DE69806747T2 - Verfahren zur veresterung von aminosäuren und proteinen - Google Patents
Verfahren zur veresterung von aminosäuren und proteinenInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Veresterung einer Aminosäure oder eines Peptids, worin die Aminosäure oder das Peptid in Gegenwart eines Monoalkylhydrosulfats der allgemeinen Formel ROSO&sub3;H in einen entsprechenden Ester umgewandelt wird, wobei R eine Alkylgruppe darstellt.
- Eine ähnliches Verfahren ist aus Khim. Ind(Sofiya), 58(10), 445-7, 1986 bekannt, welches die Veresterung einer aliphatischen Aminosäure mit Hilfe von Methylhydrosulfat beschreibt.
- Ein Nachteil des bekannten Verfahrens besteht darin, daß in der Theorie mindestens zwei Äquivalente Methylhydrosulfat und in Experimenten sogar 3,75 Äquivalente zur Veresterung erforderlich sind, um eine Ausbeute von 93 bis 94% zu erreichen, während die dafür erforderliche Reaktionszeit relativ lang ist. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Veresterung von Aminosäuren und Peptiden bereit, welches die vorstehend beschriebenen Nachteile nicht aufweist.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dies dadurch erreicht, daß das Hydrosulfat in Gegenwart einer Aminosäure oder eines Peptids aus Chlorsulfonsäure und einem Alkohol mit der allgemeinen Formel ROH hergestellt wird, wobei R die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben aufweist.
- Überraschenderweise wurde festgestellt, daß eine Umwandlung von mehr als 99% in einer Reaktionszeit von weniger als einer Stunde bei Verwendung einer im wesentlichen äquimolaren Menge an Chlorsulfonsäure, die hinsichtlich der Menge der Aminosäure oder des Peptids berechnet wurde, erreicht werden kann. Im Gegensatz zu den Erwartungen fand keine Reaktion zwischen der Aminofunktionalität der Aminosäure oder des Peptids und Chlorsulfonsäure unter Bildung einer entsprechenden N-substituierten Aminosulfonsäure statt.
- Ein weiterer wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß die Reaktion bei hohen Konzentrationen an Aminosäure oder Peptid in einem Alkohol durchgeführt werden kann und daß hohe Esterkonzentrationen möglich werden.
- Obwohl PL-B-159729 eine Veresterung in Methanollösung beschreibt, welche Methylhydrosulfat (CH&sub3;OSO&sub3;H) enthält, wobei das Methylhydrosulfat in situ aus Methanol und Chlorsulfonsäure gebildet wird, beschreibt diese Patentveröffentlichung die Veresterung von 3-Amino-pyrazin-2-carbonsäure. Abgesehen von der Tatsache, daß diese Patentveröffentlichung grundsätzlich verschiedene Verbindungen betrifft, beansprucht sie, daß die Veresterung in der Theorie mindestens 2 Äquivalente Chlorsulfonsäure (CISO&sub3;H) erfordert, wobei in den Experimenten 4 Äquivalente Chlorsulfonsäure benötigt werden und die Reaktionszeit viele Stunden beträgt.
- Prinzipiell können alle Aminosäuren und Peptide, welche optisch aktiv sein können, beispielsweise Dipeptide, durch das erfindungsgemäße Verfahren verestert werden, beispielsweise α-Aminosäuren, sowohl aromatisch als auch aliphatisch, insbesondere Phenylglycin, welche substituiert oder unsubstituiert sein können, beispielsweise p-Hydroxyphenylglycin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin und Valin. Es zeigte sich auch, daß die Hydroxyfunktionalität von beispielsweise Hyroxyphenylglycin nicht mit Chlorsulfonsäure reagiert. Bekannte Dipeptide sind beispielsweise L-Alanyl-L-Prolin (AlaPro) oder L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester (APM). Es wurde festgestellt, daß im wesentlichen keine Racemisierung bei der Veresterung optisch aktiver Verbindungen stattfand.
- Als Alkohol kann prinzipiell jeder Alkohol verwendet werden, der normalerweise für säurekatalysierte Veresterungen verwendet wird, beispielsweise Alkohole mit der Formel ROH, wobei R eine Alkylgruppe darstellt, insbesondere eine Alkylgruppe mit 1 bis 20 C-Atomen.
- Vorzugsweise werden Alkohole der Formel ROH verwendet, wobei R eine Alkyl gruppe darstellt, insbesondere eine niedere Alkylgruppe mit r bis 5 C-Atomen, beispielsweise Methanol, Ethanol, (i- oder n-)Propanol oder (1- oder n-)Butanol. Gute Ergebnisse werden insbesondere mit primären Alkoholen erzielt.
- Die Temperatur, bei der die Veresterung stattfindet, ist nicht besonders kritisch und liegt in der Praxis zwischen 30ºC und Rückflußtemperatur, vorzugsweise zwischen 50ºC und 120ºC. Die optimale Temperatur kann abhängig von dem gewünschten Ester, d. h. dem verwendeten Alkohol und der Aminosäure oder dem Peptid, variieren. Es wurde festgestellt, daß die Bildung eines Methylesters im allgemeinen bei Rückflußtemperatur optimal fortschreitet, wohingegen eine etwas niedrigere Temperatur als Rückflußtemperatur häufig bessere Ergebnisse hinsichtlich eines höheren Alkylesters ergibt. Die optimale Temperatur kann durch einen Fachmann ohne weiteres bestimmt werden.
- Jedes inerte organische Lösungsmittel kann als Lösungsmittel (oder Suspensionsmittel) in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Es ist bevorzugt, den in der Veresterung verwendeten Alkohol als Lösungsmittel einzusetzen.
- Das Molverhältnis von Chlorsulfonsäure zu der Aminosäure oder dem Peptid beträgt vorzugsweise zwischen 0,8 und 2,0, insbesondere wird (etwas) mehr als ein äquimolares Verhältnis von Chlorsulfonsäure zu der Aminosäure oder zu dem Peptid ausgewählt, beispielsweise zwischen 1,0 und 1,3.
- In einer geeigneten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu veresternde Aminosäure oder das zu veresternde Peptid in einem Alkohol suspendiert oder gelöst. Anschließend wird Chlorsulfonsäure, vorzugsweise über einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 20 Minuten, vorzugsweise 4 bis 10 Minuten, gegebenenfalls unter Kühlung, wenn die Temperatur nicht direkt die Rückflußtemperatur oder die anvisierte Veresterungstemperatur erreichen soll, zu der Lösung tropfenweise zudosiert. Danach wird die Temperatur auf ein gewünschtes Niveau, beispielsweise zwischen 50 und 120ºC, angehoben und das Reaktionsgemisch wird bei dieser Temperatur für einen Zeitraum von beispielsweise zwischen 10 Minuten und 10 Stunden, abhängig von der Temperatur und dem gewünschten Ester, gehalten. Wenn die Umwandlung (praktisch) beendet ist, wird der Ester beispielsweise durch Verdampfen des Alkohols und Extraktion bei erhöhtem pH-Wert unter Verwendung eines (an sich bekannten) organischen Lösungsmittels gewonnen, das mit Wasser nicht oder schlecht mischbar ist, beispielsweise Toluol, Dichlormethan oder Methylisobutylketon (MIBK). In einigen Fällen, beispielsweise in dem Fall von Estern des p-Hydroxyphenylglycins, ist es auch möglich, den Ester direkt durch Kristallisation aus Wasser bei einem erhöhten pH-Wert (pH-Wert 8 bis 10) nach einer vollständigen oder teilweisen Verdampfung oder auch ohne Verdampfung des Alkohols zu gewinnen.
- Die Erfindung wird nun durch die nachfolgenden Beispiele beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein.
- Eine Suspension oder eine Lösung von 30 Gew.-% Aminosäure oder Dipeptid in einem Alkohol wurde auf einem Eisbad bei 0 bis 5ºC unter einem kontinuierlichen Stickstoffstrom gekühlt. Danach wurden 1,1 Äquivalente CISO&sub3;H tropfenweise zugegeben, das Eisbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch wurde auf die gewünschte Temperatur gebracht.
- Von Zeit zu Zeit wurde eine Probe aus dem Reaktionsgefäß entnommen, sorgfältig gewogen und um einen Faktor von 3 (bezogen auf das Gewicht) mit dem verwendeten Alkohol verdünnt. Für jede untersuchte Umsetzung wurden Eich- bzw. Standardlösungen der Aminosäure sorgfältig hergestellt, die 90, 95, 98 und 99% Umwandlung entsprachen. Auf diese Art und Weise wurden 2ul-Mengen von (sorgfältig verdünnten) Proben des Reaktionsgemischs mit Hilfe eines Dünnschichtchromatogramms (TLC) gleichzeitig mit 2ul-Mengen der vorstehend beschriebenen Eichlösungen getrennt. Nach dem Besprühen mit Ninhydrin wurden die gemessenen Intensitäten der Aminosäurepunkte verglichen und die Umwandlung (in %) konnte verhältnismäßig gut abgeschätzt werden. Die Maximalwerte sind in den Beispielen als Umwandlung angegeben; die benötigte Zeit (t), um die maximale Umwandlung zu erreichen, ist in der nächsten Spalte angegeben.
- In einer Vielzahl von Beispielen wurden die erhaltenen Gemische aufgearbeitet. In solchen Fällen wurde ein Wert für die Ausbeute bestimmt, der sich auf die Ausbeute nach Aufarbeitung bezieht. Die folgenden Aufarbeitungstechniken wurden angewendet.
- Das nach der Veresterungsreaktion erhaltene Gemisch wurde durch Verdampfen aufkonzentriert, wonach der verbleibende Rest zwischen Dichlormethan und Wasser aufgetrennt bzw. extrahiert wurde und das Wasser und das resultierende Gemisch wurden langsam mit Hilfe von 5N wässriger NaOH unter heftigem Rühren langsam auf pH = 9 angehoben. Die Schichten wurden getrennt und die wässrige Schicht wurde einmal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinten organischen Phasen wurden getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;) und durch Verdampfen aufkonzentriert, wobei in diesem Verfahren der freie Ester erhalten wurde.
- Die erhaltenen Ester von L-Tyrosin und D/L-p-Hydroxyphenylglycin wurden durch Kristallisation aufgearbeitet, wobei das erhaltene Reaktionsgemisch nach der Veresterung aufkonzentriert wurde. Der Rest wurde in Wasser aufgenommen bzw. absorbiert, auf etwa 5ºC gekühlt und mit 5N wässriger NaOH auf pH = 10-11 neutralisiert bzw. gebracht, was eine Kristallisation des freien Esters ergab. Nach zusätzlichem Rühren bei 5ºC für etwa 15 Minuten wurde das Präzipitat filtriert und zweimal mit Wasser gewaschen. Der resultierende Feststoff wurde im Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet (40ºC).
- In allen Fällen wurde nach Aufarbeitung ein > 99% reiner Ester gewonnen (¹H NMR, HPLC).
- L-Phenylalanin (L-Phe), L-Tyrosin (L-Tyr), L-Prolin (L-Pro) und D/L-p- Hydroxyphenylglycin (D/L-HPG) wurden mit Methanol (MeOH) unter Anwendung des allgemeinen Verfahrens verestert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
- Die gleichen Aminosäuren wie in den Beispielen I bis IV wurden auf die gleiche Art und Weise mit anderen Alkoholen verestert: Ethanol (EtOH), n-Propanol (n- PrOH), i-Propanol (i-PrOH), n-Butanol (n-BuOH), i-Butanol (i-BuOH). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2
- L-Alanyl-L-Prolin (Ala-Pro) und L-Aspartyl-L-Phenylalaninmethylester (APM) wurden durch das vorstehend beschriebene allgemeine Verfahren verestert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3
Claims (9)
1. Verfahren zur Veresterung einer Aminosäure oder eines Peptids, worin die
Aminosäure oder das Peptid in Gegenwart eines Hydrosulfats der
allgemeinen Formel ROSO&sub3;H in einen entsprechenden Ester umgewandelt wird,
wobei R eine Alkylgruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß das
Hydrosulfat in Gegenwart der Aminosäure oder des Peptids aus
Chlorsulfonsäure und einem Alkohol der allgemeinen Formel ROH hergestellt wird,
wobei R die gleiche Bedeutung wie vorstehend beschrieben aufweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Molverhältnis von Chlorsulfonsäure zu der Aminosäure oder zu dem Peptid zwischen
0,8 und 2,0 beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das
Molverhältnis von Chlorsulfonsäure zu der Aminosäure oder zu dem Peptid zwischen
1,0 und 1,3 beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin ein primärer Alkohol als
Alkohol verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin Methanol als Alkohol verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Chlorsulfonsäure zu
einer Suspension oder einer Lösung der Aminosäure oder des Peptids in
dem Alkohol gegeben wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, worin die Chlorsulfonsäure über einen
bestimmten Zeitraum zudosiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die verwendete
Aminosäure eine α-Aminosäure ist, die aus der Gruppe, umfassend p-
Hydroxyphenylglycin, Phenylglycin, Phenylalanin, Tyrosin, Prolin und Valin,
ausgewählt ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin L-Alanyl-L-Prolin oder
ein Ester von L-Aspartyl-L-Phenylalanin als Peptid verwendet wird.
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