DE69737196T2

DE69737196T2 - Schädlingsbekämpfungsmittel

Info

Publication number: DE69737196T2
Application number: DE69737196T
Authority: DE
Inventors: Paul Wellesbourne JARRETT; Deborah June Warwick ELLIS; James Alun Wynne Ystradgynlais MORGAN
Original assignee: University of Warwick
Current assignee: University of Warwick
Priority date: 1996-08-29
Filing date: 1997-08-27
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2017-08-28
Also published as: BR9711285A; IL128694A0; US7214525B1; DE69737196D1; JP4338057B2; CN1233938A; ES2281107T3; CA2263897A1; ZA977373B; EP0923295A1; MY136245A; JP2001508032A; GB9618083D0; NZ334847A; EP0923295B1; WO1998008388A1; WO1998008388A8; CN1146322C; RU2225114C2; ATE349892T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien, Wirkstoffe und Zusammensetzungen, die eine Pestizidaktivität aufweisen und von Bakterien, genauer gesagt von Xenorhabdus-Spezies, abstammen. Die Erfindung betrifft weiters Organismen und Verfahren, die solche Verbindungen und Zusammensetzungen einsetzen.
Es besteht ein kontinuierlicher Bedarf an Materialien, Wirkstoffen, Zusammensetzungen und Organismen, die eine Pestizidaktivität aufweisen, beispielsweise für den Einsatz im Pflanzenschutz oder für die Bekämpfung von durch Insekten hervorgerufenen Krankheiten. Neue Materialien sind erforderlich, um das Problem der Resistenz gegen vorhandene Pestizide zu überwinden. Idealerweise sind solche Materialien billig in der Herstellung, stabil, weisen eine hohe Toxizität auf (wenn einzeln oder in Kombination eingesetzt) und sind wirksam, wenn sie durch den Zielschädling oral aufgenommen werden. Demnach wäre jede Erfindung, die Materialien, Wirkstoffe, Zusammensetzungen oder Organismen bereitstellt, in denen eine dieser Eigenschaften verbessert wäre, ein Fortschritt auf dem Gebiet der Erfindung.
Xenorhabdus-Spezies stehen in der Natur häufig in symbiotischer Verbindung mit einem Nematodenwirt, und es ist bekannt, dass diese Verbindung genutzt werden kann, um Schädlingsaktivität zu bekämpfen. Es ist beispielsweise bekannt, dass bestimmte Xenorhabdus-Spezies allein in der Lage sind, einen Insektenwirt zu töten, wenn sie in das Haemocoel des Wirts injiziert werden.
Zusätzlich dazu wurde ein extrazelluläres, für Insekten tödliches Toxin von Photorhabdus luminescens isoliert (diese Spezies wurde kürzlich von der Gattung Xenorhabdus entfernt und ist mit den Spezies dieser Gattung eng verwandt). Dieses Toxin ist nicht wirksam, wenn es aufgenommen wird, aber es ist höchst toxisch, wenn es in bestimmte Insektenlarven injiziert wird (siehe N.E. Beckage et al. (Hrsg.), Parasites and Pathogens of Insects 2, Academic Press (1993)).
Weiters sind bestimmte niedermolekulare heterozyklische Verbindungen von P. luminescens und X. nematophilus bekannt, die antibiotische Eigenschaften aufweisen, wenn sie intravenös oder topisch angewandt werden (siehe S.H. Rhodes et al., PCT-WO 84/01775).
Zusätzlich dazu offenbart Bowen (1995), Diss. Abs. Bestell-Nr. AAI9608671 [STN-Zugangsnr. 96:33246] ein weiteres Toxin von P. luminescens, das für mehrere Insektenordnungen bei Injektion oder bei Aufnahme über die Nahrung toxisch sein soll.
Yamanaka et al., Chem. Abs. 118 (1), 2250 (1993), offenbaren, dass Lebendzellen und der Überstand von Kulturen von ATCC 19061 von Xenorhabdus nematophilus bei Injektion in das Haemocoel von Spodoptera litura toxisch war. Diese Toxizität nahm mit ansteigender Temperatur ab, jedoch wurde das verantwortliche toxische Element nicht weiter charakterisiert.
WO 95/00647 (CSIRO) erläutert ein Toxingen von X. nematophilus. Seine Verwendung für die Bearbeitung von Pflanzen und Viren für Insektenbekämpfung wird ebenfalls erläutert.
Toxine von Bacillus thuringiensis sind ebenfalls bekannt, und es wurde vorgeschlagen (in EP 0 238 441 A von CIBA-GEIGY), dass diese in Fusionsproteinen mit anderen Toxinmaterialien eingesetzt werden könnten.
WO 98/50427 (Dow Agrosciences et al.) beansprucht ein Prioritätsdatum vor dem Einreichdatum der vorliegenden Anmeldung, und deshalb entspricht der Gegenstand von WO 98/50427, der Anspruch auf das beanspruchte Prioritätsdatum hat, dem Stand der Technik nach Art. 54(3) gegenüber dem Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, der nur den Anspruch auf das Einreichdatum hat, für die Staaten CH, DE, DK, ES, FR, GB, IT, LI, NL. WO 98/50427 betrifft Proteine der Gattung Xenorhabdus, die für Insekten, wenn sie diesen ausgesetzt sind, toxisch sein sollen. Es wird vorgeschlagen, dass diese Proteintoxine zur Insektenbekämpfung auf die Nahrung von Insektenlarven und auf Pflanzen angewandt werden könne. WO 98/50427 stellt 3 kurze Aminosäuresequenzen von diesen Proteinen bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt neue Pestizidmittel und Zusammensetzungen von Xenorhabdus-Spezies, Organismen, die solche Verbindungen und Zusammensetzungen herstellen, und Verfahren, die diese Wirkstoffe, Zusammensetzungen und Organismen einsetzen, bereit.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung sind wie in den nachstehende Ansprüchen definiert. Demnach wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Töten oder Bekämpfen von Schädlingsinsekten bereitgestellt, das die orale Verabreichung von bestimmten Zellen von Xenorhabdus-Spezies oder bestimmten Pestizidmaterialien, die von dieser abstammen oder erhalten werden können, an Schädlinge umfasst.
Wie in den Ansprüchen dargelegt, stellt die Erfindung eine Insektizidzusammensetzung bereit, die:

(i) zur oralen Verabreichung an ein Insekt bestimmt ist;
(ii) ein von einer Xenorhabdus-Spezies erhältliches proteinartiges Pestizidmaterial oder ein Pestizidfragment davon oder ein(e) Pestizidvariante oder -derivat von einem davon umfasst, das/die bei oraler Verabreichung in jedem Fall toxische Aktivität aufweist, worin das Pestizidmaterial Material umfasst, für das die Nucleotidsequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon oder eine Sequenz, die an diese Sequenz hybridisiert, kodiert.

Andere Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40886 oder NCIMB 40887 oder den Überstand von Kulturen von diesen.
Toxine können von Xenorhabdus wie nachstehend veranschaulicht isoliert werden. Toxische Aktivität wurde mit dem Material assoziiert, für das die Nucleotidsequenz in
2 kodiert. Demnach umfasst die Zusammensetzung geeigneterweise ein Pestizidmaterial, für das die vollständige Nucleotidsequenz in 2 oder ein Teil davon kodiert. Pestizidfragmente sowie Varianten oder Derivate solcher Toxine können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Sequenz in 2 ist ungefähr 40 kb lang. Es wird angenommen, dass diese Sequenz für mehr als ein Protein kodieren kann, wobei jedes dieser Proteine einzeln oder wenn gemeinsam vorhanden regulieren oder für Insekten tödlich sein kann. Es ist eine Routinesache, zu bestimmen, welche Teile für die Insektizidaktivität erforderlich oder ausreichend sind.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung "Variante" auf Toxine, die eine modifizierte Aminosäuresequenz, aber eine ähnliche Aktivität aufweisen. Bestimmte Aminosäuren können durch verschiedene Aminosäuren ersetzt werden, ohne dass die Natur der Aktivität bedeutend verändert wird. Das Ersetzen kann durch "konservative Substitution" erfolgen, wobei eine Aminosäure durch eine Aminosäure ersetzt wird, die weitgehend ähnliche Eigenschaften aufweist, oder es können einige nicht-konservative Substitutionen stattfinden. Im Allgemeinen sind die Varianten jedoch zumindest zu 60 % homolog zu dem nativen Toxin, geeigneterweise zumindest zu 70 % homolog und noch bevorzugter zumindest zu 90 % homolog.
Die Bezeichnung "Derivat" bezieht sich auf Toxine, die beispielsweise durch chemische oder biologische Verfahren modifiziert wurden.
Diese Toxine sind neu, und sie und die Nucleinsäuren, die für sie kodieren, stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar.
Eine bevorzugte Xenorhabdus-Spezies ist die Bakterie X. nematophilus. Besondere Stämme von X. nematophilus, die im Zusammenhang mit der Erfindung zweckdienlich sind, sind der ATTC-19061-Stamm, der bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland (NCIMB), erhältlich ist. Zusätzlich dazu umfassen geeignete Stämme zwei neue Stämme von Xenorhabdus, die bei der NCIMB am 10. Juli 1997 hinterlegt und mit den Lagernummern NCIMB 40886 und NCIMB 40887 bezeichnet wurden. Letztere beiden Stämme bilden einen weiteren Aspekt der Erfindung und werden als "erfindungsgemäße Stämme" bezeichnet.
Alle Stämme weisen gemeinsame Eigenschaften auf, wie untenstehend in Tabelle 1 angeführt wird. Tabelle 1

*NBTA (Oxoid-Nährstoffagar umfassend 0,0025 % Bromthymolblau und 0,004 Tetrazoliumchlorid)

Vorzugsweise ist der Zielschädling ein Insekt, und noch bevorzugter gehört es der Ordnung der Lepidoptera, insbesondere Pieris brassicae, Pieris rapae oder Plutella xylostella, oder der Ordnung der Diptera, insbesondere Culex quinquefaciatus, an.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Zellen von den erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämmen oder aus diesen entwickelte Wirkstoffe gemeinsam mit Bacillus thuringiensis als orales Pestizid eingesetzt.
In weiteren Ausführungsformen werden, statt Bacillus thuringiensis selbst zu verwenden, von B. thuringiensis erhaltbare Pestizidmaterialien (z.B. Deltaendotoxine oder andere Isolate) gemeinsam mit den erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämmen eingesetzt.
Die Bezeichnung "erhältlich von" soll nicht nur Materialien umfassen, die direkt von dem jeweiligen Bakterium isoliert wurden, sondern auch jene, die in der Folge in andere Organismen kloniert und von anderen Organismen produziert wurden.
Demnach stellt die unerwartete Erkenntnis, dass Bakterien der Gattung Xenorhabdus (und von diesen abstammende Materialien) bei Aufnahme eine Pestizidaktivität aufweisen und dass solche Bakterien und Materialien gemeinsam mit B. thuringiensis (und von diesem abstammenden Toxinen oder Materialien) vorteilhaft eingesetzt werden können, die Grundlage für einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Die Pestizidaktivität von B.-thuringiensis-Isolaten allein wurde bereits gut dokumentiert. Jedoch wurde die synergistische Pestizidaktivität von diesen Isolaten und Bakterien der Xenorhabdus-Spezies (oder den davon abgeleiteten Materialien) zuvor noch nicht aufgezeigt.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird ein Kulturüberstand der Kulturen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme statt der Zellen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme eingesetzt.
Alle diese Verfahren können unter anderem für die Schädlingsbekämpfung eingesetzt werden.
Die Erfindung macht auch Pestizidzusammensetzungen verfügbar, die Zellen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme in Kombination mit B. thuringiensis umfas sen. Wie bei den obenstehend erläuterten Verfahren kann ein Pestizidtoxin von B. thuringiensis (vorzugsweise ein Deltaendotoxin) als Alternative zu B. thuringiensis in den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Auf ähnliche Weise kann ein Kulturüberstand von den Kulturen der erfindungsgemäßen Xenorhabdus-Stämme statt der Zellen von Xenorhabdus-Spezies eingesetzt werden.
Solche Zusammensetzungen können unter anderem für den Pflanzenschutz, z.B. durch das Besprühen von Pflanzen, oder für den Viehschutz eingesetzt werden. Zusätzlich dazu können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für die Vektorsteuerung eingesetzt werden.
Die Erfindung umfasst weiters neue Pestizidmittel, wie in den Ansprüchen dargelegt, die aus Xenorhabdus-Spezies isolilert werden können. Isolationsverfahren für solche Mittel sind dem Fachmann bekannt.
Insbesondere umfassen solche Verfahren die Trennung und Identifizierung von Toxinproteinen entweder auf der Ebene der Proteine oder der DNA.
Die Anmelder haben eine DNA-Region von Xenorhabdus NCIMB 40887 kloniert und teilweise sequenziert, wobei diese Region für die Insektizidaktivität kodiert und nachstehend als 2 (Seq.-ID Nr. 1) angeführt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung demnach ein Toxin bereit, für das die DNA der Seq.-ID Nr. 1 oder eine Variante oder ein Fragment von dieser kodiert.
Die Erfindung stellt auch eine rekombinante DNA bereit, die für ein solches Toxin kodiert. Die rekombinante DNA der vorliegenden Erfindung kann die Sequenz aus 2 umfassen oder eine Variante oder ein Fragment von dieser. Andere DNA-Sequenzen können für ähnliche Proteine kodieren, als Folge der Degeneration des genetischen Codes. Alle solche Sequenzen sind Teil des Umfangs der Erfindung.
Die hierin bereitgestellte Sequenz reicht aus, um Sonden herstellen zu können, die eingesetzt werden können, um die DNA von Toxingenen zu identifizieren und anschließend zu extrahieren. Diese DNA kann dann in Vektoren und Wirtszellen kloniert werden, wie es dem Stand der Technik entspricht.
DNA, die die Sequenz aus 2 umfasst oder an diese unter stringenten Bedingungen hybridisiert, stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar.
Der Ausdruck "hybridisieren an" bedeutet, dass die Nucleotidsequenz unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, wie den in Sambrook, Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, veranschaulichten, an die gesamte Sequenz aus 2 oder einen Teil von dieser anellieren wird.
Die Länge der für eine bestimmte analytische Technik eingesetzten Sequenz hängt von der Natur der Technik, dem Komplementaritätsausmaß der Sequenz, der Natur der Sequenz und insbesondere dem GC-Gehalt der Sonde oder des Primers sowie den eingesetzten Hybridisierungsbedingungen ab. Bei hochstringenten Bedingungen binden nur Sequenzen, die vollständig komplementär sind, bei wenig stringenten Bedingungen binden hingegen auch Sequenzen, die zu 60 % homolog, noch geeigneter zu 80 % homolog, zu der Zielsequenz sind. Sowohl hochstringente als auch wenig stringente Bedingungen werden von der hierin verwendeten Bezeichnung "stringente Bedingungen" abgedeckt.
Geeignete DNA-Fragmente aus 2, d.h. jene, die für Pestizidmittel kodieren, können mittels einer Standardtechnik identifiziert werden. Beispielsweise können Transposonmutagenese-Techniken eingesetzt werden, wie beispielsweise in H.S. Siefert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 735–739, USA (1986), beschrieben. Vektoren, wie z.B. das Cosmid cHRIM1, können mittels verschiedener Transposone mutiert werden und dann in Bezug auf den Verlust der Insektizidaktivität untersucht werden. Auf diese Weise können DNA-Regionen identifiziert werden, die für die für die toxische Aktivität verantwortlichen Proteine kodieren.
Das Minitransposon mTn3(HIS3) kann beispielsweise in einen toxischen Xenorhabdus-Klon, wie z.B. cHRIM1 (nachstehend als "Klon 1" bezeichnet), eingeführt werden, indem cHRIM1-DNA in E. coli RDP146 (pLB101) elektrophoriert wird und dieser Stamm mit E. coli RDP146 (pOX38), gefolgt von E. coli NS2114Sm, gepaart wird. Der Endstamm umfasst cHRIM1-DNA mit einer einzelnen Insertion des Transposon mTn3(HIS3). Diese Kolonien können kultiviert werden und ihre Insektizidaktivität wie nachstehend in Beispiel 8 beschrieben getestet werden. Das Erstellen einer Restriktionskarte oder DNA-Sequenzieren kann eingesetzt werden, um die Insertionsstelle von mTn3(HIS3) und damit die DNA-Regionen, die in Toxizität involviert sind, zu identifizieren. Ähnliche Ansätze können bei anderen Transposonen, wie z.B. Tn5 und mTn5, eingesetzt werden.
Ortsgerichtete Mutagenese von cHRIM1, wie in Maniatis, Fritsch und Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor (1982), erläutert, kann ebenfalls eingesetzt werden, um die Bedeutung von spezifischen DNA-Regionen für die toxische Aktivität zu untersuchen.
Alternativ dazu können Subklonierungstechniken eingesetzt werden, um Regionen der klonierten DNA zu identifizieren, die für Insektizidaktivität kodieren. In diesem Verfahren werden spezifische kleinere Fragmente der DNA subkloniert, und ihre Aktivität wird bestimmt. Zu diesem Zweck kann Cosmid-DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten werden und an eine kompatible Restriktionsstelle auf einem Plasmidvektor, wie z.B. pUC19, ligiert werden. Das Ligationsgemisch kann in E. coli transformiert werden, und transformierte Klone können unter Einsatz eines Selektionsmarkers, wie z.B. Antibiotikaresistenz, ausgewählt werden, für den auf dem Plasmidvektor kodiert wird. Diese Techniken werden detailliert beispielsweise in Maniatis et al., s.o. (siehe S. 390–391), und L.G. Davies, M.D. Dibner und J.F. Battey, Molecular Biology, Elsevier (siehe S. 222–224), beschrieben.
Einzelne Kolonien, die spezifische klonierte Fragmente umfassen, können kultiviert werden und wie nachstehend in Beispiel 8 beschrieben in Bezug auf ihre Aktivität getestet werden. Subklone mit Insektizidaktivität können weiter trunkiert werden, indem dasselbe Verfahren zur weiteren Identifikation von DNA-Regionen eingesetzt wird, die für Aktivität kodieren.
Die Erfindung offenbart auch einen isolierten-Pestizidwirkstoff, der ein Toxin umfasst, das ein Protein enthält, für das DNA kodiert, die die Sequenz in 2 oder eine Variante oder ein Fragment von dieser umfasst. Der Wirkstoff kann von Kulturen von X. nematophilus oder Varianten davon erhalten werden, weist eine orale Pestizidaktivität gegenüber Pieris brassicae, Pieris rapae und Plutella xylostella auf, ist bis 55°C im Wesentlichen hitzebeständig, wirkt synergistisch mit B.-thuringiensis-Zellen als orales Pestizid und ist gegenüber Proteolyse durch Trypsin und Proteinase K im Wesentlichen beständig.
"Bis 55°C im Wesentlichen hitzebeständig" bedeutet, dass der Wirkstoff weiterhin Pestizidaktivität aufweist, wenn er getestet wird, nachdem er in Suspension 10 in lang auf 55°C erhitzt wurde, und vorzugsweise zumindest 50 % der Aktivität im unbehandelten Zustand beibehält.
"Gegenüber Proteolyse im Wesentlichen beständig" bedeutet, dass der Wirkstoff weiterhin Pestizidaktivität aufweist, nachdem er 2 h lang bei 30°C Proteasen ausgesetzt wurde, und vorzugsweise zumindest 50 % der Aktivität im unbehandelten Zustand beibehält.
"Wirkt synergistisch" bedeutet, dass die Aktivität der Kombination von Komponenten größer ist als ausgehend von der Einzelverwendung der Komponenten zu erwarten wäre. Wenn beispielsweise gemeinsam mit B.-thuringiensis-Zellen als orales Pestizid verwendet, ist die Konzentration von B.-thuringiensis-Zellmaterial, die notwendig ist, um 50 % Mortalität in P. brassicae zu erreichen, wenn alleine verwendet, um zumindest 80 % reduziert, wenn es in Kombination mit dem Mittel bei einer Konzentration verwendet wird, die ausreicht, um 25 % Mortatilät zu ergeben, wenn das Mittel alleine verwendet wird.
Es wurde festgestellt, dass die Aktivität des Materials durch 30-kDa-Cut-off-Filter zurückgehalten, aber von 100-kDa-Filtern nur teilweise zurückgehalten wird.
Vorzugsweise wird der Wirkstoff dadurch weiter charakterisiert, dass die Pestizidaktivität durch eine Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS – 0,1 % 60 min) und Aceton (50 %, 60 min) bei 25°C verloren geht.
Die kennzeichnenden Eigenschaften des oben beschriebenen isolierten Wirkstoffs können eingesetzt werden, um diesen von Xenorhabdus-Spezies-Zellen und Kulturmediumüberständen zu reinigen oder seine Konzentration in diesen anzureichern. Verfahren zur Reinigung von Proteinen aus heterogenen Gemischen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (z.B. Ammoniumsulfatfällung, Proteolyse, Ultrafiltration mit bekannten Molekulargewicht-Cut-oft-Filtern, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, etc.). Die orale Pesitizidaktivität stellt ein angenehmes Verfahren bereit, um den Wirkstoffanteil nach jeder Stufe oder in jeder Eluent-Probe zu testen. Ein solches Vorgehen erfordert von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung keine erfinderischen Bemühungen.
Die Erfindung offenbart weiters orale Pestizidzusammensetzungen, die einen oder mehrere der oben beschriebenen Wirkstoffe umfassen. Solche Zusammensetzungen umfassen vorzugsweise ebenfalls andere Pestizidmaterialien von Nicht-Xenorhabdus-Spezies.
Diese anderen Materialien können so ausgewählt werden, dass ihre Eigenschaften die der oben beschriebenen Wirkstoffe ergänzen oder mit diesen synergistisch zusammenwirken.
Vorzugsweise umfasst die orale Pestizidzusammensetzung einen oder mehrere der oben beschriebenen Pestizidwirkstoffe in Kombination mit B. thuringiensis (oder mit einem von diesem abstammenden Toxin, vorzugsweise Endotoxin).
Rekombinante DNA, die für die Proteine kodiert, stellt einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Die DNA kann unter Einfluss von geeigneten Steuerungselementen, wie z.B. Promotoren, Enhancern, Signalsequenzen etc., in einen Expressionsvektor inkorporiert werden, wie auf dem Gebiet der Erfindung klar ist. Diese Expressionsvektoren stellen einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung dar. Sie können eingesetzt werden, um einen Wirtsorganismus zu transformieren, um sicher zu stellen, dass der Organismus das Toxin produziert.
Die Erfindung stellt ebenfalls einen Wirtsorganismus zur Verfügung, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die für einen oben beschriebenen Pestizidwirkstoff kodiert.
Verfahren zum Klonieren der Sequenz für ein charakterisiertes Protein in einen Wirtsorganismus sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Das Protein kann beispielsweise gereinigt und sequenziert werden: Da für das Sequenzieren keine Aktivität erforderlich ist, kann eine SDS-Gelelektrophorese gefolgt vom Blotting des Gels eingesetzt werden, um das Protein zu reinigen. Die Proteinsequenz kann eingesetzt werden, um eine Nucleotidsonde herzustellen, die wiederum eingesetzt werden kann, um geeignete genomische Fragmente einer Xenorhabdus-Genbibliothek zu identifizieren. Diese Fragmente können dann mittels eines geeigneten Vektors in einen Wirtsorganismus eingeführt werden, der das Protein exprimieren kann. Der Einsatz eines solchen allgemeinen Verfahrens ist Routine und für Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung nicht erfinderisch. Solche Techniken können für die Herstellung von anderen Xenorhabdus-Toxinen als die, für die die Sequenz in 2 kodiert, angewandt werden.
Es kann wünschenswert sein, den Wirkstoff zu manipulieren (z.B. mutieren), indem seine Gensequenz (und somit Proteinstruktur) verändert wird, um z.B. seine physikalischen oder toxikologischen Eigenschaften zu optimieren.
Es kann ebenfalls wünschenswert sein, dass der Wirt so bearbeitet oder ausgewählt wird, dass er auch andere proteinartige Pestizidmaterialien (z.B. Deltaendotoxin von B. thuringiensis) exprimiert. Ebenso kann es wünschenswert sein, Wirtsorganismen herzustellen, die Fusionsproteine exprimieren, die aus dem aktiven Teil des Wirkstoffs und anderen, die Toxizität verstärkenden Materialien bestehen.
Ein Wirt kann ausgewählt werden, um große Mengen des Pestizidmaterials zur Reinigung herzustellen, z.B. unter Einsatz von B. thuringiensis, das mit dem für den Wirkstoff kodierenden Gen transformiert ist. Vorzugsweise ist der Wirt jedoch eine Pflanze, die dadurch eine verbesserte Schädlingsresistenz gewinnen würde. Geeignete Pflanzenvektoren, z.B. das Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Alternativ dazu kann der Wirt so ausgewählt werden, dass er für die Schädlinge direkt pathogen ist, z.B. ein Insekten-Baculovirus.
Die Lehre und der Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst alle diese Wirtsorganismen sowie die Wirkstoffe, mutierten Wirkstoffe oder Wirkstoff-Fusionsmaterialien, die die Wirtsorganismen exprimieren.
Die Erfindung stellt demnach Verfahren, Zusammensetzungen, Wirkstoffe und Organismen bereit, die eine gewerblich anwendbare Pestizidaktivität aufweisen und besonders für verbesserten Pflanzenschutz oder die verbesserte Bekämpfung von durch Insekten hervorgerufene Krankheiten geeignet sind.
Die Verfahren, Zusammensetzungen und Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung werden nun zur Veranschaulichung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Zeichnungen, die keine Einschränkung darstellen, beschrieben. Andere Ausführungsformen, die Teil des Schutzumfangs der Erfindung sind, werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung im Lichte dieser Beispiele und Abbildungen klar werden.
ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Variation im Laufe der Wachstumszeit von X. nematophilus ATCC 19061 und die Aktivität von Zellen und Überständen gegenüber P. brassicae, wie in Beispiel 3 beschrieben.
2 zeigt die Sequenz des Hauptteils eines klonierten Toxingens von Xenorhabdus.
3 zeigt einen Vergleich von Restriktionskarten der klonierten Toxingene von zwei Xenorhabdus-Stämmen (oben Klon 1 und unten Klon 3).
BEISPIELE
Beispiel 1 – Verwendung von X.-nematophilus-Zellen als orales Insektizid
ZELLWACHSTUM: Eine Subkultur von X. nematophilus (ATCC 19061, Stamm 9965, erhältlich von den National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Schottland) wurde eingesetzt, um 250-ml-Erlenmeyerkolben zu inokulieren, die jeweils 50 ml Luria-Nährmedium umfassten, das 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro Liter umfasste. Die Kulturen wurden in den Kolben 40 h lang bei 27°C auf einem Rundschüttler kultiviert.
HERSTELLUNG EINER ZELLSUSPENSION: Die Kulturen wurden 10 min lang bei 5000 × g zentrifugiert. Die Überstände wurden entsorgt, und die Zell-Pellets wurden einmal gewaschen und wieder in einem gleichen Volumen Phosphatpuffer-Salzlösung (8 g NaCl, 1,44 g Na₂HPO₄ und 0,24 g KH₂PO₄ pro Liter) mit pH 7,4 suspendiert.
AKTIVITÄT DER ZELLSUSPENSION BEI INSEKTEN: Die Biotests wurden wie folgt durchgeführt: P. brassicae: Die Larven wurden mit einer künstlichen Nahrung auf Agarbasis (wie von David und Gardiner, London Nature 207, 882–883 (1965), beschrieben) ernährt, in die eine Reihe von Verdünnungen von Zellsuspensionen inkorporiert worden war. Die Biotests wurden unter Einsatz einer Reihe von 5 Dosen mit mindestens 25 Larven pro Dosis durchgeführt. Unbehandelte und hitzebehandelte (10 min lang bei 55°C) Zellen wurden getestet. Die Mortalität wurde nach 2 und 4 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf 25°C gehalten wurde.
Aedes aegypti: Die Larven wurden einer Reihe von 5 verschiedenen Verdünnungen der Zellsuspension in entionisiertem Wasser ausgesetzt. Die Biotests wurden unter Einsatz von 2 Dosen pro Verdünnung von 50 ml Zellsuspension in 9,5-cm-Kunststofftassen mit 25 Larven im zweiten Larvenstadium pro Dosis durchgeführt. Unbehandelte und hitzebehandelte Zellen (10 min lang bei 55°C oder 80°C) wurden getestet. Die Mortalität wurde nach 2 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf 25°C gehalten wurde.
Culex quinquefaciatus: Die Larven wurden einer einzigen Zellsuspension-Konzentration ausgesetzt, die 4 × 10⁷ Zellen/ml umfasste. Die Biotests erfolgten unter Einsatz von zwei 50-ml-Zellsuspensionen in 9,5-cm-Kunststofftassen mit 25 Larven im zweiten Larvenstadium pro Tasse. Unbehandelte und hitzebehandelte (10 min lang bei 55°C oder 80°C) wurden getestet. Die Mortalität wurde nach 2 Tagen aufgezeichnet, wobei die Temperatur auf 25°C gehalten wurde. Mortalität

Behandlung 2 Tage

Unbehandelt 100

Behandelt bei 55°C 100

Behandelt bei 80°C 0
Demnach zeigen die Ergebnisse deutlich, dass Zellen von X. nematophilus als orales Insektizid gegen eine Reihe von Insektenspezies wirksam sind (und gegen P. brassicae besonders stark). Die Insektizidaktivität hängt nicht von der Lebensfähigkeit der Zellen ab (d.h. sie ist weitgehend unbeeinflusst von dem Erhitzen auf 55°C, das die Lebensfähigkeit der Zellen um >99,99 % senkt), wird jedoch durch das Erhitzen auf 80°C stark reduziert, da dadurch die meisten Proteine denaturiert werden.
Beispiel 2 – Verwendung von X.-nematophilus-Überstand als orales Insektizid
ZELLWACHSTUM: Kulturen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert.
HERSTELLUNG DES ÜBERSTANDS: Die Kulturen wurden zweimal 10 min lang bei 10000 g zentrifugiert. Die Zell-Pellets wurden entsorgt.
AKTIVITÄT DES ÜBERSTANDS BEI INSEKTEN: Der Biotest war wie folgt: Die Aktivität gegen neonatale P. brassicae und zwei Tage alte Larven von Pieris rapae und Plutella xylostella wurde wie für P. brassicae in Beispiel 1 gemessen, wobei jedoch eine Reihe von unbehandelten Verdünnungen des Überstands statt der Zellsuspensionen eingesetzt wurde und die Mortalität lediglich nach 4 Tagen aufgezeichnet wurde.

LC50 (μl Überstand/g Nahrung)

Insektenspezies 4 Tage

P. brassicae 22

P. rapae 79

P. xylostella 135
Zusätzlich dazu wurde eine größenreduzierende Aktivität (62 % Reduktion in 7 Tagen) gegenüber Mamestra brassicae bei Larven nachgewiesen, die mit einer künstlichen Nahrung gefüttert wurden, die X.-nematophilus-Überstand umfasste (Ergebnisse sind nicht angeführt).
Diese Ergebnisse zeigen demnach deutlich, dass der Überstand von X.-nematophilus-Kulturmedium als orales Insektizid für eine Reihe von Insektenspezies wirksam ist und besonders stark gegen P. brassicae.
Das zehnminütige Erhitzen der Überstände auf 55°C verursachte den teilweisen Verlust der Aktivität, während 80°C zu einem vollständigen Aktivitätsverlust führte. Die Aktivität wurde auch durch eine Behandlung mit SDS (0,1 % (Gew./Vol.), 60 min lang) und Aceton (50 Vol.-%, 60 min lang) vollständig verloren, wurde jedoch durch Triton X-100 (0,1 %, 60 min lang), Nicht-Nahrungs-P40 (0,1 %, 60 min lang), NaCl (1 M, 60 min lang) oder kalte, zweiwöchige Lagerung bei 4°C oder –20°C nicht beeinflusst. All diese Eigenschaften stimmen mit einem proteinartigen Wirkstoff überein.
Die allgemeine Wirkungsweise von X.-nematophilus-Zellen und -Überständen, d.h. die Reduktion der Larvengröße und deren Tod innerhalb von 2 Tagen bei hoher Dosierung, und andere Eigenschaften, z.B. Temperaturbeständigkeit, scheinen ähnlich zu sein, was darauf hindeutet, dass ein einzelner Wirkstoff oder eine einzelne Wirkstoffart für die oralen Insektizidaktivitäten von Zellen und Überständen verantwortlich ist.
Beispiel 3 – Zeitmaßstab für das Auftreten einer Aktivität eines durch die Nahrung aufnehmbaren Insektizids
ZELLWAGHSTUM: 1 ml einer Übernacht-Kultur von X. nematophilus wurde eingesetzt, um einen Erlenmeyer-Kolben zu inokulieren. Zellen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert. Das Wachstum wurde durch eine Messung der optischen Dichte bei 600 nm bestimmt.
PRODUKTION VON ZELLSUSPENSION UND ÜBERSTÄNDEN: Diese wurden wie in den Beispielen 1 und 2 hergestellt.
PRODUKTION VON ZELLSUSPENSION UND ÜBERSTÄNDEN GEGEN P. BRASSICAE: Der Zellsuspension-Biotest wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt, je doch wurde eine einzige Dosis suspendierter Zellen eingesetzt, die 50 μl Nährmedium/g Nahrung entsprach, und die Mortalität wurde nach 2 Tagen gemessen. Der Zellüberstand-Biotest wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt, jedoch wurde eine einzige Dosis eingesetzt, die 50 μl Überstand/g Nahrung entsprach (d.h. mehr als doppelt soviel wie LC50), und die Mortalität nach 2 Tagen gemessen wurde.
Die Ergebnisse werden in 1 angeführt. Demnach zeigen diese Ergebnisse deutlich, dass die Zellen, die aus einem X.-nematophilus-Kulturmedium stammen, als orales Insektizid gegen P. brassiacae nach nur 5 h hochwirksam sind und Überstände nach 20 h hochwirksam sind. Obwohl eine leichte Zelllyse in den ersten Phasen des Wachstums beobachtet wurde, wurde nach diesem Zeitpunkt keine bedeutende Zelllyse mehr beobachtet, was darauf hinweist, dass die Überstandaktivität auf einen authentischen extrazellulären Wirkstoff zurückzuführen sein kann (im Gegensatz zu einem Wirkstoff, der nur nach dem Zellzerfall freigesetzt wird).
Beispiel 4 – Synergie zwischen X.-nematophilus-Zellen und B.-thuringiensis-Pulverpräparaten
ZELLWACHSTUM UND SUSPENSION: X.-nematophilus-Zellen wurden wie in Beispiel 1 kultiviert und suspendiert. Der B.-thuringiensis-Stamm HD1 (von Bacillus Genetic Stock Centre, The Ohio State University, Columbus, Ohio 43210, USA) wurde kultiviert, geerntet und zu einem Pulver formuliert, wie von Dulmage et al., J. Invertebrate Pathology 15, 15–20 (1970), beschrieben.
AKTIVITÄT VON X.-NEMATOPHILUS-ZELLEN UND B.-THURINGIENSIS-PULVER GEGEN P. BRASSICAE: Die Biotests wurden unter Einsatz von X. nematophilus und B. thuringiensis in Kombination oder unter Einsatz von B.-thuringiensis-Zellpulver allein durchgeführt. Die Biotests wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, jedoch wurden verschiedene Verdünnungen von B.-thuringiensis-Pulver statt X. nematophilus eingesetzt. Für das Kombinationsexperiment wurde eine konstante Dosis X.-nematophilus-Zellsuspension, die für ein Ergebnis von 25 % Mortalität ausreichte, ebenfalls zu der Nahrung zugesetzt. Die Mortalität wurde nach 2 Tagen aufgezeichnet.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein Synergismus zwischen X.-nematophilus-Zellen und B.-thuringiensis-Pulver besteht, wenn diese als orales Insektizid gegen P. brassicae wirken.
Beispiel 5 – Synergie zwischen X.-nematophilus-Überständen und B.-thuringiensis-Pulver
ZELLWACHSTUM UND HERSTELLUNG DER ÜBERSTÄNDE: X.-nematophilus-Zellen wurden kultiviert und Überstände wurden hergestellt, wie in Beispiel 2. B. thuringiensis wurde wie in Beispiel 4 kultiviert und behandelt.
AKTIVITÄT VON X.-NEMATOPHILUS-ÜBERSTÄNDEN UND B.T.-ZELLPULVER GEGEN P. BRASSICAE: Die Biotests wurden unter Einsatz von X.-nematophilus-Überständen und B. thuringiensis in Kombination oder unter alleinigem Einsatz von B.-thuringiensis-Pulver durchgeführt. Der Biotest gegen neonatale P. brassicae und 2 Tage alte Larven von Pieris rapae und Plutella xylostella wurden wie in Beispiel 2 gemessen, jedoch wurden verschiedene Verdünnungen von B. thuringiensis statt X. nematophilus eingesetzt. Für das Kombinationsexperiment wurde eine konstante Dosis X.-nematophilus-Überstand, die für ein Ergebnis von 25 % Mortalität ausreichte, ebenfalls zu der Nahrung zugesetzt. Die Mortalität wurde nach 4 Tagen aufgezeichnet.
Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass ein Synergismus zwischen X.-nematophilus-Überständen und B.-thuringiensis-Pulver besteht, wenn sie als orales Insektizid gegen verschiedene Insektenspezies wirken. Die Tatsache, dass X.-nematophilus-Zellen und -Überstände diesen Synergismus aufweisen, deutet stark darauf hin, dass ein einziger Wirkstoff oder eine einzelne Wirkstoffart für die gezeigten Aktivitäten verantwortlich ist.
Beispiel 5 – Charakterisierung des Insektizidwirkstoffs von X.-nematophilus-Überstand durch Proteolyse
ZELLWACHSTUM UND HERSTELLUNG VON ÜBERSTÄNDEN: X.-nematophilus-Zellen wurden kultiviert und Überstände wurden hergestellt, wie in Beispiel 2.
PROTEOLYSE DES ÜBERSTANDS: Der Kulturüberstand (50 ml) wurde 48 h lang gegen 0,5 M NaCl (3 × 1 l) bei 4°C dialysiert. Das Volumen des Überstands im Dialyseschlauch wurde durch das Bedecken mit Polyethylenglykol 8000 (Sigma Chemicals) um das Fünffache reduziert. Proben wurden entfernt und mit Trypsin (Sigma T8253 = 10.000 Einheiten/mg) oder Proteinase K (Sigma P0390 = 10 Einheiten/mg) bei einer Konzentration von 0,1 mg Protease/ml Probe 2 h lang bei 30°C behandelt.
AKTIVITÄT VON PROTEASE-BEHANDELTEM ÜBERSTAND GEGEN P. BRASSICAE: Der Biotest gegen neonatale Larven von P. brassicae wurde durchgeführt, indem 25 μl jeder "Behandlung" auf der künstlichen Nahrung auf Agarbasis, auf die in Beispiel 1 verwiesen wurde, in einem Kunststoffbehälter mit 4,5 cm Durchmesser verteilt wurden. Vier Behälter mit jeweils 10 Larven wurden für jede Behandlung eingesetzt. Die Mortalitäten wurden nach 1 und 2 Tagen aufgezeichnet. Kontrollen, die nur Wasser, Trypsin (0,1 mg/ml) und Proteinase K (0,1 mg/ml) einsetzten, wurden auf dieselbe Weise getestet.
Beispiel 6
Entomozidische Aktivität von anderen Xenorhabdus
Unter Einsatz der Vorgehensweise der Beispiele 1 und 2 wurden vier verschiedene Xenorhabdus-Stämme gegen Schädlingsinsekten getestet.
Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

I) Aktivität gegen Pieris brassicae
Es wurde festgestellt, dass die entomozidische Aktivität der Zellen und des Überstands bei allen vier Stämmen um mehr als 99 % reduziert wurde, wenn diese 10 min lang auf 80°C erhitzt wurden.
II) Aktivität gegen Stechmücken (Aedes aegypti) Bakterien wurden in einer Rate von 10⁷ Zellen/ml Wasser zugesetzt
Außerdem senkten alle Stämme das Wachstum von Heliothis virescens signifikant.

Beispiel 7
Klonieren von Toxingenen von Xenorhabdus-Stämmen
Vollständige Zell-DNA wurde von NCIMB 40887 und ATCC 19061 unter Einsatz eines genomischen DNA-Reinigungssets von Quiagen isoliert. Die Zellen wurden in L-Nährmedium (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl pro I) bei 28°C unter Schütteln (150 U/min) bis zu einer optischen Dichte von 1,5 A₆₀₀ kultiviert. Die Kulturen wurden durch Zentrifugieren bei 4000 × g geerntet und erneut in 3,5 ml BI-Puffer (50 mM Tris/HCl, 0,05 % Tween 20, 0,5 % Triton X-100, pH 7,0) suspendiert und 30 min lang bei 50°C inkubiert. Die DNA wurde von den bakteriellen Lysaten unter Einsatz von Quiagen-100/G-Spitzen gemäß den Herstellerhinweisen isoliert. Die resultierende gereinigte DNA wurde bei –20°C in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) gelagert.
Eine repräsentative DNA-Bibliothek wurde unter Einsatz von vollständiger DNA von teilweise mit dem Restriktionsenzym Sau3a verdautem NCIMB 40887 und ATTC 19061 hergestellt. Etwa 20 g DNA von jedem Stamm wurden bei 37°C mit 0,25 Einheiten des Enzyms inkubiert. In Zeitabständen von 10, 20, 30, 45 und 60 min wurden Proben entnommen und 15 min lang auf 65°C erhitzt. Um die Größe der DNA-Fragmente zu visualisieren, wurden die Proben einer Elektrophorese auf 0,5 (Gew./Vol.) Agarosegelen unterzogen.
Die DNA-Proben, die den höchsten Anteil an 30- bis 50-kb-Fragmenten enthielten, wurden vereinigt und mit 4 Einheiten alkalischer Shrimps-Phosphatase (Boehringer) 15 min lang bei 37°C behandelt, wonach eine Hitzebehandlung bei 65°C folgte, um die Phosphatase zu inaktivieren.
Die aufgrund ihrer Größe ausgewählten DNA-Fragmente wurden an die BamH1-Stelle des Cosmidvektors SuperCos! (Stratagent) gebunden und in den Escherichia-coli-Stamm XL Blue 1 verpackt, wobei ein Gigapack-II-Verpackungsset (Stratgene) gemäß den Herstellerhinweisen eingesetzt wurde.
Um Cosmidklone mit entomozidischer Aktivität auszuwählen, wurden einzelne Kolonien, die auf L-Agar-Platten, die 25 μg Ampicillin umfassten, ausgewählt wurden, in L-Nährmedium (umfassend 25 μg/ml Ampicillin) über Nacht bei 28°C kultiviert. Nährmediumkulturen (50 μl) wurden individuell auf der Oberfläche von Insektennahrung in Behältern mit 4,5 cm Durchmesser, wie in Beispiel 5 beschrieben, verteilt. Zu jedem Behälter wurden 10 neonatale Larven von P. brassicae zugesetzt. Die Larven wurden nach 24, 72 und 96 h untersucht, wobei Mortalität und die Größe der überlebenden Larven untersucht wurde. Insgesamt wurden 220 Klone von NCIMB 40887 getestet, wobei festgestellt wurde, dass zwei eine Reduktion des Larvenwachstums und den Tod der Larven innerhalb von 72 h hervorrufen. Von 370 Klonen von ATTC 19061 wurde bei einem festgestellt, dass er innerhalb von 72 h den Tod der Larven verursachte.
Beispiel 8
Aktivität von klonierten Toxingenen gegen Pieris brassicae
Die drei aktiven Klone aus Beispiel 7 wurden in L-Nährmedium, umfassend 25 μg/ml Ampicillin, 24 h lang bei 28°C auf einem Rundschüttler bei 150 U/min kultiviert. Die Aktivität der Toxinklone gegenüber neonatalen Larven wurde durch die Integration von ganzen Nährmediumkulturen in die Insektennahrung, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.

* XL1-Blue-E.-coli-Nährmedium

Wenn die E.-coli-Toxinklone 10 min lang auf 80°C erhitzt wurden und zu der Nahrung in einer Rate von 100 μl/g zugesetzt wurden, wurde keine Aktivität gegenüber der Larven beobachtet. Die Hitzeempfindlichkeit der Toxine wird hervorgehoben.
Beispiel 9
Seguenzieren des klonierten Toxins von NCIMB 40887 Cosmid-DNA des oben angesprochenen, entomozidischen Klons 1 von NCIMB 40887 wurde unter Einsatz eines Wizard-Plus-SV-DNA-Systems (Promega) gemäß den Herstellerhinweisen gereinigt. Eine teilweise Karte des klonierten Fragments wurde unter Einsatz einer Reihe von Restriktionsenzymen, EcoR1, BamH1, HindIII, Sal1 und Sac1, wie in 3 dargestellt, erhalten. Die DNA-Sequenzierung wurde durch auf pUC18 und pUC19 basierende Subklone des Cosmids unter Einsatz der Enzyme EcoR1, BamH1, HindIII, EcoRV und PvuII initiiert. Sequenzlücken wurden unter Einsatz eines Primer-Walking-Ansatzes auf gereinigter Cosmid-DNA gefüllt. Sequenzreaktionen wurden unter Einsatz des "ABI-PRISM^TM-Dye-Terminator-Cycle-Sequencing-Ready-Reaction-Sets" mit Ammplitaq-DNA-Polymerase FS gemäß den Herstellerhinweisen durchgeführt. Die Proben wurden durch einen automatischen ABI-Sequenzierungsautomaten gemäß den Herstellerhinweisen analysiert. Der Hauptteil der DNA-Sequenz für das klonierte Toxinfragment wird in 2 dargestellt.
Beispiel 10
Restriktionskarte von kloniertem Toxin von Klon 3
Cosmid-DNA des oben genannten, entomozidischen Klons 3 wurde wie in Beispiel 9 beschrieben gereinigt. Eine Restriktionskarte des klonierten Fragments wurde unter Einsatz der Restriktionsenzyme BamH1, HindIII, Sal1 und Sac1 erhalten und wird in 3 dargestellt. Wenn ein Vergleich mit der Karte von Klon 1 (3) angestellt wird, ist durch die einander überlagernden Regionen deutlich, dass die Restriktionskarten einander sehr ähnlich sind. Der einzige nachweisbare Unterschied zwischen den beiden Klonen war eine Reduktion der Größe von zwei HindIII-Fragmenten in Klon 3, entsprechend den 11,4-kb- und 7,2-kb-HindIII-Fragmenten in Klon 1, um jeweils 2 kb bzw. 200 bp. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die DNA-Regionen, die für die Toxizität in den beiden Bakterienstämmen kodieren, insgesamt verwandt sind.
Beispiel 11
Southern-Blot-Hybridisierungsexperimente
Ein 10,3-kb-BamH1-Sal1-Fragment der DNA von Klon 1 wurde als Sonde für die Hybridisierung von vollständiger, mit HindIII verdauter DNA der Xenorhabdus-Stämme ATCC 19061, NCIMB 40886 und NCIMB 40887 eingesetzt. Die Hybridisierung erfolgte mit 20 ng/ml DIG-markierter DNA-Sonde 18 h lang bei 65°C. Filter wurden vor dem immunologischen Nachweis zweimal 5 min lang mit 2 × SSC (0,3 M NaCl, 30 mM Natriumcitrat, pH 7,0)/0,1 % (Gew./Vol.) Natriumdodecylsulfat bei Raumtemperatur und zweimal 15 min lang mit 0,1 × SSC (15 mM NaCl, 1,5 mM Nat riumcitrat, pH 7,0) mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat bei 65°C gewaschen. Die Sonde wurde markiert, und Experimente wurden gemäß den Herstellerhinweisen durchgeführt, wobei ein nicht-radioaktives DIG-DNA-Markierungs- und Nachweis-Set (Boehringer) eingesetzt wurde. Die Sonde wurde an ein HindIII-Fragment mit etwa 8 kb in allen drei Stämmen sowie als ein 11,4-kb-Fragment in NCIMB 40887 und ein etwa 9-kb-Fragment in NCIMB 40886 und ATCC 19061 hybridisiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stämme NCIMB 40886 und ATCC 19061 DNA umfassen, die eine enge Homologie mit dem Toxingen des oben genannten Klons 1 aufweist, wodurch die Ähnlichkeit der von den drei Stämmen produzierten Toxine bestätigt wird.

Claims

PATENTANSPRÜCHE für die Staaten AT, BE, FI, GR, SE, LU, MC 1. Rekombinante DNA, die für ein Pestizidmittel kodiert, das ein Toxin umfasst, welches ein Protein umfasst, für das DNA kodiert, welche die Sequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon umfasst. 2. Rekombinante DNA nach Anspruch 1, welche die Sequenz aus 2 umfasst. 3. Rekombinante DNA, welche die gesamte oder einen Teil der Sequenz aus 2 umfasst oder unter stringenten Bedingungen an die gesamte oder einen Teil der Sequenz aus 2 hybridisiert und für ein Pestizidmaterial kodiert. 4. Rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein Fusionsprotein kodiert, das einen als Pestizid aktiven Teil des Mittels nach Anspruch 1 in Kombination mit anderen proteinartigen, toxizitätsfördernden Pestizidmaterialien umfasst. 5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die toxizitätsfördernden Pestizidmaterialien δ-Endotoxin von B. thuringiensis umfassen. 6. Expressionsvektor, eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfassend. 7. Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist. 8. Wirtsorganismus nach Anspruch 7, der so bearbeitet oder ausgewählt ist, dass er auch andere proteinartige, toxizitätsfördernde Pestizidmaterialien exprimiert. 9. Wirtsorganismus nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin der Wirt eine Pflanze ist. 10. Wirtsorganismus nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin der Wirt ein für Insekten pathogenes Virus ist. 11. Mikroorganismus, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40886 umfassend. 12. Mikroorganismus, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40887 umfassend. 13. Pestizidmittel, ein Toxin umfassend, welches ein Protein umfasst, für das DNA kodiert, welche die Sequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon umfasst. 14. Fusionsprotein, für das die rekombinante DNA nach Anspruch 4 kodiert. 15. Pestizidzusammensetzung, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40886 oder NCIMB 40887 umfassend. 16. Pestizidzusammensetzung, einen Überstand umfassend, der von Zellkulturen des Xenorhabdus-Stamms NCIMB 40886 oder NCIMB 40887 stammt. 17. Pestizidzusammensetzung, ein Mittel nach Anspruch 13 umfassend. 18. Insektizidzusammensetzung, welche: (i) zur oralen Verabreichung an ein Insekt bestimmt ist; (ii) ein von einer Xenorhabdus-Spezies erhältliches proteinartiges Pestizidmaterial oder ein Pestizidfragment davon oder ein(e) Pestizidvariante oder -derivat von einem davon umfasst, das/die bei oraler Verabreichung auf jeden Fall toxische Aktivität aufweist, worin das Pestizidmaterial Material umfasst, für das die Nucleotidsequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon oder eine Sequenz, die an diese Sequenz hybridisiert, kodiert. 19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, ein weiteres Pestizidmaterial, das nicht von Xenorhabdus erhältlich ist, umfassend. 20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin das weitere Pestizidmaterial ein von B. thuringiensis erhältliches Material umfasst. 21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiters Zellen von B. thuringiensis umfassend. 22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin die von B. thuringiensis erhältlichen Pestizidmaterialien das δ-Endotoxin umfassen. 23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, weiters einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger umfassend. 24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin der Träger Teile von Insektennahrung umfasst. 25. Verfahren zur Tötung oder Bekämpfung von Schadinsekten, wobei das Verfahren die Applikation einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 24 an Schadinsekten oder ihre Umgebung umfasst. 26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Schadinsekten zur Ordnung der Lepidoptera oder Diptera gehören.
PATENTANSPRÜCHE für die Staaten CH DE, DK, ES FR, GB, IT, LI und NL 1. Rekombinante DNA, die für ein Pestizidmittel kodiert, das ein Toxin umfasst, welches ein Protein umfasst, für das DNA kodiert, welche die Sequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon umfasst, mit der Maßgabe, dass die rekombinante DNA nicht für ein Xenorhabdus-Wi-Proteintoxin kodiert, das (i) die n-terminale Aminosäuresequenz: Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val und (ii) eine ungefähre Größe von 130 kDa aufweist. 2. Rekombinante DNA, welche die Sequenz aus 2 umfasst. 3. Rekombinante DNA, welche die gesamte oder einen Teil der Sequenz aus 2 umfasst oder unter stringenten Bedingungen an die gesamte oder einen Teil der Sequenz aus 2 hybridisiert und für ein Pestizidmaterial kodiert, mit der Maßgabe, dass die rekombinante DNA nicht für ein Xenorhabdus-Wi-Proteintoxin kodiert, das (i) die n-terminale Aminosäuresequenz: Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val und (ii) eine ungefähre Größe von 130 kDa aufweist. 4. Rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein Fusionsprotein kodiert, das (i) einen als Pestizid aktiven Teil eines Proteins, für das DNA kodiert, welche die Sequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon umfasst, in Kombination mit (ii) anderen proteinartigen, toxizitätsfördernden Pestizidmaterialien umfasst. 5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die toxizitätsfördernden Pestizidmaterialien δ-Endotoxin von B. thuringiensis umfassen. 6. Expressionsvektor, eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfassend. 7. Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6 transformiert ist. 8. Wirtsorganismus nach Anspruch 7, der so bearbeitet oder ausgewählt ist, dass er auch andere proteinartige, toxizitätsfördernde Pestizidmaterialien exprimiert. 9. Wirtsorganismus nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin der Wirt eine Pflanze ist. 10. Wirtsorganismus nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin der Wirt ein für Insekten pathogenes Virus ist. 11. Mikroorganismus, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40886 umfassend. 12. Mikroorganismus, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40887 umfassend. 13. Pestizidmittel, ein Toxin umfassend, welches ein Protein umfasst, für das DNA kodiert, welche die Sequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon umfasst, mit der Maßgabe, dass das Toxin kein Protein mit der Aminosäuresequenz: Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val umfasst, mit der Maßgabe, dass das Toxin nicht das Xenorhabdus-Wi-Proteintoxin ist, das (i) die n-terminale Aminosäuresequenz: Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val und (ii) eine ungefähre Größe von 130 kDa aufweist. 14. Fusionsprotein, für das die rekombinante NDA nach Anspruch 4 kodiert. 15. Pestizidzusammensetzung, den Xenorhabdus-Stamm NCIMB 40886 oder NCIMB 40887 umfassend. 16. Pestizidzusammensetzung, einen Überstand umfassend, der von Zellkulturen des Xenorhabdus-Stamms NCIMB 40886 oder NCIMB 40887 stammt. 17. Pestizidzusammensetzung, ein Mittel nach Anspruch 13 umfassend. 18. Insektizidzusammensetzung, welche: (i) zur oralen Verabreichung an ein Insekt bestimmt ist; (ii) ein von einer Xenorhabdus-Spezies erhältliches proteinartiges Pestizidmaterial oder ein Pestizidfragment davon oder ein(e) Pestizidvariante oder -derivat von einem davon umfasst, das/die bei oraler Verabreichung auf jeden Fall toxische Aktivität aufweist, worin das Pestizidmaterial Material umfasst, für das die Nucleotidsequenz aus 2 oder eine Variante oder ein Fragment davon oder eine Sequenz, die an diese Sequenz hybridisiert, kodiert, mit der Maßgabe, dass das Pestizidmaterial nicht das Xenorhabdus-Wi-Proteintoxin umfasst, das (i) die n-terminale Aminosäuresequenz: Asn Gln Asn Val Glu Pro Ser Ala Gly Asp Ile Val und (ii) eine ungefähre Größe von 130 kDa aufweist. 19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, ein weiteres Pestizidmaterial, das nicht von Xenorhabdus erhältlich ist, umfassend. 20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, worin das weitere Pestizidmaterial ein von B. thuringiensis erhältliches Material umfasst. 21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, weiters Zellen von B. thuringiensis umfassend. 22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, worin die von B. thuringiensis erhältlichen Pestizidmaterialien das δ-Endotoxin umfassen. 23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, weiters einen landwirtschaftlich annehmbaren Träger umfassend. 24. Zusammensetzung nach Anspruch 23, worin der Träger Teile von Insektennahrung umfasst. 25. Verfahren zur Tötung oder Bekämpfung von Schadinsekten, wobei das Verfahren die Applikation einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 bis 24 an Schadinsekten oder ihre Umgebung umfasst. 26. Verfahren nach Anspruch 25, worin die Schadinsekten zur Ordnung der Lepidoptera oder Diptera gehören.