-
Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum simultanen Überwachen
von in einer Mehrzahl von Reaktionsgefäßen stattfindenden Reaktionen,
wobei die Vorrichtung einen metallischen Gefäßhalter mit einer Mehrzahl
von Kammern aufweist, wobei die Seitenwand jeder dieser Kammern
so geformt ist, daß sie
passend ein entfernbares und transparentes Reaktionsgefäß in einer
aufrechten Stellung aufnehmen kann.
-
Die
Erfindung betrifft insbesondere eine Vorrichtung der obengenannten
Art, bei der die Überwachung
auf der Messung von Fluoreszenzlicht beruht. Dieses wird von Proben-Reagenzmischungen
ausgesandt, wenn diese durch Licht, insbesondere Licht kurzer Wellenlänge, angeregt
werden, das von einer geeigneten Lichtquelle zur Verfügung gestellt
wird.
-
Eine
Vorrichtung zur automatischen Durchführung von Temperaturzyklen
ist aus der
EP 0 642 831
A1 bekannt. Diese Vorrichtung umfaßt einen kreisförmigen Halter
für zwölf Reaktionsgefäße, die jeweils
etwa 100 μl
einer Mischung aus Proben- und Reagenzflüssigkeit enthalten. Der Halter
ist aus Metall und ermöglicht
es, die unterschiedlichen Zyklus-Temperaturen von einem gesteuerten
Peltier-Element schnell auf die Mischungen zu übertragen.
-
Ein
System zur Detektion von Produkten einer Nukleinsäurenamplifikation
in Echtzeit ist aus der WO 95/30139 A1 bekannt. Dieses System ermöglicht es,
auf Fluoreszenz basierende Messungen an einer Mehrzahl von Mischungen
aus Proben-Reagenzflüssigkeit
in kleinen Gefäßen bei
verschiedenen, wechselnden Temperaturen durchzuführen. Das Anregungslicht gelangt
durch eine Faseroptik und eine Fokuslinse zu der Oberseite der Gefäße. Das
Fluoreszenzlicht wird gesammelt und auf demselben Weg in umgekehrter
Richtung zu einer zentralen optischen Trennungs- und Analysekomponente
geleitet.
-
Die
beschriebenen Vorrichtungen haben bedeutende Nachteile. In der kreisförmigen Anordnung der
Gefäße, die
in der
EP 0 642 831
A1 offenbart ist, kann nur eine relativ kleine Anzahl an
Gefäßen auf
einem einzelnen Peltier-Element angeordnet werden. Folglich wird
nur ein kleiner Teil der auf dem Peltier-Element zur Verfügung stehenden
Fläche
zum Thermo-Zyklieren der Gefäße genutzt.
-
Um
Temperaturzyklen an einer großen
Zahl von in einem Kreis angeordneten Reaktionsgefäßen durchführen zu
können,
wäre es
nötig,
mehr als ein Peltier-Element zum Kühlen und Heizen zu verwenden.
Das ist nicht wünschenswert,
da Peltier-Elemente recht teuer sind. Bei der Vorrichtung, die aus der
WO 95/30139 bekannt ist, liegen der Pfad des Anregungslichts und
der Pfad des Fluoreszenzlichts dicht beieinander, was die Möglichkeit
unerwünschter
Interferenzen erhöht.
-
Deshalb
ist es mit dem Aufbau der erwähnten,
bekannten Vorrichtungen nicht möglich,
eine sehr kompakte Anordnung von Reaktionsgefäßen zu verwirklichen, die zum
Thermo-Zyklieren
einer Mehrzahl von Proben-Reagenzmischungen geeignet ist, welche
sich in auf einem Thermalblock angeordneten Reaktionsgefäßen befinden.
-
Das
Dokument EP-A-0580362 offenbart eine Vorrichtung zum Überwachen
von Reaktionen, die nicht-parallele Lichtleiter umfaßt.
-
Aufgabe
der Erfindung ist es deshalb, eine Vorrichtung der eingangs genannten
Art zur Verfügung
zu stellen, die eine sehr kompakte Anordnung von Reaktionsgefäßen ermöglicht,
die für
ein effizientes Thermo-Zyklieren von Proben-Reagenzmischungen, die
sich in mehreren Reaktionsgefäßen befinden,
geeignet ist und die optische Echtzeitmessungen ermöglicht.
Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur
Verfügung
zu stellen, mit der ein Thermo-Zyklieren einer großen Zahl
von Reaktionsgefäßen mit
einem einzigen Peltier-Element möglich
ist.
-
Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch eine Vorrichtung gelöst, die
- – mehrere
erste optische Faserlichtleiter, wobei jeder dieser Faserlichtleiter
die Innenseite der Seitenwand einer der Kammern mit einer Lichtquelle
verbindet, und
- – mehrere
zweite optische Faserlichtleiter, wobei jeder dieser Faserlichtleiter
die Innenseite der Seitenwand einer der Kammern mit einem Lichtempfänger verbindet,
aufweist,
- – wobei
in jeder der Kammern die Wege des durch die ersten und zweiten optischen
Faserlichtleiter übertragenen
Lichts, die mit der Kammer verbunden sind, denselben Punkt der Längsachse
der Kammer treffen, falls eine Reaktionsflüssigkeit in dem Gefäß ist, und
zwar derart, daß aus
einem der Lichtleiter austretendes Licht nicht in der Lage ist,
den anderen mit der Kammer verbundenen Lichtleiter zu erreichen.
-
Ein
wesentlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin,
daß eine
sehr kompakte Anordnung der Reaktionsgefäße erreicht wird und sie deshalb
geeignet ist, eine Thermo-Zyklierung der Proben-Reagenzmischungen,
die sich in den Reaktionsgefäßen befinden,
effizient durchzuführen. Ein
weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin,
daß trotz
des kurzen Abstands zwischen benachbarten Reaktionsgefäßen und
des kurzen Abstands zwischen Anregungs- und Fluoreszenzlichtleitern,
die jeweils optisch an die Reaktionsgefäße angeschlossen sind, Streulicht,
das von einem Anregungslichtstrahl stammt, der auf eine Proben-Reagenzmischung
in einem Reaktionsgefäß gerichtet
ist, eine Messung von Fluoreszenzlicht, das von der Proben-Reagenzmischung
emittiert wurde, nicht beeinträchtigen
kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung
ist deshalb insbesondere zum Überwachen
von in einer Mehrzahl von Reaktionsgefäßen stattfindenden Reaktionen
mittels Fluoreszenzmessungen geeignet. Die Fluoreszenzmessungen
können
zu jeder beliebigen Zeit durchgeführt werden, insbesondere während die
in den Reaktionsgefäßen enthaltenen
Proben-Reagenzmischungen thermozykliert werden.
-
Bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung werden durch die Merkmale charakterisiert, die in
den Ansprüchen
2 bis 11 definiert sind.
-
Zum
besseren Verständnis
der Erfindung werden bevorzugte Ausführungsbeispiele im folgenden
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Zeichnungen näher
beschrieben.
-
1 zeigt
eine Draufsicht eines Gefäßhalters;
-
2 zeigt
einen senkrechten Schnitt durch den in 1 gezeigten
Gefäßhalter;
-
3 zeigt
eine vergrößerte Darstellung
eines senkrechten Schnitts durch eine der Kammern des Gefäßhalters
und durch zwei Ebenen, die einen Winkel von 90° einschließen und durch die Zentren von
Verbindern wie 21 und 22 in 1 verlaufen;
-
4 zeigt
eine zweite Draufsicht des Gefäßhalters.
-
1 zeigt
eine Draufsicht eines Gefäßhalters 11, 2 einen
senkrechten Querschnitt durch den Gefäßhalter. Beide Figuren sind
hinsichtlich der tatsächlichen
Größe der gezeigten
Objekte um einen Faktor von ungefähr 2 vergrößert. Der
Halter 11 umfaßt
eine quadratische Grundplatte 12, deren Unterseite eben
ist. Der obere Teil der Platte 12 umfaßt eine matrixartige Anordnung
von vierundzwanzig Kammern 13. Jede dieser Kammern hat
aufrecht stehende Seitenwände 14 und
einen kreisförmigen Querschnitt
in einer senkrecht zu ihrer Längsachse verlaufenden
Ebene. Die Außenseite
der Seitenwände 14 hat
eine zylindrische Form. Die Innenseite der Seitenwände 14 definiert
eine Kammer, deren Querschnitt zum Boden der Kammer hin abnimmt.
Jede der Kammern 13 ist passend geformt, um den unteren
Teil eines handelsüblichen,
abnehmbaren Reaktionsgefäßes 18 aufzunehmen,
das etwa 100 μl
Flüssigkeit
aufnehmen kann. Der untere Teil eines solchen Reaktionsgefäßes hat
eine Form, die genau in den Innenraum einer Kammer 13 hineinpaßt, wenn das
Gefäß in der
Kammer positioniert wird.
-
Die
glatte Unterseite der Grundplatte 12 ist auf einem einzigen
Peltier-Element 19 angeordnet, das zum Heizen und Kühlen des
Gefäßhalters 11 und der
Reaktionsgefäße 18 dient,
die in die Kammern 13 der Grundplatte 12 eingebracht
wurden. Um eine gute Wärmeleitfähigkeit
zu gewährleisten,
ist der Gefäßhalter 11 aus
Metall, vorzugsweise aus Aluminium. In der folgenden Beschreibung
wird der Ausdruck "optische
Faser" verwendet,
um einen optischen Faserlichtleiter zu bezeichnen, bei dem es sich nicht
unbedingt um eine einzelne Faser handelt, sondern der vorzugsweise
ein Bündel
dünner
optischer Fasern umfaßt,
beispielsweise ein Bündel
mit etwa 50 bis 100 optischen Fasern, wobei ein solches Bündel einen
Durchmesser von etwa 0,5 mm hat.
-
An
jeder Kammerwand 14 sind zwei Verbinder 21, 22 angeordnet.
Diese Verbinder dienen dazu, optische Fasern 31, 32 zu
befestigen und sind zueinander, in Draufsicht gesehen, unter einem
Winkel von etwa 90° angeordnet.
-
3 zeigt
eine um einen Faktor von etwa 5:1 vergrößerte Darstellung eines senkrechten
Querschnitts der Kammer 13 und daran angeschlossene optische
Faserlichtleiter. Es handelt sich dabei um einen Querschnitt entlang
zweier verschiedener Ebenen, die sich in der Längsachse 16 der Kammer 13 schneiden.
In einer dieser Ebenen ist die Achse eines in 1 gezeigten
Verbinders 21 enthalten. In der anderen Ebene ist die Achse
eines in 1 gezeigten Verbinders 22 enthalten.
-
Wie
in 3 gezeigt, hat die Grundplatte 12 Bohrungen 12.1,
in welche die kreisförmige
Kammer 13 eingesetzt und in denen sie fixiert ist, beispielsweise
durch Einpressen oder Löten.
Die Unterseite wurde anschließend
poliert. Wenn ein Reaktionsgefäß 18 in
eine Kammer 13 eingebracht wird, paßt der untere Teil des Gefäßes 18 genau
in den von den Innenseiten der Seitenwände 14 begrenzten
Innenraum der Kammer 13. Wie die Ausschnittsvergrößerung in einem
Kreis auf der linken Seite der 3 zeigt,
hat die Seitenwand 14 einen ersten Verbinder 21,
der eine horizontale Bohrung 21a aufweist.
-
Ein
Endabschnitt einer optischen Faser 31 ist in der Bohrung 21a des
Verbinders 21 angeordnet. Bei der optischen Faser 31 handelt
es sich um ein Bündel
von optischen Fasern mit einem Bündeldurchmesser
von etwa 0,5 mm, das von einer flexiblen Hülle 31b mit einem äußeren Durchmesser
von etwa 1,5 mm umgeben ist. Der Endabschnitt der optischen Faser 31,
der sich in der Bohrung 21a befindet, ist von einer starren
Führungshülse 31a umgeben.
Ein Ende dieser Hülse
ist unter die flexible Hülle 31b geschoben.
Ihr anderes Ende ist durch eine Schraube 33 so fixiert,
daß das
offene Ende der Faser 31 nahe an der Wand des Reaktionsgefäßes 18, aber
davon beabstandet angeordnet ist. Das Vorderende 31c der
Faser 31 hat eine polierte Oberfläche, die in einer zu der Längsachse 16 der
Kammer 13 parallelen Ebene liegt. Die axiale Verlängerung 41 der Faser 31 trifft
die Längsachse 16 der
Kammer 13 bzw. des Gefäßes 18.
Der Abstand zwischen dem Vorderende 31c und der Wand des
Gefäßes 18 wird mit
Hilfe eines kugelförmigen
Eichmaßes
eingestellt.
-
Wie
in 3 gezeigt, ist der Verbinder 22 an der
Seitenwand 14 etwas unterhalb des Verbinders 21 angeordnet.
Die Anschlußbohrung 22a des
Verbinders 22 ist hinsichtlich der Längsachse 16 der Kammer
geneigt. Die axiale Erstreckung 42 der Bohrung 22a schneidet
die Längsachse 16 der
Kammer 13 nahezu in demselben Punkt wie die Erstreckung 41 der
Bohrung 21a.
-
Ein
Endabschnitt einer optischen Faser 32 ist in der Bohrung 22a des
Verbinders 22 angeordnet. Bei der optischen Faser 32 handelt
es sich um ein Bündel
von optischen Fasern mit einem Bündeldurchmesser
von etwa 0,5 mm, das von einer flexiblen Hülle 32b mit einem äußeren Durchmesser
von etwa 1,5 mm umgeben ist. Der Endabschnitt der optischen Faser 32,
der sich in der Bohrung 22a befindet, ist von einer starren
Führungshülse 32a umgeben.
Ein Ende dieser Hülse
ist unter die flexible Hülle 32b geschoben.
Ihr anderes Ende ist durch eine Schraube 33 so fixiert,
daß das
offene Ende der Faser 32 nahe an der Wand des Reaktionsgefäßes 18, aber
davon beabstandet angeordnet ist. Das Vorderende 32c der
Faser 32 hat eine polierte Oberfläche, die in einer hinsichtlich
der Längsachse 16 der
Kammer 13 geneigten Ebene liegt. Die axiale Erstreckung 42 der
Faser 32 trifft die Längsachse 16 der
Kammer 13 bzw. des Gefäßes 18.
Der Abstand zwischen dem Vorderende 32c und der Wand des
Gefäßes 18 wird mit
Hilfe eines kugelförmigen
Eichmaßes
eingestellt.
-
Wie
in 3 gezeigt, schneiden die axialen Erstreckungen 41, 42 die
Achse 16 nicht exakt in demselben Punkt. Wenn sich aber
Reaktionsflüssigkeit
in dem Gefäß 18 befindet,
bewirkt Lichtbrechung der von den optischen Fasern 31 und 32 eingeleiteten
Lichtstrahlen, daß sich
diese Strahlen in einem Punkt treffen.
-
Zudem
ist der Aufbau so, daß der
Winkel zwischen der axialen Erstreckung 41 und dem Abschnitt
der Seitenwand des Gefäßes 18,
der an den Verbinder 21 angrenzt, mit dem Winkel zwischen
der Erstreckung 42 und dem Abschnitt der Seitenwand des
Gefäßes 18,
der an den Verbinder 22 angrenzt, übereinstimmt. Folglich treffen
die von den optischen Fasern 31 und 32 eingeleiteten
Lichtstrahlen dieselben geometrischen Verhältnisse an.
-
Um
unerwünschte
Lichtreflektionen zu verhindern, ist der gesamte Halter 11 einschließlich der Kammern 13 schwarz
gefärbt,
beispielsweise durch einen anodischen Überzug.
-
Wie 4 zeigt,
werden alle optischen Fasern 31, beispielsweise durch ein
wendelförmiges Band,
gebündelt
und zusammengehalten, um ein Bündel 51 zu
bilden. Alle optischen Fasern 32 werden ebenfalls, beispielsweise
durch ein wendelförmiges
Band, gebündelt
und zusammengehalten, um ein Bündel 52 zu
bilden. Die Bündel 51 und 52 erstrecken
sich in dieselbe Richtung. Wichtig ist, daß alle Fasern 31 und
alle Fasern 32 etwa dieselbe Länge haben und daß keine
der Fasern 31, 32 stark gebogen wird. Der Mindestradius
einer Biegung von Fasern wie 31 und 32, bei denen
es sich jeweils um ein Bündel
dünner
optischer Fasern handelt, ist wesentlich kleiner als der zulässige Biegeradius
einer einzelnen optischen Faser, die denselben Gesamtquerschnitt
hat. Der Einsatz optischer Faserbündel 31, 32 macht
deshalb Biegungen mit einem kleinen Krümmungsradius möglich, so
daß viele
Fasern auf relativ engem Raum untergebracht werden können.
-
Wie
die 1 und 4 zeigen, führt jede Faser 31,32 auf
dem Weg von ihrem Verbinder 21 bzw. 22 in den
Raum außerhalb
des Bereichs, in dem sich der Gefäßhalter 11 befindet
(1), höchstens an
zwei Kammern 13 vorbei. Dies wird einerseits durch die
Anordnung der Kammern 13 und ihrer Verbinder 21, 22,
die gemäß 1 nach
außen
zeigen, und andererseits durch den im vorhergehenden beschriebenen
Aufbau der Verbinder 21, 22 und der zugehörigen Bohrungen 21a, 22a,
welche die Fasern 31, 32 in zwei verschiedenen
Ebenen zwischen den Kammern 13 führen, erreicht. Diese Anordnung
ermöglicht
es, daß die
Fasern 31 und Fasern 32 quer zueinander verlaufen.
-
Insgesamt
ist der Aufbau, der einen Gefäßhalter 11 mit
einer Seitenlänge
von etwa 4 cm und einem Abstand von 9 mm zwischen den Längsachsen 16 aneinander
angrenzenden Kammern 13 umfaßt, sehr kompakt. Ein Maß für die Kompakt heit
des Aufbaus ist das Verhältnis
der Querschnittsfläche
aller Reaktionsgefäße 18,
wie sie in der Draufsicht gemäß 1 zu
sehen ist, zu der Fläche,
die auf dem Gefäßhalter 11 zum
Positionieren der Gefäße 18 zur Verfügung steht.
Dieses Verhältnis
ist größer als
0,6. Der beschriebene Aufbau ermöglicht
es, über
den gesamten Halter 11 hinweg, eine gleichmäßige, räumlich konstante
Temperatur zu gewährleisten. Zum
thermischen Zyklieren wird diese Temperatur durch elektrische Steuerung
des Peltier-Elements 19 geändert.
-
Der
Gefäßhalter 11 wird
in einer Vorrichtung zum Überwachen
von Reaktionen, beispielsweise von flüssigen biologischen Proben,
verwendet. Solche flüssigen
Proben haben ein Volumen von beispielsweise 100 μl und werden in die Reaktionsgefäße 18 gefüllt, die
in den Kammern 13 fixiert sind. Dies geschieht automatisch,
beispielsweise mit Hilfe von Pipettiermitteln. Die Reaktionen finden
in den Reaktionsgefäßen 18 statt
und erfordern zyklische Temperaturänderungen. Durch die optischen
Fasern 32 kann zu jeder beliebigen Zeit Anregungslicht
einer üblichen
Lichtquelle, beispielsweise einer Halogenlampe mit einem Interferenzfilter
zum Erzeugen von monochromatischem Licht, in jede der Kammern 13 eingestrahlt
werden. Dieses Licht tritt aus den Vorderenden 32c der
Fasern 32 aus, verläuft
durch die transparenten Wände
der Gefäße 18 hindurch
und erreicht die flüssige
Proben-Reagenzmischung, in der der Lichtstrahl gebrochen wird. Die
Proben-Reagenzmischung enthält
Fluorophore, die bei Anregung in Abhängigkeit von dem Ergebnis der
Reaktion mehr oder weniger Fluoreszenzlicht aussenden. Das Fluoreszenzlicht
wird von den optischen Fasern 31 aufgenommen und zu vierundzwanzig
individuellen Lichtempfängern,
z.B. Photodioden, geleitet, die nicht gezeigt sind. Die von den
Lichtempfängern
empfangenen Signale werden anschließend hinsicht lich der einzelnen
zu überwachenden
Reaktionen untersucht.
-
Es
ist wichtig, daß die
Enden der beiden Fasern 31 und 32 nicht optisch
aneinander angeschlossen sind. Bei dem im vorhergehenden beschriebenen
Aufbau nehmen die Fasern 31 nur Fluoreszenzlicht auf, das überwacht
werden soll. Streulicht, das von den Wänden der Reaktionsgefäße 18,
der oberen Meniskusoberfläche
der flüssigen
Probe und/oder Partikeln innerhalb der Probe reflektiert wird, erreicht
den Lichtempfänger
nicht und hat deshalb auch keinen Einfluß auf von ihm ausgegebene Signale.
Die Geometrie der aufrecht stehenden Gefäße 18, die konische
Wand der Gefäße 18 und
die horizontale bzw. nicht horizontale Richtung der axialen Erstreckungen 41 ,42 führen zu
einem Minimum an Streulicht. Schaum an der Oberfläche der
flüssigen
Proben oder Niederschläge
in dem Gefäß 18 haben
keinen Einfluß.
Tageslicht kann durch Tageslichtfilter minimiert werden oder noch
besser dadurch, daß der
Gefäßhalter 11 mit
einer lichtdichten Schachtel abgeschirmt wird.
-
Es
gibt viele Varianten der allgemeinen Idee der Erfindung. Die wichtigsten
Varianten werden im folgenden angesprochen:
- – Der Gefäßhalter 11 kann
eine Mehrzahl von mehr oder weniger als 24 Kammern 13 haben.
- – Der
Gefäßhalter 11 kann
als Quadrat, Rechteck, Kreis oder sonstwie geformt werden. Die Kammern 13 können matrixartig
mit rechteckig oder versetzt verlaufenden Linien und Spalten angeordnet
werden.
- – Der
Winkel zwischen den beiden Faserverbindern 21, 22 kann,
wie gezeigt, 90° betragen,
aber der Winkel kann auch größer oder
kleiner sein. Im allgemeinen muß der Winkel
so klein sein, daß kein
Licht, das aus der optischen Faser 32 austritt, direkt
die andere Faser 31 erreichen kann, die Licht von der flüssigen Probe
empfängt.
- – Die
Bohrungen 21a, 22a der Verbinder 21, 22 können beide
von der Horizontalen abweichend orientiert sein, beispielsweise
die erste aufwärts gerichtet,
die zweite abwärts
gerichtet sein, wobei die axialen Erstreckungen 41, 42 die
Längsachse 16 der
Kammer 13 in demselben Punkt oder nahe beieinander liegenden
Punkten schneiden.
- – Die
optischen Fasern 31, 32 können in den Bohrungen 21a, 22a auch
auf andere Weise als mit Schrauben 33 befestigt werden,
die in 3 gezeigt sind, beispielsweise durch Kleben. Die Schrauben 33 haben
aber den Vorteil, daß die
Fasern leicht ausgetauscht werden können.
- – Die
Abmessungen der Kammern 13 und der Reaktionsgefäße 18 sind
variabel. Zudem können mit
demselben Gefäßhalter 11 zwei
oder mehr verschiedene Größen verwendet
werden.
-
Insgesamt
wurde eine Vorrichtung beschrieben, mit der sich Reaktionen mittels
Licht simultan zu jeder beliebigen Zeit überwachen lassen, wobei die Vorrichtung
einen metallischen Gefäßhalter 11 mit
einer Mehrzahl von Kammern 13 aufweist, wobei die Seitenwände 14 dieser
Kammern 13 geformt sind, um passend in einer aufrechten
Stellung unabhängig voneinander
austauschbare, transparente und konische Reaktionsgefäße 18 aufzunehmen,
in denen die Reaktionen stattfinden. Die Vorrichtung umfaßt erste
optische Fasern 32, welche die Innenseiten der Seitenwände 14 von
allen Kammern 13 mit einer Lichtquelle verbinden, und zweite
optische Fasern 31, welche die Innenseiten der Seitenwände 14 von allen
Kammern 13 mit mindestens einem Lichtempfänger verbinden,
so daß die
Wege des durch die ersten und zweiten Fasern 32, 31 übertragenen
Lichts die Längsachse 16 der
jeweiligen Kammer 13 in demselben Punkt schneiden, wenn
sich in dem Gefäß 18 eine
Reaktionsflüssigkeit
befindet, und zwar derart, daß aus
den ersten Fasern 32 austretendes Licht nicht in der Lage
ist, direkt die zweiten Fasern 31 zu erreichen.