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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. GEBIET DER ERFINDUNG
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Identifikation
von Genen, die bei Hypoxie differenziell exprimiert werden, und
Verwendung der Gene und Genprodukte für die Diagnose und den therapeutischen
Eingriff.
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2. BESCHREIBUNG DES VERWANDTEN
STANDES DER TECHNIK
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Das
Maß der
Gewebeoxygenierung spielt eine wichtige Rolle bei der normalen Entwicklung,
ebenso wie bei pathologischen Vorgängen wie Ischämie. Gewebeoxygenierung
spielt eine signifikant regulierende Rolle sowohl bei der Apoptose
als auch bei der Angiogenese (Bouck et al., 1996; Bunn et al., 1996;
Dor et al., 1997; Carmeliet et al., 1998). Apoptose (siehe Duke
et al., 1996, zum Überblick)
und Wachstumsstopp geschehen, wenn Zellwachstum und -lebensfähigkeit
wegen Sauerstoffmangel (Hypoxie) reduziert sind. Angiogenese (das
heißt
Blutgefäßwachstum,
Vaskularisierung) wird stimuliert, wenn hypoxygenierte Zellen Faktoren
sezernieren, welche die Proliferation und Migration von Endothelzellen
in einem Versuch stimulieren, die Sauerstoffhomöostase wieder herzustellen
(für einen Überblick
siehe Hanahan et al., 1996).
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Ischämische Erkrankungspathologien
schließen
eine Abnahme in der Blutzufuhr zu einem Körperorgan, Gewebe oder Körperteil
ein, die allgemein durch Verengung oder Verschluss der Blutgefäße, wie
z. B. bei Retinopathie, akutem Nierenversagen, Myokardinfarkt und
Schlaganfall, verursacht wird. Deswegen sind Apoptose und Angiogenese,
wenn sie durch ischämische
Zustände
induziert werden, ebenfalls in diese Krankheitszustände verwickelt.
Neoangiogenese wird bei etlichen Formen der Retinopathie und beim
Tumorwachstum gesehen. Es wird bemerkt, dass Angiogenese für das Tumorwachstum
notwendig ist und dass eine Verzögerung
der Angiogenese ein nützliches
Werkzeug bei der Kontrolle von Bösartigkeit
und Retinopathien sein würde.
Ferner würde
es nützlich
sein, tumorigene Zellen dazu zu bringen, Apoptose (das heißt programmierten Zelltod)
durchzumachen.
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Diese
Prozesse sind jedoch komplexe Kaskaden von Ereignissen, die durch
viele verschiedene Gene kontrolliert werden, welche auf die verschiedenen
Stressarten, wie Hypoxie, reagieren. Die Expression von unterschiedlichen
Genen, die auf Hypoxiestress reagieren, kann nicht nur Apoptose
oder Angiogenese, sondern beides auslösen. Bei Krebs wurde beobachtet,
dass mit Apoptose und Angiogenese in Beziehung stehende Gene therapeutische
Ziele sind. Hypoxie selber spielt jedoch eine kritische Rolle bei
der Auswahl von Mutationen, welche zu schwereren tumorigenen Phänotypen
beitragen (Graeber et al., 1996). Deshalb wird die Identifikation
von Kandidatengenen und -genprodukten benötigt, welche therapeutisch
nicht nur bei Krebs und Ischämie
genutzt werden können
und welche entweder Apoptose oder Angiogenese induzieren oder, um
die Vorgänge
zu verzögern.
Es wäre
nützlich,
Gene zu identifizieren, welche direkte Kausalbeziehungen zwischen einer
Erkrankung und ihren damit in Beziehung stehenden Pathologien haben,
und ein herauf oder herunter regulierendes (Regulator-)Gen zu identifizieren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden gereinigte, isolierte und klonierte Nucleinsäuresequenzen bereitgestellt,
die auf Hypoxie ansprechende Gene kodieren, welche Sequenzen haben,
wie in der Gruppe, umfassend SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2, dargelegt,
oder eine komplementäre
oder Allelvariantensequenz und menschliche Homologa, soweit benötigt, dazu.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Proteine bereit, wie durch
die in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargelegten Nucleinsäuresequenzen
kodiert, wobei die SEQ ID Nrn. 9 und 10 Beispiele der Proteine sind.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Antikörper bereit, die gegen die
Proteine gerichtet sind, wie sie durch die Nucleinsäuresequenzen
kodiert werden, wie sie in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargelegt
sind, einschließlich
der SEQ ID Nrn. 9 und 10.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter transgene Tiere und Zelllinien
bereit, die wenigstens eine exprimierbare Nucleinsäuresequenz,
wie in SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 dargelegt, tragen. Die vorliegende
Erfindung stellt weiter eukaryotische Knockout-Organismen bereit,
in denen wenigstens eine Nucleinsäuresequenz, wie in SEQ ID Nr.
1 und SEQ ID Nr. 2 dargelegt, ausgeknockt sind.
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Ebenfalls
wird hierin ein Verfahren zur Regulierung von Angiogenese in einem
Patienten beschrieben, der einen Bedarf an einer solchen Behandlung
hat, durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines
Antagonisten eines Proteins, wie es durch die Nucleinsäuresequenz,
die in SEQ ID Nr. 2 dargelegt ist, kodiert wird, an einen Patienten.
Alternativ stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit,
Angiogenese in einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf,
zu regulieren durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen
Menge von wenigstens einem Gegensinn-Oligonucleotid gegen die Nucleinsäuresequenz,
wie in SEQ ID Nr. 2 dargelegt, oder eines dominant negativen Peptids,
das gegen die Sequenz oder ihre Proteine gerichtet ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, Angiogenese
oder Apoptose in einem Patienten zu regulieren, der einer solchen
Behandlung bedarf, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen
Menge eines durch SEQ ID Nr. 2 kodierten Proteins oder der Proteinsequenz,
wie sie in SEQ ID Nr. 10 dargelegt ist, als aktive Bestandteile
in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger an einen Patienten.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, ein Apoptose
regulierendes Gen bereitzustellen, indem direkt einem Patienten,
der einer solchen Therapie bedarf, unter Nutzung von Gentherapie
ein exprimierbarer Vektor verabreicht wird, der Expressionskontrollsequenzen
umfasst, welche an die in SEQ ID Nr. 2 (menschliches Homolog) dargelegten
Sequenzen operabel gekoppelt sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, um
ein Angiogenese regulierendes Gen bereitzustellen, unter Nutzung
von Gentherapie, indem einem Patienten, der einer solchen Therapie
bedarf, direkt ein exprimierbarer Vektor verabreicht wird, der Expressionskontrollsequenzen
umfasst, welche an die in SEQ ID Nr. 2 dargelegten Sequenzen operabel
gekoppelt sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Regulierung der Antwort
auf hypoxische Zustände in
einem Patienten bereit, der einer solchen Behandlung bedarf, durch
Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Gegensinn-Oligonucleotids,
das gegen die in SEQ ID Nr. 2 dargelegten Sequenzen gerichtet ist,
an einen Patienten. Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren
zur Bereitstellung eines Hypoxieregulierungsgens unter Nutzung von
Gentherapie bereit, indem einem Patienten, der einer solchen Therapie
bedarf, direkt ein exprimierbarer Vektor verabreicht wird, der Expressionskontrollsequenzen
umfasst, die operabel an die in SEQ ID Nr. 2 dargelegten Sequenzen
gekoppelt sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Diagnostizieren
des Vorkommens von Ischämie
in einem Patienten bereit, das die Schritte des Analysierens einer
Körperflüssigkeit
oder Gewebeprobe des Patienten in Bezug auf die Anwesenheit oder
das Genprodukt wenigstens eines exprimierten (heraufregulierten)
Gens, wie dargelegt in SEQ ID Nr. 2, umfasst, und wo die Ischämie festgestellt
wird, falls das heraufregulierte Gen oder Genprodukt bestätigt wird.
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BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Andere
Vorteile der vorliegenden Erfindung werden leicht geschätzt werden,
wenn dieselbe besser verstanden wird durch Bezugnahme auf die folgende
detaillierte Beschreibung, wenn sie in Verbindung mit den begleitenden
Zeichnungen bedacht wird, worin:
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1 ein
Computerscan ist, der die In-vitro-Translation von cDNS-Klonen von
RTP801 voller Länge (SEQ
ID Nr. 1) zeigt. cDNS-Klone werden in vitro unter Verwendung eines
gekoppelten Transkriptions-Translations-Kits (Promega) translatiert.
Translationsprodukte werden auf Acrylamidgel aufgetrennt und Röntgenfilm ausgesetzt.
Zwei Klone, mit Pfeilen markiert, ergaben die erwartete Proteingröße von annähernd 30
KD. Dies bestätigt
die Sequenzanalyse des mutmaßlichen
Leserasters.
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2 ist
ein Computerscan, der die Northern-Blot-Analyse von RTP801 (SEQ
ID Nr. 1) zeigt. RNS wurde aus Ratten-C6-Gliomzellen extrahiert,
die Hypoxie für
0, 4 oder 16 Stunden ausgesetzt waren. PolyA+-selektierte mRNS (2 μg) aus jeder
Probe wurde auf denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt, auf Nytran-Membranen
geblottet und mit der rtp241-Sonde hybridisiert. Eine Bande mit
1,8 Kb wird beobachtet, die eine markante Induktion nach Hypoxie
zeigt.
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3 ist
ein Computerscan, der die Northern-Blot-Analyse von RTP779 (SEQ
ID Nr. 2) zeigt. RNS wurde aus Ratten-C6-Gliomzellen extrahiert,
die Hypoxie für
0, 4 oder 16 Stunden ausgesetzt waren. PolyA+-selektierte mRNS (2 μg) aus jeder
Probe wurde auf denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt, auf Nytran-Membranen
geblottet und mit der rtp779-Sonde hybridisiert. Eine Bande mit
1,8 Kb wird beobachtet, die eine äußerst differenzielle Expression
zeigt.
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4 ist
ein Computerscan, der die Northern-Blot-Analyse von RTP241 (SEQ
ID Nr. 3) zeigt. RNS wurde aus Ratten-C6-Gliomzellen extrahiert,
welche Hypoxie für
0, 4 oder 16 Stunden ausgesetzt waren. PolyA+-selektierte mRNS (2 μg) aus jeder
Probe wurde auf denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt, auf Nytran-Membranen
geblottet und mit der rtp241-Sonde hybridisiert. Zwei Banden mit
1,8 Kb und 4 Kb werden beobachtet; beide zeigen eine gute differenzielle
Expression.
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5 ist
ein Computerscan, der die Northern-Blot-Analyse von RTP359 (SEQ
ID Nr. 5) zeigt. RNS wurde aus Ratten-C6-Gliomzellen extrahiert,
welche Hypoxie für
0, 4 oder 16 Stunden ausgesetzt waren. PolyA+-selektierte mRNS (2 μg) aus jeder
Probe wurde auf denaturierenden Agarosegelen aufgetrennt, auf Nytran-Membranen
geblottet und mit der rtp359-Sonde hybridisiert. Eine Bande mit
4,5 Kb wird beobachtet, die eine gute differenzielle Expression
zeigt.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung identifiziert Kandidatengene und -genprodukte,
die therapeutisch und diagnostisch nicht nur bei Hypoxie und Ischämie genutzt
werden können
und die Apoptose oder Angiogenese regulieren können. Mit Regulieren oder Modulieren
oder Kontrollieren wird gemeint, dass der Vorgang entweder bis zu
dem Ausmaß induziert
oder inhibiert wird, das notwendig ist, eine Änderung in dem Vorgang und
dem damit verbundenen Erkrankungszustand in dem Patienten zu bewirken.
Ob Induktion oder Inhibition beabsichtigt ist, wird aus dem zu behandelnden
Vorgang und der zu behandelnden Erkrankung ersichtlich sein und
wird Fachleuten in der Medizin bekannt sein. Die vorliegende Erfindung
identifiziert Gene für
die Gentherapie, Diagnostika und Therapeutika, die eine direkte
Kausalbeziehung zwischen einer Erkrankung und damit in Verbindung
stehenden Pathologien und Herauf- oder Herunterregulator- (Responder-)Genen
haben. Das heißt,
die vorliegende Erfindung wird durch eine physiologische Beziehung
zwischen Ursache und Wirkung initiiert.
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Die
vorliegende Erfindung stellt gereinigte, isolierte und klonierte
Nucleinsäurepolynucleotide
(Sequenzen) bereit, die Gene kodieren, welche wenigstens auf hypoxische
Zustände
durch Heraufregulation der Expression ansprechen und welche Sequenzen
haben, wie sie in der Gruppe dargelegt sind, die die SEQ ID Nr.
1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4 und SEQ ID Nr. 5 und
ihre Analoga und Polymorphismen oder eine komplementäre oder
Allelvariantensequenz dazu umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt
ferner SEQ ID Nr. 6 bereit, welche ein bekanntes Gen (Neuroleukin)
ist, das ebenfalls auf den hypoxischen Stress anspricht, indem es
heraufreguliert wird. SEQ ID Nr. 6 ist die menschliche Sequenz für Neuroleukin
und hat über 90%
Homologie mit der Rattensequenz. Das menschliche Homolog wird verwendet,
wo es geeignet ist. Wegen der hohen Homologie zwischen den Ratten-
und Menschsequenzen kann die Rattensequenz ebenfalls für Sonden
und Ähnliches
verwendet werden, falls notwendig.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner Proteine und ihre Analoga bereit,
wie sie durch die Nucleinsäuresequenzen
kodiert werden, die in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3,
SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 dargelegt sind, wobei die SEQ ID Nrn.
7 und 8 ebenso wie die SEQ ID Nrn. 9-11 Beispiele der Proteine sind. Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren bereit, Angiogenese
oder Apoptose in einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf,
zu regulieren durch Verabreichung an einen Patienten einer therapeutisch
wirksamen Menge eines Proteins, das durch die SEQ ID Nrn. 2-6 kodiert
wird, oder durch die Proteinsequenzen, wie sie in den SEQ ID Nrn.
7-8, 10-11 dargelegt sind, als aktive Bestandteile in einem pharmazeutisch
annehmbaren Träger.
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Die
Proteine können
rekombinant erzeugt werden (siehe allgemein Marshak et al., 1996 "Strategies for Protein
Purification and Characterization. A laboratory course manual." CSHL Press) und
Analoga können wegen
des posttranslationalen Bearbeitens vorhanden sein. Der Begriff
Analog, wie er hierin verwendet wird, wird als eine Nucleinsäuresequenz
oder als ein Protein definiert, das gewisse Unterschiede in ihren
Aminosäure-/Nucleotidsequenzen
hat im Vergleich mit der natürlichen
Sequenz der SEQ ID Nrn. 1-8.
Gewöhnlicherweise
wird das Analog allgemein zu wenigstens 70% homolog zu jenem Teil
sein, der funktionell relevant ist. In bevorzugteren Ausführungsbeispielen
wird die Homologie wenigstens 80% betragen und kann sich 95% Homologie
mit der Protein-/Nucleotidsequenz nähern. Die Aminosäure- oder Nucleotidsequenz
eines Analogons kann von jener der Primärsequenz differieren, wenn
wenigstens ein Rest deletiert, inseriert oder substituiert wird;
das Protein- oder Nucleinsäuremolekül bleibt
aber funktionell. Unterschiede in der Glykosylierung können Proteinanaloga
bereitstellen.
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Funktionell
relevant bezieht sich auf die biologische Eigenschaft des Moleküls und bedeutet
in diesem Zusammenhang einen In-vivo-Effektor oder eine antigenische
Funktion oder Aktivität,
die direkt oder indirekt durch ein natürlich vorkommendes Protein
oder Nucleinsäuremolekül durchgeführt wird.
Effektorfunktionen schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
darauf, dass sie Rezeptorbindung, jegliche enzymatische Aktivität oder enzymmodulierende
Aktivität,
jegliche Trägerbindungsaktivität, jegliche
Hormonaktivität,
jede Aktivität
bei der Förderung
oder Inhibition von Adhäsion
von Zellen auf extrazellulärer
Matrix oder auf Zelloberflächenmolekülen einschließen, oder
auf irgendeine strukturelle Rolle beschränkt sind, ebenso wie, dass
sie die Nucleinsäuresequenz
aufweisen, welche ein funktionelles Protein kodiert und exprimierbar
ist. Die Antigenfunktionen bedeuten im Wesentlichen das Besitzen
eines Epitops oder einer Antigenstelle, die in der Lage ist, mit Antikörpern, die
gegen ein natürlich
vorkommendes Protein hervorgerufen wurden, kreuz zu reagieren. Biologisch
aktive Analoga teilen eine Effektorfunktion des nativen Proteins,
welches zusätzlich
eine Antigenfunktion aufweisen kann, dies jedoch nicht muss.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter Antikörper bereit, die gegen die
Proteine gerichtet sind, wie sie durch die Nucleinsäuresequenzen
kodiert werden, wie dargelegt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ
ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, welche in
Immuntests und Ähnlichen
verwendet werden können.
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Die
Antikörper
können
entweder monoklonal, polyklonal oder rekombinant sein. Gewöhnlich können die
Antikörper
gegen das Immunogen oder einen Teil davon, z. B. ein auf der Sequenz
basierendes synthetisches Peptid, zubereitet werden oder können rekombinant
zubereitet werden durch Klonierungstechniken oder das natürliche Genprodukt
und/oder Teile davon können
isoliert und als das Immunogen verwendet werden. Immunogene können verwendet
werden, um Antikörper
durch Standard-Antikörperproduktionstechniken
herzustellen, die Fachleuten wohl bekannt sind, wie beschrieben
allgemein in Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988, und Borrebaeck,
Antibody Engineering – A
Practical Guide, W. H. Freeman and Co., 1992. Antikörperfragmente
können
ebenfalls aus den Antikörpern
durch Fachleuten bekannten Verfahren zubereitet werden und schließen Fab,
F(ab')2 und
Fv ein.
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Um
polyklonale Antikörper
zu produzieren, wird ein Wirt, wie ein Kaninchen oder eine Ziege,
mit dem Immunogen oder Immunogenfragment immunisiert, im Allgemeinen
mit einem Adjuvans, und, falls notwendig, an einen Träger gekoppelt;
Antikörper
gegen das Immunogen werden aus den Seren gesammelt. Ferner kann der
polyklonale Antikörper
so absorbiert sein, dass er monospezifisch ist. Das heißt, die
Seren können
gegen verwandte Immunogene absorbiert werden, so dass keine kreuzreaktiven
Antikörper
in den Seren verbleiben, was sie monospezifisch macht.
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Um
monoklonale Antikörper
zu produzieren, schließt
die Technik Hyperimmunisierung eines geeigneten Donors, im Allgemeinen
eine Maus, mit dem Immunogen und Isolierung der die Antikörper produzierenden Milzzellen
ein. Diese Zellen werden mit einer Zelle verschmolzen, die Immortalität hat, wie
eine Myelomzelle, um ein fusioniertes Zellhybrid bereitzustellen,
das Unsterblichkeit hat und das den erforderlichen Antikörper sezerniert.
Die Zellen werden dann in der Masse kultiviert und die monoklonalen
Antikörper
werden aus den Kulturmedien für
die Verwendung geerntet.
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Um
einen rekombinanten Antikörper
zu erzeugen (siehe allgemein Huston et al., 1991; Johnson und Bird,
1991; Mernaugh und Mernaugh, 1995), werden Boten-RNS aus Antikörper erzeugenden
B-Lymphozyten von
Tieren oder aus Hybridzellen revers transkribiert, um komplementäre DNS (cDNS)
zu gewinnen. Antikörper-cDNS,
die die volle oder nur eine Teillänge haben kann, wird amplifiziert
und in einen Phagen oder ein Plasmid kloniert. Die cDNS kann von
einer teilweisen Länge
der schweren und leichten Ketten-cDNS sein, getrennt oder verbunden
durch einen Linker. Der Antikörper
oder das Antikörperfragment
wird unter Verwendung eines geeigneten Expressionssystems exprimiert,
um einen rekombinanten Antikörper
zu gewinnen. Antikörper-cDNS
kann ebenfalls durch Screening von einschlägigen Expressionsbibliotheken
gewonnen werden.
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Der
Antikörper
kann an ein festes Trägersubstrat
gebunden werden oder kann mit einer detektierbaren Einheit konjugiert
werden oder kann sowohl gebunden als auch konjugiert werden, wie
es im Stand der Technik wohl bekannt ist (für eine allgemeine Diskussion
der Konjugation fluoreszierender oder enzymatischer Einheiten siehe
Johnstone & Thorpe,
Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications,
Oxford, 1982). Das Binden von Antikörpern an ein festes Trägersubstrat
ist ebenfalls im Stand der Technik wohl bekannt. (Siehe für eine allgemeine
Diskussion Harlow & Lane
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Publications,
New York, 1988, und Bonebaeck, Antibody Engineering – A Practical
Guide, W. H. Freeman and Co., 1992.) Die mit der vorliegenden Erfindung
gedachten detektierbaren Einheiten können einschließen, sind
jedoch nicht beschränkt
auf fluoreszierende, metallische, enzymatische und radioaktive Marker,
wie Biotin, Gold, Ferritin, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Peroxidase,
Urease, Fluorescein, Rhodamin, Tritium, 14C
und Iodierung.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter transgene Tiere und Zelllinien
bereit, die wenigstens eine exprimierbare Nucleinsäuresequenz
tragen, wie dargelegt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr.
3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6. Mit exprimierbar
ist der Einschluss sämtlicher
regulatorischer Elemente in der Sequenz gemeint, die notwendig sind
für die
Expression des Gens, oder indem das Gen in dem Zielgenom so platziert
wird, dass es exprimiert wird. Die vorliegende Erfindung stellt
weiter eukaryotische Knockout-Organismen bereit, in welchen wenigstens
eine der in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr.
4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 dargelegten Nucleinsäuresequenzen
ausgeknockt worden ist.
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Diese
transgenen und Knockout-Tiere werden unter Verwendung von im Stand
der Technik bekannten Standardverfahren konstruiert und wie dargelegt
in den US-Patenten 5,487,992, 5,464,764, 5,387,742, 5,360,735, 5,347,075,
5,298,422, 5,288,846, 5,221,778, 5,175,385, 5,175,384, 5,175,383,
4,736,866, ebenso wie von Burke und Olson (1991), Capecchi (1989),
Davies et al., (1992), Dickinson et al., (1993), Duff und Lincoln
(1995), Huxley et al., (1991), Jakobovits et al., (1993), Lamb et
al., (1993), Pearson und Choi (1993), Rothstein (1991), Schedl et
al., (1993), Strauss et al., (1993). Weiterhin stellen die Patentanmeldungen
WO 94/23049, WO 93/14200, WO 94/06908, WO 94/28123 ebenfalls Information
bereit. Es kann genauer jede im Stand der Technik bekannte Technik
verwendet werden, um das Transgen exprimierbar in Tiere einzuführen, um
die elterliche Tierlinie zu produzieren. Solche Techniken schließen ein,
sind jedoch nicht beschränkt
auf pronucleäre
Mikroinjektion (US-Patent 4,873,191); retrovirusvermittelter Gentransfer
in Keimlinien (Van der Putten et al., 1985); Gentargeting in embryonalen
Stammzellen (Thompson et al., 1989; Mansour, 1990, und US-Patent
5,614,396); Elektroporation von Embryonen (Lo, 1983); und spermavermittelter
Gentransfer (Lavitrano et al., 1989). Für einen Überblick solcher Techniken
siehe Gordon (1989).
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Weiterhin
kann ein elterlicher Stamm, statt dass er ein direktes menschliches
Transgen trägt,
das homologe, durch Gentargeting modifiziert endogene Gen haben,
so dass es sich dem Transgen annähert.
Das bedeutet, dass das endogene Gen "humanisiert" und/oder mutiert worden ist (Reaume
et al., 1996). Es sollte festgestellt werden, dass, falls die tierischen
und menschlichen Sequenzen im Wesentlichen homolog sind, ein "humanisiertes" Gen nicht erforderlich
ist. Das transgene Elterntier kann ebenfalls eine überexprimierte
Sequenz tragen, entweder die nicht-mutierte oder eine mutierte Sequenz
und humanisiert oder nicht, wie erforderlich. Der Begriff Transgen
wird deshalb verwendet, um sich auf sämtliche dieser Möglichkeiten
zu beziehen.
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Zusätzlich können Zellen
aus dem Abkömmling
isoliert werden, welcher ein Transgen von jedem transgenen Elternteil
trägt,
und die verwendet werden, um primäre Zellkulturen oder Zelllinien
zu etablieren, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
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Wo
geeignet, wird ein Elternstamm homozygot für das Transgen sein. Zusätzlich wird
das endogene Nicht-Transgen in dem Genom, das homolog ist mit dem
Transgen, nicht expressiv sein. Mit nicht expressiv ist gemeint,
dass das endogene Gen nicht exprimiert werden wird und dass diese
Nicht-Expression
auf die Nachkommen vererbbar ist. Zum Beispiel könnte das endogene homologe
Gen durch im Stand der Technik bekannte Verfahren "ausgeknockt" werden. Alternativ
könnte
der elterliche Stamm, der eines der Transgene empfängt, eine
Mutation an dem endogenen homologen Gen tragen, was es nicht-exprimiert macht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Regulierung von Angiogenese
in einem Patienten bereit, der einer solchen Behandlung bedarf,
indem einem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge eines Antagonisten
von wenigstens einem Protein verabreicht wird, wie es durch die
Nucleinsäuresequenzen, wie
dargelegt in SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr.
4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, kodiert wird. Der Antagonist wird
dosiert und in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht,
wie hierin unten beschrieben. Der Begriff Antagonist oder Antagonisieren
wird in seiner breitesten Bedeutung verwendet. Antagonismus kann
jeden Mechanismus oder jede Behandlung einschließen, welche in Inhibition,
Inaktivierung, Hemmung oder Reduktion der Genaktivität oder des
Genproduktes resultiert. Es sollte festgestellt werden, dass die
Inhibition eines Gens oder eines Genprodukts für einen Anstieg in einer korrespondierenden Funktion
sorgen kann, welche das Gen oder das Genprodukt reguliert hat. Der
antagonisierende Schritt kann das Blockieren zellulärer Rezeptoren
für die
Genprodukte der SEQ ID Nrn. 1-6 einschließen und kann die Gegensinn-Behandlung
einschließen,
wie sie hierin unten diskutiert wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Regulierung
von Angiogenese oder Apoptose in einem Patienten, der einer solchen
Behandlung bedarf, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge
eines regulierenden Agens in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger an einen
Patienten bereit, wobei das Protein ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend
aus SEQ ID Nrn. 7-11. Das regulierende Agens wird dosiert und in
einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zugeführt, wie hierin unten beschrieben.
Zum Beispiel kann ein Patient Bedarf daran haben, Apoptose in tumorigenen
Zellen zu induzieren oder Angiogenese in Traumasituationen, wo z.
B. eine Gliedmaße
wieder befestigt werden muss, oder in einem Transplantat, wo Revaskularisierung
erforderlich ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Regulierung von Angiogenese
oder Apoptose in einem Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf,
bereit, durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge an
einen Patienten von wenigstens einem Gegensinn-Oligonucleotid oder
einem dominant negativen Peptid (entweder als cDNS oder als Peptid;
Herskowitz, 1987), das gegen die Nucleinsäuresequenzen, wie dargelegt
in den SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ
ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, gerichtet ist. Die vorliegende Erfindung
stellt ebenfalls ein Verfahren bereit, die Antwort auf hypoxische
Zustände
in einem Patienten zu regulieren, der einer solchen Behandlung bedarf,
durch Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines Gegensinn-Oligonucleotids an
einen Patienten, das gegen wenigstens eine der in der Gruppe dargelegten
Sequenzen gerichtet ist, die die SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ
ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6 umfasst. Das
Gegensinn-Oligonucleotid als der aktive Bestandteil in einer pharmazeutischen
Zubereitung wird dosiert und in einem pharmazeutisch annehmbaren
Träger
zugeführt,
wie hierin unten diskutiert.
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Viele Übersichtsartikel
deckten die Hauptaspekte der Gegensinn-(AS-(antisense)) Technologie
und ihres enormen therapeutischen Potenzials ab (Wright und Anazodo,
1995). Es gibt Übersichtsartikel über die chemischen
(Crooke, 1995; Uhlmann et al., 1990), zellulären (Wagner, 1994) und therapeutischen
(Hanania et al., 1995; Scanlon et al., 1995; Gewirtz, 1993) Aspekte
dieser sich schnell entwickelnden Technologie. Innerhalb einer relativ
kurzen Zeit wurde umfassende Information über die In-vitro-Verwendung von AS-Nucleotidsequenzen
in kultivierten primären
Zellen und Zelllinien, ebenso wie für die In-vivo-Applikation solcher
Nucleotidsequenzen für
die Unterdrückung
spezifischer Vorgänge
und für
die Änderung
von Körperfunktionen
in einer vorübergehenden
Weise akkumuliert. Weiterhin ist ausreichend Erfahrung nun in vitro
und in vivo in Tiermodellen und menschlichen und klinischen Versuchen
zugänglich,
um die menschliche Wirksamkeit vorherzusagen.
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Die
Gegensinnintervention bei der Expression spezifischer Gene kann
durch die Verwendung von synthetischen AS-Oligonucleotidsequenzen
erreicht werden (für
jüngere
Berichte siehe Lefebvred'Hellencourt
et al., 1995; Agrawal, 1996; Lev-Lehman et al., 1997). AS-Oligonucleotidsequenzen
können
kurze DNS-Sequenzen sein, typischerweise 15-30 mer, sie können jedoch
ebenfalls so klein sein wie 7 mer sein (Wagner et al., 1996), gestaltet,
um Ziel-mRNS von Interesse zu komplementieren und eine RNS:AS-Duplex zu bilden.
Diese Duplexbildung kann das Verarbeiten, Splicen, den Transport
oder die Translation der relevanten mRNS verhindern. Ferner können gewisse
AS-Nucleotidsequenzen zelluläre
RNase-H-Aktivität auslösen, wenn
sie mit ihrer Ziel-mRNS hybridisiert werden, was in mRNS-Abbau resultiert
(Calabretta et al., 1996). In jenem Fall wird RNase H den RNS-Bestandteil
der Duplex abspalten und kann möglicherweise
die AS freisetzen, um weiter mit zusätzlichen Molekülen der
Ziel-RNS zu hybridisieren. Eine zusätzliche Wirkweise resultiert
aus der Wechselwirkung von AS mit genomischer DNS, um eine Tripel-Helix
zu bilden, welche transkriptionell inaktiv sein kann.
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Das
Sequenz-Zielsegment für
das Gegensinn-Oligonucleotid wird so ausgewählt, dass die Sequenz geeignete
energieverwandte Eigenschaften zeigt, die wichtig sind für die Oligonucleotidduplexbildung
mit ihren komplementären
Matrizen, und dass sie ein geringes Potenzial für Selbstdimerisierung oder
Selbstkomplementierung zeigt (Anazodo et al., 1996). Zum Beispiel
kann das Computerprogramm OLIGO (Primer Analysis Software, Version
3.4) verwendet werden, um Gegensinnsequenz-Schmelztemperatur, die
Eigenschaften freier Energie zu bestimmen und um das Potenzial der
Eigendimerbildung und eigenkomplementärer Eigenschaften zu beurteilen.
Das Programm erlaubt die Bestimmung einer qualitativen Abschätzung dieser
beiden Parameter (die mögliche
Selbstdimerbildung und selbstkomplementär) und stellt eine Anzeige
von "kein Potenzial" oder "gewisses Potenzial" oder "im Wesentlichen vollständiges Potenzial" bereit. Unter Verwendung
dieses Programmes werden allgemein solche Zielsegmente ausgewählt, die
Abschätzungen
dahingehend haben, dass sie kein Potenzial in diesen Parametern
haben. Es können
jedoch Segmente verwendet werden, die "ein gewisses Potenzial" in einer der Kategorien
haben. Eine Balance der Parameter wird verwendet bei der Auswahl,
wie es im Stand der Technik bekannt ist. Ferner werden die Oligonucleotide
ebenfalls, wie erforderlich, selektiert, so dass Analogsubstitution
die Funktion nicht wesentlich beeinträchtigt.
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Phosphorthioat-Gegensinn-Oligonucleotide
zeigen normalerweise keine signifikante Toxizität bei Konzentrationen, die
wirksam sind, und zeigen ausreichende pharmakodynamische Halbwertszeiten
in Tieren (Agarwal et al., 1996) und sind nucleaseresistent. Es
wurden gegensinn-induzierte Loss-Of-Function-Phänotypen
(Phänotypen,
bei denen eine Funktion verloren ging), die mit der zellulären Entwicklung
in Beziehung stehen, für
das saure Glia-Faser-Protein (GFAP), für die Etablierung der Tektumplattenbildung
in Hühnchen (Galileo
et al., 1991) und für
das N-myc-Protein, das verantwortlich ist für die Aufrechterhaltung von
zellulärer Heterogenität in neuroektodermalen
Kulturen (Epithelzellen gegen Neuroblastenzellen, welche sich in
ihren Koloniebildungseigenschaften, Tumorigenität und Anhaftung unterscheiden)
(Rosolen et al., 1980; Whitesell et al., 1991) gezeigt. Gegensinn-Oligonucleotidinhibition
des basischen Fibroblastenwachstumsfaktors (bFgF), der mitogene
und angiogene Eigenschaften hat, unterdrückte 80% des Wachstums in Gliomzellen
(Morrison, 1991) in einer gesättigten
und spezifischen Weise. Da sie hydrophob sind, treten Gegensinn-Oligonucleotide
gut mit Phospholipidmembranen in Wechselwirkung (Akhter et al.,
1991). Nach jeder Wechselwirkung mit der zellulären Plasmamembran werden sie
aktiv (oder passiv) in lebende Zellen transportiert (Loke et al., 1989),
in einem gesättigten
Mechanismus, von dem vorhergesagt wird, dass er spezifische Rezeptoren
involviert (Yakubov et al, 1989).
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Anstelle
einer Gegensinnsequenz, wie sie hierin oben diskutiert wird, können Ribozyme
genutzt werden. Dies ist besonders notwendig in Fällen, wo
Gegensinntherapie durch stöchiometrische Überlegungen
begrenzt wird (Sarver et al., 1990, Gene Regulation and Aids, S.
305-325). Es können
dann Ribozyme verwendet werden, welche dieselbe Sequenz zum Ziel
nehmen. Ribozyme sind RNS-Moleküle,
die eine katalytische RNS-Fähigkeit
besitzen (siehe für
einen Überblick
Cech), welche eine spezifische Stelle in einer Ziel-RNS spalten.
Die Anzahl an RNS-Molekülen,
die von einem Ribozym gespalten werden, ist größer als jene Zahl, die durch
die Stöchiometrie
vorhergesagt wird (Hampel and Tritz, 1989; Uhlenbeck, 1987).
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Ribozyme
katalysieren die Phosphodiesterbindungsspaltung von RNS. Es wurden
etliche strukturelle Ribozymfamilien identifiziert, einschließlich Gruppe-I-Introns,
RNase P, das Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus, Hammerkopf- (Hammerhead-)
Ribozyme und Haarnadelschleifen-(Hairpin-) Ribozym, das ursprünglich aus
dem negativen Strang der Satelliten-RNS des Tabakringfleckenvirus
(sTRSV) abgeleitet worden ist (Sullivan, 1994; US-Patent Nr. 5,225,347,
Spalten 4-5). Die letzten beiden Familien werden aus Viroiden und
Virusoiden abgeleitet, bei welchen von dem Ribozym angenommen wird,
dass es Monomere von Oligomeren trennt, die während der Rolling-Circle-Replikation
geschaffen werden (Symons, 1989 und 1992). Hammerkopf- und Haarnadelschleifen-Ribozymmotive
sind am gewöhnlichsten
für die
Trans-Spaltung von mRNS für
die Gentherapie angepasst (Sullivan, 1994). Der in der vorliegenden
Verwendung genutzte Ribozymtyp wird ausgewählt, wie es im Stand der Technik
bekannt. Haarnadelschleifen-Ribozyme befinden sich nun im klinischen Versuch
und sind der bevorzugte Typ. Im Allgemeinen ist das Ribozym 30-100
Nucleotide lang.
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Modifikationen
oder Analoga von Nucleotiden können
eingeführt
werden, um die therapeutischen Eigenschaften der Nucleotide zu verbessern.
Verbesserte Eigenschaften schließen eine erhöhte Nucleaseresistenz
und/oder erhöhte
Fähigkeit
ein, Zellmembranen zu durchdringen.
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Nucleaseresistenz,
wo erforderlich, wird durch jedes im Stand der Technik bekannte
Verfahren bereitgestellt, das nicht mit der biologischen Aktivität der Gegensinn-Oligodesoxynucleotide,
cDNS und/oder den Ribozymen in Wechselwirkung tritt, wie für das Verfahren
der Verwendung und Zufuhr erforderlich (Iyer et al., 1990; Eckstein,
1985; Spitzer und Eckstein, 1988; Woolf et al., 1990; Shaw et al.,
1991). Modifikationen, die an Oligonucleotiden gemacht werden können, um
die Nucleaseresistenz zu erhöhen,
schließen
das Modifizieren des Phosphor- oder Sauerstoffheteroatoms in dem
Phosphatrückgrat
ein. Diese schließen
das Zubereiten von Methylphosphonaten, Phosphorthioaten, Phosphordithioaten
und Morpholinoligomeren ein. In einem Ausführungsbeispiel wird dafür gesorgt,
indem Phosphorthioatbindungen vorgesehen sind, die die 4-6 Nucleotidbasen
des 3'-Endes verknüpfen. Alternativ
verknüpfen
Phosphorthioatbindungen sämtliche
Nucleotidbasen. Andere Modifikationen, die im Stand der Technik
bekannt sind, können
verwendet werden, wo die biologische Aktivität bewahrt wird, die Stabilität gegen
Nucleasen jedoch wesentlich erhöht
wird.
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Die
vorliegende Erfindung schließt
ebenfalls sämtliche
Analoga oder Modifikationen eines Oligonucleotids der Erfindung
ein, die nicht wesentlich die Funktion des Oligonucleotids beeinträchtigen.
Die Nucleotide können
aus natürlich
vorkommenden oder synthetisch modifizierten Basen ausgewählt werden.
Natürlich
vorkommende Basen schließen
Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin und Uracil ein. Modifizierte Basen
der Oligonucleotide schließen
Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl-, 2-Propyl- und andere
Alkyladenine, 5-Halouracil, 5-Halocytosin, 6-Azacytosin und 6-Azathymin,
Pseudouracil, 4-Thiouracil, 8-Haloadenin, 8-Aminoadenin, 8-Thioladenin,
8-Thiolalkyladenine, 8-Hydroxyladenin
und andere 8-substituierte Adenine, 8-Haloguanine, 8-Aminoguanin,
8-Thiolguanin, 8-Thioalkylguanine,
8-Hydroxylguanin und andere substituierte Guanine, andere Aza- und
Desazaadenine, andere Aza- und Desazaguanine, 5-Trifluormethyluracil
und 5-Trifluorcytosin ein.
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Zusätzlich können Nucleotidanaloga
zubereitet werden, worin die Struktur des Nucleotids fundamental geändert worden
ist und die besser geeignet sind als therapeutische oder experimentelle
Reagenzien. Ein Beispiel eines Nucleotidanalogs ist eine Peptidnucleinsäure (PNS),
worin das Desoxyribose- oder (Ribose-)Phosphatrückgrat in der DNS (oder RNS)
mit einem Polyamidrückgrat
ersetzt worden ist, welches ähnlich
ist mit jenem, das in Peptiden zu finden ist. Von PNS-Analoga wurde
gezeigt, dass sie gegen Abbau durch Enzyme resistent sind und dass
sie in vivo und in vitro verlängerte
Lebenszeiten haben. Weiterhin wurde von PNS gezeigt, dass sie stärker an
eine komplementäre
DNS-Sequenz binden als ein DNS-Molekül. Diese Beobachtung wird dem
Fehlen einer geladenen Abstoßung
zwischen dem PNS-Strang
und dem DNS-Strang zugeschrieben. Andere Modifikationen, die an
Oligonucleotiden gemacht werden können, schließen Polymerrückgrate, cyclische
Rückgrate
oder acyclische Rückgrate
ein.
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Die
aktiven Bestandteile der pharmazeutischen Zusammensetzung können Oligonucleotide
einschließen,
die nucleaseresistent sind, was für die Praxis der Erfindung
benötigt
wird, oder sie können
ein Fragment davon einschließen,
von dem gezeigt wird, dass es denselben Effekt hat, und das gegen
die geeignete(n) Sequenz(en) und/oder Ribozyme gerichtet ist. Kombinationen
aktiver Bestandteile, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart,
können
verwendet werden, einschließlich
Kombinationen von Gegensinnsequenzen.
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Die
Gegensinn-Oligonucleotide (und oder Ribozyme) und cDNS der vorliegenden
Erfindung können durch
jedes im Stand der Technik für
Ribonuclein- oder Desoxyribonucleinnucleotide bekannte Verfahren
synthetisiert werden. Zum Beispiel kann ein 380B-DNA-Synthetisiergerät von Applied
Biosystems verwendet werden. Wenn Fragmente verwendet werden, können zwei
oder mehr solcher Sequenzen für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung synthetisiert und miteinander
gekoppelt werden.
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Die
Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung können entweder direkt oder mit
viralen oder nicht-viralen Vektoren zugeführt werden. Wenn sie direkt
zugeführt
werden, werden die Sequenzen im Allgemeinen nucleaseresistent gemacht.
Alternativ können
die Sequenzen in Expressionskassetten oder -konstrukte so eingebaut
werden, dass die Sequenz in der Zelle exprimiert wird, wie hierin
unten diskutiert. Allgemein enthält
das Konstrukt die richtige regulatorische Sequenz oder Promotor,
um der Sequenz zu ermöglichen, dass
sie in der zum Ziel genommenen Zelle exprimiert wird.
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Negativ
dominantes Peptid bezieht sich auf eine Teil-cDNS-Sequenz, die einen
Teil eines Proteins kodiert, das heißt ein Peptid (siehe Herskowitz,
1987). Dieses Peptid kann eine von dem Protein, von dem es abgeleitet
wurde, verschiedene Funktionen haben. Es kann mit dem vollständigen Protein
in Wechselwirkung treten und seine Aktivität inhibieren oder es kann mit
anderen Proteinen in Wechselwirkung treten und deren Aktivität in Antwort
auf das vollständige
Protein inhibieren. Negativ dominant bedeutet, dass das Peptid in
der Lage ist, die natürlichen
Proteine zu überwinden
und vollständig
ihre Aktivität
zu inhibieren, um der Zelle eine abweichende Eigenschaft, wie Resistenz
oder Sensitivierung zum Abtöten,
zu geben. Für
den therapeutischen Eingriff wird entweder das Peptid selber als
der aktive Bestandteil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zugeführt oder
die cDNS kann der Zelle zugeführt
werden, unter Verwendung desselben Verfahrens für die Gegensinn-Zufuhr.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bereitstellen eines
Apoptoseregulierungsgens, Angiogeneseregulierungsgens oder eines
Hypoxieregulierungsgens bereit, indem einem Patienten, der einer
solchen Therapie bedarf, unter Nutzung von Gentherapie ein exprimierbarer
Vektor, der Expressionskontrollsequenzen umfasst, die operabel mit
einer der in der Gruppe, umfassend SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ
ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, dargelegten
Sequenzen gekoppelt ist, direkt zugeführt wird.
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Gentherapie,
wie es hierin verwendet wird, bezieht sich auf den Transfer genetischen
Materials (z. B. DNS oder RNS) von Interesse in einen Wirt, um eine
genetische oder erworbene Krankheit oder um Zustandsphänotypen
zu behandeln oder vorzubeugen. Das genetische Material von Interesse
kodiert ein Produkt (z. B. ein Protein, Polypeptid, Peptid, funktionelle
RNS, Gegensinn), dessen Produktion in vivo gewünscht wird. Zum Beispiel kann
das genetische Material von Interesse ein Hormon, einen Rezeptor,
ein Enzym, ein Polypeptid oder Peptid von therapeutischem Wert kodieren.
Alternativ kodiert das genetische Material von Interesse ein Suizidgen.
Für einen Überblick
siehe im Allgemeinen den Text "Gene
Therapy" (Advances
in Pharmacology 40, Academic Press, 1997).
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Es
wurden zwei grundsätzliche
Ansätze
für die
Gentherapie entwickelt: (1) Ex-vivo- und (2) In-vivo-Gentherapie. Bei
der Ex-vivo-Gentherapie werden Zellen von einem Patienten entnommen
und, während sie
kultiviert werden, werden sie in vitro behandelt. Allgemein wird
ein funktionelles Ersatzgen in die Zelle im Wege eines geeigneten
Genzufuhrvehikels/-verfahrens (Transfektion, Transduktion, homologe
Rekombination etc.) und ein Expressionssystem, wenn benötigt, eingeführt und
dann werden modifizierte Zellen in Kultur expandiert und dem Wirt/Patienten
wieder gegeben. Von diesen genetisch reimplantierten Zellen wurde
gezeigt, dass sie das transfizierte genetische Material in situ
exprimieren.
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Bei
der In-vivo-Gentherapie werden die Zielzellen nicht aus dem Subjekt
entfernt, stattdessen wird das zu übertragende genetische Material
in die Zellen des Empfängerorganismus
in situ eingeführt,
das heißt
innerhalb des Empfängers.
Bei einer alternativen Ausführung,
falls das Wirtsgen defekt ist, wird das Gen in situ repariert (Culver,
1998). Von diesen genetisch veränderten
Zellen wurde gezeigt, dass sie das transfizierte genetische Material
in situ exprimieren.
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Das
Genexpressionsvehikel ist in der Lage, die heterologe Nucleinsäure in eine
Wirtszelle zu liefern/zu übertragen.
Das Expressionsvehikel kann Elemente einschließen, um das Targeting, die
Expression und die Transkription der Nucleinsäure auf eine zellselektive
Weise, wie es im Stand der Technik bekannt ist, zu kontrollieren.
Es sollte festgestellt werden, dass oftmals das 5'UTR und/oder 3'UTR des Gens durch
das 5'UTR und/oder
3'UTR des Expressionsvehikels
ersetzt werden kann. Deshalb kann, wie hierin verwendet das Expressionsvehikel,
soweit erforderlich, nicht das 5'UTR
und/oder 3'UTR des
tatsächlich
zu transferierenden Gens einschließen, sondern kann nur die spezifische
Aminosäurekodierungsregion
einschließen.
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Das
Expressionsvehikel kann einen Promotor einschließen, um die Transkription des
heterologen Materials zu kontrollieren, und kann entweder ein konstitutiver
oder induzierbarer Promotor sein, um eine selektive Transkription
zu erlauben. Es können
Enhancer, die erforderlich sein können, um notwendige Transkriptionsspiegel
zu erhalten, wahlweise eingeschlossen sein. Enhancer sind im Allgemeinen
nicht-translatierte DNS-Sequenzen,
die zusammenhängend
mit der kodierenden Sequenz (in cis) arbeiten, um das durch den Promotor
diktierte basale Transkriptionsmaß zu ändern. Das Expressionsvehikel
kann ebenfalls ein Selektionsgen einschließen, wie hierin unten beschrieben.
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Vektoren
können
in Zellen oder Gewebe durch jedes einer Vielzahl von im Stand der
Technik bekannten Verfahren eingeführt werden. Solche Verfahren
können
allgemein beschrieben gefunden werden in Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New
York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), Chang
et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vega
et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995), Vectors:
A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston
MA (1988), und Gilboa et al., (1986), und schließen z. B. die stabile oder
transiente Transfektion, Lipofektion, Elektroporation und die Infektion
mit rekombinanten viralen Vektoren ein. Zusätzlich, siehe US-Patent 4,866,042
für Vektoren,
die das Zentralnervensystem einschließen, und ebenfalls die US-Patente
5,464,764 und 5,487,992 für
Positiv-Negativ-Selektionsverfahren.
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Das
Einführen
von Nucleinsäuren
durch Infektion bietet etliche Vorteile gegenüber den anderen aufgelisteten
Verfahren. Es kann wegen ihrer infektiösen Art eine höhere Effizienz
erhalten werden. Ferner sind Viren sehr spezialisiert und infizieren
typischerweise spezifische Zelltypen und pflanzen sich dort fort.
Folglich kann ihre natürliche
Spezifität
verwendet werden, um die Vektoren auf spezifische Zelltypen in vivo
oder innerhalb eines Gewebes oder einer gemischten Zellkultur zu
richten. Virale Vektoren können
ebenfalls mit spezifischen Rezeptoren oder Liganden modifiziert
werden, um die Zielspezifität
durch rezeptorvermittelte Ereignisse zu ändern.
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Ein
spezifisches Beispiel eines viralen DNS-Vektors für das Einführen und
Exprimieren von rekombinanten Sequenzen ist der vom Adenovirus abgeleitete
Vektor Adenop53TK. Dieser Vektor exprimiert ein Thymidinkinase-(TK-)Gen
des Herpesvirus für
entweder die positive oder negative Selektion und eine Expressionskassette
für die
gewünschten
rekombinanten Sequenzen. Dieser Vektor kann verwendet werden, um
Zellen zu infizieren, die einen Adenovirusrezeptor haben, was die
meisten Krebse epithelialen Ursprungs ebenso wie andere einschließt. Dieser
Vektor kann, ebenso wie andere, welche ähnliche gewünschte Funktionen zeigen, verwendet
werden, um eine gemischte Zellpopulation zu behandeln und kann z.
B. eine In-vitro- oder Ex-vivo-Kultur von Zellen, ein Gewebe oder
ein menschliches Subjekt einschließen.
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Es
können
zusätzliche
Eigenschaften zu dem Vektor hinzugefügt werden, um seine Sicherheit
sicherzustellen und/oder seine, therapeutische Wirksamkeit zu erhöhen. Solche
Eigenschaften schließen
z. B. Marker ein, die verwendet werden können, um negativ gegen Zellen
zu selektieren, die mit dem rekombinanten Virus infiziert sind.
Ein Beispiel solch eines negativen Selektionsmarkers ist das oben
beschriebene TK-Gen, das Sensitivität für das Antibiotikum Gancyclovir
verleiht. Negativselektion ist deshalb ein Mittel, durch welches Infektion
kontrolliert werden kann, da sie induzierbaren Suizid durch die
Zugabe von Antibiotikum bereitstellt. Solch ein Schutz stellt sicher,
dass, falls z. B. Mutationen entstehen, die geänderte Formen des viralen Vektors oder
der rekombinanten Sequenz erzeugen, eine zelluläre Transformation nicht geschehen
wird.
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Eigenschaften,
die die Expression auf bestimmte Zelltypen begrenzen, können ebenfalls
eingeschlossen sein. Solche Eigenschaften schließen z. B. Promotoren und regulatorische
Elemente ein, die spezifisch für den
gewünschten
Zelltyp sind.
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Zusätzlich sind
rekombinante virale Vektoren nützlich
für die
In-vivo-Expression einer gewünschten Nucleinsäure, da
sie Vorteile wie laterale Infektion und Targetingspezifität bieten.
Laterale Infektion ist im Lebenszyklus von z. B. Retroviren innewohnend
und ist der Vorgang, durch welchen eine einzelne infizierte Zelle viele
Nachfahrenvirionen produziert, die sich absprossen und benachbarte
Zellen infizieren. Das Ergebnis ist, dass ein großes Gebiet
schnell infiziert wird, von dem das Meiste anfänglich nicht durch die ursprünglichen viralen
Partikel infiziert worden war. Dies steht im Gegensatz zu dem vertikalen
Infektionstyp, bei welchem das infektiöse Mittel nur durch Tochternachfahren
verbreitet wird. Es können
ebenfalls virale Vektoren produziert werden, die unfähig sind,
sich lateral zu verbreiten. Diese Eigenschaft kann nützlich sein,
falls der gewünschte Zweck
das Einführen
eines spezifizierten Gens in nur eine lokalisierte Anzahl von Zielzellen
ist.
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Wie
oben beschrieben, sind Viren sehr spezialisierte infektiöse Mittel,
die sich in vielen Fällen
schon entwickelt haben, um Wirtsabwehrmechanismen zu umgehen. Typischerweise
infizieren Viren spezifische Zelltypen und pflanzen sich dort fort.
Die Zielspezifität
viraler Vektoren nutzt ihre natürliche
Spezifizität
auf spezifisch vorbestimmte Zielzelltypen und führt dabei ein rekombinantes
Gen in die infizierte Zelle ein. Der zu verwendende Vektor in den
Verfahren der Erfindung wird von dem zum Ziel zu nehmenden gewünschten
Zelltyp abhängen
und wird Fachleuten bekannt sein. Zum Beispiel würde, falls Brustkrebs behandelt
werden soll, dann ein Vektor verwendet werden, der spezifisch für solche
epitheliale Zellen ist. Ähnlich
würde,
falls Krankheiten oder pathologische Zustände des hämatopoetischen Systems zu behandeln
sind, dann ein viraler Vektor verwendet werden, der spezifisch für Blutzellen
und ihre Vorläuferzellen,
bevorzugt für
den spezifischen Typ an hämatopoetischer
Zelle ist.
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Es
können
retrovirale Vektoren konstruiert werden, um entweder als infektiöse Partikel
zu funktionieren oder um nur eine einzige Anfangsrunde der Infektion
durchzumachen. In dem ersteren Fall wird das Genom des Virus so
modifiziert, dass es sämtliche
der notwendigen Gene, regulatorischen Sequenzen und Verpackungssignale
bewahrt, um neues virales Protein und RNS zu synthetisieren. Wenn
diese Moleküle
erst einmal synthetisiert sind, dann verpackt die Wirtszelle die
RNS in neue virale Partikel, die in der Lage sind, weitere Infektionsrunden
durchzumachen. Das Vektorgenom wird ebenfalls bearbeitet, um das
gewünschte
rekombinante Gen zu kodieren und zu exprimieren. In dem Fall der
nicht-infektiösen viralen
Vektoren wird das Vektorgenom gewöhnlich mutiert, um das virale
Verpackungssignal zu zerstören,
das erforderlich ist, die RNS in Viruspartikel zu verkapseln. Ohne
solch ein Signal werden alle Partikel, die gebildet werden, ein
Genom nicht enthalten und können
deshalb nicht durch nachfolgende Infektionsrunden fortschreiten.
Der spezifische Vektortyp wird von der intendierten Anwendung abhängen. Die
tatsächlichen
Vektoren sind ebenfalls bekannt und leicht in der Technik zugänglich oder
können
durch Fachleute unter Verwendung von wohl bekannter Methodik konstruiert
werden.
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Der
rekombinante Vektor kann auf etlichen Wegen verabreicht werden.
Falls z. B. virale Vektoren verwendet werden, kann das Vorgehen
einen Vorteil aus ihrer Zielspezifität ziehen und sie müssen folglich
nicht lokal an der erkrankten Stelle verabreicht werden. Die lokale
Verabreichung kann jedoch eine schnellere und wirksamere Behandlung
sicherstellen, wobei die Verabreichung ebenfalls z. B. durch intravenöse oder
subkutane Injektion in das Subjekt durchgeführt werden kann. Die Injektion
von viralen Vektoren in eine Spinalflüssigkeit kann ebenfalls als
eine Applikationsweise verwendet werden, insbesondere in dem Falle
neurodegenerativer Erkrankungen. Nach der Injektion werden die viralen
Vektoren so lange zirkulieren, bis sie Wirtszellen mit der passenden
Zielspezifität
für die
Infektion erkennen.
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Ein
alternativer Applikationsmodus kann durch die direkte Inokulation
lokal an der Stelle der Erkrankung oder dem pathologischen Zustand
oder durch Inokulation in das Gefäßsystem, welche die Stelle
mit Nährstoffen
versorgt, oder in die Spinalflüssigkeit
sein. Die lokale Verabreichung ist vorteilhaft, da es keinen Verdünnungseffekt
gibt und deshalb eine kleinere Dosis erforderlich ist, um die Expression
in einer Mehrheit der zum Ziel genommenen Zellen zu erreichen. Zusätzlich kann
die lokale Inokulation die Zielerfordernisse erleichtern, die mit
anderen Applikationsformen erforderlich ist, da ein Vektor verwendet
werden kann, der sämtliche
Zellen in dem inokulierten Gebiet infiziert. Falls die Expression
nur in einer spezifischen Untergruppe von Zellen in dem geimpften
Gebiet gewünscht
wird, dann können
Promotoren und regulatorische Elemente, die spezifisch für die gewünschte Untergruppe
sind, verwendet werden, um dieses Ziel zu bewerkstelligen. Solche Nicht-Ziel-Vektoren
können
z. B. virale Vektoren, virale Genome, Plasmide, Phagemide und Ähnliche
sein. Transfektionsvehikel, wie Liposomen, können ebenfalls verwendet werden,
um die oben beschriebenen nicht-viralen Vektoren in Empfängerzellen
innerhalb des geimpften Gebiets einzuführen. Solche Transfektionsvehikel
sind Fachleuten bekannt.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die aktiven Bestandteile
der vorliegenden Erfindung enthalten, wie hierin oben beschrieben,
werden verabreicht und dosiert in Übereinstimmung mit guter medizinischer
Praxis, was den klinischen Zustand des einzelnen Patienten, den
Ort und das Verfahren der Applikation, den Verabreichungsplan, das
Alter des Patienten, dessen Geschlecht, Körpergewicht und andere dem medizinischen
Praktiker bekannte Faktoren berücksichtigt.
Die pharmazeutisch "wirksame
Menge" für Zwecke hierin
ist folglich durch solche Überlegungen
bestimmt, wie sie in der Medizin bekannt sind. Diese Menge muss wirksam
sein, um eine Verbesserung zu erzielen, einschließlich, jedoch
nicht beschränkt
auf eine verbesserte Überlebensrate
oder eine schnellere Genesung oder eine Verbesserung oder eine Elimination
von Symptomen und anderen Indikatoren, wie sie durch geeignete Maßnahmen
von Fachleuten in der Medizin ausgewählt sind. Die pharmazeutischen
Zusammensetzungen können
Kombinationen der aktiven Bestandteile sein, werden jedoch wenigstens
einen aktiven Bestandteil einschließen.
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In
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen
der vorliegenden Erfindung auf verschiedenen Wegen verabreicht werden,
unter Berücksichtigung
der Art der Verbindungen in den pharmazeutischen Zusammensetzungen.
Es sollte bemerkt werden, dass sie als die Verbindung oder als ein
pharmazeutisch annehmbares Salz verabreicht werden können und
dass sie alleine oder als ein aktiver Bestandteil in Kombination
mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Verdünnungsmitteln, Hilfsstoffen
und Vehikeln verabreicht werden können. Die Verbindungen können oral,
subkutan oder parenteral, einschließlich intravenös, intraarterial,
intramuskulär,
intraperitoneal und durch die intranasale Applikation verabreicht
werden, ebenso wie intrathekal und durch Infusionstechniken. Implantate
der Verbindungen sind ebenfalls nützlich. Der Patient, der behandelt
wird, ist ein warmblütiges
Tier und insbesondere ein Säuger,
einschließlich
des Menschen. Die pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel, Hilfsstoffe und
Vehikel, ebenso Implantatträger,
beziehen sich im Allgemeinen auf inerte, nicht-toxische feste oder
flüssige
Füllstoffe,
Verdünnungsmittel
oder Verkapselungsmaterial, das nicht mit den aktiven Bestandteilen
der Erfindung reagiert.
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Es
wird bemerkt, dass Menschen im Allgemeinen länger behandelt werden als die
Maus oder andere Versuchstiere, die hierin als Beispiel ausgeführt sind,
deren Behandlung eine Dauer hat, die proportional zu der Dauer des
Erkrankungsfortschreitens und der Arzneimittelwirksamkeit ist. Die
Dosen können
Einzeldosen oder mehrfache Dosen über einen Zeitraum von etlichen
Tagen sein, es sind jedoch Einzeldosen bevorzugt.
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Die
Dosen können
einzelne Dosen oder mehrfache Dosen über einen Zeitraum von etlichen
Tagen sein. Die Behandlung hat im Allgemeinen eine Länge, die
proportional zu der Länge
des Krankheitsfortschreitens und der Arzneimittelwirksamkeit und
den behandelten Patienten ist.
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Wenn
die Verbindung der vorliegenden Erfindung parenteral verabreicht
wird, wird sie im Allgemeinen in einer injizierbaren Dosiseinheitsform
(Lösung,
Suspension, Emulsion) formuliert werden. Die für die Injektion geeigneten
pharmazeutischen Formulierungen schließen sterile wässrige Lösungen oder
Dispersionen und sterile Puder für
die Rekonstitution in sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein.
Der Träger
kann ein Lösungsmittel
oder ein Dispersionsmedium sein, enthaltend z. B. Wasser, Ethanol,
Polyol (z. B. Glycerol, -Propylenglykol, flüssiges Polyethylenglykol und Ähnliches),
geeignete Mischungen davon und pflanzliche Öle.
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Die
richtige Fluidität
kann z. B. aufrecht erhalten werden durch die Verwendung eines Überzugs
wie Lecithin, durch die Erhaltung der erforderlichen Partikelgröße in dem
Fall einer Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven
Mitteln. Nicht-wässrige
Vehikel wie Baumwollsamenöl,
Sesamöl,
Olivenöl, Sojaöl, Maiskeimöl, Sonnenblumenöl oder Erdnussöl und Ester,
wie Isopropylmyristat, können
ebenfalls als Lösungsmittelsysteme
für Verbindungszusammensetzungen
verwendet werden. Zusätzlich
können
zahlreiche Additive, welche die Stabilität, Sterilität und Isotonie der Zusammensetzungen
verbessern, einschließlich
antimikrobiellen Konservierungsmitteln, Antioxidantien, Komplexbildnern
und Puffer hinzugefügt
werden. Die Verhinderung der Tätigkeit
von Mikroorganismen kann durch etliche antibakterielle und Antipilzmittel
sichergestellt werden, z. B. durch Parabene, Chlorbutanol, Phenol,
Sorbinsäure
und Ähnliches.
In vielen Fällen
wird es wünschenswert
sein, isotonische Mittel einzuschließen, z. B. Zucker, Natriumchlorid
und Ähnliche.
Die verlängerte Absorption
der injizierbaren pharmazeutischen Form kann durch die Verwendung
von Mitteln zustande gebracht werden, welche die Absorption verzögern, z.
B. Aluminiummonostearat und Gelatine. Gemäß der vorliegenden Erfindung
würde jedoch
jedes verwendete Vehikel, Verdünnungsmittel
oder Additiv mit den Verbindungen kompatibel sein müssen.
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Sterile
injizierbare Lösungen
können
zubereitet werden durch Einschließen der bei der Praxis der
vorliegenden Erfindung genutzten Verbindungen in der erforderlichen
Menge des geeigneten Lösungsmittels
mit zahlreichen anderen Bestandteilen, falls gewünscht.
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Eine
pharmakologische Formulierung der vorliegenden Erfindung kann dem
Patienten in einer injizierbaren Formulierung verabreicht werden,
die jeden kompatiblen Träger,
wie etliche Vehikel, Hilfsstoffe, Additive und Verdünnungsmittel
enthält;
oder die in der vorliegenden Erfindung genutzten Verbindungen können parenteral
dem Patienten in der Form von subkutanen Implantaten mit verzögerter Freisetzung
oder in der Form von Zielzufuhrsystemen, wie monoklonale Antikörper, durch
Vektor unterstützte
Zufuhr, iontophoretisch, Polymermatrizen, Liposomen und Mikrokugeln
zugeführt
werden. Beispiele an in der vorliegenden Erfindung nützlichen
Zufuhrsystemen schließen
ein: 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194;
4,447,233; 4,447,224; 4,439,196 und 4,475,196. Viele andere solcher
Implantate, Zufuhrsysteme und Module sind Fachleuten wohl bekannt.
-
Eine
pharmakologische Formulierung der Verbindung, die in der vorliegenden
Erfindung genutzt wird, kann dem Patienten oral verabreicht werden.
Gewöhnliche
Verfahren wie Verabreichung der Verbindungen in Tabletten, Suspension,
Lösungen,
Emulsionen, Kapseln, Pudern, Sirup und Ähnliche sind nützlich.
Bekannte Techniken, welche sie oral oder intravenös zuführt und
die die biologische Aktivität
bewahren, sind bevorzugt.
-
In
einem Ausführungsbeispiel
kann die Verbindung der vorliegenden Erfindung anfänglich durch
intravenöse
Injektion verabreicht werden, um die Blutspiegel auf einen geeigneten
Spiegel zu bringen. Die Spiegel des Patienten werden dann durch
eine orale Dosierungsform aufrechterhalten, obwohl andere Applikationsformen,
in Abhängigkeit
von dem Zustand des Patienten und wie oben angezeigt, verwendet
werden können.
Die zu verabreichende Menge wird für den behandelten Patienten
variieren und wird von ungefähr
100 ng/kg Körpergewicht
bis 100 mg/kg Körpergewicht
pro Tag variieren und wird bevorzugt von 10 μg/kg bis 10 mg/kg pro Tag betragen.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren für die Diagnose
der Anwesenheit von Ischämie
in einem Patienten bereit, das die Schritte des Analysierens einer
Körperflüssigkeit
oder Gewebeprobe von dem Patienten hinsichtlich der Anwesenheit
oder eines Genproduktes von wenigstens einem exprimierten Gen (heraufreguliert),
wie dargelegt in der Gruppe, umfassend SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr.
2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5 und SEQ ID Nr. 6, oder
von Proteinen, wie dargelegt in SEQ ID Nrn. 7-11, einschließt, und wo
Ischämie
bestimmt wird, falls das heraufregulierte Gen oder Genprodukt bestätigt wird,
wie hierin in dem Beispiel beschrieben. Die Körperflüssigkeiten können Tränenflüssigkeit,
Serum, Urin, Schweiß oder
eine andere Körperflüssigkeit
einschließen,
wo sezernierte Proteine aus dem Gewebe, das ein ischämisches
Ereignis durchmacht, lokalisiert werden können.
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Zusätzliche
Verfahren für
die Identifikation des Gens oder Genprodukts sind Immuntests, wie
ELISA oder Radioimmuntests (RIA), sie können verwendet werden, wie
es Fachleuten bekannt ist, insbesondere um Genprodukte in den Proben
zu identifizieren. Immunhistochemisches Färben von Gewebeproben wird
ebenfalls für
die Identifikation genutzt. Zugängliche
Immuntests sind umfassend beschrieben in der Patent- und Wissenschaftsliteratur.
Siehe z. B. die US-Patente 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578;
3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533;
3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 und 5,281,521.
Ferner können
für die
Identifikation des Gens In-situ-Hybridisierung, Southern-Blotting,
konformatorischer Einzelstrangpolymorphismus, Restriktionsendonucleasefingerprinting
(REF), PCR-Amplifikation und DNS-Chipanalyse unter Verwendung der
Nucleinsäuresequenz
der vorliegenden Erfindung als Primer verwendet werden.
-
Die
obige Diskussion stellt eine Tatsachenbasis für die Verwendung von Genen,
um Hypoxie und Ischämie
und damit ebenfalls Apoptose und Angiogenese zu regulieren, bereit.
Die verwendeten Verfahren und die Nützlichkeit der vorliegenden
Erfindung kann durch das folgende, nicht begrenzende Beispiel und
die begleitenden Figuren gezeigt werden.
-
BEISPIEL
-
VERFAHREN:
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Die
meisten in der Molekularbiologie verwendeten Techniken werden weithin
in der Technik praktiziert und die meisten Praktiker sind mit den
Standardquellmaterialien, welche spezifische Bedingungen und Vorgänge beschreiben,
vertraut. Für
die Bequemlichkeit mögen
die folgenden Absätze
als eine Richtlinie dienen.
-
Allgemeine
Verfahren in der Molekularbiologie: Es wird im Stand der Technik
bekannten und nicht-spezifisch beschriebenen Standard-Molekularbiologietechniken
im Allgemeinen gefolgt, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989),
und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989), besonders für die Northern-Analyse
und die In-situ-Analyse, und in Perbal, A Practical Guide to Molecular
Cloning, John Wiley & Sons,
New York (1988), und in Watson et al., Recombinant DNA, Scientific
American Books, New York. Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde allgemein
durchgeführt,
wie in PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic
Press, San Diego, CA (1990).
-
Reaktionen
und Manipulationen, die andere Nucleinsäuretechniken einschließen, bis
nicht anderweitig festgestellt, wurden durchgeführt, wie allgemein beschrieben
in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, und wie in der Methode, die
dargelegt ist in den US-Patenten 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531;
5,192,659 und 5,272;057, und hierin durch Bezugnahme einschlossen.
-
Zusätzlich kann
In-situ-(In-Cell-)PCR in Kombination mit Durchflusszytometrie für die Detektion
von Zellen verwendet werden, die spezifische DNS- und mRNS-Sequenzen
enthalten (Testoni et al., 1996, Blood 87:3822).
-
Allgemeine
Verfahren in der Immunologie: Es wird Standardverfahren in der Immunologie,
die allgemein im Stand der Technik bekannt sind und die nicht spezifisch
beschrieben sind, allgemein gefolgt, wie in Stites et al.(Hrsg.),
Basic and Clinical Immunology (8. Auflage), Appleton & Lange, Norwalk,
CT (1994), und Mishell und Shiigi (Hrsg.), Selected Methods in Cellular
Immunology, W.H. Freeman and Co., New York (1980). Zugängliche
Immuntests sind ausgedehnt beschrieben in der Patent- und Wissenschaftsliteratur.
Siehe z. B. US-Patente 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578;
3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533;
3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521,
ebenso wie Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Springs Harbor, New York, 1989.
-
Differenzialanalyse
-
Es
wurden z. B. C6-Gliomzellen oder andere geeignete Zellen, Zelllinien
oder Gewebe unter normalen Bedingungen (Normoxie) oder unter Sauerstoffentzugsbedingungen
(Hypoxie) allgemein für
4 bis 16 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden geerntet und
RNS wird aus den Cytoplasmaextrakten und aus den Kernfraktionen
zubereitet. Nach der Extraktion der RNS werden fluoreszierende cDNS-Sonden
zubereitet. Jeder Zustand (z. B. 4 Stunden Hypoxie und Normoxie)
wird mit einem unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoff markiert.
Zum Beispiel kann eine Sonde aus einer Mischung aus Cy3-dCTP-cDNS, zubereitet
aus aus hypoxischen Zellen extrahierter RNS, und Cy5-dCTP-cDNS,
zubereitet aus aus normoxischen Zellen extrahierter RNS, zusammengesetzt
sein. Die Sonden werden für
die Hybridisierung an den Mikroarray verwendet, der individuell
aufgetüpfelte
Ziel-DNS-Klone enthält,
die von C6-Zellen abgeleitet sind, welche Hypoxie ausgesetzt waren.
Differenzielle Expression wird durch die Menge fluoreszierender
cDNS, die mit jedem der Klone auf dem Array hybridisiert, gemessen.
Gene, die unter Hypoxie heraufreguliert sind, werden mehr Fluoreszenz
von Cy3 als von Cy5 haben. Die Ergebnisse zeigen Gene, die transkriptorisch
induzierte mRNS-Arten sind, die sehr schnell auf Hypoxie ansprechen.
-
Differenzielles Display:
-
Reverse
Transkription: 2 μg
RNS werden mit 1 pmol Oligo-dT-Primer (dT)18 in
einem Volumen von 6,5 μl
durch Erhitzen auf 70°C
für 5 Minuten
und Abkühlen
auf Eis dem Annealing unterzogen. 2 μl Reaktionspuffer (×5), 1 μl 10 mM dNTP-Mischung
und 0,5 μl
reverse Transkriptase SuperScript-II (GibcoBRL) wurden hinzugefügt. Die
Reaktion wird für
eine Stunde bei 42°C
durchgeführt.
Die Reaktion wird durch die Zugabe von 70 μl TE (10 mM Tris, pH = 8; 0,1
mM EDTA) gestoppt.
-
Oligonucleotide,
die für
das differenzielle Display verwendet werden: Die Oligonucleotide
sind allgemein jene, die in dem Delta-RNA-Fingerprinting-Kit (Clontech
Labs,Inc.) beschrieben sind. Amplifikationsreaktionen: Jede Reaktion
wird in 20 μl
durchgeführ
und enthält
50 μM dNTP-Mischung, 1 μM von jedem
Primer, 1 × Polymerasepuffer,
1 Einheit Expansionspolymerase (Boehringer Mannheim), 2 μCi [α-32P]dATP und 1 μl cDNS-Matrize. Die Cyclisierungsbedingungen
sind allgemein: drei Minuten bei 95°C, dann drei Cyclen von zwei
Minuten bei 94°C,
fünf Minuten
bei 40°C,
fünf Minuten
bei 68°C.
Diesen wird von 27 Cyclen mit einer Minute bei 94°C, zwei Minuten
bei 60°C,
zwei Minuten bei 68°C
gefolgt. Reaktionen wurden abgeschlossen durch eine siebenminütige Inkubation
bei 68°C
und durch die Zugabe von 20 μl
Sequenzierstopplösung
(95% Formamid, 10 mM NaOH, 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xylencyanol).
-
Gelanalyse:
Allgemein werden 3 bis 4 μl
auf ein 5%iges Sequenzierpolyacrylamidgel geladen und die Proben
werden der Elektrophorese bei 2000 Volt/40 Milliampere unterzogen,
bis der langsame Farbstoff (Xylencyanol) sich ungefähr 2 cm
von der Unterkante entfernt befindet. Das Gel wird auf ein Filterpapier übertragen,
unter Vakuum getrocknet und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
-
Wiedergewinnung
differenzieller Banden: Banden, die irgendeinen Unterschied zwischen
den verschiedenen Pools zeigen, werden aus dem getrockneten Gel
ausgeschnitten und in ein Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. 50 μl steriles
H2O werden hinzugefügt und die Röhrchen werden
auf 100°C
für 5 Minuten
erhitzt. 1 μl
wird zu einer 49 μl-PCR-Reaktion
unter Verwendung derselben Primer, die für das differenzielle Display
verwendet worden sind, hinzugefügt
und die Proben werden für
30 Cyclen mit einer Minute bei 94°C,
einer Minute bei 60°C
und einer Minute bei 68°C
amplifiziert. 10 μl
werden auf Agarosegel analysiert, um die erfolgreiche Amplifikation
sichtbar zu machen und zu bestätigen.
-
Analyse repräsentativer
Unterschiede
-
Reverse
Transkription: wie oben, jedoch mit 2 μg polyA+-selektierter mRNS.
-
Zubereitung
doppelsträngiger
cDNS: cDNS aus dem vorangegangenen Schritt wird mit Alkali behandelt,
um die mRNS zu entfernen, gefällt
und in 20 μl
H2O gelöst.
50 μl Puffer,
2 μl 10
mM dATP, H2O auf 48 μl und 2 μl terminale Desoxynucleotidtransferase
(TdT) werden hinzugefügt.
Die Reaktion wird 2–4
Stunden bei 37°C
inkubiert. 5 μl
Oligo-dT (1 μg/μl) wurden
hinzugefügt
und bei 60°C
für fünf Minuten
inkubiert. 5 μl
200 mM DTT, 10 μl
10 × Sektionspuffer
(100 mM MgCl2, 900 mM Hepes, pH 6,6), 16 μl dNTPs (1
mM) und 16 U Klenow werden hinzugefügt und die Mischung wird über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert, um ds cDNS zu erzeugen. 100 μl TE werden
hinzugefügt
und mit Phenol/Chloroform extrahiert. Die DNS wird gefällt und
in 50 μl
H2O gelöst.
-
Erzeugung
von Repräsentationen:
cDNS mit DpnII wird durch die Zugabe von 3 μl DpnII-Reaktionspuffer 20 V und DpnII zu 25 μl cDNS verdaut
und fünf
Stunden bei 37°C
inkubiert. 50 μl
TE werden hinzugefügt und
mit Phenol/Chloroform extrahiert. cDNS wird gefällt und auf eine Konzentration
von 10 ng/μl
gelöst.
-
Treiber:
1,2 μg mit
DpnII verdaute cDNS, 4 μl
von jedem Oligo und 5 μl
Ligationspuffer ×10
werden dem Annealing bei 60°C
für zehn
Minuten unterzogen. 2 μl
Ligase werden hinzugefügt
und über
Nacht bei 16°C
inkubiert. Die Ligationsmischung wird durch Hinzufügen von
140 μl TE
verdünnt.
-
Amplifikation
wird in einem Volumen von 200 μl
unter Verwendung des geeigneten Primers und 2 μl Ligationsprodukt durchgeführt und
wiederholt in 20 Röhrchen
für jede
Probe. Vor dem Hinzufügen
von Taq-DNS-Polymerase werden die Röhrchen auf 72°C für drei Minuten
erhitzt. Die PCR-Bedingungen sind wie folgt: fünf Minuten bei 72°C, zwanzig
Cyclen mit einer Minute bei 95°C
und drei Minuten bei 72°C,
gefolgt von zehn Minuten bei 72°C.
Jeweils vier Reaktionen wurden vereinigt, mit Phenol/Chloroform
extrahiert und gefällt. Amplifizierte
DNS wird auf eine Konzentration von 0,5 μg/μl gelöst und sämtliche Proben werden vereinigt.
-
Subtraktion:
Tester-DNS (20 μg)
wird mit DpnII wie oben verdaut und auf einem 1,2% Agarosegel aufgetrennt.
Die DNS wird aus dem Gel extrahiert und 2 μg werden mit den passend Oligos
ligiert. Die ligierte Tester-DNS wird dann auf 10 ng/μl mit TE
verdünnt.
Treiber-DNS wird mit DpnII verdaut und auf eine Endkonzentration
von 0,5 μg/μl aufgereinigt.
Mische 40 μg
Treiber-DNS mit 0,4 μg
Tester-DNS. Extraktion wird durchgeführt mit Phenol/Chloroform und
gefällt
unter Verwendung von zwei Waschschritten mit 70% Ethanol, die DNS
wird in 4 μl
30 mM EPPS, pH = 8,0, 3 mM EDTA resuspendiert und mit 35 μl Mineralöl überschichtet. Denaturiere
bei 98°C
für fünf Minuten,
kühle auf
67°C ab
und füge
1 μl 5 M
NaCl zu der DNS hinzu. Inkubiere bei 67°C für zwanzig Stunden. Verdünne die
DNS durch Hinzufügen
von 400 μl
TE.
-
Amplifikation:
Amplifikation subtrahierter DNS in einem Endvolumen von 200 μl erfolgt
wie folgt: Puffer, Nucleotide und 20 μl verdünnte DNS werden hinzugefügt, auf
72°C erhitzt
und Taq-DNS-Polymerase
wird hinzugefügt.
Inkubiere bei 72°C
für fünf Minuten
und füge
passende Oligos hinzu. Es werden zehn Zyklen mit einer Minute bei
95°C, drei
Minuten bei 70°C
durchgeführt.
Inkubiere zehn Minuten bei 72°C.
Die Amplifikation wird in vier gesonderten Röhrchen wiederholt. Die amplifizierte
DNS wird mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefällt und sämtliche vier Röhrchen werden
in 40 μl
0,2 × TE
vermischt und mit Mung-Bean-Nuclease (Endonuclease aus Mungo-Bohnen)
wie folgt verdaut: zu 20 μl
DNS werden 4 μl
Puffer, 14 μl
H2O und 2 μl Mung-Bean-Nuclease (10 Einheiten/μl) hinzugefügt. Inkubiere
bei 30°C
für fünfunddreißig Minuten
+ erstes differenzielles Produkt (DPI (First Differential Product).
-
Wiederhole die Subtraktionshybridisierung
und PCR-Amplifikation mit dem Treiber:
-
Differenzielles
Verhältnis
von 1:400 (DPII) und 1:40.000 (DPIII) unter Verwendung von geeigneten
Oligonucleotiden. Differenzielle Produkte werden dann in einem Bluescript-Vektor
an der BAM-HI-Stelle für
die Analyse der einzelnen Klone kloniert.
-
DIFFERENZIELLE
EXPRESSION UNTER VERWENDUNG VON GENEXPRESSIONSMIKROARRAY
-
Wie
hierin oben beschriebene isolierte Boten-RNS wird mit fluoreszierenden
dNTPs unter Verwendung einer reversen Transkriptionsreaktion markiert,
um eine markierte cDNS-Sonde zu schaffen. mRNS wird aus C6-Zellen,
die unter normoxischen Bedingungen kultiviert worden sind, extrahiert
und mit Cy3-dCTP (Amersham) markiert und mRNS, die aus C6-Zellen,
die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert worden sind, extrahiert
worden ist, wird mit Cy5-dCTP (Amersham) markiert. Die beiden markierten
cDNS-Sonden werden dann vermischt und auf einem Mikroarray hybridisiert
(Schena et al., 1996), zusammengesetzt aus z. B. 2000 cDNS-Klonen,
die aus einer cDNS-Bibliothek hergeleitet worden sind, die zubereitet
worden ist aus C6-Zellen, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert
worden sind. Nach der Hybridisierung wird der Mikroarray unter Verwendung
eines Laserscangeräts
gescannt und die Fluoreszenzmenge von jedem der Fluoreszenzfarbstoffe
wird für
jeden cDNS-Klon auf dem Mikroarray gemessen, was eine Anzeige für den mRNS-Spiegel
in jeder der untersuchten Ausgangs-mRNS-Populationen gibt. Der Vergleich der
Fluoreszenz jedes cDNS-Klons auf dem Mikroarray zwischen den beiden
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen ist ein Maß für die differenzielle
Expression der angezeigten Gene zwischen den beiden experimentellen
Bedingungen.
-
IN-SITU-ANALYSE
-
In-situ-Analyse
wird für
die Kandidatengene durchgeführt,
die durch die differenzielle Antwort auf das Aussetzen an hypoxischen
Bedingungen, wie oben beschrieben, identifiziert worden sind. Die
Expression wird in zwei experimentellen Systemen untersucht: feste
Tumoren und hypoxische Retina.
-
Feste
Tumoren werden durch Injektionen der Ausgangsgliomzellen, die für die differenzielle
Expression verwendet wurden, in Mäusen gebildet. Die Gliomzellen
bilden Tumoren, die dann ausgeschnitten, auf Objektträger aufgebracht
und verwendet werden, um individuell die Expressionsspiegel des
Kandidatengens zu messen. Das Modell des festen Tumors (Benjamin
et al., 1997) zeigt, dass die Expression des Kandidatengens in Tumoren
um hypoxische Regionen herum, die in dem Zentrum des Tumors gefunden
werden und deshalb in vivo durch Hypoxie reguliert sind, aktiviert
wird. Heraufregulation zeigt weiter an, dass das heraufregulierte Gen
Angiogenese fördern
kann, welche erforderlich ist, um das Tumorwachstum aufrecht zu
erhalten.
-
Das
Modell der hypoxischen Retina misst Expressionsspiegel in einem
Organ, das Hypoxie (Ischämie) ausgesetzt
ist und direkt Retinopathie nachahmt. Hypoxie in der Retina wird
durch Aussetzen neugeborener Ratten an Hyperoxie, was Blutgefäße in den
Retina verkleinert, geschaffen (Alon et al., 1995). Nach dem Überführen auf
normale Sauerstoffspiegel wird relative Hypoxie wegen dem Fehlen
an Blutzufuhr ausgebildet. Hypoxische Retina wird ausgeschnitten,
in Scheiben geschnitten und verwendet, um die Expression des Kandidatengens
zu überwachen.
-
ERGEBNISSE
-
Unter
Nutzung von Genexpressionsmikroarrayanalyse wurden die in SEQ ID
Nrn. 1-6 dargelegten Gene als unter hypoxischen Bedingungen differenziell
exprimiert identifiziert.
-
Wie
in den Figuren gezeigt, wurde differenzielle Expression unter hypoxischen
Bedingungen beobachtet. Nothern-Analyse wurde mit 32P-dCTP markierten
Sonden, abgeleitet aus den Kandidatengenen, durchgeführt. 2 μg mRNS wurden
auf Formaldehyd enthaltenden Agarosegelen fraktioniert, auf eine
Nitrocellulosemembran geblottet und mit den markierten cDNS-Sonden
hybridisiert.
-
Um
die Kinetiken der Expression als ein Ergebnis von Hypoxie zu überwachen,
wurde mRNS von Zellen in Normoxie zubereitet und 4 und 16 Stunden
hypoxischen Bedingungen ausgesetzt. Die Ergebnisse der Analyse zeigten,
dass sämtliche
Gene (SEQ ID Nrn. 1-6) durch hypoxische Bedingungen induziert worden sind,
was die durch die Genexpressionsmikroanalyse gewonnenen Ergebnisse
bestätigt.
-
In
der In-situ-Analyse unter Verwendung des Modells des festen Tumors
wurden die SEQ ID Nrn. 1-6 heraufreguliert, das heißt exprimiert.
In dem Retinamodell wurden die SEQ ID Nrn. 1, 2 und 6 als in diesem Modell
heraufreguliert gefunden.
-
SEQ
ID Nr. 1 (RTP801) ist das Rattenhomolog von SEQ ID Nr. 2 (RTP779).
Die Proteinsequenzen sind die SEQ ID Nr. 9 bzw. SEQ ID Nr. 10. Beide
dieser Gene wurden nicht in Gendatenbanken gemeldet und sie werden
unter hypoxischem Stress exprimiert und in beiden In-situ-Analysen
heraufreguliert. Die Expression dieses Gens wurde beobachtet in
dem Ovar, wo aktive Apoptose geschah. Seine Regulation ist abhängig von HIF-1
(Carmeliet et al., 1998), was weiter anzeigt, dass das Gen verbunden
ist mit durch Hypoxie induzierter Apoptose. Eine gewisse Homologie
wurde zwischen dem 3'UTR
von RTP801 und dem 5'UTR
eines Transkriptionsfaktors (Ratte) pet-1 (Carmeliet et al., 1998;
Spence et al., 1998; Fyodorov et al., 1998) gefunden.
-
SEQ
ID Nr. 3 (RTP241) ist 1902 bp lang, wurde nicht in Gendatenbanken
gemeldet und wird unter hypoxischem Stress exprimiert und in beiden
In-situ-Analysen heraufreguliert. Die Gensequenz hat eine gewisse Homologie
mit einem Hefegen, das stromaufwärts
des cox14-Gens lokalisiert ist. Das Protein (SEQ ID Nr. 7), das
durch die Sequenz kodiert wird, enthält eine Signalpeptidregion
und wird deshalb sezerniert.
-
SEQ
ID Nr. 4 (RTP220) ist 4719 bp lang, sie wurde nicht in Gendatenbanken
gemeldet und wird unter hypoxischem Stress exprimiert und in den
In-situ-Tumoranalysen heraufreguliert. Die Gensequenz hat eine gewisse
Homologie mit Anilin aus Drosophila. Die Proteinsequenz wird in
SEQ ID Nr. 11 dargelegt.
-
SEQ
ID Nr. 5 (RTP953/359) ist eine Genteilsequenz, die nicht in Gendatenbanken
gefunden worden ist und unter hypoxischem Stress exprimiert wird
und in beiden In-situ-Analysen heraufreguliert wird.
-
SEQ
ID Nr. 6 (RTP971) wird unter hypoxischem Stress exprimiert und in
der In-situ-Tumoranalyse heraufreguliert. Die Originalanalyse verwendete
die Rattensequenz. SEQ ID Nr. 6 ist das menschliche Homolog und
hat mehr als 90% Homologie mit der Rattensequenz. Basierend auf
der vorangegangenen Sequenzanalyse scheint es, dass es das Gen Neuroleukin
oder ein Mitglied jener Genfamilie ist. Von dem wurde nicht berichtet,
dass es auf Hypoxiebedingungen ansprechend ist, und es wird berichtet,
dass es ein neuer Motilitätsfaktor
für Astrocyten
ist. Das berichtete Gen kodiert ein Protein (SEQ ID Nr. 8, menschliches
Homolog), das als eine glykolytisches Enzym Phosphohexoseisomerase
und als ein Überlebensfaktor
für Neuronen
identifiziert worden ist (Niinaka et al., 1998; Watanabe et al.,
1996).
-
Die
Astrocytenmotilität
ist ein wichtiger Faktor bei der Bildung von Blutgefäßen (Angiogenese)
im Gehirn und in der Retina. Astrocyten können als Sauerstoffspiegelsensoren
angesehen werden, da sie unter hypoxischen Bedingungen durch die
Sekretion von angiogenetischen Faktoren wie WEGF ansprechen. In
einem Experiment wurden primäre
Astrocytenkulturen etabliert und in vitro ohne Serum wachsen gelassen
und die Astrocyten waren unbeweglich. Wenn jedoch konditioniertes
Medium aus Retinakulturen, die unter hypoxischen Bedingungen kultiviert
worden sind, zu den Astrocytenkulturen hinzugefügt wurde, wurde Motilität beobachtet.
Falls der Neuroleukin-Inhibitor (Obese et al., 1990), D-Erythose-4-Phosphat
(in einer Konzentration von 1,25 mM) hinzugefügt wurde, wurden deutliche
Anzeichen von Inhibition der Motilität in den Astrocytenkulturen
beobachtet, was anzeigt, dass die Astrocytenmotilität (und -stellation)
von der Neuroleukinaktivität
abhängig
war. Andere Ergebnisse zeigen, dass SEQ ID Nr. 6 ebenfalls HIF-1-abhängig ist,
was weiter anzeigt, dass das Gen in Verbindung steht mit durch Hyoxie
induzierte Angiogenese und Apoptose.
-
Durch
diese Anmeldung hindurch wurde auf zahlreiche Publikationen, einschließlich US-Patenten, durch
Bezugnahme auf Autor und Jahr und auf Patente durch die Nummern
Bezug genommen. Vollständige Zitierungen
der Publikationen sind unten aufgelistet.
-
Die
Erfindung wurde in einer erläuternden
Weise beschrieben und es soll verstanden werden, dass von der Terminologie,
welche verwendet worden ist, beabsichtigt ist, dass sie in der Natur
der Worte der Beschreibung eher liegt als in der Beschränkung.
-
Offensichtlich
sind viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung
im Lichte der obigen Lehren möglich.
Es soll deshalb verstanden werden, dass die Erfindung innerhalb
des Schutzumfangs der angehängten
Ansprüche
anderweitig, als spezifisch beschrieben, praktiziert werden kann.
-
LITERATURVERZEICHNIS
-
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