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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Technisches Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verhinderung von Hautirritationen
durch Windelausschlag und insbesondere zur Verhinderung und zur
Behandlung von Windelausschlag, welcher durch Enzyme aus Fäkalien verursacht
wird.
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Kurzbeschreibung des Stands
der Technik
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Windelausschlag
ist eine Form von Hautentzündung,
die Kinder betrifft, deren nasse und/oder beschmutzte Windeln nicht
umgehend gewechselt werden. Da es praktisch unmöglich ist, allen Bedürfnissen
eines Kindes unverzüglich
nachzukommen, leiden auch gut behütete Kinder von Zeit zu Zeit
an Windelausschlag.
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Seit
kurzer Zeit besteht die Einsicht, dass das Anfangsstadium von einigen
Formen von Windelausschlag das Resultat einer Hautreizung ist, die
durch Nahrungsenzyme in den Fäkalien
der Kinder, insbesondere Trypsin, Chymotrypsin und Elasthase, verursacht
wird. Diese Enzyme sind proteolytische Enzyme, die im Magen-Darm-Trakt
zur Verdauung von Nahrung erzeugt werden. Der Stuhl von Kindern
ist meist wässrig
und enthält
unter anderem Bakterien und einen gewissen Anteil unzerstörter Verdauungsenzyme.
Es wurde herausgefunden, dass für
den Fall, dass diese Enzyme für
eine hinreichende Zeitdauer in Kontakt mit der Haut verbleiben,
eine Hautirritation entsteht, die für sich alleine bereits unangenehm
ist, und die den Boden für
eine Infektion für
Mikroorganismen bereiten kann.
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Konventionelle
Methoden, um Windelausschlag zu verhindern oder zu lindern, bestanden
bisher in der Anwendung von Pudern, um die Haut trocken zu halten,
und Cremen und Wundsalben, um die Haut vor dem Kontakt mit den irritierenden
Stoffen zu schützen.
Dennoch bleibt Windelausschlag ein Problem für Kinder und Eltern.
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Eine
entsprechende Problematik, die auf Hautirritationen durch proteolytische
Enzyme in Fäkalien
zurückzuführen ist,
wurde bei Patienten mit einem künstlichen
Darmausgang gefunden. Solche Patienten würden ebenfalls von verbesserten
Behandlungsmethoden zur Verhinderung von Hautirritationen aufgrund
von Enzymen in Fäkalien
profitieren.
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Entsprechend
bestand weiterhin die Notwendigkeit zusätzlicher Verfahren zur Verhinderung
und Behandlung von Windelausschlag und vergleichbaren Hautirritationen
anzugeben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Dem
Bedarf zusätzlicher
Methoden zur Verhinderung von Windelausschlag wurde mit der vorliegenden
Erfindung Rechnung getragen, wobei proteolytische Enzyme aus Fäkalien durch
den Kontakt mit behandelten organophilen Tonen inaktiviert werden.
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Eine
Mischung zur Umsetzung der Erfindung umfasst einen Anteil eines
behandelten, organophilen Tons, der geeignet ist, irritierend wirkende
proteolytische Enzyme aus Fäkalien
zu inaktivieren und der in einem pharmazeutisch anwendbaren, nicht
giftigen dermatologischen Trägerstoff
verteilt ist.
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In
einer weiteren Ausführung
der Erfindung wird eine Mischung, die behandelten organophilen Ton enthält, beispielsweise
ein superabsorbierendes Polymer mit organophilem Ton, in ein Gewebe
zur Herstellung von Kleidungsstücken,
beispielsweise Windeln, eingebracht, welche in Kontakt mit Fäkalien,
die Haut reizende Enzyme enthalten, kommen kann.
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Entsprechend
offenbart die vorliegende Erfindung die Verwendung von organophilem
Ton, der ein Reaktionsprodukt eines Tons ist, der aus der Gruppe ausgesucht
wird, die aus natürlich
vorkommenden und synthetischen Montmorillonit, Bentonit, Beidellit,
Hektorit, Saponit und Stevensit mit einer langkettigen organischen
quaternären
Ammoniumverbindung gebildet wird, und der zur Herstellung eines
Mittels zum Schutz von menschlicher Haut und der Haut von Säugetieren
gegen Reizungen verwendet wird, welche durch den Kontakt mit proteolytische
Enzyme enthaltenden Fäkalien
verursacht werden.
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Nach
einem Aspekt der Erfindung umfasst das Mittel eine Mischung, die
den organophilen Ton verteilt in einem pharmazeutisch verwendbaren
dermatologischen Trägerstoff
enthält.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Mittel eine Mischung, die den organophilen
Ton verteilt in einer wasserdurchlässigen Matrix enthält.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt ist das Mittel ein Stoff, der ein verwobenes oder
nicht verwobenes Gewebe mit dem darin enthaltenen organophilen Ton
umfasst.
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Weitere
Aspekte der Erfindung werden durch die folgende Beschreibung der
Erfindung offenbart.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG UND BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
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Bei
der Verwendung der Erfindung werden die reizenden Einflüsse durch
proteolytische Enzyme aus Fäkalien
dadurch abgemildert, dass die Enzyme mit Materialien in Kontakt
gebracht werden, welche die Enzyme durch Adsorption inaktivieren
oder es so verhindern, dass diese ihre natürliche proteolytische Aktivität entfalten.
Insbesondere wurde gefunden, dass bestimmte organophile Tone Enzyme
aus Fäkalien
absorbieren können
und damit verhindern, dass diese in Kontakt mit der Haut treten,
ferner können
die Enzyme auch inaktiviert werden, so dass diese so umgewandelt
werden, dass sie ihre Fähigkeit,
Hautirritationen auszulösen,
verlieren.
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Durch
das erfindungsgemäße Verfahren
werden die Fäkalien,
welche die reizend wirkenden proteolytischen Enzyme enthalten, in
Kontakt zu einer solchen Menge behandeltem organophilem Ton gebracht,
die ausreicht, um die enzymatische Aktivität zu reduzieren, um so deren
Fähigkeit,
Hautirritationen auszulösen,
zu verringern oder zu beseitigen.
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Um
sicherzustellen, dass der organophile Ton in Kontakt mit den proteolytischen
Enzymen kommt, wird er in einen anatomischen Bereich gebracht, bei
dem der Kontakt mit Fäkalien
wahrscheinlich ist, beispielsweise durch Verwendung in Bereichen
der Haut, die normalerweise von einer Windel bedeckt sind oder durch die
Anwendung in der Windel selbst oder durch die Aufnahme im Aufbau
der Windel.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird der organophile Ton in ein pharmazeutisch geeignetes Material
zum Auftragen auf die Haut, beispielsweise der eines Kindes, und
zwar in einem Bereich, der einem Kontakt mit Fäkalien unterliegt, eingebracht.
Der den organophilen Ton enthaltende Stoff wird hinreichend häufig aufgetragen,
beispielsweise nach jedem Windelwechsel, und zwar in einer ausreichenden
Menge, um eine effektive Menge organophilen Tons auf die Haut aufzubringen,
die Enzyme aus Fäkalien
absorbieren und deaktivieren kann.
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Die
genaue Menge des behandelten organophilen Tons, die auf die Haut
aufgebracht wird, ist selbstverständlich nicht kritisch, vorausgesetzt,
dass eine solchermaßen
ausreichende Menge verwendet wird, die geeignet ist, eine wesentliche
Verringerung von Hautirritationen zu bewirken, die durch Enzyme
aus Fäkalien verursacht
wird. Typischerweise ist die auf die Haut aufgebrachte Menge organophilen
Tons wenigstens 0,25 mg/cm2.
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Der
für die
vorliegende Erfindung verwendete behandelte organophile Ton wird
typischerweise auf die Haut mittels einer dermatologisch geeigneten
Mischung aufgebracht, die eine Suspension organophilen Tons in einen
pharmakologisch geeigneten Trägerstoff
umfasst. Geeignete Trägerstoffe
sind unter anderem organische und wässrige flüssige Trägerstoffe, Lotionen, Cremen,
Emulsionen oder Gele. Der organophile Ton kann ebenso in einer fein
verteilten Form als Mischung in einem Puder, beispielsweise einer
Mischung aus Talkum oder eines fein verteilten Stärkepuders,
angewandt werden.
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Die
schützende
Mischung kann auch eine Wirkung als Barriere haben, welches es verhindert,
dass Enzyme aus Fäkalien
in direkten Kontakt mit der Haut treten. Die Trägerstoffe können Weichmacher enthalten, um
die Heilung irritierter Haut zu unterstützen, und Emulgatoren, für den Fall
dass es notwendig ist, den organophilen Ton in Suspension zu halten.
Der Trägerstoff
sollte vorzugsweise inert im Hinblick auf den organophilen Ton sein,
d. h. er sollte frei sein von Stoffen, welche ihrerseits vom organophilen
Ton aufgenommen werden, und die so die Adsorptions- und Inaktivierungseigenschaften
des organophilen Tons deaktivieren, welche die Voraussetzung für die Fähigkeit
zur Bindung von proteolytischen Enzymen aus Fäkalien ist. Im Allgemeinen haben
die Inhaltsstoffe relativ lange Kohlenwasserstoffketten, d. h. C-8
oder länger,
und sollten von der schützenden
Mischung ausgenommen werden, da solche Kohlenwasserstoffketten dazu
neigen, mit dem organophilen Ton wechselzuwirken und so die Adsorptionsfähigkeit
für proteolytische
Enzyme aus Fäkalien
zu reduzieren oder zu zerstören.
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Entsprechend
enthält
die dermatologische Mischung gemäß der vorliegenden
Erfindung organophilen Ton mit einem Anteil von 3–50 Gew.-%
in einem üblichen
dermatologischen Trägerstoff.
Bevorzugt umfasst die Mischung 3–20 Gew.-% und insbesondere
bevorzugt von etwa 5 bis etwa 10 Gew.-% organophilen Ton.
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Geeignete
Trägerstoffe
umfassen hydrophobe Trägerstoffe,
wie beispielsweise Petrolatum oder Mineralöl oder Mischungen daraus, oder
hydrophile Trägerstoffe
wie wasserbasierte Cremen einschließlich Emulsionen aus Petrolatum
und/oder Mineralöl
in Wasser sowie wasserbasierte Medien, die durch Mittel zur Viskositätseinstellung
eingedickt sind. Geeignete Stoffe zur Eindickung von wasserbasierten
Trägerstoffen
umfassen Polyoxyethylen, beispielsweise Polyethylenglykol und deren
Derivate mit einem Molekulargewicht von 3000 bis 20000; Polycarbonsäure, beispielsweise
Polyacrylsäure
und deren Salze; Derivate aus Zellulose wie etwa Hydroxyethyl Zellulose,
Hydroxypropyl Zellulose, Hydroxypropyl Methylzellulose, Methylzellulose,
Natrium-Carboxymethylzellulose und hydrophile organische Polymere
wie etwa Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrolidon und Natriumsalz der
Polyacrylsäure.
Natürliche
Gummistoffe, wie beispielsweise Xanthan Gummi, Carragenan, Traganath,
sind ebenfalls nützliche
Substanzen zum Einlegen von wasserbasierten Trägerstoffen. Das Eindickungsmittel
kann auch eine kolloidale Dispersion eines hydrophilen Tons sein,
beispielsweise natürlich vorkommende
Montmorillonit, Bentonit, Beidellit, Hektorit, Saponit und Stevensit
und synthetisch produzierte analoge Substanzen.
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Die
dermatologische Mischung mit einem organophilen Ton sollte eine
so hinreichende Viskosität
aufweisen, dass eine einfache Verteilung auf der Haut erlaubt ermöglicht wird
und gleichzeitig eine im Allgemeinen durchgehende Schicht der aktiven
Stoffe auf der zu schützenden
Haut gewährleistet
ist. Dermatologische Trägerstoffe
sind dem Fachmann bekannt und die Auswahl und Zubereitung eines
geeigneten Trägerstoffs kann
von einem Fachmann ohne umfangreiche Experimente ausgeführt werden.
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Organophiler
Ton, der als Grundmaterial für
die Barrierewirkung und/oder als absorbierendes und inaktivierendes
Material für
fäkale
Enzyme in der erfindungsgemäß schützenden
Erfindung verwendet wird, kann ein konventioneller handelsüblicher
organophiler Ton sein, der zur Verwendung als Arzneimittel geeignet ist.
Solche organophile Tone sind wohl bekannt und können von einem der Tone aus
der Smektit-Klasse hergestellt werden, die dafür bekannt sind, dass sie in
Wasser und/oder einem hydrophilen Lösungsmittel zu einer viskosen
Suspension anschwellen. Geeignete Tone umfassen natürlich vorkommende
Montmorillonite, Bentonite, Beidellite, Hektorite, Saponite und
Stevensite und ihre entsprechenden synthetischen Äquivalente.
Diese Tone haben eine lamellare Struktur, wobei Alkalimetallionen
in den Lamellen verteilt sind. Die Behandlung des Tons mit einer
langkettigen quarternären
Ammoniumverbindung führt
zu einem Austausch der Alkalimetallionen durch positiv geladene
(kationisch) organische Moleküle
und macht so den Ton organophil.
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Die
quarternären
Ammoniunverbindungen, die zur Behandlung des organophilen Tons der
Mischung zum Hautschutz verwendet werden, haben typischerweise ein
oder zwei langkettige Substituenten, beispielsweise 14–20 Kohlenstoffatome,
und zwei oder drei kurzkettige Substituenten, wie beispielsweise
eine Methylgruppe. Eine bevorzugte quarternäre Ammoniumverbindung ist dehydrogenierter
Dimethyl-Talg aus Ammoniumchlorid. Da der Talg einen hohen Anteil
von Stearinsäure
mit 18 Kohlenstoffatomen enthält,
wird der resultierende Ton oft als Quaternium-18 Ton, beispielsweise
Quaternium-18 Bentonit oder Quaterinum-18 Hektorit, bezeichnet.
Die Zusammensetzung und Herstellung eines solchen organophilen Tons
wird in der
US 4,861,584 aufgezeigt.
Ein bevorzugter organophiler Ton zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren
ist Quaternium-18 Bentonit.
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Organophiler
Ton, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, wird
bevorzugt durch Dispersion mit einem Lösungsmittel, wie etwa Propyplencarbonat,
aktiviert, welches dafür
bekannt ist, dass es die Adsorptionsfähigkeit von Ton für organische
Materialien verbessert.
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Der
behandelte organophile Ton wird in der vorliegenden Erfindung auch
zur Einbringung in Kleidungsstücke
verwendet, beispielsweise einer Windel, welche in Kontakt mit Fäkalien treten
können.
Enzyme aus Fäkalien,
die mit dem organophilen Ton auf einer Windel in Kontakt kommen,
werden inaktiviert und folglich führen sie nicht zur Irritationen
der an das Kleidungsstück
angrenzenden Haut. Der organophile Ton kann in das Gewebe aufgenommen
werden, beispielsweise das einer Windel, und zwar durch das Auftragen
desselben als Beschichtung auf den Fasern des Gewebes oder nachträglich als
Beschichtung auf dem Gewebe, nachdem das Kleidungsstück hergestellt
wurde. Das Kleidungsstück
kann auch mit organophilem Ton imprägniert werden, entweder durch
Eintauchen in einen flüssigen
Trägerstoff,
in den der organophile Ton suspendiert ist, und durch das nachfolgende
Entfernen des Trägerstoffs,
beispielsweise durch Verdunstung, oder durch das Bepudern des Kleidungsstücks mit
einem organophilem Ton selbst oder in einer Mischung mit einem puderförmigen Trägerstoff,
wie voranstehend beschrieben.
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Gemäß einem
bevorzugten Ausführungsbeispiel
wird der behandelte organophile Ton in ein stark absorbierendes
Polymer eingebracht, wobei die so hergestellte Mischung in ein Gewebe
eingebracht werden kann, aus dem ein Kleidungsstück wie beispielsweise eine
Windel etwa aus einem nicht verwobenen Stoff, hergestellt werden
kann und zwar durch konventionelle Verfahren, die zur Einbringung
von stark absorbierenden Polymeren in solche Stoffe angewandt werden.
Diese stark absorbierenden Polymere sind wohlbekannt und umfassen
unter anderem vernetzte Polymere wie Acrylsäure, Carboxymethyl Zellulose,
die mittels Epichlorhydrin vernetzt wurde, Polyaminosäure, beispielsweise
Polyasparaginsäure,
die beispielsweise mittels Lysin, Zellstoffpolymeren aus Zellulose,
beispielsweise Holzfasern und Carbonsäure Monomeren, vernetzt wurde. Die
Herstellung eines solchen stark absorbierenden Monomers ist konventionell
und wird im Allgemeinen durch die Polymerisierung des Monomers in
einer wässrigen
Lösung
oder in einer Suspension eines organischen Lösungsmittels unter Einwirkung
eines geeigneten Initiators für
eine auf freien Radikalen basierende Polymerisation bewirkt. Der
organophile Ton kann durch ein beliebiges Mittel, welches eine hinreichende
Verteilung in der Polymermatrix bewirkt, mit dem stark absorbierenden
Polymer kombiniert werden. Beispielsweise kann ein organophiler
Ton, beispielsweise Quaternium-18 Bentonit, als fein verteilte Suspension
in eine wässrige
Suspension eines stark absorbierenden Polymers verteilt werden,
die wiederum durch die Herstellung eines solchen Polymers mittels
Polymerisation aus einem konventionellen hydrophilen Monomer in
einer wässrigen
Lösung
oder einer Suspension hergestellt wird. Diese Dispersion kann mittels
konventionellen Mixens basierend auf hoher Scherrate bewirkt werden.
Ein Feststoffpulver, das den organophilen Ton dispergiert, indem
es stark absorbierendes Polymer enthält, kann dann durch ein konventionelles
Trocknungsverfahren wie Sprühtrocknen
oder Freistrahltrocknung hergestellt werden. Das stark absorbierende
Polymer, das einen organophilen Ton enthält, kann durch ein konventionelles
Verfahren in ein zur Herstellung von absorbierenden Kleidungsstücken geeignetes
Gewebe eingebracht werden. Beispielsweise kann das stark absorbierende
Polymer als Beschichtung auf ein gewebtes oder nicht gewebtes Tuch
oder dessen Fasern aufgebracht werden, es kann in die Zwischenräume des
Tuchs oder zwischen einzelne Lagen des gewebten oder ungewebten Tuchs
in Form eines Kompositgewebes aufgenommen werden. Das stark absorbierende
Polymer kann in ein Gewebe aufgenommen werden, und zwar durch Imprägnierung
des Gewebes mit einer Lösung
oder einer Suspension des Polymers in Wasser oder einem anderen
geeigneten Trägerstoff,
gefolgt von einem Trocknungsschnitt des imprägnierten Gewebes. Das stark
absorbierende Polymer umfassend einen organophilen Ton kann ferner
in eine Schaumschicht, beispielsweise eine Polyurethan-Schaumschicht, welche
auf der Tuchlage befestigt ist oder zwischen den Lagen des Tuchs
platziert wird, aufgenommen werden, um ein zur Herstellung eines
Kleidungsstücks,
wie einer Windel, geeignetes Gewebe zu erzielen. Das stark absorbierende Polymer,
welches einen organophilen Ton umfasst, kann auch in einem nicht
gewebten Stoff aufgenommen werden, und zwar durch die Auflösung des
Polymers in fein verteilter Form in einer Suspension aus Precursorfasern,
um dann nicht gewebten Stoff durch eine konventionelle Feuchtlagenbehandlung
herzustellen. Windeln, die aus einem Gewebe hergestellt sind, welches
organophilen Ton enthält,
können
dazu beitragen, Hautirritationen durch fäkale Enzyme bei Kindern, welche
diese Windeln tragen, zu verhindern.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIEL
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Das
nachfolgende Ausführungsbeispiel
illustriert die Wirksamkeit von Quaternium-18 Bentonit als absorbierenden Stoff
und als Deaktivator für
proteolytische Enzyme aus Fäkalien.
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Die
Test wurden an Lösungen
von drei verschiedenen proteolytischen Verdauungsenzymen, Chymotrypsin,
Trypsin und Elasthase, durchgeführt,
um die Wirksamkeit von Bentonit-Ton zur Adsorption und/oder Deaktivierung
dieser Enzyme zu demonstrieren, wobei der Ton durch eine Behandlung
mit Quaternium-18
organophil gemacht wurde (im Folgenden wird dieser als „Quaternium-18
Bentonit" oder als „Q-18B" bezeichnet). Die
Menge der durch Adsorption im Q-18B immobilisierten Enzym wurde
durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(HPLC) bestimmt und der neutralisierende Effekt von Q-18B wurde
durch die Messung des Verlusts an enzymatischer Aktivität mittels
Standardaktivitätstests
ermittelt und diese Verringerung in der Aktivität mit der Neutralisierung der
Enzyme durch Adsorption verglichen.
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Um
die Tests zur Bestimmung der Adsorption und der Neutralisierungseffizienz
von Q-18B durchzuführen,
wurden wässrige
Lösungen
von Chymotrypsin, Trypsin, Elasthase mittels eines Phosphatpuffers
bei einem pH-Wert 8 hergestellt, bei diesem pH haben diese Enzyme
nachgewiesenermaßen
ihre maximale proteolytische Aktivität. Die Testlösungen enthielten
0,4 mg/0,4 ml (mg/ml) Trypsin, 0,2 mg/ml Trypsin und 1,0 mg/ml Elasthase.
Diese Konzentrationen entsprechen den durchschnittlichen Konzentrationen
dieser drei hauptsächlichen
proteolytischen Enzyme aus Fäkalien
von Kindern.
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Die
enzymatische Gesamtaktivität
für jede
Lösung
wurde durch die Verwendung eines Aliquots von 1,0 ml gemessen, wobei
drei Experimente durchgeführt
wurden und der Mittelwert aus den drei gemessenen Werten ermittelt
wurde.
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Der
adsorbierende und inaktivierende Effekt von Q-18B für jede der
Enzymlösungen
wurde mittels des folgenden Verfahrens ermittelt. Die Testlösungen umfassen
10,0 ml der von jedem der Enzyme hergestellten Enzymlösungen.
Zu jeder Testprobe wurden 1,0 Gramm Q-18B hinzugefügt und die
so erhaltene Mischung wurde mittels eines Magnetrührers für 10 Minuten
bei geringer Geschwindigkeit durchmischt. Die Mischung wurde dann
mittels eines vorgewaschenen Nr. 1 Filterpapiers gefiltert und das
Filtrat gesammelt und dessen Volumen sorgsam gemessen. Eine entsprechende
Kontrollprobe wurde durch Filtration von 10 ml einer Enzymlösung durch
Filterpapier hergestellt. Das Filtrat wurde dann zu einer Dialyseröhre mit
einer Dialyseschwelle von 2000 Daltons transferiert und eine Dialyse
für 4 Stunden
bei 4°–6°C gegen deioniertes
Wasser durchgeführt.
Der Rückstand
aus dem Dialyseschritt wurde gefriergetrocknet, um so das zurückbleibende
Enzympulver zu sammeln. Das einer Gewichtsbestimmung unterzogene
zurückbehaltene
Enzym wurde in einer Phosphatpulverlösung bei einem pH-Wert 8 aufgelöst und die
enzymatische Aktivität
wie voranstehend beschrieben bestimmt. Da durch die Testprozedur
ein gewisser Verlust an Enzymen und an enzymatischer Aktivität resultiert,
wurde eine Kontrollprobe durch Auflösen eines weiteren Aliquots
aus gefriergetrockneten zurückbehaltenen
Enzymen in einer geeigneten beweglichen Phase durchgeführt und
der Enzymanteil durch Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC)
gemessen. Die Adsorption und der inaktivierende Effekt von Q-18B wurden
durch den Vergleich des Verlusts an Enzymen von enzymatischer Aktivität der behandelten
Testproben mit dem entsprechenden Verlust bei den Kontrollproben
bestimmt.
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Details
des analytischen Verfahrens und der so erzielten Resultate werden
nachfolgend beschrieben.
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Um
Proben zur Analyse einer bestimmten Menge von Protein und dessen
enzymatischer Aktivität
herzustellen, wurde das gefriergetrocknete Filtrat in 6,0 ml Wasser
aufgelöst
und in zwei Teile mit je 3,0 ml aufgeteilt. Diese Lösungen wurden
wiederum gefriergetrocknet, um einen Festkörper zu erhalten. Folglich
ergab jede experimentelle Bestimmung zwei zurückbehaltene Stoffmengen gleichen
Gewichts, die zur Bestimmung des Anteils an Proteinen und der enzymatischen
Aktivität
des nach der Behandlung mit Q-18B in der Enzymlösung verbleibenden Enzyms herangezogen
werden konnten.
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Bestimmung der Enzymmenge
in Form von Protein
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Chymotrypsin
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Eine
Standard-Chymotrypsin-Lösung
wurde durch Auflösen
von 2,30 mg Chymotrypsin in 2,30 ml Wasser hergestellt, um eine
Enzymlösung
mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml zu erhalten. Eine Menge mit 50
Mikrolitern (μl)
dieser Lösung
wurde in einen Hochleistungsflüssigchromatographen
eingeführt,
wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren
unter Verwendung einer beweglichen Phase mit einer ursprünglichen
Zusammensetzung von 2,3 M Ammoniumsulfat in einem Phosphatpuffer mit
einem pH-Wert von 8 und einer Endzusammensetzung bestehend aus einem
reinen Phosphatpuffer Anwendung fand, wobei als Gradientenzeit 10
Minuten angesetzt wurden. Die Laufzeit wurde mit 6,1–6,2 Minuten bestimmt.
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Die
gefriergetrockneten zurückbehaltenen
Stoffe der Kontroll- und der Testproben wurden in 2,0 ml Wasser
aufgelöst
und jede der Lösungen
wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert
und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem oberen Protokoll unterzogen.
Die aufgefundenen Resultate werden in der nachfolgenden Tabelle
1 zusammengestellt.
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Trypsin
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Eine
Standard-Trypsinlösung
wurde durch das Auflösen
von 2,50 mg Trypsin in 2,50 ml Wasser hergestellt, wobei sich eine
Lösung
mit einer Enzymkonzentration von 1,0 mg/ml ergab. Eine Menge mit
50 Mikrolitern (μl)
dieser Lösung
wurde in einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen
eingeführt,
wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren
Verwendung fand, wobei die bewegliche Phase mit einer ursprünglichen
Zusammensetzung von 2 M Ammoniumsulfat in einem Tris HCl Puffer
mit einem pH-Wert von 7,5 verwendet wurde und als Endzusammensetzung
der reine Puffer ohne das Ammoniumsulfat resultierte, und wobei
eine Gradientenzeit von 10 Minuten angesetzt wurde. Die Laufzeit
wurde mit 6,61 Minuten für
Beta-Trypsin und 7,72 Minuten für
alpha-Trypsin bestimmt.
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Die
gefriergetrockneten zurückbehaltenen
Anteile der Kontroll- und der Testproben wurden jeweils in 2,0 ml
Wasser aufgelöst
und jede der Lösungen
wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert
und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem voranstehend beschriebenen
Protokoll unterzogen. Diese aufgefundenen Resultate sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt, wobei die Gesamtkonzentration
von Trypsin (alpha- und beta-Trypsin)
angegeben ist.
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Elasthase
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Eine
Standard-Elasthaselösung
wurde durch das Auflösen
von 1,90 mg Elasthase in 0,95 ml Wasser hergestellt, wobei sich
eine Lösung
mit einer Enzymkonzentration von 2,0 mg/ml ergab. Eine Menge mit
50 Mikrolitern (μl)
dieser Lösung
wurde in einen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen
eingeführt,
wobei eine Progel TSK Butyl-NPR Säule mit einem Gradienten Auswaschungsverfahren
Verwendung fand, und wobei die bewegliche Phase mit einer ursprünglichen
Zusammensetzung von 2 M Ammoniumsulfat in einem Tris HCl Puffer
mit einem pH-Wert von 7,5 verwendet wurde und als Endzusammensetzung
der reine Puffer ohne das Ammoniumsulfat resultierte und, wobei
eine Gradientenzeit von 10 Minuten verwendet wird. Die Laufzeit wurde
mit 7,75 Minuten für
alpha-Trypsin bestimmt.
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Die
gefriergetrockneten zurückbehaltenen
Anteile der Kontroll- und der Testproben wurden jeweils in 2,0 ml
Wasser aufgelöst
und jede der Lösungen
wurde mittels eines Balls aus vorgewaschener Baumwolle filtriert
und einer Behandlung mit dem HPLC gemäß dem voranstehend beschriebenen
Protokoll unterzogen. Diese aufgefundenen Resultate sind in der
nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.
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Tabelle
1
Verlust an Enzymproteinen einer Lösung, die einer Behandlung
mit Q-18 unterzogen wurde
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Bestimmung der enzymatischen
Aktivität
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Chymotrypsin
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Eine
Standard-Chymotrypsin-Lösung
wurde durch Auflösung
von 0,40 mg Chymotrypsin in 5,0 ml Phosphatpuffer hergestellt. Die
enzymatische Konzentration wurde durch das folgende Verfahren analysiert:
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Folgende
Reagenzien wurden hergestellt:
Reagenz
A: | 80
mM Tris HCl-Puffer, pH 7,8 bei 25°C; |
Reagenz
B: | 1,18
mM Natriumbenzoyl Tyrosin Ethylester-Lösung, hergestellt durch das
Auflösen
der Reagenzien in 31,7 ml Methanol und Verdünnung bis zu einem Volumen
von 50 ml mit deioniziertem Wasser; |
Reagenz
C: | 1
mM Wasserstoffchloridsäure
Lösung; |
Reagenz
D: | Phosphatpuffer
(die Chymotrypsinlösung
wurde mit einer Konzentration von 2–5 Einheiten/ml in Reagenz D
verwendet.) |
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Eine
Reaktionslösung
wurde durch die Mischung von 1,42 ml Reagenz A, 1,40 ml Reagenz
B und 0,08 ml Reagenz C hergestellt. Die Lösung wurde durch Rotation vermischt
und die optische Adsorption bei einer Wellenlänge von 256 nm (A256nm)
solange beobachtet, bis diese konstant war. Daraufhin wurde 0,1
ml Enzymlösung
in Reagenz D zur Reaktionslösung
hinzugefügt,
die Lösung
wurde durch Rotation gemischt und die A256nm Adsorption
wurde für
ungefähr
5 Minuten beobachtet. Die maximale Abnahmerate der optischen Adsorption
(ΔA256nm/min) wurde als Messgröße der Enzymkonzentration
angenommen. Ein Vergleichsdurchgang wurde durch die Verwendung von
ausschließlich
Reagenz D ohne Enzym durchgeführt
und der Vergleichswert für ΔA256nm/min wurde für jede der Enzymlösungen subtrahiert,
um so zu einem Wert zu kommen, welcher proportional zur Konzentration
des Enzyms ist.
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Die
Testproben wurden durch Auflösung
des gefriergetrockneten Rückstands
des aufgeteilten Dialyserückbehalts
analysiert, wobei dieser einen Maximalwert von 2,0 mg Chymotrypsin
in 5,0 ml Reagenz D enthielt, daraufhin wurde die tatsächliche
Konzentration von Chymotrypsin gemäß der voranstehend beschriebenen
Vorgehensweise bestimmt, wobei eine Menge von 0,1 ml der Lösung verwendet
wurde. Die Resultate des Tests sind in der nachfolgenden Tabelle
2 dargestellt.
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Trypsin
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Eine
Standard-Trypsin-Lösung
wurde durch die Auflösung
von 0,40 mg Trypsin in 10,0 ml Phosphatpufferlösung (kalt) hergestellt. Die
Enzymkonzentration wurde durch die folgende Vorgehensweise bestimmt:
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Folgende
Reagenzien wurden hergestellt:
Reagenz
E: | 67
mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,6 bei 25°C; |
Reagenz
F: | 0,25
mM Natriumbenzoyl L-Arginin Ethylester-Lösung; |
Reagenz
G: | Trypsin-Enzym-Lösung mit
350–700
Einheiten/ml des Reagenz E. |
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Eine
Reaktionslösung
wurde durch die Stabilisierung von 3,00 ml des Reagenz E bei 25°C hergestellt, wobei
die optische Adsorption bei einer Wellenlänge von 253 nm (A253nm)
solange beobachtet wurde, bis diese konstant blieb. Daraufhin wurde
eine Menge von 0,2 ml des Reagenz G zur Reaktionslösung hinzugefügt, die Reaktionslösung wurde
durch Rotation gemischt und der A253nm-Wert
wurde für
ungefähr
5 Minuten beobachtet. Die maximale Abnahmerate der optischen Adsorption
(ΔA253nm/min) wurde als Messgröße für die Enzymkonzentration
angenommen. Ein Vergleichsdurchgang wurde mit dem Reagenz G ohne
Enzym durchgeführt, wobei
der ΔA253nm/min-Wert der Testprobe für jede der
Enzymlösungen
subtrahiert wurde, um so zu einem Wert zu gelangen, welcher proportional
zur Konzentration des Enzyms ist.
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Die
Testproben wurden durch die Auflösung
des gefriergetrockneten Rückstands
des aufgeteilten Dialyserückbehalts
analysiert, welche einen Maximalanteil von 1,0 mg Chymotrypsin in
einer Menge von 10,0 ml des Reagenz E enthielten, wobei die tatsächliche
Konzentration von Chymotrypsin durch die voranstehend beschriebene
Vorgehensweise mittels Verwendung von 0,2 ml der Testlösung bestimmt
wurde. Die Resultate des Tests sind in der nachfolgenden Tabelle
2 dargestellt.
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Elasthase
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Ein
kaliometrisches Endpunktverfahren wurde zur Bestimmung der in den
Testproben, d. h. des gefriergetrockneten Stoffs aus dem aufgeteilten
Dialyserückbehalt,
befindlichen Elasthasemenge herangezogen.
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Folgende
Reagenzien wurden hergestellt:
Reagenz
H: | 200
mM Tris Puffer, pH 8,8 bei 37°C; |
Reagenz
I: | Elasthase-Orcein-Substrat; |
Reagenz
J: | Elasthase-Enzym-Lösung mit
25–100
Einheiten/ml im Reagenz H. |
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Eine
Serie von Elasthase-Substrat-Lösungen
wurde durch das Auflösen
abgewogener Menge von Reagenz I in Reagenz H hergestellt. Eine Menge
der Standard- oder der Vergleichslösung wurde dann mit den Substratlösungen wie
folgt vermischt:
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Die
Standardlösung
mit Elasthase wurde durch die Auflösung von 12,06 mg Elasthase
in 2,0 ml Puffer hergestellt, was eine Lösung mit 1,03 mg Elasthase
pro Milliliter ergab. Eine Menge von 0,01 ml der Standard-Elasthase-Lösung wurde
zu der Substratlösung
hinzugefügt,
die Lösung
wurde durch Verquirlen vermischt und für 12–16 Stunden bei 37°C einer Wärmebehandlung
unterzogen. Es wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von
590 Nanometern (A590) des Standards gemessen
und eine Standardkurve hergestellt.
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Die
Testproben wurden durch die Auflösung
des gefriergetrockneten Rückstands
des aufgeteilten Dialyserückbehalts
analysiert, wobei diese einen Maximalwert von 5,0 mg (600 Einheiten)
Elasthase in 2,0 ml des Pulvers enthielten, dann wurden 0,01 ml
der Testlösungen
mit der Substratmischung für
20 Minuten bei 37°C
einer Wärmebehandlung
unterzogen. Der A590-Wert wurde für die Testproben
bestimmt und die Standardlösung
wurde gemäß der voranstehend
beschriebenen Vorgehensweise hergestellt, dann wurde die enthaltene
Enzymmenge berechnet. Die Ergebnisse der Untersuchung sind in der
nachfolgenden Tabelle 2 dargestellt.
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Tabelle
2
Verlust an Enzymprotein durch Behandlung einer Lösung mit
Q-18
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Die
in dem Ausführungsbeispiel
dargestellten Daten zeigen, dass ein wesentlicher Anteil der proteolytische
Enzyme aus Enzymen, welche für
Hautirritationen beim Windelausschlag und dergleichen verantwortlich
sind, durch den Kontakt mit organophilen Tonen wie Quaternium-18
Bentonit inaktiviert werden.