DE69731213T2

DE69731213T2 - 2-methoxyestradiol-induzierte apoptosis in krebszellen

Info

Publication number: DE69731213T2
Application number: DE69731213T
Authority: DE
Inventors: Tapas Mukhopadhyay; A. Jack ROTH
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 2006-02-23
Anticipated expiration: 2017-07-25
Also published as: CA2262533A1; EP0921821A1; US5958892A; AU723401B2; EP0921821B1; US6410029B1; ATE279212T1; JP2000517299A; WO1998004291A1; DE69731213D1; US20030099614A1; AU3738397A

Description

GRUNDLAGEN DER ERFINDUNG
1. Erfindungsgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Krebstherapie. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Methoxyestradiol zur Stimulierung der p53-Expression in Tumorzellen, wobei dadurch der programmierte Zelltod induziert wird.
2. Beschreibung der verwandten Technik
Normale Gewebehomöostase wird durch ein kompliziertes Gleichgewicht zwischen der Zellproliferations und der Zelltodrate erlangt. Es wird vermutet, dass eine Störung dieses Gleichgewichts ein schwerwiegendes schädliches Ereignis bei der Entwicklung von Krebs ist. Die Hemmung der Apoptose (programmierter Zelltod) ist mit diesem zerstörenden Ereignis in Verbindung gebracht worden. Die Wirkungen derartiger Defekte sind katastrophal, allein in den USA sind sie die Ursache von über einer halben Million Tote pro Jahr.
Das p53-Gen ist als ein Tumorsuppressorgen bekannt (Montenarh, 1992). Es besteht nun eine große Wahrscheinlichkeit, dass Mutationen von p53 mit der Onkogenese vieler menschlicher Krebsarten verbunden sind. Zahlreiche Berichte zeigen, dass das Wachstum wie zum Beispiel von Darm-, Glioblastom-, Brustkrebs, Osteosarkom- und Lungentumorzellen von der Expression von Wildtyp p53 supprimiert werden kann.
Die Einführung von Wildtyp p53 in viele verschiedene p53-mutierte Zellen unter Zuhilfenahme von viralen Übertragungsverfahren hat zur Expression des Wildtyp p53-Transgens und zu einer Suppression des malignen Phänotyps geführt. Diese Beobachtungen zeigen, dass ein hoher Expressionslevel von Wildtyp p53 ein erwünschter Weg für die Behandlung von onkogener Malignität ist.
Da die Halbwertzeit von p53 sehr kurz ist, sie beträgt zwischen 15 und 20 Minuten, hat es sich als schwierig erwiesen, die Expression von exogenem p53 unter Zuhilfenahme herkömmlicher Strategien zu erhöhen. Die mikrozelluläre Umgebung dieser Zellen ist so, dass eine Überexpression von Wildtyp p53 Protein, wenn sie erreicht wird, durch einen schnellen Abbau konterkariert wird. Daher ist die Übertragung von Wildtyp p53 in Krebszellen, die Wildtyp p53 enthalten, unter Zuhilfenahme herkömmlicher viraler Vektoren, als eine Möglichkeit zur Verminderung des Tumorwachstums bestenfalls ineffizient. Ein signifikanter Prozentsatz von Krebsarten behalten ein Wildtyp p53-Gen bei, aber die Erhöhung der Expression dieser Gene leidet wahrscheinlich unter derselben Limitierung.
Deshalb besteht ein eindeutiger Bedarf an einem Versuchsansatz zur nachhaltigen Induktion oder Erhöhung der Wildtyp p53-Expression in Krebszellen, um eine Apoptose in derartigen Krebszellen zu vermitteln.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, Kits zur Verwendung in Verfahren zur Erhöhung des p53 Level in einer Zielzelle bereitzustellen. Es gibt ähnliche offengelegte Verfahren zur Apoptose-Induktion in einer Zelle, die ein funktionsfähiges p53 exprimiert. Es ist ebenfalls ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Kits zur Verwendung bei verbesserten Verfahren zur Behandlung von Krebsarten bereitzustellen, umfassend eine Verabreichung eines p53-Gens zusammen mit einem Agens, das den p53-Level in Zellen erhöht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Kit bereitgestellt, umfassend ein Wildtyp p53-Gen und ein 2-Methoxyestradiol zur Verwendung in einem Verfahren der Krebsbehandlung in einem Patienten, das die Schritte umfasst:

(a) Transferieren eines Wildtyp p53-Gens in eine Tumorzelle von besagtem Patienten, und
(b) Verabreichen an besagte Tumorzelle einer 2-Methoxyestradiol-Menge, die hinreichend ist, eine Apoptose in besagter Zelle zu induzieren. Das p53 kann ein endogenes oder exogenes Protein sein. Die Zelle kann eine Endothelzelle oder eine Tumorzelle zum

Beispiel eine Lungentumorzelle wie beispielsweise eine Zelle des nicht-kleinzelligen Lungenkarzinoms sein.
Weitere Gegenstände, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung ersichtlich. Es sollte allerdings zu verstehen sein, dass die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, da sie bevorzugte Anwendungsformen der Erfindung darstellen, nur als Beispiele zur Erläuterung dienen, da verschiedene Änderungen und Modifikationen im Sinne und Rahmen der Erfindung dem Fachmann aus dieser detaillierten Beschreibung ersichtlich werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen sind Teil der vorliegenden Beschreibung und sind enthalten, um bestimmte Aspekte der Erfindung näher zu zeigen. Die Erfindung mag unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen zusammen mit der detaillierten Beschreibung der hier angeführten spezifischen Anwendungsformen besser zu verstehen sein.
1A–1D. Gemessenes Zellwachstum in unbehandelten Zellen oder mit 5 mm 2-MeOE₂(MET) oder 5 mm 16-Epiestriol (MEC) behandelten H358 (1A), H322 (1B), A549 (1C) und H460 (1D) Zelllinien. Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und Zellzahlen wurden nach Kristallviolett-Färbung bestimmt. Ergebnisse sind repräsentativ aus drei unabhängigen Untersuchungen; Balken, Standardabweichung.
2A. Prozentuale Verteilung von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus nach 48 h Behandlung mit 16-Epiestriol (ME) oder 2-MeOE₂ (MET). H358 (p53 deletiert), H322 (p53 mutiert) und H460 (p53 Wildtyp) Zelllinien wurden behandelt und einer Zellzyklus-Analyse unterzogen, wie sie in Material und Methoden beschrieben ist, und mit entsprechenden unbehandelten Kontrollzellen (C) verglichen.
2B. Prozentuale Verteilung von Zellen in verschiedenen Stadien des Zellzyklus nach 48 h Behandlung mit 16-Epiestriol (ME) oder MeOE₂ (MET). Der Prozentsatz von Zellen, die eine Apoptose zeigen, wurde mit einem FACScan nach Färbung mit UTP- markiertem Biotin und anschließend FITC gemessen. C, unbehandelte Zelllinie (Kontrolle); ME, mit 16-Epiestriol behandelte Zellen; MET, mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen.
3. H460 Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-Tumorzellwachstum nach Behandlung mit 2-MeOE₂ und Adp53. Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben, geerntet und Zellzahlen wurden nach Kristallviolett-Färbung gezählt. Ergebnisse sind repräsentativ aus drei unabhängigen Versuchen. Weiße Quadrate, unbehandelte Zellen (CON), schwarze Rauten, mit Adenovirus dl312 transduzierte Zellen (dl312); weiße Kreise, mit Adp53 transduzierte Zellen (V3); weiße Dreiecke, mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (MET); schwarze Quadrate, mit Adp53 transduzierte und mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (V3-MET). Siehe Beispiele I und V für experimentelle Details.
4. A549 Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-Tumorzellwachstum nach Behandlung mit 2-MeOE₂ und Adp53. Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben, geerntet und Zellzahlen wurden nach Kristallviolett-Färbung ausgezählt. Ergebnisse sind repräsentativ aus drei unabhängigen Versuchen. Weiße Quadrate, unbehandelte Zellen (CON), schwarze Rauten, mit Adenovirus dl312 transduzierte Zellen (dl312); weiße Kreise, mit Adp53 transduzierte Zellen (V3); weiße Dreiecke, mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (MET); schwarze Quadrate, mit Adp53 transduzierte und mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (V3-MET). Siehe Beispiele I und V für experimentelle Details.
5. A1299 Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-Tumorzellwachstum nach Behandlung mit 2-MeOE₂ und Adp53. Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben, geerntet und Zellzahlen wurden nach Kristallviolett-Färbung gezählt. Ergebnisse sind repräsentativ aus drei unabhängigen Versuchen. Weiße Quadrate, unbehandelte Zellen (CON), schwarze Rauten, mit Adenovirus dl312 transduzierte Zellen (dl312); weiße Kreise, mit Adp53 transduzierte Zellen (V3); weiße Dreiecke, mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (MET); schwarze Quadrate, mit Adp53 transduzierte und mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (V3-MET). Siehe Beispiele I und V für experimentelle Details.
6. H322 Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-Tumorzellwachstum nach Behandlung mit 2-MeOE₂ und Adp53. Kulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten, wie angegeben, geerntet und Zellzahlen wurden nach Kristallviolett-Färbung gezählt. Ergebnisse sind repräsentativ aus drei unabhängigen Versuchen. Weiße Quadrate, unbehandelte Zellen (CON), schwarze Rauten, mit Adenovirus dl312 transduzierte Zellen (dl312); weiße Kreise, mit Adp53 transduzierte Zellen (V3); weiße Dreiecke, mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (MET); schwarze Quadrate, mit Adp53 transduzierte und mit 2-MeOE₂ behandelte Zellen (V3-MET). Siehe Beispiele I und V für experimentelle Details.
7. H460 Nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom-Zellwachstum in vivo nach Behandlung mit 2-MeOE₂. Mäusen wurden Tumorzellen subkutan injiziert und dann entweder nicht behandelt oder erhielten oral 2-MeOE₂ oder 16-Epiestriol. Tumorgröße wurde alle fünf Tage über 35 Tage gemessen. Weiße Quadrate, unbehandelte Mäuse (CON); weiße Rauten, 16-Epiestriol (MEC); weiße Kreise, 2-MeOE₂ (MET). Siehe Beispiele I und VI für experimentelle Details.
8. Die Wirkungen von 2-MeOE₂ auf in vivo Tumorkoloniewachstum in einem Lungenmetastase-Modell. Mäuse wurden mit A549 Zellen geimpft und dann nicht behandelt (weiße Balken) oder mit einer täglichen oralen Verabreichung entweder von 16-Epiestriol (MEC) oder 2-MeOE₂ (MET) behandelt. Metastase-Kolonien auf der Lungenoberfläche wurden nach Färbung mit Tusche gezählt. Siehe Beispiele I und VI für experimentelle Details.
9. Die Wirkungen von 2-MOE₂ und Adp53 auf in vivo Tumorkoloniewachstum in einem Lungenmetastase-Modell. Mäuse wurden mit A549 Zellen intravenös geimpft und dann nicht behandelt, mit drei Dosen ausschließlich Adp53 (ausschließlich p53) geimpft, mit einer täglichen oralen Verabreichung entweder von ausschließlich 2-MeOE₂ (ausschließlich 2ME) behandelt oder einer Kombination aus 2-MeOE₂. und Adbgal (b-gal + 2ME) oder 2-MeOE₂ und Adp53 (p53 + 2ME) behandelt. Metastase-Kolonien auf der Lungenoberfläche wurden nach Färbung mit Tusche gezählt. Siehe Beispiele I und VI für experimentelle Details.
BESCHREIBUNG DER BEISPIELHAFTEN ANWENDUNGSFORMEN
Krebs ist für den Tod von über einer halben Million Menschen pro Jahr allein in den Vereinigten Staaten verantwortlich. Die Ursachen für Krebs sind multifaktoriell, allerdings ist es bekannt, dass Aberrationen beim kontrollierten Zelltod zu einer unkontrollierten Zellproliferation führen und daher zu vielen Krebsarten beitragen. Vom p53-Gen ist bekannt, dass es Fähigkeiten zur Tumorsuppression besitzt und Mutationen im Wildtyp p53 mit einer Reihe an Krebsarten korreliert sind.
Viele Versuche sind unternommen worden, um die Wildtyp p53-Expression in Tumorzellen mit Hilfe von Gentherapie-Techniken zu steigern. Diese Versuche, obwohl potenziell wertvoll, sind generell begrenzt gewesen, da das p53 eine sehr kurze Halbwertzeit besitzt. Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Erhöhung des p53-Levels in Tumorzellen bereit, wobei dadurch eine erhöhte Apoptose-Inzidenz ermöglicht wird. Wildtyp oder funktionsfähiges p53 sowie ein Wildtyp oder funktionsfähiges p53-Gen, das p53 codiert, ist für den Zweck der vorliegenden Erfindung derart definiert, dass es eine Tumor supprimierende Aktivität besitzt. Die Erfinder haben entdeckt, dass das Steroid 2-Methoxyestradiol die Expression von Wildtyp p53 erhöhen kann. Diese Erkenntnis kann auf vielfältige Weise genutzt werden. Erstens können Krebsarten, die normal p53 exprimieren, mit 2-Methoxyestradiol behandelt werden, wie hier offengelegt, wobei dadurch die p53-Level erhöht werden, was hilft, die Apoptose zu induzieren. Zweitens können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet sein, um die herkömmliche Gentherapie zu verbessern, wo Wildtyp p53 in Tumorzellen eingeführt wird. Das Hinzufügen von 2-Methoxyestradiol zum Dosis-Schema erhöht den p53-Level, was den Zelltod induziert oder verstärkt. Eine dritte Möglichkeit, die vorliegende Erfindung einzusetzen, findet in einer Kombinationstherapie Anwendung, wo die Gentherapie in Kombination mit einer herkömmlichen Chemotherapie angewandt ist, und 2-Methoxyestradiol zur Erhöhung der Wildtyp p53-Expression eingesetzt ist und dadurch den programmierte Zelltod induziert.
A. Methoxyestradiol
2-Methoxyestradiol (2-MeOE₂) ist ein natürliches Stoffwechselnebenprodukt des menschlichen Körpers, das durch Hydroxylierung von Estradiol und anschließender O-Methylierung in der Leber gebildet wird. Einige ältere Daten weisen darauf hin, dass diese Verbindung einen cytotoxische Wirkung auf die Brustkrebszelllinie MCF-7 besitzt (Lottering et al., 1992). Der genaue Mechanismus der Arzneimittelwirkung ist nicht vollständig verstanden, aber Untersuchungen haben gezeigt, dass das Arzneimittel mit der Spindelbildung interferiert, was zu einer ungleichen Chromosomenverteilung, Hemmung der DNA-Synthese und anormalen Metaphase in Chinesischen Hamster V79 Zellen in Kultur führt (Aizu-Yokota et al., 1995).
Es ist gezeigt worden, dass in der MCF-7 Zelllinie 2-MeOE₂ an die Colchicin-Bindungsstelle der Tubulinfilamente bindet, was entweder zu einer Hemmung der Tubulinpolymerisierung oder Störungen der Stabilität von Mikrotubuli in Abhängigkeit der Reaktionsbedingungen führt (Cushman et al., 1995). 2-Methoxyestradiol hemmt die Endothelzellmigration und Angiogenese in vitro (Fotsis et al., 1994).
Interessanterweise scheint diese Verbindung für normale Zellen nichttoxisch zu sein. 2-Methoxyestradiol zeigt keine Wirkung auf normale menschliche Hautfibroblasten, selbst bei einer Konzentration von 100 μM, wohingegen die halbmaximale Hemmkonzentration der Verbindung (IC₅₀) 0,15 μM für Endothelzellen beträgt (Fotsis et al., 1994). Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die orale Verabreichung von 2-Methoxyestradiol in Mäusen zu einer potenten Hemmung der Kapillarbildung in festen Tumoren und zu verringertem Wachstum führt. Die in vivo Untersuchungen zeigten, dass die Antitumoraktivität des 2-MeOE₂ nicht mit einer allgemeinen Toxizität verbunden war (Fotsis et al., 1994).
Hierin haben die Erfinder gezeigt, dass 2-MeOE₂ den Level von Wildtyp p53 in Krebszelllinien, assoziiert mit p21 WAF1/CIP1, erhöht. Die Wachstumshemmung ist spezifisch und durch eine p53 vermittelte Apoptose induziert. Die Wirkung einer 2-MeOE₂ Behandlung auf den Zellzyklus von Lungenkrebszelllinien wurde ebenfalls geprüft. Der Zellzyklus besteht aus vier Phasen, als G1, S, G2 und M bezeichnet, und die Zeitdauer, die eine Zelle für jede zu durchlaufende Phase benötigt, variiert von Zelltyp zu Zelltyp. Für einen gegebenen Zelltyp ist die erforderliche Zeit zum Durchlaufen jeder Phase relativ konstant. Allerdings kann der Zeitpunkt des Beginns einer oder mehrerer Phasen des Zellzyklus durch Faktoren wie beispielsweise Nährstoffversorgung oder Arzneimittelbehandlung beeinflusst werden. 2-MeOE₂ scheint keinen Effekt auf die Verteilung auf irgendeine der vier Phasen des Zellzyklus in der Lungenkrebszelllinien zu besitzen, wie es mit durchflusscytometrischer Analyse festgestellt worden ist. 2-MeOE₂ besaß eine geringe Hemmwirkung auf die p53-negativen oder p53-mutierten Zelllinien.
B. Assays auf Derivate, die Wildtyp p53-Expression erhöhen, zur Verwendung in der Erfindung
In bestimmten Anwendungsformen ist ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Expression von Wildtyp p53 erhöhen, offengelegt. Es ist zu erwarten, dass diese Durchmusterungstechnik bei der allgemeinen Identifizierung einer beliebigen Verbindung, die eine erhöhte p53-Expression in Krebszellen verursachen wird, sich als zweckdienlich erweisen wird.
Zweckdienliche Verbindungen mit ähnlichen Wirkungen auf p53 sind nicht auf 2-MeOE₂ beschränkt. Natürliche Estradiol-Derivate, einschließlich aber nicht auf Substitutionen von reaktiven Gruppen an Positionen in der Estradiol-Ringstruktur beschränkt, können ähnliche Wirkungen auf die Stabilisierung von p53 besitzen. Einfache chemische Modifikationen von 2-MeOE₂ durch den Fachmann, einschließlich aber nicht auf Substitution oder Addition von Alkyl, Alkoxy, Alkenyl oder Derivaten davon oder anderen Gruppen mit kleinen Kernradien, die als Elemente in der Periodentafel in den ersten drei Reihen definiert sind, beschränkt, können ähnliche Wirkungen auf die p53-Expression besitzen. Diese Modifikationen umfassen Substitution oder Additionen von kurzen, nicht verzweigten Ketten, die weniger als fünf Atome enthalten.
Zweckdienliche Verbindungen enthalten Fragmente oder Teile von natürlich vorkommenden Verbindungen oder mögen nur als aktive Kombinationen bekannter Verbindungen gefunden werden, die sonst inaktiv sind. Dementsprechend ist es in Durchmusterungsassays zur Identifizierung pharmazeutischer Agenzien, die p53-Levels in Krebszellen erhöhen, beabsichtigt, dass Verbindungen, die aus natürlichen Quellen wie beispielsweise Tiere, Bakterien, Pilze, pflanzliche Quellen, einschließlich Blätter und Rinde, isoliert sind, als Kandidaten auf das Vorhandensein potenziell zweckdienlicher pharmazeutischer Agenzien getestet werden. Es ist zu verstehen, dass die zu durchmusternden pharmazeutischen Agenzien ebenfalls aus chemischen Zusammensetzungen oder vom Menschen hergestellten Verbindungen abgeleitet oder synthetisiert sein können.
In diesen Anwendungsformen ist ein Verfahren zur Bestimmung der Fähigkeit der Kandidatensubstanz offengelegt, die Wildtyp p53-Levels in Zellen zu erhöhen, wobei das Verfahren allgemein die Schritte umfasst:

(a) Gewinnen einer Zelle mit Wildtyp p53;
(b) Mischen einer Kandidatensubstanz mit der Krebszelle; und
(c) Bestimmen der Fähigkeit der Kandidatensubstanz, den Wildtyp p53-Gehalt der Zelle zu erhöhen.

Um eine Kandidatensubstanz mit einer Fähigkeit, p53-Levels zu erhöhen, zu identifizieren, muss man den p53-Level einer Zelle messen oder bestimmen. Man würde dann die Kandidatensubstanz zu der Zelle geben und den p53-Gehalt in Anwesenheit der Kandidatensubstanz bestimmen. Eine Kandidatensubstanz, die den p53-Level bezogen auf den in ihrer Abwesenheit gemessenen p53-Level erhöht, ist als eine Kandidatensubstanz mit positiver Aktivität definiert.
Eine „wirksame Menge" ist als die Menge definiert, die p53-Levels in Krebszellen im Vergleich zu ihren Kontrolllevels (unbehandelt) reproduzierbar erhöht.
Eine signifikante Erhöhung der Wildtyp p53-Expression, z. B. wie unter Zuhilfenahme der Western Blot Analyse gemessen, ist durch eine Erhöhung der Wildtyp p53-Levels um wenigstens 30–40% und bevorzugter durch Erhöhungen um wenigstens 50% repräsentiert, wobei höhere Werte eingeschlossen sind. Assays, die p53-Gehalt und Expression in Zellen messen, sind in der Technik bekannt.
Alternativ mag es erwünscht sein, die Wachstumshemmung von Krebszellen zu messen, z. B. mittels Testen des Wachstums gemäß dem MTT-Assay. Eine signifikante Wachstumshemmung ist durch eine Verringerung von wenigstens 30%–40% im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen und bevorzugter wenigstens 50% repräsentiert, wobei signifikantere Verringerungen eingeschlossen sind. Wachstumstests, wie MTT-Test, sind in der Technik bekannt. Tests können wie von Mosmann et al., 1983; Rubinstein et al., 1990 (hier durch Quellenangabe eingefügt) beschrieben, durchgeführt sein. Falls eine Kandidatensubstanz eine Wachstumshemmung von Krebszellen bei dieser Art von Untersuchung zeigt, wird sie deshalb als eine Verbindung definiert, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist.
Das quantitative in vitro Testen von 2-MeOE₂-Analoga ist keine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, da im Allgemeinen davon ausgegangen wird, dass die Agenzien häufig auf Basis ihrer bekannten Eigenschaften oder mittels Struktur- oder Funktionsvergleich mit denjenigen Agenzien, die bereits ihre Wirksamkeit gezeigt haben, ausgewählt sind.
Deshalb sind die wirksamen Mengen häufig die Mengen, die für eine Verabreichung an Tiere in einem anderen Kontext als sicher betrachtet sind. Der Fachmann sollte sich generell auf „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe (hier durch Verweis eingefügt) zur Orientierung bei Verwendung von Östrogenen beziehen.
D. p53 und p53-Mutationen bei Krebs
Gegenwärtig wird p53 als ein Tumorsuppressorgen betrachtet (Montenarh, 1992). Hohe Levels von mutiertem p53 sind in vielen Zellen gefunden worden, die mittels chemischer Carcinogenese, UV-Bestrahlung und verschiedenen Viren, einschließlich SV40, transformiert worden waren. Das p53-Gen ist ein häufiges Ziel einer Mutationsinaktivierung in einer Vielzahl menschlicher Tumoren und es ist bereits als das am häufigsten mutierte Gen bei menschlichen Krebsarten dokumentiert (Mercer, 1992). Es ist in über 50% von humanem NSCLC (Hollestein et al., 1991) und in einem weiten Spektrum anderer Tumoren mutiert.
Das p53-Gen codiert ein 393 Aminosäure-Phosphoprotein, das Komplexe mit Wirtsproteinen wie beispielsweise einem großen T-Antigen und E1B bilden kann. Das Protein wird in normalen Geweben und Zellen gefunden, aber in Konzentrationen, die im Vergleich mit transformierten Zellen oder Tumorgewebe winzig sind. Interessanterweise scheint Wildtyp p53 bei der Regulation von Zellwachstum und -teilung bedeutend zu sein. Es ist gezeigt worden, dass eine Überexpression von Wildtyp p53 in manchen Fällen in menschlichen Tumorzelllinien antiproliferativ ist. Folglich kann p53 als ein negativer Regulator des Zellwachstums wirken (Weinberg, 1991) und kann direkt unkontrolliertes Zellwachstum supprimieren oder indirekt Gene aktivieren, die dieses Wachstum supprimieren. Folglich mag Fehlen oder Inaktivierung von Wildtyp p53 zur Transformation beitragen. Allerdings deuten einige Untersuchungen an, dass das Vorliegen von mutiertem p53 für die volle Expression des transformierenden Potenzials des Gens erforderlich sein kann.
Wildtyp p53 wird als ein wichtiger Wachstumsregulator in vielen Zelltypen betrachtet. Unsinn-Mutationen sind beim p53-Gen häufig und sind für das Transformationsvermögen des Onkogens essenziell. Eine einzige genetische Änderung, die von Punktmutationen herrührt, kann karzinogenes p53 bilden. Anders als bei anderen Onkogenen sind von p53 Punktmutationen bekannt, die in wenigstens 30 verschiedenen Codons vorkommen und häufig dominante Allele erzeugen, die Verschiebungen im Zellphänotyp ohne eine Reduktion zur Homozygotie bilden. Zusätzlich scheinen viele dieser dominanten negativen Allele im Organismus toleriert und auf der Keimbahn weitergegeben zu werden. Verschiedene mutierte Allele scheinen von minimal funktionsgestört bis zu stark penetrant dominanten negativen Allele zu reichen (Weinberg, 1991).
Casey und Mitarbeiter haben berichtet, dass eine Transfektion von Wildtyp p53 codierender DNA in zwei humane Brustzelllinien die Wachstumssuppressionskontrolle in derartigen Zellen wiederherstellt (Casey et al., 1991). Ein ähnlicher Effekt ist auch bei der Transfektion von Wildtyp, aber nicht mutiertem, p53 in humane Lungenkrebszelllinien demonstriert worden (Takahasi et al., 1992). p53 scheint über das mutierte Gen dominant zu sein und wird gegen die Proliferation selektiert, wenn es in Zellen mit dem mutierten Gen transfiziert ist. Normale Expression des transfizierten p53 beeinflusst nicht das Wachstum von Zellen mit endogenem p53. Folglich könnten derartige Konstrukte von normalen Zellen ohne Nebenwirkungen aufgenommen werden. Es wird folglich vermutet, dass die Behandlung von p53-assoziierten Krebsarten mit Wildtyp p53 die Anzahl maligner Zellen oder deren Wachstumsrate vermindert.
E. Behandlung von p53-positiven Krebsarten mittels Verwendung von 2-Methoxyestradiol
Ein Patient mit einem Tumor, der Wildtyp p53 exprimiert, wird mit 2-Methoxyestradiol behandelt. In einem derartigen Fall wird der p53-Status der Tumorzellen unter Anwendung herkömmlicher Verfahren bestimmt, Beispiele hierfür sind unten beschrieben. Patienten können, müssen aber nicht, zuvor Chemo-, Radio- oder Gentherapien erhalten haben. Optimalerweise zeigen die Patienten eine adäquate Knochenmarkfunktion (als periphere absolute Granulocyten-Zahl > 2.000/mm³ und Plättchen-Zahl von 100.000/mm³ definiert), adäquate Leberfunktion (Bilurubin ≤ 1,5 mg/dl) und adäquate Nierenfunktion (Kreatinin < 1,5 mg/dl).
Der Patient wird mit einer pharmazeutisch verträglichen Form von 2-MeOE₂ oder einem funktionsfähigen Analogon davon behandelt. Diese Verabreichung könnte in Form zum Beispiel einer intratumoralen Injektion oder tatsächlich einem beliebig anderen Applikationsverfahren erfolgen, das routinemäßig angewandt wird und dem Fachmann gut bekannt ist, z. B. systemisch i. v. Eine Biopsie der Läsionen, in die injiziert werden soll, wird durchgeführt und das Gewebe für immunhistochemische Untersuchungen aufbewahrt.
Die 2-MeOE₂-Dosis wird typischerweise in einer pharmazeutisch verträglichen Form unmittelbar vor Verabreichung gelöst. Die anfängliche Dosis beträgt 100 mg 2-MeOE₂/kg Körpergewicht. Selbstverständlich kann dies von der Größe des Tumors, der Wachstumsrate des Tumors, etc. abhängen. Die Behandlung erfolgt über einen sechswöchigen Zeitraum. Während dieser Zeit wird der Tumor auf das Ausbleiben von Tumorprogression, Reaktion auf Toxizität kontrolliert und die Dosen dementsprechend angepasst.
1. Bestimmung des p53-Status von Zellen
Vielfältige Detektionsverfahren können in der vorliegenden Erfindung zur Detektion des p53-Status einer Zelle eingesetzt sein. Es gibt zahlreiche Antikörper gegen das p53-Protein, daher kann ein beliebiger Assay, der Antikörper zur Detektion nutzt zum Beispiel ELISAs, Western Blotting und andere Immunoassay-Techniken, zur Identifizierung des p53-Proteins genutzt werden. Alternativ können Assays, die Nucleotid-Sonden einsetzen, zur Identifizierung der Anwensenheit/Abwesenheit eines intakten p53-Gens zum Beispiel Southern Blotting, Nothern Blotting oder PCR-Techniken genutzt werden. Alle obigen Techniken sind dem Fachmann bekannt und könnten in der vorliegenden Erfindung ohne großes Experimentieren genutzt werden.
i. ELISAs, Immunoassay und immunohistologischer Assay
Offengelegte Immunoassays umfassen, sind aber nicht auf die im U.S. Patent Nr. 4.367.110 (doppelter monoklonaler Antikörper-Sandwich-Assay) und U.S. Patent Nr. 4.452.901 (Western Blot) beschriebenen Assays beschränkt. Andere Assays beinhalten Immunopräzipitation markierter Liganden und Immunohistochemie, sowohl in vitro als auch in vivo.
Immunoassays sind im eigentlichen Sinne Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunoassays sind die in der Technik bekannten verschiedenen Typen Enzym-gekoppelter Festphasenimmunoassays (ELISAs) und Radioimmunoassays (RIA). Immunohistochemische Detektion unter Verwendung von Gewebeschnitten sind ebenfalls besonders zweckdienlich.
In einem beispielhaften ELISA sind die anti-p53-spezifischen Antikörper auf einer ausgewählten Oberfläche, die eine Proteinaffinität zeigt, wie beispielsweise eine Polystyrol-Mikrotiterplatte immobilisiert. Dann wird eine Testzusammensetzung, die das erwünschte Antigen enthält, wie beispielsweise eine klinische Probe zu den Vertiefungen gegeben. Nach Binden und Waschen zwecks Entfernen nichtspezifisch gebundener Immunkomplexe, kann das gebundene Antigen detektiert werden. Die Detektion erfolgt generell durch Zugabe eines weiteren, für das erwünschte Antigen spezifischen Antikörpers, der an eine detektierbare Markierung gebunden ist. Dieser ELISA-Typ ist ein einfacher „Sandwich-ELISA". Die Detektion kann ebenfalls durch die Zugabe eines zweiten Antikörpers erreicht werden, der für das erwünschte Antigen spezifisch ist, und anschließende Zugabe eines dritten Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper besitzt, wobei der dritte Antikörper an einen detektierbaren Marker gebunden ist.
Variationen der ELISA-Techniken sind dem Fachmann bekannt. In einer derartigen Variation sind die Proben, die das erwünschte Antigen enthalten, auf der Oberfläche der Vertiefung immobilisiert und werden dann mit den Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach Binden und geeignetem Waschen werden die gebundenen Immunkomplexe detektiert. Wo die ersten Antigen-spezifischen Antikörper an einen detektierbaren Marker gebunden sind, können die Immunkomplexe direkt detektiert werden. Wiederum können die Immunkomplexe unter Zuhilfenahme eines zweiten Antikörpers, der eine Bindungsaffinität für den ersten Antigen-spezifischen Antikörper besitzt, detektiert werden, wobei der zweite Antikörper an einen detektierbaren Marker gebunden ist.
Kompetitive ELISAs sind ebenfalls möglich, in denen Testproben um Bindung mit bekannten Mengen markierter Antigene oder Antikörpern konkurrieren. Die Menge reaktiver Spezies in der unbekannten Probe wird durch Mischen der Probe mit der bekannten markierten Spezies vor oder während der Inkubation mit beschichteten Vertiefungen bestimmt. Das Vorhandensein reaktiver Spezies in der Probe dient zur Verminderung der Menge markierter Spezies, die für ein Binden an die Vertiefung verfügbar ist, und vermindert folglich das Signal.
Ungeachtet des angewandten Formats besitzen ELISAs gemeinsame Merkmale wie beispielsweise Beschichtung, Inkubation oder Binden, Waschen zum Entfernen nicht spezifisch gebundener Spezies und Detektion der gebundenen Immunkomplexe. Diese Merkmale sind unten beschrieben.
Antigene oder Antikörper können ebenfalls an einen festen Träger wie beispielsweise in Form von Platten, Kügelchen, Tauchstäbchen, Membranen oder Säulenmatrices gebunden sein und die zu analysierende Probe kann auf das/den immobilisierte(n) Antigen oder Antikörper aufgetragen werden. Zum Beschichten einer Platte entweder mit Antigen oder Antikörper wird man normalerweise die Vertiefungen der Platte mit einer Lösung des Antigens oder Antikörpers entweder über Nacht oder für einen bestimmten Zeitraum inkubiert. Die Vertiefungen der Platte werden dann gewaschen, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen. Jegliche verbleibenden verfügbaren Oberflächen der Vertiefungen werden dann mit einem unspezifischen Protein „beschichtet", das bezüglich der Test-Antisera sich antigen neutral verhält. Dieses schließt bovines Serumalbumin (BSA), Casein und Milchpulverlösungen mit ein. Das Beschichten erlaubt, unspezifische Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche zu blockieren, und vermindert folglich den Hintergrund aufgrund unspezifischen Bindens von Antisera auf der Oberfläche.
In ELISAs ist es möglicherweise gebräuchlicher, eher ein zweites oder drittes Detektionsmittel als ein direktes Verfahren anzuwenden. Folglich wird nach Binden des Antigens oder Antikörpers an die Vertiefung, Beschichten mit einem nichtreaktiven Material zur Reduktion des Hintergrunds, und Waschen zum Entfernen nichtgebundenen Materials die immobilisierende Oberfläche mit der zu testenden klinischen oder biologischen Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die für eine Bildung des Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) effektiv sind. Detektion des Immunkomplexes erfordert dann einen markierten zweiten bindenden Liganden oder Antikörper oder einen zweiten bindenden Liganden oder Antikörper zusammen mit einem markierten dritten Antikörper oder dritten bindenden Liganden.
„Unter Bedingungen, die für eine Immunkomplex (Antigen/Antikörper) Bildung effektiv sind" bedeutet, dass die Bedingungen vorzugsweise Verdünnen der Antigene und Antikörper mit Lösungen wie beispielsweise BSA, bovines gamma Globulin (BGG) und Phosphat gepufferte Saline (PBS)/Tween beinhalten. Diese zugegebenen Agenzien neigen ebenfalls dazu, die Reduktion des unspezifischen Hintergrunds zu unterstützen.
Geeignete Bedingungen bedeuten ebenfalls, dass die Inkubation bei einer Temperatur und für einen Zeitraum erfolgt, die ein hinreichendes Binden erlauben. Inkubationsschritte dauern typischerweise etwa 1 bis 2 bis 4 Stunden, bei Temperaturen vorzugsweise um etwa 25° bis 27°C oder können über Nacht bei etwa 4°C liegen.
Nach allen Inkubationsschritten wird in einem ELISA die in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um nicht komplexiertes Material zu entfernen. Waschen beinhaltet oftmals Waschen mit einer PBS/Tween Lösung oder Boratpuffer. Nach der Bildung spezifischer Immunkomplexe zwischen Testprobe und dem ursprünglich gebundenen Material und nachfolgendem Waschen kann das Vorhandensein selbst winziger Mengen von Immunkomplexen bestimmt werden.
Um ein Detektionsmittel bereitzustellen, ist der zweite oder dritte Antikörper mit einer Markierung verknüpft, um eine Detektion zu ermöglichen. Vorzugsweise ist diese Markierung ein Enzym, das eine Farbentwicklung nach Inkubation mit einem geeigneten chromogen Substrat hervorruft. Folglich ist es zum Beispiel erwünscht, den ersten oder zweiten Immunkomplex mit einem Urease, Glucose-Oxidase, alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxid-konjugierten Antikörper für einen Zeitraum und unter Bedingungen, die für die Entwicklung einer weiteren Immunkomplex-Bildung förderlich sind, z. B. zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur in einer PBS-haltigen Lösung wie beispielsweise PBS-Tween, in Kontakt zu bringen und zu inkubieren.
Nach Inkubation mit dem markierten Antikörper und nachfolgendem Waschen, um nichtgebundenes Material zu entfernen, wird die Menge an Markierung quantifiziert z. B. durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat wie beispielsweise Harnstoff und Bromkresolpurpur oder 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure [ABTS] und H₂O₂, im Falle von Peroxidase als Enzymmarker. Die Quantifizierung wird dann durch Messen der Intensität der Farbentwicklung z. B. mit Hilfe eines Lichtspektrum-Spektralphotometers bestimmt.
Alternativ kann die Markierung eine chemilumineszente Markierung sein. Die Verwendung derartiger Markierungen ist in U.S. Patent, Nr. 5.310.687 5.238.808 und 5.221.605 beschrieben.
Assays auf den p53-Status der Zelle können ebenfalls die Verteilung von normalem anormalem Gewebe für diagnostische Zwecke bestimmen. Verfahren für in vitro und in situ Analyse sind bekannt und umfassen die Bewertung der Bindung von Antigenspezifischen Antikörpern an Geweben, Zellen oder Zellextrakten. Diese sind herkömmliche Techniken, die vom Fachmann beherrscht werden. Zum Beispiel können die Antikörper gegen p53 zusammen mit sowohl frisch gefrorenen als auch Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeblöcken, die für eine immunohistochemischen Untersuchung präpariert werden, verwendet sein. Jeder Gewebeblock kann aus 50 mg übriggebliebenem „pulverisierten" Tumor bestehen. Das Verfahren zum Präparieren von Gewebeblöcken aus diesen partikulären Proben ist in früheren ICH-Untersuchungen von verschiedenen Prognosefaktoren z. B. bei Brustkrebs erfolgreich angewandt worden und ist dem Fachmann bekannt. (Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990; Brown et al., 1990).
Zusammengefasst: es können gefrorene Schnitte präpariert sein durch Rehydratisieren von 50 ng gefrorenem pulverisierten Tumor bei Raumtemperatur in PBS in kleinen Kunststoffkapseln; Pelletieren der Partikel mittels Zentrifugation; Resuspendieren dieser Partikel in einem viskosen Einbettungsmedium (OCT); Invertieren der Kapsel und erneutes Pelletieren mittels Zentrifugation; schnellgefrieren in –70°C Isopentan; Schneiden der Kunststoffkapsel und Entfernen des gefrorenen Gewebezylinders; Sichern des Gewebezylinders auf einer Cryostat Microtom-Spannvorrichtung; und Schneiden von 25–50 seriellen Schnitten, die durchschnittlich 500 auffallend intakte Tumorzellen enthalten.
Dauer-Schnitte können mit einem ähnlichen Verfahren präpariert sein, das beinhaltet Rehydratation der 50 mg Probe in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus Kunststoff; Pelletieren; Resuspendieren in 10% Formalin für eine vierstündige Fixierung; Waschen/Pelletieren; Resuspendieren in warmem 2,5% Agar; Pelletieren, Abkühlen in Eiswasser, um den Agar fest werden zu lassen, Entnahme des Gewebe/Agar-Blocks aus dem Röhrchen; Infiltration und Einbetten des Blocks in Paraffin; und Schneiden von bis zu 50 seriellen Dauer-Schnitte.
ii. Southern und Nothern Blotting Techniken
Southern und Nothern Blotting sind verbreitet angewandte Techniken in der Molekularbiologie und werden vom Fachmann beherrscht.
Für Southern Blots wird die DNA aus Testzellen durch vorsichtiges Aufbrechen der Zelle in Anwesenheit eines Kationen-Chelators wie beispielsweise EDTA gewonnen. Die Proteine und andere Zellanhaftungen werden durch Mischen mit gesättigtem Phenol oder Phenol/Chloroform und Zentrifugation der Emulsion entfernt. Die DNA ist in der oberen wässrigen Phase, sie ist von Proteinen befreit und wird mit Ethanol gemischt. Diese Lösung ermöglicht die Fällung der DNA und die DNA kann mittels Zentrifugation wiedergewonnen werden.
Elektrophorese in Agarose- oder Polyacrylamidgelen ist die gängigste Weise, DNA-Moleküle zu trennen. Southern Blot bestätigt die Identität der p53 codierenden DNA. Hierzu wird DNA von dem intakten Gel auf Nitrocellulosepapier transferiert. Dann wird das Nitrocellulosepapier in Puffer gewaschen, in dem sich zum Beispiel eine radiomarkierte cDNA befindet, die eine zur Wildtyp p53-DNA komplementäre Sequenz enthält. Die Sonde bindet spezifisch an die DNA, die wenigstens einen Teil von p53 codiert, und kann mittels Autoradiographie durch Inkontaktbringen des hybridisierten Nitrocellulosepapiers mit einem Röntgenfilm detektiert werden.
p53 codierende mRNA kann auf ähnliche Weise mit einem als Nothern Blot bekannten Verfahren detektiert werden. Für eine genauere Beschreibung von Puffern, Gelpräparation, Elektrophoresebedingungen etc. wird der Fachmann auf Sambrook et al. (1989) verwiesen.
iii. Polymerasekettenreaktion (PCR)
PCR ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der modernen analytischen Biologie. Kurze Oligonucleotid-Sequenzen, normalerweise 15–35 bp lang, werden homolog zu flankierenden Regionen an jeder Seite der zu amplifizierenden Sequenzen konstruiert. Primer werden im Überschuss zur Ausgangs-DNA, in Anwesenheit von Puffer, Enzym und freien Nucleotiden zugegeben. Die Ausgangs-DNA wird bei 95°C denaturiert und dann auf 40–50°C gekühlt, um den Primern ein Anlagern zu ermöglichen. Die Temperatur wird auf die für die Polymerase für eine Extensionsphase optimale Temperatur eingestellt. Dieser Zyklus wird 25–40 mal wiederholt.
Insbesondere verwendet die vorliegende Erfindung die PCR, um den p53-Status von Zellen zu detektieren. Mutationen im p53-Gen werden zuerst mit Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) detektiert, was auf der elektrophoretischen Bestimmung von Konformationsveränderungen in einzelsträngigen DNA-Molekülen basiert, die durch Punktmutationen oder anderen Formen geringer Nucleotid-Änderungen induziert sind. Um herauszufinden, wo sich die Mutation innerhalb des p53-Gens befindet, wird jedes Exon separat mittels PCR unter Verwendung von Primern, die für das bestimmte Exon spezifisch sind, amplifiziert. Nach Amplifizierung wird das PCR-Produkt denaturiert und auf einem Polyacrylamidgel getrennt, um eine Veränderung der Mobilität aufgrund einer Konformationsänderung zu detektieren, die aus einer Punktmutation oder anderen geringen Nucleotid-Änderung im Gen resultierte. Mutationen führen zu Änderungen der physikalischen Konformation der DNA wie auch zu Änderungen der elektrischen Ladung des Moleküls. Folglich wird während der Elektrophorese, wenn eine elektrische Ladung auf das Molekül wirkt, die DNA, die sich von DNA in Form und Ladung verglichen mit der Wildtyp-DNA geringfügig unterscheidet, mit einer anderen Geschwindigkeit wandern und folglich eine andere Position im Gel einnehmen.
Nach der Bestimmung, welches DNA-Fragment die Mutation enthält, werden die spezifischen Nucleotid-Änderungen durch DNA-Sequenzierung des amplifizierten PCR-Produkts detektiert. Sequenzierung linearer DNA zerlegt das DNA-Molekül in seine einzelnen Nucleotide in der Reihenfolge, in der sie im intakten Molekül zusammengesetzt sind. Trennung der einzelnen Nucleotide mittels Elektrophorese auf einem Sequenziergel erlaubt die Detektion einzelner Nucleotid-Änderungen verglichen mit dem Wildtyp und wird zur Bestimmung von Homo- oder Heterozygotie einer Mutation eingesetzt, was einfach durch das Auftreten einer einzelnen oder doppelten Bande im Sequenziergel zu unterscheiden ist.
2. Pharmazeutische Zusammensetzungen und Verabreichungswege
Wässrige Zusammensetzungen weisen eine wirksame Menge einer Verbindung auf, die die Expression von Wildtyp p53 erhöht, zum Beispiel 2-MeOE₂. Derartige Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder wässrigen Medium gelöst oder dispergiert.
Der Ausdruck „pharmazeutisch oder pharmazeutisch verträglich" bezeichnet molekulare Gebilde oder Zusammensetzungen, die keine nachteilige, allergische oder andere ungünstige Reaktion hervorrufen, wenn sie an ein Tier oder Menschen als geeignet verabreicht werden. Wie hier verwendet, beinhaltet „pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes beliebige und alle Lösemittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Agenzien, isotonische und die Absorption verzögernde Agenzien und ähnliche. Die Verwendung derartiger Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik bekannt. Ausgenommen ist insofern jedes herkömmliche Medium oder Agens, das mit den aktiven Bestandteilen inkompatibel ist, dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen erwogen wird. Ergänzende aktive Bestandteile wie beispielsweise weitere Antikrebsmittel können den Zusammensetzungen zugefügt sein.
Zusätzlich zu den für eine parenterale Verabreichung formulierten Verbindungen, wie beispielsweise diejenigen für intravenöse oder intramuskuläre Injektion umfassen weitere pharmazeutisch verträgliche Formen z. B. Tabletten oder Feststoffe für eine orale Verabreichung; Depot-Kapseln und gegenwärtig verwendete beliebig weitere Formen, einschließlich Cremes, Lotionen, Mundwässer, Inhalationsmittel und ähnliche.
Die aktiven Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden oftmals für eine parenterale Verabreichung formuliert, z. B. für Injektionen über intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder sogar intraperitoneale Wege formuliert. Die Zubereitung einer wässrigen Zusammensetzung, die eine Verbindung oder Verbindungen enthält, die die Level von Wildtyp p53 erhöhen, ist dem Fachmann in Anbetracht der vorliegenden Offenlegung bekannt. Typischerweise können derartige Zusammensetzungen als injizierbare, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, zubereitet sein; als feste Formen, die zur Verwendung zur Zubereitung von Lösungen oder Suspensionen nach der Zugabe eine Flüssigkeit vor der Injektion ebenfalls zubereitet sein können und die Zubereitungen können ebenfalls emulgiert sein.
Lösungen für aktive Verbindungen als freie Base oder pharmazeutisch verträgliche Salze können in Wasser mit einer oberflächenaktiven Substanz wie beispielsweise Hydroxyethylcellulose geeignet gemischt zubereitet sein. Dispersionen können ebenfalls in Glycerol, flüssigen Polyethylenglycolen und Mischungen davon und in Ölen zubereitet sein. Unter gewöhnlichen Aufbewahrungs- und Gebrauchsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die für eine injizierbare Verwendung geeigneten pharmazeutischen Formen umfassen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen; Formulierungen enthaltend Sesamöl, Erdnussöl oder wässrigen Propylenglycol; und sterile Pulver zur improvisierten Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen. In allen Fällen muss die Form steril sein und muss in einem Ausmaß flüssig sein, dass sie sich leicht spritzen lässt. Sie muss unter den Herstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein und muss vor einer Kontaminierung mit Mikroorganismen wie Bakterien und Pilze geschützt sein.
Die aktiven Verbindungen können in einer Zusammensetzung in neutraler Form oder Salzform formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen die Säureanlagerungssalze (mit den freien Aminogruppen des Proteins gebildet) und die mit anorganischen Salzen wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure oder derartigen organischen Säuren wie Essigsäure, Oxasäure, Weinsäure, Mandelsäure und ähnlichen gebildet sind. Salze, die mit freien Carboxylgruppen gebildet sind, können ebenfalls von anorganischen Basen abstammen wie beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium- oder Eisenhydroxide und derartige organische Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und ähnliche.
Der Träger kann ebenfalls ein Lösemittel oder Dispersionsmedium sein, enthaltend zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerol, Propylenglycol und flüssiger Polyethylenglycol und ähnliches), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle. Die passende Fließfähigkeit kann aufrecht erhalten sein zum Beispiel durch Verwendung eines Überzugs wie beispielsweise Lecithin, durch Aufrechthalten der erforderlichen Partikelgröße im Falle der Dispersion und durch Verwendung von oberflächenaktiven Substanzen. Die Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedenen antibakterielle und fungizide Agenzien zum Beispiel Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und ähnliches verhindert werden. In vielen Fällen ist es bevorzugt, dass isotonische Agenzien zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid enthalten sind. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Verwendung von Absorption verzögernden Agenzien zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine bewerkstelligt sein.
Sterile injizierbare Lösungen sind durch Zufügen der aktiven Komponenten in der erforderlichen Menge in das geeignete Lösemittel mit verschiedenen anderen, oben aufgezählten Bestandteilen und, falls erforderlich, anschließendem Sterilfiltrieren zubereitet. Allgemein sind Dispersionen durch Zufügen der verschiedenen sterilisierten aktiven Bestandteile zu einem sterilen Vehikulum zubereitet, das das Dispersionsbasismedium und die erforderlichen weiteren Bestandteile, die oben aufgezählt sind, enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Zubereitung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Zubereitungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefrietrocknungsverfahren, die ein Pulver des aktiven Bestandteils plus jeden zusätzlich erwünschten Bestandteils einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
In bestimmten Fällen könnten die therapeutischen Formulierungen der Erfindung ebenfalls in Formen zubereitet sein, die sich für eine topische Verabreichung wie beispielsweise Cremes und Lotionen eignen. Diese Formen können zur Behandlung von Haut assoziierten Erkrankungen wie beispielsweise verschiedene Sarkome verwendet sein.
Nach Formulierung werden Lösungen auf eine mit der Dosierungsformulierung zu vereinbarenden Weise und in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Die Formulierungen sind einfach in verschiedenen Dosierungsformen verabreicht wie beispielsweise injizierbare Lösungen, die oben beschrieben sind, wobei selbst Arzneimittelfreisetzungskapseln und ähnliches einsetzbar sind.
Für eine parenterale Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung zum Beispiel geeignet gepuffert sein, falls erforderlich, und das flüssige Verdünnungsmittel mit hinreichend Saline oder Glucose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind besonders für intravenöse, intramuskuläre, subkutane und intraperitoneale Verabreichung geeignet. In dieser Beziehung sind sterile wässrige Medien, die eingesetzt werden können, dem Fachmann in Anbetracht der vorliegenden Offenlegung bekannt. Zum Beispiel könnte eine Dosis in 1 ml isotonischer NaCl-Lösung gelöst werden und entweder zu 1000 ml Hypodermoclyse-Flüssigkeit zugegeben oder in die vorgesehene Infusionsstelle injiziert werden (siehe zum Beispiel „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, Seiten 1035–1038 und 1570–1580). Eine gewisse Dosierungsvariation erfolgt in Abhängigkeit des Zustandes des zu behandelnden Patienten. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt auf jeden Fall die geeignete Dosis für jeden einzelnen Patienten.
3. Kits
Sämtliche essenzielle Materialien und Reagenzien, die zur Bestimmung von Wildtyp p53 in einer Probe oder zur Erhöhung des Levels von Wildtyp p53 unter Zuhilfenahme von MeOE₂ in Tumorzellen erforderlich sind, können in einem Kit zusammengestellt sein. Wenn die Bestandteile des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen bereitgestellt sind, so ist die flüssige Lösung bevorzugt eine wässrige Lösung, wobei eine sterile wässrige Lösung besonders bevorzugt ist.
Zur Detektion von Wildtyp p53 kann das Kit Materialien für eine PCR-Analyse wie Primer, Puffer und geeignete Lösemittel enthalten. Falls die Detektion mit Hilfe immunologischer Mittel erfolgt, kann das Kit alternativ Antikörper, die gegen das p53 gerichtet sind, zweite Antikörper, die die ersten Antikörper binden, Markierungen oder signalgebende Verbindungen (entweder konjugiert oder nichtkonjugiert) und verschiedene Reagenzien zur Generierung und Detektion von Signalen enthalten.
Für den in vivo Gebrauch kann eine Zusammensetzung allein oder gemeinsam mit p53-codierenden Expressionsvektoren bereitgestellt sein. Dies sind normalerweise separate Formulierungen, können aber in einer einzigen pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzung formuliert sein. Der Behälter selbst kann für eine Verabreichung angepasst sein, wie beispielsweise ein Inhalator, eine Spritze, Pipette, Augentropfer oder andere derartige ähnliche Apparaturen, von denen die Formulierung auf einen infizierten Körperbereich wie beispielsweise Lungen appliziert, in ein Tier injiziert oder mit weiteren Komponenten des Kits selbst appliziert und gemischt sein kann.
Die Zusammensetzungen dieser Kits können ebenfalls in getrockneten oder lyophilisierten Formen bereitgestellt sein. Wenn Reagenzien oder Komponenten in einer getrockneten Form bereitgestellt sind, erfolgt das Lösen im Allgemeinen mittels Zugabe eines geeigneten Lösemittels. Es ist angedacht, dass das Lösemittel in einem anderen Behälter ebenfalls bereitgestellt werden kann. Die Kits der Erfindung können ebenfalls eine Anleitung enthalten, die eine Verabreichung des die Wildtyp p53-Expression erhöhenden Agens und/oder der Gentherapie-Agenzien erklärt oder die Assays zur Bestimmung der p53-Levels in Proben erläutert.
Die Kits der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise ein Hilfsmittel, in dem die Gefäße in fester Umschließung für den Handel wie beispielsweise Injektions- oder vorgeformter Kunststoffbehälter enthalten sind, in denen die erwünschten Gefäße untergebracht sind. Ungeachtet der Anzahl oder Art der Behälter können die Kits der Erfindung ebenfalls enthalten oder verpackt sein mit einem separaten Instrument für die Unterstützung bei der Injektion/Verabreichung oder Verbringen der endgültigen Komplex-Zusammensetzung im Körper eines Tieres. Ein derartiges Gerät kann ein Inhalator, eine Spritze, Pipette, Pinzette, Messlöffel, Augentropfer oder irgendein derartiges medizinisch bewährtes Überbringungsvehikel. Weitere Instrumente umfassen Vorrichtungen, die das Ablesen oder Überwachen von Reaktionen in vitro erlauben.
F. Behandlung von Krebsarten mit mutierter p53-Expression unter Verwendung von 2-Methoxyestradiol in Kombination mit einer Gentherapie
In einer separaten Anwendungsform der vorliegenden Erfindung ist es angedacht, dass 2-MeOE₂ in Kombination mit einer herkömmlichen Gentherapie in einem Kit zur Behandlung derjeniger Krebsarten verwendet wird, die mutiertes p53 exprimieren.
Es ist eindeutig, dass eine Übertragung von Wildtyp p53 in Tumoren, die ein mutiertes p53-Gen exprimieren, die schädlichen Effekte der p53-Mutation überwinden kann. In der vorliegenden Anwendungsform der Erfindung ist 2-Methoxyestradiol gemeinsam mit dem Wildtyp p53-Gen verabreicht, wobei dadurch die Expression des exogen applizierten Wildtyp p53 sich erhöht. Das 2-MeOE₂ kann gleichzeitig mit der Gentherapie, vor der Gentherapie oder nach der Gentherapie verabreicht sein. Sämtliche Komponenten der Gentherapie und die therapeutischen 2-MeOE₂-Zusammensetzungen können in Form eines Kits zusammengestellt sein, wie es oben beschrieben ist. Die für die Genübertragung eingesetzten Elemente sind unten beschrieben.
1. Expressionsvektoren
In der gesamten Anmeldung bedeutet der Ausdruck "Expressionskonstrukt", dass jede Art eines genetischen Konstruktes, enthaltend eine die für ein p53-Genprodukt codierende Nucleinsäure, in der ein Teil oder die gesamte p53-Nucleinsäure in der Lage ist, transcribiert und nachfolgend in ein Protein übersetzt zu werden, umfasst ist.
Um das Konstrukt zu einer Expression eines p53-Transcripts zu veranlassen, steht das das p53-Polynucleotid codierende Polynucleotid unter der Transcriptionskontrolle eines Promotors. Ein „Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die vom Synthese-Apparat der Wirtszelle oder vom eingeführten Synthese-Apparat erkannt wird, der zur Initiation der spezifischen Transcription eines Gens erforderlich ist. Der Ausdruck „unter Transcriptionskontrolle" heißt, dass der Promotor an der korrekten Stelle bezogen auf das Polynucleotid ist, um RNA-Polymerase-Initiation und Expression des Polynucleotids zu steuern.
Der Ausdruck Promotor bezeichnet hier eine Gruppe Module für die Transcriptionskontrolle, die um die Initiationsstelle für die RNA-Polymerase II herum angehäuft sind. Der größte Teil der Vorstellung darüber, wie Promotoren organisiert sind, stammt von Untersuchungen verschiedener viraler Promotoren, einschließlich derjenigen für die HSV Thymidinkinase (tk) und SV40 frühe Transcriptionseinheiten. Diese Untersuchungen, von jüngeren Arbeiten untermauert, haben gezeigt, dass Promotoren aus diskreten Funktionsmodulen zusammengesetzt sind, wobei jedes aus ungefähr 7–20 bp DNA besteht und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transcriptionale Aktivator- oder Repressorproteine enthalten.
Wenigstens ein Modul in jedem Promotor dient zur Positionierung der Startstelle für die RNA-Synthese. Das bekannteste Beispiel hierfür ist die TATA Box, aber bei einigen Promotoren fehlt die TATA Box, wie beispielsweise dem Promotor für das terminale Desoxynucleotidyl-Transferase-Gen von Säugern und dem Promotor für die SV40 späten Gene, wobei ein die Startstelle überlagerndes diskretes Element selbst hilft, die Initiationsort zu fixieren.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Frequenz der Transcriptionsinitiation. Typischerweise befinden diese sich in der Region 30–110 bp stromaufwärts der Startstelle, obwohl von zahlreichen Promotoren vor kurzem gezeigt worden ist, dass sie funktionale Elemente ebenfalls stromabwärts der Startstelle besitzen. Die Entfernung zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, wenn Elemente invertiert oder relativ zueinander verschoben werden. In dem tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf bis 50 bp weit erhöht werden, bevor die Aktivität abzunehmen beginnt. Abhängig vom Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder gemeinsam oder unabhängig voneinander arbeiten können, um die Transcription zu aktivieren.
Es wird nicht angenommen, dass ein bestimmter Promotor, der zur Steuerung der Expression eines p53-Polynucleotids eingesetzt ist, entscheidend ist, solange er in der Lage ist, das Polynucleotid in der Zielzelle zu exprimieren. Wo eine menschliche Zelle als Ziel ausgewählt ist, ist es folglich bevorzugt, die Polynucleotid codierende Region benachbart zu und unter Kontrolle eines Promotors zu positionieren, der in der Lage ist, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden. Allgemein ausgedrückt, ein derartiger Promotor könnte entweder einen humanen oder viralen Promotor umfassen.
In verschiedenen Anwendungsformen kann der humane Cytomegalovirus (CMV) Immediate-early-Genpromotor, der SV40 frühe Promotor und die lange terminale Wiederholung vom Rous Sarkomavirus verwendet sein, um eine p53-Nucleotid-Expression mit hohem Level zu erhalten. Die Verwendung anderer viraler oder Säugerzell- oder Bakteriophagen-Promotoren, von denen in der Technik bekannt ist, dass sie eine Expression von Polynucleotiden erreichen, ist ebenso in Erwägung gezogen, vorausgesetzt, dass die Expressionslevels für eine Bildung einer Wachstumshemmwirkung hinreichend sind.
Durch Einsatz eines Promotors mit gut bekannten Eigenschaften können Expressionslevel und -muster eines Polynucleotids nach Transfektion optimiert werden. Zum Beispiel erlaubt die Auswahl eines Promotors, der in bestimmten Zellen aktiv ist wie beispielsweise Tyrosinase (Melanom), alpha-Fötoprotein und Albumin (Lebertumoren), CC10 (Lungentumor) und Prostata-spezifisches Antigen (Prostatatumor), eine Gewebe spezifische Expression von p53-Polynucleotiden. Tabelle 1 führt einige Elemente/Promotoren auf, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein können, um die Expression von p53-Konstrukten zu regulieren. Diese Liste ist nicht als erschöpfend für alle möglichen Elemente, die an der Förderung der p53-Expression beteiligt sind, sondern sind lediglich als Beispiele dafür aufzufassen.
Enhancer wurden ursprünglich als genetische Elemente nachgewiesen, die eine Transcription von einem Promotor erhöhten, der sich an einer entfernten Position auf demselben DNA-Molekül befand. Diese Fähigkeit, über eine große Entfernung zu wirken, waren ohne Beispiel in den klassischen Untersuchungen über die prokaryotische Transcriptionsregulation. Nachfolgende Arbeiten zeigten, dass DNA-Regionen mit Enhancer-Aktivität eher wie Promotoren organisiert sind. Das heißt, sie sind aus vielen einzelnen Elementen zusammengesetzt, jedes von ihnen bindet an ein oder mehrere transcriptionale Proteine.
Der wesentliche Unterschied zwischen Enhancer und Promotoren ist operational. Eine Enhancer-Region als Ganzes muss in der Lage sein, die Transcription über eine Distanz zu stimulieren, was für eine Promotor-Region oder deren Bestandteile nicht zutreffen muss. Andererseits muss eine Promotor-Region ein oder mehrere Elemente besitzen, die die Initiation einer RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Richtung steuern, wohingegen Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Promotoren und Enhancer sind häufig überlappend und angrenzend, häufig scheinen sie eine sehr ähnliche modulare Organisation zu besitzen.
Zusätzlich könnte eine beliebige Promotor/Enhancer Kombination (laut der Eukaryotic Promotor Data Base EPDB) zum Steuern der Expression eines p53-Konstrukts verwendet sein. Verwendung von einem T3, T7 oder SP6 cytoplasmatischen Expressionssystem ist eine weitere mögliche Anwendungsform. Eukaryotische Zellen können eine cytoplasmatische Transcription von bestimmten Bakteriophagen-Promotoren unterstützen, falls die geeignete Bakteriophagen-Polymerase bereitgestellt ist, entweder als Teil des Übertragungskomplexes oder als ein zusätzlicher genetischer Expressionsvektor.
Tabelle 1
Tabelle 1 Fortsetzung
Außerdem kann die Auswahl eines Promotors, der als Antwort auf spezifische physiologische Signale reguliert wird, eine induzierbare Expression des p53-Konstrukts erlauben. Zum Beispiel ist mit dem Polynucleotid unter Kontrolle des humanen PAI-1 Promotors die Expression durch den Tumor-Nekrose-Faktor induzierbar. Tabelle 2 verdeutlicht einige Promotor/Induktor Kombinationen:
Tabelle 2
Tabelle 2 Fortsetzung
In bestimmten Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung kann die Übertragung eines Expressionsvektors in eine Zelle mittels Einbeziehung eines Markers in den Expressionsvektor in vitro oder in vivo identifiziert werden. Der Marker würde zu einer identifizierbaren Veränderung der transfizierten Zelle führen, was eine einfache Identifizierung der Expression erlaubte. Normalerweise hilft der Einschluss eines Arzneimittelselektionsmarkers bei Klonierung und bei der Selektion von Transformanten. Alternativ können Enzyme wie beispielsweise Herpes simplex Virus Thymidinkinase (tk) (eukaryotisch) oder Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (prokaryotisch) eingesetzt sein. Immunologische Marker können ebenfalls eingesetzt sein. Es wird nicht vermutet, dass der eingesetzte selektierbare Marker von Bedeutung ist, solange er in der Lage ist, gemeinsam mit dem p53 codierenden Polynucleotid exprimiert zu werden. Weitere Beispiele für selektierbare Marker sind dem Fachmann bekannt.
Typischerweise wird man ein Polyadenylierungssignal mit einbeziehen, um eine korrekte Polyadenylierung des Transcripts zu erhalten. Es wird nicht geglaubt, dass die Natur des Polyadenylierungssignals für eine erfolgreiche praktische Anwendung der Erfindung entscheidend ist, und eine beliebige derartige Sequenz eingesetzt werden kann. Ebenfalls ist auch über den Terminator als ein Element des Expressionskonstrukts nachzudenken. Diese Elemente können dazu dienen, die mRNA-Levels zu erhöhen und ein Durchlesen aus dem Konstrukt in andere Sequenzen zu minimieren.
In bevorzugten Anwendungsformen der vorliegenden Erfindung umfasst das Expressionskonstrukt einen Virus oder ein hergestelltes Konstrukt, das von einem viralen Genom abgeleitet ist. Die Fähigkeit bestimmter Viren, in die Zelle über eine Rezeptor-vermittelte Endocytose einzudringen und in manchen Fällen sich in die Chromosomen der Wirtszelle zu integrieren, haben sie zu attraktiven Kandidaten für den Gentransfer in eine Säugerzelle gemacht. Weil gezeigt worden ist, dass die direkte Aufnahme nackter DNA wie auch die Rezeptor-vermittelte Aufnahme von DNA-Komplexen (unten diskutiert) möglich ist, müssen Expressionsvektoren allerdings nicht viralen Ursprungs sein, sondern stattdessen kann es ein beliebiges Plasmid, Cosmid oder Phagenkonstrukt sein, das in der Lage ist, die Expression codierter Gene in Säugerzellen zu unterstützen, wie beispielsweise pUC oder Bluescript^TM Plasmidreihen.
i. Retroviren
Die Retroviren sind eine Gruppe einzelsträngiger RNA-Viren, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, ihre RNA in doppelsträngige DNA in infizierten Zellen mittels reverser Transcription umzuschreiben (Coffin, 1990). Die resultierende DNA integriert sich stabil als ein Provirus in zelluläre Chromosomen und steuert die Synthese viraler Proteine. Die Integration führt zur Beibehaltung der viralen Gensequenzen in der Empfängerzelle und ihren Abkömmlingen. Das retrovirale Genom enthält drei Gene – gag, pol und env – die für Capsid-Proteine, Polymerase-Enzyme beziehungsweise Hüllkomponenten codieren. Die stromaufwärts des gag Gens gefundene Sequenz, als ψ bezeichnet, fungiert als ein Signal für Verpackung des Genoms in Virionen. Zwei lange terminale Wiederholungssequenzen (LTR) liegen am 5' und 3'-Ende des viralen Genoms vor. Diese enthalten einen starken Promotor und Enhancer-Sequenzen und sind für eine Integration in das Wirtszellgenom erforderlich (Coffin, 1990).
Um einen retroviralen Vektor zu konstruieren, wird eine ein p53 codierende Nucleinsäure in das virale Genom an der Stelle von bestimmten viralen Sequenzen inseriert, um einen Virus zu bilden, der replikationsdefekt ist. Um Virionen herzustellen wird eine Verpackungszelllinie, die die gag, pol und env Gene enthält, aber ohne die LTR und ψ Komponenten konstruiert (Mann et al., 1983). Wenn ein rekombinantes Plasmid, das eine humane cDNA enthält, zusammen mit den retroviralen LTR und ψ Sequenzen in diese Zelllinie eingeführt wird (durch Calciumphosphat-Fällung zum Beispiel), erlaubt die ψ Sequenz dem RNA-Transcript des rekombinanten Plasmids in virale Partikel verpackt zu werden, welche dann in das Kulturmedium sezerniert werden (Nicolas und Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Das Medium, das die rekombinanten Retroviren enthält, wird dann gesammelt, gegebenenfalls konzentriert, und für den Gentransfer verwendet. Retrovirale Vektoren können ein breites Spektrum an Zelltypen infizieren. Allerdings erfordert die Integration und stabile Expression die Teilung der Wirtszellen (Paskind et al., 1975).
Ein neuartiger Versuchsansatz zum spezifischen Zielen von retroviralen Vektoren wurde vor kurzem entwickelt, der auf der chemischen Modifikation eines Retrovirus mittels chemischer Addition von Galactose-Resten an die virale Hülle beruht. Diese Modifikation könnte die spezifische Infektion von Hepatocyten via Asialoglycoprotein-Rezeptoren erlauben.
Ein anderer Versuchsansatz zum Zielen rekombinanter Retroviren wurde entwickelt, in dem biotinylierte Antikörper gegen ein retrovirales Hüllprotein und gegen einen spezifischen Zellrezeptor verwendet wurden. Die Antikörper waren über Biotin-Komponenten unter Zuhilfenahme von Streptavidin gekoppelt (Roux et al., 1989). Unter Verwendung von Antikörpern gegen Haupthistokompatibilitätskomplex Klasse I und Klasse II Antigene demonstrierten sie die Infektion einer Reihe Humanzellen, die diese Oberflächenantigene tragen, mit einem ökotropen Virus in vitro (Roux et al., 1989).
ii. Adenoviren
Humane Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Tumorviren mit Genomgrößen von ungefähr 36 kb (Tooze et al., 1981). Als ein Modellsystem für eukaryotische Genexpression sind Adenoviren umfassend untersucht und gut charakterisiert worden, was sie zu einem attraktiven System für eine Entwicklung von Adenovirus als ein Gentransfersystem macht. Diese Gruppe Viren lässt sich leicht anziehen und manipulieren und zeigt eine breites Wirtsspektrum in vitro und in vivo. In lytisch infizierten Zellen sind Adenoviren in der Lage; die Proteinsynthese des Wirts abzuschalten, die Zellapparate für eine Synthese großer Mengen an Virusprotein zu steuern und ausgiebige Virus-Mengen zu produzieren.
Die E1-Region des Genoms enthält E1A und E1B, die für die Transcriptionsregulation des viralen Genoms erforderlichen Proteine codieren, wie auch einige zelluläre Gene. E2-Expression, einschließlich E2A und E2B, erlaubt die Synthese viraler replikativer Funktionen, z. B. DNA-bindendes Protein, DNA-Polymerase und ein terminales Protein, das die Replikation startet. E3-Genprodukte verhindern eine Cytolyse durch cytotoxische T-Zellen und Tumor-Nekrose-Faktor und scheinen für die Virusvermehrung von Bedeutung zu sein.
Mit den E4-Proteinen assoziierte Funktionen umfassen DNA-Replikatiun, Expression des späten Gens und Wirtszellabschaltung. Die Produkte des späten Gens umfassen den größten Teil der Virion-Capsidproteine und diese werden nur exprimiert, nachdem der größte Teil der Verarbeitung eines einzigen primären Transcripts von dem späten Hauptpromotor erfolgt ist. Der späte Hauptpromotor (MLP) zeigt eine hohe Effizienz während der späten Phase der Infektion (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991).
Da nur ein kleiner Teil des viralen Genoms in cis erforderlich zu sein scheint (Tooze. 1981), bieten Adenovirus-abgeleitete Vektoren oftmals eine exzellente Möglichkeit, große DNA-Fragmente zu substituieren, wenn sie in Verbindung mit Zelllinien wie beispielsweise 293 Zellen verwendet sind. Ad5-transformierte menschliche embryonale Nierenzelllinien (Graham, et al., 1977) sind entwickelt worden, um essenzielle virale Proteine in trans zu liefern. Der Erfinder schließt folglich, dass die Charakteristika von Adenoviren sie zu guten Kandidaten zur Verwendung beim Zielen auf Krebszellen in vivo machen (Grunhaus & Horwitz, 1992).
Besondere Vorteile eines Adenovirussystems zum Übertragen fremder Proteine auf eine Zelle beinhalten (i) die Fähigkeit, relativ große Stücke viraler DNA durch fremde DNA zu ersetzen; (ii) die strukturelle Stabilität rekombinanter Adenoviren; (iii) die Sicherheit einer adenoviralen Verabreichung an Menschen; und (iv) bekanntlicherweise keine irgendwie geartete Verbindung zwischen einer adenoviralen Infektion und Krebs oder Malignitäten; (v) die Fähigkeit, hohe Titer des rekombinanten Virus zu erhalten; und (vi) die hohe Infektiosität von Adenovirus.
Weitere Vorteile von Adenovirus-Vektoren gegenüber Retroviren beinhalten die höhere Gen-Expressionslevels. Zusätzlich ist die Adenovirus-Replikation anders als bei retroviralen Sequenzen unabhängig von der Wirtsgenreplikation. Weil Adenovirus transformierende Gene in der E1-Region ohne weiteres deletiert sein können und noch effiziente Expressionsvektoren liefern, wird vermutet dass das onkogene Risiko des Adenovirus vernachlässigbar ist (Grunhaus & Horwitz, 19921.
Im Allgemeinen beruhen Adenovirus-Gentransfersysteme auf rekombinantem, hergestelltem Adenovirus, der durch Deletion eines Teils seines Genoms wie beispielsweise E1 replikationsdefekt gemacht ist, aber seine Infektionsfähigkeit behalten hat. Sequenzen, die relativ große Fremdproteine codieren, können exprimiert werden, wenn zusätzliche Deletionen im Adenovirus-Genom gemacht werden. Zum Beispiel Adenoviren, die sowohl in der E1 als auch in der E3-Region Deletionen haben, sind in der Lage, bis zu 10 kb fremder DNA zu tragen und können zu hohen Titern in 293 Zellen angezogen werden (Stratford-Perricaudet und Perricaudet, 1991). Von einer überraschend anhaltenden Expression von Transgenen nach einer Adenovirus-Infektion ist ebenfalls berichtet worden.
iii. Weitere Vektoren als Expressionskonstrukte
Weitere virale Vektoren können als Expressionskonstrukte in der vorliegenden Erfindung eingesetzt sein. Es können Vektoren eingesetzt sein, die von Viren wie beispielsweise Vaccinia-Virus (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988), Adeno-assoziierter Virus (AAV) (Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Hermonat und Muzycska, 1984) und Herpesviren abgeleitet sind. Diese Viren bieten einige attraktive Merkmale für verschiedene Säugerzellen (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baichwal und Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990).
Mit der kürzlichen Entdeckung von defekten Hepatitis B Viren wurden neue Einblicke in die Beziehung von Struktur und Funktion von verschiedenen viralen Sequenzen gewonnen. In vitro Untersuchungen zeigten, dass der Virus trotz der Deletion von bis zu 80% seines Genoms die Fähigkeit zu Helfer abhängigem Verpacken und reverser Transcription beibehalten konnte (Horwich et al., 1990). Die ließ vermuten, dass große Teile des Genoms durch fremdes genetisches Material ersetzt werden könnte. Der Hepatropismus und die Persistenz (Integration) waren besonders attraktive Eigenschaften für einen Leber-gerichteten Gentransfer. Chang et al. führten vor kurzem das Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) Gen in das Enten Hepatitis B Virus-Genom anstelle der Polymerase, Oberfläche und Präoberfläche codierenden Sequenzen ein. Es wurde mit Wildtyp-Virus in eine Vogel Hepatomzelllinie cotransfiziert. Kulturmedium mit hohem Titer an rekombinantem Virus wurde verwendet, um primäre Enten-Hepatocyten zu infizieren. Eine stabile CAT Genexpression wurde wenigstens 24 Tage nach Transfektion nachgewiesen (Chang et al., 1991).
2. Alternative Verfahren zur Genübertragung
Um die Expression von p53-Konstrukten zu bewirken, muss der Expressionsvektor in eine Zelle übertragen werden. Wie oben beschrieben, ist der bevorzugte Mechanismus für eine Übertragung über eine virale Infektion, wo der Expressionsvektor in ein infektiöses Adenovirus-Partikel eingekapselt ist.
Verschiedene nicht-virale Verfahren für den Transfer von Expressionsvektoren in kultivierte Säugerzellen sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen worden. Diese umfassen Calciumphosphat-Fällung (Graham und van der Eb, 1973; Chen und Okayama, 1987; Rippe et al., 1990), DEAE-Dextran (Gopal. 1985), Elektroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), direkte Mikroinjektion (Harland und Weintraub, 1985), DNA-beladene Liposomen (Nicolau und Sene, 1982; Fraley et al., 1979) und Lipofectamin-DNA Komplexe, Zellbeschallung (Fechheimer et al., 1987), Genbombardement unter Zuhilfenahme von Hochgeschwindigkeitsprojektilen (Yang et al., 1990), Polykationen (Boussif et al., 1995) und Rezeptor-vermittelte Transfektion (Wu und Wu, 1987; Wu und Wu, 1988). Einige dieser Techniken können für einen in vivo und ex vivo Gebrauch erfolgreich angepasst werden.
In einer Anwendungsform der Erfindung kann der adenovirale Expressionsvektor einfach aus einem nackten rekombinanten Vektor bestehen. Transfer des Konstrukts kann mit Hilfe irgendeines der oben erwähnten Verfahren durchgeführt sein, die physikalisch oder chemisch die Zellmembran durchlässig machen. Zum Beispiel injizierten Dubensky et al. (1984) erfolgreich Polyomavirus-DNA in Form von CaPO₄-Niederschlägen in Leber und Milz erwachsener und neugeborener Mäuse und demonstrierten eine aktive virale Replikation und akute Infektion. Benvenisty und Neshif (1986) demonstrierten ebenfalls, dass direkte intraperitoneale Injektion von CaPO₄ gefällten Plasmiden zu einer Expression der transfizierten Gene führte. Es ist angedacht, dass ein p53-Konstrukt codierende DNA ebenfalls auf eine ähnliche Weise in vivo transferiert werden könnte.
Eine andere Anwendungsform der Erfindung zum Transfer eines nackten DNA-Expressionsvektors in Zellen kann ein Partikelbombardement umfassen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA beschichtete Mikroprojektile auf eine hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, um ihnen ein Durchdringen der Zellmembranen und Eindringen in Zellen, ohne diese zu töten, zu ermöglichen (Klein et al., 1987). Mehrere Vorrichtungen zur Beschleunigung kleiner Partikel sind entwickelt worden. Eine dieser Vorrichtungen beruht auf einer Hochspannungsentladung zur Erzeugung eines elektrischen Stroms, der dann wieder die Antriebskraft liefert (Yang et al., 1990). Die eingesetzten Mikroprojektile bestanden aus biologisch inerten Substanzen wie beispielsweise Wolfram- oder Goldkügelchen.
Ausgewählte Organe einschließlich Leber, Haut und Muskelgewebe von Ratten und Mäusen sind in vivo bombardiert worden (Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991). Dies kann eine chirurgische Exposition des Gewebes oder der Zellen erfordern, um jegliches zwischenliegendes Gewebe zwischen Pistole und Zielorgan zu beseitigen. Ein p53-Konstrukt codierende DNA kann mit diesem Verfahren übertragen werden.
In einer weiteren Anwendungsform der Erfindung kann der Expressionsvektor in einem Liposom eingeschlossen sein. Liposomen sind Vesikelstrukturen, die durch eine Phospholipid-Doppelmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen besitzen mehrere, von einem wässrigen Medium getrennte Lipidschichten. Liposomen formieren sich spontan, wenn Phospholipide in überschüssiger wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten arrangieren sich selbst vor der Formierung geschlossener Strukturen und schließen Wasser und gelöste Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten ein (Ghosh und Bachhawat, 1991). Ebenfalls werden Lipofectamin-DNA Komplexe in Betracht gezogen.
Liposomen-vermittelte Polynucleotid-Übertragung und Expression von fremder DNA in vitro ist ebenfalls erfolgreich gewesen. Wong et al. (1980) demonstrierte die Durchführbarkeit einer Liposomen-vermittelten Übertragung und Expression von fremder DNA in kultivierten Hühnerembryo-, HeLa- und Hepatomzellen. Nicolau et al. (1987) führte einen erfolgreichen Liposomen-vermittelten Gentransfer in Ratten nach intravenöser Injektion aus.
In bestimmten Anwendungsformen der Erfindung können die Liposomen mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) komplexiert sein. Es ist gezeigt worden, dass dieses die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von Liposomen-eingekapselter DNA fördert (Kaneda et al., 1989). In anderen Anwendungsformen kann das Liposom mit nukleären Nichthiston chromosomalen Proteinen (HMG-1) komplexiert oder zusammen eingesetzt sein (Kato et al., 1991). In noch weiteren Anwendungsformen kann das Liposom mit sowohl HVJ als auch HMG-1 komplexiert oder zusammen eingesetzt sein. Weil derartige Expressionsvektoren bei Transfer und Expression eines Polynucleotids in vitro und in vivo erfolgreich eingesetzt worden sind, sind sie in der vorliegenden Erfindung verwendbar. Wo ein Bakteriophagen-Promotor in dem DNA-Konstrukt eingesetzt ist, ist es ebenfalls erwünscht, dass das Liposom eine geeignete Bakteriophagen-Polymerase enthält.
Ein anderer Mechanismus für den Transfer von Expressionsvektoren in Zellen ist die Rezeptor-vermittelte Übertragung. Dieser Versuchsansatz macht sich den Vorteil der selektiven Aufnahme von Makromolekülen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose in fast allen eukaryotischen Zellen zu Nutze. Aufgrund der Zelltyp-spezifischen Verteilung der verschiedenen Rezeptoren kann die Übertragung hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993). Rezeptor-vermittelte auf Gene zielende Vehikel bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem Zellrezeptor-spezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Agens. Verschiedene Liganden sind für einen Rezeptor-vermittelten Gentransfer eingesetzt worden. Die ausgiebigst charakterisierten Liganden sind Asialoorosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987) und Transferrin (Wagner et al., 1993). Vor kurzem ist ein synthetisches Neoglycoprotein, das den gleichen Rezeptor wie ASOR erkennt, als ein Genübertragungsvehikel eingesetzt worden (Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994) und ein epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) ist ebenfalls verwendet worden, um Gene auf Zellen des squamösen Karzinoms zu übertragen.
In anderen Anwendungsformen kann das Übertragungsvehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Zum Beispiel verwendete Nicolau et al. (1987) Lactosyl-Ceramid, ein Galactose-terminales Asialgangliosid, das in Liposomen inkorporiert war, und beobachtete eine erhöhte Aufnahme des Insulin-Gens von Hepatocyten. Folglich ist es wahrscheinlich, dass ein adenoviraler Expressionsvektor auf einen Zelltyp wie beispielsweise Lungen-, Epithel- oder Tumorzellen mit Hilfe beliebiger zahlreicher Rezeptor-Liganden-Systeme, mit oder ohne Liposomen, ebenfalls spezifisch übertragen werden kann. Zum Beispiel kann der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) als der Rezeptor für eine vermittelte Übertragung vom p53-Konstrukt in viele Tumorzellen, die eine Aufregulation vom EGF-Rezeptor zeigen, verwendet sein. Galactose kann zum Zielen auf den Asialoglycoprotein-Rezeptor auf Leberzellen verwendet sein. Ebenfalls können Antikörper gegen CD5 (CLL), CD22 (Lymphom), CD25 (T-Zellleukämie) und MAA (Melanom) als zielende Teile ähnlicherweise verwendet sein.
In bestimmten Anwendungsformen kann der Gentransfer unter ex vivo Bedingungen leichter durchgeführt sein. Ex vivo Gentherapie bezeichnet die Isolation von Zellen von einem Tier, die Übertragung eines Polynucleotids in die Zellen, in vitro, und dann die Rückgabe der modifizierten Zellen in ein Tier. Dies kann die chirurgische Entnahme von Gewebe/Organen von einem Tier oder die Primärkultur von Zellen und Geweben umfassen. Andersen et al., U.S. Patent 5.399.346, hier in seiner Gesamtheit eingefügt, legt ex vivo Therapieverfahren offen. Während der ex vivo Kultur kann der Expressionsvektor das p53-Konstrukt exprimieren. Zum Schluss können die Zellen in das ursprüngliche Tier wieder zurückgeführt werden oder einem anderen Tier in einer pharmazeutisch verträglichen Form mit Hilfe eines der unten beschriebenen Mitteln verabreicht werden.
G. Kombination mit Chemo- und Radiostandardtherapie
Tumorzellresistenz gegen DNA schädigende Agenzien stellt ein Hauptproblem in der klinischen Onkologie dar. Ein Ziel in der heutigen Krebsforschung ist, Möglichkeiten für eine Verbesserung der Wirksamkeit von Chemo- und Radiotherapie durch Kombination mit der Gentherapie zu finden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, dass eine 2-MeOE₂ verstärkte p53-Gentherapie ähnlicherweise zusammen mit einer chemo- und radiotherapeutischen Intervention eingesetzt sein könnte.
Um Krebs wie beispielsweise maligne oder metastasierende Zellen unter Zuhilfenahme der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung abzutöten, bringt man eine „Ziel"-Zelle mit 2-MeOE₂ und einem p53 Protein oder Gen und gegebenenfalls mit wenigstens einem Chemotherapeutikum z. B. einem DNA schädigenden Agens in Kontakt. Diese Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge bereitgestellt, die wirksam wäre, die Zellen abzutöten oder die Proliferation der Zellen zu hemmen. Dieser Prozess kann Inkontaktbringen der Zellen mit dem 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen und dem/den Chemotherapeutika oder Faktor/en zum selben Zeitpunkt umfassen. Dies kann durch Inkontaktbringen der Zelle mit einer einzigen Zusammensetzung oder pharmazeutischen Formulierung, die beide Agenzien enthält, oder durch Inkontaktbringen der Zelle mit zwei verschiedenen Zusammensetzungen oder Formulierungen zum selben Zeitpunkt erreicht werden, worin eine Zusammensetzung das 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen und die andere das Chemotherapeutikum enthält.
Alternativ kann die 2-MeOE₂ verstärkte p53-Behandlung der Behandlung mit dem Chemotherapeutikum in zeitlichen Abständen, die von Minuten bis zu Wochen reichen, vorausgehen oder folgen. In Anwendungsformen, wo der DNA schädigende Faktor und 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen separat der Zelle appliziert sind, würde man sich generell vergewissern, dass nicht ein signifikanter Zeitraum zwischen den Zeitpunkten der Übertragung vergeht, so dass das DNA schädigende Agens und 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen noch in der Lage wäre, einen vorteilhaften kombinierten Effekt auf die Zelle auszuüben. In derartigen Fällen ist zu bedenken, dass man die Zelle mit beiden Agenzien innerhalb etwa 12–24 Stunden jeweils und bevorzugter innerhalb etwa 6–12 Stunden jeweils in Kontakt bringt, wobei eine Verzugszeit von nur etwa 12 Stunden am bevorzugtesten ist. In manchen Situationen kann es erwünscht sein, den Behandlungszeitraum signifikant auszudehnen, wo allerdings mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7) zwischen den entsprechenden Verabreichungen liegen.
Es ist ebenfalls vorstellbar, dass mehr als eine Verabreichung entweder von 2-MeOE₂ und p53 Protein oder Gen oder dem Chemotherapeutikum erwünscht ist. Verschiedene Kombinationen können eingesetzt sein, wo 2-MeOE₂ und p53 Protein oder Gen „A" ist und das Chemotherapeutikum „B" ist:
Die Ausdrücke „ in Kontakt gebracht" und „exponiert", wenn sie für eine Zelle verwendet sind, sind hier zur Beschreibung eines Prozesses verwendet, in dem ein Protein wie beispielsweise 2-MeOE₂ und p53 und ein Chemotherapeutikum oder Faktor auf eine Zielzelle übertragen oder in direkter Nachbarschaft zur Zielzelle verbracht sind. Um ein Abtöten der Zelle zu erreichen, werden beide Agenzien auf eine Zelle in einer kombinierten Menge übertragen, die wirksam ist, die Zelle abzutöten.
Insbesondere sind in der vorliegenden Erfindung DNA schädigende Agenzien als Teil eines kombinierten Therapieprotokolls eingesetzt. DNA schädigende Agenzien oder Faktoren sind hier als beliebige chemische Verbindung oder Behandlungsverfahren definiert, die/das eine DNA-Schädigung induziert, wenn auf eine Zelle angewandt. Derartige Agenzien und Faktoren umfassen Bestrahlung und Wellen, die DNA-Schädigung induzieren wie beispielsweise γ-Strahlen, Röntgenstrahlen, UV-Strahlen, Mikrowellen, elektronische Emissionen und ähnliches. Verschiedene chemische Verbindungen, ebenfalls als „Chemotherapeutika" beschrieben, induzieren DNA-Schädigungen, wobei alle diese Verbindungen in den hier offengelegten Verfahren der kombinierten Behandlung verwendet sein können. Für eine Verwendung in Betracht gezogene Chemotherapeutika umfassen z. B. Adriamycin, 5-Fluoruracil (5FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) und sogar Wasserstoffperoxid. Die Erfindung umfasst ebenfalls die Anwendung einer Kombination aus einem oder mehreren DNA schädigenden Agenzien, entweder auf Strahlen basierend oder reale Verbindungen wie beispielsweise die Anwendung von Röntgenstrahlen mit Cisplatin oder die Anwendung von Cisplatin und Etoposid. In bestimmten Anwendungsformen ist die Anwendung von Cisplatin in Kombination mit 2-MeOE₂ und einem p53-Protein oder Gen als diese Verbindung besonders bevorzugt.
Jedes beliebige Verfahren kann angewandt sein, um eine Zelle mit 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen in Kontakt zu bringen, solange das Verfahren zu erhöhten Levels von funktionsfähigem p53-Protein innerhalb der Zelle führt. Dies umfasst sowohl die direkte Übertragung eines p53-Proteins auf eine Zelle als auch die Übertragung eines Gens oder DNA-Abschnittes, der p53 codiert, wobei dieses Gen die Expression und Produktion von p53 innerhalb der Zelle steuert. Da Proteinübertragung derartigen Nachteilen wie Proteinabbau und geringe zelluläre Aufnahme unterliegt, wird an die Verwendung eines rekombinanten Vektors gedacht, der ein p53-Protein codiert, was bestimmte Vorteile liefern würde.
Bei der Behandlung von Krebs gemäß der Erfindung würde man die Tumorzellen mit einem Chemotherapeutikum zusätzlich zu 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen in Kontakt bringen. Dies kann durch Bestrahlen der lokalisierten Tumorstelle mit DNA schädigenden Strahlen wie beispielsweise Röntgenstrahlen, UV-Licht oder γ-Strahlen oder sogar Mikrowellen erreicht werden. Alternativ können die Tumorzellen mit dem DNA schädigenden Agens in Kontakt gebracht werden durch Verabreichen an einen Probanden einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine DNA schädigende Verbindung wie beispielsweise Adriamycin, 5-Fluoruracil, Etoposid, Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C oder bevorzugter Cisplatin umfasst. Das DNA schädigende Agens kann als eine kombinierte therapeutische Zusammensetzung oder Kit zubereitet und angewandt sein, indem es mit 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen wie oben beschrieben kombiniert wird.
Agenzien, die direkt Nucleinsäuren insbesondere DNA vernetzen, sind ins Auge gefasst worden und es wird hier von ihnen gezeigt, dass sie DNA-Schäden verursachen, die zu einer synergistischen anti-neoplastischen Kombination führen. Agenzien wie beispielsweise Cisplatin und andere DNA-Alkylierungsmittel können verwendet sein. Cisplatin ist zur Krebsbehandlung weit verbreitet eingesetzt, mit in klinischen Anwendungen eingesetzten wirksamen Dosen von 20 mg/m² über 5 Tage alle drei Wochen für insgesamt drei Runden. Cisplatin wird nicht oral absorbiert und muss deshalb mittels intravenöser, subkutaner, intratumoraler oder intraperitonealer Injektion zur Verfügung gestellt werden.
Agenzien, die DNA schädigen, umfassen ebenfalls Verbindungen, die mit DNA-Replikation, Mitose und Chromosomenseggregation interferieren. Derartige chemotherapeutische Verbindungen umfassen Adriamycin, auch als Doxorubicin bekannt, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin und ähnliche. Weit verbreitete Verwendung in der klinischen Situation für die Behandlung von Neoplasmen sind diese Verbindungen mittels Bolus-Injektion intravenös im Dosisbereich von 25–75 mg/m² an 21 Tagesintervallen für Adriamycin, bis zu 35–50 mg/m² für Etoposid intravenös oder die doppelte intravenöse Dosis pro Tag oral verabreicht.
Agenzien, die die Synthese und Übersetzung der Nucleinsäure-Vorläufer und Untereinheiten unterbrechen, führen ebenfalls zu DNA-Schäden. Als solche sind mehrere Nucleinsäure-Vorläufer entwickelt worden. Besonders zweckdienlich sind Agenzien, die intensive Tests durchlaufen haben und ohne weiteres verfügbar sind. Als solche sind Agenzien wie beispielsweise 5-Fluoruracil (5-FU) bevorzugt mit neoplastischem Gewebe verwendet, was dieses Agens für ein Zielen auf neoplastische Zellen besonders zweckdienlich macht. Obwohl es sehr toxisch ist, ist 5-FU mit einem großen Spektrum an Trägern, einschließlich topisch, applizierbar, wobei allerdings eine intravenöse Verabreichung im Dosisbereich von 3 bis 15 mg/kg/Tag gewöhnlich eingesetzt ist.
Weitere Faktoren, die DNA-Schäden verursachen und häufig eingesetzt worden sind, beinhalten allgemein bekannte γ-Strahlen, Röntgenstrahlen und/oder das gerichtete Überbringen von Radioisotopen zu Tumorzellen. Andere Formen DNA schädigender Faktoren sind ebenfalls in Betracht gezogen worden wie beispielsweise Mikrowellen und UV-Bestrahlung. Es ist am wahrscheinlichsten, dass alle diese Faktoren ein großes Schadensspektrum auf die DNA-Vorläufer, auf die Replikation und Reparatur von DNA und die Zusammenlagerung und Aufrechterhaltung von Chromosomen bewirken. Dosisbereiche für Röntgenstrahlen reichen von täglichen Dosen von 50 bis 200 Röntgen für längere Zeiträume (3 bis 4 Wochen), bis zu Einzeldosen von 2000 bis 6000 Röntgen. Dosisbereiche für Radioisotope variieren stark und sind von der Halbwertzeit des Isotops, der Stärke und Art der emittierten Strahlen und der Aufnahme von den neoplastischen Zellen abhängig.
Der Fachmann richtet sich nach „Remington's Pharmaceutical Sciences" 15. Ausgabe, Kapitel 33, insbesondere Seiten 624–652. Eine geringe Änderung der Dosis kann notwendigerweise in Abhängigkeit des Zustandes des zu behandelnden Patienten erfolgen. Die für die Verabreichung verantwortliche Person bestimmt auf alle Fälle die geeignete Dosis für den einzelnen Patienten. Darüber hinaus sollten Präparate für die Verabreichung an Menschen die erforderliche Sterilität, Pyrogenizität, allgemeine Sicherheit und Reinheitsstandards, wie von der FDA Office of Biologics standards gefordert, gegeben sein.
Die Erfinder gehen davon aus, dass die regionale Übertragung von 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen auf Lungenkrebszellen in Patienten mit p53 assoziierten Krebsarten ein sehr effizientes Verfahren zum Übertragen eines therapeutisch wirksamen Proteins ist, um die klinische Erkrankung zu bekämpfen. Ähnlich kann die Chemo- oder Strahlentherapie auf eine bestimmte, affizierte Region des Körpers des Patienten gerichtet sein. Alternativ mag eine systemische Übertragung von 2-MeOE₂ und p53-Protein oder Gen oder dem DNA schädigenden Agens unter bestimmten Umständen geeignet sein, zum Beispiel wenn eine intensive Metastasis erfolgt ist.
H. Beispiele
Die folgenden Beispiele sind enthalten, um die bevorzugten Anwendungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Der Fachmann sollte zur Kenntnis nehmen, dass die in den Beispielen offen gelegten Techniken, die den dargestellten Techniken, die von den Erfindern entdeckt sind, folgen und bei der praktischen Umsetzung der Erfindung funktionieren, und können folglich als bevorzugte Formen in der Praxis betrachtet sein. Allerdings sollte der Fachmann in Anbetracht der vorliegenden Offenlegung zur Kenntnis nehmen, dass viele Änderungen in den spezifischen Anwendungsformen, die hier offengelegt sind, gemacht werden können und noch ein gleiches oder ähnliches Resultat erhalten wird, ohne den Sinn der Erfindung zu verändern oder den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
BEISPIEL I
Material und Methoden
Zelllinien und Gewebekultur
Nicht-kleinzellige Lungenkrebszelllinie H1299 (p53 deletiert), H460 (Wildtyp p53), H358 (p53 deletiert) und pH 322 (p53 mutiert) wurden von Drs. Adi Gazdar und John Minna erhalten. Die humane Lungenkrebszellinie A549 (Wildtyp p53) wurde von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640 Medium, supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem fötalen Rinderserum, angezogen und bei 5% CO₂ gehalten. Alle in vitro Untersuchungen wurden durchgeführt, wenn die Zellen zu 70% konfluent waren.
Adenovirusvektor-Konstruktion und Transfektion
Ein Adp53-Säugerexpressionsvektor wurde in unserem Laboratorium, wie bereits berichtet, hergestellt (Zhang, et al., 1993). Zusammengefasst: PCR-erzeugte humane Wildtyp p53 cDNA wurde in einen pXCJL.1 Shuttle-Vektor unter der Kontrolle des humanen Cytomegalovirus (CMV) Promotors subkloniert. Das resultierende Konstrukt und pJM17 wurden in 293 Zellen cotransfiziert. Adenovirale Rekombinanten wurden dann isoliert, mittels Western Blot Analyse getestet und weiter gereinigt. Zuletzt wurden Adenovirus-Titer bestimmt. Die MOI wurde als Verhältnis von Gesamtzahl an Plaque-bildenden Einheiten, die bei einer bestimmten Infektion verwendet waren, zu Gesamtzahl an zu infizierenden Zellen definiert.
Western Blot Analyse
Die Kontrollzellen und Arzneimittel-behandelten Zellen wurden in kalter PBS gewaschen, in Laemmli Probenpuffer lysiert und einer Western Blot Analyse, wie zuvor beschrieben, unterworfen (Mukhopadhyay et al., 1995). Die Blots wurden mit Pab 1801 anti- p53 monoklonalem Antikörper (Oncogene Sciences, Uniondale, NY) besondet. Der Blot wurde außerdem mit anti-WAF1 monoklonalem Antikörper (p21) besondet.
Die Blots wurden in Tris-gepufferter Saline, die 0,1% Tween 20 enthielt, gewaschen, mit Meerrettich-Peroxydase, die mit einem zweiten Antikörper konjugiert ist, inkubiert und der spezifische Immunkomplex wurde mittels verstärkter Chemilumineszenz-Technik gemäß Herstellerangaben (Amersham, Arlington, IL) detektiert. Blots wurden erneut mit anti-Actin monoklonalem Antikörper (Amersham) besondet, um die gleiche Proteinbeladung zu zeigen.
RNA-Isolierung und Northern Blot Analyse
Gesamt-RNA wurde aus den subkonfluenten Kulturen unter Verwendung von Guanidinthiocyanat isoliert (Chomczynsky und Sacchi, 1987). Zwanzig Mikrogramm Gesamt-RNA wurde in 1,4% Agarose/MOPS Formaldehydgel einer Elektrophorese unterzogen, auf eine Nylonmembran übertragen und mit einer radioaktiv markierten p53 cDNA-Sonde, wie zuvor beschrieben (Mukhopadyay und Roth, 1993), hybridisiert.
Analyse der DNA-Bindung
Elektrophoretische Mobilitätsassays (EMSA) wurden unter Verwendung von Kernextrakt von der H460 Zelllinie durchgeführt. Die Kernextrakte wurden aus unbehandelten Kontrollzellen und 2-MeOE₂-behandelten Zellen hergestellt. Die Zellen wurden in eiskalter PBS gewaschen und in 0,5 ml Kern-Erntepuffer (10 mM HEPES, pH 7,9; 10 mM KCl; 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1% NP-40; 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid; 2 mg/ml Leupeptin; 2 mg/ml Aprotinin; 0,5 mg/ml Benzamidin) geschabt. Nach 30 minütiger Inkubation auf Eis, wurden die Lysate 1 min. bei 4°C zentrifugiert. Das Kernpellet wurde in Kern-Erntepuffer, der 0,4 M NaCl enthält, resuspendiert und 1 h auf Eis inkubiert. Die Kernextrakte wurden in einer Mikrozentrifuge mit 12.000 rpm 30 min. bei 4°C zentrifugiert und der Überstand wurde bei –70°C aufbewahrt.
Um die elektrophoretischen Mobilitätsassays (EMSA) durchzuführen, wurden 10 mg Kernextrakt vorsichtig mit 0,1 mg Poly (dl-dC) und 1 ng ³²P endmarkiertem p53-Konsensusbindenden Oligonucleotid in Bindungspuffer (25 mM HEPES, pH 7,9; 0,5 mM EDTA; 0,5 mM DTT; 1% NP-40; 5% Glycerol; 50 mM NaCl) in 20 ml Gesamtreaktionsvolumen gemischt. Ein Mikroliter (1 mg) p53 monoklonaler Antikörper DO1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Calif) wurde zu der DNA nach Binden gegeben und weitere 15 min. inkubiert, um die Superverschiebung zu zeigen. DNA-Protein Komplexe wurden in nativen 4,5% Polyacrylamidgelen aufgetrennt.
Wachstumsassay
Für Messungen der Zellgröße wurden 5 × 10⁴ Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen ausplattiert oder es wurden alternativ 1 × 10⁴ Zellen 24 Stunden vor Arzneimittel-Behandlung oder adenoviraler Infektion auf Gewebekulturplatten ausgesät. Zellwachstum wurde mit unbehandelten Kontrollen, mit 2-MeOE₂-behandelten Zellen und mit einer Kombination aus Adp53 (1 MOI) und 2-MeOE₂-behandelten Zellen gemessen. Als interne Kontrolle wurden die Zellen mit einem leeren adenoviralen Vektor dl312 transduziert. Kontrollzellen und behandelte Zellen wurden trypsiniert, mit Kristallviolett gefärbt und unter Zuhilfenahme eines Hämoctoymeters gezählt. Die Untersuchungen wurden dreifach durchgeführt.
Durchflusscytometrische Analyse
Kontrollzellen und behandelte Zellen wurden mittels Trypsinierung gesammelt, in PBS gewaschen und in 70% Ethanol übernacht fixiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen in PBS 30 min. rehydratisiert, zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Zur DNA-Analyse wurde 50 mg/ml Propidiumiodid (Sigma) mit zugegeben und die Zellen wurden in Gegenwart von RNase mit 15 mg/ml für 30 min. bei 37°C inkubiert. Die durchflusscytometrische Analyse wurde in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (Coulter Epics Elite) durchgeführt.
TdT Färbung
Terminale Desoxynucleotidyltransferase-vermittelter dUTP-Biotin-Nick-Endmarkierung (TUNEL) Assay wurde, wie bereits beschrieben (Fujiwara et al., 1994), durchgeführt. Zusammengefasst: die Zellen wurden fixiert und auf den Objektträger zytozentrifugiert. Die Zellen wurden in TdT-Puffer (30 mM Tris-HCl, pH 7,2, 140 mM Kakodylat, 1 mM Kobaltchlorid) inkubiert und mit biotinyliertem dUTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 100 U/ml TdT-Enzym (Bethesda Research Laboratory) 1 h bei 37°C inkubiert. Der Avidin-Biotin Komplex wurde unter Verwendung des Vectastain Elite Kit (Vector Laboratory, Burlingame, CA) mit Hilfe des Diaminobenzidin-H₂O₂ Verfahrens detektiert
BEISPIEL II
Die Wirkungen von 2-MeOE₂ auf die Wachstumscharakteristika von Krebszellen
Die Erfinder testeten die Wirkung einer 2-MeOE₂ -Behandlung auf die Wachstumscharakteristika von vier verschiedenen humanen Lungenkrebszelllinien, die sich in ihrem p53-Status unterschieden: H358 (p53 deletiert), H322 (p53 mutiert), H460 (Wildtyp p53), A549 (Wildtyp p53).
Die Zellen wurden mit 5 μM 2-MeOE₂ oder 16-Epiestriol (anderer Östrogen-Metabolit) behandelt und das Wachstum der Zellen wurde über fünf Tage überwacht (1).
2-MeOE₂ zeigte einen signifikanten Wachstumshemmeffekt auf die A549 und H460 Zellen, die das Wildtyp p53 enthalten, wohingegen es faktisch keinen Wachstumshemmeffekt auf die mutierte p53 H322 Zelllinie oder auf die p53 deletierte H358 Zelllinie besaß.
Western Blot Analyse des p53-Proteins nach 2-MeOE₂-Behandlung zeigten, dass dieses Arzneimittel eine Erhöhung der Wildtyp p53-Levels posttranscriptional bewirkte im Vergleich zu Wildtyp p53 tragenden Zelllinien. Die Wildtyp p53 Proteinlevels sind um das 6 bis 8fache während 48 h 2-MeOE₂-Behandlung in diesen Lungenkrebszelllinien erhöht. Allerdings erfolgte keine Erhöhung der Levels des mutierten p53 Proteins in der H322 Zelllinie oder in normalen Bronchialepithelzelllinien.
Das Wildtyp p53 offenbart seinen pleiotropen Effekt durch Aktivierung mehrere Zielgene. WAF1 ist eines dieser Ziele vom p53-Gen, und codiert ein p21 WAF1/CIP1 Protein mit einem Molekulargewicht von 21 kDa, das ein Inhibitor der Cyclin-abhängigen Kinase 2 ist, die für den G1-S Übergang erforderlich ist (E1-Deiry et al., 1993). Erhöhte p53 Levels nach 2-MeOE₂-Behandlung verursachten eine Aktivierung des p21 Gens aus. Wenn die Blots erneut mit WAF1 monoklonalem Antikörper besondet wurden, zeigten die H460 und A549 Zelllinien 3–5fache Erhöhungen der p21-Proteinexpression.
BEISPIEL III
2-MeOE₂-vermittelte Erhöhung von p53 ist von einem posttranscriptionalen Mechanismus kontrolliert
Dosis-Antwort-Untersuchungen zeigen, dass in diesen Lungenkrebszelllinien eine 5 μM 2-MeOE₂-Behandlung p53 und p21 auf einen maximalen Level nach 48 h stimulierte. Um zu bestimmen, ob von 2-MeOE₂ erhöhtes Wildtyp p53 vorwiegend von einem posttranscriptionalen Phänomen kontrolliert ist, wurden Gesamt-RNA von der H460 Kontrolle und nach 48 h 2-MeOE₂-Behandlung mittels Northern Blots untersucht.
Die Blots wurden mit radiomarkierter p53 cDNA besondet. Ergebnisse zeigten keine Änderungen der p53 mRNA-Levels nach Arzneimittelbehandlung, was darauf hinweist, dass 2-MeOE₂ keinen Effekt auf die Expression von Wildtyp p53 RNA besitzt und der p53-Proteinlevel das Resultat einer posttranscriptionalen Modifikation ist.
BEISPIEL IV
2-MeOE₂-Behandlung führt zu einer erhöhten Expression von p21WAF1/CIP1
Vermehrtes p53-Protein in H460 Zellen, die 48 h mit 2-MeOE₂ behandelt waren, war mit einer erhöhten p53 DNA-bindenden Aktivität korreliert. Die Erfinder testeten die Fähigkeit des p53-Proteins, das aus der Kontrolle, unbehandelt, und aus der 2-MeOE₂-behandelten H460 Zelllinie isoliert war, an Ziel-DNA Konsensussequenz zu binden. H460 Zellen wurden mit 5 μM 2-MeOE₂ 48 h behandelt und dann wurden Gesamt-Kernextrakte hergestellt. Eine dreifache Erhöhung der p53 DNA-bindenden Aktivität wurde in dem Kernextrakt von 2-MeOE₂-behandelten Zellen verglichen mit den unbehandelten Kontrollzellen gezeigt. Supershift-Analyse unter Zuhilfenahme von monoklonalem Antikörper wurde durchgeführt, um zu bestätigen, dass p53-Protein an die Konsensus-DNA bindenden Elemente bindet. Diese Daten zeigen, dass das nach der 2-MeOE₂-Behandlung gebildete Wildtyp p53-Protein funktional aktiv ist. Erhöhte p53 Expression war mit erhöhter Expression von p21 WAF1/CIP1 verknüpft.
Es ist gezeigt worden, dass eine p21-Induktion eine p53-vermittelte G1-Hemmung auslöst und die Apoptose induziert. Allerdings besaß in diesen Lungenkrebszelllinien weder die Erhöhung von Wildtyp p53 noch von p21 Proteinlevels einen Effekt auf den Zellzyklus.
Zellzyklus-Analyse zeigte keinen Beweis einer G1-Hemmung in diesen Lungenkrebszelllinien nach einer 2-MeOE₂ oder Epiestriol-Behandlung an (2A). Die Zellen wurden mit P1 markiert und der Zellzyklus wurde mittels FACScan analysiert. Ein die Apoptose-Zellen repräsentierender Peak trat bei 2-MeOE₂ behandelten H460 und A549 Zelllinien auf. Eine signifikante Steigerung des Zelltods war während des Wachstumsassays nach 48 h 2-MeOE₂-Behandlung von H460 und A549 Zelllinien beobachtet, obwohl nur zwei tote Zellen in der H322 oder in der H358 Zelllinien nach Kristallviolett-Färbung festgestellt wurden.
Um zu bestätigen, dass die Zellen aufgrund der Apoptose sterben, wurden sowohl schwebende als auch anhaftende Zellpopulationen vereint und in 70% Methanol fixiert und gleichzeitig mit UTP-markiertem Biotin und anschließend mit FITC-Avidin zur Detektion der mit einer Apoptose assoziierten DNA-Strangbrüche gefärbt. Die Ergebnisse zeigten, dass 2-MeOE₂-behandelte Zellen eine Apoptose durchliefen. 2B vergleicht den Prozentsatz von Apoptose-Zellen nach einer FACS-Analyse. Von A549 Zellen zeigten etwa 48% einen Apoptosezelltod nach 48 h Behandlung mit 5 μM 2-MeOE₂, während sie keinen Effekt auf H322 mutierte Zelllinien besaß. Zellen wurden ebenfalls mit biotinyliertem UTP für einen TUNEL-Assay gefärbt, um DNA-Fragmentierung zu beobachten. H460 Zellen wurden in Chamber-Slides angezogen und mit Arzneimitteln behandelt und TdT-Färbung wurde, wie in Materialien und Methoden beschrieben, durchgeführt. Mit Epiestriol behandelte Zellen oder scheinbehandelte Kontrollzellen zeigten eine geringe DNA-Fragmentierung, während 2-MeOE₂ behandelte Zellen viele Apoptose-Körperchen zeigten. Es scheint folglich, dass Apoptose für diese Lungenkrebszellen spezifisch ist und von der Verfügbarkeit hoher Wildtyp-Levels von p53-Protein in den Tumorzellen abhängig ist, bei denen bereits genetische Verletzungen gehäuft auftreten, da das normale Bronchialepithel nicht die beobachteten Veränderungen als Antwort auf eine 2-MeOE₂-Behandlung zeigte.
Das Wildtyp p53-Protein ist hochdynamisch und erfährt Konformationsänderungen in Abhängigkeit des proliferativen Status der Zelle (Milner und Watson, 1990). Mit dieser offensichtlichen konformationalen Flexibilität des Wildtyp p53-Proteins könnte ein pharmakologische Intervention in der Lage sein, das Protein in seinem funktionsfähig aktiven Status zu stabilisieren. Es ist bereits gezeigt worden, dass Geldanamycin die Konformation von mutiertem p53 und die biochemischen Eigenschaften selektiv verändern konnte (Blagosklony et al., 1995). Bei der Untersuchung der Erfinder zeigten Pulse-Chase-Untersuchungen, dass die Halbwertzeit des p53-Proteins nach einer 2-MeOE₂-Behandlung erhöht war. Folglich können posttranslationionale Modifikationen, die von 2-MeOE₂ verursacht sind, zu beobachteten höheren p53-Proteinlevel führen.
Diese Untersuchungen zeigen eindeutig, dass 2-MeOE₂ die Levels des Wildtyp p53-Gens auf posttranslationale Weise erhöht und die Zellen zum Durchlaufen der Apoptose induziert. Diese Verbindung besaß faktisch keine Wirkung auf p53-mutierte oder p53-deletierte Lungenkrebszelllinien. Folglich ist diese Verbindung ein potenter Inhibitor von Tumorzellwachstum in Zellen, die ein Wildtyp p53-Protein exprimieren.
BEISPIEL V
2-MeOE₂-Behandlung von Adp53-transduzierten Tumorzellen induziert Apoptose
In Krebszellen, die Wildtyp p53-defizient sind, induziert Transfer und Überexpression eines Wildtyp p53-Gens eine Wachstumshemmung und Apoptose. Krebszellen, die endogenes Wildtyp p32 exprimieren, können aufgrund unzureichender Levels an p53-Protein-akkumulation in der Zelle keine Apoptose durchlaufen. Da 2-Methoxyestradiol die Akkumulation von endogenem Wildtyp p53-Protein in humanen Tumorzellen posttranscriptional stabilisiert und fördert, untersuchten die Erfinder die Effekte einer 2-MeOE₂-Behandlung auf Tumorzellen, die mit einem Wildtyp p53 enthaltenden, rekombinanten Adenovirus (Adp53) transduziert waren.
Vier humane Nichtkleinzelliges Lungenkarzinom-(NSCLC)-Zellinien wurden für diese Untersuchung verwendet: H460 (Wildtyp p53), A549 (Wildtyp p53), H1299 (p53 fehlend) und H322 (p53 mutiert). Erste Dosis-Antwort-Untersuchungen unter Verwendung von H460 Zellen deuteten an, dass 5 mM 2-MeOE₂ hinreichend waren, Akkumulation von p53-Protein auszulösen und zu stabilisieren, so dass Wachstumshemmung und Apoptose induziert wurden. Folglich wurde diese Konzentration in der vorliegenden Untersuchung eingesetzt. Behandlung von H460 (3) oder A549 (4) Zellen mit ausschließlich 5 mM 2-Methoxyestradiol induzierte 3–4fach höhere Level von Wildtyp p53-Protein und nachfolgende Wachstumshemmung, wohingegen Behandlung von normalen Zellen, die endogenes Wildtyp p53-Protein enthalten, mit 2-Methoxyestradiol nicht beeinflusste. Im Gegensatz dazu hatte eine Behandlung von H1299 (5) oder H322 (6) Zellen mit ausschließlich 2-Methoxyestradiol keine Wirkungen auf das Zellwachstum. Adenovirus-vermittelten Transfer von Wildtyp p53-Gen mit einer geringen Dosis von einer MOI (Infektionsmultiplizität) hatte keine Wirkung auf irgendeine der getesteten Zelllinien. Wenn 2-Methoxyestradiol zu denselben Adp53-infizierten Zellen 24 h gegeben war, wurde allerdings eine starke Wachstumshemmung beobachtet (3–6). Untersuchung der Apoptose-Induktion mittels TUNEL-Färbung der H1299 Zellen ergab viele apoptose-Körper, was darauf hindeutet, dass 2-MeOE₂ das intrazelluläre Wildtyp p53-Protein stabilisierte, so dass hohe Levels Protein akkumulieren, was zu einer Induktion von Wachstumshemmung und Apoptose führt. Weil weder eine Behandlung einer der Zelllinien mit ausschließlich 2-MeOE₂ oder Adp53 mit angewandten Konzentrationen, die hinreichend waren, Wachstumshemmung oder Apoptose zu induzieren, war aber eine gemeinsame Verabreichung der Agenzien erfolgreich. Weil das Potenzial des viralen Vektors eine Toxizität und Immunreaktionen gegen den Vektor induziert, wenn er in hohen Dosen verwendet ist, lässt die hier beschriebene Strategie vermuten, dass kleine Adp53-Dosen zusammen mit einem nichttoxischen Agens wie 2-MeOE₂ beim Abtöten von Tumorzellen von Vorteil wären, ungeachtet des p53-Status
Die Synergie zwischen transfiziertem p53 und 2-MeOE₂ eröffnet aussichtsreiche Möglichkeiten für eine Krebsbehandlung über eine Gentherapie. 2-MeOE₂ scheint mehrere einzigartige Merkmale zu besitzen. Erstens ist es ein nichttoxisches Stoffwechselnebenprodukt von Östrogen, das in normalem menschlichen Urin vorkommt. Zweitens verursacht es eine 6 bis 8fache Akkumulation von Wildtyp p53-Protein, das mit einer Apoptose verknüpft ist. Drittens, obwohl die molekulare Basis für die bevorzugte Empfindlichkeit von Tumorzellen nicht verstanden ist, ist die 2-MeOE₂-Wirkung für Krebszellen gegenüber normalen Bronchialepithelzellen spezifisch (Mukhopadhyay & Roth, 1997; Seegers, et al., 1997). 2-MeOE₂ allein kann in den Tumorzelllinien, die endogenes Wildtyp p53 enthalten, p53 induzieren, was zu einem gewissen Grad zu einer Wachstumshemmung und Apoptose führt (Mukhopadhyay & Roth, 1997).
Was p53 anbelangt, so spielt es eine bedeutende Rolle bei der Ermittlung, ob eine Zelle einfach das Wachstum stoppt oder weiter wächst und Selbstmord als Antwort auf verschiedene äußere Stimuli begeht. Eine Mutation im p53-Gen inaktiviert häufig dessen Funktion und trägt zu einer malignen Progression bei (Vogelstein & Kinzler, 1992). Akkumulation des p53-Proteins kann die Zelle ursächlich auf einen von zwei Wegen zwingen: Hemmung des Zellzyklus (Kuerbitz, et al., 1992) oder programmierten Zelltod (Apoptose) (Shaw, et al., 1992; Ryan, et al., 1993). Der genaue Mechanismus, wie Wildtyp p53 eine Apoptose induziert, ist nicht eindeutig verstanden, allerdings lassen einige Untersuchungen vermuten, dass p53 die Induktion der Apoptose transcriptional aktiviert (Yonish-Rouach, et al., 1992), während andere vermuten, dass dies nicht zutrifft (Wagner et al., 1994).
Anbetracht dessen beschrieben diese Beispiele eine einzigartige Strategie für die humane Gentherapie. Diese Strategie kombiniert einen adenoviralen Vektor, der Wildtyp p53 codiert, mit einem antiangiogenen Agens, das selbst für die Zellen nichttoxisch ist. Tatsächlich ist von 2-MeOE₂ gezeigt worden, dass es die Tumorvaskularisierung vermindert, was für Tumorwachstum in vivo entscheidend ist (Fotsis, et al., 1994), und dass es für humane normale Hautfibroblasten selbst bei einer Konzentration von 100 mM nichttoxisch ist (Fotsis et al., 1994). Anders als herkömmliche Chemotherapeutika ist es sicher und schließt ein mögliches Problem mit der Arzneimittelresistenz aus. Obwohl der Mechanismus, mit dem 2-MeOE₂ Wildtyp p53-Levels erhöhen kann, nicht klar ist, scheint es, dass 2-MeOE₂ einen pleiotropen Effekt auf zelluläre Prozesse abhängig von Zelltyp und zellulärem Kontext besitzt. Induktion von p53 nach 2-MeOE₂-Behandlung korrelierte mit einer erhöhten Expression des Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor p21^WAF1/CIP1 Proteins in Zellen, die Wildtyp p53 exprimieren (Mukhopadhyay & Roth, 1997). Ein ähnliches Phänomen ist in anderen Zelltypen beobachtet worden. Zum Beispiel haben die Erfinder in MCF-7 Zellen hohe Levels an p53-Protein-Induktion gefunden, die mit Apoptose assoziiert waren (Daten nicht gezeigt). Ein früherer Bericht wies darauf hin, dass 2-MeOE₂ in der Östrogen-abhängigen MCF-7 Zelllinie eine G2/M-Hemmung verursachte, die mit einer Depolymerisierung von Tubulin assoziiert war (Tishler, et al., 1995). Wir beobachteten allerdings keinen Effekt auf die Tubulinstruktur in Immunfluoreszenz-Untersuchungen unserer Lungenkrebszelllinien (Daten nicht gezeigt) oder in A431 Zellen, selbst bei einer Konzentration von 20 mM (Attala, et al., 1996). Es ist ebenfalls vermutet worden, dass 2-MeOE₂ eine Mitose-Hemmung in einer Leukämiezelllinie durch Inhibition des Calmodulin-Stoffwechselweges verursacht (Attala, et al., 1996). Doch wenn Lungenkrebszelllinien mit 5 mM 2-MeOE₂ behandelt werden, besteht keine Wirkung auf die Verteilung der Tumorzellen auf die verschiedenen Phasen des Zellzyklus (Mukhopadhyay & Roth, 1997). Diese Daten lassen deshalb vermuten, dass 2-MeOE₂ über einen separaten Stoffwechselweg die Aktivierung von p53 und anschließende p53-abhängige Prozesse bewirkt.
Ein durchaus möglicher Stoffwechselweg, geänderte Phosphorylierung von p53-Protein-Isoformen, ist aufgrund einer zweidimensionalen Gelelektrophorese-Untersuchung des Gesamt-Proteins nach 2-MeOE₂-Behandlung vermutet worden (Maxwell et al., 1996). Zusammengefasst: spezifische Phosphorylierungsereignisse, die p53-Isoformen generieren, können die p53-Protein-Levels stabilisieren und die Proteinfunktion bei der Apoptose regulieren. Dies schließt allerdings die Möglichkeit nicht aus, dass die erhöhte Stabilität von Wildtyp p53 auf 2-MeOE₂-induzierte endogene Effektor-Moleküle zurückzuführen ist, die p53 binden und dessen Konformation modulieren können, was zu einem stabileren Protein und folglich zu einer Änderung der an der p53 Umsetzung beteiligten Stoffwechselwege führt.
Wenn p53-negative H1299 Zellen mit 2-MeOE₂ behandelt oder mit einem MOI Adp53 infiziert sind, scheint der Effekt auf das Zellwachstum gering zu sein. Aber wenn Adp53-transduzierte Zellen mit 2-MeOE₂ behandelt sind, folgt einer mehrfachen Erhöhung der Transgen-Expression eine schnelle Apoptose. Dies lässt vermuten, dass eine Superinduktion von Wildtyp p53-Protein für die Induktion der Apoptose verantwortlich ist, die mit hohen Levels p21^WAF1/CIP1 assoziiert ist. Obwohl hohe Dosen von Adp53 (50–100 MOI) zusammen mit 2-MeOE₂ extrem wirksam beim Abtöten von Lungenkrebszelle sind (~95–100%) (Daten nicht gezeigt), ist von sehr geringen Dosen von Adp53 gezeigt worden, dass sie für eine Kontrolle des Krebszellwachstums in Kultur und in vivo recht ausreichend sind. Folglich kann eine virale Toxizität vermieden werden. Darüber hinaus zeigen vorausgehende Versuche, dass eine Infizierung von subkutanen Tumoren mit Adp53 und dann orale Gabe von 2-MeOE₂ das Tumorwachstum sehr wirksam vermindert (siehe nächstes Beispiel).
BEISPIEL VI
In vivo 2-MeOE₂-Behandlung von Adp53-transduzierten Tumorzellen supprimiert Tumorwachstum
Die in den vorhergehenden Beispielen beschrieben Versuche demonstrieren die Wirksamkeit der Suppression des Zellwachstums und der Induktion der Apoptose in Tumorzellen nach einer kombinierten Behandlung mit Adp53 und 2-MeOE₂. Um die potenzielle Wirksamkeit dieses Versuchsansatzes der Krebsbehandlung noch weiter zu ergründen, führten die Erfinder in vivo Versuche durch.
In der ersten Versuchsreihe wurden die Wirkungen von 2-MeOE₂ allein auf das Wachstum von Tumorzellen in vivo gemessen. In athymischen Nacktmäusen wurde 1 × 10⁶ H460 Zellen (Wildtyp p53) subkutan in die Flanken injiziert und fünf Tage später wurde bei den Mäusen ein Dosis-Schema mit 1 mg 2-MeOE₂ oralen Dosen täglich oder 16-Epiestriol begonnen, das ein nicht funktionsfähiges Östrogen-Analogon ist, in 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) und Olivenöl gelöst. Wie in 7 gezeigt ist, wuchsen die unbehandelten Kontrollzellen oder 16-Epiestriol-behandelten Zellen unkontrolliert und das Tumorvolumen nahm rasch zu. Im Gegensatz dazu war das Tumorwachstum in Mäusen, die 2-MeOE₂ erhielten, drastisch gehemmt, sogar über 35 Tage nach der Tumorzellinjektion hinaus.
In der nächsten Versuchsreihe wurde ein Lungenmetastase-Modell verwendet, um die Wirkungen von 2-MeOE₂ allein oder in Kombination mit Adp53 zu testen. In ersten Versuchen wurde die Fähigkeit von 2-MeOE₂ allein getestet, Metastase-Bildung in den Lungen athymischer Nacktmäuse zu supprimieren. 2 × 10⁶ A549 Zellen (Wildtyp p53) wurden in die Schwanzvene der Mäuse intravenös injiziert und dann erhielten die Mäuse oral 1 mg/Maus/Tag 2-MeOE₂ oder 16-Epiestriol von Tag 5 bis Tag 21, zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse getötet. Tusche wurde dann in die Tracheen der Mäusen injiziert, um die Tumorkolonien auf den Lungenoberflächen zu färben. Lungen wurden entnommen und die Tumorkolonien gezählt. Wie in 8 zu sehen ist, hatten Mäuse, die weder 2-MeOE₂ noch 16-Epiestriol erhielten, ungefähr 800 Tumorkolonien auf ihren Lungenoberflächen. Ähnlich besaß 16-Epiestriol keine Wirkung auf eine Verminderung der Anzahl an Metastase-Kolonien. Allerdings verminderte die Behandlung mit 2-MeOE₂ die Anzahl an Kolonien verglichen mit den Kontrollmäusen signifikant.
In der nächsten Versuchsreihe wurden die Wirkungen von gemeinsam eingesetztem 2-MeOE₂ und Adp53 in dem Maus-Metastase-Modell getestet. Mäusen wurde an Tag null 2 × 10⁶ A549 Zellen injiziert und dann wurden an Tag fünf, sieben und neun 1,5 × 10⁹ Adp53-Partikel intravenös in die Schwanzvene injiziert. Von Tag fünf bis Tag 21, zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse getötet, wurde 2-Methoxyestradiol in 20% DMSO, gelöst in Olivenöl, mit einer Konzentration von 1 mg/Maus/Tag oral verabreicht. Lungenmetastasen wurden durch Färben mit Tusche detektiert und die Anzahl an Metastase-Kolonien auf der Lungenoberfläche gezählt. Als Kontrolle dienten Mäuse, die nur A549 Tumorzellen erhalten hatten und ungefähr 500 Kolonien bildeten und als Repräsentanten einer Nullprozent-Hemmung des Metastasewachstums betrachtet wurden (9). Mäuse, die Adp53 oder 2-MeOE₂-Behandlung allein erhielten, zeigten eine 15,9% beziehungsweise 42,3% Hemmung der Koloniebildung. Mäuse, die 2-MeOE₂ und Adbgal als negative Kontrolle für Adenovirus- Infektion erhielten, zeigten eine 35,2% Hemmung der Koloniebildung. Mäuse, die sowohl 2-MeOE₂ als auch Adp53 erhielten, zeigten 72,6% Hemmung der Koloniebildung. Diese Ergebnisse sind signifikant für ein 95% Vertrauensintervall. Zusätzlich war die Größe der Kolonien in Mäusen kleiner, die sowohl 2-MeOE₂ als auch mit Adp53 behandelt wurden, verglichen mit Mäusen, die jeweils mit einem Agens allein behandelt wurden. Folglich war in einem in vivo Modell die Etablierung von Lungentumoren vermindert und die Größe der Tumoren waren nach einer systemischen Behandlung mit einer Kombination aus Adp53 und 2-MeOE₂ verringert. Deshalb kann eine kombinierte Behandlung mit Adp53 und anschließend 2-MeOE₂ sich als eine wirksame Alternative in einer zukünftigen Gentherapie erweisen.
REFERENZEN
Die folgenden Referenzen sind in dem Umfange, wie sie beispielhafte Verfahrensdetails oder andere ergänzende Details zu den hier dargelegten Details liefern, hier durch Referenzen speziell eingefügt.

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Claims

Kit umfassend ein Wildtyp-p53-Gen und ein 2-Methoxyöstradiol für die Behandlung von Krebs in einem Patienten.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das Wildtyp-p53-Gen in einem Adenovirus enthalten ist.
Kit gemäß Anspruch 2, wobei der Adenovirus replikationsdefizient ist.
Kit gemäß Anspruch 3, wobei dem Adenovirus wenigstens ein Teil der E1 Region fehlt.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein Lungenkrebs ist.
Kit gemäß Anspruch 5, wobei der Lungenkrebs ein nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein Brustkrebs ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein Sarkom ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das Wildtyp-p53-Gen in einem adeno-assoziierten Virus enthalten ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das Wildtyp-p53-Gen in einem Herpesvirus enthalten ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein Krebs ist, der ein funktionales p53-Protein exprimiert.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei der Krebs ein Krebs ist, der kein funktionales p53-Protein exprimiert.
Kit gemäß Anspruch 2, wobei das Wildtyp-p53-Gen unter der Kontrolle eines CMV IE-Promotors steht.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das Wildtyp-p53-Gen in einem Retrovirus enthalten ist.
Kit gemäß Anspruch 1, wobei das Wildtyp-p53-Gen in einem nicht-viralen Expressionsvektor enthalten ist.
Kit gemäß Anspruch 15, wobei der Expressionsvektor in einem Liposom eingekapselt ist.
Verwendung von 2-Methoxyöstradiol in Kombination mit einem Wildtyp-p53-Gen für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der Krebs ein Lungenkrebs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 18, wobei der Lungenkrebs ein nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der Krebs ein Brustkrebs ist.
Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei der Krebs ein Sarkom ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das Medikament für eine parenterale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Medikament für eine intravenöse Verabreichung geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Medikament für eine intratumorale Verabreichung geeignet ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 24, wobei das Medikament weiterhin einen antimykotischen und/oder einen antibakteriellen Wirkstoff umfasst.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei das Medikament mit einer Injektionsspritze verabreichbar ist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 26, wobei das Medikament für die Verabreichung in Kombination mit einem DNA-schädigenden Wirkstoff geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei der DNA-schädigende Wirkstoff für die Verabreichung vor oder nach dem Medikament geeignet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der DNA-schädigende Wirkstoff ein chemotherapeutischer Wirkstoff ist.
Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei der chemotherapeutische Wirkstoff Adriamycin, 5-Fluoruracil (5-FU), Etoposid (VP-16), Camptothecin, Aktinomycin D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP) oder Wasserstoffperoxid ist.
Verwendung gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei der DNA-schädigende Wirkstoff Strahlung oder Wellen ist, die DNA-Schäden induzieren.
Verwendung gemäß Anspruch 31, wobei die Strahlung oder Wellen, die DNA-Schäden induzieren, γ-Strahlung, Röntgenstrahlung, UV-Strahlung, Mikrowellen oder elektronische Emissionen sind.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 27 bis 32, wobei entweder der DNA-schädigende Wirkstoff oder das Medikament oder beides wiederholt verabreicht wird.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 17 bis 33, wobei das Medikament für eine Verabreichung in einer Dosis von 100 mg/kg geeignet ist.