DE69834246T2

DE69834246T2 - Fett acyl-coa: fettalkohol o-acyltransferasen

Info

Publication number: DE69834246T2
Application number: DE69834246T
Authority: DE
Inventors: Dennis Kathryn Woodland LARDIZABAL; George James Davis METZ; W. Michael Davis LASSNER
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1997-06-05
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2018-06-06
Also published as: EP0986647A1; CA2292768C; KR20010013426A; CN1301304A; JP4126102B2; US6596538B1; JP2002513293A; CN1255541C; DE69834246D1; WO1998055632A1; CA2292768A1; ATE323768T1; EP0986647B1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Jojoba-Acyl-Transferase, Verfahren zur Reinigung und Gewinnung einer solchen Jojoba-Acyl-Transferase, damit zusammenhängende Aminosäure- und Nucleinsäuresequenzen sowie Verfahren zur Verwendung einer solchen Jojoba-Acyl-Transferase bei gentechnischen Anwendungen.
Einführung
Hintergrund
Durch die Entwicklung von gentechnischen Methoden für Pflanzen ist es möglich, eine Vielzahl von Pflanzenspezies zu transformieren und zu regenerieren und dadurch Pflanzen mit neuen und wünschenswerten Eigenschaften zu erhalten. Ein interessanter Bereich für solche gentechnische Methoden bei Pflanzen ist die Produktion von wertvollen Produkten in Pflanzengeweben. Solche Anwendungen erfordern die Verwendung verschiedener DNA-Konstrukte und Nucleinsäuresequenzen zur Verwendung bei Transformationsereignissen unter Bildung von Pflanzen, die das gewünschte Produkt produzieren. Zum Beispiel sind für eine geeignete Expression von Gensequenzen pflanzenfunktionelle Promotoren erforderlich, wobei die Expression entweder in der gesamten Pflanze oder in ausgewählten Pflanzengeweben erfolgt. Außerdem werden häufig Selektionsmarkersequenzen verwendet, um das transformierte Pflanzenmaterial zu identifizieren. Solche Pflanzenpromotoren und Selektionsmarker liefern wertvolle Werkzeuge, die nützlich sind, um die neuen Pflanzen zu erhalten.
Ein wünschenswertes Ziel, das solche gentechnischen Methoden beinhaltet, ist die Fähigkeit zur Bereitstellung von Kulturpflanzen, die eine geeignete Quelle für Wachsester aufweisen. Wachsester sind in einer Vielzahl von industriellen Anwendungen erforderlich, wie in Pharmaka, Kosmetika, Waschmitteln, Kunststoffen und Gleitmitteln. Solche Produkte, insbesondere langkettige Wachsester, standen früher vom Pottwal, einer bedrohten Art, oder in letzter Zeit von dem Wüstenstrauch Jojoba zur Verfügung. Keine dieser Quellen sorgt für eine bequeme Zufuhr von Wachsestern. Um eine zuverlässige Quelle für solche Verbindungen zu erhalten, ist also eine Transformation von Kulturpflanzen, die sich in Bezug auf Wachstum, Ernte und Gewinnung von Produkten leicht manipulieren lassen, wünschenswert.
Um solche transformierten Pflanzen zu erhalten, müssen jedoch zuerst die Gene erhalten werden, die für die Biosynthese der gewünschten Wachsesterprodukte verantwortlich sind. Die Produktion von Wachsestern resultiert aus der Wirkung von wenigstens zwei enzymatischen Aktivitäten, Fettacyl-Reductase und Fettacyl:Fettalkohol-Acyltransferase oder Wachs-Synthase. Außerdem kann auch eine β-Ketoacyl-ACP-Synthase an der Wachsbiosynthese beteiligt sein, indem sie für sehr langkettige Fettacyl-CoA-Substrate für die enzymatische Reaktion der Reductase und der Wachs-Synthase sorgt. Voruntersuchungen mit solchen Enzymen und eine ausgedehnte Analyse und Reinigung einer Fettacyl-Reductase weisen darauf hin, dass diese Proteine mit Membranen assoziiert sind, doch das Enzym, das für die Fettacyl:Fettalkohol-Ligierungsreaktion in der Wachsbiosynthese verantwortlich ist, ist nicht gut charakterisiert. Eine weitere Untersuchung und letztlich Reinigung dieses Enzyms wird also benötigt, so dass die Gensequenzen, die die enzymatische Aktivität codieren, erhalten werden können.
Es ist daher wünschenswert, eine Reinigungsvorschrift zu erarbeiten, mit der das Wachs-Synthase-Protein erhalten werden kann und die Aminosäuresequenz bestimmt werden kann und/oder für die Wachs-Synthase spezifische Antikörper erhalten werden können. Auf diese Weise können die Durchmusterung einer Bibliothek, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder immunologische Techniken verwendet werden, um Klone zu identifizieren, die ein Wachs-Synthase-Protein exprimieren. Auf diese Weise erhaltene Klone können analysiert werden, so dass die Nucleinsäuresequenzen, die der Wachs-Synthase-Aktivität entsprechen, identifiziert werden. Dann können die Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen in Verbindung mit Fettacyl-Reductase-Proteinen, die entweder den transgenen Wirtszellen nativ sind oder durch Rekombinationstechniken zugeführt werden, für die Produktion von Wachsestern in Wirtszellen verwendet werden.
Relevante Literatur
Es wurde berichtet, dass zellfreie Homogenisate von sich entwickelnden Jojoba-Embryos Acyl-CoA-Fettalkohol-Acyl-Transferase-Aktivität aufweisen. Die Aktivität wurde mit einer aufschwimmenden Wachsschicht in Verbindung gebracht, das sich bei differentieller Zentrifugation bildete (Pollard et al. (1979) los. cit.; Wu et al. (1981) los. cit.).
Die Solubilisierung eines Multienzymkomplexes aus Euglena gracilis mit Fettacyl-SCoA-Transacylase-Aktivität wird von Wildner und Hallick berichtet (Abstract von The Southwest Consortium Fifth Annual Meeting, 22.-24. April 1990, Las Cruces, NM.).
Eine zehnfache Reinigung von Jojoba-Acyl-CoA:Alkohol-Transacylase-Protein wird von Pushnik et al. berichtet (Abstract von The Southwest Consortium Fourth Annual Meeting, 7. Februar 1989, Riverside, Ca.).
Ein Assay für Jojoba-Acyl-CoA:Alkohol-Transacylase-Aktivität wurde von Garver et al. berichtet (Analytical Biochemistry (1992) 207: 335-340).
WO 93/10241 betrifft Pflanzen-Fettacyl-CoA:Fettalkohol-O-Acyl-Transferasen. Ein Jojoba-57-kD-Protein wird als Jojoba-Fettacyl-CoA:Fettalkohol-O-Acyl-Transferase (Wachs-Synthase) identifiziert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung berichteten später, dass das 57-kD-Protein von Jojoba eine β-Ketoacyl-CoA-Synthase ist, die an der Biosynthese sehr langkettiger Fettsäuren beteiligt ist (Lassner et al., The Plant Cell (1996) 8: 281-292).
Die Photoaffinitätsmarkierung eines 57-kD-Jojobasamen-Polypeptids, das als Acyl-CoA:Fettalkohol-Acyl-Transferase postuliert wurde, wurde ebenfalls von Shockey et al. beschrieben (Plant Phys. (1995) 107: 155-160).
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt Ergebnisse der Analyse der Wachs-Synthase-Aktivität in Säulenfraktionen aus einer ersten Reinigungsvorschrift für Wachs-Synthase. 1A zeigt Ergebnisse einer Blue-A-Agarose-Chromatographie. 1B zeigt Ergebnisse einer Keramik-Hydroxyapatit-Chromatographie. 1C zeigt Ergebnisse einer Sephacryl^®-S-100-Ausschlusschromatographie. 1D zeigt Ergebnisse einer Hydroxyapatit-Chromatographie.
2 zeigt Ergebnisse der Analyse der Wachs-Synthase-Aktivität in Säulenfraktionen aus einer zweiten Reinigungsvorschrift für Wachs-Synthase. 2A zeigt Ergebnisse einer Blue-A-Agarose-Chromatographie. 2B zeigt Ergebnisse einer Hydroxyapatit-Chromatographie. 2C zeigt Ergebnisse einer Superdex^®-75-Ausschlusschromatographie.
3 zeigt die Nucleotidsequenz des PCR-Produkts ausgehend von den Primern WSPEP14-F1 und WSPEP33-R2 (3A) und die vollständige Nucleotidsequenz einer Fettacyl-CoA:Fettalkohol-O-Acyl-Transferase aus Jojoba, die aus 5'- und 3'-RACE-Produkten abgeleitet ist (3B).
4 zeigt die Autoradiographie einer DC-Platte, die den Einbau von 1-¹⁴C-16:0-CoA in Wachs in Assays der Sedimentfraktionen zeigt, die aus sich entwickelnden Samen von mit pCGN8559 transformiertem Arabidopsis hergestellt wurden. Eine Membranfraktion aus sich entwickelnden Jojoba-Samen bildet die positive Kontrolle. Die Hintergrundaktivität ist in den Assays der Arabidopsis-Pflanzen 8612-3 und 8613-2 gezeigt.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Jojoba-Fettacyl-CoA:Fettalkohol-O-Acyl-Transferase-Protein bereit (Fettalkohol-Acyl-Transferase, E.C.2.3.1.75), das bei der Bildung von Wachsester aktiv ist und von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das die Nucleinsäuresequenz von 3B umfasst. Diese Fettacyl-CoA:Fettalkohol-O-Acyl-Transferase wird hier auch als "Wachs-Synthase" oder "Wachs-Synthase der Erfindung" bezeichnet. Die Wachs-Synthase der Erfindung kann gegenüber einer Vielzahl von Fettacyl- und Fettalkoholsubstraten einschließlich Acyl-CoA und Acyl-ACP aktiv sein. Die Kohlenstoffkettenlänge dieser Substrate kann variieren, obwohl eine gegebene Wachs-Synthase eine Präferenz für Acyl- und Alkoholsubstrate mit einer speziellen Kettenlänge zeigen kann oder gegenüber einem weiten Bereich von Acyl- und Alkoholsubstraten in Bezug auf die Kohlenstoffkettenlänge aktiv sein kann.
Im Allgemeinen zeigt die Wachs-Synthase der Erfindung Aktivität gegenüber wenigstens solchen Acyl- und Alkoholsubstraten mit einer Kettenlänge von 8 bis 26 Kohlenstoffatomen, obwohl auch andere Acyl- oder Alkoholsubstrate getestet und weitere Aktivitäten gefunden werden können. Nachdem das Wachs-Synthase-Protein dieser Erfindung erhalten wurde, sind jetzt außerdem weitere Manipulationen möglich, die weiter unten im Einzelnen beschrieben werden. Diese Manipulationen können zur Produktion oder Auffindung anderer, verwandter Wachs-Synthasen führen.
In einem wichtigen Aspekt dieser Erfindung werden Nucleinsäuresequenzen bereitgestellt, die die Wachs-Synthase der Erfindung codieren. Es werden Verfahren beschrieben, mit denen diese Sequenzen identifiziert und aus den Aminosäuresequenzen des Wachs-Synthase-Proteins dieser Erfindung erhalten werden können. Verwendungen der Struktur-Gensequenzen zur Isolierung anderer Wachs-Synthase-Sequenzen sowie in rekombinanten Konstrukten zur Transcription von Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen und/oder Expression von Wachs-Synthase-Proteinen in Wirtszellen werden beschrieben.
Diese Erfindung umfasst also Jojoba-Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen und die entsprechenden Aminosäuresequenzen. Sie gibt weiterhin die Verwendung dieser Nucleinsäuresequenzen bei der Herstellung von Oligonucleotiden, die Wachs-Synthase codierende Sequenzen enthalten, zur Analyse und Gewinnung von Pflanzen-Wachs-Synthase-Gensequenzen an. Die Jojoba-Wachs-Synthase codierende Sequenz kann je nach Verwendungszweck eine vollständige oder partielle Sequenz codieren. Die ganze oder ein Teil der genomischen Sequenz oder cDNA-Sequenz wird in Betracht gezogen.
Die Erfindung stellt weiterhin ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereit, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Jojoba-Acyl-Transferase oder einen Teil davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie eine heterologe DNA-Sequenz, die natürlicherweise nicht mit der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz assoziiert ist, codiert.
Von speziellem Interesse sind rekombinante DNA-Konstrukte, die für eine Transcription oder Transcription und Translation (Expression) der Jojoba-Wachs-Synthase-Sequenzen sorgen. Insbesondere Konstrukte, die zur Transcription oder Transcription und Translation in Wirtspflanzenzellen befähigt sind, werden bevorzugt. Für einige Anwendungen kann eine Reduktion der Pflanzen-Wachs-Synthase wünschenswert sein. Es können also rekombinante Konstrukte gestaltet werden, die die Jojoba-Wachs-Synthase-Sequenzen in umgekehrter Orientierung für die Expression einer Antisense-Sequenz aufweisen, oder die Verwendung von Cosuppressionskonstrukten, die auch als "Transwitch"-Konstrukte bekannt sind, kann nützlich sein. Solche Konstrukte können eine Vielzahl von regulatorischen Bereichen enthalten, einschließlich Transcriptionsstartbereichen, die aus Genen erhalten werden, die präferentiell in Pflanzensamengewebe exprimiert werden. Für einige Verwendungen kann es wünschenswert sein, entweder die Transcriptions- und Translationsstartbereiche des Wachs-Synthase-Gens zusammen mit der Wachs-Synthase codierenden Sequenz zu verwenden oder die Transcription und Translation einer heterologen Sequenz zu steuern.
In noch einem anderen Aspekt bezieht sich diese Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung der Jojoba-Wachs-Synthase in einer Wirtszelle oder deren Nachkommen über die Expression eines Konstrukts in der Zelle. Zellen, die als Ergebnis der Produktion der die Jojoba-Wachs-Synthase codierenden Sequenz eine Wachs-Synthase enthalten, werden hier ebenfalls in Betracht gezogen. In solchen Konstrukten können auch andere Nucleinsäuresequenzen eingesetzt werden, die für Proteine codieren, die an der Produktion von Wachsestern und/oder verschiedenen Fettacyl-Spezies beteiligt sind.
Weiterhin kann erkannt werden, dass die Wachs-Synthase dieser Erfindung Anwendung bei der Produktion von Wachsestern in solchen Wirtszellen finden kann, die Fettacyl- und Fettalkoholsubstrate der Jojoba-Wachs-Synthase enthalten. Solche Wirtszellen können in der Natur vorkommen oder durch Transformation mit Nucleinsäurekonstrukten, die eine Fettacyl-Reductase codieren, erhalten werden. Eine Fettacyl-Reductase oder "Reductase" ist aktiv bezüglich der Katalyse der Reduktion einer Fettacylgruppe zu dem entsprechenden Alkohol. US 5,403,918 (beruht auf den US-Patentanmeldungen 07/659,975 (eingereicht am 22.2.91) und 07/767,251 (eingereicht am 27.9.91)) und US 5,370,996 (beruht auf der Anmeldung Nr. 07/920,430 (eingereicht am 31.7.92) betreffen solche Reductase-Proteine. Diese Informationen sind auch in WO 92/14816 zu finden. Außerdem sind hier auch noch andere Quellen für Wachs-Synthase-Proteine beschrieben, die ebenfalls wünschenswerte Quellen für Reductase-Proteine sind.
In diesem Aspekt der Erfindung werden insbesondere Pflanzenzellen in Betracht gezogen, die die bevorzugten Alkoholsubstrate der hier beschriebenen Jojoba-Wachs-Synthase enthalten. Ein Verfahren, um Pflanzenzellen mit bevorzugten Alkoholsubstraten der Jojoba-Wachs-Synthase zu versehen, bei dem die Zellen mit rekombinanten Nucleinsäurekonstrukten transformiert werden, die eine Fettacyl-Reductase-Nucleinsäuresequenz codieren, wird in Betracht gezogen. Wirtspflanzen, die normalerweise keine wesentlichen Mengen der von Wachs-Synthase genutzten Alkoholsubstrate enthalten, können also mit einem Reductase-Konstrukt transformiert werden, so dass die Alkohole produziert werden. Auf diese Weise bilden die in der Wirtszelle vorhandenen Fettacylgruppen auch die Quelle für das Fettalkoholsubstrat, das von Wachs-Synthase bei der Synthese von Wachsestern genutzt wird. Je nach den Spezifitäten der Wachs-Synthase- und Reductase-Proteine erkennt man, dass auf diese Weise Pflanzenzellen erhalten werden können, die eine Vielzahl von wünschenswerten Wachsesterprodukten produzieren. Solche Produkte haben je nach der Kettenlänge und dem Sättigungsgrad des Fettalkohols und der Fettacylgruppen unterschiedliche Eigenschaften. Die gemäß den vorliegenden Verfahren produzierten Wachsesterprodukte können also aus den Wirtszellen gewonnen werden.
Diese Erfindung betrifft auch die modifizierten Zellen, die die obigen rekombinanten DNA-Konstrukte umfassen, insbesondere Pflanzenzellen und Samenzellen, die durch Expression der Jojoba-Wachs-Synthase-Sequenzen und -Proteine dieser Erfindung erhalten werden.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Jojoba-Wachs-Synthase bereitgestellt, die aktiv bezüglich der Katalyse der Veresterung eines Fettalkohols durch eine Fettacylgruppe unter Bildung eines Wachsesters ist und von einem Nucleinsäuremolekül codiert wird, das die Nucleinsäuresequenz von 3B umfasst. Proteine, die solche enzymatischen Reaktionen durchführen, sind als Fettacyl-CoA:Fettalkohol-Acyl-Transferase (Fettalkohol-Acyl-Transferase, E.C.2.3.1.75) bekannt.
Obwohl sie typischerweise als Acyl-CoA:Alkohol-Acyl-Transferase bezeichnet wird, kann die Wachs-Synthase dieser Erfindung auch Aktivität gegenüber einer Vielzahl von Acylsubstraten einschließlich Fettacyl-CoA und Fettacyl-ACP-Molekülen zeigen. Außerdem können sowohl die Acyl- als auch die Alkoholsubstrate, auf die die Wachs-Synthase einwirkt, verschiedene Kohlenstoff-Kettenlängen und Sättigungsgrade haben, obwohl die Wachs-Synthase präferentielle Aktivität gegenüber bestimmten Molekülen zeigen kann.
Viele verschiedene Organismen produzieren Wachsester aus Alkohol- und Acylsubstraten. Zum Beispiel produzieren Pflanzen epidermales oder kutikuläres Wachs (Kolattukudy (1980) in The Biochemistry of Plants (Stumpf, P.K. und Conn, E.E., Hrsg.), Band 4, S. 571-645), und der Wüstenstrauch Jojoba produziert ein Samenspeicherwachs (Ohlrogge et al. (Lipids (1978) 13: 203-210). Wachssynthese wurde auch bei verschiedenen Bakterienspezies, wie Acinetobacter (Fixter et al. (1986), J. Gen. Microbiol. 132: 3147-3157) und Micrococcus (Lloyd (1987), Microbios 52: 29-37), und bei dem Einzeller Euglena (Khan und Kolattukudy (1975), Arch. Biochem. Biophys. 170: 400-408) beschrieben. Außerdem wurde über eine Wachsproduktion und Wachs-Synthase-Aktivität bei mikrosomalen Präparaten aus Meibomschen Drüsen von Rindern (Kolattukudy et al. (1986), J. Lipid Res. 27: 404-411), Vogel-Bürzeldrüsen und verschiedenen Insekten und Meeresorganismen berichtet.
Um eine zuverlässige Quelle für ein Wachs-Synthase-Protein zur Verwendung in Veresterungsreaktionen zu erhalten, ist es wünschenswert, mit der Wachs-Synthase assoziierte Nucleinsäuresequenzen zu isolieren, so dass diese Sequenzen für die Produktion des Wachs-Synthase-Enzyms in Wirtszellen kloniert werden können. Zum Beispiel kann man Nucleinsäuresequenzen, die ein Wachs-Synthase-Protein codieren, in Vektoren für die Expression in E.-coli-Zellen klonieren, um eine leicht verfügbare Quelle für das Wachs-Synthase-Protein zu erhalten. Das so produzierte Wachs-Synthase-Protein kann auch verwendet werden, um Antikörper gegen Wachs-Synthase-Proteine zur Verwendung bei der Identifizierung und Reinigung von verwandten Wachs-Synthase-Proteinen aus verschiedenen Quellen, insbesondere aus Pflanzen, zu erzeugen. Außerdem kann eine weitere Untersuchung des Wachs-Synthase-Proteins zu Reaktionen der ortsspezifischen Mutagenese führen, um seine katalytischen Eigenschaften weiter zu charakterisieren und zu verbessern oder seine Fettalkohol- oder Fettacyl-Substratspezifität zu verändern. Eine Wachs-Synthase mit veränderter Substratspezifität kann Anwendung in Verbindung mit anderen FAS-Enzymen finden.
Vor der vorliegenden Erfindung waren Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen von Wachs-Synthase-Proteinen nicht bekannt. Um die mit Wachs-Synthase assoziierten Nucleinsäuresequenzen zu erhalten, war es also notwendig, das Protein zuerst aus einer verfügbaren Quelle zu reinigen und wenigstens eine partielle Aminosäuresequenz zu bestimmen, so dass geeignete Sonden hergestellt werden konnten, die für die Isolierung von Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen geeignet sind.
Der Wüstenstrauch Simmondsia chinensis (Jojoba) wurde als Quelle eines in Frage kommenden Wachs-Synthase-Proteins identifiziert. Erste Studien zeigen, dass die Jojoba-Wachs-Synthase ein integrales Membranprotein hydrophober Natur ist. Im Allgemeinen sind membranassoziierte Proteine schwierig zu reinigen, da sie häufig ihre enzymatische Aktivität verlieren, wenn sie in Lösung gebracht, d.h. aus der Membranumgebung, in der sie normalerweise funktionieren, gelöst werden. Zu den Techniken, die verwendet werden, um integrale Membranproteine in Lösung zu bringen, gehört die Zugabe von Detergentien oder organischen Lösungsmitteln zu einem Präparat einer geeigneten Membranfraktion. Dann können weitere herkömmliche Reinigungstechniken, wie Fällung, Ionenaustausch, Gelfiltration und Affinitätschromatographie, verwendet werden, wobei man annimmt, dass das gewünschte Protein seine funktionelle Aktivität, die mit Hilfe eines speziellen enzymatischen Assays gemessen werden kann, noch beibehält.
Als erster Schritt zur Gewinnung eines solubilisierten Membranproteins ist typischerweise ein mikrosomales Membranpräparat, das Wachs-Synthase-Aktivität umfasst, erwünscht. Standardpräparate für mikrosomale Membran verwenden differentielle Zentrifugation eines zellfreien Homogenisats (CFH), was eine Membranfraktion ergibt, die frei von ganzen Zellen, Zellkernen und löslichem Protein ist. (Siehe zum Beispiel Moore et al. (1987), Biological Membranes: A Practical Approach, S. 37-72, Hrsg. Finalay und Evans.) Bei Ölsamen ergeben die ersten Zentrifugationsschritte typischerweise ein Sediment, einen Überstand und eine aufschwimmende Ölschicht, und dann können durch weitere Zentrifugation des Überstands mikrosomale Membranen gewonnen werden.
In US 5,403,918 ist eine Vorschrift beschrieben, durch die eine Jojoba-Membranfraktion mit guter Ausbeute der Enzymaktivität erhalten wurde, die mit Fettacyl-Reduktase, einem weiteren Enzym, das an der Bildung von Wachsestern in Jojoba beteiligt ist, assoziiert ist. Das Verfahren stellt auch Membranfraktionen mit Wachs-Synthase-Aktivität bereit, wie es im Einzelnen in den folgenden Beispielen beschrieben ist. Außerdem sind Präparate mikrosomaler Membranen aus Jojoba auch bei Lassner et al. (loc. cit.) beschrieben. Dem Fachmann sind noch weitere Verfahren bekannt, die verwendet werden können, um ähnliche Membranpräparate zu erhalten. Außerdem sind Verfahren zur Bestimmung der Wachs-Synthase-Aktivität in solchen Präparaten in Beispiel 1 beschrieben.
Ein kritisches Stadium für die weitere Enzymcharakterisierung und -reinigung ist das Stadium der Gewinnung von solubilisiertem Wachs-Synthase-Protein, das aus seiner nativen Lipiddoppelschichtmembran-Umgebung abgetrennt wird, aber messbare enzymatische Wachs-Synthase-Aktivität in erheblichem Ausmaß beibehält. Die Entfernung von integralen Membranproteinen aus der Lipiddoppelschicht erfolgt typischerweise unter Verwendung von amphiphilen Detergentien in wässriger Lösung, obwohl in manchen Fällen auch organische Lösungsmittel verwendet wurden. Dem Fachmann sind viele verschiedene Detergentien und Verfahren zur Solubilisierung von Membranproteinen bekannt, und eine Übersicht gibt es auch von Neugebauer (Methods Enzymol. (1990) 182: 239-253) und Hjelmiland (Methods Enzymol. (1990) 182: 253-264).
Häufig stellt sich heraus, dass Detergentien, die zum Solubilisieren von Membranproteinen verwendet werden, die enzymatische Aktivität eines gewünschten Proteins hemmen. Mehrere Detergentien wurden auf Solubilisierung von Jojoba-Wachs-Synthase getestet, einschließlich CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat), von dem in US 5,403,918 nachgewiesen wurde, dass es für die Reinigung einer Fettacyl-Reductase aus Jojoba geeignet ist. Es zeigte sich, dass alle die enzymatische Wachs-Synthase-Aktivität hemmen. Obwohl oberhalb der CMC (kritischen Micellenkonzentration) eine starke Hemmung durch CHAPS beobachtet wurde, zeigte sich, dass die Zugabe von Phospholipiden (PL), wie L-Phosphatidylcholin, und die Einstellung der CHAPS- Konzentration von 1,0% auf 0,2%, d.h. unterhalb der CMC, zur Rekonstitution eines Teils der Wachs-Synthase-Aktivität führt. Die primäre Anforderung für die Rekonstitution der Wachs-Synthase-Aktivität ist die Gegenwart von Phospholipiden während der Entfernung oder Verdünnung des Detergens, so dass das Wachs-Synthase-Protein in Phospholipidvesikel eingebaut wird. Dies unterscheidet sich von der Vorschrift, die für die Rekonstitution von Jojoba-Reductase-Aktivität entwickelt wurde, welche keine Zugabe von Phospholipiden erfordert. Wenn also Phospholipide in einem Wachs-Synthase-Präparat, wie demjenigen aus einer mikrosomalen Membranfraktion, vorhanden sind, kann die Aktivität einfach dadurch nachgewiesen werden, dass man das Detergens entfernt oder verdünnt. Bei weiter gereinigten Wachs-Synthase-Präparaten müssen jedoch Phospholipide hinzugefügt werden, um die Aktivität nachzuweisen. Eine optimale Aktivitätsausbeute wird erhalten, wenn das Verhältnis von CHAPS zu PL in dem Assay 2,8/1 (w/w) beträgt. Ein Verfahren zur Rekonstitution und Bestimmung der Wachs-Synthase-Aktivität in solubilisierten Wachs-Synthase-Präparaten ist in Beispiel 1 beschrieben.
Nachdem man ein solubilisiertes Wachs-Synthase-Protein erhalten hat, erkennt man, dass jetzt weitere Experimente zur Charakterisierung des Enzyms hinsichtlich seiner Substratspezifität, Cofaktoranforderungen und möglichen aktivitätshemmenden Mitteln durchgeführt werden können. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass die Jojoba-Wachs-Synthase dieser Erfindung ein breites Spektrum von Acylsubstraten hat, einschließlich Acyl-ACP- und Acyl-CoA-Molekülen. Außerdem können die Acyl- und Fettalkoholsubstrate einen breiten Größenbereich in Bezug auf die Kohlenstoffkettenlänge haben. Zum Beispiel wurde die Aktivität unter Verwendung von Substraten mit Kohlenstoffkettenlängen von C12 bis C24 getestet, und es zeigte sich, dass alle von dem Enzym genutzt werden. Außerdem zeigte sich eine Aktivität gegenüber Fettacyl und Fettalkoholen mit verschiedenen Unsättigungsgraden.
Chromatographische Techniken können verwendet werden, um angereicherte Präparate von Pflanzen-Wachs-Synthase zu erhalten. Ein solcher Reinigungsschritt beinhaltet eine Chromatographie über eine immobilisierte Reaktivfarb stoffmatrix, wie Cibacron^® Blue F3GA (Blue A), das in dieser Erfindung verwendet wird. Die Jojoba-Wachs-Synthase-Aktivität bindet an eine solche Säule, wenn sie in einem Puffer vorliegt, der ungefähr 0,3 M NaCl enthält, während mehr als ungefähr 85% des anderen Proteins durchläuft oder in anschließenden Waschvorgängen entfernt wird. Wie in US 5,403,918 beschrieben ist, wird unter solchen Bedingungen auch Reductase-Aktivität an die Blue-A-Säule gebunden. Es wird hier nachgewiesen, dass ungefähr 70% der auf eine Blue-A-Säule geladenen Wachs-Synthase-Aktivität durch Elution mit einer Waschlösung aus 2,0 M NaCl-Puffer zurückgewonnen werden kann. Das Jojoba-Reductase- und das β-Ketoacyl-CoA-Synthase(KCS)-Protein sind ebenfalls in diesem Blue-A-Eluat vorhanden.
Eine weitere Reinigung des Blue-A-Eluats wird erhalten, indem man die Probe auf eine Säule mit kristallinem Hydroxyapatit (HA) lädt. Wachs-Synthase-Aktivität bindet nicht an die Säule und findet sich im Eluat und der Waschlösung. Der größte Teil der Reductase- und KCS-Aktivität bindet an die Säule, wie auch der größte Teil des Proteins in der Probe. Die in Bezug auf Wachs-Synthase-Aktivität angereicherte HA-Fraktion kann für Ausschlusschromatographie verwendet werden, und unter Verwendung einer Superdex^®-75-Ausschlusssäule wird das Molekulargewicht des Jojoba-Wachs-Synthase-Proteins auf 48 kD geschätzt.
Unter Verwendung solcher Reinigungstechniken kann das Jojoba-Wachs-Synthase-Protein als im Wesentlichen gereinigtes Proteinpräparat gewonnen werden, und die Aminosäuresequenz kann erhalten werden. Ähnlich würde man aufgrund der hydrophoben Natur der Fettalkoholsubstrate von Wachs-Synthase-Enzymen auch bei anderen Wachs-Synthasen voraussagen, dass sie in ihren nativen Zellen mit Membranen assoziiert sind, und somit können die hier für Jojoba-Wachs-Synthase beschriebenen Reinigungstechniken auch für die Gewinnung eines gereinigten Präparats anderer Wachs-Synthase-Proteine geeignet sein.
Zum Beispiel produziert Euglena gracilis Wachse über die enzymatischen Wirkungen einer Fettacyl-CoA-Reductase und einer Fettacyl-CoA-Alkohol-Transacylase oder Wachs-Synthase. Typischerweise werden in diesem Organismus Wachse mit Kohlenstoffkettenlängen im Bereich von 24-32 nachgewiesen. Wie es oben für Jojoba beschrieben wurde, kann das Euglena-Wachs-Synthase-Enzym mit Hilfe einer CHAPS/NaCl-Lösung in Lösung gebracht werden, und ein partiell gereinigtes Wachs-Synthase-Präparat wird durch Farbstoff-Ligand-, HA- und Ausschlusschromatographie erhalten.
Von Acinetobacter-Spezies ist ebenfalls bekannt, dass sie Wachsesterzusammensetzungen produzieren, obwohl der Mechanismus nicht gut definiert ist. Wie hier beschrieben ist, wird in Acinetobacter-Spezies eine Fettacyl-CoA-Alkohol-Transacylase- oder Wachs-Synthase-Aktivität nachgewiesen. Die Wachs-Synthase-Aktivität wird in CHAPS/NaCl in Lösung gebracht, durch Blue-A-Säulenchromatographie angereichert und kann unter Verwendung von Techniken wie Ausschlusschromatographie weiter gereinigt werden.
Um Nucleinsäuresequenzen zu erhalten, die die Wachs-Synthase der vorliegenden Erfindung codieren, wird die Bande, die das gereinigte Protein enthält, aus einem SDS-Gel herausgeschnitten, um sie in Aminosäure-Sequenzierungsreaktionen zu verwenden. Im Gegensatz zu bequemeren Verfahren, wie Übertragung des Proteins auf Nitrocellulose- oder Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Membranen, wurde ein Verdau im Gel verwendet, weil keine Bedingungen gefunden wurden, unter denen das Jojoba-Wachs-Synthase-Protein auf solche Membranen übertragen und gebunden werden konnte. Ein kommerzielles Labor, W.M. Keck Foundation/Yale University, wurde mit Gelschnitten, die gereinigtes Jojoba-Wachs-Synthase-Protein enthalten, zur Verwendung bei der Bestimmung von Aminosäuresequenzen des Jojoba-Proteins durch Verdau im Gel und anschließende Proteinsequenzierung versorgt. Die auf diese Weise erzeugten Peptidsequenzen können in PCR-Gen-Isolierungstechniken und cDNA-Bibliothek-Screening verwendet werden, wie es in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist.
Weitere Experimente zur Bestätigung der Identität der Wachs-Synthase können ebenfalls wünschenswert sein, wie die Expression des Proteins in E, coli. Dann kann die Wachs-Synthase in solchen Zellen auf Fettacyl- und Fettalkoholsubstrate einwirken, wobei Wachsester entstehen, die mit verschiedenen Analyseverfahren nachgewiesen werden können. Wenn die Wirtszellen das Alkoholsubstrat der Wachs-Synthase nicht enthalten, kann die Aktivität durch Testen von Zellextrakten überprüft werden. Alternativ dazu kann ein Wachs-Synthase-Protein auch durch invitro-Translation unter Verwendung von Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen und kommerziell erhältlichen Translations-Kits hergestellt werden. Eine Zugabe von mikrosomalen Membranpräparaten zu der in-vitro-Translationsprobe kann notwendig sein, um aktives Wachs-Synthase-Protein zu erhalten, wenn das Einfügen in die Membran für die Aktivität entscheidend ist. Weitere Tests können immunologische Assays beinhalten, wodurch für das in Frage kommende Protein spezifische Antikörper hergestellt werden und sich zeigt, dass sie die Wachs-Synthase-Aktivität in Proteinpräparaten hemmen.
Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist, werden Nucleinsäuresequenzen also unter Verwendung von Aminosäuresequenzen isoliert, die für die mit Wachs-Synthase-Aktivität assoziierten Proteine bestimmt werden, sowohl, um die Identität eines Wachs-Synthase-Proteins zu bestätigen, als auch, um für eine Transcription der Sequenzen und/oder eine Expression des Proteins in Wirtszellen, entweder prokaryontischen oder eukaryontischen, zu sorgen.
Da die Wachs-Synthase ein membrangebundenes Protein ist, kann es wünschenswert sein, ein in Frage kommendes Protein in einer Pflanzenzelle zu exprimieren, um die Aktivität zu überprüfen. Elektroporation oder Bombardierung von Pflanzengewebe für eine transiente Expression können für diesen Zweck geeignet sein. Letztlich wünscht man eine stabile Expression in einer Pflanze, die Substrate produziert, die von diesem Enzym erkannt werden. Wenn eine Pflanze, die für die Transformation mit Wachs-Synthase-Sequenzen ins Auge gefasst wurde, die Fettalkohol- und Fettacylester-Substrate dieses Enzyms natürlicherweise nicht enthält, kann ein Pflanzenextrakt hergestellt und auf Wachs-Synthase-Aktivität getestet werden, indem man Substrate der Wachs-Synthase zu dem Extrakt gibt. Konstrukte und Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Wirten mit Wachs-Synthase-Sequenzen sind im Folgenden ausführlicher diskutiert.
Nucleinsäuren, die für die Wachs-Synthase dieser Erfindung codieren, können die Nucleinsäuresequenz von 3B umfassen. Es kann sich um genomische oder cDNA handeln, und sie können aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken oder direkt aus isolierter Pflanzen-DNA isoliert werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist also ein rekombinantes DNA-Konstrukt, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Jojoba-Acyl-Transferase oder einen Teil gemäß der obigen Definition sowie eine heterologe DNA-Sequenz, die natürlicherweise nicht mit der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz assoziiert ist, codiert. Wie in den folgenden Beispielen ausführlicher beschrieben ist, wird hier ein Verfahren zur Gewinnung der Nucleinsäuresequenz für die Jojoba-Wachs-Synthase durch PCR aus Primern, die für die offenbarte Jojoba-Wachs-Synthase-Peptide spezifisch sind, bereitgestellt.
Zu den Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen dieser Erfindung gehören solche, die dem Jojoba-Wachs-Synthase-Protein entsprechen. "Entsprechen" bedeutet Nucleinsäuresequenzen, entweder DNA oder RNA, einschließlich solcher, die Jojoba-Wachs-Synthase-Protein oder einen Teil davon, der in Bezug auf die Bildung von Wachsester aktiv ist, codieren. Das rekombinante DNA-Konstrukt der Erfindung kann weiterhin regulatorische Sequenzen, die sich 5' oder 3' von den codierenden Sequenzen befinden und die die Transcription oder Transcription und Translation (Expression) der Wachs-Synthase in Jojoba-Embryos steuern, Intronsequenzen, die in der cDNA nicht vorhanden sind, sowie Sequenzen, die irgendein Leader- oder Signalpeptid eines Vorläufer-Wachs-Synthase-Proteins codieren, das für das Einsetzen in die Membran des Endoplasmatischen Retikulums erforderlich sein kann, aber im reifen Wachs-Synthase-Enzym nicht gefunden wird, umfassen.
Die Jojoba-Wachs-Synthase-Aminosäuresequenz kann alternativ dazu auch in einem anderen Organismus identifiziert und isoliert werden, wobei man als Sonden Jojoba-Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen oder Antikörper, die gegen das Jojoba-Wachs-Synthase-Protein hergestellt wurden, verwendet. Auf diese Weise erkennt man, dass Sequenzen dieser anderen Wachs-Synthasen in ähnlicher Weise verwendet werden können, um mit Wachs-Synthase-Proteinen assoziierte Nucleinsäuresequenzen aus anderen Quellen zu isolieren.
Für die Isolierung von Nucleinsäuresequenzen können cDNA- oder genomische Bibliotheken unter Verwendung von Plasmid- oder viralen Vektoren und dem Fachmann wohlbekannten Techniken hergestellt werden. Geeignete Nucleinsäurehybridisierungsverfahren und immunologische Verfahren, die zur Suche nach den gewünschten Sequenzen verwendet werden können, sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und werden zum Beispiel bei Maniatis et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) angegeben.
Typischerweise zeigt eine Sequenz, die unter Verwendung von Nucleinsäuresonden erhältlich ist, 60-70% Sequenzidentität zwischen der Zielsequenz und der gegebenen Sequenz, die das interessierende Wachs-Synthase-Enzym codiert. Lange Sequenzen mit einer Sequenzidentität von nur 50-60% können aber auch erhalten werden. Die Nucleinsäuresonde kann ein langes Fragment der Nucleinsäuresequenz sein, oder es kann auch eine kürzere, Oligonucleotidsonde, sein. Wenn längere Nucleinsäurefragmente als Sonden verwendet werden (mehr als etwa 100 bp), kann man das Screening mit einer geringeren Stringenz durchführen, um Sequenzen aus der Zielprobe zu erhalten, die eine Abweichung von 20-50% (d.h. eine Sequenzhomologie von 50-80%) gegenüber den als Sonde verwendeten Sequenzen haben. Oligonucleotid-Sonden können beträchtlich kürzer als die vollständige, ein Wachs-Synthase-Enzym codierende Nucleinsäuresequenz sein, sollten aber wenigstens etwa 10, vorzugsweise wenigstens etwa 15 und noch mehr bevorzugt wenigstens etwa 20 Nucleotide haben. Wenn im Gegensatz zu längeren Regionen kürzere Regionen verwendet werden, ist ein höherer Grad der Sequenzidentität erwünscht. Somit kann es wünschenswert sein, aktive Zentren des Enzyms zu identifizieren, wo die Aminosäuresequenzidentität hoch ist, um Oligonucleotid-Sonden für den Nachweis von homologen Genen zu entwerfen.
Um zu bestimmen, ob ein verwandtes Gen durch Hybridisierung mit einer gegebenen Sequenz isoliert werden kann, wird die Sequenz markiert, um einen Nachweis, typischerweise unter Anwendung von Radioaktivität, zu ermöglichen, obwohl auch andere Verfahren verfügbar sind. Die markierte Sonde wird zu einer Hybridisierungslösung gegeben und mit Filtern, die die gewünschten Nucleinsäuren enthalten, entweder Northern- oder Southern-Blots (zur Suche nach gewünschten Quellen für die Homologie), oder den Filtern, die zu suchende cDNA oder genomische Klone enthalten, inkubiert. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen können dahingehend variiert werden, dass die Hybridisierung der Sonde mit den interessierenden Sequenzen optimiert wird. Niedrigere Temperaturen und höhere Salzkonzentrationen ermöglichen eine Hybridisierung entfernter verwandter Sequenzen (niedrige Stringenz). Wenn unter Bedingungen einer niedrigen Stringenz die Hintergrund-Hybridisierung ein Problem darstellt, kann die Temperatur entweder im Hybridisierungs- oder im Waschschritt erhöht und/oder der Salzgehalt erniedrigt werden, um den Nachweis der speziellen hybridisierenden Sequenz zu verbessern. Die Hybridisierungs- und die Waschtemperatur können auf der Grundlage der geschätzten Schmelztemperatur der Sonde eingestellt werden, wie in Beitz et al. (Methods in Enzymology (1983) 100: 266-285) diskutiert wird.
Wenn eine geeignete Sonde und geeignete Hybridisierungs- und Waschbedingungen identifiziert wurden, wie es oben beschrieben ist, werden cDNA- oder genomische Bibliotheken durchmustert, wobei man die markierten Sequenzen und optimierte Bedingungen verwendet. Die Bibliotheken werden zuerst aus einem festen Agarmedium ausgestrichen, und die DNA wird auf eine geeignete Membran, gewöhnlich Nitrocellulose- oder Nylonfilter, übertragen. Diese Filter werden dann mit der markierten Sonde hybridisiert und gewaschen, wie es oben diskutiert ist, um Klone zu identifizieren, die die verwandten Sequenzen enthalten.
Für die immunologische Durchmusterung können Antikörper gegen die Jojoba-Wachs-Synthase hergestellt werden, indem man Kaninchen oder Mäusen das gereinigte Protein injiziert. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind dem Fachmann wohlbekannt, und Firmen, die sich auf die Antikörperproduktion spezialisiert haben, stehen ebenfalls zur Verfügung. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt werden, obwohl polyklonale Antikörper für die Gen-Isolierung typischerweise besser geeignet sind.
Um gewünschte Pflanzenspezies zu durchmustern, wird eine Western-Analyse durchgeführt, um zu bestimmen, dass in einem Rohextrakt der gewünschten Pflanzenspezies ein verwandtes Protein vorhanden ist, das mit den Antikörpern gegen die Jojoba-Wachs-Synthase kreuzreagiert. Dies wird durch nach einer Elektrophorese erfolgende Immobilisierung der Pflanzenextraktproteine auf einer Membran, gewöhnlich Nitrocellulose, und Inkubation mit dem Antikörper erreicht. Zum Nachweis des Antikörper/Protein-Komplexes auf den Nitrocellulosefiltern stehen viele verschiedene Systeme zur Verfügung, einschließlich der radioaktiven Markierung des Antikörpers und Konjugatsystemen von zweitem Antikörper/Enzym. Einige der verfügbaren Systeme wurden von Oberfelder beschrieben (Focus (1989) BRL/Life Technologies, Inc. 11: 1-5). Wenn in den ersten Experimenten kein verwandtes Protein nachgewiesen wird, können andere Nachweissysteme und Blockierungsmittel verwendet werden. Wenn eine Kreuzreaktivität beobachtet wird, können Gene, die die verwandten Proteine codieren, isoliert werden, indem man Expressionsbibliotheken durchmustert, die die gewünschte Pflanzenspezies darstellen. Expressionsbibliotheken können in einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Vektoren aufgebaut werden, einschließlich Lambda gt11, wie es bei Maniatis et al. (loc. cit.) beschrieben ist.
Dann werden die Klone, die gemäß der obigen Beschreibung unter Verwendung von DNA-Hybridisierungs- oder immunologischen Screening-Techniken identifiziert wurden, gereinigt, und die DNA wird mit bekannten Techniken isoliert und analysiert. Auf diese Weise wird überprüft, dass die Klone ein verwandtes Wachs-Synthase-Protein codieren. Andere Wachs-Synthasen können erhalten werden, indem man die "neue" Wachs-Synthase in derselben Weise verwendet, wie die Jojoba-Wachs-Synthase verwendet wurde.
Der Fachmann wird sich darüber im Klaren sein, dass die Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenz dieser Erfindung mit Hilfe von Standardtechniken der ortsspezifischen Mutation oder PCR modifiziert werden kann, oder eine Modifizierung der Sequenz kann erreicht werden, indem man eine synthetische Nucleinsäuresequenz herstellt. Diese modifizierten Sequenzen werden ebenfalls als eine Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenz dieser Erfindung angesehen. Zum Beispiel können Wobble-Positionen in Codons geändert werden, so dass die Nucieinsäuresequenz dieselbe Aminosäuresequenz codiert, oder alternativ dazu können Codons so geändert werden, dass konservative Aminosäuresubstitutionen resultieren. In beiden Fällen behält das Peptid oder Protein die gewünschte enzymatische Aktivität bei.
Eine Nucleinsäuresequenz eines Wachs-Synthase-Enzyms dieser Erfindung kann eine DNA- oder RNA-Sequenz sein, die von genomischer DNA, cDNA, mRNA abgeleitet ist oder ganz oder zum Teil synthetisiert werden kann. Die Gensequenzen können zum Beispiel kloniert werden, indem man genomische DNA aus einer geeigneten Quelle isoliert und die interessierende Sequenz unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert und kloniert. Alternativ dazu können die Gensequenzen auch entweder vollständig oder zum Teil synthetisiert werden, insbesondere wenn es wünschenswert ist, von Pflanzen bevorzugte Sequenzen zu erhalten. Somit kann das gesamte oder ein Teil des gewünschten Struktur-Gens (der Teil des Gens, der das Wachs-Synthase-Protein codiert), unter Verwendung von Codons synthetisiert werden, die von einem ausgewählten Wirt bevorzugt werden. Vom Wirt bevorzugte Codons können beispielsweise aus den Codons bestimmt werden, die am häufigsten bei den Proteinen verwendet werden, die in einer gewünschten Wirtsspezies exprimiert werden.
Die mit Wachs-Synthase-Proteinen assoziierten Nucleinsäuresequenzen sind vielseitig verwendbar. Zum Beispiel können rekombinante Konstrukte hergestellt werden, die als Sonden verwendet werden können oder für eine Expression des Wachs-Synthase-Proteins in Wirtszellen sorgen. Je nach Verwendungszweck können die Konstrukte die Sequenz, die für die gesamte Wachs-Synthase codiert, oder einen Teil davon enthalten. Zum Beispiel können kritische Bereiche der Wachs-Synthase, wie ein aktives Zentrum, identifiziert werden. So können weitere Konstrukte hergestellt werden, die nur einen Teil der Wachs-Synthase-Sequenz enthalten, der die Aminosäuren codiert, die für eine gewünschte Wachs-Synthase-Aktivität notwendig sind.
Zu den geeigneten Systemen für eine Expression der Wachs-Synthase-Sequenzen dieser Erfindung gehören prokaryontische Zellen, wie E. coli, Hefezellen und Pflanzenzellen, wobei sowohl Gefäßpflanzenzellen als auch Zellen von gefäßlosen Pflanzen erwünschte Wirte sind. Auf diese Weise kann das Wachs-Synthase-Protein produziert werden, um weitere Studien zu ermöglichen, wie ortsspezifische Mutagenese von codierenden Sequenzen, um die Wirkungen von spezifischen Mutationen auf reaktive Eigenschaften des Wachs-Synthase-Proteins zu analysieren.
Die DNA-Sequenz, die eine Wachs-Synthase dieser Erfindung codiert, kann auf vielerlei Weise mit Fremd-DNA-Sequenzen kombiniert werden. "Fremd"-DNA-Sequenzen bedeutet jede DNA-Sequenz, die man natürlicherweise nicht mit der Wachs-Synthase-Sequenz verknüpft findet, einschließlich DNA-Sequenzen von demselben Organismus, die man natürlicherweise nicht mit Jojoba-Wachs-Synthase-Sequenzen verknüpft findet. Sowohl Sense- als auch Antisense-Konstrukte, bei denen Wachs-Synthase codierende Sequenzen verwendet werden, werden in Betracht gezogen, wobei Sense-Sequenzen für die Expression von Wachs-Synthase in einer Wirtszelle verwendet werden können und Antisense-Sequenzen verwendet werden können, um die endogenen Konzentrationen eines homologen Wachs-Synthase-Proteins, das von einem Zielorganismus natürlicherweise produziert wird, zu senken. Außerdem können die Wachs-Synthase-Gensequenzen dieser Erfindung auch in einem fremden Wirt in Verbindung mit allen oder einem Teil der Sequenzen, die normalerweise mit der Wachs-Synthase assoziiert sind, wie regulatorischen oder Membran-Zielsteuerungssequenzen, eingesetzt werden.
In ihren Komponententeilen wird eine DNA-Sequenz, die Wachs-Synthase codiert, in einem rekombinanten Konstrukt kombiniert, das in der 5'→3'-Transcriptionsrichtung einen Transcriptionsinitiations-Kontrollbereich, der die Transcription und Translation in einer Wirtszelle fördern kann, die Wachs-Synthase codierende Nucleinsäuresequenz und einen Transcriptionsterminationsbereich aufweist. Je nach dem Wirt werden die regulatorischen Bereiche variieren und können Bereiche aus viralen, Plasmid- oder chromosomalen Genen umfassen. Für die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Mikroorganismen, insbesondere einzelligen Wirten, kann eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Promotoren eingesetzt werden. Die Expression in einem Mikroorganismus kann eine leicht verfügbare Quelle für das Pflanzenenzym liefern. Zu den Transcriptionsstartbereichen, die beschrieben wurden, gehören Bereiche aus bakteriellen und Hefewirten, wie E. coli, B. subtilis, Saccharomyces cerevisiae, einschließlich Genen wie β-Galactosidase, T7-Polymerase und Tryptophan E.
Der größte Teil der rekombinanten Konstrukte wird regulatorische Bereiche beinhalten, die in Pflanzen funktionieren und für eine Expression des Wachs-Synthase-Gens unter Bildung eines funktionellen Wachs-Synthase-Proteins sorgen. Das offene Leseraster, das für die Pflanzen-Wachs-Synthase codiert, oder ein funktionelles Fragment davon wird an seinem 5'-Ende mit einem den Transcriptionsstart regulierenden Bereich verbunden, wie der Wildtypsequenz, die man natürlicherweise in 5'-Richtung stromaufwärts der Wachs-Synthase-Struktur-Gens findet. Es stehen zahlreiche andere Promotorbereiche aus nativen Pflanzengenen zur Verfügung, die für eine Vielzahl von konstitutiven oder regulierbaren Expressionen von Struktur-Gensequenzen sorgen.
Außer Sequenzen aus nativen Pflanzengenen können auch andere Sequenzen in Pflanzen für eine konstitutive Genexpression sorgen, wie regulatorische Bereiche, die mit Agrobacterium-Genen verbunden sind, einschließlich Bereichen, die mit Genen für Nopalin-Synthase (Nos), Mannopin-Synthase (Mas) oder Octopin-Synthase (Ocs) verbunden sind. Ebenfalls geeignet sind Bereiche, die die Expression von viralen Genen steuern, wie der 35S- und der 19S-Bereich des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV). Der hier verwendete Ausdruck "konstitutiv" zeigt nicht notwendigerweise an, dass ein Gen in allen Zelltypen auf demselben Niveau exprimiert wird, sondern dass das Gen in einem weiten Bereich von Zelltypen exprimiert wird, wenn auch oft eine gewisse Variation der Häufigkeit nachweisbar ist. Andere geeignete Transcriptionsstartbereiche sorgen vorzugsweise für eine Transcription in bestimmten Geweben oder unter bestimmten Wachstumsbedingungen, wie solche von Napin, Samen- oder Blatt-ACP und der kleinen Untereinheit von Rubisco.
In Ausführungsformen, bei denen die Expression des Wachs-Synthase-Proteins in einem Pflanzenwirt gewünscht wird, kann die Verwendung des ganzen oder eines Teils des vollständigen Jojoba-Wachs-Synthase-Gens gewünscht werden, es können nämlich die 5'-stromaufwärts liegenden nichtcodierenden Bereiche (Promotor) zusammen mit der Struktur-Gen-Sequenz und 3'-stromabwärts liegenden nichtcodierenden Bereichen eingesetzt werden. Wenn ein anderer Promotor gewünscht wird, wie ein Promotor, der der interessierenden Wirtspflanze nativ ist, oder ein modifizierter Promotor, d.h. mit Transcriptionsstartbereichen, die von einer Genquelle stammen, und Translationsstartbereichen, die von einer anderen Genquelle stammen, oder verstärkte Promotoren, wie Doppel-355-CaMV-Promotoren, können die Sequenzen mit Hilfe von Standardtechniken miteinander verbunden werden. Zusätzlich können 5'-untranslatierte Bereiche von hochexprimierten Pflanzengenen geeignet sein, um für eine erhöhte Expression der hier beschriebenen Wachs-Synthase-Proteine zu sorgen.
Die DNA-Konstrukte, die für eine Wachs-Synthase-Expression in Pflanzen sorgen, können mit einer Vielzahl von Pflanzen eingesetzt werden, insbesondere Pflanzen, die die Fettacyl-CoA-Substrate des Wachs-Synthase-Enzyms produzieren, wie Brassica. Andere interessierende Pflanzen produzieren wünschenswerte Fettacylsubstrate, wie mittel- oder langkettige Fettacyl-Moleküle; dazu gehören unter anderem Raps (Canola-Sorten), Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Cuphea, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen sowie Mais. Von besonderem Interesse ist die Verwendung solcher Konstrukte in erucasäurereichen Sorten von Raps-Brassica (HEAR) für die Produktion von langkettigen flüssigen Wachsen. Weitere Verwendungen, die für HEAR-Pflanzen in Betracht gezogen werden, umfassen die Produktion von Sorten, die infolge der Bereitstellung einer zusätzlichen Wachs-"Senke" für Erucasäure, die normalerweise in TAG (Triacylglycerid) des Samens gespeichert wird, wesentlich erhöhte Konzentrationen von Erucasäure enthalten.
Was das Fettalkoholsubstrat des Wachs-Synthase-Enzyms betrifft, sind andere Samenpflanzen außer Jojoba nicht dafür bekannt, große Mengen an Fettalkoholen zu produzieren, obwohl kleine Mengen dieses Substrats für das Wachs-Synthase-Enzym zur Verfügung stehen können. Daher ist es in Verbindung mit den Wachs-Synthase-Konstrukten dieser Erfindung wünschenswert, die Zielwirtszelle mit der Fähigkeit auszustatten, aus den in den Wirtszellen vorhandenen Fettacylmolekülen Fettalkohole zu produzieren. Zum Beispiel sind eine Pflanzen-Fettacyl-Reductase und Verfahren, um für die Expression der Reductase-Enzyme in Pflanzenzellen zu sorgen, in US 5,370,996 beschrieben. Die Nucleinsäuresequenz und die translatierte Aminosäuresequenz der Jojoba-Reductase sind in 1 dieses Patents angegeben. Indem man also die Wirtspflanzenzelle sowohl mit Wachs-Synthaseals auch mit Reductase-Proteinen ausstattet, können Wachsester aus den Fettalkohol- und Fettacylsubstraten produziert werden. Weiterhin wird in der vorliegenden Erfindung die Expression von β-Ketoacyl-CoA-Synthase in Verbindung mit der Expression von Wachs-Synthase- und -Reductase-Proteinen in Betracht gezogen. Auf diese Weise kann die Produktion von sehr langkettigen Fettsäuresubstraten dieser Enzyme in der Zielpflanzenspezies erhöht werden.
Außer der Jojoba-Reductase können auch Reductase-Enzyme von anderen Organismen in Verbindung mit den Wachs-Synthasen dieser Erfindung nützlich sein. Weitere potentielle Quellen für Reductase-Enzyme sind Euglena, Acinetobacter, Micrococcus, bestimmte Insekten und Meeresorganismen sowie spezialisierte Säuger- oder Vogelgewebe, von denen bekannt ist, dass sie Wachsester enthalten, wie Meibomsche Drüsen von Rindern oder Vogel-Bürzeldrüsen. Weitere potentielle Quellen für Reductase-Proteine können anhand ihrer Fähigkeit identifiziert werden, Fettalkohole oder, wenn auch Wachs-Synthase vorhanden ist, Wachsester zu produzieren.
Die Wachs-Synthase- und Reductase-Sequenzen können während desselben Transformationsereignisses bereitgestellt werden, oder alternativ dazu können auch zwei verschiedene transgene Pflanzenlinien, von denen die eine Wachs-Synthase-Konstrukte aufweist und die andere Reductase-Konstrukte aufweist, durch Transformation mit den verschiedenen Konstrukten produziert werden.
Diese Pflanzenlinien können dann unter Verwendung bekannter Pflanzenzuchttechniken miteinander gekreuzt werden, so dass man Wachs-Synthase und Reductase enthaltende Pflanzen für die Produktion von Wachsesterprodukten erhält.
Weiterhin können auch andere Nucleinsäuresequenzen, die für Enzyme codieren, welche an der Bildung sehr langkettiger Fettsäuren beteiligt sind, Verwendung in den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung zur Produktion von Wachsestern in einer Wirtspflanze finden. Solche Nucleinsäuresequenzen sind in der Technik bekannt und sind etwa in US 5,679,881 beschrieben. Wie in den folgenden Beispielen beschrieben ist, wird die Wachs-Synthase der vorliegenden Erfindung zum Beispiel in Pflanzen-Expressionskonstrukten in Verbindung mit Nucleinsäuresequenzen verwendet, die für eine Fettsäure-Elongase (beschrieben in US 5,679,881 ) und eine Acyl-CoA-Reductase (beschrieben in US 5,403,918 ) codieren. Solche Pflanzen-Expressionskonstrukte sorgen für die Produktion von Wachsestern in transgenen Arabidopsis-thaliana-Pflanzen.
Für Anwendungen, die zur Produktion von Wachsester führen, sind 5'-stromaufwärts liegende nichtcodierende Bereiche wünschenswert, die von Genen erhalten werden, die während der Samenreifung reguliert werden, insbesondere solche, die vorzugsweise in Pflanzenembryogewebe exprimiert werden, wie Bereiche, die von regulatorischen Bereichen von ACP, Oleosin (Lee und Huang (1991), Plant Physiol. 96: 1395-1397) und Napin abgeleitet sind. Transcriptionsstartbereiche, die für eine bevorzugte Expression in Samengewebe sorgen, d.h., die in anderen Pflanzenteilen nicht nachweisbar sind, gelten als wünschenswert für die Wachsesterproduktion, um alle zerstörerischen oder nachteiligen Wirkungen des Genprodukts in anderen Pflanzenteilen zu minimieren. Weiterhin können die Samen solcher Pflanzen geerntet und die Lipidreserven dieser Samen gewonnen werden, so dass man eine leicht verfügbare Quelle von Wachsestern erhält. Somit kann ein neues Samenprodukt in Ölsaatpflanzen erhalten werden, von denen nicht bekannt ist, dass sie ohne Transformation mit den hier beschriebenen Wachs-Synthase-Konstrukten Wachsester als Komponente ihrer Samenlipidreserven produzieren.
Solche "samenspezifischen Promotoren" können gemäß den Lehren von US 5,420,034 und 5,430,194 erhalten und verwendet werden. Außerdem kann es in dem Fall, dass Pflanzengene, wie die Jojoba-Reductase und -Wachs-Synthase, exprimiert werden, wünschenswert sein, für die Expression der Jojoba-Gene in einer transformierten Pflanzenspezies, wie Arabidopsis oder Brassica, das gesamte Pflanzengen einschließlich der 5'- und der 3'-regulatorischen Bereiche und aller Introns, die in der codierenden Sequenz vorhanden sind, zu verwenden.
Regulatorische Transcriptionsterminationsbereiche können ebenfalls in rekombinanten Konstrukten dieser Erfindung bereitgestellt werden. Transcriptionsterminationsbereiche können von der DNA-Sequenz, die die Jojoba-Wachs-Synthase codiert, oder einem zweckmäßigen Transcriptionsterminationsbereich, der von einer anderen Genquelle abgeleitet ist, bereitgestellt werden, insbesondere dem Transcriptionsterminationsbereich, der natürlicherweise mit dem Transcriptionsstartbereich assoziiert ist. Der Transcriptionsterminationsbereich enthält wenigstens 0,5 kb, vorzugsweise 1-3 kb, einer Sequenz 3' des Struktur-Gens, von dem der Terminationsbereich stammt.
Weitere Pflanzengenbereiche können verwendet werden, um die Expression von Wachs-Synthase- und Reductase-Genen in Pflanzengeweben zu optimieren. Zum Beispiel können 5'-untranslatierte Bereiche von hochexprimierten Genen, wie dem der kleinen Untereinheit (SSU) von RuBP-Carboxylase, die 5' von codierenden DNA-Sequenzen eingefügt werden, für eine verstärkte Translationseffizienz sorgen. Teile des das SSU-Leader-Protein codierenden Bereichs (wie der Teil, der die ersten 6 Aminosäuren codiert) können in solchen Konstrukten ebenfalls verwendet werden. Bei Anwendungen, in denen eine Zielsteuerung in Pflanzenplastidorganellen wünschenswert ist, können außerdem Transitpeptid-codierende Sequenzen von SSU oder anderen zellkerncodierten Chloroplastenproteinen in Verbindung mit Wachs-Synthase- und Reductase-Sequenzen verwendet werden.
Je nach dem Verfahren zur Einführung der DNA-Expressionskonstrukte in die Wirtszelle können auch andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Was wichtig ist:
Diese Erfindung ist gleichermaßen auf Zweikeimblättrige und Einkeimblättrige Spezies anwendbar und wird leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regenerationstechniken anwendbar sein.
Bei der Entwicklung des rekombinanten Konstrukts werden die verschiedenen Komponenten des Konstrukts oder Fragmente davon normalerweise in einen zweckmäßigen Klonierungsvektor eingesetzt, der zur Replikation in einem bakteriellen Wirt, z.B. E. coli, befähigt ist. Es gibt zahlreiche Vektoren, die in der Literatur beschrieben wurden. Nach jeder Klonierung kann das Plasmid isoliert und einer weiteren Manipulation, wie Restriktionsspaltung, Insertion von neuen Fragmenten, Ligierung, Deletion, Insertion und Resektion, unterzogen werden, um die Komponenten der gewünschten Sequenz maßzuschneidern. Sobald das Konstrukt fertiggestellt ist, kann es dann zur weiteren Manipulation im Einklang mit der Art der Transformation der Wirtszelle auf einen geeigneten Vektor übertragen werden.
Das rekombinante Konstrukt wird normalerweise auch ein Strukturgen umfassen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt aufweist und für eine Selektion der transformanten Zellen sorgt. Das Gen kann für eine Resistenz gegen ein cytotoxisches Agens, z.B. gegen ein Antibiotikum, Schwermetall oder Toxin, für eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt Prototrophie verleiht, oder virale Immunität sorgen. Ähnlich sind auch Gene geeignet, die Enzyme codieren, die für eine Produktion einer Verbindung sorgen, die sich anhand einer Farbänderung, wie GUS, oder Lumineszenz, wie Luciferase, identifizieren lässt. Je nach der Zahl der verschiedenen Wirtsspezies, in die das Expressionskonstrukt oder dessen Komponenten eingeführt werden, können ein oder mehrere Marker eingesetzt werden, wobei für die verschiedenen Wirte unterschiedliche Bedingungen für die Selektion verwendet werden.
Außer den Sequenzen, die für eine Transcription von Wachs-Synthase-Sequenzen sorgen, können die DNA-Konstrukte dieser Erfindung auch für eine Expression eines oder mehrerer zusätzlicher Gene sorgen, deren Proteinprodukt in Verbindung mit der Wachs-Synthase bewirken kann, dass ein wertvolles Endprodukt produziert wird. Wie oben diskutiert, werden zum Beispiel DNA-Konstrukte, die für eine Expression von Wachs-Synthase und einer Fettacyl-Reductase sorgen, so dass in transformierten Wirten Wachsester produziert werden können, in dieser Erfindung in Betracht gezogen. Weiterhin ist eine Produktion von verschiedenen Wachsestern mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen und Sättigungsgraden erwünscht und kann erhalten werden, indem man Wirtspflanzen transformiert, die Fettalkohol- und Fettacylsubstrate verschiedener Kettenlängen aufweisen. Solche Pflanzen können zum Beispiel durch Verfahren bereitgestellt werden, die in WO 91/16421 beschrieben sind, das verschiedene Thioesterase-Gene und Verfahren zur Verwendung solcher Gene zur Produktion von Fettacylsubstraten mit unterschiedlichen Kettenlängen in transformierten Wirtspflanzen beschreibt.
Um die Produktion von Wachsestern in Ölsaat-Wirtspflanzen zu optimieren, kann es weiterhin wünschenswert sein, die Produktion der Triacylglyceridöle, die normalerweise in den Samen solcher Pflanzen produziert werden, zu senken. Ein Verfahren, um dies zu bewerkstelligen, besteht in der Antisense-Unterdrückung eines Gens, das für diesen Vorgang entscheidend, aber für die Produktion von Wachsestern nicht notwendig ist. Zu diesen Genzielen gehören Diacylglycerin-Acyltransferase und andere Enzyme, die die Synthese von Triacylglycerin katalysieren. Außerdem kann es wünschenswert sein, die Ölsaatpflanzen mit Enzymen zu versehen, die verwendet werden können, um Wachsester als Nährstoffquelle abzubauen, wie solche, die aus Jojoba oder verschiedenen anderen wachsproduzierenden Organismen isoliert werden können. Auf diese Weise kann eine maximale Produktion von Wachsestern in Wirtssamenpflanzen erreicht werden.
Die Wachsester, die in den hier beschriebenen Verfahren produziert werden, können unter Verwendung von Techniken für die Wachsextraktion aus Jojoba oder durch verschiedene andere Produktionsverfahren, die verwendet werden, um Ölprodukte aus verschiedenen Ölsaatpflanzen zu erhalten, geerntet werden. Die so erhaltenen Wachse finden Anwendung in vielen Industrien einschließlich Pharmaka, Kosmetika, Waschmitteln, Kunststoffen und Gleitmitteln. Die Anwendungen variieren in Abhängigkeit von der Kettenlänge und dem Sättigungsgrad der Wachsesterkomponenten. Zum Beispiel sind langkettige Wachse, die eine Doppelbindung in jeder Kohlenstoffkette aufweisen, bei Raumtemperatur flüssig, während Wachse mit gesättigten Kohlenstoffkettenkomponenten bei Raumtemperatur fest sein können, insbesondere wenn die gesättigten Kohlenstoffketten längere Kohlenstoffketten sind.
Das Verfahren der Transformation ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, und zur Zeit stehen verschiedene Verfahren zur Pflanzentransformation zur Verfügung. Wenn neuere Verfahren zur Transformation von Kulturpflanzen verfügbar werden, können sie hier direkt angewendet werden. Zum Beispiel können viele Pflanzenspezies, die natürlicherweise anfällig für eine Agrobacterium-Infektion sind, durch Verfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation mit dreiteiligen oder binären Vektoren erfolgreich transformiert werden. Andere Sequenzen, die geeignet sind, um für eine Übertragung von Nucleinsäuresequenzen auf Wirtspflanzenzellen zu sorgen, können von pflanzenpathogenen Viren oder pflanzentransponierbaren Elementen abgeleitet sein. Außerdem wurden Techniken der Mikroinjektion, DNA-Partikelbombardierung und Elektroporation entwickelt, die die Transformation verschiedener Einkeimblättriger und Zweikeimblättriger Pflanzenspezies ermöglichen.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben wurde, wird sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser zu verstehen sein, die nur zum Zwecke der Veranschaulichung mit aufgenommen sind und die Erfindung nicht einschränken sollen, es sei denn, dies wird ausdrücklich gesagt.
Beispiele
Beispiel 1 – Wachs-Synthase-Assays
Verfahren zum Testen auf Wachs-Synthase-Aktivität in mikrosomalen Membranpräparaten oder solubilisierten Proteinpräparaten werden beschrieben.
A. Radioaktiv markiertes Material
Das Substrat, das im Allgemeinen in den Wachs-Synthase-Assays verwendet wird, [1-¹⁴C]-Palmitoyl-CoA, wird von Amersham (Arlington Heights, IL) bezogen. Substrate mit anderer Kettenlänge wurden synthetisiert, um Kettenlängenspezifitätsstudien durchzuführen. Langkettige [1-¹⁴C]-Fettsäuren (spezifische Aktivität 51-56 Ci/mol), nämlich 11-cis-Eicosensäure, 13-cis-Docosensäure und 15-cis-Tetracosensäure werden durch die Reaktion von Kalium[¹⁴C]cyanid mit dem entsprechenden Alkoholmesylat und anschließende basische Hydrolyse des Alkoholnitrils zur freien Fettsäure hergestellt. Die freien Fettsäuren werden mit Diazomethan in Ether in ihre Methylester umgewandelt und durch präparative Silbernitrat-Dünnschichtchromatographie (DC) gereinigt. Die Fettsäuremethylester werden zu den freien Fettsäuren zurückhydrolysiert. Die radiochemische Reinheit wird durch drei DC-Verfahren bewertet: Normalphasen-Silica-DC, Silbernitrat-DC und C18-Umkehrphasen-DC. Die durch diese Verfahren gemessene radiochemische Reinheit betrug 92-98%. Langkettige [1-¹⁴C]-Acyl-CoAs werden nach dem Verfahren von Young und Lynen (J. Bio. Chem. (1969) 244: 377) aus den entsprechenden freien [1-¹⁴C]-Fettsäuren bis zu einer spezifischen Aktivität von 10 Ci/mol hergestellt. [1-¹⁴C]-Hexadecanal wird durch die Dichromat-Oxidation von [1-¹⁴C]-Hexadecan-1-ol gemäß einer Mikromaßstab-Modifikation des Verfahrens von Pletcher und Tate (Tet. Lett. (1978) 1601-1602) hergestellt. Das Produkt wird durch präparative Silica-DC gereinigt und als Hexanlösung bis zur Verwendung bei –70 °C aufbewahrt.
B. Assay auf Wachs-Synthase-Aktivität in einer mikrosomalen Membran
Die Wachs-Synthase-Aktivität in einem mikrosomalen Membranpräparat wird durch Inkubation von 40 μM [1-¹⁴C]-Acyl-CoA (gewöhnlich Palmitoyl-CoA, spezifische Aktivität 5,1 bis 5,6 mCi/mmol) und 200 mM Oleylalkohol mit der zu testenden Probe in einem Gesamtvolumen von 0,25 ml gemessen. Das Inkubationsgemisch enthält auch entweder 25 mM HEPES (4-[2-Hydroxyethyl]-1-piperazinethansulfonsäure), pH 7,5, als Puffermittel mit 20% (w/v) Glycerin, 1 mM DTT, 0,5 M NaCl oder 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, als Puffermittel mit 0,28 M NaCl, 10% Glycerin und 2 mM β-Mercaptoethanol. Die Studien wurden am Anfang mit dem ersten Puffersystem durchgeführt, wobei der pH-Wert so gewählt wurde, dass die Präferenz des Acyl-CoA-Reductase-Enzyms berücksichtigt wurde. Die Membranpräparate wurden später zum zweiten Puffersystem gewechselt, so dass das höhere pH-Optimum der Wachs-Synthase berücksichtigt wurde.
Ein Substratgemisch wird in einem Glas-Vial hergestellt, wobei unmittelbar vor der Verwendung Oleylalkohol hinzugefügt wird, und zu Proben gegeben. Die Inkubation wird bis zu einer Stunde lang bei 30 °C durchgeführt. Der Assay wird beendet, indem man das Assayröhrchen auf Eis stellt und sofort 0,25 ml Isopropanol:Essigsäure (4:1 v/v) hinzufügt. Unmarkierte Wachsester (0,1 mg) und Oleylalkohol (0,1 mg) werden als Träger hinzugefügt. Die [¹⁴C]-Lipide werden durch die Vorschrift von Hara und Radin (Anal. Biochem. (1978) 90: 420) im heruntergesetzten Maßstab extrahiert. Zu dem beendeten Assay werden 2 ml Hexan/Isopropanol (3:2, v/v) gegeben. Die Probe wird mit dem Wirbelmischer gemischt, 1 ml wässrige Natriumsulfatlösung (6,6% w/v) wird hinzugefügt, und die Probe wird erneut mit dem Wirbelmischer gemischt.
C. Assay auf solubilisierte Wachs-Synthase-Aktivität
Solubilisierte Wachs-Synthase wird bestimmt, wobei man bis zu 50 μl Probe in einem 250-μl-Assay verwendet, der 40 μM 1-¹⁴C-16:0-CoA (5 Ci/mol), 200 μM 18:1-OH, 0,07% Sojaphospholipid (Sigma, P-3644), 0,2% CHAPS, 280 mM NaCl, 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 2 mM β-ME und 5,6% Glycerin enthält. Phospholipid (50 mg/ml in 0,5% CHAPS) wird direkt zu der Probe, die sich in 1% CHAPS befindet, gegeben und dann mit einem Cocktail verdünnt, der die übrigen Assaykomponenten enthält. Die Rekonstitution der Aktivität beruht vermutlich auf dem Einbau von Wachs-Synthase in die Phospholipid-Vesikel. Wachs-Synthase ist detergensempfindlich und erfordert für eine maximale Aktivität, dass die Menge an Phospholipid (PL) und Detergens (CHAPS) in dem Assay auf 2,8/1 (CHAPS/PL, w/w) ausgewogen ist. Assays auf Wachs-Synthase-Aktivität in Proben, die durch Ultrafiltration konzentriert werden, erfordern eine Neueinstel lung des getesteten Probevolumens wegen der Konzentration von CHAPS. Die Einführung von zu viel CHAPS in den Assay führt zu einer Hemmung der Aktivität. Wenn die Proben durch Ultrafiltration konzentriert werden, kann das optimale Volumen der zu testenden Probe wiederhergestellt werden, indem man eine Konzentrationskurve von % CHAPS in dem Assay durchführt, wobei man eine kleine Menge Probe verwendet und bei einer festen Konzentration von Phospholipid und NaCl testet. Wachs-Synthase ist gegenüber Veränderungen der PL-Konzentration weniger empfindlich als gegenüber Veränderungen der CHAPS-Konzentration.
D. Analyse von Assayprodukten
Zum Analysieren der Produkte entweder des Wachs-Synthase-Assays am mikrosomalen Membranpräparat oder des solubilisierten Wachs-Synthase-Assays wurden zwei Vorschriften entwickelt. Eine Vorschrift, die unten als "extensiver Assay" beschrieben ist, ist zeitraubender, liefert jedoch in höherem Maße quantitative Ergebnisse. Die andere Vorschrift, die unten als "schneller Assay" beschrieben ist, liefert ebenfalls ein Maß für die Wachs-Synthase-Aktivität, ist aber schneller, bequemer und weniger quantitativ.

1. Extensive Analyse: Nach der Zugabe des Natriumsulfats und dem Mischen der Probe mit dem Wirbelmischer wird die obere, organische Phase entfernt, und die untere, wässrige Phase wird mit 4 ml Hexan/Isopropanol (7:2 v/v) gewaschen. Die organischen Phasen werden vereinigt und unter Stickstoff zur Trockne eingedampft. Der Lipidrückstand wird in einem kleinen Volumen Hexan resuspendiert, und von einem Aliquot wird die Radioaktivität mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Der Rest der Probe kann für eine DC-Analyse der markierten Klassen verwendet werden und dadurch ein Maß für das produzierte Gesamtwachs ergeben.

Für die Lipidklassenanalyse wird die Probe auf eine Silica-DC-Platte aufgetragen, und die Platte wird in Hexan/Diethylether/Essigsäure (80:20:1 oder 70:30:2 v/v/v) entwickelt. Die Verteilung der Radioaktivität zwischen den Lipidklassen, am Anfang größtenteils Wachsester, freie Fettsäuren, Fettalkohole und polare Lipide, wird mit Hilfe eines AMBIS-Radioanalyse-Bildgebungssystems (AMBIS Systems Inc., San Diego, CA) gemessen. Falls notwendig, können die einzelnen Lipidklassen zur weiteren Analyse von der DC-Platte zurückgewonnen werden. Umkehrphasen-DC-Systeme unter Verwendung von C18-Platten, die in Methanol entwickelt werden, werden ebenfalls für die Analyse verwendet.

2. Schnelle Analyse: Nach der Zugabe des Natriumsulfats und dem Mischen der Probe mit dem Wirbelmischer wird ein bekannter Prozentsatz der organischen Phase entfernt und mit dem Flüssigszintillationszähler gezählt. Diese Berechnung wird verwendet, um die Gesamtradioaktivität in der organischen Phase abzuschätzen. Dann wird ein anderer Teil der organischen Phase entfernt, unter Stickstoff heruntergetrocknet, in Hexan wieder aufgelöst und auf DC-Platten getüpfelt und entwickelt und abgetastet, wie es für den ausführlichen Assay beschrieben ist. Auf diese Weise wird der Prozentsatz der Gesamtradioaktivität, die in Wachs eingebaut ist, bestimmt.

Beispiel 2 – Weitere Studien zur Charakterisierung der Wachs-Synthase-Aktivität
A. Samenentwicklung und Wachs-Synthase-Aktivitätsprofile
Die embryonale Entwicklung wurde über zwei Sommer hinweg an fünf Pflanzen in Davis, CA, verfolgt. Es zeigte sich, dass das Frisch- und Trockengewicht der Embryos von etwa Tag 80 bis etwa Tag 130 mit einer einigermaßen stetigen Geschwindigkeit zunahm. Lipidextraktionen zeigen Folgendes: Wenn das Frischgewicht der Embryos etwa 300 mg erreicht (etwa Tag 80), erreicht das Verhältnis von Lipidgewicht zu Trockengewicht das maximale Niveau von 50%.
Die Wachs-Synthase-Aktivität wurde in sich entwickelnden Embryos gemessen, wie es in Beispiel 1B beschrieben ist. Da bestimmt wurde, dass die Hüllen der Jojobasamen die Quelle eines oder mehrerer hemmender Faktoren sind, wurden die Samenhüllen entfernt, bevor die Embryos zur Lagerung in flüssigem Stickstoff bei –70 °C eingefroren wurden.
Die Entwicklungsprofile für Wachs-Synthase-Aktivitäten, wie sie entweder in einem zellfreien Homogenisat oder einer Membranfraktion gemessen wurden, weisen auf eine starke Induktion der Aktivität hin, die ungefähr 110-115 Tage nach der Blüte ihren Spitzenwert erreicht. Embryos für enzymologische Studien wurden also etwa 90 bis 110 Tage nach der Blüte geerntet, einer Zeit, wenn die Wachs-Synthase-Aktivität hoch ist, die Lipidablagerung noch keine Maximalwerte erreicht hat und sich die Samenhülle leicht entfernen lässt. Die höchste Geschwindigkeit der Zunahme der Wachs-Synthase-Aktivität wird zwischen den Tagen 80 und 90 nach der Blüte beobachtet. Embryos für den Aufbau einer cDNA-Bibliothek wurden also etwa 80 bis 90 Tage nach der Blüte geerntet, wenn die Synthesegeschwindigkeit des Wachs-Synthase-Proteins vermutlich am größten ist. Entsprechend würde man annehmen, dass die Konzentration an mRNA, die Wachs-Synthase codiert, in diesem Stadium maximal ist.
B. Mikrosomale Membranpräparate
Jojoba-Embryos werden ungefähr 90-110 Tage nach der Blüte geerntet, was durch Messung des Wassergehalts der Embryos (45-70%) abgeschätzt wird. Die äußeren Schalen und Samenhüllen werden entfernt, und die Keimblätter werden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und für die zukünftige Verwendung bei –70 °C gelagert. Für ein Anfangsproteinpräparat werden gefrorene Embryos durch Zerstoßen in einem Stahlmörser bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs pulverisiert. In einem typischen Experiment werden 70 g Embryos verarbeitet.
Das Pulver wird in einem Verhältnis von 280 ml Lösung pro 70 g Embryos zu der folgenden Lösung mit hoher Salzkonzentration gegeben: 3 M NaCl, 0,3 M Saccharose, 100 mM HEPES, 2 mM DTT und die Protease-Inhibitoren 1 mM EDTA, 0,7 mg/ml Leupeptin, 0,5 mg/ml Pepstatin und 17 mg/ml PMSF. Ein zellfreies Homogenisat (CFH) wird gebildet, indem man die pulverisierten Embryos ungefähr 30 Sekunden lang mit einem Gewebehomogenisator (Kinematica, Schweiz; Modell PT10/35) in dem Puffer dispergiert und dann über drei Schichten Miracloth (CalBioChem, LaJolla, CA) filtriert. Das Filtrat wird eine Stunde lang mit 100 000 × g zentrifugiert.
Die resultierende Probe besteht aus einem Sediment, einem Überstand und einer aufschwimmenden Fettschicht. Die Fettschicht wird entfernt, und die Überstandfraktion wird isoliert und über Nacht (mit dreimaligem Austausch der Pufferlösung) gegen eine Lösung dialysiert, die 1 M NaCl, 100 mM HEPES, 2 mM DTT und 0,5 mM EDTA enthielt. Das Dialysat wird 1½ Stunden lang mit 200 000 × g zentrifugiert, was ein Sediment DP2 ergab. Das Sediment wird in 25 mM HEPES und 10% Glycerin in ungefähr 1/20 des ursprünglichen CFH-Volumens suspendiert, was das mikrosomale Membranpräparat ergab.
Die Aktivität wird so bestimmt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Der Rückgewinnungsgrad der Wachs-Synthase-Aktivität wird auf ungefähr 34% der ursprünglichen Aktivität im zellfreien Homogenisat geschätzt. Die Wachs-Synthase-Aktivität in diesem Präparat ist stabil, wenn es bei –70 °C gelagert wird.
C. Substratspezifität
Acyl-CoA- und Alkoholsubstrate mit unterschiedlichen Kohlenstoffkettenlängen und Graden der Unsättigung wurden zu einer mikrosomalen Membranfraktion gegeben, wie sie oben beschrieben ist, um den Bereich der Substrate zu bestimmen, die von der Jojoba-Wachs-Synthase erkannt werden. Die Wachs-Synthase-Aktivität wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1B gemessen, wobei die Acyl-Spezifität unter Verwendung von 80 mM Acyl-CoA-Substrat und 100 mM radioaktiv markiertem Oleylalkohol gemessen wurde. Die Alkoholspezifität wurde unter Verwendung von 100 mM Alkoholsubstrat und 40 mM radioaktiv markiertem Eicosenoyl-CoA gemessen. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Acyl- und Alkohol-Substratspezifität der Jojoba-Wachs-Synthase
Die obigen Ergebnisse beweisen, dass die Jojoba-Wachs-Synthase einen breiten Bereich von Fettacyl-CoA- und Fettalkoholsubstraten verwertet.
Außerdem wurde die Wachs-Synthase-Aktivität gegenüber verschiedenen Acylthioester-Substraten in ähnlicher Weise getestet, wobei Palmitoyl-CoA, Palmitoyl-ACP und N-Acetyl-S-palmitoylcysteamin als Acylsubstrate verwendet wurden. Die größte Aktivität wurde gegenüber dem Acyl-CoA-Substrat beobachtet. Eine erhebliche Aktivität (ca. 10% derjenigen von Acyl-CoA) wurde bei Acyl-ACP beobachtet, aber gegenüber dem N-Acetyl-S-palmitoylcysteamin-Substrat war keine Aktivität nachweisbar.
D. Effektoren der Aktivität
Verschiedene Sulfhydryl-Reagentien wurden in Bezug auf ihre Wirkung auf die Wachs-Synthase-Aktivität durchmustert. Es zeigte sich, dass quecksilberorganische Verbindungen die Aktivität stark hemmen. Iodacetamid und N-Ethylmaleamid waren viel weniger effektiv. Eine Hemmung durch para-Hydroxymercuribenzoat wurde beobachtet, aber diese Hemmung konnte durch anschließende Zugabe von DTT wieder rückgängig gemacht werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung durch para-Hydroxymercuribenzoat die Blockierung einer essentiellen Sulfhydrylgruppe beinhaltet.
Beispiel 3 – Reinigung von Jojoba-Wachs-Synthase
Es werden Verfahren beschrieben, die für die Isolierung eines Jojoba-Membranpräparats mit Wachs-Synthase-Aktivität, Solubilisierung der Wachs-Synthase-Aktivität und weitere Reinigung des Wachs-Synthase-Proteins verwendet werden können.
A. Mikrosomales Membranpräparat
Die folgende Modifikation des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens wird eingesetzt und liefert eine verbesserte Membranfraktion, die für die Reinigung von Wachs-Synthase aus solubilisierten Membranen geeignet ist.
Typischerweise werden 100 g Jojoba-Embryos zu 400 ml Extraktionspuffer (40 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 200 mM KCl, 10 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol) gegeben, in einem Mischer vermahlen und mit einem Polytron-Gewebehomogenisator homogenisiert. Alle anschließenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. Das gemischte Material wird über Miracloth (CalBioChem) filtriert. Zentrifugation (20 000 × g; 20 min) des Filtrats ergab eine aufschwimmende Wachsschicht, eine trübe Überstandsfraktion und ein dunkelgrünes Sediment. Die Überstandsfraktion wird isoliert und zentrifugiert (100 000 × g; 2 h), wobei man Membransedimente erhält, die dann in 40 ml Puffer A (25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 200 mM KCl, 5 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol), der 50% (w/v) Saccharose enthält, resuspendiert werden. Dieses Homogenisat wird auf vier SW28-Zentrifugenröhrchen (Beckman) verteilt und jeweils mit 10 ml Puffer A, der 20% Saccharose enthält, und dann mit 13 ml Puffer A überschichtet. Nach der Zentrifugation (28 000 U/min; 2 h) wird eine Membranfraktion an der Grenzfläche zwischen 20%/50% Saccharose gewonnen, mit vier Volumina Puffer A verdünnt und durch Zentrifugation (200 000 × g; 1 h) gewonnen. Dann werden die Membranen in 10 ml Vorratspuffer [25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 1 M NaCl, 10% (w/v) Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol] homogenisiert. Die Proteinkonzentration der durch diese Vorschrift hergestellten Membranen liegt typischerweise zwischen 7 und 9 mg/ml. Die Proteinkonzentrationen werden so abgeschätzt, wie es beschrieben ist (Bradford, 1976), wobei BSA als Proteinstandard verwendet wird.
B. Solubilisierung des Wachs-Synthase-Proteins
Die Membransuspension wird durch Verdünnung mit Vorratspuffer (25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 1 M NaCl, 10% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol) auf ungefähr 0,83 mg Protein pro ml eingestellt. Festes 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-1-propansulfonat (CHAPS) wird so hinzugefügt, dass man eine Endkonzentration von 2% (w/v) und ein Verhältnis von Detergens zu Protein von 24:1 erreicht. Nach 1 h Inkubation auf Eis wird die Probe zentrifugiert (200 000 × g, 1 h), und die Überstandsfraktion wird isoliert.
C. Reinigung der Wachs-Synthase-Aktivität
Die Überstandsfraktion aus der Zentrifugation mit 200 000 × g wird verdünnt (mit 0,57% CHAPS, 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 20% Glycerin), so dass man Endkonzentrationen an NaCl und CHAPS von 0,3 M bzw. 1% erhält. Die Probe wird auf eine Säule mit Blue-A-Agarose (Amicon, Inc., Beverly, MA) geladen, die mit Puffer B (25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 1% CHAPS, 20% Glycerin), der 0,3 M NaCl enthält, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit Äquilibrierungspuffer wird Wachs-Synthase-Aktivität mit Puffer B eluiert, der 2 M NaCl enthält. Aktive Fraktionen, die von der Blue-A-Säule eluiert werden, werden vereinigt (Blue Pool) und für die weitere Chromatographie verwendet.
Zwei Reinigungsvorschriften wurden für die Bandenidentifizierung und weitere Reinigung des Wachs-Synthase-Proteins verwendet. In Vorschrift 1 (1) wurde der Blue Pool durch Ultrafiltration in einer Druckzelle, die mit einer YM-30-Membran (Amicon, Inc., Beverly, MA) ausgestattet war, auf das 5,4fache konzentriert. Eine Hälfte des Konzentrats wurde auf eine Keramik-Hydroxyapatit(CHT)-Säule (Bio-Scale CHT-2; Bio-Rad, Hercules, CA) aufgetragen, die mit Puffer B, der 2 M NaCl enthält, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 6 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, und die gebundenen Proteine wurden mit Puffer B eluiert, der 0,1 M Dikaliumphosphat und 2 M NaCl enthielt. Nach Reäquilibrierung der CHT-Säule wurde die zweite Hälfte des Blue-Pool-Konzentrats in derselben Weise chromatographiert. Um Aktivität nachzuweisen, wurde Wachs-Synthase gemäß der Vorschrift für durch Ultrafiltration konzentrierte Proben getestet. Die an CHT-Durchlauf 1 gemessene Wachs-Synthase-Aktivität wurde im Eluat und in der Waschflüssigkeit gefunden. Die Proteinprofile der beiden CHT-Durchläufe waren identisch, so dass der CHT-Durchlauf 2 nicht getestet wurde. Aktive Fraktionen aus den beiden CHT-Durchläufen wurden vereinigt und auf das 10fache konzentriert und auf eine Sephacryl^®-S100-HR-Säule (2,5 × 90 cm) aufgetragen, die mit Puffer B mit 1,0 M NaCl äquilibriert worden war. Protein- und Aktivitätsbestimmungen wurden durchgeführt, und aktive Fraktionen wurden aus dem zurückgehaltenen Teil des Durchlaufs mit maximaler Aktivität und minimalem Proteingehalt ausgewählt. Der S100-Pool (Fraktionen 64-70) wurde auf eine Säule mit kristallinem Hydroxyapatit (HA) (Bio-Gel HT; Bio-Rad, Hercules, CA, 1 × 19,3 cm) aufgetragen, die mit Puffer B mit 1 M NaCl äquilibriert worden war. Wiederum war der größte Teil der Wachs-Synthase-Aktivität im Eluat und in der Waschflüssigkeit vorhanden. Die gebundenen Proteine wurden in Puffer B mit 0,1 M Dikaliumphosphat und 1 M NaCl eluiert. Fraktionen aus dem letzten HA-Durchlauf wurden durch SDS-PAGE untersucht. Ein einzelnes Protein, das auf SDS-PAGE bei 33 kD wanderte, wurde mit der Anwesenheit von Wachs-Synthase-Aktivität in Beziehung gebracht.
In einem zweiten Präparat (Vorschrift 2, 2) wurde der Blue Pool ohne Konzentrierung direkt auf eine Säule mit kristallinem HA (1 × 11,7 cm) aufgetragen, der in Puffer B mit 1 M NaCl äquilibriert worden war. Zwei Fraktionen wurden für die weitere Reinigung durch Ausschlusschromatographie auf einer Superdex^®-75-HR-10/30-Säule (Bio-Rad, Hercules, CA; Größenbereich: 5000 bis 75 000 Dalton) ausgewählt, die mit 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 1% CHAPS, 20% Glycerin, 1 M NaCl äquilibriert worden war. Die Wachs-Synthase-Aktivität wurde gemäß der Vorschrift gemessen, die in Beispiel 1C für solubilisierte Proben beschrieben ist. Eine Fraktion wurde früh im Eluat der HA-Säule (Fraktion 31) und die andere in de Waschflüssigkeit (Fraktion 67) eluiert. Die Proteinprofile der beiden Fraktionen waren auf der Basis einer SDS-PAGE-Analyse unterschiedlich. Beide Superdex^®-75-Durchläufe wurden durch Gradienten-SDS-PAGE untersucht, und ein Protein von ungefähr 33 kD, das mit Aktivität chromatographiert wurde, wurde identifiziert. Eine Eichkurve wurde erzeugt, wobei man Molekülmassenstandards verwendete, die unter denselben Puffer- und Säulenbedingungen chromatographiert wurden. Ein Vergleich des Elutionsvolumens des Maximums der Wachs-Synthase-Aktivität mit dieser Standardkurve ergab einen Wert von 48 kD für die Molekülmasse des solubilisierten Enzyms.
Ein Diagramm, das die Reinigung der Wachs-Synthase ausgehend von Vorschrift 1 darstellt (Tabelle 2), zeigt eine 150fache Reinigung des Enzyms aus der solubilisierten Proteinfraktion. Tabelle 2 Reinigung der Jojoba-Wachs-Synthase
D. SDS-PAGE-Analyse
Proben aus den Säulenfraktionen wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer (1 × Puffer = 2% SDS, 250 mM β-Mercaptoethanol, 0,0025% Bromphenolblau) verdünnt und durch Elektrophorese analysiert. Eine Polyacrylamid-Gradienten-Gelelektrophorese (10-13%) wurde nach dem Verfahren von Laemmli (Nature (1970), 227: 680-685) mit einigen der Modifikationen von Delepelaire (Proc. Nat. Acad. Sci. (1979) 76: 111-115) durchgeführt. Natriumdodecylsulfat wurde im oberen Reservoirpuffer mit 0,1% verwendet, wurde jedoch aus dem unteren Reservoirpuffer, dem Sammel- und dem Trenngel weggelassen. Das Sammelgel enthielt 5% einer 30%igen Acrylamid-Stammzusammensetzung (29,2% Acrylamid, 0,8% N,N'-Bismethylenacrylamid, w/v), 0,06% Ammoniumpersulfat (w/v) und 0,1% TEMED (v/v). Das Trenngel enthielt einen 10-13% linearen Gradienten von Acrylamid-Stammzusammensetzung, die mit einem 0-10% linearen Gradienten von Saccharose stabilisiert war. Eine Elektrophorese wurde 9-10 Stunden lang bei Raumtemperatur unter 150 V Gleichspannung durchgeführt. Proteine wurden durch Anfärben mit Silber nach dem Verfahren von Blum et al. (Electrophoresis (1987), 8: 93-99) oder mit Coomassie Blue (0,1% Coomassie Blue R-250, 50% Methanol, 10% Essigsäu re) sichtbar gemacht. Das als Wachs-Synthase identifizierte 33-kDa-Protein tritt bis zur Reinigung durch die Hydroxyapatit-Säule nicht als Hauptkomponente der aktiven Fraktion auf. Nach der Reinigung gemäß Vorschrift 1 (Beispiel 3C) ist das einzige Protein, das mit Aktivität korreliert, auf der letzten Säule eines bei 33 kDa.
Beispiel 4 – Vorbereitung von Protein für Verdau im Gel
A. Vorbereitung von Proben für SDS-PAGE durch Konzentration
Ungeradzahlige Fraktionen aus dem Eluat/der Waschflüssigkeit der letzten HA-Säule (Vorschrift 1) wurden vereinigt und durch Ultrafiltration in einer Druckzelle, die mit einer YM-30-Membran (Amicon, Inc., Beverly, MA) ausgestattet war, auf das Dreifache konzentriert. Die Probe wurde unter Verwendung von zwei Centricon-30-Einheiten (Amicon, Inc., Beverly, MA) auf Volumina von ungefähr 50 μl weiter konzentriert. Jede Probe wurde mit 6 μl SDS-Cocktail (4 μl 20% SDS, 1 μl 14,3 M β-Mercaptoethanol und 1 μl 0,1% Bromphenolblau) behandelt. Nach 15 Minuten Absitzenlassen bei Raumtemperatur wurden die Proben auf ein 10-13% Acrylamid-Gradientengel (Beispiel 3D) (16 × 16 cm × 1 mm dick) aufgetragen, und die Proteine wurden 9,5 Stunden lang durch Elektrophorese unter 150 V Gleichspannung aufgetrennt. Das Gel wurde 15 Minuten lang mit 0,1% Coomassie-Blau in 50% Methanol, 10% Essigsäure angefärbt und dann 2 × 20 Minuten lang in 50% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt. Die 33-kD-Wachs-Synthase-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und 3 × 20 Minuten lang in 50% Ethanol entfärbt. Eine Spur enthielt einen Proteinstreifen und wurde beim endgültigen Verdau nicht verwendet.
B. Vorbereitung von Proben für SDS-PAGE durch Fällung
Aliquote (0,8 ml) der geradzahligen Fraktionen aus der letzten HA-Säule (Vorschrift 1) wurden über das Säulenprofil hinweg in Gruppen zu dreien vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gleichmäßig auf drei 1,5-ml-Vials aufgeteilt. Protein wurde durch die Zugabe von 0,2 ml 40% TCA ausgefällt. Nach 30 Minuten auf Eis wurden die Proben zentrifugiert (12 000 × g, 15 Minuten bei 4 °C), um das ausgefällte Protein zu sedimentieren. Die Überstände wurden entfernt, und die Sedimente wurden zweimal mit 0,6 ml eiskaltem Aceton gewaschen. Die letzten drei Sedimente für jede vereinigte Gruppe von Proben wurden mit denselben 50 μl SDS-Probenpuffer resuspendiert, indem man den Puffer von einem Vial zum nächsten übertrug. Die geleerten Vials, deren Inhalt bereits resuspendiert worden war, wurden mit 10 μl Probenpuffer gewaschen, was ein resuspendiertes Gesamtvolumen von 60 μl für jede vereinigte Probe ergab. Die Proben wurden auf ein 12%-Acrylamid-Tris/Glycin-Mini-Gel (Novex, San Diego, CA, 1,5 mm × 10 Napf) aufgetragen, und Proteine wurden durch Elektrophorese unter 150 V Gleichspannung aufgetrennt, und zwar 20 Minuten über die Elution von Farbstoff aus dem unteren Teil des Gels hinaus. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau angefärbt und mit Hilfe von Gel-Clear (Novex, San Diego, CA) entfärbt. Wachs-Synthase wurde aus drei nichtäquivalenten Spuren auf dem Gel, die der Spitzen- und der Nachlauffraktion aus der Säule entsprachen, ausgeschnitten. Die Gelschnitte wurden in 1,5-ml-Vials gegeben und 2 Stunden lang mit 1 ml 50% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt. Die Entfärbungslösung wurde entfernt, und die Gelschnitte wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und für den Verdau im Gel über Nacht auf Trockeneis zum WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory an der Yale University geschickt. Ein Gelschnitt aus der durch Ultrafiltration konzentrierten Probe und drei Gelschnitte aus den durch Fällung konzentrierten Proben wurden für einen tryptischen Verdau im Gel vereinigt.
Beispiel 5 – Bestimmung der Aminosäuresequenz
Die Proteinsequenzierung wurde am WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory, Yale University, durchgeführt. Zu den Verfahren gehören die Aminosäureanalyse eines Teils (10-15%) des Gelschnitts zur Quantifizierung der Aminosäurezusammensetzung, der Abbau des Proteins mit einem der proteolytischen Enzyme (Trypsin oder Lysyl-Endopeptidase) und die Fraktionierung der Produkte durch Umkehrphasen-HPLC. Extinktionspeaks werden aus dem HPLC-Durchlauf ausgewählt und einer Laser-Desorptions-Massenspektrometrie unterzogen, um die Anwesenheit, Menge und Masse des Peptids vor der Proteinsequenzierung zu bestimmen. Die längsten Peptide werden für die Mikrosequenzierung ausgewählt.
Aminosäuresequenzen von Jojoba-Wachs-Synthase-Peptiden, die durch Trypsin-Verdau erhalten wurden, sind unten in Tabelle 3 unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes gezeigt. Tabelle 3 Aminosäuresequenz von tryptischen Peptiden aus Jojoba-Wachs-Synthase
Vergleichsbeispiel 6 – Reinigung von zusätzlichen Wachs-Synthasen und Reductasen
A. Verfahren in Anlehnung an die Jojoba-Wachs-Synthase-Solubilisierungs- und -Reinigungsverfahren, um partiell gereinigte Präparate von Wachs-Synthase von anderen Organismen zu erhalten, werden beschrieben.
Acinetobacter
Zellen des Acinetobacter-calcoaceticus-Stamms BD413 (ATCC Nr. 33305) werden auf ECLB (E.-coli-Luria-Bouillon), das während der logarithmischen Wachstumsphase gesammelt wurde, gezüchtet und in einem Puffer gewaschen, der entweder HEPES-NaOH, pH 7,5 oder Tricin-NaOH, pH 7,8, in 0,1 M NaCl, 1 mM DTT und Protease-Inhibitoren enthielt. Gewaschene Zellen wurden in frischem Puffer resuspendiert und durch Passieren durch eine French-Druckzelle lysiert (zwei Durchgänge mit 110,3 MPa (16 000 psi)). Nicht aufgebrochene Zellen werden durch 10 Minuten Zentrifugation mit 5000 × g entfernt, und die Membranen werden durch 1 Stunde Zentrifugation mit 100 000 × g isoliert. Das Membransediment wird in Vorratspuffer (25 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, oder 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, in 10% (w/v) Glycerin, 100 mM NaCl) homogenisiert. Wachs-Synthase-Aktivität wird in diesen Membranen mit Hilfe von Assaybedingungen nachgewiesen, die in Beispiel 1B für das Jojoba-Enzym beschrieben sind, wobei man [1-¹⁴C]-Palmitoyl-CoA und 18:1-Alkohol als Substrate verwendet.
Die Wachs-Synthase-Aktivität wird durch Inkubation der Membranen mit 2% CHAPS in Gegenwart von 0,5 M NaCl bei einem Verhältnis von Detergens zu Protein von 5:1 in Lösung gebracht. Die Solubilisierung der Aktivität wird durch den Nachweis von Wachs-Synthase-Enzymaktivität in der Überstandsfraktion nach 1 Stunde Zentrifugation mit 200 000 × g und durch Ausschlusschromatographie nachgewiesen (d.h. die Aktivität eluiert als symmetrischer Peak in den zurückgehaltenen Fraktionen aus der Säule). Die Aktivität des solubilisierten Enzyms wird durch einfache Verdünnung der CHAPS-Konzentration auf ca. 0,3% (d.h. unterhalb seiner CMC) nachgewiesen. Ein Einbau des Enzyms in Phospholipidvesikel ist nicht erforderlich, um die solubilisierte Aktivität nachzuweisen.
Zur Reinigung wird die solubilisierte Acinetobacter-Wachs-Synthase-Aktivität chromatographischen Verfahren ähnlich denen unterzogen, die für die Jojoba-Wachs-Synthase beschrieben sind. Bei einer Vorschrift wird das lösliche Proteinpräparat unter Niedersalzbedingungen (100 mM NaCl in einem Säulenpuffer, der 0,75% CHAPS, 10% Glycerin, 25 mM HEPES-NaOH enthält, pH 7,5) auf eine Blue-A-Agarose-Säule geladen und unter Verwendung von 1,0 M NaCl im Säulenpuffer von der Säule eluiert.
Ausschlusschromatographie auf dem Medium Superose^® 12 (Pharmacia; Piscataway, NJ) wird verwendet, um einen Schätzwert für die Größe des nativen Enzyms zu erhalten. Ein Vergleich mit Molekülmassestandards, die unter identischen Bedingungen chromatographiert werden, ergibt eine scheinbare Masse von ca. 40 kDa für die solubilisierte Wachs-Synthase.
In einer anderen Vorschrift wird solubilisiertes Protein auf eine Blue-A-Säule geladen, die mit 25 mM Tricin-NaOH, pH 7,8, 1% CHAPS, 20% Glycerin, das 0,1 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war, und in demselben Puffer, der 1,0 M NaCl enthielt, eluiert. Dann wird das eluierte Material auf eine Hydroxyapatitsäule geladen, die mit Säulenpuffer, der 1,0 M NaCl enthielt, äquilibriert worden war, und im Unterschied zur Jojoba-Wachs-Synthase bindet die Acinetobacter-Wachs-Synthase-Aktivität an die Säule und wird in einem Gradienten von 1-100 mM Dikaliumphosphat eluiert. Wenn mit SDS-PAGE untersucht wird, können mehrere in Frage kommende Proteine mit der Wachs-Synthase-Aktivität in Beziehung gebracht.
Euglena
Euglena gracilis, Stamm Z (ATCC Nr. 12716) wird heterotroph im Dunkeln (Tani et al. (1987), Agric. Biol. Chem. 51: 225-230) bei ca. 26 °C unter mäßigem Schütteln gezüchtet. Die Zelten werden isoliert und in Puffer gewaschen, der 25 mM Bistrispropan, pH 7,0, 0,25 M NaCl und 1 mM EDTA enthält. Die gewaschenen Zellen werden in frischem Puffer resuspendiert und durch Passieren durch eine French-Druckzelle lysiert (zwei Durchgänge mit 110,3 MPa (16 000 psi)). Nicht aufgebrochene Zellen, Zelltrümmer und Zellkerne werden durch 20 Minuten Zentrifugation mit 20 000 × g entfernt, und die mikrosomalen Membranen werden durch 1 Stunde Zentrifugation mit 200 000 × g isoliert. Das Membransediment wird in Vorratspuffer (25 mM Bistrispropan, pH 7,0, 0,25 M NaCl, 10% (w/v) Glycerin und 1 mM EDTA) homogenisiert. Wachs-Synthase-Aktivität wird in diesen Membranen mit Hilfe von Assaybedingungen nachgewiesen, wie sie für das Jojoba-Enzym beschrieben wurden. Das radioaktiv markierte Substrat ist dasselbe wie für das Jojoba-Beispiel (d.h. [1-¹⁴C]-Palmitoyl-CoA), doch wird 16:0 und nicht 18:1 als Alkoholakzeptor verwendet, und es wird Bistrispropan-Puffer bei pH 7,0 verwendet.
Die Euglena-Wachs-Synthase-Aktivität wird durch Inkubation der Membranen mit 2% CHAPS in Gegenwart von 0,5 M NaCl in Lösung gebracht. Die Solubilisierung des Proteins wird durch den Nachweis von Enzymaktivität in der Überstandsfraktion nach 1 Stunde Zentrifugation mit 200 000 × g nachgewiesen. Die Aktivität des solubilisierten Enzyms wird durch Verdünnung der CHAPS-Konzentration auf ca. 0,3% (d.h. unterhalb seiner CMC) nachgewiesen. Es ist nicht notwendig, das Enzym in Phospholipidvesikel einzubauen, wie im Falle der solubilisierten Jojoba-Wachs-Synthase.
Zur partiellen Reinigung wird die solubilisierte Euglena-Wachs-Synthase-Aktivität einer chromatographischen Trennung auf Blue-A-Agarose-Medium unterzogen. Die Säule wird mit 0,1 M NaCl in einem Säulenpuffer äquilibriert, der 25 mM Bistrispropan, pH 7,0, 20% (w/v) Glycerin, 0,75% CHAPS und 1 mM EDTA enthält. Die Probe, die solubilisierte Wachs-Synthase-Aktivität enthält, wird auf 0,1 M NaCl verdünnt und auf eine Säule von 1 × 7 cm (5,5 ml Bettvolumen) geladen. Die Säule wird mit Äquilibrierungspuffer gewaschen und einem linearen NaCl-Gradienten (0,1 M bis 1,0 M NaCl) in Säulenpuffer unterworfen. Die Wachs-Synthase-Aktivität wird als breiter Peak in der letzten Hälfte des Salzgradienten eluiert.
Eine SDS-PAGE-Analyse von Säulenfraktionen zeigt, dass die Polypeptidkomplexität der aus der Säule eluierten Aktivität relativ zum aufgeladenen Material stark reduziert ist. Ein Polypeptid mit einer scheinbaren Molekülmasse von ca. 41 kDa wurde beobachtet, das zusammen mit der Wachs-Synthase-Aktivität in den Säulenfraktionen eluierte. Weitere Reinigungstechniken, wie sie für Jojoba und Acinetobacter beschrieben sind, werden durchgeführt, um die Assoziation der Wachs-Synthase-Aktivität mit dem Peptid von ca. 41 kDa zu überprüfen.
Für die weitere Analyse der Wachs-Synthase-Aktivität in Euglena wurde eine Ausschlusschromatographie wie folgt durchgeführt. Ein mikrosomales Membranpräparat wurde von Euglena-Zellen erhalten, die auf flüssigem heterotrophem Medium (Tani et al., loc. cit.) im Dunkeln gezüchtet wurden. Die Wachs-Synthase-Aktivität wurde durch 1 Stunde Behandlung der Membranen mit 2% (w/v) CHAPS und 500 mM NaCl in einer gepufferten Lösung (25 mM Bistris, pH 7,0, 1 mM EDTA und 10% (w/v) Glycerin) auf Eis in Lösung gebracht. Nach Verdünnung des CHAPS auf 0,75% und des NaCl auf 200 mM durch Zugabe eines Verdünnungspuffers wurde die Probe 1,5 Stunden lang mit ca. 200 000 × g zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wurde auf eine Blue-A-Farbstoffsäule geladen, die mit Säulenpuffer (25 mM Bistris, pH 7,0, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,75% CHAPS), der außerdem 200 mM NaCl enthielt, voräquilibriert worden war. Die Säule wurde mit Säulenpuffer, der 200 mM NaCl enthielt, gewaschen, bis der A280-Wert des Effluenten auf den Wert vor der Beladung zurückkehrte. Die Wachs-Synthase-Aktivität, die an die Säule gebunden hatte, wurde freigesetzt, indem man die NaCl-Konzentration im Säulenpuffer auf 1,5 M erhöhte. Die Fraktionen aus der Blue-A-Säule, die Wachs- Synthase-Aktivität enthielten, welche durch das 1,5 M NaCl (ca. 20 ml kombiniertes Volumen) freigesetzt worden war, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration (Amicon-Druckzelle, die mit einer YM-30-Membran ausgestattet war) auf ungefähr das 30fache konzentriert. Das konzentrierte Material aus der Blue-A-Säule wurde als Probe für eine Trennung durch Ausschlusschromatographie auf dem Medium Superose^® 12 (Pharmacia) verwendet.
Ungefähr 200 μl der Probe wurde auf eine Superose^®-12-Säule (HR 10/30) geladen, die mit Säulenpuffer, der 0,5 M NaCl enthielt, voräquilibriert worden war, und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,1 ml/min entwickelt. Die Wachs-Synthase-Aktivität eluierte als glatter Peak von der Säule. Ein Vergleich des Elutionsvolumens der Wachs-Synthase-Aktivität mit den Elutionsprofilen von Molekülmasse-Standardproteinen ergab einen Schätzwert von 166 kDa für die scheinbare Molekülmasse des Enzyms. Fraktionen, die Wachs-Synthase-Aktivität enthielten, wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und anschließendes Anfärben mit Silber analysiert. Eine vorläufige Analyse der Polypeptidprofile der verschiedenen Fraktionen zeigte keine Proteine mit Molekülmassen von 100 kDa oder mehr, deren Färbeintensität zum Aktivitätsprofil zu passen schien. Das Wachs-Synthase-Polypeptid kann als Nebenkomponente in dem Probengemisch vorhanden sein, die auf dem mit Silber angefärbten Gel nicht leicht nachweisbar ist. Alternativ dazu kann das Enzym auch aus Untereinheiten bestehen, die während der SDS-PAGE dissoziieren.
B. Neben der Jojoba-Reductase, wie die von der in 1 angegebenen Sequenz codierten, sind auch Reductase-Proteine aus anderen Quellen zur Verwendung in Verbindung mit den Wachs-Synthase-Proteinen dieser Erfindung wünschenswert. Solche Proteine können von Organismen identifiziert und erhalten werden, die bekanntermaßen Wachsester aus Alkohol- und Acylsubstraten produzieren.
Zum Beispiel kann eine NADH-abhängige Fettacyl-CoA-Reductase-Aktivität aus mikrosomalen Membranen erhalten werden, die aus Euglena gracilis isoliert werden. Verfahren, die verwendet werden können, um mikrosomale Membranen zu isolieren, sind zum Beispiel in WO 92/14816 (eingereicht am 21. Februar 1992) beschrieben. Die Reductase-Aktivität wird aus diesen Membranen unter Verwendung derselben Ansätze in Lösung gebracht, wie sie für Jojoba-Reductase und – Wachs-Synthase verwendet wurden. Die Membranen werden eine Stunde lang auf Eis mit verschiedenen Mengen des Detergens CHAPS in einer Pufferlösung inkubiert, die aus 25 mM Bistris, pH 6,9, 250 mM NaCl, 10% Glycerin und 1 mM EDTA besteht. Dann wird die Probe eine Stunde lang mit 200 000 × g zentrifugiert, und der Überstands- und die Sedimentfraktion werden auf NADH-abhängige Reductase-Aktivität getestet, wobei man radioaktiv markiertes Palmitoyl-CoA und NADH als Substrate verwendet. Ein zweckmäßiger Assay für Reductase-Aktivität ist in WO 92/14816 beschrieben. Eine Inkubation der Membranen mit 0,3, 0,5 oder 0,7% (w/v) CHAPS führt zur Retention der Reductase-Aktivität in den Überstandsfraktionen, was auf eine Solubilisierung des Enzyms hinweist. Wenn CHAPS während der Inkubation und Zentrifugation weggelassen wird, findet man die gesamte Reductase-Aktivität in der Sedimentfraktion. Alle Proben werden vor dem Testen in derselben Pufferlösung auf das Zehnfache verdünnt, um das während der Inkubation vorhandene CHAPS zu verdünnen. Die Anwesenheit von CHAPS im Assay in Konzentrationen oberhalb der CMC (ungefähr 0,5% (w/v) führt zu einer Hemmung der Enzymaktivität. Die Stabilität der Reductase-Aktivität in bis zu 2% CHAPS kann verbessert werden, indem man die Glycerinkonzentration in der Pufferlösung auf 20% erhöht. Die Reductase-Aktivität wird durch Verdünnung des CHAPS unterhalb der CMC zurückgewonnen.
Beispiel 7 – Isolierung von Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen
DNA-Sequenzen, die Wachs-Synthase-Peptide codieren, werden aus Jojoba unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden erhalten, die ausgehend von Wachs-Synthase-Peptidsequenzen entworfen werden. Die Wachs-Synthase-Nucleinsäuresequenzen können durch Amplifikation von DNA durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Oligonucleotiden als Primer oder alternativ dazu durch Screening einer cDNA- oder genomischen DNA-Bibliothek, indem man die Oligonucleotide oder zuvor isolierte Sequenzen zur Verwendung als Sonden radioaktiv markiert, erhalten werden.
A. Konstruktion von Jojoba-cDNA-Bibliotheken
RNA wird nach einem Polyribosom-Isolierungsverfahren, das ursprünglich von Jackson und Larkins beschrieben wurde (Plant Physiol. (1976) 57: 5-10), gemäß einer Modifikation von Goldberg et al. (Developmental Biol. (1981) 83: 201-217) aus Jojoba-Embryos isoliert, die 80-90 Tage nach der Blüte gesammelt wurden. Bei diesem Verfahren werden alle Schritte, wenn nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben ist, bei 4 °C durchgeführt. 10 g Gewebe werden in einem Waring-Mischer in flüssigem Stickstoff gemahlen, bis das Gewebe zu einem feinen Pulver wird. Nachdem der flüssige Stickstoff verdampft ist, werden 170 ml Extraktionspuffer (200 mM Tris, pH 9,0, 160 mM KCl, 25 mM EGTA, 70 mM MgCl₂, 1% Triton^® X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 1 mM Spermidin, 10 mM β-Mercaptoethanol und 500 mM Saccharose) hinzugefügt, und das Gewebe wird etwa 2 Minuten lang homogenisiert. Das Homogenisat wird über steriles Miracloth filtriert und 20 Minuten lang mit 12 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird in einen sterilen 500-ml-Kolben dekantiert, und 1/19 Volumen einer 20%igen Tensidlösung (20% Brij 35, 20% Tween 40, 20% Noidet p-40 w/v) wird bei Raumtemperatur hinzugefügt. Die Lösung wird 30 Minuten lang bei 4 °C mit mäßiger Geschwindigkeit gerührt, und dann wird der Überstand 30 Minuten lang mit 12 000 × g zentrifugiert.
Etwa 30 ml Überstand werden in sterile Ti-60-Zentrifugenröhrchen allquotiert und mit 7 ml einer Lösung unterschichtet, die 40 mM Tris, pH 9,0, 5 mM EGTA, 200 mM KCl, 30 mM MgCl₂, 1,8 M Saccharose, 5 mM β-Mercaptoethanol enthält. Die Röhrchen werden bis oben mit Extraktionspuffer gefüllt und 4 Stunden lang bei 4 °C in einem Ti60-Rotor mit 60 000 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt, und 0,5 ml Resuspensionspuffer (40 mM Tris, pH 9,0, 5 mM EGTA, 200 mM KCl, 30 mM MgCl₂, 5 mM β-Mercaptoethanol) werden in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden 10 Minuten lang auf Eis gelegt, und danach werden die Sedimente gründlich resuspendiert und vereinigt. Dann wird der Überstand 10 Minuten lang mit 120 × g zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Ein Volumen selbstverdauter 1 mg/ml Proteinase K in 20 mM Tris, pH 7,6, 200 mM EDTA, 2% N-Laurylsarcosinat wird zu dem Überstand gegeben, und das Gemisch wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
RNA wird ausgefällt, indem man 1/10 Volumen Natriumacetat und 2 Volumina Ethanol hinzufügt. Nach mehreren Stunden bei –20 °C wird RNA durch 30 Minuten Zentrifugation mit 12 000 × g bei 4 °C sedimentiert. Das Sediment wird in 10 ml TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA) resuspendiert und mit dem gleichen Volumen Phenol, das mit Tris pH 7,5 gesättigt ist, extrahiert. Die Phasen werden getrennt, indem man 20 Minuten lang bei 4 °C mit 10 000 × g zentrifugiert. Die wässrige Phase wird entfernt, und die organische Phase wird mit einem Volumen TE-Puffer erneut extrahiert. Die wässrigen Phasen werden dann vereinigt und mit einem Volumen Chloroform extrahiert. Die Phasen werden wiederum durch Zentrifugation getrennt, und die wässrige Phase wird mit Ethanol ausgefällt, wie es oben beschrieben wurde, was die polyribosomale RNA ergibt.
Polysaccharid-Kontaminanten in dem polyribosomalen RNA-Präparat werden entfernt, indem man die RNA über eine Cellulosesäule (Sigma-cell 50) in Puffer mit hohem Salzgehalt (0,5 M NaCl, 20 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) laufen lässt. Die Kontaminante bindet an die Säule, und die RNA wird im Eluent aufgefangen. Die Eluentfraktionen werden vereinigt, und die RNA wird mit Ethanol ausgefällt. Dann wird die ausgefällte Gesamt-RNA in einem kleineren Volumen resuspendiert und auf eine Oligo-d(T)-Cellulosesäule aufgetragen, um die polyadenylierte RNA zu isolieren.
Polyadenylierte RNA wird verwendet, um eine cDNA-Bibliothek in dem Plasmid-Klonierungsvektor pCGN1703 aufzubauen, der von dem kommerziellen Klonierungsvektor Bluescribe M13- (Stratagene Cloning Systems; San Diego, CA) abgeleitet ist und wie folgt hergestellt wird. Der Polylinker von Bluescribe M13- wird durch Verdau mit BamHI, Behandlung mit Mungbohnen-Endonuclease und Ligierung der glatten Enden verändert, wobei ein BamHI-deletiertes Plasmid pCGN1700 entsteht. pCGN1700 wird mit EcoRI und SstI (benachbarte Restriktionsstellen) verdaut und mit einem synthetischen Linker assoziiert, der Restriktionsstellen für BamHI, PstI, XbaI, ApaI und SmaI, einen 5'-Überhang von AATT und einen 3'-Überhang von TCGA aufweist. Durch das Einsetzen des Linkers in pCGN1700 wird die EcoRI-Stelle beseitigt, die SstI-Stelle, die man in Bluescribe findet, regeneriert (hier auch zuweilen als "SacI" bezeichnet), und es werden die im Linker enthaltenen neuen Restriktionsstellen hinzugefügt. Das resultierende Plasmid pCGN1702 wird mit HindIII verdaut und mittels Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen; die lineare DNA wird mit PvuII partiell verdaut und mit T4-DNA-Ligase in verdünnter Lösung ligiert. Eine Transformante, bei der der lac-Promotor-Bereich deletiert ist, wird ausgewählt (pCGN1703) und als Plasmid-Klonierungsvektor verwendet.
Kurz gesagt, das Klonierungsverfahren für die cDNA-Synthese ist wie folgt. Der Plasmid-Klonierungsvektor wird mit SstI verdaut, und an den resultierenden klebrigen 3'-Überhang-Enden werden Homopolymer-T-Schwänze erzeugt, wobei man terminate Desoxynucleotidyl-Transferase verwendet. Das Plasmid mit dem Schwanz wird durch Oligo(dA)-Cellulose-Chromatographie von unverdautem oder schwanzlosem Plasmid abgetrennt. Der resultierende Vektor dient als Primer für die Synthese von ersten cDNA-Strängen, die kovalent an beide Enden des Vektorplasmids gebunden sind. Die cDNA-mRNA-Vektorkomplexe werden in Gegenwart von Desoxyguanosintriphosphat mit terminaler Transferase behandelt, wobei G-Schwänze an den Enden der cDNA-Stränge entstehen. Der zusätzliche cDNA-mRNA-Komplex neben der BamHI-Stelle wird durch BamHI-Verdau entfernt, wobei ein cDNA-mRNA-Vektorkomplex mit einem klebrigen BamHI-Ende an einem Ende und einem G-Schwanz am anderen zurückbleibt. Dieser Komplex wird zyklisiert, wobei man einen assoziierten synthetischen Zyklisierungslinker verwendet, der ein klebriges 5'-BamHI-Ende, Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme NotI, EcoRI und SstI und ein 3'-C-Schwanz-Ende aufweist. Nach der Ligierung und Reparatur wird der E.-coli-Stamm DH5a (BRL, Gaithersburg, MD) mit den zirkulären Komplexen transformiert, um die cDNA-Bibliothek zu erzeugen. Die Jojoba-Embryo-cDNA-Bank enthält ungefähr 1,5 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Größe der cDNA-Inserts von ungefähr 500 Basenpaaren.
Polyadenylierte Jojoba-RNA wird ebenfalls verwendet, um eine cDNA-Bibliothek im Klonierungsvektor IZAPII/EcoRI (Stratagene, San Diego, CA) aufzubauen. Die Bibliothek wird mit Hilfe von Vorschriften, DNA und Bakterienstämmen aufgebaut, wie sie vom Hersteller geliefert werden. Klone werden mit Hilfe von Gigapack-Gold-Verpackungsextrakten (Stratagene) verpackt, ebenfalls gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Die auf diese Weise aufgebaute cDNA-Bibliothek enthält ungefähr 1 × 10⁶ Klone mit einer mittleren Größe der cDNA-Inserts von ungefähr 400 Basenpaaren,
B. Synthetische Oligonucleotide
Zur Verwendung als PCR-Primer werden im Allgemeinen aus einzelsträngigen DNA-Matrizen, die durch Reverse Transcription ais mRNA erhalten wurden, Oligonucleotide hergestellt, die die Sequenz, die den Wachs-Synthase-Peptid-codierenden Sequenzen entspricht, in der Sense-Orientierung enthalten. Diese Oligonucleotide werden als Primer für die "Vorwärts"-Amplifikationsreaktion unter Bildung von Sinnstrang-DNA verwendet.
Für die "Rückwärts"-Reaktion für die Amplifikation des nichtcodierenden DNA-Strangs kann ein Oligonucleotid so gestaltet werden, dass es mit einem Teil des Primers identisch ist, der verwendet wird, um die DNA-Matrize für die PCR herzustellen. Alternativ dazu können auch Oligonucleotide, die eine Sequenz enthalten, die zu Wachs-Synthase-Peptid-codierenden Sequenzen komplementär ist, in Kombination mit einem "Vorwärts"-Wachs-Synthase-Oligonucleotid-Primer, wie er oben beschrieben ist, verwendet werden.
Wenn die Wachs-Synthase-Peptid-Sequenzen Aminosäuren enthalten, die von mehreren verschiedenen Codons codiert werden können, können der Vorwärts- oder der Rückwärtsprimer "degenerierte" Oligonucleotide sein, d.h. ein Gemisch aus allen oder einigen der möglichen codierenden Sequenzen für einen bestimmten Peptidbereich enthalten. Um die Zahl der verschiedenen Oligonucleotide, die in einem solchen Gemisch vorhanden sind, zu reduzieren, werden bei der Herstellung des synthetischen Oligonucleotids für PCR-Primer vorzugsweise Peptidbereiche ausgewählt, die die kleinstmögliche Zahl an möglichen codierenden Sequenzen aufweisen. Wenn das synthetische Oligonucleotid verwendet werden soll, um eine Bibliothek direkt nach Wachs-Synthase-Sequenzen zu durchmustern, sind in ähnlicher Weise Oligonucleotide mit geringerer Degeneriertheit bevorzugt. Folgendes ist ein Beispiel für die Sequenz des Peptids WSPEP33 (mittlere Linie) und der Vorwärts- (obere Linie) und Rückwärts-DNA-Sequenz (untere Linie), die das Peptid WSPEP33 codieren.
Folgendes ist ein Beispiel für die Sequenz des Peptids WSPEP29 (mittlere Linie) und der Vorwärts- (obere Linie) und Rückwärts-DNA-Sequenz (untere Linie), die das Peptid WSPEP29 codieren.
Folgendes ist ein Beispiel für die Sequenz des Peptids WSPEP14 (mittlere Linie) und der Vorwärts- (obere Linie) und Rückwärts-DNA-Sequenz (untere Linie), die das Peptid WSPEP14 codieren.
Folgendes sind Sequenzen von synthetischen Oligonucleotiden, die verwendet werden können, um Wachs-Synthase-Sequenzen zu erhalten. Die Namen der Oligonucleotide spiegeln die besonderen Wachs-Synthase-Peptidfragmentnummern wider, die in Beispiel 5 aufgeführt sind. Der Buchstabe "F" im Oligonucleotidnamen bezeichnet einen PCR-Vorwärtsreaktionsprimer. Der Buchstabe "R" bezeichnet einen PCR-Vorwärtsreaktionsprimer.
Die Nucleotidbasencodes für die obigen Nucleotide sind wie folgt:

A: = Adenin
T: = Thymin
Y: = Cytosin oder Thymin
C: = Cytosin
U: = Uracil R = Adenin oder Guanin
G: = Guanin
I: = Inosin
O: = Inosin oder Cytosin
H: = Adenin, Cytosin oder Thymin
N: = Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin
W: = Adenin oder Thymin
S: = Guanin oder Cytosin
B: = Guanin, Cytosin oder Thymin
K: = Guanin oder Thymin
M: = Adenin oder Cytosin

C. PCR-Reaktionen
Poly(A)+-RNA wird aus Gesamt-RNA isoliert, die aus Jojoba-Gewebe isoliert wurde, wie es oben beschrieben ist. cDNA wird durch Reverse Transcription aus Poly(A)+ oder Gesamt-RNA hergestellt, wobei man den Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Jojoba-cDNA wird in den unten dargelegten PCR-Reaktionen 1-16 verwendet.
PCR wird in einer PCR-Maschine des Typs Perkin Elmer Cetus GeneAmp PCR System 9600 durchgeführt, wobei man durch Reverse Transcription erhaltene einzelsträngige cDNA als Matrize verwendet. Kommerziell erhältliche PCR- Reaktions- und -Optimierungsreagentien werden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
Das für die PCR-Amplifikation verwendete Temperaturprogramm ist wie folgt: 1 Zyklus bei 95 °C während 2 Minuten; 4 Zyklen bei 95 °C während 30 Sekunden, 60 °C während 1 Minute und 72 °C während 4 Minuten; 4 Zyklen bei 95 °C während 30 Sekunden, 57 °C während 1 Minute und 72 °C während 4 Minuten; 4 Zyklen bei 95 °C während 30 Sekunden, 54 °C während 1 Minute und 72 °C während 4 Minuten; 4 Zyklen bei 95 °C während 30 Sekunden, 51 °C während 1 Minute und 72 °C während 4 Minuten; und 25 Zyklen bei 95 °C während 30 Sekunden, 48 °C während 1 Minute und 72 °C während 4 Minuten.
Aus den Reaktionen 3 und 4 wurde ein PCR-Produkt mit einer Länge von ungefähr 700 Nucleotiden nachgewiesen. Das PCR-Produkt wurde mit Hilfe von Gel-Elektrophorese gereinigt und in pCR2.1 kloniert, wobei ein Topo TA Cloning Kit (Invitrogen Corp.) verwendet wurde. Die DNA-Sequenz des klonierten PCR-Produkts wurde bestimmt und war 708 Nucleotide lang (3).
Die gesamte cDNA kann mit Hilfe von 5'- und 3'-RACE (Frohman et al., 1988) amplifiziert werden, wobei man den Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Aus der Sequenz des 708-Nucleotiden-PCR-Fragments, das mit Hilfe der Primer WSPEP14-F1 und WSPEP33-R2 abgeleitet wurde, wurden die folgenden Primer synthetisiert:
3'-RACE-Reaktionen wurden unter Verwendung der Parimere WSRACEF1, WSRACEF2 und WSRACEF3 gestaltet. 5'-RACE-Reaktionen wurden unter Verwendung der Parimere WSRACER1, WSRACER2 und WSRACER3 gestaltet. PCR-Reaktionen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Clontech Laboratories Inc.) durchgeführt. Alle 6 PCR-Reaktionen ergaben sichtbare PCR-Produkte mit Größen im Bereich von ungefähr 700 Nucleotiden bis 1000 Nucleotide. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt und gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen Corp.) in pCR2.1 kloniert. Die DNA-Sequenz von mehreren Klonen sowohl aus den 5'- als auch aus den 3'-RACE-Reaktionen und des früheren PCR-Produkts, das von den Primern WSPEP14-F1 und WSPEP33-R2 abgeleitet war, wurden mit Hilfe von Sequencher Software (Gene Codes Corp.) zusammengefügt. Die zusammengefügte Sequenz aller PCR-Produkte enthält den codierenden Bereich der cDNA-Sequenz.
Um ein Genfragment zu isolieren, das für die Klonierung des Wachs-Synthase-Gens in Expressionscassetten für die Pflanzenlipidmodifikation geeignet ist, kann der codierende Bereich des Gens ausgehend von cDNA unter Verwendung der Primer WAXSYNFOR und WASXYNREV amplifiziert werden. Die Sequenz von WAXSYNFOR lautet GGATCCGTCGACACAATGGAGGTGGAGAAGGAGCTAAAG, und die Sequenz von WASXYNREV lautet GCATGCAGATCTCACCACCCCAACAAACCCATC. Die PCR-Reaktion wird unter Verwendung des Marathon CDNA gemäß den Anweisun gen des Herstellers (Clontech Laboratories Inc.) durchgeführt. Das PCR-Programm besteht aus 30 Zyklen bei 94 °C während 15 Sekunden, 60 °C während 1 Minute, 72 °C während 2 Minuten. Die PCR-Produkte wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen Corp.) in pCR2.1 kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pCGN8538 bezeichnet.
Beispiel 8. Erzeugung von transgenen Pflanzen, die die Wachs-Synthase-cDNA enthält
Zwei binäre Pflanzen-Vektoren wurden konstruiert. Das Plasmid pCGN8559 enthält 3 Gene, die für die Wachsbiosynthese notwendig sind: für das kondensierende Enzym, das an der Fettsäureverlängerung auf Kettenlängen von mehr als 18 Kohlenstoffatomen beteiligt ist (KCS), die Acyl-CoA-Reductase, die an der Bildung von Fettalkoholen beteiligt ist, und die Wachs-Synthase. Ein Kontrollplasmid, pCGN8557, enthält die Gene für KCS und Acyl-CoA-Reductase. Das Asp718-Fragment von pCGN7698, das die Jojoba-Acyl-CoA-Reductase unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen von Napin enthält, wurde in die Asp718-Stelle des binären Vektors pCGN5139 kloniert, wobei pCGN8555 entstand. Das NotI-Fragment von pCGN7844, das die Lunaria-KCS unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen von Napin enthält, wurde in die NotI-Stelle von pCGN8555 kloniert, wobei pCGN8557 entstand. Das SalI-BglII-Fragment von pCGN8538, das den codierenden Bereich des Jojoba-Wachs-Synthase-Gens enthält, wurde in die Napin-Expressionscassette von pCGN7770 kloniert, das mit denselben beiden Restriktionsendonucleasen verdaut wurde, wobei pCGN8553 entstand. Das Sse8387-Fragment von pCGN8553, das die Jojoba-Wachs-Synthase unter der Kontrolle der regulatorischen Sequenzen von Napin enthält, wurde in die Sse8387-Stelle von pCGN8557 kloniert, wobei pCGN8559 entstand. Die binären Vektoren wurden durch Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens EHA105 eingeführt. Die Vektoren wurden verwendet, um Arabidopsis thaliana Ökotyp No-O gemäß der Vakuuminfiltrationsvorschrift von Bent et al. (1994, Science 265: 1856-1860) zu transformieren.
Beispiel 9. Analyse des Samenöls
Schoten von sieben Arabidopsis-Pflanzen, die mit pCGN8559 transformiert worden waren und sich in verschiedenen Stadien der Entwicklung befanden, wurden geerntet. Der sich entwickelnde Samen wurde aus zehn Schoten, die von jeder Pflanze gesammelt wurden, entnommen und in 275 μl Puffer (100 mM HEPES/NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl) homogenisiert. Ein Teil des Homogenisats (200 μl) wurde 20 Minuten lang bei 4 °C mit 16 000 × g zentrifugiert, was zu einem Überstand und Sediment führte. Das Sediment wurde in 200 ml desselben Puffers resuspendiert. Das Homogenisat und die beiden Fraktionen wurden nach der in Beispiel 1B ausführlich beschriebenen Vorschrift auf Wachs-Synthase-Aktivität getestet. Pro Assay wurden 25 μl Probe in einem Endvolumen von 250 μl verwendet. Der Assaypuffer enthielt 40 μM 1-¹⁴C-16:0-CoA (spezifische Aktivität 5 μCi/μmol), 200 μM 18:1-Alkohol, 50 mM HEPES/NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl und 2 mM β-Mercaptoethanol. Eine DC-Analyse zeigte in 5 der 7 analysierten Pflanzen den Einbau von radioaktivem Marker aus 1-¹⁴C-16:0-CoA in eine Bande, die zusammen mit einem Wachsstandard wanderte (4). Diese Aktivität wurde in der Homogenisat- und der Sedimentfraktion, aber nicht in der Überstandfraktion nachgewiesen. Die in diesen Proben nachgewiesene Wachs-Synthase-Aktivität ist mehrere Größenordnungen größer als eine endogene Wachs-Synthase-Aktivität, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie in sich entwickelnden Arabidopsis-Samen vorhanden ist. Die in 8612-3 und 8613-2 nachgewiesene Aktivität deutet auf diese endogene "Hintergrund"-Aktivität hin. Eine positive Kontrolle für die Wachsaktivität war die Jojoba-(DP2)-Membranfraktion.
Die obigen Ergebnisse beweisen, dass aus partiell gereinigten Wachs-Synthase-Proteinen erhaltene Nucleinsäuresequenzen aktiv in Bezug auf die Bildung von Wachsestern aus Fettalkohol- und Fettacylsubstraten sind. Verfahren zur Gewinnung der Wachs-Synthase-Proteine und ihrer Aminosäuresequenzen werden angegeben. Solche Nucleinsäuresequenzen können so manipuliert werden, dass sie für die Transcription der Sequenzen und/oder Expression von Wachs-Synthase-Proteinen in Wirtszellen sorgen, wobei diese Proteine für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können. Zu diesen Anwendungen gehören die Produkti on von Wachsesterverbindungen, wenn die Wachs-Synthase in Wirtszellen verwendet wird, die eine Quelle für Fettalkoholsubstrate aufweisen, wobei diese Substrate den Wirtszellen nativ sein oder durch Verwendung von rekombinanten Konstrukten, die ein Fettacyl-Reductase-Protein codieren, das in Bezug auf die Bildung von Alkoholen aus Fettacylsubstraten aktiv ist, zugeführt werden können.

Claims

Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon, die bzw. der bezüglich der Bildung eines Wachsesters aktiv ist und durch ein Nucleinsäuremolekül codiert wird, das die Nucleinsäuresequenz von 3B umfasst.
Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei der Wachsester aus einem Fettalkohol und einem Fettacyl-CoA-Substrat gebildet ist.
Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei die Jojoba-Acyltransferase gegenüber einem Fettacylsubstrat mit einer Kohlenstoffkette der Formel C_2x aktiv ist, wobei x eine ganze Zahl von 6 bis 12 ist.
Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1, wobei die Jojoba-Acyltransferase gegenüber einem Fettalkoholsubstrat mit einer Kohlenstoffkette der Formel C_2x aktiv ist, wobei x eine ganze Zahl von 6 bis 12 ist.
Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1, die bzw. der die Peptidsequenz TIDEYPVMFNYTQK umfasst.
Jojoba-Acyltransferase oder ein Teil davon gemäß Anspruch 1, die bzw. der die Peptidsequenz FVPAVAPHGGALR umfasst.
Rekombinantes DNA-Konstrukt, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die die Jojoba-Acyltransferase oder das Teil davon gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie eine heterologe DNA-Sequenz, die natürlicherweise nicht mit der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz assoziiert ist, codiert.
Konstrukt gemäß Anspruch 7, das die Nucleinsäuresequenz von 3B oder ein Teil davon umfasst.
Konstrukt gemäß Anspruch 7 oder 8, das weiterhin einen Promotor umfasst, der wenigstens für die Transcription der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz in einer Wirtszelle sorgt.
Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei der Promotor für die Expression der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz in einer Pflanzenzelle sorgt.
Konstrukt gemäß Anspruch 10, wobei die Pflanzenzelle eine Embryozelle einer Samenpflanze ist.
Konstrukt gemäß Anspruch 9, wobei der Promotor für die Expression der die Jojoba-Acyltransferase codierenden Sequenz in einer Bakterienzelle sorgt.
Konstrukt gemäß Anspruch 10, wobei der Promotor aus einem Gen stammt, das bevorzugt in einer Embryozelle einer Samenpflanze exprimiert wird.
Zelle, die ein Konstrukt gemäß einem der Ansprüche 7 bis 13 umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 14, die eine Pflanzenzelle ist.
Zelle gemäß Anspruch 15, die eine Brassica-Pflanzenzelle ist.
Zelle gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, die eine Wirtszelle ist und ein rekombinantes Konstrukt umfasst, das eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ein Fettacyl-Reductase-Protein codiert, und wobei die die Jojoba-Acyltransferase codierende Sequenz gegenüber der Wirtszelle heterolog ist und wobei die Sequenzen, die die Reductase und die Jojoba-Acyltransferase codieren, unter der regulatorischen Kontrolle von Promotoren stehen, die in der Wirtszelle funktionieren.
Prokaryontische Zelle, die eine Jojoba-Acyltransferase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Wachsesters in einer Wirtszelle, umfassend die Schritte des Züchtens einer Wirtszelle, die ein rekombinantes Konstrukt umfasst, wobei das Konstrukt eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die wenigstens einen Teil der Jojoba-Acyltransferase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert, wobei die die Jojoba-Acyltransferase codierende Sequenz unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen steht, die in der Zelle funktionieren, unter Bedingungen, die die Expression der Jojoba-Acyltransferase bewirken, wobei die Wirtszelle ein Fettalkoholsubstrat der Jojoba-Acyltransferase umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Wirtszelle ein Prokaryont ist.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei die Wirtszelle eine Embryozelle einer Samenpflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei es sich bei der Samenpflanze um Brassica handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 19, wobei das Fettalkoholsubstrat der Wachs-Synthase in der Wirtszelle als Ergebnis der Expression einer eine Fettacyl-Reductase codierenden Sequenz aus einem heterologen rekombinanten Konstrukt erzeugt wird.
Wirtszelle, die einen Wachsester umfasst, der gemäß dem Verfahren von Anspruch 19 erzeugt wurde.
Zelle gemäß Anspruch 15, bei der es sich um eine Brassica-Samenzelle handelt, wobei die internen Lipidreserven der Samenzelle Wachsester umfassen.
Zelle gemäß Anspruch 25, wobei die Wachsester langkettige Wachsester sind.