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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes und im Wesentlichen
reines Säugerpolypeptid,
welches verschieden ist von bekannten Adreno-, Serotonin- und Dopamin-Rezeptoren
und welches zumindest auf den Membranen von Muskeln und Eosinophilen
in Säugern,
zum Beispiel in der Ratte, dem Meerschweinchen und dem Menschen,
vorliegt.
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Die
Erfindung betrifft auch:
Plasmide, enthaltend die Gene, welche
das Polypeptid codieren;
Wirtszellen, transformiert durch Gene,
welche das vorstehend erwähnte
Polypeptid codieren;
Nucleotidsonden, die mit den Genen, welche
das vorstehend erwähnte
Polypeptid codieren, hybridisieren können; und
polyclonale
und monoclonale Antikörper,
die gegen das vorstehend erwähnte
Polypeptid gerichtet sind und welche für die in-vitro-Diagnose verwendet
werden können.
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Eine
große
Vielzahl von Membranrezeptoren für
Hormone und Neurotransmitter ist aus einer einzelnen Polypeptidkette,
die sieben hydrophile Sequenzen enthält, aufgebaut und kann an G-Proteine
gekoppelt sein, die regulatorisch für die Guaninnucelotid-Bindung
sind welche bei der Aktivierung durch Agonisten oder Antagonisten
verschiedene Effektoren wie Enzyme oder Ionenkanäle stimulieren oder hemmen.
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Die
Familie der sieben Transmembrandomänen-Rezeptoren umfaßt solche
für Adrenalin
und andere Katecholamine, die adrenergen Rezeptoren und solche für Acetylcholin
und verwandte Muskarin-Liganden, die muskarinartigen cholinergen
Rezeptoren. Andere ähnliche
Proteine, die dieser wachsenden Familie angehören, sind solche für Serotonin,
für Dopamin,
für Tachykinine
und für
die Hyphophysen-Glycoproteinhormone, um
nur einige wenige zu erwähnen.
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Die
Existenz von atypischen adrenergen Rezeptoren (ARs) in Fettzellen,
in gastrointestinalen Geweben (Bianchetti und Manara, 1990) und
in Skelettmuskeln (Challiss et al., 1988) ist hinreichend belegt
worden. Atypische β-adrenerge
Rezep toren (β-ARs)
sind definiert als β-ARs,
die nicht als typische β-ARs
(β1-AR und β2-AR) mit
einer geringen β-AR-antagonistischen
Wirkung, welche das Propranolol (einem klassischen nicht-selektiven β-AR-Antagonisten)-Resistenz-Merkmal
aufweist, klassifiziert werden können.
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Beispielsweise
charakterisierten McLaughlin, MacDonald und Mitarbeiter die β-ARs im Rattendickdarm
(McLaughlin und MacDonald, 1990; MacDonald und Lamont, 1993; McKean
und MacDonald, 1995). Propranolol war ein schwacher Antagonist gegenüber Isoproterenol
und BRL-37344. Die Propranolol-Resistenzantworten von Isoproterenol
wurden durch Cyanopindolol bei einem pA2-Wert
von 7,12 unter Blockade der β1-
und β2-AR-Wirkungen
antagonisiert. Die Autoren berichteten, daß die Antworten auf Isoproterenol
im Rattendickdarm größtenteils
durch β3-AR
vermittelt wurden, wobei β1-AR
und β2-AR
einen geringen Anteil daran hatten (McKean und MacDonald, 1995).
Diese Beobachtung wird durch Ek et al., 1986, gestützt, welche β1- und β2-AR in Rattendickdarm-Membranen
durch [125I]-Pindolol-Bindungsstudien nachwiesen.
Folglich sind im Rattendickdarm zusätzlich zu β1- und β2-ARs vorwiegend β3-ARs vorhanden. Ähnlich wie
im Ileum des Meerschweinchens war Cyanopindolol als ein Antagonist
bei atypischen β-ARs
der Ratte wirksam, während
es als ein β1-
und β2-AR-Antagonist
mit einer β3-AR-agonistischen
Wirkung auf β3-ARs
im Menschen und der Maus wirkte (Blin et al., 1993).
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Die
meisten der pharmakologischen Merkmale der atypischen β-ARs können durch
eine β3-AR-Aktivität erklärt werden.
Jedoch ist der Mangel an β3-AR-Transkripten in Skelettmuskeln
oder das Fehlen von heterogenen Antworten in vaskulären glatten
Muskeln immer noch ungeklärt,
was die Komplexität
des Fachgebiets der Rezeptoren zeigt.
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Die
Erfindung beantwortet eine ungelöste
Frage im Hinblick auf die Existenz eines Polypeptids mit einer Rezeptoraktivität, welche
sich von derjenigen der β3-adrenergen
Rezeptoren unterscheidet. In der Tat gewährt sie Zugang zu einer neuen
Rezeptorklasse, welche zumindest in Muskeln und in Eosinophilen
vorkommt und Transmembrandomänen
aufweist und eine Signaltransduktionsfunktion besitzen kann.
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Die
Erfinder haben nun unerwartet festgestellt, daß in Membranen von glatten
Muskeln des Rattendickdarms ein nicht-Adreno-, nicht-Serotonin-
und nicht- Dopamin-Rezeptor
vorhanden ist, der zumindest die Hemmung eines depolarisierten Dickdarmtonus
vermittelt.
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Der
Gegenstand der Erfindung ist ein im Wesentlichen reines Säugerpolypeptid,
das Stellen enthält, welche,
wenn diese Stellen an der Oberfläche
einer Zelle exponiert werden, in der Lage sind, Iodocyanopindolol
(ICYP) unter Blockade von α-, β1-, β2- und β3-AR, Serotonin-5-HT1A- und Serotonin-5-HT1B-Rezeptoren zu
binden, wobei die Bindung saturierbar und reversibel ist und unter
Stereoselektivität
durch einen β-adrenergen
Rezeptor-Agonisten, SM-11044, aber nicht durch Isoproterenol, Norepinephrin,
Epinephrin, Serotonin, Dopamin oder BRL-37344 ersetzt werden kann
und nicht durch Propranolol blockiert wird, wobei das Polypeptid
(1) ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30–40 kDa bei der Markierung
mit 125I-Iodocyanopindolol nach einer Photoaffinitätsmarkierung
und der Auftrennung durch Elektrophorese und ein scheinbares Molekulargewicht
von etwa 60–80
kDa in einem Western-Blot aufweist, und wobei (2) durch Säurespaltung
ein Fragment erzeugt wird, das die folgende Formel aufweist: DPX1FFQHRIHX2FSIFNX3, worin X1 die Bedeutung
S (SEQ ID NO: 5) oder X (SEQ ID NO: 6) hat, X2 die
Bedeutung V (SEQ ID NO: 6) oder W (SEQ ID NO: 5) hat, und X3 die Bedeutung S (SEQ ID NO: 5) oder H (SEQ
ID NO: 6) hat, wobei das Polypeptid zumindest auf den Membranen
von Muskeln und Eosinophilen vorliegt und ein nicht-adrenerger Rezeptor
ist.
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Der
neue nicht-adrenerge Rezeptor weist die folgenden Affinitäten für verschiedene β3-AR-Agonisten und
-Antagonisten auf:
SM-11044 stimuliert im Ileum des Meerscheinchen
die Relaxation eines durch KCl induzierten Tonus, wobei es eine
größere Wirksamkeit
als bei der Lipolyse in weißen
Fettzellen der Ratte besitzt. SM-11044 und BRL-35135A, ein wirksamer β3-AR-Agonist,
weisen die zusätzliche
Eigenschaft auf, daß sie
die durch Leukotrien B4 induzierte Chemotaxis von Eosinophilen im
Meerscheinchen hemmen (Sugasawa und Morooka, 1992a; Sugasawa und
Morooka, 1992b), während
Isoproterenol und BRL-37344 keine solche Wirkung zeigten (Sugasawa
und Morooka, 1992a). Diese Hemmung wurde durch den nicht-selektiven β-AR-Antagonisten
Propranolol nicht beeinflußt,
aber wurde durch Alprenolol, einem β1- und β2-AR-Antagonisten/β3-AR-Partialagonisten,
antagonisiert.
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Obwohl
der Rattendickdarm zusätzlich
zu β2-AR
zusammen mit einer kleinen Population von β1-AR (Arunlakshana O. et al.,
1959) tatsächlich β3-AR enthält (Bensaid
M. et al., 1993), weist die vorliegende Erfindung zweifellos die
Existenz einer neuen funktionellen Bindungsstelle im Rattendickdarm
nach. Diese Stelle wurde mittels Ligandenbindung und Photoaffinitätsmarkierung
charakterisiert, wobei ein neues Bindungsprotein nachgewiesen wurde,
welches hierin als Ro-SMBP (SM-11044-Bindungsprotein oder Nagetier-SM-Bindungsprotein)
bezeichnet wird.
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Das
neue nicht-adrenerge SM-Bindungsprotein ist auch in menschlichen
Muskeln (glatten und gestreiften) nachgewiesen worden (Hu-SMBP)
und enthält
zumindest die Sequenz SEQ ID NO: 1.
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Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform
besteht das Protein aus SEQ ID NO: 14.
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Das
Protein enthält
eine hydrophobe C-terminale Region aus 356 Resten, welche bis zu
neun Transmembranregionen enthalten kann.
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Die
Erfindung betrifft auch eine isolierte und gereinigte Nucleinsäure, die
einen Säugetier-Rezeptor, wie
vorstehend definiert, und Fragmente davon codiert.
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Im
Menschen schließt
die codierende Sequenz mindestens SEQ ID NO: 2 ein.
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Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform
besteht die codierende Sequenz aus SEQ ID NO: 13, welche der SMBP-cDNA
entspricht.
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Die
SEQ ID NO: 13 umfaßt
insbesondere die folgenden einmaligen Restriktionsstellen: BstU
I, Hha I, HinP I, Ava I, Sma I, Xma I, BsaA I, Apa I, Ban II, Bsp120
I, Eco0109 I, Sca I, Xmn I, Dra I, Nsi I, Ppu10 I, Acc65 I, Ban
I, Kpn I, Bsp1407 I, Spe I, BspD I, Cla I, Hinf I, Tfi I, Avr II,
Drd I, Esp3 I, Bpm I, PflM I, Bsm I, Alu I, BceF I, Bgl II, BstY
I, ApaL I, Age I, BsrF I, Nsp I, Nsp7524 I und NspC I, so wie in
den 19, 20 und 21 angeordnet.
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Diese
Sequenz codiert ein Polypeptid von 576 Aminosäureresten, welches eine hydrophile
N-terminale Region von 220 Resten und eine hydrophobe C-terminale
Region von 356 Resten enthält.
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Die
Nucleinsäuresequenzen
in verschiedenen Säugetieren
hybridisieren mindestens mit:
- – einem
900 bp-Fragment von SEQ ID NO: 3, oder
- – einem
300 bp-Fragment von SEQ ID NO: 4.
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Diese
Fragmente sind nützlich
für den
Nachweis des Gens, welches den vorliegenden neuen nicht-adrenergen
Rezeptor codiert.
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt auch cDNA-Clone, dadurch
gekennzeichnet, daß sie
ein Sequenzfragment umfassen, welches den erfindungsgemäßen nicht-adrenergen
Rezeptor codiert.
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Gemäß der Erfindung
umfaßt
der als 24.3 bezeichnete Clon 1,7 kb und schließt SEQ ID NO: 2 ein, wobei
er das vorliegende Hu-SMBP codiert.
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Die
Erfindung betrifft auch synthetische und nicht-synthetische Nucleotidsonden,
dadurch gekennzeichnet, daß sie
mit einer der Nucleinsäuren,
wie vorstehend definiert, oder mit deren komplementären Sequenzen
oder deren entsprechenden RNA hybridisieren, wobei diese Sonden
derart sind, daß sie
nicht mit den Genen oder der Boten-RNA, welche β-adrenerge Rezeptoren codieren,
hybridisieren.
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Die
Sonden sind beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus den vorstehend
erwähnten
900 bp (SEQ ID NO: 3)- und 300 bp (SEQ ID NO: 4)-Fragmenten und
aus SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12, wahlweise markiert unter Verwendung
eines Markers, wie einem radioaktiven Isotop, einem geeigneten Enzym
oder einem Fluorochrom, ausgewählt.
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Die
SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12 können
als Primer für
die Amplifikation einer der vorliegenden Nucleinsäuresequenzen
verwendet werden.
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Die
Hybridisierungsbedingungen für
die Sonden von mehr als 100 Nucleotiden sind wie folgt definiert: 600
mM NaCl; 60 mM Na-Citrat; 8 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM Na-Phosphat;
1% Ficoll; 1% Polyvinylpyrrolidon; 1% Rinderserumalbumin; 40% Formamid;
0,2% SDS; und 50 μg/ml
Lachssperma-DNA.
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Die
Erfindung betrifft auch ein(en) rekombinantes(n) Plasmid, Cosmid
oder Phagen, insbesondere für die
Clonierung und/oder Expression, enthaltend eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz,
welche an einer der Clonierungsstellen davon (welche für dessen
Replikation nicht essentiell ist) inseriert ist.
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Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform
umfaßt
das Plasmid ferner einen Replikationsursprung für die Replikation in einer
Wirtszelle, mindestens ein Gen, dessen Expression eine Selektion
der Wirtszelle, welche mit dem Plasmid transformiert ist, ermöglicht,
und eine regulatorische Sequenz, die einen Promotor einschließt, welcher
die Expression eines Polypeptids mit einer nicht-adrenergen Aktivität, wie vorstehend
definiert, in der Wirtszelle erlaubt.
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Gemäß einer
vorteilhaften Anordnung dieser Ausführungsform ist das Plasmid
pcDNA3, worin die SEQ ID NO: 2 in einen Polylinker inseriert ist,
wobei das Plasmid bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
[National Collection of Microorganism Cultures] (CNCM, unterhalten
durch das Pasteurinstitut) am 10. Dezember 1996 unter der Nummer
I-1795 hinterlegt wurde.
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Die
Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, welche durch ein rekombinantes
Plasmid, wie vorstehend definiert, umfassend die Regulationselemente,
welche die Expression der Nucleotidsequenz, welche das erfindungsgemäße Polypeptid
codiert, in diesem Wirt ermöglicht,
transformiert ist.
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Eine
solche Zelle ist zur Expression eines erfindungsgemäßen SMBP
befähigt.
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Gemäß einer
vorteilhaften Ausführungsform
besteht die Wirtszelle insbe sondere aus Säugerzelllinien.
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Die
Erfindung betrifft auch Antikörper,
welche spezifisch gegen das vorliegende Polypeptid gerichtet sind,
wobei diese Antikörper
derart sind, daß sie
weder bekannte α-
oder β-Adreno-
noch Serotonin- oder Dopamin-Rezeptoren erkennen.
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Vorteilhafterweise
stellt der erfindungsgemäße neue
nicht-adrenerge Rezeptor ein Hilfsmittel für die Selektion eines Liganden,
welcher an der Aktivierung oder an der Hemmung dieser Rezeptoren
beteiligt ist, dar.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Testen einer Substanz
auf eine Agonist- oder Antagonist-Aktivität gegenüber einem erfindungsgemäßen Polypeptid,
wobei das Verfahren umfaßt:
- – Inkontaktbringen
der Substanz mit Gewebe-Membranproteinen oder einer transformierten
Wirtszelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert,
unter Bedingungen, welche eine Bindung zwischen den Polypeptid-Bindungsstellen und
einem Agonisten oder einem Antagonisten dafür erlauben, und
- – Messen
eines geeigneten Transduktionssignals.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer
Verbindung für ein
erfindungsgemäßes Polypeptid,
wobei das Verfahren umfaßt:
- – Transformieren
einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz,
welche den vorliegenden Rezeptor codiert,
- – Züchten der
transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression
des Rezeptors erlauben, der durch die Nucleotidsequenz codiert wird,
und den Transfer des exprimierten Rezeptor-Polypeptids in die Membran
der transformierten Wirtszelle, so daß die Transmembransequenzen
des Rezeptor-Polypeptids in die Zellmembranen der transformierten
Wirtszelle eingebettet werden,
- – Inkontaktbringen
der transformierten Wirtszelle mit der Verbindung, und
- – Messen
der Menge der Verbindung, die an das Rezeptor-Polypeptid gebunden
ist.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer
Verbindung für ein
erfindungsgemäßes Polypeptid,
wobei das Verfahren umfaßt:
- – Extrahieren
von Membranproteinen, die dem vorliegenden Rezeptor-Polypeptid entsprechen,
aus geeigneten Geweben oder Zellen wie Muskeln,
- – Inkontaktbringen
der Membranproteine mit der Verbindung, und
- – Messen
der Menge der Verbindung, die an das Rezeptor-Polypeptid gebunden
ist.
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Die
funktionelle Rolle dieses Polypeptid-Rezeptors würde die Relaxation von depolarisierten
intestinalen glatten Muskeln oder die Hemmung der Chemotaxis von
Eosinophilen einschließen.
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Ein
spezifischer Agonist für
diesen neuen Rezeptor zeigt mindestens eine therapeutische Potentialität bei gastrointestinalen
Erkrankungen, welche auf einem depolarisierten Tonus basieren, bei
konstitutionsallergischem Asthma und bei dem Hypereosinophilie-Syndrom,
das auf einer Anreicherung von Eosinophilen basiert.
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Somit
ermöglicht
der vorliegende Polypeptid-Rezeptor die Entwicklung von Arzneistoffen
für zumindest
gastrointestinale Erkrankungen, die auf einem depolarisierten Tonus
basieren, für
konstitutionsallergisches Asthma und für das Hypereosinophilie-Syndrom.
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Neben
den vorstehenden Anordnungen umfaßt die Erfindung auch andere
Anordnungen, welche aus der folgenden Beschreibung deutlich werden,
worin auf die beigefügten
Zeichnungen verwiesen wird, wobei bedeuten:
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1:
Präparative
SDS-PAGE, gefolgt von einer Autoradiographie mit 50 mg solubilisierten
Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 0,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin
und 20 μM
Propranolol.
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2:
Analytische chemische Spaltung von SMBP. Das isolierte und markierte
Protein von 34 kDa wurde mit destilliertem Wasser (Bahn 1), 70%iger
Ameisensäure
(Bahn 2), 10% Cyanbromid in 70%iger Ameisensäure (Bahn 3), 75%iger Trifluoressigsäure (Bahn
4) oder 10% Cyanbromid in 75%iger Trifluoressigsäure (Bahn 5) für 24 h bei
Raumtemperatur inkubiert, durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt,
gefolgt von einer Autoradiographie. Die Pfeile zeigen markierte
8 kDa-, 10 kDa- und 12 kDa-Fragmente.
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3:
Präparative
Cyanbromid-Spaltung von SMBP. Das isolierte und markierte Protein
von 34 kDa wurde mit 10% Cyanbromid in 70%iger Ameisensäure für 24 h bei
Raumtemperatur inkubiert. Ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde
auf einer Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einer Autoradiographie.
Die Pfeile zeigen markierte 8 kDa-, 10 kDa- und 12 kDa-Fragmente.
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4:
Analytische chemische Spaltung von SMBP. 4a:
die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden mit destilliertem
Wasser (Bahn 1), 70%iger Ameisensäure (Bahn 2) oder 1% Cyanbromid
in 70%iger Ameisensäure
(Bahn 3) für
24 h bei Raumtemperatur inkubiert, oder 4b:
die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden mit destilliertem
Wasser (Bahn 1) oder 70%iger Ameisensäure (Bahn 2) für 72 h bei
37°C inkubiert,
durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt und einer Autoradiographie
unterworfen.
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5:
Präparative
Säurespaltung
von SMBP. Das isolierte und markierte Protein von 34 kDa wurde mit
70%iger Ameisensäure
für 72
h bei 37°C
inkubiert. Ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf einer Tricin-SDS-PAGE
aufgetrennt, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Pfeile zeigen
ein markiertes 8 kDa-Fragment.
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6:
Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des photoaffinitätsmarkierten und durch Ameisensäure gespaltenen
8 kDa-Fragments. Das aus Tricin-SDS-PAGE-Gelen isolierte Fragment wurde durch
eine Umkehrphasen-HPLC weiter gereinigt. Das Fragment wurde mit
einem linearen Gradienten von 30–98% Puffer B innerhalb von
120 min aus der C4-Säule
eluiert (------). Das Radioaktivitätsprofil für das markierte 8 kDa-Fragment
wurde dargestellt (•).
Basierend auf der Menge der gewonnenen Radioaktivität betrug
die Rückgewinnung
aus der HPLC-Säule
91,6%.
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7:
Enzym-Immunoassay (ELISA) von Antiserum (•), präimmunisiertem Serum (O) oder
einem affinitätsgereinigten
Antikörper
(∎, α8-Antikörper) auf
einer mit dem freien Peptid beschichteten Platte. Der polyclonale
Kaninchen-Antikörper
wurde gegen das synthetische Peptid, welches der N-terminalen Sequenz
des 8 kDa-Fragments entspricht, hervorgerufen.
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8:
Immunpräzipitation
des solubilisierten, photoaffinitätsmarkierten SMBP. Solubilisierte
Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 1,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin,
20 μM Propranolol
und 1,1 mM Ascorbinsäure,
wurden mit 1:200 verdünntem,
präimmunisiertem
Serum (Bahn 1) oder 10 μg α8-Antikörper (Bahn
2) immunpräzipitiert.
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9:
Western-Blot der Rattendickdarm-Membranproteine. Bahn 1 zeigt die
Kontrolle (es wurde 1:200 verdünntes,
präimmunisiertes
Serum verwendet). Die 70 kDa-Bande wurde durch 2 μg/ml α8-Antikörper (Bahn
2) nachgewiesen. Der Nachweis wurde gehemmt, wenn der Antikörper mit
10 μg/ml
des spezifischen Peptids vorinkubiert wurde (Bahn 3).
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10:
Beziehung zwischen der Wirksamkeit von β-AR-Agonisten im Rattendickdarm
und in weißen Fettzellen
in Gegenwart von 10 μM
Phentolamin und 1 μM
Propranolol. In der Figur ist die lineare Regressionsgerade der
vier Agonisten, mit Ausnahme von SM-11044, dargestellt (r = 0,97,
p < 0,05). Der
Korrelationskoeffizient, wenn mit SM-11044 berechnet, war nicht
signifikant (r = 0,87, p > 0,05).
Die Daten geben die pD2-Mittelwerte ± SEM (aus Tabelle 1) wieder.
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11:
Zeitlicher Verlauf der Assoziation (O, durchgezogene Linie) und
der Dissoziation (•,
gestrichelte Linie) der spezifischen Bindung von 1 nM [125I]-ICYP
an Rattendickdarm-Membranen in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol.
Die Reversibilität
der Bindung wurde durch die Zugabe von 100 μM SM-11044 im Gleichgewichtszustand
(30 min) erreicht. Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei Experimenten,
welche in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
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12:
Gesamte unspezifische und spezifische Bindung von [125I]-ICYP
an Rattendickdarm-Membranen in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol.
Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 100 μM SM-11044
bestimmt. Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei Experimenten wieder,
die in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden. Das eingefügte Bild
zeigt ein Scatchard-Diagramm der spezifische Bindung (r = 0,978,
p < 0,001). Der
Kd-Wert betrug 11,0 ± 0,95
nM, und der Bmax-Wert betrug 716,7 ± 21,12 fmol/mg Protein.
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13:
Ersetzen der spezifische Bindung von 1 nM [125I]-ICYP
an Rattendickdarm-Membranen durch (a) Katecholamine, 5-HT und (b)
Stereoisomere von SM-11044 in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol.
Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei bis vier Experimenten,
die in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
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14:
SDS-PAGE, gefolgt durch eine Autoradiographie, von solubilisierten
Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 1,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und
verschiedenen Kompetitoren. Bahn 1: Kontrolle; Bahn 2: Ersatz durch
20 μM Propranolol;
Bahn 3: Ersatz durch 20 μM
Propranolol und 100 μM
BRL-37344; Bahn 4: Ersatz durch 20 μM Propranolol und 100 μM SM-11044.
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15:
Zweidimensionale SDS-PAGE, gefolgt durch eine Autoradiographie,
von solubilisierten Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert
mit 1,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart
von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol.
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16:
Trypsinspaltung der photoaffinitätsmarkierten
Rattendickdarm-Membranen.
Die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden ohne (Bahn
1) oder mit 50 μg
Trypsin (Bahn 2) für
24 h bei 37°C
inkubiert, durch eine Tricin-SDS-PAGE
aufgetrennt und einer Autoradiographie unterworfen.
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17:
Ersatz der spezifische Bindung von 1 nM [125I]-ICYP
an Ratten-Skelettmuskel-Membranen durch
SM-11044 und (–)-Isoproterenol
in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von zwei Experimenten,
welche in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
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18: Northern-Blot mit mehreren menschlichen
Geweben, welche mit der markierten 300 bp-Sonde hybridisiert wurden.
Waschen in 2× SSC,
0,05% SDS bei Raumtemperatur und Exponieren auf einem Hyperfilm
MP mit zwei Verstärkungsschirmen
bei –80°C für drei Tage.
(A) Die Northern-Blot-Hybridisierung wurde mit einer polyadenylierten
mRNA aus acht verschiedenen menschlichen glatten und gestreiften
Muskeln durchgeführt.
(B) Ähnliche
Analyse mit einer Vielzahl von nicht-muskulären Geweben (Herz, Gehirn,
Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Pankreas). Linke Seite: die Skala
gibt das Molekulargewicht des RNA-Markers in Kilobasen (kb) an.
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Die 19, 20 und 21 veranschaulichen
die Restriktionskarte von SEQ ID NO: 14 (alle Stellen: 19; ausschließlich einmalige Stellen: 20 und 21).
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22 veranschaulicht einen Sequenzvergleich
mit bekannten Proteinen (Arabidobsis-Protein, hMP70-Protein, p76-Protein,
D87444-Protein und Emp70-Protein).
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23 veranschaulicht (A) einen Vergleich
der Hydropathie-Profile (Kyte & Doolittle)
durch das GeneJockey Sequence Processor-Programm zwischen SMBP und
den homologen Proteinen D87444, Hu-p76, hMP70 und Emp70 aus Hefe
und dem Arabidobsis-Protein. (B) Vergleich der Hydropathie-Profile
(Kyte & Doolittle-Verfahren) der C-terminalen
hydrophoben Region zwischen SMBP und den homologen Proteinen D87444,
Hu-p76, hMP70 und Emp70 aus Hefe.
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24 veranschaulicht
die Sequenzen, die den hydrophoben Bereichen (Kästchen) entsprechen.
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25 veranschaulicht
die Immunpräzipitation
von mit [125I]-iodierten Zellmembranproteinen
durch den α8-Antikörper; Bahn
1: COS-Zellen, transfiziert mit einem Vektor, enthaltend den Angiotensin-Rezeptor AT2R;
und Bahn 2: COS-Zellen, transfiziert mit einem Vektor, enthaltend
die SMBP-Nucleotidsequenz.
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Beispiel 1: Isolierung
und Charakterisierung des vorliegenden Rezeptors in den Membranen
von glatten Muskeln im Rattendickdarm
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1) Materialien und Methoden
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SM-11044
((L)-Threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-[3-(4-fluorophenyl)propyl]-serin-pyrrolidinamid-hydrobromid)
und (±)-Cyanopindolol
wurden bei Sumitomo Pharmaceuticals (Osaka, Japan) synthetisiert. (–)-3-[125I]-Iodocyanopindolol ([125I]- ICYP) und (±)-3-[125I]-Iodocyanopindolol-Diazirin ([125I]-ICYP-Diazirin) wurden von Amersham
(Buckinghamshire, England) bezogen. Alle anderen Materialien hatten
Reagensqualität.
-
Präparation
der Rattendickdarm-Membranen
-
Tiefgefrorene
Rattendickdärme
(SD-Stämme,
männlich
und weiblich) wurden von Pel-Freeze Biologicals (Arkansas, USA)
bezogen. Die Membranen der glatten Muskeln im Dickdarm wurden präpariert,
wie im Wesentlichen bei Ek et al., 1986, beschrieben ist, wobei
die folgenden geringfügigen
Modifikationen vorgenommen wurden. Das Dickdarmsegment wurde in
einer eiskalten Tris-Salzlösung
(10 mM Tris/HCl, 154 mM NaCl (pH 7,4)) gewaschen und in Längsrichtung
aufgeschnitten, und die Schleimhaut wurde durch Reiben mit einem Objektträger auf
einer eiskalten Kunststoffplatte entfernt. Die Präparationen
der glatten Muskeln wurden mit einem Polytron-Homogenisator für 1 min
homogenisiert. Das Homogenat wurde durch eine Gaze filtriert und zentrifugiert
(1500 × g
für 20
min bei 4°C).
Der Überstand
wurde gesammelt und zentrifugiert (50.000 × g für 20 min bei 4°C). Das Pellet,
umfassend die Membranen, wurde in Tris-Salzlösung resuspendiert und bis
zum Gebrauch bei –80°C gelagert.
Die Proteinkonzentration wurde durch den Bio-Rad Protein-Test-Kit
(Bio-Rad, USA) bestimmt.
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Bindungstests
mit den Rattendickdarm-Membranen
-
Die
Sättigungsbindungsstudien
wurden in einem Endvolumen von 200 μl Tris-Salzlösung, enthaltend 50 μg Membranproteine
und verschiedene Konzentrationen (0,05–25 nM) von [125I]-ICYP,
in Gegenwart von 10 μM
Serotonin (5-HT), 10 μM
Phentolamin, 20 μM
(±)-Propranolol
und 1,1 mM Ascorbinsäure
(pH 7,4) durchgeführt,
um mögliche
5-HT-Rezeptoren, ARs bzw. die Oxidation von Katecholaminen zu blockieren.
Das [125I]-ICYP wurde nach der Entfernung
von Methylalkohol durch Druckluft, um einen Einfluß des Lösungsmittels zu
vermeiden, verwendet. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 30 min
in einem Schüttelwasserbad-Inkubator ausgeführt und
durch die Zugabe von 4 ml eiskalter Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen
Filtration unter Vakuum auf einem Whatman GF/B-Filter, welcher vorher
in Tris-Salzlösung,
enthaltend 0,1% Polyethylenimin (pH 7,4) eingeweicht wurde, beendet.
Die Filter wurden dreimal mit 4 ml eiskalter Tris-Salzlösung gewaschen, in
Kunststoffröhrchen
transferiert und in einem Gammazähler
gezählt.
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Photoaffinitätsmarkierung
der Rattendickdarm-Membranen
-
Die
Photoaffinitätsmarkierung
wurde in einem Endvolumen von 10 ml Tris-Salzlösung, enthaltend 50 mg der
Membranen, 0,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin,
ergänzt
mit 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin, 20 μM
(±)-Propranolol
und 1,1 mM Ascorbinsäure
(pH 7,4), durchgeführt.
Die Membranen wurden bei 37°C
für 60
min im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad-Inkubator
inkubiert. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 20 ml einer
eiskalten Tris-Salzlösung,
gefolgt von einer schnellen Zentrifugation (50.000 × g für 10 min
bei 4°C),
beendet. Die Membranen wurden in 2–3 ml desselben Puffers resuspendiert
und unter Kühlen
mit zirkulierendem Wasser während
10 min mit einer UV-Lampe bestrahlt (Guillaume et al., 1994). Die
markierten Membranen wurden mit 20 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung verdünnt und
zentrifugiert (50.000 × g
für 30
min bei 4°C). Die
markierten Membranen wurden unmittelbar vor der Elektrophorese in
SDS-Reduktionspuffer (5% SDS, 1 2β-Mercaptoethanol,
10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau, 50 mM Tris/HCl, pH 6,8) für 1 h oder
mehr bei Raumtemperatur denaturiert.
-
Präparative
SDS-PAGE und Extraktion der photoaffinitätsmarkierten Proteine
-
Die
präparative
SDS-PAGE wurde auf einem großformatigen
(160 mm Breite × 200
mm Höhe × 3 mm Dicke)
Polyacrylamidgel mit einem 12%igen Trenngel und einem 4%igen Sammelgel
(40% T, 2,6% C) unter reduzierenden Bedingungen im Wesentlichen
gemäß den Methoden
nach Laemmli, 1970, durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele in einen Plastikbeutel verpackt
und für
3 Tage bei 4°C
auf einem X-OMATTM AR-Film (Eastman Kodak
Co., USA) einer Autoradiographie unterworfen. Die photoaffinitätsmarkierten
Proteine wurden wie folgt durch passive Extraktion extrahiert. Die
radioaktive 34 kDa-Bande wurde ausgeschnitten und durch Zerdrücken unter
Verwendung einer 10 ml-Einmal-Plastikspritze (Terumo, Japan) in kleine
Stücke
von weniger als 3 × 3 × 3 mm3 zerkleinert. Die Gele wurden in ein doppeltes
Volumen von 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS (Extraktionspuffer),
eingetaucht und für
16 h bei 37°C
unter Rotieren inkubiert. Der Extrakt wurde unter Verwendung einer
SPIN-XII-Vorrichtung (Porengröße 0,45 μm, Costar,
USA) bei 1500 × g
für 30
min gewonnen. Die zurückbleibenden
Gelstücke
wurden erneut in ein doppeltes Volumen des Extraktionspuffers eingetaucht
und für
2 h bei 37°C
unter Rotieren inkubiert, und der Extrakt wurde gewonnen, wie vorstehend
beschrieben wurde. Die zwei Extrakte wurden vereinigt und unter
Verwendung einer Centripräp-10-
und einer Centricon-10-Vorrichtung (Amicon, USA) auf maximal 0,5
ml konzentriert und bei –20°C gelagert.
-
Chemische
Spaltung der Extrakte aus der präparativen
SDS-PAGE und Reinigung mittels HPLC
-
Das
photoaffinitätsmarkierte
34 kDa-Protein, welches aus der präparativen SDS-PAGE extrahiert
wurde, wurde unter Verwendung der Centricon-10-Vorrichtung zweimal
mit destilliertem Wasser gewaschen und durch einen Vakuumkonzentrator
gefriergetrocknet und anschließend
mit 200 μl
70%iger Ameisensäure
oder 10% CNBr/70%ige Ameisensäure
für 24
h bei Raumtemperatur oder 70%iger Ameisensäure für 72 h bei 37°C im Dunkeln
behandelt. Die gespaltenen Produkte wurden mit 500 μl destilliertem
Wasser verdünnt
und gefriergetrocknet. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.
Die gespaltenen Produkte wurden in SDS-Reduktionspuffer gelöst und durch
die Zugabe von Aliquots von 30% NaOH neutralisiert, bis die Färbung in
Blau umschlug, und durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele
wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Die markierten
Banden wurden ausgeschnitten, passiv extrahiert und durch Zentrifugation (ProSpinTM, Applied Biosystems, USA) auf PVDF-Membranen
geblotted. Die Membranen wurden dreimal mit 1 ml 20% Methanol gewaschen
um SDS und Salze zu entfernen. Die Fragmente wurden mit 200 μl 75% Hexafluoroisopropanol
extrahiert. Jede Elution wurde in einem Vakuumkonzentrator auf 20 μl eingedampft,
in 75 μl
DMSO und 75 μl
Ausgangspuffer (15% Acetonitril-15% Isopropanol-0,5% TFA; Puffer
A) gelöst
und auf eine C4-Umkehrphasensäule
(Aquapore Butyl-BU-300, 2,1 mm ID, 10 mm Länge, Applied Biosystems) aufgegeben.
Die Trennung erfolgte durch eine 120 min dauernde Gradientenelution
bei 40°C
mit 50% Acetonitril-50% Isopropanol, enthaltend 0,5% TFA (Puffer
B), in einer Durchflußrate
von 35 ml/min unter Verwendung eines Waters 625 LC-Systems. Der
Gradient reichte von 30% bis 98% Puffer B. Die Elution der Fragmente
wurde durch die Absorption bei 210 nm und 275 nm überwacht,
und die Elution der mit Iod radioaktiv markierten Produkte wurde
durch eine Gammazählung
der Fraktionen überwacht.
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Tricin-SDS-PAGE
-
Die
chemisch gespaltenen Fragmente wurden auf einem Tricin-Gelsystem
unter reduzierenden Bedingungen (Schägger H. et al., 1987) unter
Verwendung eines 18%igen Polyacrylamid-Trenngels, enthaltend 10,7%
Glycerin, aufgetrennt. Die Gele ließ man für 16 h altern, um den Abbau
der reaktiven chemischen Zwischenprodukte nach der Polymerisierung
zu ermöglichen.
-
Aminosäuresequenzierung
-
Die
Aminosäuresequenzbestimmung
erfolgte durch einen Edman-Abbau, 1967, mit einem Applied Biosystems
473A-Proteinsequenzanalysengerät.
Die Proben wurden auf präzyklisierte
Filter, beschichtet mit Polybren (Biobrene, Applied Biosystems),
aufgebracht, um die Proteinauswaschung zu verringern und die anfänglichen
Ausbeuten zu verbessern.
-
Antikörperherstellung
-
Der
Antikörper
wurde hergestellt, wie im Wesentlichen durch Guillaume et al. (Eur.
J. Biochem. 224 (1994), 761–770),
beschrieben wurde.
-
Kurz
zusammengefaßt,
wurden basierend auf den bestimmten Aminosäuresequenzen Peptide synthetisiert,
wobei ein Cysteinrest an den C-terminalen Rest angehängt wurde,
um die Kopplung an das Trägerprotein
(Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin,
KLH) zu erleichtern. Die synthetischen Peptide wurden über ihre
Cysteinreste an KLH konjugiert. 0,4 mg des Peptidkonjugats, suspendiert
in komplettem Freundschen Adjuvans, wurden intradermal einem Kaninchen
injiziert. Nachimpfungen wurden viermal in Abständen von 2 Wochen durch Injektion
von 0,2 mg des Peptidkonjugats, suspendiert in inkomplettem Freundschen
Adjuvans, verabreicht. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung
wurde das Antiserum aus Vollblut gewonnen.
-
Der
Antikörper
wurde durch eine Affinitätschromatographie
an einer Säule,
enthaltend das synthetische Peptid, gekoppelt an aktivierte Thiol-Sepharose-4B
(Pharmacia) über
einen Cysteinrest am C-Terminus, gereinigt, und der Antikörpertiter gegen
das freie Peptid ohne eine Konjugation an KLH wurde durch einen
ELISA bestimmt.
-
Immunpräzipitation
-
Insgesamt
wurden Mengen von 10 mg der Membranen mit 1,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin in
Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin, 20 μM
Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure
in 10 ml Tris-Salzlösung (pH
7,4) photoaffinitätsmarkiert.
Die Membranen wurden in einer Menge von 1 mg Membranprotein/ml Tris-Salzlösung, enthaltend
2% n-Octylglucosid (n-Octyl-β-D-glucopyranosid,
Sigma), für
2 h auf Eis unter gelegentlichem Mischen solubilisiert. Die solubilisierten
Proteine wurden durch Zentrifugation (200.000 × g, 30 min bei 4°C) von dem
unlöslichen
Material getrennt. Die Proteine wurden mit 8 M Harnstoff für 1 h bei
Raumtemperatur unter gelegentlichen Mischen behandelt und unter
Verwendung einer Centricon-10-Vorrichtung fünfmal mit
Tris-Salzlösung
gewaschen. Die solubilisierten Membranproteine wurden in 1 ml Tris-Salzlösung, enthaltend
0,1% Tween-20, gelöst
und mit 10 μg
Antikörper
und 50 μl
Protein A-Agarose-Kügelchen
(Boehringer-Mannheim, Deutschland) für 16 h bei 4°C unter Rotieren
inkubiert. Das Präzipitationsprodukt
wurde vorsichtig fünfmal
mit einer eiskalten Tris-Salzlösung,
enthaltend 0,1% Tween-20,
gewaschen und in SDS-Reduktionspuffer für mehr als 1 h bei Raumtemperatur
denaturiert. Die immunpräzipitierten
Proteine wurden einer 12%igen SDS-PAGE und anschließend einer
Autoradiographie unterworfen.
-
Western-Blot
-
Die
photoaffinitätsmarkierten
Membranen (40 μg
Protein) wurden durch eine 12%ige SDS-PAGE aufgetrennt. Der Elektrotransfer
der Proteine auf Nitrocellulose wurde im Wesentlichen gemäß Towbin
et al., 1979, mit einer Trans-Blot-SD-Apparatur (Bio-Rad) für 1 h bei
einer Stromstärke
von 1 mA/cm2 ausgeführt. Die Nitrocellulosemembranen
wurden dreimal mit Dulbecco's
phosphatgepufferter Salzlösung
(PBS), enthaltend 0,2% Tween-20, gewaschen und in PBS, enthaltend
5% entrahmtes Milchpulver und 0,2% Tween-20, für 1 h bei Raumtemperatur abgesättigt. Man
ließ den
Antikörper
(2 μg/ml
in PBS, enthaltend 1% entrahmtes Milchpulver und 0,2% Tween-20;
Puffer C) für
16 h bei 4°C
reagieren.
-
Nach
dreimaligem Waschen in Puffer C wurden die Nitrocellulosestreifen
für 45
min bei Raumtemperatur mit einem an Peroxidase konjugierten, affinitätsgereinigten
Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immuno-Research Laboratories,
USA) in einer Verdünnung
von 1:2500 in Puffer C inkubiert und dreimal in Puffer C gewaschen.
Nach dem Waschen in PBS, enthaltend 0,2% Tween-20, wurden die reaktiven
Banden mit einem ECL-Kit (Amersham, England) sichtbar gemacht. In
Inhibitionsexperimenten wurde der Antikörper für 2 h bei 37°C mit dem
freien Peptid in einer Konzentration von 10 μg/ml in Puffer C vorinkubiert.
-
2) Ergebnisse
-
Extraktion
des photoaffinitätsmarkierten
SMBP
-
Aus
600 glatten Muskeln des Rattendickdarms wurden 2,0 g Membranproteine
gewonnen. Die Ligandenbindungsaktivität von SMBP wurde durch [125I]-ICYP
unter Blockade der Adreno- und Serotonin-Rezeptoren abgeschätzt. Durch
eine Scatchard-Diagramm-Analyse wurde eine einzelne Klasse von Bindungsstellen mit
einer Dissoziationskonstante (Kd) von 7,22 ± 0,007 nM und einer maximalen
Anzahl an Bindungsstellen (Bmax) von 1,13 ± 0,071 pmol/mg Membranprotein
(zwei unabhängige
Experimente, durchgeführt
in doppelter Ausfertigung, ausgedrückt als Mittelwert ± SD) nachgewiesen.
-
Das
SMBP war zu hydrophob, um durch eine Säulenchromatographie wie eine
Umkehrphasen-HPLC mit einer C4-Säule
(Aquapore Butyl-BU-300, Applied Biosystems), Ionenaustauschchromatographie
(Aquapore Weak Anion AX-300, Applied Biosystems), Chromatofokussierung
(PBE 94 und Polybuffer 74, Pharmacia) oder Hydroxyapatitchromatographie
(BioGel HPHT, Bio-Rad) abgetrennt zu werden. Eine präparative SDS-PAGE
wurde durchgeführt,
um das SMBP unmittelbar nach der Photoaffinitätsmarkierung abzutrennen. Fünfzig mg
der markierten Membranen konnten auf eine Reihe von Polyacrylamidgelen
aufgegeben werden, ohne daß eine
nennenswerte Diffusion des markierten 34 kDa-SMBP beobachtet wurde
(1). Die passive Extraktion der 34 kDa-Banden ergab
eine Ausbeute von 79,3–86,2%
der gesamten radioaktiven Proteine in den Gelen.
-
Chemische Spaltung, Reinigung
und Sequenzierung
-
Die
chemische Spaltung weist gegenüber
der proteolytischen Spaltung einige Vorteile auf. Sie vermeidet
eine Verunreinigung durch die Protease selbst und erzeugt eine begrenzte
Anzahl an großen
Fragmenten. Analytisch wurde jeweils 1 mg des markierten 34 kDa-Proteins
mit 10% CNBr in 70%iger Ameisensäure
oder in 75%iger TFA behandelt, um die Auswirkung der Säure zu vergleichen.
Unter Ameisensäure-Bedingungen erzeugte
das CNBr drei markierte Fragmente von 8 kDa, 10 kDa und 12 kDa,
und Ameisensäure
allein erzeugte ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa. Unter
den Säurebedingungen
mit TFA wurde der überwiegende
Teil der Markierung durch die Säure
selbst abgespalten, wobei ein einzelnes markiertes Fragment von 10
kDa durch die CNBr-Spaltung beobachtet wurde (2).
-
Der
Extrakt des markierten 34 kDa-Proteins aus 400 mg der Membranen
(411794 CpM) wurde durch CNBr/Ameisensäure präparativ gespalten, und ein
Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf Tricin-SDS-PAGE-Gelen
aufgetrennt. Drei markierte Fragmente von größtenteils 12 kDa und in geringerer
Menge von 8 kDa und 10 kDa wurden auf einem Autoradiogramm der mit
Coomassie-Blau gefärbten
Gele beobachtet (3).
-
Die
Spaltung des photoaffinitätsmarkierten
34 kDa-Proteins an den Methioninresten durch die Behandlung mit
CNBr/Ameisensäure
für 24
h bei Raumtemperatur ergab drei markierte Fragmente (8 kDa, 10 kDa
und 12 kDa, 4a, Bahn 3). Die Behandlung
mit Ameisensäure
allein erzeugte ein einzelnes Fragment von 8 kDa (4a,
Bahn 2), und die Dichte der 8 kDa-Bande erhöhte sich bei längerer Inkubation
(für 72
h bei 37°C, 4b, Bahn 2).
-
Der
Extrakt des markierten 34 kDa-Proteins aus 400 mg der Membranen
(381198 CpM) wurde durch Ameisensäure präparativ gespalten, und ein
Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf Tricin-SDS-PAGE-Gelen
aufgetrennt. Ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa wurde auf
einem Autoradiogramm der mit Coomassie-Blau gefärbten Gele beobachtet (
5).
Das radioaktive Fragment von 8 kDa (insgesamt 21400 CpM) im präparativen
Maßstab
wurde durch passive Extraktion aus den Tricin-SDS-PAGE-Gelen ohne Färbung mit
Coomassie-Blau extrahiert und auf PVDF-Membranen geblotted (19581
CpM). Das Fragment wurde aus den PVDF-Membranen extrahiert (10045
CpM) und durch eine Umkehrphasen- HPLC
weiter gereinigt. Ein radioaktiver Peak wurde bei 62% Puffer B beobachtet
(Fraktion Nr. 27 und 28; insgesamt 3239 CpM,
6). Die
gesamte Rückgewinnungsausbeute
der anfänglichen
Radioaktivität
betrug 91,6%. Die Peakfraktionen wurden einer Untersuchung mit einem
Proteinsequenzanalysengerät
unterworfen, und die erhaltene Aminosäuresequenz war wie folgt:
- in Klammern: erwartete
Aminosäure
- X: unbestimmte Aminosäure.
-
Eine
analytische CNBr-Spaltung ergab, daß die Spaltung an dem Methioninrest
in Gegenwart von TFA, welche die Spaltung an CNBr-resistenten Bindungen
wie Met-Thr oder Met-Ser verbessert (Fontana A. et al., 1986), ein
einzelnes Fragment von 10 kDa erzeugte.
-
Unter
Ameisensäure-Bedingungen
erzeugte das CNBr drei markierte Fragmente von 8 kDa, 10 kDa und
12 kDa, und Ameisensäure
allein erzeugte ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa. Diese
Daten legen nahe, daß das
12 kDa-Fragment
einen CNBr-resistenten Methioninrest enthält, welcher durch CNBr/TFA in
ein 10 kDa-Fragment gespalten wird, und daß das durch Ameisensäure allein
erzeugte 8 kDa-Fragment ein Produkt der Spaltung an einer säureempfindlichen
Bindung wie Asp-Pro ist.
-
Immunpräzipitation
und Western-Blot
-
Das
der N-terminalen Sequenz des 8 kDa-Fragments entsprechende Peptid
(Acetyl-FFQHRIHVFSIFNHC) wurde an KLH gekoppelt, und das Konjugat
wurde dazu verwendet, einen Antikörper mit einem hohem Titer
hervorzurufen. Die Antikörperantwort
wurde bei einer Verdünnung
von 2 × 10–5 des
Antiserums und bei 0,08 μg/ml
des affinitätsgereinigten
Antikörpers
(α8-Antikörper) beobachtet,
wie durch einen ELISA gegen das freie Peptid ohne Konjugation an
KLH abgeschätzt
wurde (7).
-
Das
dem 8 kDa-Fragment entsprechende synthetische Peptid war hydrophob
und konnte nicht ohne Dimethylsulfoxid in einem Puffer gelöst werden.
Zuerst wurde das aus präparativen
SDS-PAGE-Gelen extrahierte, markierte 34 kDa-Protein nach der Entfernung
von SDS verwendet, aber es wurde kein markiertes Protein immunpräzipitiert.
Nach der Solubilisierung der photoaffinitätsmarkierten Membranen durch
n-Octylglucosid, gefolgt durch eine Denaturierung mit Harnstoff,
wurde das markierte 34 kDa-SMBP durch den α8-Antikörper immunpräzipitiert
(8).
-
Der α8-Antikörper erkannte
in einem Western-Blot nur eine 70 kDa-Bande. Die Spezifität des Antikörpers wurde
durch die Fähigkeit
des freien Peptids, die Bindung des Antikörpers an das 70 kDa-Protein
zu hemmen, veranschaulicht (9). In einem
anderen Experiment wurde das photoaffinitätsmarkierte SMBP durch eine
zweidimensionale Elektrophorese im präparativen Maßstab gereinigt,
und der markierte 34 kDa-Fleck in den Gelen wurde isoliert, extrahiert
und einer SDS-PAGE unterworfen. Zwei markierte Banden von 34 kDa
und 70 kDa, abgeleitet von 34 kDa, wurden beobachtet, was zeigt,
daß das
70 kDa-Protein ein Dimer sein könnte.
-
Beispiel 2: Pharmakologische
Eigenschaften des Ratten-Rezeptors gemäß Beispiel 1
-
Die
durch Katecholamine induzierten relaxierenden Antworten, welche
nicht für
eine Blockade der α-, β1- und β2-Adrenorezeptoren
(ARs) anfällig
sind, sind für
eine Reihe von Präparationen
aus gastrointestinalen glatten Muskeln, wie aus dem Ileum des Meerschweinchens
(Bond R.A. et al., 1988), dem proximalen Dickdarm der Ratte (Croci
T. et al., 1988), dem distalen Dickdarm der Ratte (McLaughlin D.P.
et al., 1990), dem Magenfundus der Ratte (McLaughlin D.P. et al.,
1990) und dem Jejunum der Ratte (Van der Vliet A. et al., 1990),
beschrieben worden. Manara et al., 1990, berichteten sogar, daß die durch
Phenylethanolaminotetraline stimulierte Relaxation des Rattendickdarms
parallel zu der Lipolyse in den Fettzellen der Ratte erfolgt, was nahe
legt, daß an
dieser Antwort überwiegend β3-ARs beteiligt
sind.
-
1) Materialien und Methoden
-
Chemikalien
-
SM-11044
((L)-Threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-[3-(4-fluorophenyl)propyl]serin-pyrrolidinamid-hydrobromid),
SM-14786 ((D)-Threo-Isomer von SM-11044), SM-14011((DL)-Threo-Isomer
von SM-11044), SM-14010 ((DL)-Erythro-Isomer von SM-11044), BRL-35135A
((R*R*)-(+)-4-[2'-[2-hydroxy-2-(3-chlorphenyl)ethylamino]propyl]phenoxyessigsäure-methylester),
BRL-37344 (Säuremetabolit
von BRL- 35135A)
und [125I]-Cyanopindolol wurden bei Sumitomo
Pharmaceuticals (Osaka, Japan) synthetisiert. CGP-12177A und CGP-20712A
waren Gaben der Ciba-Geigy Corporation (Basel, Schweiz). ICI-198157
((RS)-4-[2-[(2-hydroxy-3-phenoxypropyl)amino]ethoxy]phenoxyessigsäuremethylester),
ICI-201651 (Säuremetabolit
von ICI-198157)
und ICI-215001 ((S)-Isomer von ICI-201651) sowie ICI-118551 wurden
von Zeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, England) bezogen. SR-58611A
((RS)-N-(7-carbethoxymethoxyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-2-yl)-2-hydroxy-2-(3-chlorphenyl)ethanaminhydrochlorid)
war eine Gabe von Sanofi-Midy (Mailand, Italien). (+)-Carazolol
wurde von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) bezogen. (+)-Bupranolol war
eine Gabe von Schwarz Pharma (Monheim, Deutschland). (–)-3-[125I]-Iodocyanopindolol
([125I]-ICYP) und (+)-3-[125I]-Iodocyanopindolol-Diazirin
([125I]-ICYP-Diazirin)
wurden von Amersham (Buckinghamshire, England) bezogen. Alle anderen
Wirkstoffe wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen.
-
Relaxation
des Rattendickdarms
-
Ein
Rattendickdarmsegment (2 cm) wurde in einem Organbad, enthaltend
10 ml modifizierte Tyrode-Lösung
(Sugasawa T. et al., Eur. J. Pharmacol. 216 (1992), 207–215), suspendiert.
Die Tyrode-Lösung
enthielt in der Studie 0,5 μM
Atropin, 0,5 μM
Desmethylimipramin, 30 μM
Hydrokortison, 30 μM
Ascorbinsäure,
10 μM Phentolamin
und 1 μM
Propranolol, um eine spontane Kontraktion, eine neuronale und extraneuronale
Aufnahme von Norepinephrin, die Oxidation von Katecholaminen bzw.
mögliche α-, β1- und β2-AR-Effekte
zu hemmen.
-
Die
relaxierende Wirkung von Agonisten wurde durch Messung der Relaxation
eines durch KCl (100 mM) induzierten Tonus, hervorgerufen durch
die kumulative Zugabe der Agonisten, wie bereits beschrieben (Sugasawa
T. et al., vorstehend erwähnt),
bestimmt. Im Falle der Untersuchung der Wirkung von Cyanopindolol
wurde dieses 5–10
min vor der Zugabe des Agonisten zugegeben.
-
Lipolyse in
weißen
Fettzellen der Ratte
-
Weiße Fettzellen
wurden aus den Nebenhoden-Fettpolstern männlicher Wistar-Ratten (190–230 g) isoliert,
und die Lipolyse wurde gemäß dem vorhergehenden
Bericht (Sugasawa T. et al., vorstehend erwähnt) bestimmt. Die Zellen wurden
für 5 min
bei 37°C
in Gegenwart von 30 μM
Ascorbinsäure,
10 μM Phentolamin und
1 μM Propranolol
vorinkubiert.
-
Anschließend wurden
die Agonisten zugegeben und während
90 min inkubiert. Im Falle der Untersuchung der Wirkung von Cyanopindolol
wurde dieses 5 min vor der Zugabe des Agonisten zugegeben.
-
Schild-Diagramm
-
Die
Agonistenkonzentrationsverhältnisse
(CR) wurden aus den EC50-Werten der Konzentration-Antwort-Kurven
der Agonisten mit oder ohne Cyanopindolol nach der Methode von Arunlakshana
et al., 1959, bestimmt.
-
Eine
lineare Regressionsanalyse wurde angewendet, um den pA2-Wert
und die Steigung der Geraden nach der Bestätigung, daß die Regression linear war
und daß die
Gerade sich nicht wesentlich von Eins verschieden war (Cochran-Cox-Test,
p > 0,05), abzuschätzen. Die
EC50-Werte wurden unter Verwendung des Computerprogramms
InPlotTM berechnet.
-
Statistische
Analyse
-
Die
Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische
Signifikanz zwischen zwei Datensätzen
wurde abhängig
von der Homogenität
der Varianzen durch den Student-t-Test oder den Cochran-Cox-Test
untersucht. Der multiple Rangtest nach Duncan wurde für mehrere
Datensätze
verwendet. Ein Wahrscheinlichkeitswert von p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
-
Membranpräparation
-
Die
Membranen von glatten Muskeln des Dickdarms und von Skelettmuskeln
wurden aus männlichen Wistar-Ratten
(300–360
g) präpariert,
wie im Wesentlichen in Beispiel 1 erwähnt wurde.
-
Bindungstests
mit den Membranen
-
Die
Sättigungsbindungsstudien
wurden in einem Endvolumen von 200 μl Tris-Salzlösung, enthaltend 50 μg Membranproteine
und verschiedene Konzentrationen (0,05–25 nM) von [125I]-ICYP,
ergänzt
mit 10 μM Serotonin
(5-HT), 10 μM
Phentolamin, 20 μM
Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure
(pH 7,4), durchgeführt, um
mögliche
5-HT-Rezeptoren, ARs bzw. die Oxidation von Katecholaminen zu blockieren.
Das [125I]-ICYP wurde nach der Entfernung
von Methylalkohol durch Druckluft, um einen Einfluß des Lösungsmittels
zu vermeiden, verwendet. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 30 min
in einem Schüttelwasserbad-Inkubator
ausgeführt
und durch die Zugabe von 4 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung, gefolgt
von einer schnellen Filtration unter Vakuum auf einem Whatman GF/B-Filter,
welcher vorher in Tris-Salzlösung,
enthaltend 0,1% Polyethylenimin (pH 7,4) eingeweicht wurde, beendet.
Die Filter wurden dreimal mit 4 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung gewaschen,
in Kunststoffröhrchen
transferiert und in einem Gammazähler
gezählt.
-
Die
Kompetitionstests wurden gegen 1 nM [125I]-ICYP
durchgeführt.
Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 100 μM SM-11044
bestimmt. Die Inhibitionskonstante Ki eines Liganden wurde unter
Verwendung der durch Cheng und Prusoff (Biochem. Pharmacol. 22 (1973),
3099–3108)
beschriebenen Gleichung berechnet. Der Hill-Koeffizient wurde durch
eine lineare Regression unter Verwendung der Daten aus den Sättigungsexperimenten
berechnet. Der Pseudo-Hill-Koeffizient und der IC50-Wert
wurden durch das Computerprogramm InPlotTM (GraphPad
Software, CA, USA) berechnet.
-
Photoaffinitätsmarkierung
der Membranen
-
Die
Photoaffinitätsmarkierung
wurde in einem Endvolumen von 1 ml Tris-Salzlösung, enthaltend 0,5 mg der
Membranen, 1,5 nM [125I]-ICYP-Diazirin,
ergänzt
mit 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin, 20 μM
Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure
(pH 7,4), durchgeführt.
Die Inkubationen wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Kompetitors
bei 37°C
für 45
min im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad-Inkubator ausgeführt und durch
die Zugabe von 10 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen
Zentrifugation (150.000 × g
für 10
min bei 4°C),
beendet. Die Membranen wurden unter Kühlen mit zirkulierendem Wasser für 5 min
mit einer UV-Lampe bestrahlt. Die markierten Membranen wurden mit
10 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung
verdünnt
und zentrifugiert (150.000 × g
für 30
min bei 4°C),
und das Pellet wurde in Tris-Salzlösung resuspendiert und bei –80°C gelagert.
-
SDS-PAGE
-
Die
SDS-PAGE wurde unter reduzierenden Bedingungen, im Wesentlichen
wie durch Laemmli, 1970, beschrieben, unter Verwendung von 12%igen
Polyacryl amidgelen (40% T, 2,6% C) durchgeführt. Die photoaffinitätsmarkierten
Membranen wurden für
mindestens 1 h bei Raumtemperatur in SDS-Probenpuffer (5% SDS, 1%
2β-Mercaptoethanol,
10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau, 50 mM Tris/HCl (pH 6,8)) inkubiert.
Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und einer Autoradiographie
auf einem X-OMATTM AR-Film (Eastman Kodak
Co., USA) unterworfen, wie in Beispiel 1, Kapitel "Präparative
SDS-PAGE", angegeben
wurde.
-
Zweidimensionale
PAGE der photoaffinitätsmarkierten
Membranen
-
Die
in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol photoaffinitätsmarkierten
Membranen wurden in IEF-Probenpuffer (8 M Harnstoff, 0,3% SDS, 5,6%
Triton X-100, 2,8% 2β-Mercaptoethanol,
1,1% Bio-Lyte 5/8-Ampholyt und 0,6% Bio-Lyte 8/10-Ampholyt (Bio-Rad))
solubilisiert, und 30 μg
der Membranproteine wurden einer IEF-Elektrophorese innerhalb eines
pl-Bereiches von 5–10
in Röhrchen
mit einem 4%igen Polyacrylamidgel, enthaltend 2,0% Bio-Lyte 5/8-Ampholyt,
1,0% Bio-Lyte 8/10-Ampholyt, 8 M Harnstoff und 2% Triton X-100,
unterworfen. Die zweite Dimension wurde auf einer SDS-PAGE mit 9%igen
Polyacrylamidgelen durchgeführt.
Die Gele wurden anschließend
getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben,
unterworfen.
-
Spaltung durch
Endoglycosidase oder N-Glycopeptidase F
-
Die
in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol photoaffinitätsmarkierten
Membranen wurden mit N-Glycopeptidase F (PNGase F, EC 3.2.2.18)
oder Endoglycosidase (Endo-Hf, EC 3.2.1.96) unter Verwendung von
Kits entsprechend den Beschreibungen des Herstellers (New England Bio-Labs,
MA, USA) behandelt. Kurz zusammengefaßt, wurden die Membranen in
0,5% SDS und 1% 2β-Mercaptoethanol
solubilisiert, und 40 μg
der Membranproteine wurden mit 5000 Einheiten PNGase F in Gegenwart von
1% NP-40 oder mit 2000 Einheiten Endo-Hf für 3 h bei 37°C inkubiert.
Die gespaltenen Proben wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen Polyacrylamidgelen
unterworfen. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie,
wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
-
Weizenkeimagglutinin (WGA)-Sepharose-Chromatographie
-
Die
in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol photoaffinitätsmarkierten
Membranen wurden in 1% Triton X-100 in Tris-Salzlösung bei 4°C für 16 h solubilisiert. Das solubilisierte Material
wurde nach einer Zentrifugation (200.000 × g für 1 h bei 4°C) gesammelt und mit Tris-Salzlösung auf 0,1%
Triton X-100 verdünnt.
Ein 1 ml-Gelbettvolumen von WGA-Sepharose 6MB (Sigma) wurde gewaschen und
mit 30 ml 0,1% Triton X-100 in Tris-Salzlösung (Puffer A) äquilibriert,
und 1 ml des solubilisierten Materials, enthaltend 200 μg Membranproteine,
wurde bei Raumtemperatur aufgegeben. Die nicht zurückgehaltene Fraktion
wurde dreimal wiederverwendet. Nach Waschen mit 10 ml Puffer A wurde
das gebundene Material mit 5 ml 300 mM N-Acetyl-D-glucosamin (Merck)
in Puffer A eluiert. Die Fraktionen wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen
Polyacrylamidgelen unterworfen. Die Gele wurden anschließend getrocknet
und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
-
Trypsinspaltung
-
Die
photoaffinitätsmarkierten
Membranen wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen Polyacrylamidgelen unterworfen.
Die Gele wurden anschließend
getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben,
unterworfen. Die radioaktive Bande bei 34 kDa wurde ausgeschnitten,
in destilliertes Wasser eingetaucht und in kleine Stücke (2 mm
Breite × 2
mm Höhe)
zerkleinert. Die isolierten Gelstücke, entsprechend 800 μg der Membranproteine,
wurden in 500 μl
100 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS und 50 μg Trypsin (EC
3.4.21.4, Typ IX aus der Schweinebauchspeicheldrüse, Sigma), für 24 h bei
37°C nach
der Methode von Kawasaki H. et al., 1990, gespalten. Nach der Spaltung
wurde der Überstand
gewonnen und unter Verwendung eines SPIN-X-Filters (Porengröße 0,45
mm, Costar, MA, USA) filtriert. Die Gelstücke wurden mittels Zentrifugation
für 10
min bei 14.000 × g
durch ein Nylonsieb (200 Mesh) gepreßt. Ein doppeltes Volumen von
100 mM Tris/HCl, enthaltend 0,1% SDS, wurde zu den zerdrückten Gelen
zugegeben, und eine zweite Extraktion wurde durch eine Inkubation
für 2 h
bei 37°C
unter Rotieren durchgeführt.
Nach der Inkubation wurden die Überstände mit
Hilfe eines SPIN-X-Filters
gewonnen. Die zwei Extrakte wurden vereinigt, unter vermindertem Druck
konzentriert und einer Tricin-SDS-PAGE unterworfen.
-
Chemische
Spaltung
-
Das
photoaffinitätsmarkierte
34 kDa-Protein wurde durch eine SDS-PAGE isoliert und mit 100 mM Tris/HCl
(pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS, wie vorstehend beschrieben, extrahiert.
Die Extrakte wurden vereinigt durch eine Centricon-10-Vorrichtung
(Amicon, MA, USA) konzentriert und zweimal mit destilliertem Wasser
gewaschen. Die Extrakte wurden durch einen Vakuumkonzentrator gefriergetrocknet
und mit 200 μl
70%iger Ameisensäure
oder 1% CNBr/70%iger Ameisensäure
für 24
h bei Raumtemperatur oder 70%iger Ameisensäure für 72 h bei 37°C im Dunkeln
behandelt. Die gespaltenen Produkte wurden mit 500 μl destilliertem
Wasser verdünnt
und gefriergetrocknet. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt.
Die gespaltenen Produkte wurden durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt.
-
Tricin-SDS-PAGE
-
Die
mit Trypsin und die chemisch gespaltenen Fragmente wurden auf einem
Tricin-Gelsystem unter reduzierenden Bedingungen (Schägger H.
et al., 1987) unter Verwendung eines 18%igen Polyacrylamid-Trenngels,
enthaltend 10,7% Glycerin, aufgetrennt. Nach der Elektrophorese
wurden die Gele mit 0,25% Coomassie-Brilliantblau R-250 (Sigma) in 40% Methanol
und 10% Essigsäure
gefärbt
und in 10%iger Essigsäure
entfärbt.
Die Gele wurden anschließend
getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben,
unterworfen.
-
2) Ergebnisse
-
Funktionelle
Studien am Rattendickdarm und an weißen Fettzellen
-
Unter
Blockade von α-, β1- und β2-ARs (in
Gegenwart von 10 μM
Phentolamin und 1 μM
Propranolol) relaxierte eine Reihe von β-AR-Agonisten den durch KCl
induzierten Tonus der glatten Muskeln in dem Rattendickdarmsegment,
wobei die Rangordnung der Wirksamkeit wie folgt war: BRL-37344 > SM-11044 > Isoproterenol > Norepinephrin = Epinephrin
(Tabelle 1). Tabelle
1 Wirksamkeit
von Agonisten im Hinblick auf eine Relaxation im Rattendickdarm
und die Lipolyse in weißen
Fettzellen der Ratte in Gegenwart von 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol
- Statistische Signifikanz
zwischen IA-Werten: * p < 0,05;
** p < 0,01 vs.
Isoproterenol (multipler Rangtest nach Duncan).
-
Der
IA-Wert von SM-11044 war signifikant höher als der für Isoproterenol
(multipler Rangtest nach Duncan), was auf unterschiedliche Wirkungsweisen
hinweist. In den weißen
Fettzellen der Ratte stimulierten dieselben Agonisten die Lipolyse
mit einer Rangordnung der Wirksamkeit wie folgt: BRL-37344 >> SM-11044 = Isoproterenol > Norepinephrin > Epinephrin (Tabelle
1). Die lineare Regressionsgerade für Isoproterenol, Norepinephrin,
Epinephrin und BRL-37344 zeigt eine signifikante Korrelation (r
= 0,97, p < 0,05)
zwischen der durch einen Agonisten induzierten Relaxation im Rattendickdarm
und der Lipolyse in den Fettzellen auf (
10), was
nahelegt, daß an
beiden Effekten überwiegend
derselbe atypische β-AR
beteiligt ist, daß heißt, eine β3-AR-Stimulierung
erfolgt. Im Gegensatz zu den vier Liganden war SM-11044 bei der
Stimulierung der Relaxation im Dickdarm wirksamer als bei der Lipolyse
in den Fettzellen (
10). In der Tat war der Korrelationskoeffizient
nicht mehr signifikant, wenn die lineare Regression mit allen Agonisten
einschließlich SM-11044
analysiert wurde (r = 0,87, p > 0,05).
Diese Daten legen nahe, daß SM-11044
auf β3-AR
und eine weitere funktionelle Stelle, welche die Relaxation im Rattendickdarm
vermittelt, einwirkt. Der Antagonismus von Cyanopindolol gegenüber SM-11044
und gegenüber
Isoproterenol wurde in beiden Präparationen
verglichen. Cyanopindolol selbst hatte bis zu der hierin verwendeten
Konzentration von 10 μM
keinen Einfluß auf den
durch KCl im Rattendickdarm induzierten Tonusgrad und stimulierte
nicht den Fettabbau in den weißen Fettzellen der
Ratte. Cyanopindolol antagonisierte die durch einen Agonisten induzierte
Relaxation im Rattendickdarm in einer konzentrationsabhängigen Weise
mit pA
2-Werten für SM-11044 von 8,31 (Steigung
= 0,78) und für
Isoproterenol von 7,65 (Steigung = 1,03) (Tabelle 2). Tabelle
2 pA
2-Werte für
Cyanopindolol im Rattendickdarm und in weißen Fettzellen der Ratte in
Gegenwart von 10 μM Phentolamin
und 1 μM
Propranolol
-
Cyanopindolol
antagonisierte auch die durch einen Agonisten induzierten Lipolyse
in den weißen
Fettzellen der Ratte in einer konzentrationsabhängigen Weise mit pA2-Werten für SM-11044 von 7,32 (Steigung
= 0,96) und für
Isoproterenol von 7,44 (Steigung = 1,08) (Tabelle 2). Die ähnlichen
pA2-Werte für Isoproterenol im Dickdarm
(7,65), für
SM-11044 in Fettzellen (7,32) und für Isoproterenol in Fettzellen
(7,44), wobei die Steigungen nahe Eins liegen, zeigt den kompetitiven
Antagonismus von Cyanopindolol für
die beiden Agonisten, welche an β3-AR
binden. Alle Steigungen in den Schild-Diagrammen waren nicht signifikant
von Eins verschieden. Jedoch schien nur die Steigung für SM-11044
im Rattendickdarm (0,78) weniger als Eins zu betragen, wobei ein
hoher pA2-Wert (8,31) erhalten wurde, was
nahe legt, daß SM-11044 und Cyanopindolol
nicht nur um die Bindung an β3-AR,
sondern auch um die weitere funktionelle Stelle im Rattendickdarm
konkurrieren.
-
Bindungstests mit Rattendickdarm-Membranen
-
Um
die vorhergesagte funktionelle Stelle zu identifizieren, um die
SM-11044 und Cyanopindolol konkurrieren, wurden Bindungsstudien
mit den Membranen von glatten Muskeln im Rattendickdarm unter Verwendung
von [125I]-ICYP als Radioligand und SM-11044
für den
Nachweis der unspezifischen Bindung unter Blockade von Serotonin-, α-, β1-, β2- und auch β3-adrenergen
Rezeptoren (in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM Phentolamin
und 20 μM
Propranolol) durchgeführt.
Der zeitliche Verlauf der spezifischen Bindung von [125I]-ICYP
(1 nM) an die Rattendickdarm-Membranen
wurde in 11 veranschaulicht. Die spezifische
Bindung erreichte nach 30 min ein Gleichgewichtsniveau (82,7 ± 1,9%,
n = 2) und wurde durch Zugabe von SM-11044 umgekehrt. Die Ergebnisse
eines Sättigungsexperiments
mit ansteigenden Mengen von [125I]-ICYP, welche
im Gleichgewichtszustand ausgeführt
wurden (30 min Inkubation), sind in 12 dargestellt.
Eine Scatchard-Diagramm-Analyse
zeigte eine einzelne Klasse von Bindungsstellen mit einer Dissoziationskonstante
(Kd) von 11,0 ± 0,95
nM und einer maximalen Anzahl an Bindungsstellen (Bmax) von 716,7 ± 21,12 fmol/mg
Protein (r = 0,978, p < 0,001)
auf. Eine Hill-Diagramm-Analyse
der Sättigungskurve
ergab einen Koeffizienten von 0,99 ± 0,03 (r = 0,998, p < 0,0001), was das
Fehlen einer Kooperativität
zeigt.
-
In
Kompetitionsbindungsstudien wurde die spezifische Bindung bis zur
Konzentration von 1 mM weder durch Isoproterenol, Norepinephrin,
Epinephrin, Dopamin noch 5-HT ersetzt (
13a,
Tabelle 1). Die Kompetitionsbindung durch Isomere von SM-11044 war
stereoselektiv, wobei SM-14011 (das racemische Threoisomer, Ki 2,0 μM) 15-mal
wirksamer war als SM-14010 (das racemische Erythroisomer, Ki 29,3 μM) (
13b, Tabelle 3). Der β1-AR-Antagonist CGP20712A und
der β3-AR-Agonist
BRL-37344 ersetzten bis zur Konzentration von 100 μM die spezifische
Bindung nicht. Der β2-AR-Antagonist
ICI-118551 war bei einem relativ hohen Ki-Wert (28,5 μM) wirksam
(Tabelle 3). Cyanopindolol war der wirksamste Kompetitor mit einem
Ki-Wert von 0,11 μM, und Pindolol
hatte bis zur Konzentration von 100 μM keinen Einfluß. Carazolol,
ein mit Cyanopindolol strukturell verwandter Ligand, war weniger
wirksam, obwohl er lipophiler ist (Tabelle 3). Interessanterweise
ersetzen BRL-35135A
(der Methylester von BRL-37344) und ICI-198157 (der Methylester
von ICI-201651)
sowie ICI-215001, ein (S)-Enantiomer von ICI-201651, die spezifische
Bindung, während
die entsprechenden Säuremetabolite
inaktiv waren (Tabelle 3). Die spezifische Bindung wurde durch GTP
signifikant verringert (29,8 ± 2,7%
Hemmung bei 300 μM
(p < 0,01) bzw.
98,2 ± 1,3%
bei 1 mM (p < 0,001),
n = 2). Tabelle
3 Affinitätswerte
(Ki-Werte) verschiedener Liganden für die spezifische Bindung von
[
125I]-ICYP an Rattendickdarm-Membranen
in Gegenwart von 10 μM
5-HT, 10 μM
Phentolamin und 20 μM
Propranolol
-
Photoaffinitätsmarkierungsstudie
-
Die
Photoaffinitätsmarkierung
wurde durchgeführt,
um die spezifische Bindungsstelle in den Rattendickdarm-Membranen
unter Verwendung von [125I]-ICYP-Diazirin sichtbar
zu machen. In Gegenwart von 10 μM 5-HT
und 10 μM
Phentolamin, aber in Abwesenheit von Propranolol wurde zusätzlich zu
zwei breiten Banden mit scheinbaren Molekularmassen von 50 kDa und
70 kDa eine einzelne dichte Bande von 34 kDa sichtbar gemacht (14,
Bahn 1). Im Gegensatz dazu blieb in Gegenwart von 20 μM Propranolol,
10 μM 5-HT
und 10 μM
Phentolamin, daß heißt, unter
denselben Bedingungen wie bei dem Kompetitionsbindungstest mit [125I]-ICYP, nur die 34 kDa-Bande sichtbar
(14, Bahn 2). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die zwei
breiten Banden β-ARs
sind. Außerdem
wurde die 34 kDa-Bande nicht durch 100 μM BRL-37344, aber durch 100 μM SM-11044
ersetzt (14, Bahn 3 bzw. 4). Diese Daten
stützen
die Ergebnisse des Kompetitionsbindungstests, was auf die Existenz
einer einzelne spezifische Bindungsstelle für [125I]-ICYP
und SM-11044 hinweist.
-
Eine
zweidimensionale PAGE der photoaffinitätsmarkierten Membranen bestätigte die
Markierung einer einzelnen Polypeptidkette von 34 kDa, welche einem
pl-Wert von 6,0 entspricht (15). Die
Molekülgröße des photoaffinitätsmarkierten
34 kDa-Proteins wurde durch die enzymatischen Behandlungen mit Endoglycosidase
oder N-Glycopeptidase F nicht modifiziert, während beide Enzyme die Molekülgröße von Ovalbumin von
43 kDa auf 40 kDa verringerten. Das solubilisierte, photoaffinitätsmarkierte
34 kDa-Protein (373,298 CpM) wurde auf eine WGA-Sepharose-Säule aufgegeben. Die nicht zurückgehaltene
Fraktion enthielt 35,7% der Radioaktivität, und die ausgewaschenen Fraktionen
enthielten 53,3% der Radioaktivität. Der spezifische Zucker, 300
mM N-Acetyl-D-glucosamin, eluierte nur 2,3% des radioaktiv markierten
Materials. Die eluierte Fraktion wurde nach der Konzentration einer
SDS-PAGE unterworfen, aber die photoaffinitätsmarkierte 34 kDa-Bande wurde
nicht nachgewiesen. Bei der Spaltung des photoaffinitätsmarkierten
34 kDa-Proteins mit Trypsin wurde ein einzelnes markiertes Protein
von 7 kDa erzeugt (16). Die Rückgewinnungsausbeuten in den
letzten Extrakten aus den Gelstücken
betrugen 62,7% für
das markierte 34 kDa-Protein und 90,4% für die in situ erzeugten tryptischen
Peptide.
-
Bindungsstudien
mit einer Membranpräparation
von Skelettmuskeln der Ratte
-
Die
spezifische Bindung von [125I]-ICYP an Skelettmuskelmembranen
wurde durch Isoproterenol bis zu Konzentrationen von 10–4 nicht
ersetzt. Im Gegensatz dazu ersetzte SM-11044 die Bindung in einer
konzentrationsabhängigen
Weise (17).
-
Pharmakologische
Definition des vorliegenden Rezeptors
-
- – SM-11044,
ein β-AR-Agonist,
zeigte atypische Agonist-Wirkungen wie relaxierende Antworten im
Ileum des Meerschweinchens und im Rattendickdarm und die Hemmung
der Chemotaxis von Eosinophilen beim Meerschweinchen.
-
Cyanopindolol
antagonisierte kompetitiv die Antworten auf Isoproterenol und SM-11044
bei β3-AR
mit ähnlichen
pA2-Werten (7,32–7,65) in Rattendickdarmsegmenten
und in weißen
Fettzellen der Ratte. Die Werte ähnelten
auch denen, welche für β3-AR auf
weißen
Fettzellen der Ratte (Kirkham D. et al., 1992), dem Rattendickdarm,
dem Magenfundus der Ratte (McLaughlin und MacDonald, 1989, 1990)
und dem Ileum des Meerschweinchens (Blue D.R. et al., 1989) berichtet
wurden. Im Gegensatz dazu antagonisierte Cyanopindolol die zusätzliche
atypische Wirkung der durch SM-11044 induzierten Dickdarmrelaxation
bei einem höheren pA2-Wert (8,31) zusammen mit einer geringen
Steigung in Schild-Diagrammen (0,78). Die Ergebnisse zeigten die
Existenz von mindestens zwei verschiedenen Affinitätsstellen
einschließlich β3-AR im Rattendickdarm.
So konkurrierten Cyanopindolol und SM-11044 nicht nur um β3-AR, sondern
auch um eine andere atypische Bindungsstelle. SM-11044 stimulierte über beide
Stellen relaxierende Antworten auf den durch KCl induzierten depolarisierten
Dickdarmtonus.
-
Ein
erster Vergleich mit atypischen Wirkungen zwischen dem Ileum des
Meerschweinchens und den weißen
Fettzellen der Ratte konnte einen speziesbedingten Unterschied nicht
ausschließen.
Jedoch ist der Unterschied der atypischen Wirkungen zwischen den
weißen
Fettzellen der Ratte und dem Rattendickdarm nun offensichtlich,
daß heißt, es ist
kein speziesbedingtes Phänomen.
- – Nachweis
der Bindungsstelle: Der Radioligand-Bindungstest wurde unter Verwendung
von Membranen der glatten Muskeln des Rattendickdarms basierend
auf den Ergebnissen von funktionellen Studien, daß SM-11044
und Cyanopindolol um diese Stellen konkurrierten, durchgeführt. Im
Allgemeinen, falls Liganden desselben Ursprungs für sowohl
den Radioliganden als auch den "kalten" Liganden verwendet
werden, kann eine physikalisch oder chemisch bedingte unspezifische
Bindung nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde im Rattendickdarm
für Cyanopindolol
ein pA2-Wert von 8,31 und für SM-11044
ein pA2-Wert von 7,29 erhalten, was auf
eine 10-fach höhere
Affinität
von Cyanopindolol als diejenige von SM-11044 für die zwei atypischen Komponenten
(β3-AR und
eine andere Stelle) hinweist. Daher wurden [125I]-ICYP
und SM-11044 als Radioligand bzw. als "kalter" Ligand verwendet.
-
[125I]-ICYP kann an β1-, β2- und β3-ARs, Serotonin-5-HT1A- und -5-HT1B-Rezeptoren binden
(Tate K.M. et al., 1991; Hoyer D. et al., 1994). Im Gegensatz dazu
wurde eine spezifische Bindung unter Blockade dieser bekannten Rezeptoren
erhalten. Kompetitionsbindungstests zeigten, daß die Bindungsstelle tatsächlich von diesen
Rezeptoren verschieden war. Natürliche
AR-Liganden (Epinephrin und Norepinephrin) und ein klassischer β-AR-Ligand
(Isoproterenol) zeigten keine Affinität, was nahe legt, daß die Bindungsstelle
von ARs verschieden ist. Mehrere synthetische β-AR-Liganden einschließlich β3-AR-Agonisten
(BRL-35135A, SR-58611A und ICI-198157) zeigten eine Affinität. Atypische
Wirkungen, welche nicht durch β3-AR
erklärt
werden konnten, können
durch die Existenz dieser Bindungsstelle erklärt werden. Tatsächlich wurden ähnliche
Bindungsstellen unter Blockade von β-ARs und Serotonin-Rezeptoren
in Skelettmuskelmembranen der Ratte beobachtet.
- – Biochemische
Charakterisierung durch eine Photoaffinitätsmarkierungsstudie:
Die
Bindungsstelle auf den Membranen von glatten Muskeln des Rattendickdarms
wurde durch [125I]-ICYP-Diazirin, einem
Photoaffinitätsliganden,
der [125I]-ICYP entspricht, sichtbar gemacht. Das
scheinbare Molekulargewicht der Stelle betrug 34 kDa bei einem isoelektrischen
Punkt (pl) von 6,0. Das abgeleitete Molekulargewicht von Ratten-β-ARs, Serotonin-5-HT1A- und -5-HT1B-Rezeptoren
betragen 43,2–50,5 kDa
(β1-AR:
50,5 kDa; β2-AR:
46,9 kDa; β3-AR:
43,2 kDa; 5-HT1A: 46,4 kDa; 5-HT1B:
43,2 kDa) (Machida et al., 1990; Gocayne et al., 1987; Muzzin P.
et al., 1991; Granneman J.G. et al., 1991; Albert A. et al., 1990; Fujiwara
et al., 1990; Voigt et al., 1991). In Zellen oder Geweben sind diese
Rezeptoren normalerweise glycosyliert, dann sind die Größen üblicherweise
größer als
die abgeleiteten Größen. Im
Gegensatz dazu schien die Größe von 34
kDa kleiner zu sein als bei diesen clonierten Ratten-Rezeptoren.
Eine Erklärung kann
das Fehlen einer N-gebundenen Glycosylierung sein. Der isoelektrische
Punkt weist darauf hin, daß die
Bindungsstelle ein saures Protein wie die β-ARs ist (Fraser C.M., 1984).
Die chemische Spaltung an den meisten Methioninresten ergab 10 kDa
und 12 kDa, und die Säurespaltung
an überwiegend
Asparagin-Prolin-Bindungen ergab 8 kDa, was zeigt, daß dieses
Protein Methioninreste enthält
und Asparagin-Prolin-Bindungen einschließen kann.
-
Beispiel 3: Isolierung
und Charakterisierung des erfindungsgemäßen Rezeptors in menschlichen
Skelettmuskeln
-
– Herstellung von Sonden:
-
SEQ
ID NO: 6 ist durch das tblastn-Programm (Altschul S.F. et al., 1990)
mit der GenBank- und der EMBL-Datenbank verglichen worden. In der
dbest-Datenbank wurde eine menschliche exprimierte Sequenz tag (EST)
mit praktisch 100% Homologie zu SEQ ID NO: 6 gefunden. Diese entspricht
SEQ ID NO: 5, welche in H. sapiens als eine partielle cDNA-Sequenz,
Clon 72F05, translatiert im Leseraster in Form von SEQ ID NO: 5,
gefunden wurde. Jedoch war nicht bekannt, ob die SEQ ID NO: 5 irgendeine
biologische Funktion haben könnte
oder nicht.
-
Im
Hinblick auf den Erhalt des erfindungsgemäßen nicht-adrenergen Rezeptors,
welcher SEQ ID NO: 1 oder NO: 13 einschließt, wurde eine Plasmid-DNA,
enthaltend den als 72F05 bezeichneten menschlichen Clon (EMBL-Hinterlegungsnummer
z28655) (Auffray C. et al., 1995), welche die entsprechende codierende Sequenz
von SEQ ID NO: 5 einschließt,
von Genethon, Frankreich, erhalten und zur Herstellung von Sonden, welche
für Hybridisierungstests
nützlich
sind, verwendet.
-
900 bp-Sonde (SEQ ID NO:
3):
-
Durch
Spaltung der Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuclease EcoRI
(New England Biolabs, Ref. 101 S) wurde eine 0,9 kb-Insertion freigesetzt,
welche dem Clon 72F05 entspricht. Dieses Fragment wurde unter Verwendung
des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits
(Qiagen, Ref. 20021) isoliert.
-
300 bp-Sonde (SEQ ID NO:
4):
-
1) Konstruktion von Sense-
und Antisense-Primern für
die PCR:
-
- Sense-Primer: S4 (SEQ ID NO: 7)
- Antisense-Primer: S6 (SEQ ID NO: 8)
-
2) PCR mit Clon 72F05:
-
Die
Amplifikation wurde mit 1 ng Plasmid-DNA, entsprechend dem Clon
72F05, in Gegenwart der folgenden Reagenzien durchgeführt: 0,25 μM jedes Primers;
10% DMSO; 2,5 E Taq-Polymerase (Promega); und 0,25 mM dNTP (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP). Der Reaktionspuffer wurde von Promega bezogen
und mit 1,5 mM MgCl2 ergänzt.
-
Die
PCR wurde mit einem Perkin-Elmer "Gene Amp PCR-System 9600" unter den folgenden
Bedingungen durchgeführt:
-
Unter
diesen Bedingungen wurde ein 0,3 kb-Fragment, entsprechend der veröffentlichten
Sequenz von Clon 72F05, amplifiziert. Das Fragment wurde unter Verwendung
des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits (Qiagen, Ref. 20021) isoliert.
-
– Radiomarkierung der Sonden:
-
Mit
Hilfe von Zufallsprimern (Feinberg et al., 1983) wurden 50 μCi dATP α32P (ICN,
Ref. 39010 X) eingebaut, um die DNA-Fragmente radioaktiv zu markieren.
-
– Northern-Blot:
-
Ein
Northern-Blot unter Verwendung einer Vielzahl von menschlichen Geweben
wurde von Clontech (Ref. 7765-1) bezogen.
-
Dieser
für die
Hybridisierung gebrauchsfertige Blot enthielt in jeder Bahn etwa
2 μg polyadenylierte mRNA
aus acht verschiedenen menschlichen Muskeln (glatten und gestreiften):
Bahnen
1–8, der
Reihe nach: menschlicher Skelettmuskel, Uterus (ohne Endometrium),
Dickdarm (ohne Schleimhaut), Dünndarm,
Blase, Herz, Magen und Prostata (vgl. 18A).
-
Die
Membran wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers mit der markierten 300 bp-Sonde (SEQ ID NO: 4) (106 CpM/ml) während 24 Stunden hybridisiert.
-
Die
Waschschritte wurden unter verschiedenen Stringenzbedingungen ausgeführt:
- 1) Geringe Stringenz: 2× SSC, 0,05% SDS, bei Raumtemperatur.
-
Eine
Exposition auf einem Amersham Hyperfilm MP bei –80°C für 3 Tage unter Verwendung von
zwei Verstärkerschirmen
zeigte drei verschiedene Fragmente: in allen Proben sind zwei Hauptbanden
vorhanden, eine bei 3,4 kb und eine bei 3,8 kb. In allen Proben
ist eine schwächere
Bande bei etwa 7 kb zu finden.
- 1) Hohe Stringenz:
0,1× SSC,
0,05% SDS, bei 50°C.
Bei derselben Exposition wurden in allen Proben dieselben Fragmente
nachgewiesen.
-
Die
Ergebnisse sind in 18 veranschaulicht
(dieselben Ergebnisse bei einer geringen oder einer hohen Stringenz).
-
Die
sichtbar gemachten mRNAs entsprechen SMBP-Transkripten. Eine Erklärung für das Vorhandensein
von drei verschiedenen Transkripten könnte möglicherweise die Verwendung
von alternativen Polyadenylierungsstellen auf dem SMBP-Gen sein
(Intervening Sequences in Evolution and Development, Stone E.M.
und Schwartz R.J., Oxford University Press, 1990).
-
Eine ähnliche
Analyse, welche mit einer Vielzahl von nicht-muskulären Geweben
(Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Pankreas) durchgeführt wurde,
bestätigte
diese Beobachtungen (18B).
-
– Clonierung der menschlichen
cDNA:
-
Eine
menschliche Skelettmuskel-cDNA-Bank wurde von Clontech (Ref. HL
300s; Artikel 32288) bezogen. 500.000 Clone wurden auf Nylonmembranen
(Hybond N+; Amersham) transferiert und durch
Hybridisieren mit entweder der 300 bp-Sonde (SEQ ID NO: 4) oder
der 900 bp-Sonde (SEQ ID NO: 3) durchmustert.
-
Die
Hybridisierungsbedingungen waren:
600 mM NaCl; 60 mM Na-Citrat;
8 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM Na-Phosphat; 1% Ficoll; 1% Polyvinylpyrrolidon;
1% Rinderserumalbumin, 40% Formamid; 0,2% SDS; und 50 μg/ml Lachssperma-DNA.
-
Die
radioaktiv markierte Sonde wurde in einer Menge von 106 CpM/ml
zugegeben und über
Nacht bei 42°C
inkubiert.
-
Die
letzten Waschschritte erfolgten bei 50°C; 0,1× SSC, 0,05% SDS für 1 Stunde.
-
Elf
positive Clone wurden durch aufeinanderfolgende Durchmusterungsrunden
identifiziert.
-
Die
Insertionsgrößen wurden
durch gleichzeitiges Schneiden mit den folgenden Restriktionsendonucleasen
analysiert: XbaI/HindIII und XbaI/BamHI (New England Biolabs). Diese
Enzyme setzten cDNA-Inserts aus dem Vektor pcDNA-I (Invitrogen)
frei. Alle Clone wurden mit T7- und SP6-Primern von beiden Enden
sequenziert, wobei festgestellt wurde, daß sie sich überlappen.
-
Die
längsten
cDNA-Inserts (Clon Nr. 24 und Nr. 15) war etwa 1,7 kb groß, und die
kleinste war etwa 0,65 kb groß (Clon
Nr. 2).
-
Clon
24 wurde unter Verwendung der T7- und SP6-Primer und der folgenden
spezifischen Primer:
Plusstrang-Primer:
S4: SEQ ID NO:
7
S8: SEQ ID NO: 9
Minusstrang-Primer:
S6: SEQ ID
NO: 8
S5: SEQ ID NO: 10
S7: SEQ ID NO: 11
S9: SEQ
ID NO: 12
auf beiden Strängen
sequenziert.
-
Die
DNA-Sequenzierungsdaten zeigten ein zusammenhängendes offenes Leseraster
(SEQ ID NO: 2 oder NO: 13). Eine Translation in die Proteinsequenz
(SEQ ID NO: 1 oder NO: 14) zeigte mehrere hydrophobe Bereiche auf
(23), was nahe legt, daß diese
Regionen mutmaßliche
membrandurchspannende Teile des Proteins sind. Die den hydrophoben
Bereichen entsprechenden Sequenzen sind in 24 hervorgehoben (Kästchen).
-
SMBP
scheint eine strukturelle Homologie zu Vertretern einer Gruppe von
Proteinen aufzuweisen, welche als "ähnlich" zu dem Saccharomyces
cerevisiae Emp70-Protein-Vorläufer
beschrieben wurden.
-
22 zeigt, daß:
- – die menschliche
Myeloblastenzelllinie D87444 (Nagase T. et al., DNA Res. 3 (1996),
321–329)
30% homolog zu SMBP ist,
- – das
p76-Protein (Schimmöller
F. et al., Hinterlegungsnummer U81006) 27% homolog zu SMBP ist,
- – das
Hefe-Endomembranprotein (Emp70), welches ein Vorläufer für ein 24
kDa-Protein (Emp24) ist, das an dem intrazellulären Vesikeltransport beteiligt
ist (Schimmöller
F. et al., EMBO J. 1417 (1995), 1329–1339), 23% homolog zu SMBP
ist,
- – hMP70
(Chluba-de Tapia J. et al., Gene 197 (1997), 195–204) 28,5% homolog zu SMBP
ist, während
- – ein
Protein von Arabidopsis thaliana (Hinterlegungsnummer U95973) 51,2%
homolog zu SMBP ist.
-
Das
Hydropathie-Diagramm von SMBP zeigt eine bemerkenswerte Ähnlichkeit
mit denen des p76-Proteins, des von Myeloblasten stammenden Proteins,
des hMP70-Proteins, des Arabidopsis-Proteins und des Emp70-Proteins
(vgl. 23).
-
Die
affinitätsmarkierte
Peptidsequenz befindet sich an der der Switch-Region zwischen dem hydrophoben N-terminalen
Teil von SMBP und dem hydrophoben C-terminalen Bereich, der die
Transmembranregionen enthält.
-
Das
Fehlen von N-Glycosylierungsstellen, das Fehlen einer Homologie
zu Plasmamembranrezeptoren und die Ähnlichkeit mit intrazellulären Proteinen
deutet darauf hin, daß SMBP
in der Tat auch ein intrazelluläres
Membranprotein sein könnte.
SMBP scheint in vielen verschiedenen Geweben exprimiert zu werden und
könnte
daher eine wichtige Rolle bei der normalen zellulären Funktion
spielen. Da SMBP anscheinend mindestens zu Emp70, das am intrazellulären Transport,
d.h. ER über
den Golgi-Apparat, beteiligt ist, völlig homogen ist, könnte dies
auch eine Funktion von SMBP sein.
-
Beispiel 4: Konstruktion
eines Plasmids für
die Expression von Hu-SMBP
-
Für die in-vitro-Expression
in Säugerzellen
wurde die 1,7 kb große
cDNA-Insertion von
Clon 24 in den Säugerexpressionsvektor
pcDNA3 (Invitrogen) subcloniert. Durch gleichzeitiges Spalten mit
der Restriktionsendonuclease XbaI und HindIII (New England Biolabs)
wurde die 1,7 kb-Insertion aus dem pcDNA-I-Vektor (vgl. Beispiel
3) freigesetzt. Das Fragment wurde dann unter Verwendung des Klenow-Fragments
(Maniatis et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1, 5.40) mit glatten
Enden versehen und unter Verwendung des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits
(Qiagen, Ref. 20021) auf einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt.
-
Der
Vektor pcDNA3 wurde an dem Polylinker durch EcoRV (New England Biolabs)
gespalten und unter Verwendung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm
(New England Biolabs) dephosphoryliert. Nach Hitzeinaktivierung
der Phosphatase wurden der Vektor und die Insertion unter Verwendung
der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) miteinander ligiert. Der
Subclon 3 wurde selektiert (bezeichnet als Clon Nr. 24.3) Dieses
Plasmid enthält
mindestens SEQ ID NO: 2.
-
Das
rekombinante Plasmid kann zur in-vitro-Expression in Säugerzelllinien
transfiziert werden.
-
Beispiel 5: Expression
von SMBP in COS-Zellen
-
COS-Zellen
wurden mit einem Vektor, enthaltend die SMBP-Nucleotidsequenz, transient
transfiziert. Die Antikörper,
welche gegen ein synthetisches Peptid, entsprechend dem affinitätsmarkierten
Fragment des Ratten-SMBP, hervorgerufen wurden (α8-Antikörper), wurden zur Immunpräzipitation
von Proteinen, extrahiert aus COS-Zellen, die mit der menschlichen
SMBP-cDNA transfiziert wurden, verwendet und unter Anwendung des
Chloramin-T-Verfahrens mit 125I-Iod markiert.
Das Präzipitat
wurde anschließend
wieder gelöst
und einer SDS-PAGE unterworfen. Nach einer Autoradiographie wurde
ein einzelnes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von
45 kDa identifiziert (25).
-
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