DE69735562T2

DE69735562T2 - Sonden zur Erkennung und Identifizierung von Helicobacter Pylori

Info

Publication number: DE69735562T2
Application number: DE69735562T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Osaka-shi KESHI; Soji Kyoto-shi EDA; Hirotsugu Takarazuka-shi Uehara; Keigo Osaka-shi NISHIDA; Akio Osaka-shi MATSUHISA
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 1996-07-24
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: EP1369495B1; EP1375677B1; DE69735593T2; EP1369495A1; ATE321881T1; US6172215B1; CA2261576C; CA2261576A1; ATE321890T1; DE69735562D1; JPH1033179A; EP0965646A1; EP0965646B1; AU3634197A; WO1998003681A1; AU721358B2; DE69735593D1; EP0965646A4; KR20000068006A; KR100361965B1

Description

[Technischer Bereich]
Die vorliegende Erfindung betrifft Sonden, die geeignet sind zum Nachweisen und Identifizieren von Helicobacter pylori, die ursächlichen Bakterien der Verdauungstrakterkrankungen, einschließlich Gastritis, Magengeschwür, Duodenalulcus duodeni oder dgl.
[Hintergrundtechnik]
Seit die Gruppe von Warren von der Existenz von Helicobacter pylori (früherer Name: Campylobacter pylori) in der humanen Magenschleimhaut berichteten (Warren J.R. et al., "Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis", Lancet 1: 1273–1275 (1983)), wurden zahlreiche Forschungen durchgeführt im Hinblick auf die biochemischen Eigenschaften davon, im Besonderen die Korrelation zwischen Helicobacter pylori und Verdauungstrakterkrankungen, einschließlich Magengeschwür, Duodenalulkus oder dgl.
Im Hinblick auf die Tatsachen, dass Helicobacter pylori mit hoher Ausbeute getrennt/nachgewiesen worden sind in der humanen Magenschleimhaut von Gastritispatienten oder Magengeschwürpatienten (z.B. wird berichtet, dass sie in einem Ausmaß von 50 ~ 80 % im Fall von chronischer Gastritis, superfizieller Gastritis, atropischer Gastritis, erosiver Gastritis oder dgl. nachgewiesen wurden), und die Symptome dieser Verdauungstrakterkrankungen entsprechend vermieden werden durch Sterilisation mittels Verabreichung von Arzneimitteln, wurde die Korrelation zwischen Helicobacter pylori und den Verdauungstrakterkrankungen nahegelegt.
Helicobacter pylori würde keine Invasion auf Schleimhautzellen ausführen, jedoch auf der Epithelschleimhautoberfläche und/oder dem intrazellulären Raum verbleiben und hier wachsen (proliferieren). Schließlich wird angenommen, dass PAS(Periodic Acid-Sciff)-reaktionspositive Schichten in der Magenschleimhaut durch das Wachstum von Helicobacter pylori geschwächt werden, wobei Wirkungen von Mucin, das die Schleimhaut schützt, verschlechtert werden, und die Potenz als Schutzfaktor der Magenschleimhaut ebenfalls verschlechtert wird (T. Ito, "Recent findings on Helicobacter pylori", Medical Technology, 19 (10), S. 892–893 (September 1991)).
Schließlich wurde auch von dem Mechanismus berichtet, dass Helicobacter pylori im Magenschleimhautepithel ankommen und verbleiben, dann Ammoniak erzeugt wird durch den Abbau von Harnstoff im Magen durch Urease von Helicobacter pylori, wobei der so erzeugte Ammoniak die Magenschleimhaut zerstört und reverse Diffusion des Wasserstoffions hervorruft und Tumore dadurch gebildet werden (Tsujii, M. et al., "Mechanism of gastric mucosal damage Induced by ammonia", Gastroeneterology 107: S. 1881–1888 (1992)).
Im Allgemeinen umfasst die herkömmliche Diagnose von Helicobacter pylori, die humanen Verdauungstrakterkrankungen entspricht:

(1) Direkten Nachweis des Vorliegens von Helicobacter pylori in einem Teil der Schleimhaut (Abstrich, Gewebemikroskopie, Kultivieren),
(2) Nachweis unter Verwendung des Kennzeichens von Helicobacter pylori, einschließlich Ureaseaktivität und
(3) Seroimmundiagnose (T. Shirai et al., "Diagnosis on Presence of Campylobacter pylori", Saishin-Igaku, 44 (2), 284–288 (1989)).

Unter den oben genannten Verfahren ist ein Verfahren (Kultivierungsverfahren) zum Nachweisen von Helicobacter pylori durch mikroaerobe Kultivierung von Biopsieproben von Magenschleimhaut das verlässlichste und genauste Verfahren. Jedoch erfordert dieses Verfahren üblicherweise ein Stunde für eine Kultivierung des Wachstums der Bakterien, wobei eine längere Zeit erforderlich wäre, um die Testergebnisse zu erhalten.
Im Hinblick auf Ureaseproduktivität durch Helicobacter pylori sind dann Verfahren zum direkten Nachweisen von Urease in Proben gastritischer Biopsien ebenfalls verwendet worden (T. Ito, "Special diagnosis for bacterial infection/4. Campylobacter pylor", Rinnshoui, 15 (Ergänzung), S. 367–369 (1989)). Da dies jedoch Verfahren sind zum Testen der Biopsieproben mit einem Endoskop erfordern die Verfahren die Durchführung durch einen Fachmann und die Patienten werden unter unerträglichem Schmerz leiden.
Weiterhin, da Harnstoff im Magen zu Ammoniak und ¹⁴CO₂ abgebaut wird, erfolgt die Diagnose einschließlich der Beurteilung von solchem ¹⁴CO₂ durch einen Szintillationszähler. Dieses Verfahren erfordert jedoch ebenfalls fachmännische Arbeit, um das Radioisotop handzuhaben.
Eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen von H. pylori sind in der Technik bekannt:
US 5,527,678 offenbart die Sequenzen von cagB- und cagC-Genen von H. pylori und isolierten Nukleinsäuren, welche spezifisch an die oben genannten Gene hybridisieren.
WO93/18150 offenbart die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen des H. pylori Cytoxins (CT), "Cytotoxin Associated Immunodominat" (CAI)-Antigen und des Wärmeschockproteins (hsp60).
WO91/09049 offenbart Oligonukleotidsequenzen, die spezifisch für H. pylori sind und die geeignet sind als DNA-Sonden und Primer beim Nachweis einer H. pylori-Infektion im Menschen.
Li et al. (Journal of Clinical Microbiology, Band 31, 8, S. 2157–2162 (1993)) offenbaren eine hochspezifische und empfindliche Sonde, die von chromosomaler DNA von H. pylori abstammt und die Tatsache, dass sie geeignet ist zum Typisieren von H. pylori-Isolaten.
Desai et al. (Journal of Applied Bacteriology, Band 75, S. 574–582 (1993)) offenbaren, dass die genetische Diversität von H. pylori eingeteilt werden kann in Bezug auf klinische Symptomatologie, unter Verwendung von 16s rRNA und einer Spezies-spezifischen DNA-Sonde.
[Offenbarung der Erfindung]
Im Hinblick auf die oben genannten Probleme in der Technik soolte die vorliegende Erfindung zur Entwicklung einer Technologie dienen zum einfachen, spezifischen und wirkungsvollen Nachweisen von Helicobacter pylori ohne Einbringen eines medizinischen Instruments, wie etwa eines Endoskops, in den Körper eines Patienten.
Der Vorteil der Erfindung ist damit gerichtet auf Sonden mit spezifischen Reaktivitäten für DNAs oder RNAs von Helicobacter pylori, welches das ursächliche Bakterium von Verdauungstrakterkrankungen ist, einschließlich Gastritis, Magengeschwür, Duodenalulcus oder dgl. und zur Analyse von Basensequenzen in den Sonden, die den charakteristischen Genteil von Helicobacter pylori betreffen.
Das heißt, DNAs des betreffenden Bakteriums, Helicobacter pylori, können signifikant nachgewiesen werden durch die Spezifität zwischen den Sonden der vorliegenden Erfindung und den Bakterien-DNAs, wobei Helicobacter pylori schnell und exakt nachgewiesen/identifiziert werden kann ohne Kultivieren/Züchten von Helicobacter pylori.
Dann kann, falls Primer entwickelt werden, basierend auf der Basensequenzinformation dieser Sonden, Helicobacter pylori identifiziert werden durch Amplifizieren von DNAs mit PCR-Techniken, ohne Durchführen eines Hybridisierungsverfahrens.
Wenn nicht-radioaktive Sonden, z.B. biotinylierte Sonden zur Hybridisierung verwendet werden, da diese Sonden nachgewiesen werden können mit einem optischen Mikroskop in einem herkömmlichen Labor ohne Einrichtungen zum Handhaben von Radioisotopen, kann dadurch ein Verfahren zum Nachweis von Bakterien schnell und einfach durchgeführt werden.
[Kurze Beschreibung der Zeichnungen]
1 ist eine Ansicht, die die Beziehung zwischen der Position der Vertiefung in der Platte mit Vertiefungen und den Proben (geblottete Stamm-DNAs) zeigt.
2 ist eine Ansicht, die die Ergebnisse einer Dot-Hybridisierung von Reaktivitäten zwischen der Sonde der vorliegenden Erfindung und DNAs aus verschiedenen Stämmen zeigt.
[Bestes Verfahren zum Durchführen der Erfindung]
Wenngleich Beispiele der Sonde, die aus Helicobacter pylori gemäß der vorliegenden Erfindung nachfolgend dargestellt sind, soll die vorliegende Erfindung nicht aufgrund der Offenbarung der Beispiele begrenzt werden:
Beispiel 1: Aus Helicobacter pylori hergestellte DNA-Sonden
(1) Herstellung von DNA-Sonden aus Helicobacter pylori
Zuerst wurde Skirrow-Medium, das die in der folgenden Tabelle 1 aufgeführten Komponenten enthält, hergestellt. TABELLE 1

Blucella Nährmedium (Difco Co.,) 14 g

destilliertes Wasser 500 ml

Polymyxin B 1250 Einheiten

Vancomycin 5 mg

Tripetoprim 2,5 mg

Pferdeserum (Difco Co.,) 50 ml

Agar 5 g
Dann wurden klinisch isolierte Helicobacter pylori in dem Blucella Nährmedium (Difco Co.,) und dem Skirrow-Medium unter micro-aerober Bedingung (Mischgas, bestehend aus 2 % Wasserstoff, 5 % Sauerstoff, 7 % Kohlendioxid, 86 Stickstoff (jeweils als Volumen-% ausgedrückt); relative Feuchtigkeit 90 %) bei 37 °C für fünf Tage kultiviert, um Helicobacter pylori zu separieren und zu züchten.
Nach dem Kultivieren wurden die kultivierten Bakterien gesammelt. Dann wurden sie im modifizierten Verfahren, basierend auf der Saito-Miura-Methodologie, vergewendet ("Preparation of transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment", Biochem. Biophys. Acta Band 72, S. 619–629 (1963)), unter Verwendung von Proteinase K (Merck) – 0,1 % SDS und unter Verwendung eines Isolierungsverfahrens für Nukleinsäure, und die genomischen DNAs davon wurden extrahiert. Extrahierte DNAs wurden vollständig verdaut mit dem Restriktionsenzym HindIII und wurden statistisch in den Vektor pGEM-3Z (Promega) kloniert.
Eine Sonde, umfassend ein DNA-Fragment, das spezifisch reagiert mit Helicobacter pylori wurde aus den so erhaltenen Klonen ausgewählt und wurde als Sonde HP-66 bezeichnet.
(2) Untersuchung der Spezies-Spezifität von DNA-Sonden, die aus Helicobacter pylori hergestellt sind
Die Reaktivitäten zwischen jeder Sonde, ausgewählt aus Beispiel 1 (1) und DNAs aus verschiedenen verursachenden Stämmen für infektiöse Erkrankungen wurden gemäß dem folgenden Verfahren getestet.
Zuerst wurden die betreffenden Stämme für den Test, die klinisch isolierten Stämme und die hinterlegten Stämme, die jeweils in Tabelle 2 aufgeführt sind, gesammelt. In Tabelle 2 ist humane genomische DNA humane genomische DNA, die erhalten wurden aus den humanen Leukozyten einzelner gesunder erwachsener Männer (30 Jahre alt), während die Kontrolle Escherichia coli K12, Stamm JM109 mit den Plasmid pGEM-3Z (Seikagaku Kogyo) ist.
TABELLE 2
Abkürzungen:

ATCC:

American Type Culture Collection (Maryland, USA)

NYSDH:

New York State Department of Health (Albany, New York, USA)

CIP:

Collection of the Institute Pasteur (Paris, Frankreich)

TIMM:

Teikyo University Institute of Medical Mycology (Tokio, Japan)

Chromosomale DNAs in jedem Stamm wurden gemäß des Verfahrens von Beispiel 1 (1) isoliert für die Spezies, die zu der Helicobacter-Gattung gehören, welche in Tabelle 2 aufgeführt ist und entsprechend der Saito-Miura-Methodologie (supra) unter Verwendung lytischer Enzyme (Lysostaphyn (Sigma), Lysozym (Sigma), Acetylmuramidase SG (Seikagaku Kogyo)) für die anderen Stämme.
Proben zur Dot Blot-Hybridisierung wurden erhalten durch punktuelles Auftragen einer bestimmten Menge (z.B. 0,1 μg/5 μl) der extrahierten DNAs auf Nylonfilter (Pauldyne) und Auswählen Alkali-denaturierter DNAs.
Proben humaner genomischer DNA wurden hergestellt durch Verwenden der früher erhaltenen humanen Leukozyten entsprechend Saito-Miura-Methodologie (supra).
Auf der anderen Seite wurden die Kontrollen hergestellt durch Verwenden von Escherichia coli K-12, JM109, welche das Plasmid pGEM-3Z (Promega) aufweisen und verwendet wurden zum Klonieren der Sonden, im Herstellungsverfahren der Plasmid-DNA, auf welche im folgenden Beispiel 2 (1) Bezug genommen wird.
Dann wurde mit jeder Probe gemäß dem Handbuch von Maniatis (T. Maniatis, et al., "Molecular Cloning (A Laboratory Manual)", Cold Spring Harbor Laboratory (1982)), über Nacht Hybridisierung durchgeführt, unter der Bedingung von 45 Formamid (Merck), 5 × SSC und 42 °C, unter Verwendung von DNA-Sonden, welche hergestellt werden aus Helicobacter pylori und markiert waren mit Digoxigenin-11-dUTP (Boehringer Mannheim).
Nach der Hybridisierung über Nacht wurden die Proben zweimal gewaschen mit 0,1 × SSC, 0,1 % SDS für 20 Minuten bei 55 °C, wurden dann farbentwickelt und nachgewiesen mit Anti-Dig-ALP-Konjugaten (Boehringer Mannheim) und Hybridisierungs-Spezifitäten darauf sind bestätigt worden.
Experimentelle Ergebnisse der Reaktivitäten zwischen jeder Sonde und den DNAs von jedem der klinisch isolierten Stämme sind in 2 gezeigt. Dann wurde die Positionsbeziehung zwischen der Vertiefung in der Platte mit Vertiefungen und Proben (geblottete Stamm-DNAs), die darauf zu blotten sind, in 1 gezeigt. Die angegebenen Positionszahlen in der schematischen Ansicht der Platte mit Vertiefungen (well-plate), die in 1 gezeigt sind, entsprechen nämlich den Proben (Stamm)-Zahlen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind.
Wie aus den Reaktionsergebnissen, die in 2 gezeigt sind, ersichtlich ist, reagierten alle getesteten Sonden nur mit DNAs von Helicobacter pylori (Stämme Nr. 1 und 2), reagierten demgemäß jedoch nicht (hybridisierten nicht) mit DNA aus Stämmen, die zur Helicobacter-Gattung gehörten, ausgenommen Helicobacter pylori, wodurch ihre Spezifitäten bestätigt worden sind.
Beispiel 2: Analyse der Basensequenz
Die Basensequenz der DNA-Sonde, deren Spezies-Spezifitäten in Beispiel 1 bestätigt worden sind, wurde entsprechend dem folgenden Verfahren sequenziert.
(1) Herstellung von Plasmid-DNA
Escherichia coli K-12, JM109, umfassend pGEM-3Z (Promega), darin eingebaut subklonierte Insertionsfragmente (die zu sequenzieren sind), wurde in 5 ml Luria-Bactani Medium (Bacto-trypton, 10 g/1 I; Bacto-Hefeextrakt, 5 g/1 I; NaCl, 10 g/1 I; pH-Wert 7,0, eingestellt mit 5N NaOH) inokuliert und wurde über Nacht kultiviert.
Kulturflüssigkeit wurde zentrifugiert (5000 UpM, 5 min.) und die Bakterien wurden gesammelt. 100 μl Lösung von 50 mM Glucose/25 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0)/10 mM EDTA, enthaltend 2,5 mg/ml Lysozym (Sigma) wurden zugegeben zu den Präzipitaten und sie wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten belassen. 0,2 M NaOH-Lösung, enthaltend 1 % Natriumdodecylsulfat (Sigma) wurden zu der so erhaltenen Suspension gegeben und sie wurden gemischt. 150 μl 5M Kaliumacetatlösung (pH-Wert 4,8) wurde weiterhin hierzu zugegeben, dann wurden sie gemischt und wurden mit Eis für 15 Minuten gekühlt.
Eine Gemischlösung aus Wasser und Phenol/Choroform (CHCl₃) (Volumenverhältnis von Wasser: Phenol/Chloroform = 1:1) wurde zugegeben bis zu einem äquivalenten Volumen Überstand, erhalten durch Zentrifugation (15.000 UpM, 15 min.) der gekühlten Lösung, und es wurde gemischt. Das doppelte Volumen Ethanol wurde zu dem Überstand, der aus einer solchen gemischten Lösung erhalten wurde, zugegeben, dann wurden sie gemischt und Präzipitate wurden erhalten durch weitere Zentrifugation (12.000 UpM, 5 min.). Diese Präzipitate wurden in 100 Lösung von 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5)/0,1 mM EDTA gelöst, dann wurden weiterhin 10 mg/ml RNaseA (Sigma)-Lösung hierzu zugegeben und sie wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten belassen.
300 μl 0,1 M Natriumacetatlösung (pH-Wert 4,8) wurden zu einem solchen Präparat gegeben, dann wurde das äquivalente Volumen der Gemischlösung, bestehend aus Wasser und Phenol/Chloroform (CHCl₃) (Volumenverhältnis von Wasser: Phenol/Chloroform = 1:1) hierzu zugegeben und sie wurden gemischt. Das doppelte Volumen Ethanol wurde weiterhin zu dem Überstand zugegeben, der aus einer solchen gemischten Lösung erhalten wurde, und Präzipitate wurden erhalten. DNA-Proben wurden hergestellt durch Trocknen dieser Präzipitate und ihr Lösen in 10 μl destilliertem Wasser.
Vorbehandlung zum Sequenzieren
Die Vorbehandlung zum Sequenzieren wurde mit dem AutoRead^TM-Sequenzierungskit (Pharmasia) durchgeführt.
Die Konzentration von DNA für ein Templat wurde eingestellt auf 5–10 μg in 32 μl Lösung. 32 μl Templat-DNA-Lösung wurden in 1,5 ml Miniröhrchen (Eppendorf) übergeführt, dann wurden 8 μl 2M NaOH-Lösung hierzu zugegeben und sie wurden vorsichtig gemischt. Nach leichter Zentrifugation wurden sie für 10 Minuten bei Raumtemperatur belassen.
7 μl 3M Natriumacetat (pH-Wert 4,8) und 4 μl destilliertes Wasser wurden hierzu zugegeben, dann wurden weiterhin 120 μl Ethanol zugegeben und sie wurden gemischt und wurden für 15 Minuten auf Trockeneis belassen. DNAs, die durch 15-minütige Zentrifugation präzipitierten, wurden gesammelt und Überstände wurden vorsichtig entfernt. Die so erhaltenen Präzipitate wurden mit 70 % Ethanol gewaschen und wurden für 10 Minuten zentrifugiert. Dann wurden die Überstände vorsichtig erneut entfernt und die Präzipitate wurden unter dem verringerten Druck getrocknet.
Präzipitate wurden gelöst in 10 μl destilliertem Wasser, dann 2 μl Fluoreszenzprimer (Fluorescent Primer, M13 Universal Primer; 5'-Fluorescein-d[CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO.: 1)]-3' (1,6 pmol/μl; 0,42 A₂₆₀ Einheit/ml); M13-Reverser Primer, 5'-Fluorescein-d[CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO.: 2)]-3' (2,1 pmol/μl; 0,42 A₂₆₀ Einheit/ml)] (0,42 A₂₆₀ Einheit/ml, 4 ~ 6 pmol) und 2 μl Annealingpuffer wurden hierzu zugegeben und sie wurden vorsichtig gemischt.
Nach leichter Zentrifugation wurden sie bei 65 °C für 5 Minuten erhitzt, dann wurden sie rasch auf eine Temperatur von 37 °C gebracht und wurden bei der Temperatur für 10 Minuten gehalten. Hiernach wurden sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten oder mehr belassen und wurden leicht zentrifugiert. Dann wurden die Proben hergestellt indem hierzu 1 μl Elongationspuffer und 3 μl Dimethylsulfoxid gegeben wurden.
Vier Probenkleingefäße (Mini-Tubes) sind gekennzeichnet worden mit den Einzelsymbolen "A", "C", "G" oder "T" und entsprechend des aufgeschriebenen Symbols wurden 2,5 μl von Gemisch A (ddATP, gelöst zusammen mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP), Gemisch C (ddCTP, gelöst zusammen mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP), Gemisch G (ddGTP, gelöst zusammen mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP) oder Gemisch T (ddTTP, gelöst zusammen mit dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in jedes Röhrchen gegossen. Jede Lösung wurde auf Eis gehalten bis zur Verwendung und die Lösung wurde bei 37 °C für 1 Minute oder mehr erhitzt, wenn sie tatsächlich verwendet wurde.
2 μl verdünnte T7DNA-Polymerase (Pharmacia; 6–8 Einheiten/2 μl) wurden zu jeder DNA-Probe gegeben und es wurde vollständig gemischt, indem pipettiert wurde oder vorsichtig gemischt wurde. Unmittelbar nach Abschluss des Mischens wurden jeweils 4 μl von jeder dieser Gemischlösungen in die jeweilige dieser vier vorgewärmten Mischlösungen gegeben. Zum Zeitpunkt des Zugebens dieser Gemischlösungen wurden frische Spitzen verwendet.
Die Lösung wurde für 5 Minuten bei 37 °C erwärmt, dann wurden 5 μl Terminierungslösung, gebunden an den zuvor angegebenen AutoRead^TM Sequenzierungskit (Pharmasia), in jede Reaktionslösung gegeben. Frische Spitzen wurden ebenfalls für dieses Zugabeverfahren verwendet.
Die Lösung wurde für zwei bis drei Minuten bei 90 °C erwärmt und wurde unmittelbar auf Eis abgekühlt. 4–6 μl/Bande der Lösung wurden für die Elektrophorese verwendet.
(3) Sequenzieren der Basensequenz
Die Basensequenzen der Sonden, die in Beispiel 1 offenbart sind, die spezifisch für Helicobacter pylori sind, wurden mit dem A.L.F.-DNA-Sequencer-System (Pharmacia) unter einer Elektrophoresebedingung von 45 °C für 6 Stunden sequenziert.
Als ein Ergebnis davon wurde die Basensequenz der Sonde SP-66 (SEQ ID NR. 10) aufgeklärt.
(Industrielle Anwendbarkeit)
Entsprechend den Sonden der vorliegenden Erfindung kann Helicobacter pylori direkt nachgewiesen werden und kann rasch/exakt identifiziert werden ohne Verwendung eines invasiven medizinischen Instruments und Züchten von Bakterien. Das heißt, entsprechend der Diagnose, unter Verwendung der vorliegenden Sonden, würde die Nachweisrate deutlich verbessert werden und die Bakterien können identifiziert werden mit einzelnen Probekörpern, wobei die Zeit, die erforderlich ist zur Diagnose, auf etwa ein bis zwei Tage verringert werden wird. Daher wird eine effektive Therapie planbar sein in dem frühen Stadium der Erkrankung und kann unmittelbar beginnen.
Da die Basensequenzen der vorliegenden Sonden, die spezifisch für DNAs von Helicobacter pylori sind, das eng verbunden mit humanen Erkrankungen des Verdauungstraktes ist, aufgeklärt worden sind, können diese Sonden künstlich hergestellt werden. Weiterhin können verursachende Bakterien-DNAs in dem klinischen Probekörper mit PCR-Techniken amplifizieren, unter Verwendung von Primern, die hergestellt werden unter Verwendung eines Teils der analysierten Basensequenzen, wobei als ein Ergebnis davon Helicobacter pylori schnell nachgewiesen wird und die vorliegenden Sonden können daher praktisch in der Diagnose verwendet werden.
Weiterhin werden durch Vergleichen der Basensequenzen von Genom-DNAs in der klinischen Probe mit denjenigen, die durch die vorliegende Erfindung analysiert werden, die verursachenden Bakterienspezies von Erkrankungen des Verdauungstraktes rasch identifiziert werden.
Wie oben angegeben, werden gemäß der vorliegenden Erfindung Proben, die als spezifisch für Helicobacter pylori erachtet werden, bereitgestellt und ausgezeichnete Anwendbarkeiten davon werden ebenfalls als ein Leitfaktor zum Herstellen von PCR-Primern und als eine Standardsequenz, die geeignet ist zum Vergleich mit genomischen DNAs in den klinischen Proben, erwartet. Die vorliegende Erfindung kann weiterhin einen Effekt zur Bereitstellung wertvoller Hinweise zum Herstellen und Entwickeln der anderen geeigneten Sonden bieten, die spezifisch für DNAs von Helicobacter pylori sind, das das verursachende esBakterium der Verdauungstrakterkrankungen ist. Dann werden, da die Basenquenzen, die in der vorliegenden Erfindung offenbart sind, erhalten wurden durch statistisches Klonieren der genomischen DNAs von klinisch isolierten Stämmen, die Verwendbarkeiten der Basensequenzen der vorliegenden Erfindung auf komplementäre Stränge davon ausgedehnt.
Es versteht sich natürlich, dass DNAs der Wildstämme den mutierten Teil enthalten. Jedoch, was aus der Offenbarung der veranschaulichenden Beispiele oben ersichtlich ist, würden solche mutierte Teile nicht die Spezifität der vorliegenden Sonden als auch die Nützlichkeit für die klinische Anwendbarkeit davon beeinträchtigen (siehe z.B. die Verwendung hiervon zur Entwicklung von PCR-Primern).
Offenbare Sequenzen

Claims

Sonde, bestehend aus einem DNA-Fragment das die Nukleotidsequenz aufweist, die gegeben ist durch die SEQ ID Nr.:10 oder die Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu der in SEQ ID Nr.:10 angegebenen Sequenz.
Sonde nach Anspruch 1, worin die Sonde zusätzlich eine nichtradioaktive nachweisbare Markierung umfasst.
Verfahren zum Nachweisen von Helciobacter pylori in einer Probe, umfassend das Hybidisieren einer Sonde nach einem der Ansprüche 1–2 mit DNA aus der Probe.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Hybridisierungsbedingungen sind: Hybridisieren über Nacht bei 42°C, unter Verwendung von 45% Formamid und 5 × SSC; und zwei Waschungen für 20 min bei 55°C, unter Verwendung von 0,1 × SSC und 0,1% SDS.