen Dihydrofolatreduktase oder Neomycinresistenz für eukaryotische Zellkultur und Tetracyclin- oder Ampicillinresistenzgene zum Kultivieren von E. coli und anderen Prokaryoten. Kanamycin- und Herbizid-Resistenzgene (PAT und BAR) sind in Pflanzensystemen allgemein verwendbar.
Selektierbare Markergene in physikalischer Proximität zu dem eingeführten DNA-Segment werden verwendet, um eine Gewinnung von transformierten Zellen entweder durch positive genetische Selektion oder Screening zu gewinnen. Die selektierbaren Markergene erlauben auch die Aufrechterhaltung von Selektionsdruck auf eine transgene Pflanzenpopulation, um sicherzustellen, dass das eingeführte DNA-Segment und seine kontrollierenden Promotoren und Enhancer durch die transgene Pflanze beibehalten werden.
Viele der üblicherweise verwendeten positiven selektierbaren Markergene zur Pflanzentransformation wurden aus Bakterien isoliert und kodieren für Enzyme, die ein selektives chemisches Agens, welches ein Antibiotikum oder ein Herbizid sein kann, metabolisch detoxifizieren. Andere positive Selektionsmarkergene kodieren für ein verändertes Target, das gegenüber dem Inhibitor unempfindlich ist.
Ein bevorzugtes Selektionsmarkergen zur Pflanzentransformation ist das BAR- oder PAT-Gen, das mit dem Selektionsmittel Bialaphos verwendet wird. Spencer et al., T. Thero. Appl'd Genetics 79, 625–631, (1990). Ein anderes nützliches Selektionsmarkergen ist das Neomycinphosphotransferase II (nptll)-Gen, isoliert aus Tn5, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, wenn es unter die Kontrolle von Pflanzenregulationssignalen gestellt wird. Fraley et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 80: 4803 (1983). Das Hygromycinphosphotransferasegen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht, ist ein weiteres Beispiel für einen verwendbaren selektierbaren Marker. Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5: 299 (1985). Zusätzliche positive selektierbare Markergene bakterieller Herkunft, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen, umfassen die Gene für Gentamycinacetyltransferase, Streptomycinphosphotransferase, Aminoglycosid-3'-adenyltransferase und die Bleomycinresistenzdeterminante. Hayford et al., Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab et al., Plant Mol. Biol. 14: 197 (1990); Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171 (1986).
Andere positive selektierbare Markergene zur Pflanzentransformation sind nicht bakterieller Herkunft. Diese Gene umfassen Mausdihydrofolatreduktase, Pflanzen-5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatsynthase und Pflanzenacetolactatsynthase Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Shah et al., Science 233: 478 (1986); Charest et al., Plant Cell Rep. 8: 643 (1990).
Eine weitere Klasse von verwendbaren Markergenen zur Pflanzentransformation mit der DNA-Sequenz erfordert ein Screening von vermutlich transformierten Pflanzenzellen anstelle einer direkten genetischen Selektion von transformierten Zellen auf Resistenz gegenüber einer toxischen Substanz, z. B. einem Antibiotikum. Diese Gene sind besonders nützlich, um das räumliche Expressionsmuster der DNA-Sequenz in spezifischen Geweben quantitativ zu bestimmen oder sichtbar zu machen und werden häufig als Reportergene bezeichnet, da sie zur Untersuchung der Genexpression an ein Gen oder eine Genregulatorsequenz fusioniert werden können. Üblicherweise verwendete Gene mm Screening von vermutlich transformierten Zellen umfassen das Gen für β-Glucuronidase (GUS), β-Galactosidase, Luciferase und Chloramphenicolacetyltransferase. Jefferson, Plant Mol. Biol. Rep. 5: 387 (1987); Teeri et al., EMBO J. 8: 343 (1989); Koncz et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 84: 131 (1987); De Block et al., EMBO J. 3: 1681 (1984). Ein anderer Ansatz für die Identifizierung von relativ seltenen Transformationsevents war die Verwendung eines Gens, das für einen dominanten konstitutiven Regulator des Zea mays-Anthocyanin-Pigmentierungswegs kodiert (Ludwig et al., Science 247: 449 (1990)).
Die geeignete DNA-Sequenz kann durch eine beliebige einer Vielzahl gut bekannter und Routinetechniken in den Vektor insertiert werden. Im Allgemeinen wird eine DNA-Sequenz zur Expression an einen Expressionsvektor gebunden, indem die DNA-Sequenz und der Expressionsvektor mit einer Restriktionsendonuclease oder mehreren Restriktionsendonucleasen gespalten werden und die Restriktionsfragmente dann unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase zusammengefügt werden. Die Sequenz kann in Vorwärts- oder Rückwärtsorientierung insertiert werden. Verfahren zur Restriktion und Ligation, die zu diesem Zweck eingesetzt werden können, sind dem Fachmann gut bekannt und für diesen Routine. In dieser Hinsicht geeignete Verfahren und Verfahren zur Konstruktion von Expressionsvektoren unter Verwendung alternativer Techniken, die dem Fachmann auch gut bekannt sind und für diesen Routine sind, sind detailliert in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ausgeführt.
Polynucleotide der Erfindung, die für die heterologe strukturelle Sequenz eines Polypeptids der Erfindung kodieren, werden im Allgemeinen unter Verwendung von Standardtechniken in den Vektor insertiert, so dass sie funktionell mit dem Promotor zur Expression verknüpft sind. Das Polynucleotid wird so positioniert werden, dass die Transkriptionsstartstelle geeigneterweise 5' zu einer Ribosomenbindungsstelle lokalisiert ist. Die Ribosomenbindungsstelle wird 5' zu dem AUG sein, das die Translation des zu exprimierenden Polypeptids initiiert. Im Allgemeinen wird es keine anderen offenen Leseraster geben, die mit einem Initiationskodon, üblicherweise AUG, beginnen und zwischen der Ribosomenbindungsstelle und dem Initiationskodon liegen. Im Allgemeinen wird es auch ein Translationsstoppkodon am Ende des Polypeptids geben und es wird ein Polyadenylierungssignal in Konstrukten zur Verwendung in eukaryotischen Zellen geben. Ein Transkriptionsterminationssignal, das geeigneterweise am 3'-Ende der transkribierten Region angeordnet ist, kann ebenfalls in dem Polynucleotidkonstrukt enthalten sein.
Der Vektor, der die geeignete DNA-Sequenz, wie sie an anderer Stelle hierin beschrieben wurde, sowie einen geeigneten Promotor und andere geeignete Kontrollsequenzen enthält, kann in einen geeigneten Wirt eingeführt werden, indem eine Vielzahl von gut bekannten Techniken, die zur Expression eines gewünschten Polypeptids darin geeignet sind, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Wirtszellen, die die oben beschriebenen diskutierten Konstrukte enthalten. Die Wirtszelle kann eine höhere Eukaryotenzelle, z. B. eine Säuger- oder Pflanzenzelle, oder eine niedere Eukaryotenzelle, z. B. eine Hefezelle, sein oder die Wirtszelle kann eine Prokaryotenzelle, z. B. eine Bakterienzelle, sein.
Die Einführung des Konstrukts in die Wirtszelle kann durch Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Mikroinjektion, kationische Lipidvermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, „Scrape Loading", ballistische Einführung, Infektion oder andere Verfahren erfolgen. Solche Verfahren sind in vielen Standard-Laborhandbüchern, z. B. in Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte umfassen Bakterienzellen, z. B. Streptococci-, Staphylococci-, E. coli, Streptomyces- und Salmonella typhimurium-Zellen; Pilzzellen, z. B. Hefezellen und Aspergillus-Zellen, Insektenzellen, z. B. Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen, z. B. CHO-, COS- und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen. Es sind Wirte für eine große Vielfalt von Expressionskonstrukten gut bekannt und der Fachmann wird nach der vorliegenden Offenbarung leicht fähig sein, einen Wirt zum Exprimieren eines Polypeptids gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung auszuwählen.
Die gentechnisch manipulierten Wirtszellen können in einem herkömmlichen Nährmedium, das in geeigneter Weise modifiziert werden kann, um inter alia Promotoren zu aktivieren, Transformanten zu selektieren oder Gene zu amplifizieren, kultiviert werden. Kulturbedingungen, z. B. Temperatur, pH und dergleichen, die vorher mit der zur Expression ausgewählten Wirtszelle verwendet wurden, werden im Allgemeinen zur Expression von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung geeignet sein, was dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein wird.
Konstrukte in Wirtszellen können in herkömmlicher Weise eingesetzt werden, um das durch die rekombinante Sequenz kodierte Genprodukt zu produzieren. Alternativ können die Polypeptide der Erfindung synthetisch durch herkömmliche Peptid-Synthesizer produziert werden.
Reife Proteine können in Säugerzellen, Hefe-, Bakterien- oder anderen Zellen unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren exprimiert werden. Zellfreie Translationssysteme können auch verwendet werden, um solche Proteine zu produzieren, wobei RNAs, die von den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung abgeleitet sind, verwendet werden.
Nach Transformation eines geeigneten Wirtsstamms und Wachstum des Wirtsstamms zu einer geeigneten Zelldichte wird, wenn der ausgewählte Promotor induzierbar ist, dieser durch geeignete Mittel (z. B. Temperaturverschiebung und Exposition gegenüber einem chemischen Inducer) induziert und die Zellen werden für einen weiteren Zeitraum kultiviert.
Zellen werden dann typischerweise durch Zentrifugation geerntet, durch physikalische oder chemische Mittel gebrochen und der resultierende Rohextrakt wird zur weiteren Reinigung zurückgehalten. Mikrobielle Zellen, die in der Expression von Proteinen verwendet werden, können durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren, einschließlich Gefrier-Auftau-Cycling, Beschallung, mechanisches Brechen oder durch Verwendung von zelllysierenden Mitteln gebrochen werden, wobei solche Verfahren dem Fachmann gut bekannt sind.
Wie oben angegeben wurde, stellt die vorliegende Erfindung Vektoren bereit, die fähig sind, Phytat-Biosyntheseenzyme unter der Kontrolle von geeigneten Promotoren zu exprimieren. Im Allgemeinen sollten die Vektoren in Pflanzenzellen funktionell sein. Gelegentlich kann es vorteilhaft sein, Vektoren zu haben, die in E. coli funktionell sind (z. B. Produktion von Protein zur Entwicklung von Antikörpern, DNA-Sequenzanalyse, Konstruktion von Inserts, Herstellung von Mengen an Nucleinsäuren und Proteinen). Vektoren und Verfahren zum Klonieren und zur Expression in E. coli werden oben diskutiert und z. B. in Sambrook et al. (supra) und in Ausubel et al. (supra).
Vektoren, die in Pflanzen funktionell sind, sind vorzugsweise binäre Plasmide, die von Agrobacterium-Plasmiden abgeleitet sind. Solche Vektoren sind fähig, Pflanzenzellen zu transformieren. Diese Vektoren enthalten linke und rechte Grenzsequenzen, die zur Integration in das Wirts(Pflanzen)-Chromosom erforderlich sind. Mindestens zwischen diesen Grenzsequenzen ist das zu exprimierende Gen unter Kontrolle eines Promotors. In bevorzugten Ausführungsformen sind auch ein selektierbarer Marker und ein Reportergen enthalten. Um einfach ausreichende Mengen an Vektor zu erhalten, ist ein bakterieller Ursprung, der die Replikation in E. coli erlaubt, bevorzugt.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen enthält der Vektor ein Reportergen und die Strukturgene dieser Erfindung. Das Reportergen sollte eine einfache Bestimmung von Transformation und Expression erlauben. Das GUS (β-Glucuronidase)-Gen ist bevorzugt ( U.S. Patent Nr. 5,268,463 ). Andere Reportergene, z. B. β-Galactosidase, Luciferase, GFP und dergleichen, sind im Kontext dieser Erfindung ebenfalls geeignet. Verfahren und Substrate zum Analysieren der Expression jedes dieser Gene sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Das Reportergen sollte unter der Kontrolle eines Promotors, der in Pflanzen funktionell ist, sein. Solche Promotoren umfassen den CaMV-35S-Promotor, den Mannopinsynthase-Promotor, den Ubiquitin-Promotor und den DNA-J-Promotor.
Der Vektor enthält vorzugsweise einen selektierbaren Marker zur Identifizierung von Transformanten. Der selektierbare Marker kann unter geeigneten Bedingungen einen Wachstumsvorteil verleihen. Im Allgemeinen sind selektierbare Marker Wirkstoffresistenzgene, z. B. Neomycinphosphotransferase. Andere Wirkstoffresistenzgene sind dem Fachmann bekannt und können leicht eingesetzt werden. Der selektierbare Marker hat einen verknüpften konstitutiven oder induzierbaren Promotor und eine Terminationssequenz, einschließlich einer Polyadenylierungssignalsequenz.
Außerdem sind in den Vektor vorzugsweise ein bakterieller Replikationsursprung und ein selektierbarer Marker für Bakterien enthalten. Von den verschiedenen Ursprüngen (z. B. coI-EI, fd-Phage) ist ein coIEI-Replikationsursprung bevorzugt. Am bevorzugtesten ist der Ursprung aus den pUC-Plasmiden, der eine hohe Kopienzahl ermöglicht.
Ein allgemeiner Vektor, der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, basiert auf pBI121 ( U.S. Patent Nr. 5,432,081 ), einem Derivat von pBIN19. Andere Vektoren wurden beschrieben ( U.S. Patent Nr. 4,536,475 ) oder können auf der Basis der hierin angegebenen Richtlinien konstruiert werden. Das Plasmid pBI121 enthält eine linke und rechte Grenzsequenz zur Integration in ein Pflanzenwirtschromosom. Diese Grenzsequenzen flankieren zwei Gene. Eines ist ein Kanamycin-Resistenzgen (Neomycinphosphotransferase), gesteuert durch einen Nopalinsynthase-Promotor und unter Verwendung einer Nopalinsynthase-Polyadenylierungsstelle. Das zweite ist das E. coli-GUS-Gen unter Kontrolle des CaMV-35S-Promotors und polyadenyliert unter Verwendung einer Nopalinsynthase-Polyadenylierungsstelle. Das Plasmid pBI121 enthält auch einen bakteriellen Replikationsursprung und einen selektierbaren Marker.
In bestimmten Ausführungsformen kann der Vektor die hierin identifizierten Strukturgene unter der Kontrolle eines Promotors enthalten. Der Promotor kann der native Promotor, assoziiert mit den Strukturgenen selbst, oder ein starker konstitutiver Promotor, z. B. der CaMV-35S-Promotor, sein. Andere Elemente, die für eine optimale Expression bevorzugt sind (z. B. Transkriptionsterminationsstelle, Enhancer, Spleißstelle) können ebenfalls enthalten sein. Die Gene können alternativ als Fusionsproteine mit z. B. einem Reportergen exprimiert werden.
Pflanzentransformationsverfahren
Wie oben diskutiert wurde, stellt die vorliegende Erfindung auch Verfahren zur Herstellung einer Pflanze, die ein fremdes Gen exprimiert, bereit, umfassend die Schritte (a) Einführen eines Vektors, wie er oben beschrieben wurde, in eine embryogene Pflanzenzelle, wobei der Vektor ein fremdes Gen in einer exprimierbaren Form enthält, und (b) Produzieren einer Pflanze aus der embryogenen Pflanzenzelle, wobei die Pflanze das fremde Gen exprimiert.
Vektoren können durch ein beliebiges von mehreren Verfahren in Pflanzenzellen eingeführt werden. Beispielsweise kann DNA als ein Plasmid durch Agrobacterium in Co-Kultivierung oder durch Beschuss eingeführt werden. Andere Transformationsverfahren umfassen Elektroporation, CaPO₄-vermittelte Transfektion und dergleichen. Vorzugsweise wird DNA zunächst in Agrobacterium transfiziert und anschließend in Pflanzenzellen eingeführt. Am bevorzugtesten wird die Transfektion durch Co-Kultivierung erreicht. Zum Teil hängt die Wahl von Transformationsverfahren von der zu transformierenden Pflanze ab.
Phytat-Biosynthesepolypeptide können aus rekombinanten Zellkulturen durch gut bekannte Verfahren, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolpräzipitation, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauschchromatographie, Phosphocellulosechromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxyapatitchromatographie und Lectinchromatographie, gewonnen und gereinigt werden. Am bevorzugtesten wird Hochleistungsflüssigkeitschromatographie („HPLC") zur Reinigung verwendet. Gut bekannte Techniken zur Proteinrückfaltung können verwendet werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der Isolierung oder Reinigung denaturiert wird.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen natürlich gereinigte Produkte, Produkte aus chemischen Syntheseverfahren und Produkte, die durch rekombinante Techniken aus einem Prokaryoten- oder Eukaryoten-Wirt produziert werden, einschließlich z. B. bakterielle, Hefe-, höhere Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellen. In Abhängigkeit von dem Wirt, der bei einem rekombinanten Produktionsverfahren verwendet wird, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glycosyliert sein oder können nicht-glycosyliert sein. Außerdem können Polypeptide der Erfindung auch einen modifizierten Anfangsmethioninrest enthalten, in einigen Fällen als Resultat von Wirt-vermittelten Prozessen.
Es ist einzusehen, dass das Gen, das das Polypeptid von Interesse exprimiert, „Kodonoptimiert" werden muss, um eine effiziente Expression eines bestimmten Wirts zu beeinflussen. So befasst sich diese Erfindung mit der Selektion der bestimmten Kodon-optimierten Sequenz für die bestimmte Wirtszelle von Interesse aus den unten angegebenen Sequenzen.
Andere Gene von Interesse können während derselben Transformationsereignisse „gestapelt” werden. Zum Beispiel können andere Gene von Interesse Resistenz gegenüber einer Krankheit, einem Schädling oder einem Herbizid verleihen oder die Futter- und Nahrungsmittelqualität der Pflanze oder des Samens verbessern, z. B. erhöhte oder veränderte Ölexpression oder veränderte Protein- oder Kohlenhydratexpression.
Regeneration von transformierten Pflanzen
Nach einer Transformation ist eine Regeneration involviert, um aus transformierten Zellen eine ganze Pflanze zu erhalten. Techniken zum Regenerieren von Pflanzen aus Gewebekultur, z. B. transformierten Protoplasten oder Callus-Zelllinie sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Phillips, et al.; Plant Cell Tissue Organ Culture; Bd. 1: S. 123; (1981); Patterson et al.; Plant Sci.; Bd. 42; S. 125 (1985); Wright, et al.; Plant Cell Reports; Bd. 6: S. 83; (1987); und Barwale, et al.; Planta; Bd. 167; S. 473 (1986); von denen jede hier durch Bezugnahme als in ihrer Gesamtheit aufgenommen gilt. Die Auswahl eines geeigneten Verfahrens liegt im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns.
Es wird erwartet, dass die transformierten Pflanzen in traditionellen Züchtungsprogrammen, einschließlich TOPCROSS-Bestäubungssystemen, wie in U.S. 5,706,603 und U.S. 5,704,160 offenbart, verwendet werden.
Polynucleotid-Assays
Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide in einem Marker, um ein Züchtungsprogramm zu unterstützen, wie es z. B. in der PCT-Publikation US89/00709 beschrieben ist. Die DNA kann direkt zur Detektion verwendet werden oder kann enzymatisch unter Verwendung der PCR vor einer Analyse amplifiziert werden. PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)). RNA oder cDNA kann in der gleichen Weise verwendet werden. Als Beispiel können PCR-Primer, die zu der Nucleinsäure komplementär ist, die für die Phytat-Biosyntheseenzyme kodieren, verwendet werden, um das Vorliegen und die Expression des Phytat-Biosyntheseenzyms zu identifizieren und zu analysieren. Unter Verwendung einer PCR kann eine Charakterisierung des Gens, das in einem bestimmten Gewebe oder einer bestimmten Pflanzenvarietät vorliegt, durch Analyse des Genotyps des Gewebes oder der Varietät durchgeführt werden. Beispielsweise können Deletionen und Insertionen durch eine Änderung in der Größe des amplifizierten Produktes im Vergleich zum Genotyp einer Referenzsequenz detektiert werden. Punktmutationen können identifiziert werden, indem amplifizierte DNA an radioaktiv markierte Phytat-Biosyntheseenzym-RNA oder alternativ radioaktiv markierte Phytat-Biosyntheseenzym-Antisense-DNA-Sequenzen hybridisiert. Perfekt übereinstimmende Sequenzen können von fehlgepaarten Duplices durch RNase-A-Verdau oder durch Differenzen bei den Schmelztemperaturen unterschieden werden.
Sequenzdifferenzen zwischen einem Referenzgen und Genen, die Mutationen haben, können auch durch direkte DNA-Sequenzierung gezeigt werden. Außerdem können klonierte DNA-Segmente als Sonden verwendet werden, um spezifische DNA-Segmente zu detektieren. Die Sensitivität solcher Verfahren kann durch geeignete Verwendung von PCR oder eines anderen Amplifikationsverfahrens stark erhöht werden. Beispielsweise wird ein Sequenzierungsprimer mit doppelsträngigem PCR-Produkt oder einem einzelsträngigen Matrizenmolekül, das durch modifizierte PCR erzeugt wurde, verwendet. Die Sequenzbestimmung wird durch herkömmliche Verfahren mit radioaktiv markiertem Nucleotid oder durch automatische Sequenzierverfahren mit fluoreszenten Tags durchgeführt.
Eine genetische Typisierung von verschiedenen Pflanzenvarietäten auf der Basis von DNA-Sequenzdifferenzen kann durch Detektion einer Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität von DNA-Fragmenten in Gelen mit oder ohne Denaturierungsmittel erreicht werden. Kleine Sequenzdeletionen und Insertionen können durch Hochauflösungs-Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. DNA-Fragmente unterschiedlicher Sequenzen können an denaturierenden Formamid-Gradientengelen unterschieden werden, in denen die Mobilitäten verschiedener DNA-Fragmente im Gel bei verschiedenen Positionen entsprechend ihrer spezifischen Schmelz- oder Partialschmelztemperaturen verzögert werden (siehe z. B. Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)).
Sequenzänderungen an spezifischen Stellen können auch durch Nukleaseschutzassays, z. B. RNase- und S1-Schutz, oder das chemische Spaltungsverfahren gezeigt werden (z. B. Cotton et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., (USA), 85: 4397–4401 (1985)).
So kann die Detektion einer spezifischen DNA-Sequenz durch Verfahren, z. B. Hybridisierung, RNase-Schutz, chemische Spaltung, direkte DNA-Sequenzierung oder die Verwendung von Restriktionsenzymen (z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen („RFLP") und Southern-Blotting genomischer DNA) erreicht werden.
Zusätzlich zu der herkömmlicheren Gelelektrophorese und der DNA-Sequenzierung können Mutationen auch durch in situ-Analyse detektiert werden.
Eine Mutation kann zum Beispiel durch einen DNA-Sequenzierungs-Assay festgestellt werden. Proben werden durch Verfahren prozessiert, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, um die RNA zu fangen. Ein erster cDNA-Strang wird aus den RNA-Proben synthetisiert, indem ein Oligonucleotidprimer zugegeben wird, der aus Sequenzen besteht, die an eine Region an der mRNA hybridisieren. Es werden reverse Transkriptase und Desoxynucleotide zugesetzt, um die Synthese des ersten cDNA-Strangs zu ermöglichen. Primersequenzen werden auf der Basis der DNA-Sequenzen der Phytat-Biosyntheseenzyme der Erfindung synthetisiert. Die Primersequenz besteht im Allgemeinen aus wenigstens 15 fortlaufenden Basen und kann wenigstens 30 oder sogar 50 fortlaufende Basen enthalten.
Zellen, die Mutationen oder Polymorphismen im Gen der vorliegenden Erfindung tragen, können auf dem DNA-Level durch eine Vielzahl von Techniken detektiert werden. Die DNA kann direkt zur Detektion eingesetzt werden oder kann enzymatisch unter Verwendung von PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163–166 (1986)) vor einer Analyse amplifiziert werden. RT-PCR kann auch verwendet werden, um Mutationen zu detektieren. Es ist besonders bevorzugt RT-PCR in Verbindung mit automatischen Detektionssystemen, z. B. GeneScan, zu verwenden. RNA oder cDNA kann zu demselben Zweck, PCR oder RT-PCR, eingesetzt werden. Zum Beispiel können PCR-Primer, die komplementär zu der Nucleinsäure sind, die für Phytat-Biosyntheseenzyme kodiert, verwendet werden, um Mutationen zu identifizieren und zu analysieren. Beispiele für repräsentative Primer sind unten in Tabelle 1 gezeigt. Zum Beispiel können Deletionen und Insertionen durch eine Änderung in der Größe des amplifizierten Produktes im Vergleich zu dem normalen Genotyp detektiert werden. Punktmutationen können durch Hybridisierung von amplifizierter DNA an radioaktiv markierte RNA- oder alternativ radioaktiv markierte Antisense-DNA-Sequenzen identifiziert werden. Während perfekt übereinstimmende Sequenzen von fehlgepaarten Duplices durch RNase-A-Verdau oder durch Differenzen in den Schmelztemperaturen unterschieden werden können, werden Punktmutationen vorzugsweise durch Sequenzanalyse identifiziert.
Primer, die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen in Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Gen verwendet wurden:
Primer, die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Myoinositol-Monophosphatase-3-Gen verwendet wurden:
Primer, die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5/6-Kinase-Gen verwendet wurden:
Primer, die zur Detektion von Mutationen oder Polymorphismen im Phosphatidylinositol-3-Kinase-Gen verwendet wurden:
Die obigen Primer können zum Amplifizieren von Phytat-Biosyntheseenzym-cDNA oder genomischen Klonen, isoliert aus einer Probe, die aus einer einzelnen Pflanze stammt, verwendet werden. Die obigen Primer können 1, 2, 3 oder 4 Nucleotide von dem 5'- und/oder dem 3'-Ende entfernt haben. Die Primer können verwendet werden, um das Gen zu amplifizieren, das aus dem Individuum isoliert wurde, so dass das Gen dann verschiedenen Techniken zur Klärung der DNA-Sequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der DNA-Sequenz identifiziert werden.
Polypeptid-Assays
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf diagnostische Assays, z. B. quantitative und diagnostische Assays zum Detektieren der Level von Phytat-Biosyntheseenzymen in Zellen und Geweben, einschließlich Bestimmung der normalen und abnormalen Level. So kann zum Beispiel ein erfindungsgemäßer diagnostischer Assay zum Detektieren der Expression von Phytat-Biosyntheseenzymen im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um inakzeptable Expressionslevel zu detektieren. Assaytechniken, die verwendet werden können, um die Level an Polypeptiden der vorliegenden Erfindung in einer Probe, die aus einer Pflanzenquelle stammt, zu bestimmen, sind dem Fachmann gut bekannt. Solche Assayverfahren umfassen Radioimmunoassays, kompetitive Bindungsassays, Western Blot-Analyse und ELISA-Assays. Unter diesen werden ELISAs häufig bevorzugt. Ein ELISA-Assay umfasst zunächst Herstellen eines für das Polypeptid spezifischen Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers. Zusätzlich wird im Allgemeinen ein Reporterantikörper hergestellt, der an den monoklonalen Antikörper bindet. Der Reporterantikörper ist an ein detektierbares Reagens, z. B. ein radioaktives, fluoreszentes oder enzymatisches Reagens, in diesem Beispiel Meerrettichperoxidaseenzym, gebunden.
Um einen ELISA-Assay durchzuführen, wird eine Probe aus einem Wirt entfernt und auf einem festen Träger, z. B. eine Polystyrolschale, der die Proteine in der Probe bindet, inkubiert. Freie Proteinbindungsstellen an der Schale werden dann bedeckt, indem mit einem nicht-spezifischen Protein, z. B. Rinderserumalbumin, inkubiert wird. Als Nächstes wird der monoklonale Antikörper in der Schale inkubiert, wobei die monoklonalen Antikörper während dieser Zeit an Phytat-Biosyntheseenzyme, die an die Polystyrolschale gebunden sind, binden. Ungebundener monoklonaler Antikörper wird mit Puffer ausgewaschen. Der Reporterantikörper, der an Meerrettichperoxidase gebunden ist, wird in die Schale gegeben, was in der Bindung des Reporterantikörpers an einem beliebigen monoklonalen Antikörper, der an Phytat-Biosyntheseenzym gebunden ist, resultiert. Dann wird ungebundener Reporterantikörper ausgewaschen. Dann werden Reagenzien für die Peroxidaseaktivität, einschließlich eines kolorimetrischen Substrats, in die Schale gegeben. Immobilisierte Peroxidase, verknüpft mit einem Phytat-Biosyntheseenzym durch die primären und sekundären Antikörper, produziert ein gefärbtes Reaktionsprodukt. Die in einem gegebenen Zeitraum entwickelte Farbmenge gibt die Menge an Phytat-Biosyntheseenzym an, die in der Probe vorliegt. Quantitative Resultate werden typischerweise durch Bezug zu einer Standardkurve erhalten.
Es kann ein Kompetitionsassay verwendet werden, in dem Antikörper, die spezifisch für Phytat-Biosyntheseenzyme sind, an einen festen Träger gebunden sind, und markiertes Enzym, das von dem Wirt stammt, über den festen Träger geleitet wird, und die detektierte Markierungsmenge, die an den festen Träger gebunden ist, kann zu einer Menge an Phytat-Biosyntheseenzym in der Probe in Korrelation gesetzt werden.
Antikörper
Die Polypeptide, ihre Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon oder Zellen, die sie exprimieren, können als Immunogene eingesetzt werden, um Antikörper dagegen zu produzieren. Diese Antikörper können zum Beispiel polyklonale oder monoklonale Antikörper sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch chimäre, Einzelketten- und humanisierte Antikörper, wie auch Fab-Fragmente oder das Produkt einer Fab-Expressionsbibliothek. Es können verschiedene Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, für die Produktion von solchen Antikörpern und Fragmenten eingesetzt werden.
Antikörper, die gegen die Polypeptide, die einer Sequenz der vorliegenden Erfindung entsprechen, erzeugt wurden, können durch direkte Injektion der Polypeptide in ein Tier oder durch Verabreichung der Polypeptide an ein Tier, vorzugsweise ein nicht-menschliches Tier, erhalten werden. Der so erhaltene Antikörper wird dann die Polypeptide selbst binden. Auf diese Weise kann sogar eine Sequenz, die nur für ein Fragment des Polypeptids kodiert, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die das ganze native Polypeptid binden. Solche Antikörper können dann eingesetzt werden, um das Polypeptid aus Gewebe, das jenes Polypeptid exprimiert, zu isolieren.
Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern kann jede Technik, welche Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinienkulturen produziert werden, verwendet werden. Beispiele umfassen die Hybridom-Technik (Kohler, G. und Milstein, C., Nature 256: 495–497 (1975)), die Trioma-Technik, die humane B-Zell-Hybridom-Technik (Kozbor et al., Immunoloy Today 4: 72 (1983)) und die EBV-Hybridom-Technik, um humane monoklonale Antikörper zu produzieren (Cole et al., S. 77–96 in MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)).
Hybridomzelllinien, die den monoklonalen Antikörper sekretieren, sind ein weiterer Aspekt dieser Erfindung.
Techniken, die für die Produktion von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden ( U.S. Patent Nr. 4,946,778 ), können angepasst werden, um Einzelketten-Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu produzieren. Auch transgene Mäuse oder andere Organismen, z. B. andere Säuger, können verwendet werden, um humanisierte Antikörper gegen immunogene Polypeptidprodukte dieser Erfindung zu exprimieren.
Die oben beschriebenen Antikörper können verwendet werden, um Klone, die das Polypeptid exprimieren, zu isolieren oder zu identifizieren oder um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung zu reinigen, und zwar durch Bindung des Antikörpers an einen festen Träger zur Isolierung und/oder Reinigung durch Affinitätschromatographie.
Polypeptidderivate umfassen antigen oder immunologisch äquivalente Derivate, die einen besonderen Aspekt dieser Erfindung bilden.
Der Ausdruck „antigen äquivalentes Derivat", wie er hierin verwendet wird, umfasst ein Polypeptid oder sein Äquivalent, welches spezifisch durch bestimmte Antikörper erkannt wird, welche, wenn sie gegen das Protein oder Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung entwickelt wurden, die unmittelbare physikalische Wechselwirkung zwischen dem Antikörper und seinem verwandten Antigen stören.
Das Polypeptid, z. B. ein Antigen oder immunologisch äquivalentes Derivat oder ein Fusionsprotein davon, wird als Antigen verwendet, um eine Maus oder ein anderes Tier, z. B. Ratte, Meerschweinchen, Ziege, Kaninchen, Schaf, Rind oder Huhn, zu immunisieren. Das Fusionsprotein kann Stabilität für das Polypeptid bereitstellen. Das Antigen kann z. B. durch Konjugation mit einem immunogenen Trägerprotein, z. B. Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin (KLH), assoziiert sein. Alternativ kann ein multiple antigenic peptide, das mehrere Kopien des Proteins oder Polypeptids umfasst, oder ein antigen oder immunologisch äquivalentes Polypeptid davon ausreichend antigen sein, um die Immunogenität zu verbessern, so dass die Verwendung eines Trägers vermieden wird.
Alternativ könnte die Phagen-Display-Technik genutzt werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten zu dem Polypeptid auszuwählen, und zwar entweder aus Repertoires von PCR-amplifizierten v-Genen von Lymphozyten aus Menschen, die auf anti-Fbp durchgemustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken (McCafferty, J et al., (1990), Nature 348: 552–554; Marks, J. et al., (1992) Biotechnology 10: 779–783). Die Affinität dieser Antikörper kann auch durch Ketten-Shuffling verbessert werden (Clackson, T. et al., (1991) Nature 352: 624–628).
Der Antikörper sollte erneut auf hohe Affinität zu dem Polypeptid und/oder Fusionsprotein durchgemustert werden.
Wie oben erwähnt wurde, kann ein Fragment des endgültigen Antikörpers hergestellt werden.
Der Antikörper kann entweder ein intakter Antikörper mit M, von etwa 150.000 oder ein Derivat davon, z. B. ein Fab-Fragment oder ein Fv-Fragment, sein, wie z. B. bei Sierra A. und Pluckthun, A., Science 240: 1038–1040 (1988) beschrieben. Wenn zwei Antigen-bindende Domänen vorliegen, kann jede Domäne gegen ein anderes Epitop gerichtet sein, wobei dieser Antikörper als „bispezifischer" Antikörper bezeichnet wird.
Der Antikörper, wie er oben genannt wurde, kann durch herkömmliche Mittel hergestellt werden, z. B. durch die etablierte monoklonale Antikörper-Technologie (Kohler, G. und Milstein, C., Nature, 256: 495–497 (1975)) oder unter Verwendung rekombinanter Mittel, z. B. Kombinationsbibliotheken, wie es z. B. in Huse, W. D. et al., Science 246: 1275–1281 (1989) beschrieben ist.
Vorzugsweise wird der Antikörper durch Expression eines DNA-Polymers, das für den Antikörper kodiert, in einem geeigneten Expressionssystem, wie es z. B. oben für die Expression von Polypeptiden der Erfindung beschrieben wurde, hergestellt. Die Wahl des Vektors für das Expressionssystem wird zum Teil durch den Wirt bestimmt, der eine prokaryotische Zelle, z. B. E. coli (vorzugsweise Stamm B) oder Streptomyces sp., oder eine eukaryotische Zelle, z. B. eine Maus-C127-, Mausmyelom-, humane HeLa-, chinesische Hamstereierstock-, filamentöser oder unicellulärer Pilz- oder Insektenzelle sein kann. Der Wirt kann auch ein transgenes Tier oder eine transgene Pflanze sein, wie es z. B. in Hiatt, A. et al., Nature 340: 76–78 (1989) beschrieben ist. Geeignete Vektoren umfassen Plasmide, Bakteriophagen, Cosmide und rekombinante Viren, die zum Beispiel von Baculoviren und Vaccinia abgeleitet sind.
Das Fab-Fragment kann auch aus seinem monoklonalen Elternantikörper durch Behandlung mit einem Enzym, z. B. unter Verwendung von Papain, um den Fab-Teil von dem Fc-Teil zu spalten, hergestellt werden.
Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungsmoleküle und Assays
Diese Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Identifizierung von Molekülen, z. B. Bindungsmolekülen bzw. bindenden Molekülen, die die Phytat-Biosyntheseenzyme binden. Gene, die für Proteine kodieren, die die Enzyme binden, z. B. Bindungsproteine, können durch zahlreiche Verfahren identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. Liganden-Panning und FACS-Sorting. Solche Verfahren sind in vielen Laborhandbüchern beschrieben, z. B. in Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991).
Zum Beispiel kann eine Expressionsklonierung zu diesem Zweck verwendet werden. Zu diesem Zweck wird polyadenylierte RNA aus einer Zelle, die die Phytat-Biosyntheseenzyme exprimiert, hergestellt, eine cDNA-Bibliothek wird aus dieser RNA erzeugt, die Bibliothek wird in Pools aufgeteilt und die Pools werden individuell in Zellen transfiziert, die das Enzym nicht exprimieren. Die transfizierten Zellen werden dann einem markierten Enzym ausgesetzt. Das Enzym kann durch eine Vielzahl gut bekannter Techniken, einschließlich Standardverfahren der Radioiodierung oder des Einschlusses einer Erkennungsstelle für eine ortsspezifische Proteinkinase, markiert sein. Nach Exposition werden die Zellen fixiert und die Enzymbindung wird bestimmt. Diese Verfahren werden zweckmäßigerweise auf Glasobjektträgern durchgeführt.
Es werden Pools von cDNA identifiziert, die Phytat-Biosyntheseenzym-bindende Zellen produziert hatten. Sub-Pools wurden aus diesen Positiven hergestellt, in Wirtszellen transfiziert und wie oben beschrieben durchgemustert. Unter Verwendung eines Verfahrens mit wiederholtem Sub-Pooling und Re-Screening kann/können ein einzelner Klon oder mehrere einzelne Klone identifiziert werden, die für das vermeintliche Bindungsmolekül kodieren.
Alternativ kann ein markierter Ligand an einen Zellextrakt, z. B. eine Membran oder einen Membranextrakt, hergestellt aus Zellen, die ein Molekül exprimieren, das z. B. ein Bindungsmolekül bindet, Photoaffinitäts-gebunden werden. Vernetztes Material wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE") aufgetrennt und auf einem Röntgenfilm belichtet. Der markierte Komplex, der die Ligandbindung enthält, kann ausgeschnitten werden, in Peptidfragmente aufgetrennt werden und einer Proteinmikrosequenzierung unterworfen werden.
Die aus einer Mikrosequenzierung erhaltene Aminosäuresequenz kann verwendet werden, um einzigartige oder degenerierte Oligonucleotidsonden zu entwickeln, um cDNA-Bibliotheken durchzumustern, um Gene zu identifizieren, die für das vermeintliche Bindungsmolekül kodieren.
Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um eine Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungskapazität von Phytat-Biosyntheseenzym-Bindungsmolekülen, z. B. Bindungsmolekülen, in Zellen oder zellfreien Präparationen zu bestimmen.
Polypeptide der Erfindung können auch verwendet werden, um die Bindung an kleinen Molekülsubstraten und Liganden in z. B. Zellen, zellfreien Präparationen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktgemischen zu bestimmen. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate und Liganden sein oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein.
Antikörper gegen Phytat-Biosyntheseenzym stellen eine nützliche Klasse von Bindungsmolekülen dar, auf die sich diese Erfindung bezieht.
Antagonisten-Assays und Moleküle
Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Screening von Verbindungen, um solche zu identifizieren, die die Wirkung von Phytat-Biosyntheseenzymen auf Zellen, z. B. ihre Wechselwirkung mit Substratmolekülen, verstärken oder blockieren. Ein Antagonist ist eine Verbindung, die die natürlichen biologischen Funktionen der Enzyme vermindert.
Potentielle Antagonisten umfassen kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper, die an ein Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität inhibieren oder auslöschen. Potentielle Antagonisten können auch kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, z. B. ein nah verwandtes Protein oder ein Antikörper sein, das/der an dieselben Stellen eines Bindungsmoleküls bindet, z. B. ein Bindungsmolekül, ohne dass Phytat-Biosyntheseenzym-induzierte Aktivitäten induziert werden; dadurch wird die Wirkung des Enzyms verhindert, indem das Enzym von einer Bindung ausgeschlossen wird.
Potentielle Antagonisten umfassen ein kleines Molekül, das an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet und diese besetzt, wodurch eine Bindung an celluläre Bindungsmoleküle, z. B. Bindungsmoleküle, verhindert wird, so dass eine normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle.
Andere potentielle Antagonisten umfassen Moleküle, die die Expression des Gens, das für Phytat-Biosyntheseenzyme kodiert, beeinträchtigt (z. B. Transaktivierungsinhibitoren). Andere potentielle Antagonisten umfassen Antisense-Moleküle. Die Antisense-Technik kann eingesetzt werden, um die Genexpression durch Antisense-DNA oder -RNA oder durch Doppel- oder Tripelhelixbindung zu kontrollieren. Antisense-Techniken werden z. B. in Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) diskutiert. Eine Tripelhelixbildung wird zum Beispiel in Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988): und Dervan et al., Science 251: 1360 (1991) diskutiert. Die Verfahren basieren auf der Bindung eines Polynucleotids an eine komplementäre DNA oder RNA. Beispielsweise kann der 5'-kodierende Teil eines Polynucleotids, das für das reife Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, verwendet werden, um ein Antisense-RNA-Oligonucleotid mit einer Länge von etwa 10 bis 40 Basenpaaren zu entwickeln. Es wird ein DNA-Oligonucleotid entwickelt, das komplementär zu einer Region des Gens ist, das in der Transkription involviert ist, wodurch eine Transkription und die Produktion von Phytat-Biosyntheseenzymen verhindert wird. Das Antisense-RNA-Oligonucleotid hybridisiert in vivo an die mRNA und blockiert eine Translation des mRNA-Moleküls zu Phytat-Biosyntheseenzymen. Die oben beschriebenen Oligonucleotide können auch an Zellen abgegeben werden, so dass die Antisense-RNA oder -DNA in vivo exprimiert werden kann, um so die Produktion von Phytat-Biosyntheseenzymen zu inhibieren.
Die Antagonisten können z. B. verwendet werden, um die Phytatlevel zu reduzieren und/oder den verfügbaren Phosphor in Pflanzenzellen zu erhöhen.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben. Die Beispiele werden lediglich angeführt, um die Erfindung unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen zu erläutern. Diese beispielhaften Ausführungen geben keine Beschrän kungen oder Umschreibungen des Rahmens der offenbarten Erfindung wieder, obgleich sie bestimmte spezifische Aspekte der Erfindung veranschaulichen.
Bestimmte hierin verwendete Ausdrücke sind in der voran stehenden Beschreibung erläutert.
Alle Beispiele wurden unter Verwendung von Standardtechniken, die dem Fachmann gut bekannt sind und für ihn Routine sind, ausgeführt, außer sie sind an anderer Stelle detailliert beschrieben. Routinetechniken der Molekularbiologie der folgenden Beispiele können durchgeführt werden, wie es in Standard-Laborhandbüchern beschrieben ist, z. B. in Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989).
Alle Teile und Mengen, die in den folgenden Beispielen angegeben sind, sind Gewichtsteile oder Gewichtsmengen, wenn nichts anderes spezifiziert ist.
Wem nicht anderes angegeben ist, wurde eine Größentrennung von Fragmenten in den Beispielen unten unter Verwendung von Agarose-Standardtechniken und Polyacrylamidgelelektrophorese ("PAGE") gemäß Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) und zahlreichen anderen Literaturstellen, z. B. Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980), durchgeführt.
Wenn nichts anderes beschrieben ist, wurden Ligationen unter Verwendung von Standardpuffern, -inkubationstemperaturen und -zeiten annähernd äquimolaren Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente und etwa 10 Einheiten T4-DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 Mikrogramm DNA durchgeführt.
Beispiel 1: Isolierung von DNA, die für neue Proteine kodiert, aus Zea mays
Das Polynucleotid, das die Myoinositol-1-phosphat-Synthase-DNA-Sequenz hat, wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten, die aus Maisembryos hergestellt worden waren, welche 15 Tage nach Bestäubung isoliert worden waren. Das Polynucleotid mit der Myoinositol-monophosphatase-3-DNA-Sequenz wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten, die aus unreifen Maisähren hergestellt worden waren. Das Polynucleotid mit der Myoinositol-1,3,4-triphosphat-5,6-Kinase-DNA-Sequenz wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten, die aus Maissamenschösslingen hergestellt worden waren. Das Polynucleotid mit der Phosphatidylinositol-3-Kinase-DNA-Sequenz wurde aus der Sequenzierung einer Bibliothek von cDNA-Klonen erhalten, die aus keimenden Maissamen hergestellt worden waren. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Standardprotokollen aus diesem Gewebe isoliert und durch Selektion mit Oligo-dT bezüglich mRNA angereichert, wiederum durch Standardprotokolle. Diese mRNA wurde dann als Matrize verwendet, um komplementäre DNA (cDNA) unter Verwendung des Enzyms reverse Transkriptase nach herkömmlichen Verfahren zu synthetisieren. Der resultierende cDNA-Strang wurde dann in doppelsträngige cDNA-Stücke konvertiert und in den Klonierungsvektor pSPORT ligiert, wobei herkömmliche Ligations/Transformationsverfahren verwendet wurden. Dann wurde einzelne Kolonien ausgewählt und Plasmid-DNA aus jeder hergestellt. Diese Plasmid-DNA wurde dann denaturiert und als Matrize in Didesoxynucleotid-Sequenzierungsreaktionen eingesetzt. Durch Sequenzierung der einzelnen so identifizierten Klone mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Sequenz entwickelt wurden, ist es dann möglich, die Sequenz in beiden Richtungen zu verlängern, um die volle Gensequenz zu bestimmen. Geeignete Techniken werden von Maniatis, T., Fritsch, E. F. und Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausg.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben. (Siehe Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Die Sequenzen wurden mit solchen Sequenzen verglichen, die in öffentlichen Datenbanken (d. h. Genbank) verfügbar sind, um Homologien/Genidentifizierung zu bestimmen. In einigen Fällen wurden die Sequenzierungsdaten von zwei oder mehr Klonen, die überlappende DNA-Segmente enthalten, verwendet, um die fortlaufende DNA-Sequenz unten zu konstruieren.
Beispiel 2: Konstruktion von Expressionskassetten für Homologie-abhängiges Gen-Silencing von Phytat-Biosyntheseenzym-Expression
Um Manipulationen dieses Merkmals in herkömmlichen Züchtungsprogrammen zu erleichtern, wird die oben beschriebene Expressionskassette im homologen Gen-Silencing (d. h. Knockout) der endogenen Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide durch Verwendung des Embryo-bevorzugten Promotors Globulin-1 verwendet, um die Expression der Gene zu steuern.
Pflanzenexpressionskassetten werden unter Verwendung des Embryo-bevorzugten Promotors Globulin-1 hergestellt, um die Expression der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide zu steuern. Globulin-1-Terminationssequenzen sind in dieser Kassette ebenfalls enthalten. Die gesamte Expressionskassette wird in einem pUC-basierten Plasmidvektor zur einfachen Manipulation E. coli kloniert. Dieses Konstrukt wird durch Partikelbeschuss-Transformation von Mais in Verbindung mit enem anderen Expressionkonstrukt, das einen selektierbaren Marker umfasst (z. B. Pat, PHP8092 → Ubi::mo-PAT::ubi), verwendet. Für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation wird ein Plasmid in einen geeigneten binären Vektor, der sowohl linke als auch rechte Grenzsequenzen enthält, gebracht, um einen DNA-Transfer in das Targetgenom zu erleichtern.
Dieses Polynucleotid, das für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodiert, resultiert, wenn es in Pflanzen nicht-funktionell gemacht wird, in einer Verringerung der Phytinsäure und einer Erhöhung der Nicht-Phytat-Phosphorlevel. Dies kann durch das transponible Element Mu bewiesen werden. Es wird bestätigt, dass Maislinien ein Mu-Element in die kodierende Region der Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotide insertiert haben. Es wurden ausgedehnte genetische Arbeiten an diesem Phänotyp durchgeführt, wobei bewiesen wurde, dass er als Homozygot rezessives Merkmal auf die Nachkommenschaft übertragen wird.
Beispiel 3: Transformation von Mais
Die erfindungsgemäßen Polynucleotide, die in einem Vektor enthalten sind, werden durch Partikelbeschuss in embryogenen Maiskallus transformiert. Transgene Maispflanzen werden durch Beschuss von embryogen ansprechenden unreifen Embryos mit Wolframpartikeln, assoziiert mit DNA-Plasmiden, produziert. Die Plasmide bestehen aus einem selektierbaren und einem nicht-selektierbaren Markergen.
Partikelherstellung
Fünfzehn mg Wolframpartikel (General Electric), 0,5 bis 1,8 μ, vorzugsweise 1 bis 1,8 μ und am bevorzugtesten 1 μ, werden zu 2 ml konzentrierter Salpetersäure gegeben. Diese Suspension wurde bei 0°C für 20 Minuten beschallt (Branson Sonifier Modell 450, 40% Output, konstanter Arbeitszyklus). Wolframpellets werden durch Zentrifugation bei 10.000 UpM (Biofuge) für eine Minute pelletisiert und der Überstand wird entfernt. Zwei Milliliter steriles destilliertes Wasser werden zu dem Pellet gegeben, und es wird eine kurze Beschallung verwendet, um die Partikel wieder zu suspendieren. Die Suspension wird pelletisiert, ein Milliliter absolutes Ethanol wird zu den Pellets gegeben und es wird eine kurze Beschallung verwendet, um die Partikel wieder zu suspendieren. Spülen, Pelletisieren und Resuspendieren der Partikel wird zwei weitere Male mit sterilem destilliertem Wasser durchgeführt und die Partikel werden in zwei Milliliter sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Die Partikel werden in 250 ml-Aliquots aufgeteilt und gefroren gelagert.
Herstellung einer Partikel-Plasmid-DNA-Assoziation
Der Vorrat an Wolframpartikeln wird kurz in enem Wasserbad-Beschallungsgerät (Branson Sonifier Modell 450, 20% Output, konstanter Arbeitszyklus) beschallt und 50 ml werden in ein Mikrozentrifugenröhrchen transferiert. Äquimolare Mengen an selektierbarer und nicht-selektierbarer Plasmid-DNA werden zu einer End-DNA-Menge von 0,1 bis 10 mg in 10 ml Gesamtvolumen zu den Partikeln gegeben und kurz beschallt. Vorzugsweise wird 1 mg Gesamt-DNA verwendet. Spezifischerweise werden 4,9 ml PHP 8092 (Ubiquitin::ubiquitin intron::mo-PAT::35S CaMV, 6.329 kbp)) plus 5,1 ml (globulin1::mi1ps::globulin1), worin Phytat-Biosyntheseenzym-Polynucleotid mi1ps ersetzen kann, beides mit 0,1 mg/ml in TE-Puffer, dieser Partikelsuspension zugesetzt. Fünfzig Mikroliter steriles wässriges 2,5 M CaCl₂ werden zugegeben und das Gemisch wird kurz beschallt und mit einem Vortex-Gerät behandelt. Zwanzig Mikroliter steriles wässriges 0,1 M Spermidin werden zugesetzt und das Gemisch wird kurz beschallt und mit einem Vortex-Gerät behandelt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 20 Minuten bei intermittierender kurzer Beschallung inkubiert. Die Partikelsuspension wird zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Zweihundertfünfzig Mikroliter absolutes Ethanol werden zu dem Pellet gegeben, gefolgt von einer kurzen Beschallung. Die Suspension wird pelletisiert, der Überstand wird entfernt, und es werden 60 ml absolutes Ethanol zugesetzt. Die Suspension wird kurz beschallt, bevor die Partikel-DNA-Agglomeration auf Makroträger geladen wird.
Vorbereitung von Gewebe
Unreife Embryos der Maisvarietät High Type II sind das Target für eine Partikelbeschuss-vermittelte Transformation. Dieser Genotyp ist die F₁ von zwei reinrassigen genetischen Linien, Eltern A und B, die aus der Züchtung von zwei bekannten Maisinzuchtlinien, A188 und B73, stammen. Beide Eltern werden bezüglich hoher Kompetenz der somatischen Embryogenese nach Armstrong et al., Maize Genetics Coop. News 65: 92 (1991) ausgewählt.
Ähren von F₁-Pflanzen werden einer Selbstung unterzogen oder einer Geschwisterkreuzung unterzogen und Embryos werden aseptisch aus sich entwickelnden Caryopsen herausgeschnitten, wenn das Scutellum erstmals trüb wird. Diese Stufe tritt in Abhängigkeit von den Wachstumsbedingungen etwa 9–13 Tage nach der Bestäubung und im Allgemeinen etwa 10 Tage nach der Bestäubung auf. Die Embryos sind etwa 0,75 bis 1,5 Millimeter lang. Ähren werden für 30 Minuten mit 20–50% Clorox oberflächensterilisiert, worauf sich drei Spülungen mit sterilem destilliertem Wasser anschließen.
Unreife Embryos werden mit dem Scutellum nach oben gerichtet auf embryogenem Induktionsmedium, umfassend N6-Basalsalze, Eriksson-Vitamine, 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 30 g/l Saccharose, 2,88 g/l L-Prolin, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 g/l Gerite und 8,5 mg/l AgNO₃, kultiviert. Chu et al., Sci. Sin. 18: 659 (1975); Eriksson, Physiol. Plant 18: 976 (1965). Das Medium wird durch Autoklavieren bei 121°C 15 Minuten sterilisiert und in 100 × 25 mm-Petrischalen verteilt. AgNO₃ wird Filter-sterilisiert und zu dem Medium nach Autoklavieren gegeben. Die Gewebe werden in vollständiger Dunkelheit bei 28°C kultiviert. Nach etwa 3 bis 7 Tagen, am üblichsten nach etwa 4 Tagen, quillt das Scutellum des Embryos auf das Doppelte seiner ursprünglichen Größe, und die Hervorschwellungen an der koleorhizalen Oberflächen des Scutellum zeigten den Beginn von embryogenem Gewebe an. Bis zu 100% der Embryos zeigten diese Reaktion, am üblichsten ist jedoch die embryogene Antworthäufigkeit etwa 80%.
Wenn die embryogene Antwort beobachtet wird, werden die Embryos auf ein Medium transferiert, das aus Induktionsmedium besteht, das so modifiziert ist, dass es 120 g/l Saccharose enthält. Die Embryos werden mit dem koleorhizalen Pol, dem embryogen reagierenden Gewebe, nach oben aus dem Kulturgewebe orientiert. Zehn Embryos pro Petrischale werden in der Mitte einer Petrischale in einem Bereich mit etwa 2 cm Durchmesser lokalisiert. Die Embryos werden für 3–16 Stunden, vorzugsweise für 4 Tage, in vollständiger Dunkelheit bei 28°C auf diesem Medium gehalten, unmittelbar vor einem Beschuss mit Partikeln, die mit Plasmid-DNAs assoziiert sind, welche die selektierbaren und nicht-selektierbaren Markergene enthalten.
Um den Partikelbeschuss von Embryos durchzuführen, werden die Partikel-DNA-Agglomerate unter Verwendung einer DuPont PDS-1000-Partikelbeschleunigungsvorrichtung beschleunigt. Die Partikel-DNA-Agglomeration wird kurz beschallt und 10 ml werden auf Makroträger abgeschieden und das Ethanol wird verdampfen gelassen. Der Makroträger wird auf einen Edelstahlstoppschirm unter Reißen eines Polymerdiaphragmas (rupture disk) beschleunigt. Das Reißen erfolgt durch komprimiertes Helium. Die Geschwindigkeit der Partikel-DNA-Beschleunigung wird auf der Basis des Bruchdrucks der Reißscheibe bestimmt. Drücke der Reißscheibe bzw. rupture disks von 200 bis 1800 psi werden bevorzugt, wobei 650 bis 1100 psi bevorzugt sind, und etwa 900 psi äußerst bevorzugt sind. Mehrere Disks werden verwendet, um einen Bereich von Reißdrücken herzustellen.
Das Bord, das die Platte mit Embryos enthält, wird 5,1 cm unterhalb des Bodens der Makroträgerplattform platziert (Bord #3). Um einen Partikelbeschuss von kultivierten unreifen Embryos durchzuführen, werden eine Reißscheibe und ein Makroträger mit getrockneten Partikel-DNA-Agglomeraten in der Vorrichtung angeordnet. Der He-Druck, der an die Vorrichtung abgegeben wird, wird auf 200 psi über dem Bruchdruck der Reißscheibe eingestellt. Eine Petrischale mit den Targetembryos wird in die Vakuumkammer gestellt und in den projizierten Weg der beschleunigten Partikel lokalisiert. In der Kammer wird ein Vakuum, vorzugsweise von etwa 28 in Hg erzeugt. Nach Betrieb der Vorrichtung wird das Vakuum entspannt und die Petrischale wird entfernt.
Beschossene Embryos bleiben während des Beschusses und 1 bis 4 Tage danach auf dem osmotisch eingestellten Medium. Die Embryos werden auf Selektionsmedium transferiert, bestehend aus N6-Basalsalzen, Eriksson-Vitaminen, 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 30 g/l Saccharose, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 g/l Gerite, 0,85 mg/l Ag NO3 und 3 mg/l Bialaphos (Herbiace Meiji), transferiert. Bialaphos wird Filter-sterilisiert zugesetzt. Die Embryos werden in Intervallen von 10 bis 14 Tagen auf frisches Selektionsmedium subkultiviert. Nach etwa 7 Wochen proliferiert embryogenes Gewebe, vermutlich sowohl mit selektierbaren als auch mit nicht-selektierbaren Markergenen transformiert, aus etwa 7% der beschossenen Embryos. Vermeintlich transgenes Gewebe wird gewonnen und das Gewebe, das von einzelnen Embryonen stammt, wird bezüglich eines Ereignisses betrachtet und wird unabhängig auf Selektionsmedium vermehrt. Zwei Zyklen der klonalen Vermehrung werden nach visueller Selektion bezüglich der kleinsten fortlaufenden Fragmente von organisiertem embryogenem Gewebe erreicht.
Eine Gewebeprobe aus jedem Ereignis wird prozessiert, um DNA zu gewinnen. Die DNA wird mit Restriktionsendonuklease eingeschränkt und mit Primersequenzen sondiert, die entwickelt wurden, um DNA-Sequenzen, die mit Phytat-Biosyntheseenzymen und dem Nicht-Phytat-Biosyntheseenzym-Teil des Plasmids überlappen, zu amplifizieren. Embryogens Gewebe mit amplifizierbarer Sequenz wird zur Pflanzenregeneration gebracht.
Zur Regeneration von transgenen Pflanzen wird embryogenes Gewebe in einem Medium, umfassend MS-Salze und Vitamine (Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15: 473 (1962)), 100 mg/l Myoinositol, 60 mg/l Saccharose, 3 g/l Gerite, 0,5 mg/l Zeatin, 1 mg/l Indol-3-essigsäure, 26,4 ng/l cis-trans-Abscissinsäure und 3 mg/l Bialaphos, in 100 X 25 mm-Petrischalen subkultiviert und im Dunkeln bei 28°C inkubiert, bis die Entwicklung von gut geformten, reifen somatischen Embryos zu sehen ist. Dies erfordert etwa 14 Tage. Gut geformte somatische Embryos sind trüb und cremefarben und bestehen aus einem identifizierbaren Scutellum und Koleoptile. Die Embryos werden einzeln auf Keimmedium, umfassend MS-Salze und Vitamine, 100 mg/l Myoinositol, 40 g/l Saccharose und 1,5 g/l Gerite, in 100 X 25 mm-Petrischalen subkultiviert und bei einer Lichtperiode 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit und 40 Millieinstein m^–2s^–1 aus Leuchtstoffröhren inkubiert. Nach etwa 7 Tagen haben die somatischen Embryos gekeimt und produzierten einen gut definierten Schößling und eine Wurzel. Die einzelnen Pflanzen werden in Keimmedium in 125 X 25 mm-Glasröhrchen subkultiviert, um eine weitere Pflanzenentwicklung zu erlauben. Die Pflanzen werden unter einer Lichtperiode von 16 Stunden Licht: 8 Stunden Dunkelheit und 40 Millieinstein m^–2s^–1 aus Leuchtstoffröhren gehalten. Nach etwa 7 Tagen sind die Pflanzen gut entwickelt und werden in Gartenerde transplantiert, abgehärtet und in ein handelsübliches Gewächshauserdegemisch getopft und in einem Gewächshaus zur sexuellen Reife wachsen gelassen. Als männliche Pflanze wird eine Eliteinzuchtlinie verwendet, um regenerierte transgene Pflanzen zu bestäuben.
Beispiel 4: Identifizierung von transgenen Maislinien mit hohem Phosphorgehalt
Die resultieren Transformanten werden bezüglich erhöhter Level an anorganischem Phosphor durchgemustert, wobei ein einfacher kolorimetrischer Assay verwendet wird. Einzelne transgene Körner werden in den Vertiefungen eines Megatiter-Züchtungstabletts unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit 2000 psi zerkleinert. Die zerkleinerten Körner werden dann für 2 Stunden bei Raumtemperatur in 2 ml 1 N H₂SO₄ eingeweicht. Durch Zugabe von 4 ml Entwicklungslösung (1 Teil 10%iger Ascorbinsäure, 6 Teile 0,42%iges Ammoniummolybdat in 1 N H₂SO₄) zu jedem zerkleinerten Korn wird eine Farbentwicklung initiiert. Nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur werden Körner entweder als positiv (blau) oder negativ (klar) bewertet. Positiv bezieht sich in diesem Fall auf einen hohen Level an anorganischem Phosphor. Dieses Protokoll ist eine modifizierte Version von dem, das bei Chen et al., Anal. Chem. 28: 1756 (1956) beschrieben ist. Solche Transformanten, die mit dem kolorimetrischen Assay als positiv durchgemustert wurden, werden dann härteren Analysen unter Einschluss von Southern-, Northern- und Western-Blotting und einer Quantifizierung der Phytinsäurelevel unterzogen.
Bestätigung von erhöhten Nicht-Phytat-Phosphorleveln
Die vorliegenden transgenen Pflanzen haben vorzugsweise Nicht-Phytat-Phosphorlevel über den natürlichen Leveln von verfügbarem Phosphor für die Pflanzenspezies von Interesse. Für Mais ist es bevorzugt, Nicht-Phytat-Phosphorlevel von 0,175%, bevorzugter etwa 0,2% und am bevorzugtesten etwa 0,255% oder höher zu haben. Diese Prozentangaben basieren auf %G/G bei 13% Feuchtigkeitsgehalt für beide Maissamen. Was Sojabohnen angeht, so ist es bevorzugt, Nicht-Phytat-Phosphorlevel von etwa 0,47%, bevorzugter etwa 0,49% und am bevorzugtesten etwa 0,51%, zu haben. Dieser zuletzt genannte Prozentwert basiert auf dem Gewicht von Nicht-Phytat-Phosphor/(Nicht-Phytat-P/Gramm Mahlzeit mit 13% Feuchtigkeit).
Jede Pflanze, die als potentielle transgene Pflanze mit hohem Phosphorgehalt identifiziert wurde, wird erneut getestet, um den ursprünglichen erhöhten Phosphorwert zu bestätigen. Einige vermeintliche transgene Pflanzen können bezüglich des Merkmals erhöhter Phosphorgehalt nicht bestätigt werden. Solche, die bestätigt werden, werden auf der Basis der Einheitlichkeit bezüglich des Merkmals erhöhter Phosphorgehalt ausgewählt.
Bestätigung von reduzierten Phytatleveln
Um zu bestimmen, dass transgene Pflanzen mit hohem Nicht-Phytat-Phosphor auch durch reduzierte Phytatlevel charakterisiert sind, wird das folgende Verfahren verwendet, um den Phytinsäurelevel in einer getesteten Probe quantitativ zu bestimmen.
Die Probe wird vermahlen, in ein konisches Kunststoffzentrifugenröhrchen gegeben und mit Salzsäure behandelt. Sie wird mit Polytron homogenisiert und bei Raumtemperatur unter Vortex-Behandlung extrahiert. Die extrahierte Probe wird in eine Klinikzentrifuge bei 2500 UpM für 15 Minuten gegeben. 2,5 ml des Überstands werden entfernt und zu 25 ml Wasser gegeben. Die Probe wird durch enie SAX^®-Säule gewaschen. Die Säule wird mit HCl gewaschen, eluiert und das Eluat zur Trockene eingedampft. Die getrocknete Probe wird in Wasser resuspendiert und durch ein 0,45 Mikrometer-Spritzenspitzefilter in eine Phiole filtriert. 10 bis 20 Mikroliter-Proben werden hergestellt, um sie in eine HPLC-Säule zu injizieren.
Das eluierende Lösungsmittel wird hergestellt, indem 515 ml Methanol, 485 ml zweifach destilliertes Wasser, 8 ml Tetrabutylammoniumhydroxid, 40% (TBAH), 200 Mikroliter 10 N, (5 M) Schwefelsäure, 0,5 ml Ameisensäure und 1–3 mg Phytinsäure gemischt werden. Phytinsäure wird hergestellt, indem 16 mg in Natriumphytat in 5 ml Wasser gegeben werden. Diese Lösung wird auf Dowex-Ionenaustauschharz (1 ml Dowex-50, saure Form, auf Glaswolle in 5 ml Pipettenspitze) gegeben. Dieses wird mit 1–2 ml Wasser gespült und das Filtrat wird mit Wasser auf 10 ml gebracht. Die Konzentration ist 1 mg/ml Phytinsäure. 2 ml werden für 1 Liter Lösungsmittel verwendet. Der pH des Lösungsmittels wird mit 10 N Schwefelsäure auf 4,10 +/– 0,05 eingestellt. Chromatographie wird durchgeführt, indem die Probe durch eine Hamilton PRP-1-reverse Phase-HPLC-Säule, erwärmt auf 40°C, mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute gepumpt wird. Die Detektion von Inositolphosphat wird mit einem Brechungsindex-Detektor (Waters), der wenigstens zwei (2) Minuten vor jedem Lauf automatisch auf null eingestellt wird, erreicht.
Die bestätigten transgenen Pflanzen mit hohem Phosphorgehalt werden auf diese Weise getestet. Einige, aber nicht alle, der Mutanten, die so evaluiert wurden, bewiesen niedrigen Phytatgehalt. Sequenzeschreibung

Sequenzprotokoll

Claims

Isoliertes Polynucleotid, kodierend für ein Polypeptid mit Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität, und umfassend: (a) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Polypeptid kodiert, das die Sequenz SEQ ID NO: 11 umfasst oder ein Komplement davon; (b) eine Polynucleotidsequenz mit einer Nucleinsäuresequenz, amplifiziert aus einer Zea-mays-Nucleinsäurebibliothek unter Verwendung der Primer von SEQ ID NOs: 12–13; (c) ein Polynucleotid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 10, wobei die %-Sequenzidentität auf der gesamten kodierenden Region basiert und durch das GAP-Programm bestimmt wird, wobei Gap Creation Penalty = 50 und Gap Extension Penalty = 3; (d) eine Polynucleotidsequenz, die für ein Fragment eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 11 kodiert, wobei das Fragment eine Deletion von 1 bis 10 Aminosäuren hat; oder ein Komplement von (a) oder (c).
Polynucleotid nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid DNA oder RNA ist.
DNA-Polynucleotid nach Anspruch 2, das die Sequenz von SEQ ID NO: 10 oder ein Komplement davon umfasst.
Isoliertes Polynucleotid aus Mais, das für Myoinositol-1-phosphat-Synthase kodiert.
Vektor, der die DNA-Sequenz von Anspruch 2 umfasst.
Expressionskassette, umfassend ein Polynucleotid nach Anspruch 1, funktionell verknüpft mit einem Promotor.
Expressionskassette nach Anspruch 6, wobei die Nucleinsäure in Antisense-Orientierung funktionell mit dem Promotor verknüpft ist.
Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 5.
Verfahren zur Herstellung eines Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Polypeptids, umfassend: Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen, die für die Expression des kodierten Polypeptids durch die Wirtszelle ausreichend sind, und Gewinnen des so produzierten Polypeptids.
Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die ein Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Polypeptid exprimiert, umfassend Transformieren oder Transfizieren der Zelle mit dem Vektor nach Anspruch 5, so dass die Zelle das Polypeptid exprimiert, das durch die cDNA, die im Vektor enthalten ist, kodiert wird.
Isoliertes Polypeptid, das Myoinositol-1-phosphat-Synthase-Aktivität aufweist und eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 95% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 11 hat, wobei die Sequenzidentität auf der gesamten Sequenz basiert und durch das GAP-Programm bestimmt wird, wobei Gap Creation Penalty = 12 und Gap Extension Penalty = 4.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 11, das wenigstens 95% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 11 aufweist und ein abgeleitetes Molekulargewicht von etwa 59,7 kDa besitzt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 12, dass die Sequenz SEQ ID NO: 11 umfasst.
Transgene Pflanze oder Pflanzenzelle, transformiert mit der DNA nach Anspruch 2, oder ein transgener Samen, produziert durch eine solche Pflanze.
Pflanze nach Anspruch 14 mit einer verringerten Konzentration an Phytinsäure oder einer erhöhten Konzentration an Nicht-Phytinsäurephosphor im Vergleich zu einer nicht-transformierten Elternpflanze.