DE69832631T2

DE69832631T2 - Zusammensetzungen geeignet zur kontrollierten freisetzung des hormons gnrh und dessen analoga

Info

Publication number: DE69832631T2
Application number: DE69832631T
Authority: DE
Inventors: J. Patrick BURNS; W. John GIBSON; J. Arthur TIPTON
Original assignee: Durect Corp
Current assignee: Durect Corp
Priority date: 1997-05-28
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2018-05-27
Also published as: CA2291087C; AU743086C; EP1017411A1; ES2255162T3; AU7598098A; AU743086B2; EP1017411B1; US6051558A; EP1017411A4; NZ501219A; CA2291087A1; ATE311196T1; BR9809189A; WO1998053837A1; DE69832631D1

Description

Hintergrund der Erfindung
In der Pferdeindustrie würde die Entwicklung eines akkuraten und ökonomischen Verfahrens für die präzise Kontrolle der Ovulation bei der Stute für das Reproduktionsmanagement von Stuten und Hengsten deutlichen Nutzen bringen. Die lange Östrusperiode der Stuten, mit einer Ovulation zu irgendeinem Zeitpunkt 1 bis 10 Tage nach dem Beginn des Östrus hat das Reproduktionsmanagement von Stuten zeitaufwendig, teuer und vor allen Dingen ineffizient gemacht. Man beginnt bei Stuten zu untersuchen, ob GnRH oder die Analoge davon als alternative nicht-antigene Ersatzstoffe zum Ersatz von hCG verwendet werden können, um die Ovulation bei präovulatorischen Stuten zu beschleunigen. Dies liegt daran, dass die wiederholte Verwendung von hCG mit einer verminderten Reaktion assoziiert wurde [Sullivan, J., J Am. Vet. Med. Assoc. 63: 895 (1973)] und auch mit einer anti-hCG-Antikörperbildung [Roser, J., J. Reprod. Fert. Suppl. 173–179 (1974)]. Gegenwärtige Daten legen nahe, dass die Ovulationsinduktion mit potenten GnRH-Analogen multiple Injektionen mit sehr niedrigen Dosierungen nötig macht [Harrison, L., et al., J. Eq. Vet Sci. 11: 163–166 (1991)] oder dass eine sehr hohe Dosis mit einem Implantat mit verzögerter Freisetzung verabreicht wird [Jochle, W. et al., J. Eq. Vet. Sci. 44: 632 (1994)].
Die Selektion eines geeigneten Arzneimittelzufuhrsystems sollte auf den pharmakokinetischen und pharmakodynamischen Eigenschaften des Arzneimittels basieren. Die Wichtigkeit der pharmakodynamischen Eigenschaften eines Arzneimittels ist insbesondere in dem Fall von Hormonen relevant, die spezifische hoch affine Rezeptoren als Ziel haben, um ihre Wirkung auszulösen. Im Fall von GnRH hängt diese Beziehung von etlichen Elementen einschließlich Art, Reproduktionsstatus und Komplexkonzentration/Präsentationswirkungen des Peptids und der Hypophysenreaktion auf es ab.
Die Anmelder haben festgestellt, dass bestimmte Zusammensetzungen für die kontrollierte Freisetzung von GnRH-Analogen geeignet sind, insbesondere zum Zweck, die Ovulation bei Stuten zu beschleunigen. Die Zusammensetzung beinhaltet ein System, basierend auf Saccharoseacetatisobutyrat (SAIB), ein vollständig verestertes Saccharosemolekül. SAIB ist ein niedermolekulares Material, das viele Eigenschaften aufweist, die mit polymeren Materialien assoziiert sind. Da SAIB kein Polymer ist, ist eine Verdünnung mit nur geringen Mengen Lösungsmitteln notwendig, um eine einfach injizierbare Lösung zu ergeben.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Anmelder haben eine bestimmte Adaptation der SAIB Arzneimittelzufuhrsystemtechnologie entdeckt, die für eine Induktion von Ovulation bei Stuten geeignet ist, mit einer Zusammensetzung, die sowohl injizierbar als auch sterilisierbar ist.
Abkürzungen und Definitionen

GnRH

Gonadotropin freisetzendes Hormon, auch bekannt als LH-RH oder LHRH

HVLCM

Hochviskoses flüssiges Trägermaterial

LH

Luteinisierendes Hormon

LH-RH

Luteinisierendes Hormone-freisetzendes Hormone

LVLCM

Niedrigviskoses flüssiges Trägermaterial.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt LH-Konzentrationen bei Stuten folgend auf eine Behandlung mit experimentellen Formulierungen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von GnRH oder Analogen davon bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, umfassend:

a) ein nicht polymeres, nicht wasserlösliches flüssiges Trägermaterial mit einer Viskosität von mindestens 5.000 cP bei 37°C, das nicht unverdünnt unter Umgebungs- oder physiologischen Bedingungen kristallisiert;
b) GnRH oder Analoge oder eine Kombination davon.

Gemäß einer Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das nicht-wasserlösliche flüssige Trägermaterial Saccharoseacetatisobutyrat.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt das nicht-wasserlösliche flüssige Trägermaterial in einer Menge von ungefähr 99,5 bis ungefähr 10 Gew.-%, relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung vor.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt das nicht-wasserlösliche flüssige Trägermaterial in einer Menge von ungefähr 95 bis ungefähr 25 Gew.-%, relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung vor.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung weiterhin ein Lösungsmittel, in dem der nicht-wasserlösliche flüssige Träger löslich ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Lösungsmittel gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ethanol, Dimethylsulfoxid, Ethyllactat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Triacetin, N-Methylpyrrolidon, Propylencarbonat und Glycofurol.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Lösungsmittel Ethanol.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung liegt das Lösungsmittel in einer Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gew.-%, relativ zum Gewicht der Zusammensetzung vor.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Analog Deslorelin.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist das Analog gewählt aus Deslorelin, Avorelin, Leuprolid und natürlichem LHRH.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von GnRH oder Analogen davon bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewichtsverhältnis zwischen ungefähr 75:25 und ungefähr 60:40 und GnRH oder ein Analog davon oder eine Kombination davon in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 5,0 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis zwischen ungefähr 0,3 mg und ungefähr 10 mg GnRH oder einem Analog davon oder einer Kombination davon bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von GnRH oder Analogen davon bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewichtsverhältnis zwischen ungefähr 75:25 und ungefähr 60:40 und GnRH oder ein Analog davon oder eine Kombination davon in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2,5 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis zwischen ungefähr 0,3 mg und ungefähr 10 mg GnRH oder einem Analog davon oder einer Kombination davon zuzuführen.
Gemäß einer Ausführungsform der flüssigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist das Analog von GnRH Deslorelin.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der flüssigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird die Zusammensetzung vor Verabreichung an die Stuten sterilisiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der flüssigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung wird die Zusammensetzung vor Verabreichung an die Stuten filtersterilisiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine filtersterilisierte flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von Deslorelin bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren-, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewicht-zu-Gewicht-Verhältnis von ungefähr 75:25 und Deslorelin mit einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 5,0 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis zwischen ungefähr 1 mg und ungefähr 2 mg Deslorelin zuzuführen, wobei die Zusammensetzung durch Injektion verabreichbar ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine filtersterilisierte flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von Deslorelin bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewicht-zu-Gewicht-Verhältnis von ungefähr 75:25 und Deslorelin mit einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis ungefähr 2,5 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis zwischen ungefähr 1 mg und ungefähr 2 mg Deslorelin zuzuführen, wobei die Zusammensetzung durch Injektion verabreichbar ist.
I. Hochviskoses flüssiges Trägermaterial (HVLCM)
Es sollte ein hochviskoses flüssiges Trägermaterial gewählt werden, das nicht-polymer, nicht-wasserlöslich ist und eine Viskosität von mindestens 5.000 cP (und optional mindestens 10.000, 15.000; 20.000; 25.000 oder sogar 50.000 cP) bei 37°C aufweist und unter Umgebungs- oder physiologischen Bedingungen nicht unverdünnt kristallisiert. Die Bezeichnung nicht-wasserlöslich bezieht sich auf ein Material, das in Wasser in einem Umfang von weniger als 1 Gew.-% unter Umgebungsbedingungen löslich ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vermindert das HVLCM signifikant seine Viskosität, wenn es mit einem Lösungsmittel zur Bildung eines LVLCM gemischt wird, das mit einem Substrat für eine kontrollierte Zufuhr vermischt werden kann. Die LVLCM/Substratzusammensetzung läßt sich typischerweise leichter im Körper platzieren als eine HVLCM/Substratzusammensetzung, da sie einfacher in und aus Spritzen oder anderen Implantationsmitteln fließt und einfach als Emulsion formulierbar ist. Das LVLCM kann jede gewünschte Viskosität aufweisen. Es wurde festgestellt, dass ein Viskositätsbereich für LVLCM von weniger als ungefähr 1.000 cP und insbesondere weniger als 200 cP typischerweise für in vivo-Anwendungen geeignet ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird Saccharoseacetatisobutyrat ("SAIB"), ein Saccharosemolekül, das mit zwei Essigsäuren und sechs Isobuttersäureeinheiten verestert ist, als HVLCM verwendet. Die Struktur von SAIB wird unten dargestellt.
SAIB ist oral nicht-toxisch und wird gegenwärtig zum Stabilisieren von Emulsionen in der Nahrungsmittelindustrie verwendet. Es handelt sich um eine sehr viskose Flüssigkeit und es hat die ungewöhnliche Eigenschaft, dass es eine dramatische Veränderung der Viskosität bei geringen Zugaben von Wärme oder unter Zugabe von Lösungsmitteln gibt. Es ist in einer großen Zahl biokompatibler Lösungsmittel löslich. Wenn es sich in Lösung oder Emulsion befindet, kann SAIB durch Injektion verabreicht werden.
In anderen Ausführungsformen kann ein HVLCM Stearatester sein, wie z.B. diejenigen von Propyleneglykol, Glyceryl, Diethylaminoethyl und Glykol, Stearatamide und andere langkettige Fettsäureamide, wie z.B. N,N'-Ethylendistearamid, Stearamid MEA und DEA, Ethylenbistearamid, Cocoaminoxid, langkettige Fettsäurealkohole, wie z.B. Cetylalkohol und Stearylalkohol, langkettige Ester, wie z.B. Myristylmyristat, Behenylerucat und Glycerylphosphate. Gemäß einer besonderen Ausführungsform ist HVLCM ein acetyliertes Saccharosedistearat (Crodesta A-10).
Das HVLCM liegt in der Zusammensetzung in jeder möglichen Menge vor, die die gewünschte Wirkung erreicht. Das HVLCM liegt typischerweise in Zusammensetzungen für eine kontrollierte Zufuhr für GnRH oder seine Analoge in einer Menge im Bereich von ungefähr 99,5% bis ungefähr 10 Gew.-% vor, typischerweise ungefähr 90% bis ungefähr 25% und besonders typisch zwischen ungefähr 85% und ungefähr 65% relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung vor.
II. Zuzuführende Substanz
Eine Vielzahl von Analogen von Gonadotropin freisetzendem Hormon sind für die kontrollierte Freisetzung in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung geeignet. Geeignete Analoge beinhalten diejenigen, die in der folgenden Tabelle I aufgeführt sind, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Bevorzugte GnRH-Analoge beinhalten Deslorelin, Avorelin, Leuprolid und natürliches LHRH. Eine andere Reihe bevorzugter GnRH-Analoge beinhaltet Triptorelin, Nafarelin, Goserelin, Buserelin und Fertirelin. Deslorelin wird besonders bevorzugt.
Die GnRH-Analoge werden durch irgendeines einer Vielzahl konventioneller Verfahren synthetisiert. Siehe allgemein Merrifield, B., Science 232: 342 (1986), Norman, A. W. et al., Hormones Academic Press New York 1987. Deslorelin wird durch das Verfahren von Ajayaghosh, A. et al., J. Org. Chem. 55: 2826 (1990); Nestor, J. J. et al., Proc. Am. Pept. Symp. 7, 109 (1981) synthetisiert; Avorelin durch das Verfahren der WO 91/18016; Leuprolid durch die Verfahren des deutschen Patents 2,446,005, US 4,005,063 ; natürliches LHRH durch das Verfahren des deutschen Patents 2,213,737 und Coy et al. Methods Enzymol. 37, 416 (1975); Triptorelin durch die Verfahren des deutschen Patents 2,625,843 und US 4,010,125 ; Goserelin durch das Verfahren des deutschen Patents 2,720,245, US 4,100,274 ; Buserelin durch das Verfahren des deutschen Patents 2,438,352, US 4,024,248 ; Fertirelin durch das Verfahren des deutschen Patents 2,321,174; US 3,853,837 .
III. Lösungsmittel
Wenn die Zusammensetzung als LVLCM verwendet wird, sollte sie ein Lösungsmittel enthalten, in dem HVLCM löslich ist. Vorzugsweise sollte die zuzuführende Substanz auch in dem Lösungsmittel löslich sein. Das Lösungsmittel sollte nicht toxisch, wasserlöslich oder wassermischbar und außerdem biokompatibel sein. Lösungsmittel, die toxisch sind, sollten für pharmazeutische oder landwirtschaftliche Zwecke nicht verwendet werden. Die verwendeten Lösungsmittel, um die Zusammensetzung in Tiere zu injizieren, sollten keine signifikanten Gewebeirritationen oder Nekrosen an der Stelle der Implantation auslösen.
Das Lösungsmittel sollte mindestens wasserlöslich sein, so dass es schnell in den Körperflüssigkeiten oder einer anderen wässrigen Umgebung diffundiert, und dazu führt, dass die Zusammensetzung koaguliert oder sich verfestigt. Beispiele für geeignete Lösungsmittel beinhalten Ethanol, Ethyllactat, Propylencarbonat, Glycofurol, N-Methylpyrrolidon, 2-Pyrrolidon, Propylenglykol, Aceton, Methylacetat, Ethylaaetat, Methylethylketon, Benzylalkohol, Triacetin, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Caprolactam, Decylmethylsulfoxid, Ölsäure und 1-Dodecylazacycloheptan-2-on. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Ethanol.
Wenn SAIB als HVLCM verwendet wird, sind die bevorzugten Lösungsmittel Ethanol, Dimethylsulfoxid, Ethyllactat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Triacetin, N-Methylpyrrolidon, Propylencarbonat und Glycofurol. SAIB ist mit Glycerin, Maisöl, Erdnussöl, 1,2-Propandiol, Polyethylenglykol (PEG200), super-raffiniertem Sesamöl und super-raffiniertem Erdnussöl nicht mischbar. Dementsprechend wird letztere Gruppe von Lösungsmittel zur Verwendung mit SAIB nicht bevorzugt.
Das Lösungsmittel wird den Zusammensetzungen typischerweise in einer Menge im Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 55 Gew.-% relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung zugefügt. Vorzugsweise liegt das Lösungsmittel in der Zusammensetzung in einer Menge von ungefähr 10 bis ungefähr 50 Gew.-% vor. Ein anderer bevorzugter Bereich liegt bei ungefähr 10 bis 30 Gew.-%.
IV. Veterinärmedizinische Verwendungen der LVLCM- und HVLCM-Zusammensetzungen
Die hier beschriebene Zusammensetzung kann dem Wirt über eine Vielzahl von Verfahren verabreicht werden, die abhängig von dem gewünschten Ergebnis variieren. Wenn der Wirt ein Tier ist, kann die Zusammensetzung beispielsweise topisch, systemisch (z.B. mukosal (oral, rektal, vaginal oder nasal) oder parenteral (intravenös, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal) in einem geeigneten Träger, falls gewünscht, verabreicht werden.
Vorzugsweise werden die gegenwärtigen Zusammensetzungen für veterinärmedizinische Zwecke als Lösungen oder Suspensionen über eine Injektion verabreicht. Wenn über eine Injektion als LVLCM verabreicht wird, leckt die geringe Menge des Lösungsmittels, die in der Zusammensetzung verwendet wird, in die wässrige Flüssigkeit des Wirts und bildet ein hoch viskoses Depot für die kontrollierte Zufuhr von Substanzen, siehe z.B. Ansel, H. C. et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Del. Systems, 6. Ausgabe, 1995.
BEISPIEL 1
A. Präparation der SAIB-Formulierung 1
Eine Lösung von Deslorelin in DMSO (1,0 Gew.-%) wurde hergestellt. Eine konzentrierte Lösung mit einem 95:5-Gewichtsverhältnis SAIB:DMSO wurde ebenfalls hergestellt.
Eine bestimmte Menge (2,1870 g) Deslorelinacetat (DA)/DMSO wurde zu 7,9230 g der 95:5 SAIB:DMSO-Lösung zufügt. Die endgültige Formulierung enthielt 2,4 mg/ml Deslorelin und hatte ein SAIB:DMSO-Verhältnis von 75:25.
B. Präparation der SAIB-Formulierung 2
Eine Lösung von Deslorelin in Ethanol (2,1 Gew.-%) wurde hergestellt. Eine konzentrierte Lösung mit einem 95:5-Gewichtsverhältnis SAIB:Ethanol wurde ebenfalls hergestellt. Eine bestimmte Menge (1,0376 g) Deslorelinacetat/Ethanol wurde zu 8,9917 g der 95:5 SAIB:Ethanollösung zugefügt. Die endgültige Formulierung enthielt 2,3 mg/ml Deslorelin und hatte ein SAIB:Ethanolverhältnis von 85:15.
C. Präparation der SAIB-Formulierung 3
Eine Lösung von Deslorelin in Ethanol (1,9 Gew.-%) wurde hergestellt. Eine konzentrierte Lösung mit einem 95:5-Gewichtsverhältnis SAIB:Ethanol wurde ebenfalls hergestellt. Eine bestimmte Menge (1,0826 g) Deslorelinacetat/Ethanol wurde zu 7,9085 g der 95:5 SAIB:Ethanollösung zugefügt. Die endgültige Formulierung enthielt 2,2 mg/ml Deslorelin und hatte ein SAIB:Ethanolverhältnis von 75:25.
D. Präparation der SAIB Formulierungen 4–8 mit 75:25 SAIB:Ethanol für eine Dosis-Titrierstudie
Eine Dosis-Titrierstudie wurde unter Verwendung dieser 75:25 SAIB:Ethanolformulierung durchgeführt, die Deslorelin-Konzentrationen von 0,5, 1,0, 1,5 und 2,0 mg/ml bewertete. Eine konzentrierte Lösung von SAIB in Ethanol (83,6 Gew.-%) wurde hergestellt und unter Verwendung eines 0,2 μm hydrophoben Filters steril filtriert. Reiner Ethanol und eine Lösung von Deslorelin in Ethanol (21,0 mg/g) wurden unter Verwendung von 0,22 μm sterilen Spritzenfiltern steril filtriert.
Geeignete Mengen von sterilen SAIB/EtOH- und EtOH/Deslorelin-Lösungen wurden mit einer bestimmten Menge von sterilem Ethanol zum Erhalt der endgültigen Mischungen mit den gewünschten Konzentrationen kombiniert. Die Mengen jeder verwendeten Komponente und die Zusammensetzungen der hergestellten Formulierungen werden in Tabelle A dargestellt. Die niedrigste Konzentration jeder Formulierung erzeugte eine Lösung, während die verbleibenden Formulierungen Suspensionen waren, die in ihrer Wolkigkeit mit ansteigenden Deslorelin-Konzentrationen zunahmen.
E. Präparation der SAIB Formulierungen 9–12 mit 65:35 SAIB:Ethanol für eine Dosis-Titrierstudie
Eine Dosis-Titrierstudie wurde ebenfalls unter Verwendung einer 65:35 SAIB:Ethanolformulierung durchgeführt, die Deslorelin-Konzentrationen von 0,5, 1,0, 1,5 und 2,0 mg/ml bewertete. Eine konzentrierte Lösung von SAIB in Ethanol (83,6 Gew.-%) wurde hergestellt und unter Verwendung eines 0,2 μm hydrophoben Filters steril filtriert. Reiner Ethanol und eine Lösung von Deslorelin in Ethanol (21,0 mg/g) wurden unter Verwendung von 0,22 μm sterilen Spritzenfiltern steril filtriert.
Geeignete Mengen von sterilen SAIB/EtOH- und EtOH/Deslorelin-Lösungen wurden mit einer bestimmten Menge von sterilem Ethanol zum Erhalt der endgültigen Mischungen mit den gewünschten Konzentrationen kombiniert. Die Mengen jeder verwendeten Komponente und die Zusammensetzungen der hergestellten Formulierungen werden in Tabelle B dargestellt. Die niedrigste Konzentration jeder Formulierung erzeugte eine Lösung, während die verbleibenden Formulierungen Suspensionen waren, die in ihrer Wolkigkeit mit ansteigenden Deslorelin-Konzentrationen zunahmen.
BEISPIEL 2
Die in diesem Experiment verwendeten Stuten stammten von der Herde an der LSU Agricultural Center Horse Farm und waren alle vom light-horse-Typ, nämlich Quarter Horses, Thoroughbreds und Araber. Alle Stuten waren in gutem körperlichem Zustand und wurden auf der nativen Sommergrasweide (im wesentlichen Bermudagras) gehalten. Die Mehrzahl der Stuten in der Herde hatten sich in der vorherigen Saison nicht in der Zucht befunden, während sechs innerhalb von 30 Tagen geworfen hatten und laktierten. Die Stuten wurden mit einer täglichen Behandlungsvorschrift eines Östrusnachweises, beginnend am 01. Juni behandelt und wurden alle im Juni einer allgemeinen Gesundheits- und Reproduktionssicherheitsüberprüfung unterzogen. Nur Stuten mit guter Gesundheit, zufriedenstellenden vulvären und vaginalen Konformationen und anscheinend normalem Uterus- und Eierstockkonformationen wurden in einen Pool potenzieller Kandidaten für die Behandlung platziert. Die meisten der Stuten waren in einem Alter von 11 und 14 Jahren (Bereich: 8 bis 22 Jahre) und wogen 400 bis 650 kg.
In dieser Studie wurden drei experimentelle Formulierungen durch Abwiegen und Vermischen von SAIB (SABER, SBS Inc., Birmingham, AL), verdünnendes Lösungsmittel hergestellt und Deslorelin wurde zum Erhalt einer Endkonzentration von 2,1 mg/ml zugefügt. SAIB:Verdünnungslösungsmittelzusammensetzung waren: 75:25 G/G SAIB:DMSO in Formulierung 1 (siehe Beispiel 1A); 85:15 G/G SAIB:Ethanol in Formulierung 2 (siehe Beispiel 1B) und 75:25 G/G SAIB:Ethanol in Formulierung 3 (siehe Beispiel 1C). Die resultierenden experimentellen Formulierungen waren hydrophob und niedrigviskos nach i.m.-Injektion, wenn das Lösungsmittel diffundierte und ließen eine SAIB-DA-Matrix zurück, die DA durch Diffusion durch das hoch viskose SAIB freisetzte, begleitet von einem Abbau von SAIB zu Saccharose und den korrespondierenden aliphatischen Säuren, aus denen der Saccharoseester hergestellt war. Zusätzlich wurde eine negative Kontrolle (1 ml von 0,9% NaCl USP, injiziert i.m.) hergestellt. Wenn die Stuten nach dem 01. Juli in den Östrus eintraten, wurden ihre Ovarien täglich durch transrektalen Ultraschall zur Bewertung der Follikelgrößen und des Gebärmutter-Erscheinungsbildes bewertet. Sobald eine Stute die folgenden zwei Kriterien erfüllte, wurde sie einer Behandlung zugeordnet, basierend auf einer vorherbestimmten statistischen Gruppierung: 1) sie musste sich im Östrus befinden und 2) sie musste ein Follikel mit einem Durchmesser von mindestens 30 mm, jedoch nicht mehr als 40 mm aufweisen. Ultraschallbewertungen wurden jeden Morgen durchgeführt und die Stuten wurden vor dem Mittag normal behandelt. Um irgendwelche möglichen Gewichtungen in den Daten zu vermeiden, unterschied sich das Personal, das die Behandlungen verabreichte von demjenigen, das die follikulären und Östruseigenschaften und Injektionsstellen bewertete. Zusätzlich waren die drei SABER-Formulierungen farbkodiert und ihr tatsächlicher Inhalt war dem gesamten Farmpersonal unbekannt.
Sobald eine Stute behandelt worden war, wurden ihre Ovarien durch Ultraschall alle 12 Stunden bewertet, bis sie ovuliert hatte. Die Größen der messbaren Follikel von jedem Ovar wurden aufgezeichnet und die Ovulation wurde durch verschiedene Veränderungen in Größe, Weichheit und dem Erscheinungsbild des dominanten Follikels, wie beschrieben im Detail von Ginther (Ginther, O. J. Ultrasonic Imaging and Reproductive Events in the Mare Equiservices Cross Plains, WI. 1986) bestimmt. Zusätzlich wurden Blutproben 24 Stunden vor der Behandlung (–24 Stunden); direkt vor der Behandlung (Zeit 0) und 1, 3, 6, 12, 24, 36 und 48 Stunden nach der Behandlung genommen und dann alle 24 Stunden bis 24 Stunden nach der Ovulation zur Messung der Progesteron- und (oder) luteinisierenden Hormon-(LH)-konzentrationen. Diese Blutproben wurden durch eine jugulare Venenpunktur in mit Heparin behandelte evakuierte Röhrchen aufgezogen und die Röhrchen wurden bei 5°C platziert, bis das Plasma für die Zentrifugation geerntet wurde. Progesteron wurde durch einen Radioimmunoassay mit kommerziell erhältlichen Reagenzien (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., Webster, Tex.) gemessen und das LH wurde durch Radioimmunoassay, wie beschrieben von Thompson et al. 1983. J. Anim. Sci. 56: 678–686 gemessen.
Jeden Tag nach der Behandlung für 7 Tage wurde die Injektionsstelle jeder Stute im Hinblick auf die drei folgenden Eigenschaften bewertet: 1) Anschwellen, das als null bewertet wurde = keins, 1 = leicht (1 cm Durchmesser oder weniger), 2 = etwas (1 bis 2,5 cm Durchmesser) und 3 = signifikant (mehr als 3 cm Durchmesser); 2) sensibel gegenüber einer Berührung, was als ja oder nein bewertet wurde und 3) Hauttemperaturbewertung, die ebenfalls als ja oder nein bewertet wurde. Die Deslorelin-Konzentrationen wurden in den gesammelten Blutproben bei –24, 0, 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 und 72 Stunden relativ zur Behandlung bestimmt. Direkt nachdem die Probe aus der Jugularvene entnommen worden war, wurde ein 1 ml-Aliquot entfernt und zu 4 ml Aceton in einem 12 × 75 mm Wegwerfglasröhrchen zugefügt. Diese Mischung wurde mehrmals umgedreht und für eine Lagerung bei –15°C mit einer Kappe versehen. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden die Extrakte zentrifugiert und Aceton in ein zweites Röhrchen dekantiert. Das Aceton wurde dann unter einem Luftstrom getrocknet und die restliche wässrige Lösung wurde zurück auf 1,0 ml mit Assaypuffer verdünnt. Deslorelin wurde in den Extrakten durch Radioimmunoassay unter Verwendung eines anti-GnRH-Antiserums (Rabb et al., 1990. J. Anim. Sci. 68: 3322–3329) und von radioaktiv iodiertem Deslorelin gemessen. Das Deslorelin wurde durch das Chloramin-T-Verfahren radioaktiv iodiert und durch QAE-Sephadex-Chromatographie wie für GnRH von Nett et al., Endocrinology 101: 1135 (1977) beschrieben, isoliert. Da endogenes GnRH nicht in ausreichenden Mengen im jugularen Blut zum Nachweis vorliegt, wurde angenommen, dass jede Immunreaktivität in den Proben Deslorelin und nicht GnRH war.
Während des Verlaufs des Experiments zeigte eine Stute eine ungewöhnlich lange Östrusperiode und ovulierte erst 216 Stunden nach der Behandlung. Da sich ihre Reaktion von allen anderen Stuten so deutlich unterschied, wurde ihre Ovulationszeit mit den verbliebenen Stuten, die Deslorelin erhielten, verglichen und es erwies sich, dass sie 3,82-Standardabweichungen vom Durchschnitt entfernt war (P < 0,01). So wurden die Daten dieser Stute aus allen Analysen entfernt und eine zusätzliche Stute wurde mit der Formulierung mit langsamer Freisetzung behandelt (siehe Beispiel 1A), um ihre Stelle einzunehmen.
Daten für Einzelzeitpunkte wurden durch eine Einwegeanalyse der Varianz unter Verwendung des allgemein linearen Modellverfahrens von SAS. 1988. SAS/STAT.RTM. User's Guide (Release 6.03). SAS Inst. Inc., Cary, N.C. analysiert. Für jede Variable wurde der Vergleich zwischen den mit Salzlösung behandelten Stuten und allen Stuten, die Deslorelin erhielten, in die Analyse eingeschlossen, wie auch individuelle Vergleiche zwischen jeder Gruppe, die Deslorelin erhielt und der Salzlösungsgruppe; diese Vergleiche basierten auf dem LSD-Wert, berechnet von der gepoolten Fehlervarianz. Für den Prozentsatz der Stuten, die innerhalb von 48 Stunden ovulierten, wurden die Stuten entweder 1 (ja) oder 0 (nein) bewertet und eine Einwegeanalyse der Varianz wurde mit diesen Daten anstelle einer Verwendung des Chi-Quadratverfahrens durchgeführt. Daten von wiederholten Probennahmen (z.B. LH-Konzentrationen) wurden durch eine Split-Plot-Analyse der Varianz analysiert, worin die Wirkung der Behandlung mit der Pferdbezeichnung(Behandlungs)bezeichnung getestet wurde und die Behandlung × Zeit-Interaktion wurde mit der Restfehlervarianz getestet. Nettobereiche unter den Reaktionskurven wurden auch für Deslorelin-Konzentrationen von 0 bis 24 Stunden nach der Behandlung und für LH-Konzentrationen von 0 bis 48 Stunden nach der Behandlung berechnet; diese Bereiche wurden durch eine Einwegeanalyse der Varianz, wie oben beschrieben, analysiert.
Die Ovulation wurde durch Ultraschall (US) und erhöhte Progesteron(P₄)-Niveaus bestätigt. Untersuchte Endpunkte beinhalteten die Stunden bis zur Ovulation, den Prozentsatz (%) der Stuten, die innerhalb von 48 Stunden ovulierten und LH-, P₄- und DA-Niveaus, die durch RIA gemessen wurden. Zusätzlich wurden auch die Injektionsstellenschwell-Punkte (0 bis 3; 0 = keine, 1 = leicht, 2 = moderat, 3 = signifikant), die Injektionsstellenempfindlichkeit (Ja/Nein) und die Temperaturerhöhung an der Injektionsstelle (Ja/Nein) untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Plasma-DA (Deslorelinacetat) -Konzentrationen nach der Behandlung mit allen drei SAIB-Formulierungen signifikant erhöht waren, mit Peakniveaus von 1902 bis 1699 pg/ml. Der Bereich unter der Reaktionskurve (AUC) für die ersten 24 Stunden nach der Injektion bestätigte auch einen signifikanten Anstieg bei SAIB-behandelten Stuten im Vergleich mit Salzlösung-behandelten Kontrollen (siehe Tabelle II).
In Tabelle II wurde ein signifikanter Anstieg im Prozentsatz der Stuten, die innerhalb von 48 Stunden ovulierten (im Vergleich mit Salzlösung) bei Stuten nachgewiesen, denen die Formulierungen 2 und 3 verabreicht worden waren.
Tabelle II
Es gab keine Wirkung der Behandlung (P = 0,467), noch irgendeine Wechselwirkung über die Zeit (P = 0,817) für die Schwellungspunkte an der Injektionsstelle noch gab es irgendeine Empfindlichkeit oder eine Erhöhung der Hauttemperatur an der Injektionsstelle bei irgendeiner Behandlung.
AUC für LH in den ersten 48 Stunden zeigte an, dass Stuten, die die Formulierung 3 erhielten (P = 0,01) und die Formulierung 2 (P = 0,1) im Vergleich mit den salzlösungsbehandelten Stuten eine Erhöhung zeigten. Zusätzlich stiegen die Plasma-LH-Konzentrationen direkt (p < 0,0003) bei allen Behandlungen außer der Salzlösung, zeigten 6 Stunden nach der Injektion einen Peak und blieben auf einem erhöhten Niveau für 36 bis 48 nach der Behandlung, wie dargestellt in 1.
Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Formulierungen 2 und 3 Deslorelin effektiv freisetzten, was die Ovulationsniveaus von LH stimulierte und die Ovulation bei Stuten beschleunigte, wobei 7 von 8 Stuten innerhalb von 48 Stunden nach der Behandlung ovulierten. Weiterhin zeigen die Daten, dass alle 3 SAIB-Formulierungen eine ausgezeichnete Biokompatibilität zeigen, bewertet durch minimale Injektionsstellenreaktionen, die ähnlich waren wie bei den Kontrollen.
BEISPIEL 3
Neunzig cyclische Stuten von verschieden light-horse-Züchtungen, in einem Alter von 3 bis 16 Jahren und einem Gewicht von 400 bis 650 kg wurden verwendet. Die Stuten wurden zufällig auf eine von 9 Blindfarben-Gruppen (n = 10/Gruppe) zugeordnet, um eine Interpretationsbeeinflussung zu vermeiden. Die Behandlungen waren 2 experimentelle Formulierungsgruppen, enthaltend: 0,5, 1,0, 1,5 oder 2,0 mg Deslorelinacetat (DA), so entworfen, dass das DA mit unterschiedlichen Raten über ungefähr 12 bis 36 Stunden (h) nach einer 1 ml-intramuskulären (i.m.) Injektion unter Verwendung einer 21 Gauge-Nadel zugeführt wurde und eine negative Kontrolle, bestehend aus SAIB, die kein Arzneimittel enthielt und die ebenfalls als eine 1 ml i.m.-Injektion verabreicht wurde.
Es wurden experimentelle Formulierungen durch Abwiegen und Vermischen von SAIB (SABER, SBS Inc., Birmingham, Ala.) Verdünnungslösungsmittel hergestellt und DA wurde zugefügt, um die geeignete Endkonzentration von 0,5, 1,0, 1,5 oder 2,0 mg/ml zu ergeben.
SAIB:Verdünnungslösungsmittelzusammensetzungen waren 75:25 G/G SAIB:Ethanol in den Formulierungen 4–8 (siehe Beispiel 1D) und 65:35 G/G SAIB:Ethanol in den Formulierungen 9–12 (siehe Beispiel 1E).
Die Ovarien von Stuten im Östrus wurden täglich durch Ultraschall (US) untersucht und wurden behandelt, sobald ein Follikel zwischen 30 mm und 40 mm nachgewiesen wurde. Danach wurden die Ovarien der Stuten alle 24 Stunden untersucht, bis eine Ovulation durch US bestätigt wurde.
Zwei Haupteffizienzvariable in der Studie waren (a) ein Intervall in Stunden nach der Behandlung bis zur Ovulation und (b) der Prozentsatz der Stuten, die innerhalb von 48 Stunden nach der Behandlung ovulierten. Die Erstere wurde statistisch unter Verwendung eines SAS^®-Cox-Regressionsmodells (proportional Hazards) analysiert. Die Letztere wurde statistisch unter Verwendung einer logistischen Regression, die die Wirkungen von Formulierung und Dosis untersuchte, analysiert. Die Hauptsicherheitsvariablen in der Studie waren (a) sichtbare Zeichen von Schwellbewertungen, (b) Empfindlichkeit gegenüber einer Berührung und (c) Hauttemperaturerhöhung an der Injektionsstelle. Diese Variablen sollten statistisch durch wiederholte Messanalysen für kategorische Daten unter Verwendung von SAS PROC CATMOD analysiert werden, da jedoch keine Schwellung, Empfindlichkeit oder Temperaturerhöhung nachgewiesen wurde, wurde die Analyse nicht durchgeführt.
Die Ovulationsdaten werden in Tabelle III präsentiert. Unter Verwendung des Cox-Modells (linear) in Dosierungen für beide Formulierungsgruppen war der Koeffizient für die 75:25 SAIB/Ethanol-Formulierung hoch signifikant (p < 0,01 unter Verwendung eines zweiseitigen Tests), jedoch war der Koeffizient für die 65:35 SAIB/Ethanol-Formulierungen nicht signifikant, was die Überlegenheit der 75:25 SAIB/Ethanol-Formulierungen anzeigte (siehe Beispiel 1C). Tabelle III

* Tatsächliche % (Cox-proportionale Hazards Modell linear vorhergesagte %; logistische Modell vorhergesagte %) bei (p < 0,01)

Unter Verwendung des logistischen Modells (linear) bei Dosierungen für beide Formulierungen, war die Wirkung der 75:25 SAIB/Ethanol-Formulierungen ebenfalls hoch signifikant (p < 0,01 unter Verwendung eines zweiseitigen Tests), während die Wirkung der 65:35 SAIB/Ethanol-Formulierungen hoch signifikant waren (p < 0,1 unter Verwendung eines zweiseitigen Tests). Weiterhin war die Neigung für die 75:25- Formulierungen signifikant größer als diejenige für die 65:35-Formulierungen (β) (p = 0,026), was die Überlegenheit der 75:25-Formulierungen anzeigte.
Quadratische Terme waren für keine Analyse signifikant, was anzeigte, dass die verwendeten linearen Modelle eine ausreichende Repräsentation für alle 9 Gruppen bereitstellten. Vorhergesagte Prozentsätze von Stuten, die innerhalb von 48 Stunden ovulierten, unter Verwendung beider Arten einer Analyse werden in Tabelle III neben den tatsächlich beobachteten Daten präsentiert.
Die Hauptsicherheitsvariablen in der Studie waren sichtbare Zeichen einer Schwellung, Empfindlichkeit gegenüber einer Berührung und eine Hauttemperaturerhöhung an der Injektionsstelle, die bei den 90 untersuchten Stuten allesamt nicht nachweisbar waren. Die Abwesenheit von irgendeiner beobachteten Schwellung, Empfindlichkeit oder einer Erhöhung der Hauttemperatur an der Injektionsstelle bei irgendeiner der Behandlungen legt deutlich eine ausgezeichnete Biokompatibilität der vorliegenden SAIB-Formulierung nahe, wenn sie unter Verwendung einer Filtersterilisation erzeugt wird und unter Verwendung kleinerer 21 Gauge-Nadeln verabreicht wird (siehe Tabelle IV).
Tabelle IV
Diese Studie demonstriert die Überlegenheit der 75:25 SAIB/Ethanol-Formulierung im Vergleich zu der 65:35 SAIB/Ethanol-Formulierung für eine Beschleunigung der Ovulation deutlich. Weiterhin sagten sowohl das Coxproportional hazard- als auch das logistische Modell eine positive Reaktionsrate für die Stimulation der Ovulation innerhalb von 48 Stunden von mehr als 70% für die 1 mg-Dosis, 80% für die 1,5 mg-Dosis und mehr als 90% für die 2 mg-Dosis von DA vorher, was anzeigt, dass solche Behandlungen die Ovulationsniveaus von LH effektiv stimulieren und die Ovulation bei der Stute beschleunigen. Schließlich zeigen die Sicherheitsdaten, dass alle neun SAIB-Formulierungen eine ausgezeichnete Biokompatibilität zeigten, bewertet durch keine nachweisbare Injektionsstellenreaktionen.

Claims

Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von GnRH oder Analogen davon bei Stuten, um die Ovulation zu induzieren, umfassend: a) ein nicht polymeres, nicht wasserlösliches flüssiges Trägermaterial mit einer Viskosität von mindestens 5.000 cP bei 37°C, das nicht unverdünnt unter Umgebungs- oder physiologischen Bedingungen kristallisiert; b) GnRH oder Analoge oder eine Kombination davon.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das nicht wasserlösliche flüssige Trägermaterial in einer Menge von 99,5 bis 10 Gew.-% oder vorzugsweise 95 bis 25 Gew.-%, relativ zum Gesamtgewicht der Zusammensetzung, vorliegt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das nicht wasserlösliche flüssige Trägermaterial Saccharoseacetatisobutyrat ist.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Analog ausgewählt ist aus Deslorelin, Avorelin, Leuprolid und natürlichem LHRH.
Zusammensetzung gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, weiterhin umfassend ein Lösungsmittel, worin das nicht wasserlösliche flüssige Trägermaterial löslich ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethanol, Dimethylsulfoxid, Ethyllactat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Triacetin, n-Methylpyrrolidon, Propylencarbonat und Glycofurol.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei das Lösungsmittel in einer Menge von 10 bis 50 Gew.-%, relativ zum Gewicht der Zusammensetzung, vorliegt.
Flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von GnRH oder Analogen davon bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, wie definiert in den Ansprüchen 1 bis 7, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewichtsverhältnis von 75:25 bis 60:40 und GnRH oder ein Analog davon oder eine Kombination davon in einer Konzentration von 0,1 bis 5,0 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, vorzugsweise 1,0 bis 2,5 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis zwischen 0,3 mg und ungefähr 10 mg des GnRH oder Analogs davon oder einer Kombination davon bereitzustellen.
Flüssige Zusammensetzung gemäß Anspruch 8, wobei das Analog von GnRH Deslorelin ist.
Filtersterilisierte flüssige Zusammensetzung für die kontrollierte Freisetzung von Deslorelin bei Stuten, um eine Ovulation zu induzieren, wie definiert in den Ansprüchen 1 bis 7, umfassend Saccharoseacetatisobutyrat und Ethanol in einem Gewicht-zu-Gewicht-Verhältnis von 75:25 und Deslorelin in einer Konzentration von 0,1 bis ungefähr 5,0 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, vorzugsweise 1,0 bis 2,5 mg/ml der flüssigen Zusammensetzung, um eine Dosis von 1 mg bis 2 mg Deslorelin zuzuführen, wobei die Zusammensetzung durch Injektion verabreichbar ist.
Emulsion, umfassend die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
Lösung, umfassend die Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.