DE69735244T2

DE69735244T2 - Icyp (iodocyanopindolol) rezeptor von säugetieren und dessen anwendungen

Info

Publication number: DE69735244T2
Application number: DE69735244T
Authority: DE
Inventors: Gerlinde Lenzen; Arthur Donny Strosberg; Toshinari Sugasawa; Shigeaki Morooka
Original assignee: Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1996-12-12
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: US7276576B1; EP0951548B9; EP0951548A1; WO1998026065A1; DE69735244D1; EP0951548B1; EP0848059A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes und im Wesentlichen reines Säugerpolypeptid, welches verschieden ist von bekannten Adreno-, Serotonin- und Dopamin-Rezeptoren und welches zumindest auf den Membranen von Muskeln und Eosinophilen in Säugern, zum Beispiel in der Ratte, dem Meerschweinchen und dem Menschen, vorliegt.
Die Erfindung betrifft auch:
Plasmide, enthaltend die Gene, welche das Polypeptid codieren;
Wirtszellen, transformiert durch Gene, welche das vorstehend erwähnte Polypeptid codieren;
Nucleotidsonden, die mit den Genen, welche das vorstehend erwähnte Polypeptid codieren, hybridisieren können; und
polyclonale und monoclonale Antikörper, die gegen das vorstehend erwähnte Polypeptid gerichtet sind und welche für die in-vitro-Diagnose verwendet werden können.
Eine große Vielzahl von Membranrezeptoren für Hormone und Neurotransmitter ist aus einer einzelnen Polypeptidkette, die sieben hydrophile Sequenzen enthält, aufgebaut und kann an G-Proteine gekoppelt sein, die regulatorisch für die Guaninnucelotid-Bindung sind welche bei der Aktivierung durch Agonisten oder Antagonisten verschiedene Effektoren wie Enzyme oder Ionenkanäle stimulieren oder hemmen.
Die Familie der sieben Transmembrandomänen-Rezeptoren umfaßt solche für Adrenalin und andere Katecholamine, die adrenergen Rezeptoren und solche für Acetylcholin und verwandte Muskarin-Liganden, die muskarinartigen cholinergen Rezeptoren. Andere ähnliche Proteine, die dieser wachsenden Familie angehören, sind solche für Serotonin, für Dopamin, für Tachykinine und für die Hyphophysen-Glycoproteinhormone, um nur einige wenige zu erwähnen.
Die Existenz von atypischen adrenergen Rezeptoren (ARs) in Fettzellen, in gastrointestinalen Geweben (Bianchetti und Manara, 1990) und in Skelettmuskeln (Challiss et al., 1988) ist hinreichend belegt worden. Atypische β-adrenerge Rezep toren (β-ARs) sind definiert als β-ARs, die nicht als typische β-ARs (β1-AR und β2-AR) mit einer geringen β-AR-antagonistischen Wirkung, welche das Propranolol (einem klassischen nicht-selektiven β-AR-Antagonisten)-Resistenz-Merkmal aufweist, klassifiziert werden können.
Beispielsweise charakterisierten McLaughlin, MacDonald und Mitarbeiter die β-ARs im Rattendickdarm (McLaughlin und MacDonald, 1990; MacDonald und Lamont, 1993; McKean und MacDonald, 1995). Propranolol war ein schwacher Antagonist gegenüber Isoproterenol und BRL-37344. Die Propranolol-Resistenzantworten von Isoproterenol wurden durch Cyanopindolol bei einem pA₂-Wert von 7,12 unter Blockade der β1- und β2-AR-Wirkungen antagonisiert. Die Autoren berichteten, daß die Antworten auf Isoproterenol im Rattendickdarm größtenteils durch β3-AR vermittelt wurden, wobei β1-AR und β2-AR einen geringen Anteil daran hatten (McKean und MacDonald, 1995). Diese Beobachtung wird durch Ek et al., 1986, gestützt, welche β1- und β2-AR in Rattendickdarm-Membranen durch [¹²⁵I]-Pindolol-Bindungsstudien nachwiesen. Folglich sind im Rattendickdarm zusätzlich zu β1- und β2-ARs vorwiegend β3-ARs vorhanden. Ähnlich wie im Ileum des Meerschweinchens war Cyanopindolol als ein Antagonist bei atypischen β-ARs der Ratte wirksam, während es als ein β1- und β2-AR-Antagonist mit einer β3-AR-agonistischen Wirkung auf β3-ARs im Menschen und der Maus wirkte (Blin et al., 1993).
Die meisten der pharmakologischen Merkmale der atypischen β-ARs können durch eine β3-AR-Aktivität erklärt werden. Jedoch ist der Mangel an β3-AR-Transkripten in Skelettmuskeln oder das Fehlen von heterogenen Antworten in vaskulären glatten Muskeln immer noch ungeklärt, was die Komplexität des Fachgebiets der Rezeptoren zeigt.
Die Erfindung beantwortet eine ungelöste Frage im Hinblick auf die Existenz eines Polypeptids mit einer Rezeptoraktivität, welche sich von derjenigen der β3-adrenergen Rezeptoren unterscheidet. In der Tat gewährt sie Zugang zu einer neuen Rezeptorklasse, welche zumindest in Muskeln und in Eosinophilen vorkommt und Transmembrandomänen aufweist und eine Signaltransduktionsfunktion besitzen kann.
Die Erfinder haben nun unerwartet festgestellt, daß in Membranen von glatten Muskeln des Rattendickdarms ein nicht-Adreno-, nicht-Serotonin- und nicht- Dopamin-Rezeptor vorhanden ist, der zumindest die Hemmung eines depolarisierten Dickdarmtonus vermittelt.
Der Gegenstand der Erfindung ist ein im Wesentlichen reines Säugerpolypeptid, das Stellen enthält, welche, wenn diese Stellen an der Oberfläche einer Zelle exponiert werden, in der Lage sind, Iodocyanopindolol (ICYP) unter Blockade von α-, β1-, β2- und β3-AR, Serotonin-5-HT_1A- und Serotonin-5-HT_1B-Rezeptoren zu binden, wobei die Bindung saturierbar und reversibel ist und unter Stereoselektivität durch einen β-adrenergen Rezeptor-Agonisten, SM-11044, aber nicht durch Isoproterenol, Norepinephrin, Epinephrin, Serotonin, Dopamin oder BRL-37344 ersetzt werden kann und nicht durch Propranolol blockiert wird, wobei das Polypeptid (1) ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 30–40 kDa bei der Markierung mit ¹²⁵I-Iodocyanopindolol nach einer Photoaffinitätsmarkierung und der Auftrennung durch Elektrophorese und ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 60–80 kDa in einem Western-Blot aufweist, und wobei (2) durch Säurespaltung ein Fragment erzeugt wird, das die folgende Formel aufweist: DPX₁FFQHRIHX₂FSIFNX₃, worin X₁ die Bedeutung S (SEQ ID NO: 5) oder X (SEQ ID NO: 6) hat, X₂ die Bedeutung V (SEQ ID NO: 6) oder W (SEQ ID NO: 5) hat, und X₃ die Bedeutung S (SEQ ID NO: 5) oder H (SEQ ID NO: 6) hat, wobei das Polypeptid zumindest auf den Membranen von Muskeln und Eosinophilen vorliegt und ein nicht-adrenerger Rezeptor ist.
Der neue nicht-adrenerge Rezeptor weist die folgenden Affinitäten für verschiedene β3-AR-Agonisten und -Antagonisten auf:
SM-11044 stimuliert im Ileum des Meerscheinchen die Relaxation eines durch KCl induzierten Tonus, wobei es eine größere Wirksamkeit als bei der Lipolyse in weißen Fettzellen der Ratte besitzt. SM-11044 und BRL-35135A, ein wirksamer β3-AR-Agonist, weisen die zusätzliche Eigenschaft auf, daß sie die durch Leukotrien B4 induzierte Chemotaxis von Eosinophilen im Meerscheinchen hemmen (Sugasawa und Morooka, 1992a; Sugasawa und Morooka, 1992b), während Isoproterenol und BRL-37344 keine solche Wirkung zeigten (Sugasawa und Morooka, 1992a). Diese Hemmung wurde durch den nicht-selektiven β-AR-Antagonisten Propranolol nicht beeinflußt, aber wurde durch Alprenolol, einem β1- und β2-AR-Antagonisten/β3-AR-Partialagonisten, antagonisiert.
Obwohl der Rattendickdarm zusätzlich zu β2-AR zusammen mit einer kleinen Population von β1-AR (Arunlakshana O. et al., 1959) tatsächlich β3-AR enthält (Bensaid M. et al., 1993), weist die vorliegende Erfindung zweifellos die Existenz einer neuen funktionellen Bindungsstelle im Rattendickdarm nach. Diese Stelle wurde mittels Ligandenbindung und Photoaffinitätsmarkierung charakterisiert, wobei ein neues Bindungsprotein nachgewiesen wurde, welches hierin als Ro-SMBP (SM-11044-Bindungsprotein oder Nagetier-SM-Bindungsprotein) bezeichnet wird.
Das neue nicht-adrenerge SM-Bindungsprotein ist auch in menschlichen Muskeln (glatten und gestreiften) nachgewiesen worden (Hu-SMBP) und enthält zumindest die Sequenz SEQ ID NO: 1.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besteht das Protein aus SEQ ID NO: 14.
Das Protein enthält eine hydrophobe C-terminale Region aus 356 Resten, welche bis zu neun Transmembranregionen enthalten kann.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte und gereinigte Nucleinsäure, die einen Säugetier-Rezeptor, wie vorstehend definiert, und Fragmente davon codiert.
Im Menschen schließt die codierende Sequenz mindestens SEQ ID NO: 2 ein.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besteht die codierende Sequenz aus SEQ ID NO: 13, welche der SMBP-cDNA entspricht.
Die SEQ ID NO: 13 umfaßt insbesondere die folgenden einmaligen Restriktionsstellen: BstU I, Hha I, HinP I, Ava I, Sma I, Xma I, BsaA I, Apa I, Ban II, Bsp120 I, Eco0109 I, Sca I, Xmn I, Dra I, Nsi I, Ppu10 I, Acc65 I, Ban I, Kpn I, Bsp1407 I, Spe I, BspD I, Cla I, Hinf I, Tfi I, Avr II, Drd I, Esp3 I, Bpm I, PflM I, Bsm I, Alu I, BceF I, Bgl II, BstY I, ApaL I, Age I, BsrF I, Nsp I, Nsp7524 I und NspC I, so wie in den 19, 20 und 21 angeordnet.
Diese Sequenz codiert ein Polypeptid von 576 Aminosäureresten, welches eine hydrophile N-terminale Region von 220 Resten und eine hydrophobe C-terminale Region von 356 Resten enthält.
Die Nucleinsäuresequenzen in verschiedenen Säugetieren hybridisieren mindestens mit:

– einem 900 bp-Fragment von SEQ ID NO: 3, oder
– einem 300 bp-Fragment von SEQ ID NO: 4.

Diese Fragmente sind nützlich für den Nachweis des Gens, welches den vorliegenden neuen nicht-adrenergen Rezeptor codiert.
Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung umfaßt auch cDNA-Clone, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Sequenzfragment umfassen, welches den erfindungsgemäßen nicht-adrenergen Rezeptor codiert.
Gemäß der Erfindung umfaßt der als 24.3 bezeichnete Clon 1,7 kb und schließt SEQ ID NO: 2 ein, wobei er das vorliegende Hu-SMBP codiert.
Die Erfindung betrifft auch synthetische und nicht-synthetische Nucleotidsonden, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit einer der Nucleinsäuren, wie vorstehend definiert, oder mit deren komplementären Sequenzen oder deren entsprechenden RNA hybridisieren, wobei diese Sonden derart sind, daß sie nicht mit den Genen oder der Boten-RNA, welche β-adrenerge Rezeptoren codieren, hybridisieren.
Die Sonden sind beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus den vorstehend erwähnten 900 bp (SEQ ID NO: 3)- und 300 bp (SEQ ID NO: 4)-Fragmenten und aus SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12, wahlweise markiert unter Verwendung eines Markers, wie einem radioaktiven Isotop, einem geeigneten Enzym oder einem Fluorochrom, ausgewählt.
Die SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12 können als Primer für die Amplifikation einer der vorliegenden Nucleinsäuresequenzen verwendet werden.
Die Hybridisierungsbedingungen für die Sonden von mehr als 100 Nucleotiden sind wie folgt definiert: 600 mM NaCl; 60 mM Na-Citrat; 8 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM Na-Phosphat; 1% Ficoll; 1% Polyvinylpyrrolidon; 1% Rinderserumalbumin; 40% Formamid; 0,2% SDS; und 50 μg/ml Lachssperma-DNA.
Die Erfindung betrifft auch ein(en) rekombinantes(n) Plasmid, Cosmid oder Phagen, insbesondere für die Clonierung und/oder Expression, enthaltend eine erfindungsgemäße Nucleinsäuresequenz, welche an einer der Clonierungsstellen davon (welche für dessen Replikation nicht essentiell ist) inseriert ist.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform umfaßt das Plasmid ferner einen Replikationsursprung für die Replikation in einer Wirtszelle, mindestens ein Gen, dessen Expression eine Selektion der Wirtszelle, welche mit dem Plasmid transformiert ist, ermöglicht, und eine regulatorische Sequenz, die einen Promotor einschließt, welcher die Expression eines Polypeptids mit einer nicht-adrenergen Aktivität, wie vorstehend definiert, in der Wirtszelle erlaubt.
Gemäß einer vorteilhaften Anordnung dieser Ausführungsform ist das Plasmid pcDNA3, worin die SEQ ID NO: 2 in einen Polylinker inseriert ist, wobei das Plasmid bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Microorganism Cultures] (CNCM, unterhalten durch das Pasteurinstitut) am 10. Dezember 1996 unter der Nummer I-1795 hinterlegt wurde.
Die Erfindung betrifft auch eine Wirtszelle, welche durch ein rekombinantes Plasmid, wie vorstehend definiert, umfassend die Regulationselemente, welche die Expression der Nucleotidsequenz, welche das erfindungsgemäße Polypeptid codiert, in diesem Wirt ermöglicht, transformiert ist.
Eine solche Zelle ist zur Expression eines erfindungsgemäßen SMBP befähigt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform besteht die Wirtszelle insbe sondere aus Säugerzelllinien.
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, welche spezifisch gegen das vorliegende Polypeptid gerichtet sind, wobei diese Antikörper derart sind, daß sie weder bekannte α- oder β-Adreno- noch Serotonin- oder Dopamin-Rezeptoren erkennen.
Vorteilhafterweise stellt der erfindungsgemäße neue nicht-adrenerge Rezeptor ein Hilfsmittel für die Selektion eines Liganden, welcher an der Aktivierung oder an der Hemmung dieser Rezeptoren beteiligt ist, dar.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Testen einer Substanz auf eine Agonist- oder Antagonist-Aktivität gegenüber einem erfindungsgemäßen Polypeptid, wobei das Verfahren umfaßt:

– Inkontaktbringen der Substanz mit Gewebe-Membranproteinen oder einer transformierten Wirtszelle, die ein erfindungsgemäßes Polypeptid exprimiert, unter Bedingungen, welche eine Bindung zwischen den Polypeptid-Bindungsstellen und einem Agonisten oder einem Antagonisten dafür erlauben, und
– Messen eines geeigneten Transduktionssignals.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer Verbindung für ein erfindungsgemäßes Polypeptid, wobei das Verfahren umfaßt:

– Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine Nucleotidsequenz, welche den vorliegenden Rezeptor codiert,
– Züchten der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Rezeptors erlauben, der durch die Nucleotidsequenz codiert wird, und den Transfer des exprimierten Rezeptor-Polypeptids in die Membran der transformierten Wirtszelle, so daß die Transmembransequenzen des Rezeptor-Polypeptids in die Zellmembranen der transformierten Wirtszelle eingebettet werden,
– Inkontaktbringen der transformierten Wirtszelle mit der Verbindung, und
– Messen der Menge der Verbindung, die an das Rezeptor-Polypeptid gebunden ist.

– Extrahieren von Membranproteinen, die dem vorliegenden Rezeptor-Polypeptid entsprechen, aus geeigneten Geweben oder Zellen wie Muskeln,
– Inkontaktbringen der Membranproteine mit der Verbindung, und
– Messen der Menge der Verbindung, die an das Rezeptor-Polypeptid gebunden ist.

Die funktionelle Rolle dieses Polypeptid-Rezeptors würde die Relaxation von depolarisierten intestinalen glatten Muskeln oder die Hemmung der Chemotaxis von Eosinophilen einschließen.
Ein spezifischer Agonist für diesen neuen Rezeptor zeigt mindestens eine therapeutische Potentialität bei gastrointestinalen Erkrankungen, welche auf einem depolarisierten Tonus basieren, bei konstitutionsallergischem Asthma und bei dem Hypereosinophilie-Syndrom, das auf einer Anreicherung von Eosinophilen basiert.
Somit ermöglicht der vorliegende Polypeptid-Rezeptor die Entwicklung von Arzneistoffen für zumindest gastrointestinale Erkrankungen, die auf einem depolarisierten Tonus basieren, für konstitutionsallergisches Asthma und für das Hypereosinophilie-Syndrom.
Neben den vorstehenden Anordnungen umfaßt die Erfindung auch andere Anordnungen, welche aus der folgenden Beschreibung deutlich werden, worin auf die beigefügten Zeichnungen verwiesen wird, wobei bedeuten:
1: Präparative SDS-PAGE, gefolgt von einer Autoradiographie mit 50 mg solubilisierten Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 0,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol.
2: Analytische chemische Spaltung von SMBP. Das isolierte und markierte Protein von 34 kDa wurde mit destilliertem Wasser (Bahn 1), 70%iger Ameisensäure (Bahn 2), 10% Cyanbromid in 70%iger Ameisensäure (Bahn 3), 75%iger Trifluoressigsäure (Bahn 4) oder 10% Cyanbromid in 75%iger Trifluoressigsäure (Bahn 5) für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert, durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Pfeile zeigen markierte 8 kDa-, 10 kDa- und 12 kDa-Fragmente.
3: Präparative Cyanbromid-Spaltung von SMBP. Das isolierte und markierte Protein von 34 kDa wurde mit 10% Cyanbromid in 70%iger Ameisensäure für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf einer Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Pfeile zeigen markierte 8 kDa-, 10 kDa- und 12 kDa-Fragmente.
4: Analytische chemische Spaltung von SMBP. 4a: die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden mit destilliertem Wasser (Bahn 1), 70%iger Ameisensäure (Bahn 2) oder 1% Cyanbromid in 70%iger Ameisensäure (Bahn 3) für 24 h bei Raumtemperatur inkubiert, oder 4b: die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden mit destilliertem Wasser (Bahn 1) oder 70%iger Ameisensäure (Bahn 2) für 72 h bei 37°C inkubiert, durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt und einer Autoradiographie unterworfen.
5: Präparative Säurespaltung von SMBP. Das isolierte und markierte Protein von 34 kDa wurde mit 70%iger Ameisensäure für 72 h bei 37°C inkubiert. Ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf einer Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt, gefolgt von einer Autoradiographie. Die Pfeile zeigen ein markiertes 8 kDa-Fragment.
6: Umkehrphasen-HPLC-Reinigung des photoaffinitätsmarkierten und durch Ameisensäure gespaltenen 8 kDa-Fragments. Das aus Tricin-SDS-PAGE-Gelen isolierte Fragment wurde durch eine Umkehrphasen-HPLC weiter gereinigt. Das Fragment wurde mit einem linearen Gradienten von 30–98% Puffer B innerhalb von 120 min aus der C4-Säule eluiert (------). Das Radioaktivitätsprofil für das markierte 8 kDa-Fragment wurde dargestellt (•). Basierend auf der Menge der gewonnenen Radioaktivität betrug die Rückgewinnung aus der HPLC-Säule 91,6%.
7: Enzym-Immunoassay (ELISA) von Antiserum (•), präimmunisiertem Serum (O) oder einem affinitätsgereinigten Antikörper (∎, α8-Antikörper) auf einer mit dem freien Peptid beschichteten Platte. Der polyclonale Kaninchen-Antikörper wurde gegen das synthetische Peptid, welches der N-terminalen Sequenz des 8 kDa-Fragments entspricht, hervorgerufen.
8: Immunpräzipitation des solubilisierten, photoaffinitätsmarkierten SMBP. Solubilisierte Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 1,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin, 20 μM Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure, wurden mit 1:200 verdünntem, präimmunisiertem Serum (Bahn 1) oder 10 μg α8-Antikörper (Bahn 2) immunpräzipitiert.
9: Western-Blot der Rattendickdarm-Membranproteine. Bahn 1 zeigt die Kontrolle (es wurde 1:200 verdünntes, präimmunisiertes Serum verwendet). Die 70 kDa-Bande wurde durch 2 μg/ml α8-Antikörper (Bahn 2) nachgewiesen. Der Nachweis wurde gehemmt, wenn der Antikörper mit 10 μg/ml des spezifischen Peptids vorinkubiert wurde (Bahn 3).
10: Beziehung zwischen der Wirksamkeit von β-AR-Agonisten im Rattendickdarm und in weißen Fettzellen in Gegenwart von 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol. In der Figur ist die lineare Regressionsgerade der vier Agonisten, mit Ausnahme von SM-11044, dargestellt (r = 0,97, p < 0,05). Der Korrelationskoeffizient, wenn mit SM-11044 berechnet, war nicht signifikant (r = 0,87, p > 0,05). Die Daten geben die pD2-Mittelwerte ± SEM (aus Tabelle 1) wieder.
11: Zeitlicher Verlauf der Assoziation (O, durchgezogene Linie) und der Dissoziation (•, gestrichelte Linie) der spezifischen Bindung von 1 nM [¹²⁵I]-ICYP an Rattendickdarm-Membranen in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol. Die Reversibilität der Bindung wurde durch die Zugabe von 100 μM SM-11044 im Gleichgewichtszustand (30 min) erreicht. Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei Experimenten, welche in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
12: Gesamte unspezifische und spezifische Bindung von [¹²⁵I]-ICYP an Rattendickdarm-Membranen in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 100 μM SM-11044 bestimmt. Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei Experimenten wieder, die in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden. Das eingefügte Bild zeigt ein Scatchard-Diagramm der spezifische Bindung (r = 0,978, p < 0,001). Der Kd-Wert betrug 11,0 ± 0,95 nM, und der Bmax-Wert betrug 716,7 ± 21,12 fmol/mg Protein.
13: Ersetzen der spezifische Bindung von 1 nM [¹²⁵I]-ICYP an Rattendickdarm-Membranen durch (a) Katecholamine, 5-HT und (b) Stereoisomere von SM-11044 in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol. Die Daten geben die Mittelwerte aus zwei bis vier Experimenten, die in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
14: SDS-PAGE, gefolgt durch eine Autoradiographie, von solubilisierten Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 1,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und verschiedenen Kompetitoren. Bahn 1: Kontrolle; Bahn 2: Ersatz durch 20 μM Propranolol; Bahn 3: Ersatz durch 20 μM Propranolol und 100 μM BRL-37344; Bahn 4: Ersatz durch 20 μM Propranolol und 100 μM SM-11044.
15: Zweidimensionale SDS-PAGE, gefolgt durch eine Autoradiographie, von solubilisierten Rattendickdarm-Membranen, photoaffinitätsmarkiert mit 1,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol.
16: Trypsinspaltung der photoaffinitätsmarkierten Rattendickdarm-Membranen. Die teilweise gereinigten, markierten Proteine wurden ohne (Bahn 1) oder mit 50 μg Trypsin (Bahn 2) für 24 h bei 37°C inkubiert, durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt und einer Autoradiographie unterworfen.
17: Ersatz der spezifische Bindung von 1 nM [¹²⁵I]-ICYP an Ratten-Skelettmuskel-Membranen durch SM-11044 und (–)-Isoproterenol in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol. Die Daten geben den Mittelwert ± SEM von zwei Experimenten, welche in doppelter Ausfertigung durchgeführt wurden, wieder.
18: Northern-Blot mit mehreren menschlichen Geweben, welche mit der markierten 300 bp-Sonde hybridisiert wurden. Waschen in 2× SSC, 0,05% SDS bei Raumtemperatur und Exponieren auf einem Hyperfilm MP mit zwei Verstärkungsschirmen bei –80°C für drei Tage. (A) Die Northern-Blot-Hybridisierung wurde mit einer polyadenylierten mRNA aus acht verschiedenen menschlichen glatten und gestreiften Muskeln durchgeführt. (B) Ähnliche Analyse mit einer Vielzahl von nicht-muskulären Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Pankreas). Linke Seite: die Skala gibt das Molekulargewicht des RNA-Markers in Kilobasen (kb) an.
Die 19, 20 und 21 veranschaulichen die Restriktionskarte von SEQ ID NO: 14 (alle Stellen: 19; ausschließlich einmalige Stellen: 20 und 21).
22 veranschaulicht einen Sequenzvergleich mit bekannten Proteinen (Arabidobsis-Protein, hMP70-Protein, p76-Protein, D87444-Protein und Emp70-Protein).
23 veranschaulicht (A) einen Vergleich der Hydropathie-Profile (Kyte & Doolittle) durch das GeneJockey Sequence Processor-Programm zwischen SMBP und den homologen Proteinen D87444, Hu-p76, hMP70 und Emp70 aus Hefe und dem Arabidobsis-Protein. (B) Vergleich der Hydropathie-Profile (Kyte & Doolittle-Verfahren) der C-terminalen hydrophoben Region zwischen SMBP und den homologen Proteinen D87444, Hu-p76, hMP70 und Emp70 aus Hefe.
24 veranschaulicht die Sequenzen, die den hydrophoben Bereichen (Kästchen) entsprechen.
25 veranschaulicht die Immunpräzipitation von mit [¹²⁵I]-iodierten Zellmembranproteinen durch den α8-Antikörper; Bahn 1: COS-Zellen, transfiziert mit einem Vektor, enthaltend den Angiotensin-Rezeptor AT2R; und Bahn 2: COS-Zellen, transfiziert mit einem Vektor, enthaltend die SMBP-Nucleotidsequenz.
Beispiel 1: Isolierung und Charakterisierung des vorliegenden Rezeptors in den Membranen von glatten Muskeln im Rattendickdarm
1) Materialien und Methoden
SM-11044 ((L)-Threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-[3-(4-fluorophenyl)propyl]-serin-pyrrolidinamid-hydrobromid) und (±)-Cyanopindolol wurden bei Sumitomo Pharmaceuticals (Osaka, Japan) synthetisiert. (–)-3-[¹²⁵I]-Iodocyanopindolol ([¹²⁵I]- ICYP) und (±)-3-[¹²⁵I]-Iodocyanopindolol-Diazirin ([¹²⁵I]-ICYP-Diazirin) wurden von Amersham (Buckinghamshire, England) bezogen. Alle anderen Materialien hatten Reagensqualität.
Präparation der Rattendickdarm-Membranen
Tiefgefrorene Rattendickdärme (SD-Stämme, männlich und weiblich) wurden von Pel-Freeze Biologicals (Arkansas, USA) bezogen. Die Membranen der glatten Muskeln im Dickdarm wurden präpariert, wie im Wesentlichen bei Ek et al., 1986, beschrieben ist, wobei die folgenden geringfügigen Modifikationen vorgenommen wurden. Das Dickdarmsegment wurde in einer eiskalten Tris-Salzlösung (10 mM Tris/HCl, 154 mM NaCl (pH 7,4)) gewaschen und in Längsrichtung aufgeschnitten, und die Schleimhaut wurde durch Reiben mit einem Objektträger auf einer eiskalten Kunststoffplatte entfernt. Die Präparationen der glatten Muskeln wurden mit einem Polytron-Homogenisator für 1 min homogenisiert. Das Homogenat wurde durch eine Gaze filtriert und zentrifugiert (1500 × g für 20 min bei 4°C). Der Überstand wurde gesammelt und zentrifugiert (50.000 × g für 20 min bei 4°C). Das Pellet, umfassend die Membranen, wurde in Tris-Salzlösung resuspendiert und bis zum Gebrauch bei –80°C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde durch den Bio-Rad Protein-Test-Kit (Bio-Rad, USA) bestimmt.
Bindungstests mit den Rattendickdarm-Membranen
Die Sättigungsbindungsstudien wurden in einem Endvolumen von 200 μl Tris-Salzlösung, enthaltend 50 μg Membranproteine und verschiedene Konzentrationen (0,05–25 nM) von [¹²⁵I]-ICYP, in Gegenwart von 10 μM Serotonin (5-HT), 10 μM Phentolamin, 20 μM (±)-Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure (pH 7,4) durchgeführt, um mögliche 5-HT-Rezeptoren, ARs bzw. die Oxidation von Katecholaminen zu blockieren. Das [¹²⁵I]-ICYP wurde nach der Entfernung von Methylalkohol durch Druckluft, um einen Einfluß des Lösungsmittels zu vermeiden, verwendet. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 30 min in einem Schüttelwasserbad-Inkubator ausgeführt und durch die Zugabe von 4 ml eiskalter Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen Filtration unter Vakuum auf einem Whatman GF/B-Filter, welcher vorher in Tris-Salzlösung, enthaltend 0,1% Polyethylenimin (pH 7,4) eingeweicht wurde, beendet. Die Filter wurden dreimal mit 4 ml eiskalter Tris-Salzlösung gewaschen, in Kunststoffröhrchen transferiert und in einem Gammazähler gezählt.
Photoaffinitätsmarkierung der Rattendickdarm-Membranen
Die Photoaffinitätsmarkierung wurde in einem Endvolumen von 10 ml Tris-Salzlösung, enthaltend 50 mg der Membranen, 0,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin, ergänzt mit 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin, 20 μM (±)-Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure (pH 7,4), durchgeführt. Die Membranen wurden bei 37°C für 60 min im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad-Inkubator inkubiert. Die Umsetzung wurde durch die Zugabe von 20 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen Zentrifugation (50.000 × g für 10 min bei 4°C), beendet. Die Membranen wurden in 2–3 ml desselben Puffers resuspendiert und unter Kühlen mit zirkulierendem Wasser während 10 min mit einer UV-Lampe bestrahlt (Guillaume et al., 1994). Die markierten Membranen wurden mit 20 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung verdünnt und zentrifugiert (50.000 × g für 30 min bei 4°C). Die markierten Membranen wurden unmittelbar vor der Elektrophorese in SDS-Reduktionspuffer (5% SDS, 1 2β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau, 50 mM Tris/HCl, pH 6,8) für 1 h oder mehr bei Raumtemperatur denaturiert.
Präparative SDS-PAGE und Extraktion der photoaffinitätsmarkierten Proteine
Die präparative SDS-PAGE wurde auf einem großformatigen (160 mm Breite × 200 mm Höhe × 3 mm Dicke) Polyacrylamidgel mit einem 12%igen Trenngel und einem 4%igen Sammelgel (40% T, 2,6% C) unter reduzierenden Bedingungen im Wesentlichen gemäß den Methoden nach Laemmli, 1970, durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele in einen Plastikbeutel verpackt und für 3 Tage bei 4°C auf einem X-OMAT^TM AR-Film (Eastman Kodak Co., USA) einer Autoradiographie unterworfen. Die photoaffinitätsmarkierten Proteine wurden wie folgt durch passive Extraktion extrahiert. Die radioaktive 34 kDa-Bande wurde ausgeschnitten und durch Zerdrücken unter Verwendung einer 10 ml-Einmal-Plastikspritze (Terumo, Japan) in kleine Stücke von weniger als 3 × 3 × 3 mm³ zerkleinert. Die Gele wurden in ein doppeltes Volumen von 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS (Extraktionspuffer), eingetaucht und für 16 h bei 37°C unter Rotieren inkubiert. Der Extrakt wurde unter Verwendung einer SPIN-XII-Vorrichtung (Porengröße 0,45 μm, Costar, USA) bei 1500 × g für 30 min gewonnen. Die zurückbleibenden Gelstücke wurden erneut in ein doppeltes Volumen des Extraktionspuffers eingetaucht und für 2 h bei 37°C unter Rotieren inkubiert, und der Extrakt wurde gewonnen, wie vorstehend beschrieben wurde. Die zwei Extrakte wurden vereinigt und unter Verwendung einer Centripräp-10- und einer Centricon-10-Vorrichtung (Amicon, USA) auf maximal 0,5 ml konzentriert und bei –20°C gelagert.
Chemische Spaltung der Extrakte aus der präparativen SDS-PAGE und Reinigung mittels HPLC
Das photoaffinitätsmarkierte 34 kDa-Protein, welches aus der präparativen SDS-PAGE extrahiert wurde, wurde unter Verwendung der Centricon-10-Vorrichtung zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen und durch einen Vakuumkonzentrator gefriergetrocknet und anschließend mit 200 μl 70%iger Ameisensäure oder 10% CNBr/70%ige Ameisensäure für 24 h bei Raumtemperatur oder 70%iger Ameisensäure für 72 h bei 37°C im Dunkeln behandelt. Die gespaltenen Produkte wurden mit 500 μl destilliertem Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt. Die gespaltenen Produkte wurden in SDS-Reduktionspuffer gelöst und durch die Zugabe von Aliquots von 30% NaOH neutralisiert, bis die Färbung in Blau umschlug, und durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt. Die Gele wurden getrocknet und einer Autoradiographie unterworfen. Die markierten Banden wurden ausgeschnitten, passiv extrahiert und durch Zentrifugation (ProSpin^TM, Applied Biosystems, USA) auf PVDF-Membranen geblotted. Die Membranen wurden dreimal mit 1 ml 20% Methanol gewaschen um SDS und Salze zu entfernen. Die Fragmente wurden mit 200 μl 75% Hexafluoroisopropanol extrahiert. Jede Elution wurde in einem Vakuumkonzentrator auf 20 μl eingedampft, in 75 μl DMSO und 75 μl Ausgangspuffer (15% Acetonitril-15% Isopropanol-0,5% TFA; Puffer A) gelöst und auf eine C4-Umkehrphasensäule (Aquapore Butyl-BU-300, 2,1 mm ID, 10 mm Länge, Applied Biosystems) aufgegeben. Die Trennung erfolgte durch eine 120 min dauernde Gradientenelution bei 40°C mit 50% Acetonitril-50% Isopropanol, enthaltend 0,5% TFA (Puffer B), in einer Durchflußrate von 35 ml/min unter Verwendung eines Waters 625 LC-Systems. Der Gradient reichte von 30% bis 98% Puffer B. Die Elution der Fragmente wurde durch die Absorption bei 210 nm und 275 nm überwacht, und die Elution der mit Iod radioaktiv markierten Produkte wurde durch eine Gammazählung der Fraktionen überwacht.
Tricin-SDS-PAGE
Die chemisch gespaltenen Fragmente wurden auf einem Tricin-Gelsystem unter reduzierenden Bedingungen (Schägger H. et al., 1987) unter Verwendung eines 18%igen Polyacrylamid-Trenngels, enthaltend 10,7% Glycerin, aufgetrennt. Die Gele ließ man für 16 h altern, um den Abbau der reaktiven chemischen Zwischenprodukte nach der Polymerisierung zu ermöglichen.
Aminosäuresequenzierung
Die Aminosäuresequenzbestimmung erfolgte durch einen Edman-Abbau, 1967, mit einem Applied Biosystems 473A-Proteinsequenzanalysengerät. Die Proben wurden auf präzyklisierte Filter, beschichtet mit Polybren (Biobrene, Applied Biosystems), aufgebracht, um die Proteinauswaschung zu verringern und die anfänglichen Ausbeuten zu verbessern.
Antikörperherstellung
Der Antikörper wurde hergestellt, wie im Wesentlichen durch Guillaume et al. (Eur. J. Biochem. 224 (1994), 761–770), beschrieben wurde.
Kurz zusammengefaßt, wurden basierend auf den bestimmten Aminosäuresequenzen Peptide synthetisiert, wobei ein Cysteinrest an den C-terminalen Rest angehängt wurde, um die Kopplung an das Trägerprotein (Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin, KLH) zu erleichtern. Die synthetischen Peptide wurden über ihre Cysteinreste an KLH konjugiert. 0,4 mg des Peptidkonjugats, suspendiert in komplettem Freundschen Adjuvans, wurden intradermal einem Kaninchen injiziert. Nachimpfungen wurden viermal in Abständen von 2 Wochen durch Injektion von 0,2 mg des Peptidkonjugats, suspendiert in inkomplettem Freundschen Adjuvans, verabreicht. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde das Antiserum aus Vollblut gewonnen.
Der Antikörper wurde durch eine Affinitätschromatographie an einer Säule, enthaltend das synthetische Peptid, gekoppelt an aktivierte Thiol-Sepharose-4B (Pharmacia) über einen Cysteinrest am C-Terminus, gereinigt, und der Antikörpertiter gegen das freie Peptid ohne eine Konjugation an KLH wurde durch einen ELISA bestimmt.
Immunpräzipitation
Insgesamt wurden Mengen von 10 mg der Membranen mit 1,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin, 20 μM Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure in 10 ml Tris-Salzlösung (pH 7,4) photoaffinitätsmarkiert. Die Membranen wurden in einer Menge von 1 mg Membranprotein/ml Tris-Salzlösung, enthaltend 2% n-Octylglucosid (n-Octyl-β-D-glucopyranosid, Sigma), für 2 h auf Eis unter gelegentlichem Mischen solubilisiert. Die solubilisierten Proteine wurden durch Zentrifugation (200.000 × g, 30 min bei 4°C) von dem unlöslichen Material getrennt. Die Proteine wurden mit 8 M Harnstoff für 1 h bei Raumtemperatur unter gelegentlichen Mischen behandelt und unter Verwendung einer Centricon-10-Vorrichtung fünfmal mit Tris-Salzlösung gewaschen. Die solubilisierten Membranproteine wurden in 1 ml Tris-Salzlösung, enthaltend 0,1% Tween-20, gelöst und mit 10 μg Antikörper und 50 μl Protein A-Agarose-Kügelchen (Boehringer-Mannheim, Deutschland) für 16 h bei 4°C unter Rotieren inkubiert. Das Präzipitationsprodukt wurde vorsichtig fünfmal mit einer eiskalten Tris-Salzlösung, enthaltend 0,1% Tween-20, gewaschen und in SDS-Reduktionspuffer für mehr als 1 h bei Raumtemperatur denaturiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden einer 12%igen SDS-PAGE und anschließend einer Autoradiographie unterworfen.
Western-Blot
Die photoaffinitätsmarkierten Membranen (40 μg Protein) wurden durch eine 12%ige SDS-PAGE aufgetrennt. Der Elektrotransfer der Proteine auf Nitrocellulose wurde im Wesentlichen gemäß Towbin et al., 1979, mit einer Trans-Blot-SD-Apparatur (Bio-Rad) für 1 h bei einer Stromstärke von 1 mA/cm² ausgeführt. Die Nitrocellulosemembranen wurden dreimal mit Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 0,2% Tween-20, gewaschen und in PBS, enthaltend 5% entrahmtes Milchpulver und 0,2% Tween-20, für 1 h bei Raumtemperatur abgesättigt. Man ließ den Antikörper (2 μg/ml in PBS, enthaltend 1% entrahmtes Milchpulver und 0,2% Tween-20; Puffer C) für 16 h bei 4°C reagieren.
Nach dreimaligem Waschen in Puffer C wurden die Nitrocellulosestreifen für 45 min bei Raumtemperatur mit einem an Peroxidase konjugierten, affinitätsgereinigten Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immuno-Research Laboratories, USA) in einer Verdünnung von 1:2500 in Puffer C inkubiert und dreimal in Puffer C gewaschen. Nach dem Waschen in PBS, enthaltend 0,2% Tween-20, wurden die reaktiven Banden mit einem ECL-Kit (Amersham, England) sichtbar gemacht. In Inhibitionsexperimenten wurde der Antikörper für 2 h bei 37°C mit dem freien Peptid in einer Konzentration von 10 μg/ml in Puffer C vorinkubiert.
2) Ergebnisse
Extraktion des photoaffinitätsmarkierten SMBP
Aus 600 glatten Muskeln des Rattendickdarms wurden 2,0 g Membranproteine gewonnen. Die Ligandenbindungsaktivität von SMBP wurde durch [¹²⁵I]-ICYP unter Blockade der Adreno- und Serotonin-Rezeptoren abgeschätzt. Durch eine Scatchard-Diagramm-Analyse wurde eine einzelne Klasse von Bindungsstellen mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von 7,22 ± 0,007 nM und einer maximalen Anzahl an Bindungsstellen (Bmax) von 1,13 ± 0,071 pmol/mg Membranprotein (zwei unabhängige Experimente, durchgeführt in doppelter Ausfertigung, ausgedrückt als Mittelwert ± SD) nachgewiesen.
Das SMBP war zu hydrophob, um durch eine Säulenchromatographie wie eine Umkehrphasen-HPLC mit einer C4-Säule (Aquapore Butyl-BU-300, Applied Biosystems), Ionenaustauschchromatographie (Aquapore Weak Anion AX-300, Applied Biosystems), Chromatofokussierung (PBE 94 und Polybuffer 74, Pharmacia) oder Hydroxyapatitchromatographie (BioGel HPHT, Bio-Rad) abgetrennt zu werden. Eine präparative SDS-PAGE wurde durchgeführt, um das SMBP unmittelbar nach der Photoaffinitätsmarkierung abzutrennen. Fünfzig mg der markierten Membranen konnten auf eine Reihe von Polyacrylamidgelen aufgegeben werden, ohne daß eine nennenswerte Diffusion des markierten 34 kDa-SMBP beobachtet wurde (1). Die passive Extraktion der 34 kDa-Banden ergab eine Ausbeute von 79,3–86,2% der gesamten radioaktiven Proteine in den Gelen.
Chemische Spaltung, Reinigung und Sequenzierung
Die chemische Spaltung weist gegenüber der proteolytischen Spaltung einige Vorteile auf. Sie vermeidet eine Verunreinigung durch die Protease selbst und erzeugt eine begrenzte Anzahl an großen Fragmenten. Analytisch wurde jeweils 1 mg des markierten 34 kDa-Proteins mit 10% CNBr in 70%iger Ameisensäure oder in 75%iger TFA behandelt, um die Auswirkung der Säure zu vergleichen. Unter Ameisensäure-Bedingungen erzeugte das CNBr drei markierte Fragmente von 8 kDa, 10 kDa und 12 kDa, und Ameisensäure allein erzeugte ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa. Unter den Säurebedingungen mit TFA wurde der überwiegende Teil der Markierung durch die Säure selbst abgespalten, wobei ein einzelnes markiertes Fragment von 10 kDa durch die CNBr-Spaltung beobachtet wurde (2).
Der Extrakt des markierten 34 kDa-Proteins aus 400 mg der Membranen (411794 CpM) wurde durch CNBr/Ameisensäure präparativ gespalten, und ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf Tricin-SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Drei markierte Fragmente von größtenteils 12 kDa und in geringerer Menge von 8 kDa und 10 kDa wurden auf einem Autoradiogramm der mit Coomassie-Blau gefärbten Gele beobachtet (3).
Die Spaltung des photoaffinitätsmarkierten 34 kDa-Proteins an den Methioninresten durch die Behandlung mit CNBr/Ameisensäure für 24 h bei Raumtemperatur ergab drei markierte Fragmente (8 kDa, 10 kDa und 12 kDa, 4a, Bahn 3). Die Behandlung mit Ameisensäure allein erzeugte ein einzelnes Fragment von 8 kDa (4a, Bahn 2), und die Dichte der 8 kDa-Bande erhöhte sich bei längerer Inkubation (für 72 h bei 37°C, 4b, Bahn 2).
Der Extrakt des markierten 34 kDa-Proteins aus 400 mg der Membranen (381198 CpM) wurde durch Ameisensäure präparativ gespalten, und ein Aliquot der gespaltenen Produkte wurde auf Tricin-SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa wurde auf einem Autoradiogramm der mit Coomassie-Blau gefärbten Gele beobachtet (5). Das radioaktive Fragment von 8 kDa (insgesamt 21400 CpM) im präparativen Maßstab wurde durch passive Extraktion aus den Tricin-SDS-PAGE-Gelen ohne Färbung mit Coomassie-Blau extrahiert und auf PVDF-Membranen geblotted (19581 CpM). Das Fragment wurde aus den PVDF-Membranen extrahiert (10045 CpM) und durch eine Umkehrphasen- HPLC weiter gereinigt. Ein radioaktiver Peak wurde bei 62% Puffer B beobachtet (Fraktion Nr. 27 und 28; insgesamt 3239 CpM, 6). Die gesamte Rückgewinnungsausbeute der anfänglichen Radioaktivität betrug 91,6%. Die Peakfraktionen wurden einer Untersuchung mit einem Proteinsequenzanalysengerät unterworfen, und die erhaltene Aminosäuresequenz war wie folgt:

in Klammern: erwartete Aminosäure
X: unbestimmte Aminosäure.

Eine analytische CNBr-Spaltung ergab, daß die Spaltung an dem Methioninrest in Gegenwart von TFA, welche die Spaltung an CNBr-resistenten Bindungen wie Met-Thr oder Met-Ser verbessert (Fontana A. et al., 1986), ein einzelnes Fragment von 10 kDa erzeugte.
Unter Ameisensäure-Bedingungen erzeugte das CNBr drei markierte Fragmente von 8 kDa, 10 kDa und 12 kDa, und Ameisensäure allein erzeugte ein einzelnes markiertes Fragment von 8 kDa. Diese Daten legen nahe, daß das 12 kDa-Fragment einen CNBr-resistenten Methioninrest enthält, welcher durch CNBr/TFA in ein 10 kDa-Fragment gespalten wird, und daß das durch Ameisensäure allein erzeugte 8 kDa-Fragment ein Produkt der Spaltung an einer säureempfindlichen Bindung wie Asp-Pro ist.
Immunpräzipitation und Western-Blot
Das der N-terminalen Sequenz des 8 kDa-Fragments entsprechende Peptid (Acetyl-FFQHRIHVFSIFNHC) wurde an KLH gekoppelt, und das Konjugat wurde dazu verwendet, einen Antikörper mit einem hohem Titer hervorzurufen. Die Antikörperantwort wurde bei einer Verdünnung von 2 × 10^–5 des Antiserums und bei 0,08 μg/ml des affinitätsgereinigten Antikörpers (α8-Antikörper) beobachtet, wie durch einen ELISA gegen das freie Peptid ohne Konjugation an KLH abgeschätzt wurde (7).
Das dem 8 kDa-Fragment entsprechende synthetische Peptid war hydrophob und konnte nicht ohne Dimethylsulfoxid in einem Puffer gelöst werden. Zuerst wurde das aus präparativen SDS-PAGE-Gelen extrahierte, markierte 34 kDa-Protein nach der Entfernung von SDS verwendet, aber es wurde kein markiertes Protein immunpräzipitiert. Nach der Solubilisierung der photoaffinitätsmarkierten Membranen durch n-Octylglucosid, gefolgt durch eine Denaturierung mit Harnstoff, wurde das markierte 34 kDa-SMBP durch den α8-Antikörper immunpräzipitiert (8).
Der α8-Antikörper erkannte in einem Western-Blot nur eine 70 kDa-Bande. Die Spezifität des Antikörpers wurde durch die Fähigkeit des freien Peptids, die Bindung des Antikörpers an das 70 kDa-Protein zu hemmen, veranschaulicht (9). In einem anderen Experiment wurde das photoaffinitätsmarkierte SMBP durch eine zweidimensionale Elektrophorese im präparativen Maßstab gereinigt, und der markierte 34 kDa-Fleck in den Gelen wurde isoliert, extrahiert und einer SDS-PAGE unterworfen. Zwei markierte Banden von 34 kDa und 70 kDa, abgeleitet von 34 kDa, wurden beobachtet, was zeigt, daß das 70 kDa-Protein ein Dimer sein könnte.
Beispiel 2: Pharmakologische Eigenschaften des Ratten-Rezeptors gemäß Beispiel 1
Die durch Katecholamine induzierten relaxierenden Antworten, welche nicht für eine Blockade der α-, β1- und β2-Adrenorezeptoren (ARs) anfällig sind, sind für eine Reihe von Präparationen aus gastrointestinalen glatten Muskeln, wie aus dem Ileum des Meerschweinchens (Bond R.A. et al., 1988), dem proximalen Dickdarm der Ratte (Croci T. et al., 1988), dem distalen Dickdarm der Ratte (McLaughlin D.P. et al., 1990), dem Magenfundus der Ratte (McLaughlin D.P. et al., 1990) und dem Jejunum der Ratte (Van der Vliet A. et al., 1990), beschrieben worden. Manara et al., 1990, berichteten sogar, daß die durch Phenylethanolaminotetraline stimulierte Relaxation des Rattendickdarms parallel zu der Lipolyse in den Fettzellen der Ratte erfolgt, was nahe legt, daß an dieser Antwort überwiegend β3-ARs beteiligt sind.
1) Materialien und Methoden
Chemikalien
SM-11044 ((L)-Threo-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-[3-(4-fluorophenyl)propyl]serin-pyrrolidinamid-hydrobromid), SM-14786 ((D)-Threo-Isomer von SM-11044), SM-14011((DL)-Threo-Isomer von SM-11044), SM-14010 ((DL)-Erythro-Isomer von SM-11044), BRL-35135A ((R*R*)-(+)-4-[2'-[2-hydroxy-2-(3-chlorphenyl)ethylamino]propyl]phenoxyessigsäure-methylester), BRL-37344 (Säuremetabolit von BRL- 35135A) und [¹²⁵I]-Cyanopindolol wurden bei Sumitomo Pharmaceuticals (Osaka, Japan) synthetisiert. CGP-12177A und CGP-20712A waren Gaben der Ciba-Geigy Corporation (Basel, Schweiz). ICI-198157 ((RS)-4-[2-[(2-hydroxy-3-phenoxypropyl)amino]ethoxy]phenoxyessigsäuremethylester), ICI-201651 (Säuremetabolit von ICI-198157) und ICI-215001 ((S)-Isomer von ICI-201651) sowie ICI-118551 wurden von Zeneca Pharmaceuticals (Macclesfield, England) bezogen. SR-58611A ((RS)-N-(7-carbethoxymethoxyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-2-yl)-2-hydroxy-2-(3-chlorphenyl)ethanaminhydrochlorid) war eine Gabe von Sanofi-Midy (Mailand, Italien). (+)-Carazolol wurde von Boehringer Mannheim (Mannheim, Deutschland) bezogen. (+)-Bupranolol war eine Gabe von Schwarz Pharma (Monheim, Deutschland). (–)-3-[¹²⁵I]-Iodocyanopindolol ([¹²⁵I]-ICYP) und (+)-3-[¹²⁵I]-Iodocyanopindolol-Diazirin ([¹²⁵I]-ICYP-Diazirin) wurden von Amersham (Buckinghamshire, England) bezogen. Alle anderen Wirkstoffe wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen.
Relaxation des Rattendickdarms
Ein Rattendickdarmsegment (2 cm) wurde in einem Organbad, enthaltend 10 ml modifizierte Tyrode-Lösung (Sugasawa T. et al., Eur. J. Pharmacol. 216 (1992), 207–215), suspendiert. Die Tyrode-Lösung enthielt in der Studie 0,5 μM Atropin, 0,5 μM Desmethylimipramin, 30 μM Hydrokortison, 30 μM Ascorbinsäure, 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol, um eine spontane Kontraktion, eine neuronale und extraneuronale Aufnahme von Norepinephrin, die Oxidation von Katecholaminen bzw. mögliche α-, β1- und β2-AR-Effekte zu hemmen.
Die relaxierende Wirkung von Agonisten wurde durch Messung der Relaxation eines durch KCl (100 mM) induzierten Tonus, hervorgerufen durch die kumulative Zugabe der Agonisten, wie bereits beschrieben (Sugasawa T. et al., vorstehend erwähnt), bestimmt. Im Falle der Untersuchung der Wirkung von Cyanopindolol wurde dieses 5–10 min vor der Zugabe des Agonisten zugegeben.
Lipolyse in weißen Fettzellen der Ratte
Weiße Fettzellen wurden aus den Nebenhoden-Fettpolstern männlicher Wistar-Ratten (190–230 g) isoliert, und die Lipolyse wurde gemäß dem vorhergehenden Bericht (Sugasawa T. et al., vorstehend erwähnt) bestimmt. Die Zellen wurden für 5 min bei 37°C in Gegenwart von 30 μM Ascorbinsäure, 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol vorinkubiert.
Anschließend wurden die Agonisten zugegeben und während 90 min inkubiert. Im Falle der Untersuchung der Wirkung von Cyanopindolol wurde dieses 5 min vor der Zugabe des Agonisten zugegeben.
Schild-Diagramm
Die Agonistenkonzentrationsverhältnisse (CR) wurden aus den EC₅₀-Werten der Konzentration-Antwort-Kurven der Agonisten mit oder ohne Cyanopindolol nach der Methode von Arunlakshana et al., 1959, bestimmt.
Eine lineare Regressionsanalyse wurde angewendet, um den pA₂-Wert und die Steigung der Geraden nach der Bestätigung, daß die Regression linear war und daß die Gerade sich nicht wesentlich von Eins verschieden war (Cochran-Cox-Test, p > 0,05), abzuschätzen. Die EC₅₀-Werte wurden unter Verwendung des Computerprogramms InPlot^TM berechnet.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Die statistische Signifikanz zwischen zwei Datensätzen wurde abhängig von der Homogenität der Varianzen durch den Student-t-Test oder den Cochran-Cox-Test untersucht. Der multiple Rangtest nach Duncan wurde für mehrere Datensätze verwendet. Ein Wahrscheinlichkeitswert von p < 0,05 wurde als signifikant angesehen.
Membranpräparation
Die Membranen von glatten Muskeln des Dickdarms und von Skelettmuskeln wurden aus männlichen Wistar-Ratten (300–360 g) präpariert, wie im Wesentlichen in Beispiel 1 erwähnt wurde.
Bindungstests mit den Membranen
Die Sättigungsbindungsstudien wurden in einem Endvolumen von 200 μl Tris-Salzlösung, enthaltend 50 μg Membranproteine und verschiedene Konzentrationen (0,05–25 nM) von [¹²⁵I]-ICYP, ergänzt mit 10 μM Serotonin (5-HT), 10 μM Phentolamin, 20 μM Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure (pH 7,4), durchgeführt, um mögliche 5-HT-Rezeptoren, ARs bzw. die Oxidation von Katecholaminen zu blockieren. Das [¹²⁵I]-ICYP wurde nach der Entfernung von Methylalkohol durch Druckluft, um einen Einfluß des Lösungsmittels zu vermeiden, verwendet. Die Inkubationen wurden bei 37°C für 30 min in einem Schüttelwasserbad-Inkubator ausgeführt und durch die Zugabe von 4 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen Filtration unter Vakuum auf einem Whatman GF/B-Filter, welcher vorher in Tris-Salzlösung, enthaltend 0,1% Polyethylenimin (pH 7,4) eingeweicht wurde, beendet. Die Filter wurden dreimal mit 4 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung gewaschen, in Kunststoffröhrchen transferiert und in einem Gammazähler gezählt.
Die Kompetitionstests wurden gegen 1 nM [¹²⁵I]-ICYP durchgeführt. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 100 μM SM-11044 bestimmt. Die Inhibitionskonstante Ki eines Liganden wurde unter Verwendung der durch Cheng und Prusoff (Biochem. Pharmacol. 22 (1973), 3099–3108) beschriebenen Gleichung berechnet. Der Hill-Koeffizient wurde durch eine lineare Regression unter Verwendung der Daten aus den Sättigungsexperimenten berechnet. Der Pseudo-Hill-Koeffizient und der IC₅₀-Wert wurden durch das Computerprogramm InPlot^TM (GraphPad Software, CA, USA) berechnet.
Photoaffinitätsmarkierung der Membranen
Die Photoaffinitätsmarkierung wurde in einem Endvolumen von 1 ml Tris-Salzlösung, enthaltend 0,5 mg der Membranen, 1,5 nM [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin, ergänzt mit 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin, 20 μM Propranolol und 1,1 mM Ascorbinsäure (pH 7,4), durchgeführt. Die Inkubationen wurden in Anwesenheit oder Abwesenheit des Kompetitors bei 37°C für 45 min im Dunkeln in einem Schüttelwasserbad-Inkubator ausgeführt und durch die Zugabe von 10 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung, gefolgt von einer schnellen Zentrifugation (150.000 × g für 10 min bei 4°C), beendet. Die Membranen wurden unter Kühlen mit zirkulierendem Wasser für 5 min mit einer UV-Lampe bestrahlt. Die markierten Membranen wurden mit 10 ml einer eiskalten Tris-Salzlösung verdünnt und zentrifugiert (150.000 × g für 30 min bei 4°C), und das Pellet wurde in Tris-Salzlösung resuspendiert und bei –80°C gelagert.
SDS-PAGE
Die SDS-PAGE wurde unter reduzierenden Bedingungen, im Wesentlichen wie durch Laemmli, 1970, beschrieben, unter Verwendung von 12%igen Polyacryl amidgelen (40% T, 2,6% C) durchgeführt. Die photoaffinitätsmarkierten Membranen wurden für mindestens 1 h bei Raumtemperatur in SDS-Probenpuffer (5% SDS, 1% 2β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau, 50 mM Tris/HCl (pH 6,8)) inkubiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele getrocknet und einer Autoradiographie auf einem X-OMAT^TM AR-Film (Eastman Kodak Co., USA) unterworfen, wie in Beispiel 1, Kapitel "Präparative SDS-PAGE", angegeben wurde.
Zweidimensionale PAGE der photoaffinitätsmarkierten Membranen
Die in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol photoaffinitätsmarkierten Membranen wurden in IEF-Probenpuffer (8 M Harnstoff, 0,3% SDS, 5,6% Triton X-100, 2,8% 2β-Mercaptoethanol, 1,1% Bio-Lyte 5/8-Ampholyt und 0,6% Bio-Lyte 8/10-Ampholyt (Bio-Rad)) solubilisiert, und 30 μg der Membranproteine wurden einer IEF-Elektrophorese innerhalb eines pl-Bereiches von 5–10 in Röhrchen mit einem 4%igen Polyacrylamidgel, enthaltend 2,0% Bio-Lyte 5/8-Ampholyt, 1,0% Bio-Lyte 8/10-Ampholyt, 8 M Harnstoff und 2% Triton X-100, unterworfen. Die zweite Dimension wurde auf einer SDS-PAGE mit 9%igen Polyacrylamidgelen durchgeführt. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
Spaltung durch Endoglycosidase oder N-Glycopeptidase F
Die in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol photoaffinitätsmarkierten Membranen wurden mit N-Glycopeptidase F (PNGase F, EC 3.2.2.18) oder Endoglycosidase (Endo-Hf, EC 3.2.1.96) unter Verwendung von Kits entsprechend den Beschreibungen des Herstellers (New England Bio-Labs, MA, USA) behandelt. Kurz zusammengefaßt, wurden die Membranen in 0,5% SDS und 1% 2β-Mercaptoethanol solubilisiert, und 40 μg der Membranproteine wurden mit 5000 Einheiten PNGase F in Gegenwart von 1% NP-40 oder mit 2000 Einheiten Endo-Hf für 3 h bei 37°C inkubiert. Die gespaltenen Proben wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen Polyacrylamidgelen unterworfen. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
Weizenkeimagglutinin (WGA)-Sepharose-Chromatographie
Die in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol photoaffinitätsmarkierten Membranen wurden in 1% Triton X-100 in Tris-Salzlösung bei 4°C für 16 h solubilisiert. Das solubilisierte Material wurde nach einer Zentrifugation (200.000 × g für 1 h bei 4°C) gesammelt und mit Tris-Salzlösung auf 0,1% Triton X-100 verdünnt. Ein 1 ml-Gelbettvolumen von WGA-Sepharose 6MB (Sigma) wurde gewaschen und mit 30 ml 0,1% Triton X-100 in Tris-Salzlösung (Puffer A) äquilibriert, und 1 ml des solubilisierten Materials, enthaltend 200 μg Membranproteine, wurde bei Raumtemperatur aufgegeben. Die nicht zurückgehaltene Fraktion wurde dreimal wiederverwendet. Nach Waschen mit 10 ml Puffer A wurde das gebundene Material mit 5 ml 300 mM N-Acetyl-D-glucosamin (Merck) in Puffer A eluiert. Die Fraktionen wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen Polyacrylamidgelen unterworfen. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
Trypsinspaltung
Die photoaffinitätsmarkierten Membranen wurden einer SDS-PAGE auf 12%igen Polyacrylamidgelen unterworfen. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen. Die radioaktive Bande bei 34 kDa wurde ausgeschnitten, in destilliertes Wasser eingetaucht und in kleine Stücke (2 mm Breite × 2 mm Höhe) zerkleinert. Die isolierten Gelstücke, entsprechend 800 μg der Membranproteine, wurden in 500 μl 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS und 50 μg Trypsin (EC 3.4.21.4, Typ IX aus der Schweinebauchspeicheldrüse, Sigma), für 24 h bei 37°C nach der Methode von Kawasaki H. et al., 1990, gespalten. Nach der Spaltung wurde der Überstand gewonnen und unter Verwendung eines SPIN-X-Filters (Porengröße 0,45 mm, Costar, MA, USA) filtriert. Die Gelstücke wurden mittels Zentrifugation für 10 min bei 14.000 × g durch ein Nylonsieb (200 Mesh) gepreßt. Ein doppeltes Volumen von 100 mM Tris/HCl, enthaltend 0,1% SDS, wurde zu den zerdrückten Gelen zugegeben, und eine zweite Extraktion wurde durch eine Inkubation für 2 h bei 37°C unter Rotieren durchgeführt. Nach der Inkubation wurden die Überstände mit Hilfe eines SPIN-X-Filters gewonnen. Die zwei Extrakte wurden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und einer Tricin-SDS-PAGE unterworfen.
Chemische Spaltung
Das photoaffinitätsmarkierte 34 kDa-Protein wurde durch eine SDS-PAGE isoliert und mit 100 mM Tris/HCl (pH 8,0), enthaltend 0,1% SDS, wie vorstehend beschrieben, extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt durch eine Centricon-10-Vorrichtung (Amicon, MA, USA) konzentriert und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die Extrakte wurden durch einen Vakuumkonzentrator gefriergetrocknet und mit 200 μl 70%iger Ameisensäure oder 1% CNBr/70%iger Ameisensäure für 24 h bei Raumtemperatur oder 70%iger Ameisensäure für 72 h bei 37°C im Dunkeln behandelt. Die gespaltenen Produkte wurden mit 500 μl destilliertem Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Dieses Waschverfahren wurde dreimal wiederholt. Die gespaltenen Produkte wurden durch eine Tricin-SDS-PAGE aufgetrennt.
Tricin-SDS-PAGE
Die mit Trypsin und die chemisch gespaltenen Fragmente wurden auf einem Tricin-Gelsystem unter reduzierenden Bedingungen (Schägger H. et al., 1987) unter Verwendung eines 18%igen Polyacrylamid-Trenngels, enthaltend 10,7% Glycerin, aufgetrennt. Nach der Elektrophorese wurden die Gele mit 0,25% Coomassie-Brilliantblau R-250 (Sigma) in 40% Methanol und 10% Essigsäure gefärbt und in 10%iger Essigsäure entfärbt. Die Gele wurden anschließend getrocknet und einer Autoradiographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen.
2) Ergebnisse
Funktionelle Studien am Rattendickdarm und an weißen Fettzellen
Unter Blockade von α-, β1- und β2-ARs (in Gegenwart von 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol) relaxierte eine Reihe von β-AR-Agonisten den durch KCl induzierten Tonus der glatten Muskeln in dem Rattendickdarmsegment, wobei die Rangordnung der Wirksamkeit wie folgt war: BRL-37344 > SM-11044 > Isoproterenol > Norepinephrin = Epinephrin (Tabelle 1). Tabelle 1 Wirksamkeit von Agonisten im Hinblick auf eine Relaxation im Rattendickdarm und die Lipolyse in weißen Fettzellen der Ratte in Gegenwart von 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol

Statistische Signifikanz zwischen IA-Werten: * p < 0,05; ** p < 0,01 vs. Isoproterenol (multipler Rangtest nach Duncan).

Der IA-Wert von SM-11044 war signifikant höher als der für Isoproterenol (multipler Rangtest nach Duncan), was auf unterschiedliche Wirkungsweisen hinweist. In den weißen Fettzellen der Ratte stimulierten dieselben Agonisten die Lipolyse mit einer Rangordnung der Wirksamkeit wie folgt: BRL-37344 >> SM-11044 = Isoproterenol > Norepinephrin > Epinephrin (Tabelle 1). Die lineare Regressionsgerade für Isoproterenol, Norepinephrin, Epinephrin und BRL-37344 zeigt eine signifikante Korrelation (r = 0,97, p < 0,05) zwischen der durch einen Agonisten induzierten Relaxation im Rattendickdarm und der Lipolyse in den Fettzellen auf (10), was nahelegt, daß an beiden Effekten überwiegend derselbe atypische β-AR beteiligt ist, daß heißt, eine β3-AR-Stimulierung erfolgt. Im Gegensatz zu den vier Liganden war SM-11044 bei der Stimulierung der Relaxation im Dickdarm wirksamer als bei der Lipolyse in den Fettzellen (10). In der Tat war der Korrelationskoeffizient nicht mehr signifikant, wenn die lineare Regression mit allen Agonisten einschließlich SM-11044 analysiert wurde (r = 0,87, p > 0,05). Diese Daten legen nahe, daß SM-11044 auf β3-AR und eine weitere funktionelle Stelle, welche die Relaxation im Rattendickdarm vermittelt, einwirkt. Der Antagonismus von Cyanopindolol gegenüber SM-11044 und gegenüber Isoproterenol wurde in beiden Präparationen verglichen. Cyanopindolol selbst hatte bis zu der hierin verwendeten Konzentration von 10 μM keinen Einfluß auf den durch KCl im Rattendickdarm induzierten Tonusgrad und stimulierte nicht den Fettabbau in den weißen Fettzellen der Ratte. Cyanopindolol antagonisierte die durch einen Agonisten induzierte Relaxation im Rattendickdarm in einer konzentrationsabhängigen Weise mit pA₂-Werten für SM-11044 von 8,31 (Steigung = 0,78) und für Isoproterenol von 7,65 (Steigung = 1,03) (Tabelle 2). Tabelle 2 pA₂-Werte für Cyanopindolol im Rattendickdarm und in weißen Fettzellen der Ratte in Gegenwart von 10 μM Phentolamin und 1 μM Propranolol
Cyanopindolol antagonisierte auch die durch einen Agonisten induzierten Lipolyse in den weißen Fettzellen der Ratte in einer konzentrationsabhängigen Weise mit pA₂-Werten für SM-11044 von 7,32 (Steigung = 0,96) und für Isoproterenol von 7,44 (Steigung = 1,08) (Tabelle 2). Die ähnlichen pA₂-Werte für Isoproterenol im Dickdarm (7,65), für SM-11044 in Fettzellen (7,32) und für Isoproterenol in Fettzellen (7,44), wobei die Steigungen nahe Eins liegen, zeigt den kompetitiven Antagonismus von Cyanopindolol für die beiden Agonisten, welche an β3-AR binden. Alle Steigungen in den Schild-Diagrammen waren nicht signifikant von Eins verschieden. Jedoch schien nur die Steigung für SM-11044 im Rattendickdarm (0,78) weniger als Eins zu betragen, wobei ein hoher pA₂-Wert (8,31) erhalten wurde, was nahe legt, daß SM-11044 und Cyanopindolol nicht nur um die Bindung an β3-AR, sondern auch um die weitere funktionelle Stelle im Rattendickdarm konkurrieren.
Bindungstests mit Rattendickdarm-Membranen
Um die vorhergesagte funktionelle Stelle zu identifizieren, um die SM-11044 und Cyanopindolol konkurrieren, wurden Bindungsstudien mit den Membranen von glatten Muskeln im Rattendickdarm unter Verwendung von [¹²⁵I]-ICYP als Radioligand und SM-11044 für den Nachweis der unspezifischen Bindung unter Blockade von Serotonin-, α-, β1-, β2- und auch β3-adrenergen Rezeptoren (in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol) durchgeführt. Der zeitliche Verlauf der spezifischen Bindung von [¹²⁵I]-ICYP (1 nM) an die Rattendickdarm-Membranen wurde in 11 veranschaulicht. Die spezifische Bindung erreichte nach 30 min ein Gleichgewichtsniveau (82,7 ± 1,9%, n = 2) und wurde durch Zugabe von SM-11044 umgekehrt. Die Ergebnisse eines Sättigungsexperiments mit ansteigenden Mengen von [¹²⁵I]-ICYP, welche im Gleichgewichtszustand ausgeführt wurden (30 min Inkubation), sind in 12 dargestellt. Eine Scatchard-Diagramm-Analyse zeigte eine einzelne Klasse von Bindungsstellen mit einer Dissoziationskonstante (Kd) von 11,0 ± 0,95 nM und einer maximalen Anzahl an Bindungsstellen (Bmax) von 716,7 ± 21,12 fmol/mg Protein (r = 0,978, p < 0,001) auf. Eine Hill-Diagramm-Analyse der Sättigungskurve ergab einen Koeffizienten von 0,99 ± 0,03 (r = 0,998, p < 0,0001), was das Fehlen einer Kooperativität zeigt.
In Kompetitionsbindungsstudien wurde die spezifische Bindung bis zur Konzentration von 1 mM weder durch Isoproterenol, Norepinephrin, Epinephrin, Dopamin noch 5-HT ersetzt (13a, Tabelle 1). Die Kompetitionsbindung durch Isomere von SM-11044 war stereoselektiv, wobei SM-14011 (das racemische Threoisomer, Ki 2,0 μM) 15-mal wirksamer war als SM-14010 (das racemische Erythroisomer, Ki 29,3 μM) (13b, Tabelle 3). Der β1-AR-Antagonist CGP20712A und der β3-AR-Agonist BRL-37344 ersetzten bis zur Konzentration von 100 μM die spezifische Bindung nicht. Der β2-AR-Antagonist ICI-118551 war bei einem relativ hohen Ki-Wert (28,5 μM) wirksam (Tabelle 3). Cyanopindolol war der wirksamste Kompetitor mit einem Ki-Wert von 0,11 μM, und Pindolol hatte bis zur Konzentration von 100 μM keinen Einfluß. Carazolol, ein mit Cyanopindolol strukturell verwandter Ligand, war weniger wirksam, obwohl er lipophiler ist (Tabelle 3). Interessanterweise ersetzen BRL-35135A (der Methylester von BRL-37344) und ICI-198157 (der Methylester von ICI-201651) sowie ICI-215001, ein (S)-Enantiomer von ICI-201651, die spezifische Bindung, während die entsprechenden Säuremetabolite inaktiv waren (Tabelle 3). Die spezifische Bindung wurde durch GTP signifikant verringert (29,8 ± 2,7% Hemmung bei 300 μM (p < 0,01) bzw. 98,2 ± 1,3% bei 1 mM (p < 0,001), n = 2). Tabelle 3 Affinitätswerte (Ki-Werte) verschiedener Liganden für die spezifische Bindung von [¹²⁵I]-ICYP an Rattendickdarm-Membranen in Gegenwart von 10 μM 5-HT, 10 μM Phentolamin und 20 μM Propranolol
Photoaffinitätsmarkierungsstudie
Die Photoaffinitätsmarkierung wurde durchgeführt, um die spezifische Bindungsstelle in den Rattendickdarm-Membranen unter Verwendung von [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin sichtbar zu machen. In Gegenwart von 10 μM 5-HT und 10 μM Phentolamin, aber in Abwesenheit von Propranolol wurde zusätzlich zu zwei breiten Banden mit scheinbaren Molekularmassen von 50 kDa und 70 kDa eine einzelne dichte Bande von 34 kDa sichtbar gemacht (14, Bahn 1). Im Gegensatz dazu blieb in Gegenwart von 20 μM Propranolol, 10 μM 5-HT und 10 μM Phentolamin, daß heißt, unter denselben Bedingungen wie bei dem Kompetitionsbindungstest mit [¹²⁵I]-ICYP, nur die 34 kDa-Bande sichtbar (14, Bahn 2). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die zwei breiten Banden β-ARs sind. Außerdem wurde die 34 kDa-Bande nicht durch 100 μM BRL-37344, aber durch 100 μM SM-11044 ersetzt (14, Bahn 3 bzw. 4). Diese Daten stützen die Ergebnisse des Kompetitionsbindungstests, was auf die Existenz einer einzelne spezifische Bindungsstelle für [¹²⁵I]-ICYP und SM-11044 hinweist.
Eine zweidimensionale PAGE der photoaffinitätsmarkierten Membranen bestätigte die Markierung einer einzelnen Polypeptidkette von 34 kDa, welche einem pl-Wert von 6,0 entspricht (15). Die Molekülgröße des photoaffinitätsmarkierten 34 kDa-Proteins wurde durch die enzymatischen Behandlungen mit Endoglycosidase oder N-Glycopeptidase F nicht modifiziert, während beide Enzyme die Molekülgröße von Ovalbumin von 43 kDa auf 40 kDa verringerten. Das solubilisierte, photoaffinitätsmarkierte 34 kDa-Protein (373,298 CpM) wurde auf eine WGA-Sepharose-Säule aufgegeben. Die nicht zurückgehaltene Fraktion enthielt 35,7% der Radioaktivität, und die ausgewaschenen Fraktionen enthielten 53,3% der Radioaktivität. Der spezifische Zucker, 300 mM N-Acetyl-D-glucosamin, eluierte nur 2,3% des radioaktiv markierten Materials. Die eluierte Fraktion wurde nach der Konzentration einer SDS-PAGE unterworfen, aber die photoaffinitätsmarkierte 34 kDa-Bande wurde nicht nachgewiesen. Bei der Spaltung des photoaffinitätsmarkierten 34 kDa-Proteins mit Trypsin wurde ein einzelnes markiertes Protein von 7 kDa erzeugt (16). Die Rückgewinnungsausbeuten in den letzten Extrakten aus den Gelstücken betrugen 62,7% für das markierte 34 kDa-Protein und 90,4% für die in situ erzeugten tryptischen Peptide.
Bindungsstudien mit einer Membranpräparation von Skelettmuskeln der Ratte
Die spezifische Bindung von [¹²⁵I]-ICYP an Skelettmuskelmembranen wurde durch Isoproterenol bis zu Konzentrationen von 10^–4 nicht ersetzt. Im Gegensatz dazu ersetzte SM-11044 die Bindung in einer konzentrationsabhängigen Weise (17).
Pharmakologische Definition des vorliegenden Rezeptors

– SM-11044, ein β-AR-Agonist, zeigte atypische Agonist-Wirkungen wie relaxierende Antworten im Ileum des Meerschweinchens und im Rattendickdarm und die Hemmung der Chemotaxis von Eosinophilen beim Meerschweinchen.

Cyanopindolol antagonisierte kompetitiv die Antworten auf Isoproterenol und SM-11044 bei β3-AR mit ähnlichen pA₂-Werten (7,32–7,65) in Rattendickdarmsegmenten und in weißen Fettzellen der Ratte. Die Werte ähnelten auch denen, welche für β3-AR auf weißen Fettzellen der Ratte (Kirkham D. et al., 1992), dem Rattendickdarm, dem Magenfundus der Ratte (McLaughlin und MacDonald, 1989, 1990) und dem Ileum des Meerschweinchens (Blue D.R. et al., 1989) berichtet wurden. Im Gegensatz dazu antagonisierte Cyanopindolol die zusätzliche atypische Wirkung der durch SM-11044 induzierten Dickdarmrelaxation bei einem höheren pA₂-Wert (8,31) zusammen mit einer geringen Steigung in Schild-Diagrammen (0,78). Die Ergebnisse zeigten die Existenz von mindestens zwei verschiedenen Affinitätsstellen einschließlich β3-AR im Rattendickdarm. So konkurrierten Cyanopindolol und SM-11044 nicht nur um β3-AR, sondern auch um eine andere atypische Bindungsstelle. SM-11044 stimulierte über beide Stellen relaxierende Antworten auf den durch KCl induzierten depolarisierten Dickdarmtonus.
Ein erster Vergleich mit atypischen Wirkungen zwischen dem Ileum des Meerschweinchens und den weißen Fettzellen der Ratte konnte einen speziesbedingten Unterschied nicht ausschließen. Jedoch ist der Unterschied der atypischen Wirkungen zwischen den weißen Fettzellen der Ratte und dem Rattendickdarm nun offensichtlich, daß heißt, es ist kein speziesbedingtes Phänomen.

– Nachweis der Bindungsstelle: Der Radioligand-Bindungstest wurde unter Verwendung von Membranen der glatten Muskeln des Rattendickdarms basierend auf den Ergebnissen von funktionellen Studien, daß SM-11044 und Cyanopindolol um diese Stellen konkurrierten, durchgeführt. Im Allgemeinen, falls Liganden desselben Ursprungs für sowohl den Radioliganden als auch den "kalten" Liganden verwendet werden, kann eine physikalisch oder chemisch bedingte unspezifische Bindung nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurde im Rattendickdarm für Cyanopindolol ein pA₂-Wert von 8,31 und für SM-11044 ein pA₂-Wert von 7,29 erhalten, was auf eine 10-fach höhere Affinität von Cyanopindolol als diejenige von SM-11044 für die zwei atypischen Komponenten (β3-AR und eine andere Stelle) hinweist. Daher wurden [¹²⁵I]-ICYP und SM-11044 als Radioligand bzw. als "kalter" Ligand verwendet.

[¹²⁵I]-ICYP kann an β1-, β2- und β3-ARs, Serotonin-5-HT_1A- und -5-HT_1B-Rezeptoren binden (Tate K.M. et al., 1991; Hoyer D. et al., 1994). Im Gegensatz dazu wurde eine spezifische Bindung unter Blockade dieser bekannten Rezeptoren erhalten. Kompetitionsbindungstests zeigten, daß die Bindungsstelle tatsächlich von diesen Rezeptoren verschieden war. Natürliche AR-Liganden (Epinephrin und Norepinephrin) und ein klassischer β-AR-Ligand (Isoproterenol) zeigten keine Affinität, was nahe legt, daß die Bindungsstelle von ARs verschieden ist. Mehrere synthetische β-AR-Liganden einschließlich β3-AR-Agonisten (BRL-35135A, SR-58611A und ICI-198157) zeigten eine Affinität. Atypische Wirkungen, welche nicht durch β3-AR erklärt werden konnten, können durch die Existenz dieser Bindungsstelle erklärt werden. Tatsächlich wurden ähnliche Bindungsstellen unter Blockade von β-ARs und Serotonin-Rezeptoren in Skelettmuskelmembranen der Ratte beobachtet.

– Biochemische Charakterisierung durch eine Photoaffinitätsmarkierungsstudie: Die Bindungsstelle auf den Membranen von glatten Muskeln des Rattendickdarms wurde durch [¹²⁵I]-ICYP-Diazirin, einem Photoaffinitätsliganden, der [¹²⁵I]-ICYP entspricht, sichtbar gemacht. Das scheinbare Molekulargewicht der Stelle betrug 34 kDa bei einem isoelektrischen Punkt (pl) von 6,0. Das abgeleitete Molekulargewicht von Ratten-β-ARs, Serotonin-5-HT_1A- und -5-HT_1B-Rezeptoren betragen 43,2–50,5 kDa (β1-AR: 50,5 kDa; β2-AR: 46,9 kDa; β3-AR: 43,2 kDa; 5-HT_1A: 46,4 kDa; 5-HT_1B: 43,2 kDa) (Machida et al., 1990; Gocayne et al., 1987; Muzzin P. et al., 1991; Granneman J.G. et al., 1991; Albert A. et al., 1990; Fujiwara et al., 1990; Voigt et al., 1991). In Zellen oder Geweben sind diese Rezeptoren normalerweise glycosyliert, dann sind die Größen üblicherweise größer als die abgeleiteten Größen. Im Gegensatz dazu schien die Größe von 34 kDa kleiner zu sein als bei diesen clonierten Ratten-Rezeptoren. Eine Erklärung kann das Fehlen einer N-gebundenen Glycosylierung sein. Der isoelektrische Punkt weist darauf hin, daß die Bindungsstelle ein saures Protein wie die β-ARs ist (Fraser C.M., 1984). Die chemische Spaltung an den meisten Methioninresten ergab 10 kDa und 12 kDa, und die Säurespaltung an überwiegend Asparagin-Prolin-Bindungen ergab 8 kDa, was zeigt, daß dieses Protein Methioninreste enthält und Asparagin-Prolin-Bindungen einschließen kann.

Beispiel 3: Isolierung und Charakterisierung des erfindungsgemäßen Rezeptors in menschlichen Skelettmuskeln
– Herstellung von Sonden:
SEQ ID NO: 6 ist durch das tblastn-Programm (Altschul S.F. et al., 1990) mit der GenBank- und der EMBL-Datenbank verglichen worden. In der dbest-Datenbank wurde eine menschliche exprimierte Sequenz tag (EST) mit praktisch 100% Homologie zu SEQ ID NO: 6 gefunden. Diese entspricht SEQ ID NO: 5, welche in H. sapiens als eine partielle cDNA-Sequenz, Clon 72F05, translatiert im Leseraster in Form von SEQ ID NO: 5, gefunden wurde. Jedoch war nicht bekannt, ob die SEQ ID NO: 5 irgendeine biologische Funktion haben könnte oder nicht.
Im Hinblick auf den Erhalt des erfindungsgemäßen nicht-adrenergen Rezeptors, welcher SEQ ID NO: 1 oder NO: 13 einschließt, wurde eine Plasmid-DNA, enthaltend den als 72F05 bezeichneten menschlichen Clon (EMBL-Hinterlegungsnummer z28655) (Auffray C. et al., 1995), welche die entsprechende codierende Sequenz von SEQ ID NO: 5 einschließt, von Genethon, Frankreich, erhalten und zur Herstellung von Sonden, welche für Hybridisierungstests nützlich sind, verwendet.
900 bp-Sonde (SEQ ID NO: 3):
Durch Spaltung der Plasmid-DNA mit der Restriktionsendonuclease EcoRI (New England Biolabs, Ref. 101 S) wurde eine 0,9 kb-Insertion freigesetzt, welche dem Clon 72F05 entspricht. Dieses Fragment wurde unter Verwendung des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits (Qiagen, Ref. 20021) isoliert.
300 bp-Sonde (SEQ ID NO: 4):
1) Konstruktion von Sense- und Antisense-Primern für die PCR:

Sense-Primer: S4 (SEQ ID NO: 7)
Antisense-Primer: S6 (SEQ ID NO: 8)

2) PCR mit Clon 72F05:
Die Amplifikation wurde mit 1 ng Plasmid-DNA, entsprechend dem Clon 72F05, in Gegenwart der folgenden Reagenzien durchgeführt: 0,25 μM jedes Primers; 10% DMSO; 2,5 E Taq-Polymerase (Promega); und 0,25 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP). Der Reaktionspuffer wurde von Promega bezogen und mit 1,5 mM MgCl₂ ergänzt.
Die PCR wurde mit einem Perkin-Elmer "Gene Amp PCR-System 9600" unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
Unter diesen Bedingungen wurde ein 0,3 kb-Fragment, entsprechend der veröffentlichten Sequenz von Clon 72F05, amplifiziert. Das Fragment wurde unter Verwendung des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits (Qiagen, Ref. 20021) isoliert.
– Radiomarkierung der Sonden:
Mit Hilfe von Zufallsprimern (Feinberg et al., 1983) wurden 50 μCi dATP α32P (ICN, Ref. 39010 X) eingebaut, um die DNA-Fragmente radioaktiv zu markieren.
– Northern-Blot:
Ein Northern-Blot unter Verwendung einer Vielzahl von menschlichen Geweben wurde von Clontech (Ref. 7765-1) bezogen.
Dieser für die Hybridisierung gebrauchsfertige Blot enthielt in jeder Bahn etwa 2 μg polyadenylierte mRNA aus acht verschiedenen menschlichen Muskeln (glatten und gestreiften):
Bahnen 1–8, der Reihe nach: menschlicher Skelettmuskel, Uterus (ohne Endometrium), Dickdarm (ohne Schleimhaut), Dünndarm, Blase, Herz, Magen und Prostata (vgl. 18A).
Die Membran wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers mit der markierten 300 bp-Sonde (SEQ ID NO: 4) (10⁶ CpM/ml) während 24 Stunden hybridisiert.
Die Waschschritte wurden unter verschiedenen Stringenzbedingungen ausgeführt:

1) Geringe Stringenz: 2× SSC, 0,05% SDS, bei Raumtemperatur.

Eine Exposition auf einem Amersham Hyperfilm MP bei –80°C für 3 Tage unter Verwendung von zwei Verstärkerschirmen zeigte drei verschiedene Fragmente: in allen Proben sind zwei Hauptbanden vorhanden, eine bei 3,4 kb und eine bei 3,8 kb. In allen Proben ist eine schwächere Bande bei etwa 7 kb zu finden.

1) Hohe Stringenz: 0,1× SSC, 0,05% SDS, bei 50°C. Bei derselben Exposition wurden in allen Proben dieselben Fragmente nachgewiesen.

Die Ergebnisse sind in 18 veranschaulicht (dieselben Ergebnisse bei einer geringen oder einer hohen Stringenz).
Die sichtbar gemachten mRNAs entsprechen SMBP-Transkripten. Eine Erklärung für das Vorhandensein von drei verschiedenen Transkripten könnte möglicherweise die Verwendung von alternativen Polyadenylierungsstellen auf dem SMBP-Gen sein (Intervening Sequences in Evolution and Development, Stone E.M. und Schwartz R.J., Oxford University Press, 1990).
Eine ähnliche Analyse, welche mit einer Vielzahl von nicht-muskulären Geweben (Herz, Gehirn, Plazenta, Lunge, Leber, Niere und Pankreas) durchgeführt wurde, bestätigte diese Beobachtungen (18B).
– Clonierung der menschlichen cDNA:
Eine menschliche Skelettmuskel-cDNA-Bank wurde von Clontech (Ref. HL 300s; Artikel 32288) bezogen. 500.000 Clone wurden auf Nylonmembranen (Hybond N⁺; Amersham) transferiert und durch Hybridisieren mit entweder der 300 bp-Sonde (SEQ ID NO: 4) oder der 900 bp-Sonde (SEQ ID NO: 3) durchmustert.
Die Hybridisierungsbedingungen waren:
600 mM NaCl; 60 mM Na-Citrat; 8 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM Na-Phosphat; 1% Ficoll; 1% Polyvinylpyrrolidon; 1% Rinderserumalbumin, 40% Formamid; 0,2% SDS; und 50 μg/ml Lachssperma-DNA.
Die radioaktiv markierte Sonde wurde in einer Menge von 10⁶ CpM/ml zugegeben und über Nacht bei 42°C inkubiert.
Die letzten Waschschritte erfolgten bei 50°C; 0,1× SSC, 0,05% SDS für 1 Stunde.
Elf positive Clone wurden durch aufeinanderfolgende Durchmusterungsrunden identifiziert.
Die Insertionsgrößen wurden durch gleichzeitiges Schneiden mit den folgenden Restriktionsendonucleasen analysiert: XbaI/HindIII und XbaI/BamHI (New England Biolabs). Diese Enzyme setzten cDNA-Inserts aus dem Vektor pcDNA-I (Invitrogen) frei. Alle Clone wurden mit T7- und SP6-Primern von beiden Enden sequenziert, wobei festgestellt wurde, daß sie sich überlappen.
Die längsten cDNA-Inserts (Clon Nr. 24 und Nr. 15) war etwa 1,7 kb groß, und die kleinste war etwa 0,65 kb groß (Clon Nr. 2).
Clon 24 wurde unter Verwendung der T7- und SP6-Primer und der folgenden spezifischen Primer:
Plusstrang-Primer:
S4: SEQ ID NO: 7
S8: SEQ ID NO: 9
Minusstrang-Primer:
S6: SEQ ID NO: 8
S5: SEQ ID NO: 10
S7: SEQ ID NO: 11
S9: SEQ ID NO: 12
auf beiden Strängen sequenziert.
Die DNA-Sequenzierungsdaten zeigten ein zusammenhängendes offenes Leseraster (SEQ ID NO: 2 oder NO: 13). Eine Translation in die Proteinsequenz (SEQ ID NO: 1 oder NO: 14) zeigte mehrere hydrophobe Bereiche auf (23), was nahe legt, daß diese Regionen mutmaßliche membrandurchspannende Teile des Proteins sind. Die den hydrophoben Bereichen entsprechenden Sequenzen sind in 24 hervorgehoben (Kästchen).
SMBP scheint eine strukturelle Homologie zu Vertretern einer Gruppe von Proteinen aufzuweisen, welche als "ähnlich" zu dem Saccharomyces cerevisiae Emp70-Protein-Vorläufer beschrieben wurden.
22 zeigt, daß:

– die menschliche Myeloblastenzelllinie D87444 (Nagase T. et al., DNA Res. 3 (1996), 321–329) 30% homolog zu SMBP ist,
– das p76-Protein (Schimmöller F. et al., Hinterlegungsnummer U81006) 27% homolog zu SMBP ist,
– das Hefe-Endomembranprotein (Emp70), welches ein Vorläufer für ein 24 kDa-Protein (Emp24) ist, das an dem intrazellulären Vesikeltransport beteiligt ist (Schimmöller F. et al., EMBO J. 1417 (1995), 1329–1339), 23% homolog zu SMBP ist,
– hMP70 (Chluba-de Tapia J. et al., Gene 197 (1997), 195–204) 28,5% homolog zu SMBP ist, während
– ein Protein von Arabidopsis thaliana (Hinterlegungsnummer U95973) 51,2% homolog zu SMBP ist.

Das Hydropathie-Diagramm von SMBP zeigt eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit denen des p76-Proteins, des von Myeloblasten stammenden Proteins, des hMP70-Proteins, des Arabidopsis-Proteins und des Emp70-Proteins (vgl. 23).
Die affinitätsmarkierte Peptidsequenz befindet sich an der der Switch-Region zwischen dem hydrophoben N-terminalen Teil von SMBP und dem hydrophoben C-terminalen Bereich, der die Transmembranregionen enthält.
Das Fehlen von N-Glycosylierungsstellen, das Fehlen einer Homologie zu Plasmamembranrezeptoren und die Ähnlichkeit mit intrazellulären Proteinen deutet darauf hin, daß SMBP in der Tat auch ein intrazelluläres Membranprotein sein könnte. SMBP scheint in vielen verschiedenen Geweben exprimiert zu werden und könnte daher eine wichtige Rolle bei der normalen zellulären Funktion spielen. Da SMBP anscheinend mindestens zu Emp70, das am intrazellulären Transport, d.h. ER über den Golgi-Apparat, beteiligt ist, völlig homogen ist, könnte dies auch eine Funktion von SMBP sein.
Beispiel 4: Konstruktion eines Plasmids für die Expression von Hu-SMBP
Für die in-vitro-Expression in Säugerzellen wurde die 1,7 kb große cDNA-Insertion von Clon 24 in den Säugerexpressionsvektor pcDNA3 (Invitrogen) subcloniert. Durch gleichzeitiges Spalten mit der Restriktionsendonuclease XbaI und HindIII (New England Biolabs) wurde die 1,7 kb-Insertion aus dem pcDNA-I-Vektor (vgl. Beispiel 3) freigesetzt. Das Fragment wurde dann unter Verwendung des Klenow-Fragments (Maniatis et al., Molecular Cloning, 2. Auflage, 1, 5.40) mit glatten Enden versehen und unter Verwendung des QiaEXII-Agarosegel-Extraktionskits (Qiagen, Ref. 20021) auf einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt.
Der Vektor pcDNA3 wurde an dem Polylinker durch EcoRV (New England Biolabs) gespalten und unter Verwendung der alkalischen Phosphatase aus Kälberdarm (New England Biolabs) dephosphoryliert. Nach Hitzeinaktivierung der Phosphatase wurden der Vektor und die Insertion unter Verwendung der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) miteinander ligiert. Der Subclon 3 wurde selektiert (bezeichnet als Clon Nr. 24.3) Dieses Plasmid enthält mindestens SEQ ID NO: 2.
Das rekombinante Plasmid kann zur in-vitro-Expression in Säugerzelllinien transfiziert werden.
Beispiel 5: Expression von SMBP in COS-Zellen
COS-Zellen wurden mit einem Vektor, enthaltend die SMBP-Nucleotidsequenz, transient transfiziert. Die Antikörper, welche gegen ein synthetisches Peptid, entsprechend dem affinitätsmarkierten Fragment des Ratten-SMBP, hervorgerufen wurden (α8-Antikörper), wurden zur Immunpräzipitation von Proteinen, extrahiert aus COS-Zellen, die mit der menschlichen SMBP-cDNA transfiziert wurden, verwendet und unter Anwendung des Chloramin-T-Verfahrens mit ¹²⁵I-Iod markiert. Das Präzipitat wurde anschließend wieder gelöst und einer SDS-PAGE unterworfen. Nach einer Autoradiographie wurde ein einzelnes Protein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 45 kDa identifiziert (25).
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Säugerpolypeptid, dadurch gekennzeichnet, dass es Stellen enthält, die zur Bindung von Jodcyanopindolol (JCYP) unter Blockade von α-, β1-, β2-, β3-AR, Serotonin-5-HT_1A- und Serotonin-5-HT_1B-Rezeptoren fähig sind, wobei die Bindung saturierbar, reversibel ist, geeignet ist, mit Stereoselektivität durch einen β-adrenergen Rezeptor-Agonisten SM-11044 nicht aber durch Isoproterenol, Norepinephrin, Epinephrin, Serotonin, Dopamin oder BRL-37344 ersetzt zu werden, und nicht durch Propranolol blockiert wird, wobei das Polypeptid (1) ein scheinbares Molekulargewicht bei Western-Blot von 60–80 kDa hat und (2) ein Fragment umfasst, das die folgende Formel DPX₁FFQHRIHX₂FSIFNX₃ hat, worin X₁ für S (SEQ ID NO: 5) oder X (SEQ ID NO: 6) steht, X₂ für V (SEQ ID NO: 6) oder W (SEQ ID NO: 5) steht und X₃ für S (SEQ ID NO: 5) oder H (SEQ ID NO: 6) steht, wobei das Polypeptid wenigstens an Muskel- und Eosinophilen-Membranen vorliegt und ein nicht-adrenerger Rezeptor ist.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens SEQ ID NO: 1 enthält.
Polypeptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus SEQ ID NO: 14 besteht.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie für einen Säugerrezeptor, wie in Anspruch 1 beansprucht, codiert.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens SEQ ID NO: 2 umfasst.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus SEQ ID NO: 13 besteht.
Gereinigte Nucleinsäure nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 hybridisiert.
cDNA-Klone, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Sequenz umfassen, die für den nicht-adrenergen Rezeptor nach Anspruch 1 codiert.
Synthetische oder nicht-synthetische Nucleotidsonde, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer Nucleinsäure nach den Ansprüchen 4 bis 8 oder mit ihrer komplementären Sequenz oder ihrer entsprechenden RNA hybridisiert, wobei die Sonde aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12 ausgewählt ist.
Sonde nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie unter Verwendung einer Markierung, zum Beispiel ein radioaktives Isotop, ein geeignetes Enzym oder ein Fluorochrom, markiert ist.
Primer zum Amplifizieren einer Nucleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO: 12 ausgewählt sind.
Rekombinantes Plasmid, insbesondere zum Klonieren und/oder zur Expression, das eine Nucleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 4 bis 8 an einer seiner Klonierungsstellen, die nicht für seine Replikation essentiell ist, enthält.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem einen Replikationsursprung zur Replikation in einer Wirtszelle, wenigstens ein Gen, dessen Expression eine Selektion der Wirtszelle, die mit dem Plasmid transformiert ist, ermöglicht, und eine regulatorische Sequenz, die einen Promotor umfasst, der eine Expression eines Polypeptids mit einer nicht-adrenergen Aktivität, wie vorstehend definiert, in der Wirtszelle erlaubt, umfasst.
Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid pcDNA3 ist, in das in einem Polylinker SEQ ID NO: 2 insertiert ist, wobei das Plasmid bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) [National Collection of Microorganism Cultures], die vom PASTEUR INSTITUTE unterhalten wird, am 10. Dezember 1996 unter der Nummer I-1795 hinterlegt wurde.
Wirtszelle, die mit einem rekombinanten Plasmid nach den Ansprüchen 12 bis 14 transformiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Regulationselemente umfasst, die die Expression der Nucleotidsequenz, die für das vorliegende Polypeptid codiert, in diesem Wirt möglich machen.
Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass sie insbesondere aus Säugerzelllinien besteht.
Antikörper, die gegen das Polypeptid nach Anspruch 1 gerichtet sind.
Isolierte und gereinigte Nucleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass sie spezifisch mit der Nucleinsäure von SEQ ID NO: 13 oder dem Komplement derselben unter den Hybridisierungsbedingungen 600 mM NaCl; 60 mM Na-Citrat; 8 mM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM Na-Phosphat; 1% Ficoll; 1% Polyvinylpyrrolidon; 1% Rinderserumalbumin; 40% Formamid; 0,2% SDS; 50 μg/ml Lachssperma-DNA hybridisiert, wobei die Nucleinsäure für ein Polypeptid codiert, das zur Bindung an JCYP unter Blockade von α-, β1-, β2-, β3-AR, Serotonin-5-HT_1A- und Serotonin-5-HT_1B-Rezeptoren fähig ist und wobei die Rollen des Polypeptids eine Inhibierung der Eosinophilen-Chemotaxis involvieren.
Polypeptid, das durch die Nucleinsäure nach Anspruch 18 codiert wird.
Verwendung einer Wirtszelle, die durch einen Expressionsvektor transformiert ist, der eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert, zur Untersuchung einer Substanz auf Agonist- oder Antagonist-Aktivität gegenüber dem Polypeptid.
Verfahren zur Untersuchung einer Substanz auf Agonist- oder Antagonist-Aktivität gegenüber einem Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: – In-Kontakt-Bringen der Substanz mit einer Wirtszelle, die durch einen Expressionvektor transformiert ist, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert, unter Bedingungen, die eine Bindung zwischen den Polypeptidbindungsstellen und einem Agonisten oder einem Antagonisten dazu erlauben, und – Messen der Hemmung der Chemotaxis.
Verfahren zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer Verbindung für ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: – Transformieren einer Wirtszelle durch einen Expressionsvektor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für das Polypeptid nach Anspruch 1 codiert, – Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Rezeptors, der durch die genannte Nucleotidsequenz codiert wird, und den Transfer des exprimierten Rezeptorpolypeptids zu der Membran der transformierten Wirtszelle erlauben, sodass Transmembransequenzen des Rezeptorpolypeptids in die Zellmembranen der transformierten Wirtszelle eingebettet werden; – In-Kontakt-Bringen der transformierten Wirtszelle mit der Verbindung und – Messen der Menge der genannten Verbindung, die an das Rezeptorpolypeptid gebunden ist.
Verfahren zur Untersuchung der Bindungsaffinität einer Verbindung für ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfasst: – Extrahieren von Membranproteinen nach Anspruch 1 aus Wirtszellen, die durch einen Expressionsvektor transformiert sind, der eine Nucleotidsequenz umfasst, welche für ein Polypeptid nach Anspruch 1 codiert, – In-Kontakt-Bringen der Membranproteine mit der Verbindung und – Messen der Menge der Verbindung, die an das Rezeptorpolypeptid gebunden ist.