DE69723383T2 - Gene coding for plant indole acetaldehyde oxidase and its use - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Aldehydoxidase-Gen, das von einer Pflanze stammt, und seine Verwendung.The present invention relates to an aldehyde oxidase gene derived from a plant and its use.

Es war bekannt, dass ein natürliches Pflanzenwachstumshormon Auxin, auch IAA oder Indolessigsäure, aus Tryptophan über Indolacetaldehyd hergestellt wird, gefolgt von der Wirkung einer Oxidase in höheren Pflanzen. Das Hormon ist durch seine physiologische Wirkung stark involviert in verschiedene morphogenetische und umweltbedingte Anpassungen einer Pflanze und hat deutliche Effekte auf die Reifung durch Wachstumsbeschleunigung bei der generellen Erntezüchtung, auf die Verbesserung des Ertrags und der Qualität durch Beschleunigung der Wurzelbildung in der Pflanzenaufzuchtsherstellung, die Steigerung des Ertrags durch Wachstumsbeschleunigung von Früchten in der Frucht- und Gemüsezüchtung, auf die Steigerung des Wertzuwachses durch Beschleunigung der Blühperiode und auf Verlängerung der Lebensdauer durch Verhinderung der Entblätterung oder Alterung bei der Zierpflanzenzüchtung. Aus diesem Grund hat es eine starke Nachfrage nach einer Methode zur künstlichen Kontrolle des Enzyms für die Industrie und besonders für die landwirtschaftliche Herstellung gegeben.It was known to be a natural Plant growth hormone auxin, also IAA or indole acetic acid Tryptophan about Indole acetaldehyde is produced, followed by the action of a Oxidase in higher plants. The hormone is heavily involved due to its physiological effects in various morphogenetic and environmental adaptations a plant and has significant effects on the maturation by accelerating growth in general crop breeding, on improving yield and quality by speeding up Root formation in plant breeding production, the increase the yield by accelerating the growth of fruits in fruit and vegetable growing, the increase in value by accelerating the flowering period and on extension the lifespan by preventing defoliation or aging at the Ornamental Plant Breeding. Because of this, there is a strong demand for a method for artificial Control of the enzyme for the industry and especially for given agricultural production.

Unter diesen Umständen haben die hier genannten Erfinder erfolgreich die gesamte Aminosäuresequenz und das Gen des Enzyms bestimmt und die vorliegende Endung vervollständigt.Under these circumstances, those mentioned here Inventor successfully the entire amino acid sequence and the gene of Enzyme determined and completed the present extension.

Folglich stellt die vorliegende Endung bereit:

• 1) Ein Aldehydoxidase-Gen, das ein 4,4 kbp-Gen ist, das aus einer Pflanze erhältlich ist, und das eine Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das eine Aldehydverbindung zu einer Carboxylsäure oxidieren kann, wobei das Gen die nachstehend spezifizierte Nucleotidsequenz hat oder eine Nucleotidsequenz, die eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mit einem oder mehreren hinzugefügten, deletierten, oder ersetzten Nucleotid(en), wobei die Nucleotidsequenz darin Nucleotide aufweist, die mittels des RACE-Verfahrens mit einem der in Beispiel 8 beschriebenen Primer-Sätze amplifizierbar ist (nachstehend bezeichnet als das Gen der vorliegenden Erfindung);
• 2) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, wobei die Aldehydverbindung ein Indolacetaldehyd ist und die Carboxylsäwe eine Indolessigsäwe ist;
• 3) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1 oder 2, das von einer Maispflanze Zea mays L. stammt;
• 4) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, das eine Nucleotidsequenz ist, die eine in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert;
• 5) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 4, das eine in SEQ ID NO: 2 (CDS-Loci: 46...4120) gezeigte Nucleotidsequenz hat;
• 6) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, das eine Nucleotidsequenz ist, die eine in SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäwesequenz codiert;
• 7) Das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 6, das eine in SEQ ID NO: 4 (CDS-Loci: 91...4138) gezeigte Nucleotidsequenz hat;
• 8) Ein Plasmid, welches das Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 umfasst;
• 9) Ein Transfonnant, der durch das Einbringen des Plasmids gemäß Punkt 8 in die Wirtszelle transformiert ist;
• 10) Der Transformant gemäß Punkt 9, wobei die Wirtszelle ein Mikroorganismus ist;
• 11) Der Transformant gemäß Punkt 9, wobei die Wirtszelle eine Pflanze ist;
• 12) Ein Verfahren zum Konstruieren eines Expressionsplasmids, welches das Ligieren umfasst von:
• (1) einem Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann;
• (2) einem Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7; und
• (3) einem Terminator, der in einer Pflanze funktionieren kann, in funktioneller Weise und in der vorstehend beschriebenen Reihenfolge;
• 13) Das Expressionsplasmid, umfassend:
• (1) einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann;
• (2) ein Aldehydoxidase-Gen gemäß Punkt 1, 2, 3, 4, 5, 6 oder 7; und
• (3) eines Terminators, der in einer Pflanze funktionieren kann, die in funktioneller Weise und in der vorstehend beschriebenen Reihenfolge ligiert werden.

Hence, the present extension provides:

• 1) An aldehyde oxidase gene which is a 4.4 kbp gene obtainable from a plant and which encodes an amino acid sequence of an enzyme which can oxidize an aldehyde compound to a carboxylic acid, the gene having the nucleotide sequence specified below or a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 with one or more nucleotide (s) added, deleted, or replaced, the nucleotide sequence therein having nucleotides incorporated by the RACE method one of the primer sets described in Example 8 is amplifiable (hereinafter referred to as the gene of the present invention);
• 2) The aldehyde oxidase gene according to item 1, wherein the aldehyde compound is an indole acetaldehyde and the carboxylic acid is an indole acetic acid;
• 3) The aldehyde oxidase gene according to item 1 or 2, which comes from a maize plant Zea mays L.;
• 4) The aldehyde oxidase gene according to item 1, which is a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1;
• 5) The aldehyde oxidase gene according to item 4, which has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 (CDS loci: 46 ... 4120);
• 6) The aldehyde oxidase gene according to item 1, which is a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3;
• 7) The aldehyde oxidase gene according to item 6, which has a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 (CDS loci: 91 ... 4138);
• 8) A plasmid which comprises the aldehyde oxidase gene according to items 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7;
• 9) A transformant which has been transformed into the host cell by introducing the plasmid according to item 8;
• 10) The transformant according to item 9, wherein the host cell is a microorganism;
• 11) The transformant according to item 9, wherein the host cell is a plant;
• 12) A method of constructing an expression plasmid which comprises ligating:
• (1) a promoter that can function in a plant cell;
• (2) an aldehyde oxidase gene according to item 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7; and
• (3) a terminator that can function in a plant in a functional manner and in the order described above;
• 13) The expression plasmid comprising:
• (1) a promoter that can function in a plant cell;
• (2) an aldehyde oxidase gene according to item 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7; and
• (3) a terminator that can function in a plant that is ligated in a functional manner and in the order described above.

Das Expressionsplasmid von Punkt 13 kann in einem Verfahren zur Kontrolle der Herstellung von Aldehydoxidase in einem Transformanten verwendet werden, welches das Einbringen des Expressionsplasmids in eine Wirtszelle umfasst.The expression plasmid from Punkt 13 can be used in a process to control the production of aldehyde oxidase be used in a transformant which is introducing of the expression plasmid in a host cell.

In diesem Verfahren stammt das Aldehydoxidase-Gen vorzugsweise von einer Pflanze und die Wirtszelle ist eine Pflanze; und in diesem Verfahren ist das Expressionsplasmid vorzugsweise das Expressionsplasmid gemäß Punkt 13.The aldehyde oxidase gene is derived from this process preferably from a plant and the host cell is a plant; and in this method the expression plasmid is preferred the expression plasmid according to point 13th

Die vorliegende Erfindung wird ausführlicher beschrieben.The present invention becomes more detailed described.

Das Gen der vorliegenden Erfindung, das aus einer Pflanze erhältlich ist, umfasst ungefähr 4,4 kbp Nucleotide und ist ein Aldehydoxidase-Gen, das eine Aminosäuresequenz eines Enzyms kodiert, das eine Aldehydverbindung oxidieren kann, um Carboxylsäure zu erzeugen. Zum Beispiel kann es Indolacetaldehyd oxidieren, um Indolessigsäure zu erzeugen.The gene of the present invention, available from a plant, is approximately 4.4 kbp Nucleotides and is an aldehyde oxidase gene that encodes an amino acid sequence of an enzyme that can oxidize an aldehyde compound to produce carboxylic acid. For example, it can oxidize indole acetaldehyde to produce indole acetic acid.

Das Gen der vorliegenden Erfindung kann aus einer Pflanze erhalten werden, z. B. Mais oder dergleichen. Das Gen der vorliegenden Erfindung und das Enzym als sein Translationsprodukt haben eine Wirkung des Oxidierens von Acetaldehydverbindung zu Carboxylsäure in einer Zelle. Zusätzlich zu Indolaldehyd kann das Enzym auch auf Substrate wie z. B. Benzaldehyd, Butyraldehyd, Protocatechualdehyd oder dergleichen wirken. Selbstverständlich kann ein einzelnes Enzym auf mehrere Verbindungen als Substrat wirken.The gene of the present invention can be obtained from a plant, e.g. B. corn or the like. The gene of the present invention and the enzyme as its translation product have an effect of oxidizing acetaldehyde compound to carboxylic acid in one Cell. additionally to indolaldehyde, the enzyme can also on substrates such. B. benzaldehyde, Butyraldehyde, protocatechualdehyde or the like act. Of course you can a single enzyme act on several compounds as a substrate.

Das Gen der vorliegenden Erfindung schließt z. B. speziell ein Gen ein, das eine Nucleotidsequenz ist, die eine in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, und ein Gen, das eine Nucleotidsequenz ist, die eine in SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, sowie ein Äquivalent von ihnen. Die folgende Verwendung des Ausdrucks „ein Äquivalent von ihnen" bezeichnet ein Aldehydoxidase-Gen, das eine Nucleotidsequenz eines Aldehydoxidase-Gens hat, das eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mit einem oder mehreren zugefügten, deletierten oder ersetzten Nucleotid(en), und bezieht sich auf eine DNA, die ein Analogon ist, das die gleiche Funktion hat. Insbesondere schließt dies ein Gen mit einer in SEQ ID NO: 2 (CDS-Loci: 46...4120) gezeigten Nucleotidsequenz oder mit einer in SEQ ID NO: 4 (CDS-Loci: 91...4138) gezeigten Nucleotidsequenz ein.The gene of the present invention includes z. B. specifically a gene that is a nucleotide sequence that a amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 encoded, and a gene that is a nucleotide sequence that contains one in SEQ ID NO: 3 amino acid sequence shown encoded, as well as an equivalent from them. The following use of the expression "an equivalent designated by them " an aldehyde oxidase gene that is a nucleotide sequence of an aldehyde oxidase gene which has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 encoded, with one or more added, deleted or replaced Nucleotide (s), and refers to a DNA that is an analog, that has the same function. In particular, this excludes a gene with one shown in SEQ ID NO: 2 (CDS loci: 46 ... 4120) Nucleotide sequence or with one in SEQ ID NO: 4 (CDS loci: 91 ... 4138) shown nucleotide sequence.

Das Gen der vorliegenden Erfindung kann durch das folgende Verfahren erhalten werden.The gene of the present invention can be obtained by the following procedure.

Zum Beispiel werden Samen von Golden-Cross-Bantam-70, einer Maissorte, (erworben bei Sakata-no-tane) einer Behandlung ausgesetzt, die durch das Eintauchen über Nacht in laufendes Leitungswasser zur Beschleunigung der Keimung führt, anschließend werden sie auf ein mit Wasser angefeuchtetes Papiertuch ausgesät und für 2 Tage unter Rotlicht (0,8 W/m²) und unter Bedingungen von 25°C und anschließend für 1 Tag in der Dunkelheit platziert, um Keimung zu ermöglichen. Die Spitzen der jungen Blattscheiden, die 1,0 bis 1,5 cm aus den erhaltenen Keimlingen gewachsen sind, werden unter grünem Sicherheitslicht herausgeschnitten, sofort in flüssigen Stickstoff tiefgefroren und bei –30°C als Proben zur Reinigung von Enzymen und als Proben zur Extraktion von RNA aufgehoben.For example, seeds from Golden-Cross-Bantam-70, a maize variety (purchased from Sakata-no-tane), are subjected to a treatment that results in accelerated germination by immersing them in tap water overnight, after which they are treated with a Watered paper towel is sown and placed for 2 days under red light (0.8 W / m ² ) and under conditions of 25 ° C and then for 1 day in the dark to allow germination. The tips of the young leaf sheaths, which have grown 1.0 to 1.5 cm from the seedlings obtained, are cut out under green safety light, immediately frozen in liquid nitrogen and at -30 ° C as samples for cleaning enzymes and as samples for extraction canceled by RNA.

Zur Reinigung von Aldehydoxidase aus den in dieser Weise hergestellten, tiefgefrorenen Proben ist es angebracht, eine in T. Koshiba et al. (Plant Physiology 110 (1996), 781–789) beschriebene Methode zu verwenden.For the purification of aldehyde oxidase it is from the frozen samples made in this way attached, one in T. Koshiba et al. (Plant Physiology 110 (1996), 781-789) to use the described method.

Um einen Verlust der Aktivität des Enzyms und einer Zersetzung des Proteins während der Verfahren zur Extraktion und Reinigung zu verhindern, werden vorzugsweise alle Behandlungen während der Reinigungsstufen bei einer niedrigen Temperatur von 2–4°C durchgefiihrt, was eine gewöhnliche Vorgehensweise in solchen Verfahren ist. Zunächst werden 150–200 g der tiefgefrorenen Probe als Ausgangsmaterial für eine Reinigungscharge verwendet. Das Material wird mechanisch mittels eines Homogenisators oder dergleichen unter Zusatz von 400 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4) zerkleinert und für 30 Minuten mit 12.000 g zentrifugiert. Der Überstand wird als eine Standardprobe des Rohenzyms abgetrennt. Von der Standardprobe des Rohenzyms wird eine Fraktion mit 30-50% gesättigten Ammoniumsulfat erhalten, gegen 20 mM Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 8,0) dialysiert und für 20 Minuten mit 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand nach Zentrifugation wird über einer Ionenaustausch-Säule (z. B. DEAE TOYOPEARL 650 M, hergestellt von Tosoh) geleitet und eine Fraktion mit Aldehydoxidase-Aktivität wird gewonnen. Die Fraktion mit der spezifischen Aktivität wird einer Chromatographie mit einer hydrophoben Säule, einer Hydroxyapatit-Säule und einer Ionenaustausch-Säule (z. B. DEAE-5PM) in dieser Reihenfolge unterworfen und gereinigt bis die Fraktion mit der Aldehydoxidase-Aktivität als eine nahezu einzelne Proteinbande durch Silberfärbung nach Elektrophorese nachgewiesen wird.To lose the activity of the enzyme and degradation of the protein during the extraction procedures and to prevent cleaning, all treatments are preferred while the cleaning stages are carried out at a low temperature of 2–4 ° C, what an ordinary How to proceed in such procedures. First, 150-200 g of frozen sample used as starting material for a cleaning batch. The material is under mechanically by means of a homogenizer or the like Add 400 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) and for Centrifuged at 12,000 g for 30 minutes. The supernatant is used as a standard sample separated from the crude enzyme. From the standard sample of the crude enzyme a fraction with 30-50% saturated Obtained ammonium sulfate against 20 mM Tris-HCL buffer (pH 8.0) dialyzed and for Centrifuged at 20,000 g for 20 minutes. The supernatant after centrifugation is about an ion exchange column (e.g. DEAE TOYOPEARL 650 M, manufactured by Tosoh) a fraction with aldehyde oxidase activity is obtained. The faction with the specific activity chromatography with a hydrophobic column, a hydroxyapatite column and an ion exchange column (e.g. DEAE-5PM) subjected to this order and cleaned until the fraction with the aldehyde oxidase activity as a nearly single Protein band by silver staining after electrophoresis is detected.

Gemäß des vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahrens ist normalerweise eine etwa 2.000 fache Reinigung im Vergleich zur Proteinmenge in der Standardprobe des Rohenzyms möglich. Es kann bestätigt werden, dass das schließlich gereinigte Protein eine Größe von etwa 300 kD als Molekulargewicht im Verfahren der Gelfiltrationssäule hat. Es kann außerdem als Bande mit einer Größe von ungefähr 150 kD als Molekulargewicht bei der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) nachgewiesen werden, was andeutet, dass das Enzym ein Dimer formt.According to the above Cleaning process is usually about 2,000 times cleaning compared to the amount of protein in the standard sample of the crude enzyme possible. It can be confirmed that that's finally purified protein about a size 300 kD as a molecular weight in the process of the gel filtration column. It can also as a band with a size of approximately 150 kD as molecular weight in SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), which indicates that the enzyme is a Dimer shapes.

In dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Fraktionierung durch Säulenchromatographie kann die effektive Sammlung der Fraktion mit Aldehydoxidase-Aktivität durch Bestimmung der Aldehydoxidase-Aktivität in den jeweiligen Fraktionen erreicht werden. Zu diesem Zweck kann z. B. eine Methode, in der Indolacetaldehyd als Substrat zu der gereinigten Fraktion zugegeben wird und die Menge an hergestelltem Indolessigsäwe durch HPLC bestimmt wird, verwendet werden. Genauer werden 100 μl der Reaktionslösung hergestellt, die aus 5–50 μl der gereinigten Fraktion, 0,1 mM Indolacetaldehyd und 0,1 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) besteht. Die Lösung wird bei 30°C für 30 Minuten inkubiert, um die Reaktion zu bewirken, und direkt im Anschluss werden 8 μl 1 N HCl, 5 μl 2,0 M Natriumhydrogensulfid und 50 μl Methanol zur Lösung zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Die Reaktionslösung wird mit 15.000 g für 5 Minuten zentrifugiert und 100 μl des so erhaltenen Überstandes werden als analytische Probe für die HPLC entnommen. Durch Nachweis der Absorption bei 280 nM kann Indolacetaldehyd als das Substrat und Indolessigsäwe als das Reaktionsprodukt quantitativ analysiert werden. Es ist effektiv, die HPLC mit z. B. ODS C18-Säulen durchzuführen, und mit einem 20–50% linearen Gradienten von Methanol, das 0,1% Essigsäwe enthält, zu eluieren.In the method for fractionation by column chromatography described above, the effective collection of the fraction with aldehyde oxidase activity can be achieved by determining the aldehyde oxidase activity in the respective fractions. For this purpose, e.g. For example, a method in which indole acetaldehyde is added as a substrate to the purified fraction and the amount of indole acetic acid produced is determined by HPLC. More precisely, 100 μl of the reaction solution are prepared, which consists of 5-50 μl of the purified fraction, 0.1 mM indole acetaldehyde and 0.1 mM phosphate buffer (pH 7.4). The solution is incubated at 30 ° C for 30 minutes to effect the reaction, and immediately afterwards 8 ul 1N HCl, 5 ul 2.0 M sodium hydrogen sulfide and 50 ul methanol are added to the solution to stop the reaction. The reaction solution is centrifuged at 15,000 g for 5 minutes and 100 μl of the supernatant thus obtained are removed as an analytical sample for HPLC. By proving the Absorbance at 280 nM can quantitatively analyze indole acetaldehyde as the substrate and indole acetic acid as the reaction product. It is effective to use HPLC with e.g. B. ODS C18 columns, and elute with a 20-50% linear gradient of methanol containing 0.1% acetic acid.

Das auf diese Weise erhaltene Protein ist teilweise gespalten und das gespaltene Peptid wird analysiert, um eine Teilinformation der Aminosäwesequenz zu erhalten. Üblicherweise wird die gereinigte Aldehydoxidase-Probe durch SDS-PAGE aufgetrennt und eine Proteinbande von 150 kDa wird durch Excision gewonnen. Die gewonnenen Gelfragmente werden z. B. mit Achromobacter-Protease-I (APn in Gegenwart von 0,1% SDS behandelt und die gespaltenen Peptidfragmente werden extrahiert. Diese wird z. B. auf eine Reversed-Phase-HPLC geladen, begleitet von einer Vorsäule eines Anionenaustauschers (DEAE), um die Peptide zu trennen und sie zurückzugewinnen. Die Aminosäwesequenz wird durch einen Protein-Sequenzierer bestimmt und Teile der Proben werden einer Molekulargewichtsbestimmung durch MALDI-TOF unterworfen, um die Genauigkeit der erhaltenen Informationen zur Aminosäuresequenz zu überprüfen.The protein obtained in this way is partially cleaved and the cleaved peptide is analyzed to obtain partial information of the amino acid sequence. Usually the purified aldehyde oxidase sample is separated by SDS-PAGE and a 150 kDa protein band is obtained by excision. The gel fragments obtained are z. B. with Achromobacter Protease-I (APn treated in the presence of 0.1% SDS and the cleaved peptide fragments are extracted. This is z. B. loaded on a reversed phase HPLC accompanied from a guard column an anion exchanger (DEAE) to separate the peptides and to win them back. The amino acid sequence is determined by a protein sequencer and parts of the samples are subjected to a molecular weight determination by MALDI-TOF, the accuracy of the amino acid sequence information obtained to check.

Anschließend wird eine Oligo-DNA synthetisiert, von der auf Grund der erhaltenen Informationen zur Aminosäuresequenz erwartet wird, dass sie die Aminosäuresequenz kodiert. Zusätzlich wird eine RT-PCR durchgeführt, wobei Gesamt-RNA als Matrize verwendet wird, um ein cDNA-Teilfragment zu amplifizieren, welches dann in ein Plasmidvektor kloniert wird.Then an oligo DNA is synthesized, based on the information obtained on the amino acid sequence it is expected to encode the amino acid sequence. In addition, performed an RT-PCR, where total RNA is used as a template to construct a partial cDNA fragment to amplify, which is then cloned into a plasmid vector.

Zur Extraktion der Gesamt-RNA werden z. B. 7 g der tiefgefrorenen Probe in flüssigen Stickstoff mit einem Mörser und einem Stößel zerstoßen, um feines Puder zu erzeugen. Nach dem Verdampfen des flüssigen Stickstoffs wird die RNA auf herkömmliche Weise extrahiert, z. B. unter Verwendung des Guanidinthiocyanat/Caesiumchlorid-Verfahrens, und die Gesamt-RNA wird von dem Extrakt durch Ethanol-Prezipitation gewonnen. Durch dieses Verfahren wird üblicherweise 1 mg Gesamt-RNA erhalten.To extract the total RNA z. B. 7 g of the frozen sample in liquid nitrogen with a mortar and pound a pestle to to produce fine powder. After evaporating the liquid nitrogen the RNA will be conventional Way extracted, e.g. B. using the guanidine thiocyanate / cesium chloride method, and the total RNA is obtained from the extract by ethanol precipitation. By this procedure is common Obtain 1 mg of total RNA.

Zur Amplifikation der cDNA wird eine Reaktion zur Reversen Transkription durchgeführt, wobei, neben synthetischen Oligo-DNAs, ein in Antisense-Orientierung synthetisierter Primer verwendet wird, der an das Transkriptionsprodukt einer Ziel-RNA gebunden wird, die in der Gesamt-RNA enthalten ist. Die Reaktion zur Reversen Transkription kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Reverse-Transkription-PCR-Kits, z. B. des RNA-PCR Kits (hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Instruments) durchgeführt werden. Anschließend kann das erhaltene Produkt der Reversen Transkription erneut einer PCR unterworfen werden, in der eine Oligo-DNA, die in Sense-Orientierung synthetisiert ist, zugefügt wird, um ein cDNA-Fragment zu amplifizieren.A is used to amplify the cDNA Reverse transcription reaction performed, with, in addition to synthetic Oligo DNAs, a primer synthesized in an antisense orientation is used, which is linked to the transcription product of a target RNA is bound, which is contained in the total RNA. The reaction for reverse transcription can be done using a commercial available Reverse transcription-PCR kit, z. B. the RNA-PCR kit (manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instruments) carried out become. Subsequently the product of reverse transcription obtained can again be one PCR are subjected to an oligo DNA that is in sense orientation is synthesized, added to amplify a cDNA fragment.

Das erhaltene cDNA-Amplifikationsfragment wird gereinigt und in einen Plasmidvektor kloniert. Als Plasmidvektor kann z. B. pCRII (hergestellt von Invitrogen) verwendet werden und das cDNA-Amplifikationsfagment kann durch Transformation von E. coli gemäß herkömmlicher Verfahren und durch Absuchen nach Transformanten, die eine Insertion haben, kloniert werden. Die Nucleotidsequenz des Klons wird unter Verwendung von z. B. des ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (hergestellt von Applied Biosystems) für den erhaltenen cDNA-Klon bestimmt.The cDNA amplification fragment obtained is purified and cloned into a plasmid vector. As a plasmid vector can e.g. B. pCRII (manufactured by Invitrogen) can be used and the cDNA amplification fragment can be transformed by transforming E. coli according to conventional Method and by searching for transformants that have an insertion have to be cloned. The clone's nucleotide sequence is shown below Use of e.g. B. the ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction kits (manufactured by Applied Biosystems) for the obtained one cDNA clone determined.

Sense- und Antisense-Primer für Teile der Nucleotidsequenz des auf diese Weise erhaltenen cDNA-Teilfragments können synthetisiert werden und dem RACE-Vefahren unterworfen werden, um cDNA-Fragmente zu erhalten, die entweder Enden in 5'-Orientierung oder 3'-Orientierung enthalten. Eine cDNA mit vollständiger Länge kann durch ihre Ligierung und Klonierung in einen Plasmidvektor erhalten werden. Für das RACE- Verfahren kann z. B. ein kommerziell erhältlicher Marathon cDNA Amplification Kit (hergestellt von Clontech) verwendet werden.Parts sense and antisense primers the nucleotide sequence of the partial cDNA fragment thus obtained can be synthesized and subjected to the RACE process in order to Obtain cDNA fragments containing either ends in 5 'orientation or 3' orientation. A cDNA with complete Length can obtained by their ligation and cloning into a plasmid vector become. For the RACE procedure can e.g. B. a commercially available Marathon cDNA Amplification Kit (manufactured by Clontech) used become.

Das Gen der vorliegenden Erfindung kann in folgender Weise verwendet werden.The gene of the present invention can be used in the following ways.

Zum Beispiel wird eine Wirtszelle, wie z. B. ein Mikroorganismus, eine Pflanze oder dergleichen durch das Einbringen des Gens der vorliegenden Erfindung transformiert, um einen Transformanten zu bilden.For example, a host cell, such as B. a microorganism, a plant or the like by the Introduction of the gene of the present invention transformed to to form a transformant.

Um das Gen der vorliegenden Erfindung in eine Pflanzenzelle einzubringen und zu exprimieren, wird ein Expressionsplasmid umfassend (1) einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle furilctionieren kann; (2) ein Gen der vorliegenden Erfindung (ein vorstehend in Punkt 1 bis 7 beschriebenes Aldehydoxidase-Gen); und (3) einen Termnator, der in einer Pflanze funktionieren kann, die in einer Pflanzenzelle in einer funktionellen Weise und in der vorstehend beschriebenen Reihenfolge ligiert werden, in eine Pflanzenzelle eingebracht, um die Zelle zu transformieren.To the gene of the present invention introducing and expressing in a plant cell becomes a Expression plasmid comprising (1) a promoter found in a plant cell furilctionation; (2) a gene of the present invention (a aldehyde oxidase gene described above in points 1 to 7); and (3) a termnator that can work in a plant that in a plant cell in a functional manner and in the above described sequence are ligated into a plant cell introduced to transform the cell.

Der hier verwendete Ausdruck „in einer funktionellen Weise" bedeutet, dass, wenn das konstruierte Plasmid in eine Pflanzenzelle eingebracht wird, um sie zu transformieren, das Gen der vorliegenden Erfindung unter der Kontrolle eines Promotors integriert wird, so dass das Gen normal transkribiert/translatiert wird und eine Funktion der Expression eines Proteins in der Pflanzenzelle hat.The expression “in one functional way "means that when the constructed plasmid is introduced into a plant cell to transform the gene of the present invention under control of a promoter is integrated so that the gene is normal is transcribed / translated and a function of expression of a protein in the plant cell.

Der Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann, beinhaltet z. B. T-DNA abgeleitete, konstitutive Typen von Promotoren, wie z. B. Nopalinsynthase-Gen (NOS)-Promotor, Octopinsynthase-Gen (OCS)-Promotor und dergleichen, Pflanzenviren abgeleitete Promotoren, wie z. B. Blumenkohlmosaikvirus (cauliflower mosaic virus, CaMV) abgeleitete 18S- and 35S-Promotoren und dergleichen und induzierbare Typen von Promotoren wie z. B. Phenylalanin-Ammonialyase-Gen (PAL)-Promotor, Chalconsynthase-Gen (CHS)-Promotor, Pathogen-verwandter Gen (pathogen-related, PR)-Promotor und dergleichen. Weiterhin beinhaltet es andere bekannte Pflanzenpromotoren.The promoter that can function in a plant cell includes e.g. B. T-DNA derived, constitutive types of promoters, such as. B. nopaline synthase gene (NOS) promoter, octopine synthase gene (OCS) promoter and the like, plant virus-derived promoters, such as. B. cauliflower mosaic virus (CaMV) derived 18S and 35S promoters and the like and inducible types of promoters such as e.g. B. Phenylalanine ammonialyase gene (PAL) promoter, chalcone synthase gene (CHS) promoter, pathogen-related gene (pathogen-related, PR) promoter and the like. Continue to be it contains other known plant promoters.

Der Terminator, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann, beinhaltet z. B. 7-DNA abgeleitete, konstitutive Typen von Terminatoren, wie z. B. Nopalinsynthase-Gen (NOS)-Terminator und dergleichen, Pflanzenviren abgeleitete Terminatoren, wie z. B. Knoblauchvirus (arlic virus) GV1-, GV2-Terminatoren und dergleichen. Weiterhin beinhaltet es andere bekannte Pflanzenterminatoren.The terminator in a plant cell can work includes e.g. B. 7-DNA derived, constitutive Types of terminators, such as B. nopaline synthase gene (NOS) terminator and the like, Plant viruses derived terminators, such as. B. Garlic virus (arlic virus) GV1, GV2 terminators and the like. Farther it includes other known plant terminators.

Zur Transformation einer Pflanzenzelle durch Einbringung eines solchen Plasmids in eine Pflanzenzelle wird das vorstehend beschriebene Expressionsplasmid in eine Pflanzenzelle durch ein beliebiges herkömmliches Vorgehen, wie z. B. die Agrobacterium-Infektionsmethode (JP-B-2-58917 und JP-A-60-70080), Elektroporationsmethode in Protoplasten (JP-A-60-251887 und JP-A-5-68575), Particle-Gun-Methode (JP-A-508316 und JP-A-63-258525) und dergleichen eingebracht und eine transformierte Pflanzenzelle kann durch Selektion einer Pflanzenzelle, in der das Gen der vorliegenden Erfindung eingebracht ist, erhalten werden. Die transformierte Pflanze wird durch Regeneration einer Pflanze gemäß konventioneller Pflanzenzellkulturverfahren, wie z. B. beschrieben in Uchimiya, „Manual for Plant Gene Manipulation" (Methode zur Herstellung transgener Pflanzen), veröffentlicht in Kodansha Scientific (ISBN 4-06-153515-7 C3045 (1990), 27–55).To transform a plant cell by introducing such a plasmid into a plant cell the expression plasmid described above into a plant cell by any conventional Procedure, such as B. the Agrobacterium infection method (JP-B-2-58917 and JP-A-60-70080), electroporation method in protoplasts (JP-A-60-251887 and JP-A-5-68575), particle gun method (JP-A-508316 and JP-A-63-258525) and the like are introduced and a transformed plant cell can be selected by selecting a plant cell in which the gene of the present Invention is introduced can be obtained. The transformed plant is achieved by regeneration of a plant according to conventional plant cell culture methods, such as B. described in Uchimiya, "Manual for Plant Gene Manipulation" transgenic plants) in Kodansha Scientific (ISBN 4-06-153515-7 C3045 (1990), 27-55).

Weiterhin kann das Expressionsplasmid der vorliegenden Erfindung in einem Verfahren zur kontrollierter Herstellung einer Aldehydoxidase in einem Transformanten verwendet werden, welches das Einbringen des Expressionsplasmids in eine Wirtszelle umfasst.Furthermore, the expression plasmid of the present invention in a method for controlled Production of an aldehyde oxidase used in a transformant the introduction of the expression plasmid into a host cell includes.

Der Promotor, der in einer Wirtszelle funktionieren kann, schließt z. B. den lacZ-Gen-Promotor des Lactose-Operons in E. coli, den Alkohol-Dehydrogenase-Gen (ADH)-Promotor in Hefe, den späten Adenovirus Hauptpromotor (adenovirus major late, Ad. ML), den frühen Promotor von SV40, Baculovirus-Promotor und dergleichen ein. Wenn der Wirt eine Pflanze ist, können Promotoren, die wie vorstehend beschrieben in einer Pflanze funktionieren können, auch miteingeschlossen werden.The promoter that is in a host cell can work, closes z. B. the lacZ gene promoter of the lactose operon in E. coli, the alcohol dehydrogenase gene (ADH) promoter in yeast, the late Adenovirus major promoter (adenovirus major late, Ad. ML), the early promoter of SV40, baculovirus promoter and the like. If the host is a plant, can Promoters that function in a plant as described above can, also be included.

Der Termiator, der in einer Wirtszelle funktionieren kann, schließt z. B. die HIS-Terminator-Sequenz in Hefe, den ADH1-Terminator, die frühe Spleißregion von SV40 und dergleichen ein. Wenn der Wirt eine Pflanze ist, können Terminatoren, die wie vorstehend beschrieben in Pflanzen funktionieren können, auch miteingeschlossen werden.The termiator that is in a host cell can work, closes z. B. the HIS terminator sequence in yeast, the ADH1 terminator, the early splice region of SV40 and the like on. If the host is a plant, terminators that like described above can work in plants, too be included.

Das Aldehydoxidase-Gen schließt z. B. von Pflanzen stammende Aldehydoxidase-Gene und vorzugsweise das Gen der vorliegenden Erfindung (ein Aldehydoxidase-Gen vorstehend beschrieben in Punkt 1 bis 7) ein.The aldehyde oxidase gene includes e.g. B. plant-derived aldehyde oxidase genes and preferably the gene of the present Invention (an aldehyde oxidase gene described in point above 1 to 7).

Die Transformation einer Wirtszelle durch das Einbringen eines solchen Plasmids in die Wirtszelle kann durch eine Methode, die allgemein im Bereich der genetischen Technologie verwendet wird, bewirkt werden.The transformation of a host cell by introducing such a plasmid into the host cell through a method that is common in the field of genetic technology is used to be effected.

Falls die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist, kann es z. B. durch eine Methode, die allgemein im Bereich der pflanzengenetischen Technologie und im Bereich der Pflanzengewebekultur verwendet wird, wie vorstehend bschrieben, bewirkt werden.If the host cell is a plant cell is it can e.g. B. by a method generally in the field of plant genetic technology and in the field of plant tissue culture is used as described above.

Die Transformation einer Pflanze durch das Einbringen des Gens der vorliegenden Erfindung kann die Verstärkung einer allgemein bekannten physiologischen Wirkung eines Auxins bewirken oder die Unterdrückung dergleichen. Zum Beispiel kann durch Verstärkung der Wirkung des Auxins durch ein Sense-Gen das Längenwachstum und die Differenzierung zu Gefäßbündel der Wirtszellen beschleunigt werden, welches in der Wachstumsbeschleunigung einer Pflanze resultiert und in der verstärkten Kapazität bei der Lagerung von Assimilationsprodukten. Als Ergebnis kann eine frühe Reifung der Pflanzen, eine Vergrößerung der Ernte wie z. B. Früchten und eine Verbesserung des Ertrags und der Qualität erwartet und realisiert werden. Andererseits kann durch Unterdrückung der Wirkung des Auxins durch ein Antisense-Gen ein dürres Pflanzenwachstum verhindert werden und eine Pflanze kann gezüchtet werden, die unter ungeeigneten Umweltbedingungen wachsen kann. Weiterhin wird durch adäquate Kontrolle des Wachstums die Verkleinerung von Pflanzen möglich und die Anwendung, z. B. zur Verhinderung der Haftung der Reispflanzen und die Verkürzung von Schnittblumen. Als Ergebnis kann eine Verbesserung des Ertrags und der Qualität erwartet werden.The transformation of a plant by introducing the gene of the present invention, the enhancement of a cause well-known physiological effects of an auxin or the oppression like. For example, by enhancing the effects of auxins length growth through a sense gene and differentiation to vascular bundles of Host cells are accelerated, which in the acceleration of growth results in a plant and in the increased capacity in the Storage of assimilation products. As a result, early ripening of the plants, an enlargement of the Harvest such as B. fruits and an improvement in yield and quality can be expected and realized. On the other hand, through oppression the action of the auxin by an antisense gene prevents dry plant growth and a plant can be grown that can grow under unsuitable environmental conditions. Farther is through adequate Control of growth the reduction of plants possible and the application, e.g. B. to prevent the adhesion of rice plants and the shortening of cut flowers. As a result, earnings can improve and the quality to be expected.

Der Zusatz eines Hormons in das Medium ist allgemein essentiell für die keimfreie Kultur von Zellen oder Gewebe oder einer Pflanze. Wenn die Auxin-Wirkung in einer Pflanze verstärkt wird durch das Einbringen und die Expression des Gens der vorliegenden Erfimdung und die dadurch steigende Herstellung von Aldehydoxidase in einem Transformanten, wird von der Pflanze angenommen, dass sie sich in einem Zustand befindet, in dem die Kapazität zum Zellwachstum, Differenzierung und individueller Regeneration in der sterilen Kultur verstärkt ist. Daher ist es möglich einen so genannten einfach zu kultivierenden Stamm zu erschaffen und dieses ist nützlich in der Herstellung der Pflanzenaufzucht von Virus freien Pflanzen, welches für die auf Gewebekultur basierende Massenvermehrung angewendet wird und für Gartenpflanzen wie z. B. Blumen- und Zierpflanzen.The addition of a hormone in the medium is generally essential for the aseptic culture of cells or tissue or a plant. When the auxin effect in a plant is enhanced by the introduction and the expression of the gene of the present invention and thereby increasing production of aldehyde oxidase in a transformant, The plant is believed to be in a state in which the capacity for cell growth, differentiation and individual regeneration intensified in sterile culture is. Therefore it is possible to create a so-called easy-to-cultivate strain and this is useful in the production of plant cultivation of virus-free plants, which for mass propagation based on tissue culture is applied and for Garden plants such as B. flowers and ornamental plants.

BeispieleExamples

Die vorliegende Erfindung wird nun mit Hilfe von Beispielen detaillierter beschrieben. Es ist jedoch zu beachten, dass der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.The present invention will now be described in more detail by way of examples. However, it is too note that the scope of the present invention is not limited to these examples.

Beispiel 1 (Herstellung von jungen Maisblattscheiden)Example 1 (Preparation of young corn sheaths)

Samen von Golden-Cross-Bantam-70, einer Maissorte, (erworben bei Sakata-no-tane) wurden einer Behandlung ausgesetzt, die durch das Eintauchen über Nacht in laufendes Leitungswasser zur Beschleunigung der Keimung führt, anschließend wurden sie auf ein mit Wasser angefeuchtetes Papiertuch ausgesät und für 2 Tage unter Rotlicht (0,8 W/m²) und unter Bedingungen von 25°C und anschließend für 1 Tag in der Dunkelheit platziert, um Keimung zu ermöglichen. Die Spitzen (1,0–1,5 cm) der jungen Blattscheiden, die 2–3 cm von den erhaltenen Keimlingen gewachsen sind, wurden unter grünem Sicherheitslicht herausgeschnitten, sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bei –30°C gelagert.Golden-Cross-Bantam-70 seeds, a maize variety (purchased from Sakata-no-tane), were subjected to treatment that resulted in accelerated germination by immersing them in running tap water overnight, followed by water-dampening Seeded paper towel and placed for 2 days under red light (0.8 W / m ² ) and under conditions of 25 ° C and then for 1 day in the dark to allow germination. The tips (1.0-1.5 cm) of the young leaf sheaths, which grew 2-3 cm from the seedlings obtained, were cut out under green safety light, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -30 ° C.

Beispiel 2 (Herstellung von Aldehydoxidase)Example 2 (Preparation of aldehyde oxidase)

Alle Verfahren der nachfolgenden Reinigungsschritte wurden bei niedriger Temperatur von 2–4°C durchgeführt.All of the procedures below Cleaning steps were carried out at a low temperature of 2-4 ° C.

Zunächst wurden ungefähr 200 g der in Beispiel 1 hergestellten, tiefgefrorenen Probe als Ausgangsmaterial für eine Reinigungscharge verwendet. Das Material wurde mechanisch mittels eines Homogenisators unter Zusatz von 400 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (pH-Wert 7,4) zerkleinert und für 30 Minuten mit 12.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde als eine Standardprobe des Rohenzyms abgetrennt. Anschließend wurde von der Standardprobe des Rohenzyms eine Fraktion mit 30–50%igem gesättigtem Ammoniumsulfat erhalten, gegen 20 mM Tris-HCL-Puffer (pH-Wert 8,0) dialysiert und für 20 Minuten mit 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand nach Zentrifugation wurde über einer Ionenaustausch-Säule (z. B. DEAE TOYOPEARL 650 M, hergestellt von Tosoh) geleitet und eine Fraktion mit Aldehydoxidase-Aktivität wurde gewonnen auf Grundlage von Aktivitätsmessungen, die wie nachfolgend in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt wurden. Die Fraktion mit Aktivität wurde einer Chromatographie mit einer hydrophoben Säule, einer Hydroxyapatit-Säule und einer Ionenaustausch-Säule (z. B. DEAE-5PM) in dieser Reihenfolge unterworfen und gereinigt bis die Fraktion mit der Aldehydoxidase-Aktivität als eine nahezu einzelne Proteinbande durch Silberfärbung nach Elektrophorese nachgewiesen wurde.Initially, about 200 g the frozen sample prepared in Example 1 as the starting material for one Cleaning batch used. The material was mechanically a homogenizer with the addition of 400 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.4) crushed and for Centrifuged at 12,000 g for 30 minutes. The supernatant was taken as a standard sample separated from the crude enzyme. Subsequently, the standard sample of the crude enzyme a fraction with 30-50% saturated Obtained ammonium sulfate against 20 mM Tris-HCL buffer (pH 8.0) dialyzed and for Centrifuged at 20,000 g for 20 minutes. The supernatant after centrifugation was about an ion exchange column (e.g. DEAE TOYOPEARL 650 M, manufactured by Tosoh) a fraction with aldehyde oxidase activity was obtained based on of activity measurements, which were carried out as described in Example 3 below. The fraction with activity was subjected to chromatography with a hydrophobic column, one Hydroxyapatite column and an ion exchange column (e.g. DEAE-5PM) subjected to this order and cleaned until the fraction with the aldehyde oxidase activity as a nearly single Protein band by silver staining after electrophoresis.

Bei dem vorstehend beschriebenen Reinigungsverfahren wurden ungefähr 0.09 mg Protein von 1,873 mg Protein in der Standardprobe des Rohenzyms zurückgewonnen und das Verhältnis von Enzymaktivität der Aldehydoxidase zu dem Original war 1.950 fach. Es wurde bestätigt, dass das schließlich gereinigte Protein eine Größe von etwa 300 kD als Molekulargewicht im Verfahren der Gelfiltrationssäule hatte. Es konnte außerdem als Bande mit einer Größe von 150 kD als Molekulargewicht bei der SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese (SDS-PAGE) nachgewiesen werden, was andeutet, dass das Enzym ein Dimer formte.In the above Cleaning procedures were approximate 0.09 mg protein of 1.873 mg protein in the standard sample of the crude enzyme recovered and the relationship of enzyme activity the aldehyde oxidase to the original was 1,950 fold. It has been confirmed that that finally purified protein about a size Had 300 kD as the molecular weight in the process of the gel filtration column. It could also as a gang with a size of 150 kD as molecular weight in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) are detected, which indicates that the enzyme formed a dimer.

Beispiel 3 (Methode zur Messung der Aldehydoxidase-Aktivität)Example 3 (method for Measurement of aldehyde oxidase activity)

Die Messung der Aldehydoxidase-Aktivität in den entsprechenden gereinigten Fraktionen beschrieben in Beispiel 2 wurde mittels einer Methode durchgeführt, bei der Indolacetaldehyd zu der gereinigten Fraktion als Substrat zugegeben wurde und die Menge an hergestellter Indolessigsäure (IAA) mittels HPLC bestimmt wurde. Die Reaktion wurde mit 100 μl der Reaktionslösung durchgeführt, die aus 5–50 μl der gereinigten Fraktion, 0,1 mM Indolacetaldehyd und 0,1 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,4) bestand. Die Lösung wurde bei 30°C für 30 Minuten inkubiert und direkt im Anschluss wurden 8 μl 1 N HCl, 5 μl 2,0 M Natriurnhydrogensulfid und 50 μl Methanol zur Lösung zugegeben, um die Reaktion abzubrechen. Die Reaktionslösung wurde mit 15.000 g für 5 Minuten zentrifugiert und 100 μl des so erhaltenen Überstandes wurden als analytische Probe für die HPLC entnommen. Durch Nachweis der Absorption bei 280 nM konnten Indolacetaldehyd und Indolessigsäure quantitativ analysiert werden. Die HPLC wurde mit ODS C18-Säulen durchgeführt und mit einem 20–50% linearen Gradienten von Methanol, das 0,1% Essigsäure enthielt, eluiert.Measurement of aldehyde oxidase activity in the corresponding purified fractions described in Example 2 was carried out using a method in which indole acetaldehyde was added to the purified fraction as a substrate and the Amount of indole acetic acid (IAA) produced was determined by HPLC. The reaction was with 100 ul the reaction solution carried out, that from 5–50 μl of the purified Fraction, 0.1 mM indole acetaldehyde and 0.1 mM phosphate buffer (pH 7.4) existed. The solution was at 30 ° C for 30 minutes incubated and immediately afterwards 8 ul 1N HCl, 5 ul 2.0 M sodium hydrogen sulfide and 50 ul Methanol to the solution added to stop the reaction. The reaction solution was with 15,000 g for Centrifuged for 5 minutes and 100 μl of the supernatant thus obtained were used as an analytical sample for the HPLC taken. By demonstrating the absorption at 280 nM Quantitative indole acetaldehyde and indole acetic acid to be analyzed. The HPLC was carried out with ODS C18 columns and with a 20–50% linear gradient of methanol containing 0.1% acetic acid eluted.

Beispiel 4 (Peptidspaltung der Aldehydoxidase: Partielle Aminosäuresequenz)Example 4 (peptide cleavage of aldehyde oxidase: partial amino acid sequence)

Das in Beispiel 2 erhaltene, gereinigte Protein wurde durch SDS-PAGE aufgetrennt und eine Proteinbande von 150 kD wurde durch Excision gewonnen. Die gewonnenen Gelfragmente wurden mit Achromobacter-Protease-I (API) in Gegenwart von 0,1% SDS behandelt und die gespaltenen Peptidfragmente wurden extrahiert. Diese wurden auf eine Reversed-Phase-HPLC geladen, begleitet von einer Vorsäule eines Anionenaustauschers (DEAE), um die Peptide zu trennen, die dann gewonnen wurden. Die Aminosäuresequenz wurde durch einen Protein-Sequenzierer (ABI 477A) bestimmt.The purified one obtained in Example 2 Protein was separated by SDS-PAGE and a protein band from 150 kD was obtained by excision. The gel fragments obtained were treated with Achromobacter Protease-I (API) in the presence of 0.1% Treated SDS and the digested peptide fragments were extracted. These were loaded on a reversed phase HPLC accompanied by a guard column an anion exchanger (DEAE) to separate the peptides that then won. The amino acid sequence was determined by a protein sequencer (ABI 477A).

Als Ergebnis wurden die nachstehenden 4 Sequenzen als die partielle Aminosäuresequenz ermittelt.As a result, the following were 4 sequences determined as the partial amino acid sequence.

Die erste war eine Sequenz, wie nachstehend gezeigt, die 18 Aminosäurereste enthielt:

und es wurde bestätigt, dass die Sequenz den Resten mit der Nr. 235 bis 252 in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht.The first was a sequence as shown below that contained 18 amino acid residues:

and it was confirmed that the sequence corresponds to residues No. 235 to 252 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

Die zweite war eine Sequenz, wie nachstehend gezeigt, die 16 Aminosäurereste enthielt:

und es wurde bestätigt, dass die Sequenz den Resten 1.234 bis 1.249 in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht oder den Resten 1.226 bis 1.241 in der in SEQ ID NO: 3 gezeigten Aminosäuresequenz.The second was a sequence as shown below that contained 16 amino acid residues:

and it was confirmed that the sequence corresponds to residues 1.234 to 1.249 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or residues 1.226 to 1.241 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.

Die dritte war eine Sequenz, wie nachstehend gezeigt, die 20 Aminosäurereste enthielt:

und es wurde bestätigt, dass die Sequenz den Resten mit den Nummern 253 bis 272 in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäwesequenz entspricht.The third was a sequence as shown below that contained 20 amino acid residues:

and it was confirmed that the sequence corresponds to the residues with the numbers 253 to 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

Die vierte war eine Sequenz, wie nachstehend gezeigt, die 21 Aminosäurereste enthielt:

und es wurde bestätigt, dass die Sequenz den Resten mit den Nummern 591 bis 611 in der in SEQ ID NO: 1 gezeigten Aminosäuresequenz entspricht.The fourth was a sequence as shown below that contained 21 amino acid residues:

and it was confirmed that the sequence corresponds to the residues with the numbers 591 to 611 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

Teile dieser gespaltenen Peptidproben wurden einer Molekulargewichtsbestimmung durch MALDI-TOF unterworfen, um die Genauigkeit der erhaltenen Aminosäuresequenz zu überprüfen.Parts of these cleaved peptide samples were subjected to a molecular weight determination by MALDI-TOF, to check the accuracy of the amino acid sequence obtained.

Beispiel 5 (Herstellung von Gesamt-RNA aus jungen Maisblattscheiden und Synthese von cDNA)Example 5 (Preparation of total RNA from young corn leaf sheaths and synthesis of cDNA)

Gleichermaßen wie in Beispiel 1 wurden Maissamen zum Keimen gebracht und 7 g der Spitzen von jungen Maisscheiden wurden von den Keimlingen gewonnen. Diese wurden in 10 ml flüssigen Stickstoff tiefgefroren und mit einem Mörser und einem Stößel zerstoßen. um feines Puder zu erzeugen. Nach dem Verdampfen des flüssigen Stickstoffs wurde die RNA auf herkömmliche Weise (Guanidinthiocyanat/Caesiumchlorid-Methode) extrahiert und 1 mg der Gesamt-RNA wurde vom Extrakt durch Ethanol-Prezipitation gewonnen.Same as in Example 1 Germinated corn seeds and 7 g of the tips of young corn sheaths were obtained from the seedlings. These were in 10 ml of liquid nitrogen frozen and with a mortar and crush a pestle. around to produce fine powder. After evaporating the liquid nitrogen the RNA was conventional Way (guanidine thiocyanate / cesium chloride method) extracted and 1 mg of total RNA was extracted from the extract by ethanol precipitation won.

Beispiel 6(Herstellung eines Oligo-DNA-Primers und RT-PCR)Example 6 (Preparation of an oligo DNA primer and RT-PCR)

Ein Gemisch von 0ligo-DNAs , von denen erwartet wird, dass sie die in Beispiel 4 bestimmte, partielle Aminosäuresequenz kodieren, wurde sowohl in Sense- als auch in Antisense-Orientierung synthetisiert.A mixture of 0ligo DNAs, from which are expected to have the partial amino acid sequence determined in Example 4 encode, was in both sense and antisense orientation synthesized.

Im Speziellen wurde ein 23-mer in Antisense-Orientierung als eine Nucleotidsequenz, die von den 8 Aminosäureresten: Val Ile His Asp Gly Thr Trp Thr in der partiellen, in Beispiel 4 beschriebenen Aminosäuresequenz 2 synthetisiert:In particular, a 23-mer in Antisense orientation as a nucleotide sequence consisting of the 8 amino acid residues: Val Ile His Asp Gly Thr Trp Thr in the partial, in Example 4 described amino acid sequence 2 synthesized:

Des weiteren wurde ein 23-mer in Sense-Orientierung als eine Nucleotidsequenz, die von den 8 Aminosäureresten: Gly Glu Ala Val Tyr Val Asp Asp in der partiellen, in Beispiel 4 beschriebenen Aminosäuresequenz 4 synthetisiert:Furthermore, a 23-mer in Sense orientation as a nucleotide sequence consisting of the 8 amino acid residues: Gly Glu Ala Val Tyr Val Asp Asp in the partial, in Example 4 described amino acid sequence 4 synthesized:

Eine Reaktion zur Reversen Transkription wurde durchgeführt unter Verwendung neben anderen eine, die als Primer in Antisense-Orientierung synthetisiert wurde, und eines kommerziell erhältlichen Reverse-Transkription-PCR-Kits (RNA-PCR Kit, hergestellt von Perkin-Elmer Cetus Instruments). Anschließend wurde das erhaltene Produkt der Reversen Transkription erneut einer PCR unterworfen, in der eine Oligo-DNA, die in Sense-Orientierung synthetisiert wurde, zugefügt wurde. Als Ergebnis wurde die Amplifikation des cDNA-Fragments bestätigt.A reverse transcription reaction was carried out using, among others, one that acts as a primer in antisense orientation was synthesized, and a commercially available reverse transcription PCR kit (RNA-PCR kit manufactured by Perkin-Elmer Cetus Instruments). Then was the reverse transcription product obtained again by PCR in which an oligo DNA synthesized in the sense orientation was added. As a result, the amplification of the cDNA fragment was confirmed.

Beispiel 7 (Klonierung des PCR amplifizierten Fragments in einen Vektor und die Analyse der Struktur)Example 7 (Cloning the PCR amplified fragment into a vector and analysis the structure)

Das in Beispiel 6 erhaltene, amplifizierte DNA-Fragment wurde gereinigt und in ein Plasmidvektor pCRII (hergestellt von Invitrogen) kloniert. Weiterhin wurde die Nucleotidsequenz der Insertion im Plasmidvektor durch den 373A DNA-Sequenzierer (hergestellt von Applied Biosystem) unter Verwendung des ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt und die Struktur des cDNA-Fragments wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde es ersichtlich, dass das klonierte cDNA-Fragment 2 Typen enthält, die unterschiedliche Strukturen haben, eine, die den Nucleotiden mit den Nr. 1.839 bis 3.785 in der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entspricht, und die andere, die den Nucleotiden mit den Nr. 1.858 bis 3.806 in der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nucleotidsequenz entspricht.The amplified obtained in Example 6 DNA fragment was purified and made into a plasmid vector pCRII ( from Invitrogen). Furthermore, the nucleotide sequence of the Insertion in the plasmid vector by the 373A DNA sequencer (made from Applied Biosystem) using the ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits (manufactured by Applied Biosystems) was determined and the structure of the cDNA fragment was determined. As As a result, it became apparent that the cloned cDNA fragment Contains 2 types, that have different structures, one that has the nucleotides No. 1,839 to 3,785 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the other corresponding to nucleotides number 1,858 to 3,806 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.

Beispiel 8 (Isolation eines cDNA-Klons mit vollständiger Länge)Example 8 (Isolation of a cDNA clone with complete Length)

Basierend auf die in Beispiel 7 erhaltenen Informationen zur Nucleotidsequenz wurden die Nucleotidsequenzen spezifisch jeweils für die 2 cDNAs gesucht und Oligo-DNA wurden für die Teilstücke in Sense- und Antisense-Orientierung synthetisiert.Based on those obtained in Example 7 Information on the nucleotide sequence became the nucleotide sequences specific for each the 2 cDNAs were searched and oligo-DNA were scanned for the sections and antisense orientation.

Im Speziellen wurden als Sense-Oligo-DNAs, die der in SEQ ID NO: 2 gezeigten Nucleotidsequenz entsprechen, zwei Typen:
ein 28-mer: 5'-GCTGGTCAAAATATTGGTGTCGTGATTG-3' (allgemein),
ein 28-mer: 5'-GATTGCTGAAACACAPAGATATGCTAAT-3',
und als Antisense-Oligo-DNAs vier Typen:
ein 27-mer: 5'-TGGCTGCAGATTTTCTGTGCTATACTC-3' (allgemein),
ein 27-mer: 5'-TGCTTTGCAGCCATATTAGCATATCTT-3',
ein 24-mer: 5'-ACAGCCTTTTGGAAGCCACCTGGA-3', und
ein 24-mer: 5'-ATCGGACTTGTTGTCGGCCTTGAC-3' synthetisiert.Specifically, two types were used as sense oligo DNAs corresponding to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2:
a 28-mer: 5'-GCTGGTCAAAATATTGGTGTCGTGATTG-3 '(general),
a 28-mer: 5'-GATTGCTGAAACACAPAGATATGCTAAT-3 ',
and as antisense oligo DNAs four types:
a 27-mer: 5'-TGGCTGCAGATTTTCTGTGCTATACTC-3 '(general),
a 27-mer: 5'-TGCTTTGCAGCCATATTAGCATATCTT-3 ',
a 24-mer: 5'-ACAGCCTTTTGGAAGCCACCTGGA-3 ', and
a 24-mer: 5'-ATCGGACTTGTTGTCGGCCTTGAC-3 'synthesized.

Des weiteren wurden als Sense-Oligo-DNAs, die der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nucleotidsequenz entsprechen, zwei Typen:
ein 28-mer: 5'-GCTGGTCAAAATATTGGTGTCGTGATTG-3'(allgemein) und
ein 28-mer: 5'-GATTGCTCAAACACAGAAGTATGCCTAC-3'
und als Antisense-Oligo-DNAs drei Typen:
ein 27-mer: 5'-TGGCTGCAGATTTTCTGTGCTATACTC-3'(allgemein),
ein 25-mer: 5'-CTTTGCCGCCATGTAGGCATACTTC-3', und
ein 24-mer: 5'-TTCCACCTATGGTTGCAGTGTTCC-3'synthetisiert.Furthermore, two types were used as sense oligo DNAs corresponding to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4:
a 28-mer: 5'-GCTGGTCAAAATATTGGTGTCGTGATTG-3 '(general) and
a 28-mer: 5'-GATTGCTCAAACACAGAAGTATGCCTAC-3 '
and as antisense oligo DNAs three types:
a 27-mer: 5'-TGGCTGCAGATTTTCTGTGCTATACTC-3 '(general),
a 25-mer: 5'-CTTTGCCGCCATGTAGGCATACTTC-3 ', and
a 24-mer: 5'-TTCCACCTATGGTTGCAGTGTTCC-3's synthesized.

Unter Verwendung dieser als Primer wurde ein RACE-Verfahren mit dem kommerziell erhältlichen Marathon cDNA Amplifikationskit (hergestellt von Clontech) durchgeführt, um cDNA-Fragmente zu erhalten, die jeweils Enden in 5'-Orientierung und 3'-Orientierung haben. Des weiteren wurde eine cDNA mit vollständiger Länge durch ihre Ligierung und Klonierung in einen Plasmidvektor pCRII (hergestellt von Invitrogen) erhalten.Using this as a primer was a RACE procedure with the commercially available Marathon cDNA amplification kit (manufactured by Clontech) to obtain cDNA fragments, the ends in 5 'orientation and have 3 'orientation. Furthermore, a full-length cDNA was generated by its ligation and Cloning in a plasmid vector pCRII (manufactured by Invitrogen) receive.

Beispiel 9 (Analyse der Nucleotidsequenz und Bestimmung der Aminosäuresequenz der cDNA-Klone)Example 9 (Analysis of Nucleotide sequence and determination of the amino acid sequence of the cDNA clones)

Für zwei der in Beispiel 8 erhaltenen cDNA-Klone wurde die Analyse der Nucleotidsequenz mit dem 373A DNA Sequenzierer (hergestellt von Applied Biosystem) unter Verwendung des ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits, des Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (hergestellt von Applied Biosystems) durchgeführt. Als Ergebnis wurde es ersichtlich, dass die Gene der vorliegenden Erfindung cDNAs waren, die 4.412 bp oder beziehungsweise 4.359 bp (siehe SEQ ID NOS: 2 und 4) haben.For Two of the cDNA clones obtained in Example 8 were analyzed for Nucleotide sequence with the 373A DNA sequencer (manufactured by Applied Biosystem) using the ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits, the Dye Terminator Cycle Sequencing Kits (manufactured by Applied Biosystems) performed. As As a result, it became apparent that the genes of the present invention cDNAs were 4,412 bp or 4,359 bp (see SEQ ID NOS: 2 and 4).

Des weiteren wurde, basierend auf die Nucleotidsequenz, die gesamte Aminosäuresequenz, die durch die Gene der vorliegenden Erfindung codiert werden, mit der GENETYX Gene Analysis Software (hergestellt vonSDC, Software Development Co.) bestimmt. Es wurde ersichtlich, dass sie Proteine mit 1.358 oder beziehungsweise 1.349 Aminosäurereste waren (siehe SEQ ID NOS: 1 und 3).Furthermore, based on the nucleotide sequence, the entire amino acid sequence that is generated by the genes of the present invention are encoded with the GENETYX genes Analysis Software (manufactured by SDC, Software Development Co.) certainly. It was seen that they were 1,358 or or 1,349 amino acid residues were (see SEQ ID NOS: 1 and 3).

Beispiel 10 (Konstruktion des Aldehydoxidase-Expressionsplasmids zur direkten Einbringung)Example 10 (Construction of the aldehyde oxidase expression plasmid for direct introduction)

Um die Expression des vom Mais stammenden Gens der vorliegenden Erfindung durch die Einbringung in eine Pflanzenzelle zu erlauben, wurde z. B. der nachfolgende Expressionsvektor zur direkten Einführung in Pflanzen konstruiert.To express the expression of maize Gene of the present invention by introduction into a plant cell to allow z. B. the following expression vector for direct introduction constructed in plants.

Ein von pUC 19 abgeleiteter GUS-Expressionsvektor pBI221 (hergestellt von Clontech) wurde durch die Restriktionsenzyme SmaI und SacI (beide hergestellt von Takara Shuzo) gespalten und ein 2,8 kbp-Fragment wurde wiedergewonnen, wobei das GUS-Strukturgen entfernt wurde. Das Ende wurde mit einem glatten Ende mittels der T4 DNA Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo) versehen. Anschließend wurde das Ende mit bakterieller Alkalische Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo) behandelt.A GUS expression vector derived from pUC 19 pBI221 (manufactured by Clontech) was by the restriction enzymes SmaI and SacI (both manufactured by Takara Shuzo) split and a 2.8 kbp fragment was recovered with the GUS structural gene removed has been. The end was blunted using the T4 DNA Polymerase (manufactured by Takara Shuzo) provided. Then was the end with bacterial alkaline phosphatase (manufactured by Takara Shuzo) treated.

Andererseits wurde die in Beispiel 8 erhaltene cDNA mit vollständiger Länge als ein Insertionsgen hergestellt und das Ende mittels der T4 DNA Polymerase gleichermaßen mit einem glatten Ende versehen. Anschließend wurden beide mit T4 DNA Ligase DNA (DNA Ligation Kit Ver. 2, hergestellt von Takara Shuzo) ligiert und zur Transformation. von kompetenten Zellen des E. coli HB101 Stamms (hergestellt von Takara Shuzo) verwendet. von denen Ampicillin resistente Stämme ausgewählt wurden. Unter den rekombinaten Plasmiden, die in den ausgewählten Stämmen amplifiziert wurden, wurden Klone ausgewählt, in denen eine kodierende Region für die Aldehydoxidase in normaler Orientierung in Relation zum 35S-Promotor eingefügt ist, abgeleitet vom Blumenkohlmosaikvirus, oder in denen der Terminator, abgeleitet von der Nopalinsynthase, so kloniert ist, dass die Region in umgekehrter Orientierung eingefügt ist, und jeweils als Expressionsvektor zur direkten Einbringung verwendet.On the other hand, that in example 8 cDNA obtained with complete Length as an insertion gene was produced and the end by means of the T4 DNA polymerase equally with a smooth end. Then both were made with T4 DNA Ligase DNA (DNA Ligation Kit Ver. 2, manufactured by Takara Shuzo) ligated and for transformation. of competent cells of E. coli HB101 strain (manufactured by Takara Shuzo) used. of which Ampicillin resistant strains selected were. Among the recombinant plasmids amplified in the selected strains clones were selected in which a coding region for the aldehyde oxidase in normal Orientation is inserted in relation to the 35S promoter, derived from the cauliflower mosaic virus, or in which the terminator, derived from nopaline synthase, is cloned so that the region is inserted in reverse orientation, and each used as an expression vector for direct introduction.

Beispiel 11 (Konstruktion des Aldehydoxidase-Expressionsplasmids zur direkten Einbringung)Example 11 (Construction of the aldehyde oxidase expression plasmid for direct introduction)

Um die Expression des vom Mais stammenden Aldehydoxidase-Gens durch Einbringen in eine Pflanzenzelle zu ermöglichen, wurde der nachfolgende Expressionsvektor zum indirekten Einbringen für Pflanzen konstruiert.To express the expression of maize Enable aldehyde oxidase gene to be introduced into a plant cell, the following expression vector became the indirect introduction constructed for plants.

Gleichermaßen wie in Beispiel 10 wurde das Aldehydoxidase-Gen, von dem das Ende mit einem glatten Ende versehen wurde, als Insertionsgen hergestellt. Andererseits wurde ein von pBIN121 abgeleiteter, binärer GUS-Expressionsvektor pBI121 (hergestellt von Clontech) durch die Restriktionsenzyme SmaI und SacI gespalten und ein Fragment wurde wiedergewonnen, wobei das GUS-Struktwgen entfernt wurde. Das Ende wurde gleichermaßen mit einem glatten Ende versehen und zur Dephosphorylierung behandelt. Beide wurden ligiert und zur Transformation von E. coli verwendet. Die rekombinanten Plasmide wurden ausgewählt und als Aldehydoxidase-Expressionsvektoren zur indirekten Einbringung verwendet. Des weiteren wurden die Plasmidvektoren in den Stamm Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mit der Tri-Parental-Methode (GUS Gene Fusion System, hergestellt von Clontech) transferiert.Same as in Example 10 the aldehyde oxidase gene, the end of which has a smooth end was provided as an insertion gene. On the other hand a binary GUS expression vector pBI121 derived from pBIN121 (manufactured by Clontech) by the restriction enzymes SmaI and SacI cleaved and a fragment was recovered, the CIS structure car was removed. The end was equally with provided with a smooth end and treated for dephosphorylation. Both were ligated and used to transform E. coli. The recombinant plasmids were selected and used as aldehyde oxidase expression vectors used for indirect insertion. Furthermore, the plasmid vectors into the strain Agrobacterium tumefaciens LBA4404 using the tri-parental method (GUS Gene Fusion System, manufactured by Clontech).

Beispiel 12 (Erzeugung einer transformierten Pflanze durch Einbringung eines Aldehydoxidase-Expressionsplasmids; Teil l)Example 12 (Generation a transformed plant by introducing an aldehyde oxidase expression plasmid; Part l)

Die aus Beispiel 10 erhältlichen Expressionsvektoren zur direkten Einbringung wurden mit einer Particle-Gun in keimfrei-kultiviertes, unreifes Skutellum einer Reispflanze gemäß einer in Shimade et al. (Ikushugaku Zasshi 44 Supplement 1 (1994), 66) beschriebenen Mlethode eingebracht, um transformierte Reispflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie mit einer Particle-Gun in keimfrei-kultiviertes, unreifes Skutellum einer Weizenpflanzen gemäß einer in Takumi et al. (Ikushugaku Zasshi 45 Supplement 1 (1995), 57) beschriebenen Methode eingebracht, um transformierte Weizenpflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie mit einer Particle-Gun in keimfrei kultiviertes. unreifes Skutellum einer Gerstenpflanzen gemäß einer in Hagio et al. (Ikushugaku Zasshi 44 Supplement 1 (1994), 67) beschriebenen Methode eingebracht, um transformierte Gerstenpflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie mit einer Particle-Gun in einen Maisadventivembryo gemäß einer in M. E. Fromm et al. (BiolTechnology 8 (1990) 833–839) beschriebenen Methode eingebracht, um transformierte Maispflanzen zu erhalten. Des weiteren wurden die in Beispiel 10 erhaltenen Expressionsvektoren zur direkten Einbringung mit einer Particle-Gun in einen Sojabohnenadventivembryo gemäß einer in der japanischen Patentanmeldung Hei 3-291501 beschriebenen Methode eingebracht, um transformierte Sojabohnenpflanzen zu erhalten.Those available from Example 10 Expression vectors for direct introduction were used with a particle gun in aseptically cultivated, immature scutellum of a rice plant according to one in Shimade et al. (Ikushugaku Zasshi 44 Supplement 1 (1994), 66) Mlethode described to transform rice plants receive. equally they were cultivated in a germ-free, immature with a particle gun Skutellum of a wheat plant according to one in Takumi et al. (Ikushugaku Zasshi 45 Supplement 1 (1995), 57). to get transformed wheat plants. Alike them in a germ-free cultivated with a particle gun. immature scutellum a barley plants according to one in Hagio et al. (Ikushugaku Zasshi 44 Supplement 1 (1994), 67) Method introduced to obtain transformed barley plants. equally they were placed in a corn-embryo embryo according to a in M.E. Fromm et al. (Biol Technology 8 (1990) 833-839) Method introduced to obtain transformed maize plants. Furthermore, the expression vectors obtained in Example 10 were for direct introduction with a particle gun into a soybean preventive embryo according to one method described in Japanese Patent Application Hei 3-291501 introduced to obtain transformed soybean plants.

Beispiel 13 (Erzeugung einer transformierten Pflanze durch Einbringung eines Aldehydoxidase-Expressionsplasmids; Teil 2)Example 13 (Generation a transformed plant by introducing an aldehyde oxidase expression plasmid; Part 2)

Die Stämme von Agrobacterium tumefaciens LBA4404, in die der Aldehydoxidase-Expressionsvektor zur direkten Einbringung eingebracht wurde, erhältlich aus Beispiel 11, wurden in ein keimfrei-kultiviertes Tabakblatt durch eine in Uchimiya, „Manual for Plant Gene Manipulation" (Methode zur Herstellung transgener Pflanzen), veröffentlicht in Kodansha Scientific (ISBN 4-06-153515-7 (1990), 27–33) beschriebene Methode infiziert, um transformierte Tabakpflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie in ein Blattstiel von keimfrei kultivierten Karottenkeimlingen durch eine in N. Pawlicki et al. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 31 (1992), 129–139) beschriebene Methode infiziert, um transformierte Karottenpflanzen zu erhalten. Des weiteren wurden sie in ein Hypokotyl oder ein Kotyledon eines keimfrei-kultivierten Keimlings von Lotus corniculatus mit einer in Nagasawa et al. (Ikushugaku Zasshi 45 Supplement 1 (1995), 143) beschriebene Methode infiziert. um transformierte Lotus corniculatus Pflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie in einen keimfrei-kultivierten Luzernadventivenembryo durch eine in R. Desgagnes et al. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 42 (1995). 129–140) beschriebene Methode infiziert, um transformierte Luzernenpflanzen zu erhalten. Gleichermaßen wurden sie in ein Epykotyl oder ein Kotyledon eines keimfrei kultivierten Erbsenkeimlings durch eine in J. Pounti-Kaerlas et al. (Theoretical and Applied Genetics 80 (1990), 246–252) beschriebene Methode infiziert, um transformierte Erbsenpflanzen zu erhalten.
SEQ ID NO: 1
Sequenzlänge: 1.358
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Protein
Originalquelle der Sequenz
Organismus: Mais (Zea mais L.)
Stamm : Kultursorte : Golden Cross Bantam 70 SEQUENZBESCHREIBUNG

SEQ ID NO: 2
Sequenzlänge: 4.412
Sequenztyp: Nucleinsäure
Strangbeschreibung: Einzelstrang
Topologie: linear
Molekültyp: cDNA zu mRNA
Originalquelle der Sequenz
Organismus: Mais (Zea mais L.)
Stamm : Kultwsorte : Golden Cross Bantam 70
Merkmale der Sequenz:
Schlüssel: CDS
Lage: 46..4120 (Terminationscodon eingeschlossen)
Identifizierungsmethode: E SEQUENZBESCHREIBUNG

SEQ ID NO: 3
Sequenzlänge: 1.349
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Protein
Originalquelle der Sequenz
Organismus: Mais (Zea mais L.)
Stamm : Kultursorte : Golden Cross Bantam 70 SEQUENZBESCHREIBUNG

SEQ ID NO: 4
Sequenzlänge: 4.359
Sequenztyp: Nucleinsäure
Strangbeschreibung: Einzelstrang
Topologie: linear
Molekültyp: cDNA zu mRNa
Originalquelle der Sequenz,
Organismus: Mais (Zea mais L.)
Stamm : Kultwsorte : Golden Cross Bantam 70
Merkmale der Sequenz:
Schlüssel: CDS
Lage: 91..4138 (Terminationscodon eingeschlossen)
Identifizierungsmethode: EThe strains of Agrobacterium tumefaciens LBA4404, into which the aldehyde oxidase expression vector for direct introduction was introduced, which can be obtained from Example 11, were introduced into a aseptic cultivated tobacco leaf by means of a manual for plant gene manipulation in Uchimiya (method for producing transgenic plants). , published in Kodansha Scientific (ISBN 4-06-153515-7 (1990), 27-33), to obtain transformed tobacco plants, and were similarly planted into a petiole of aseptically grown carrot seedlings by a method described in N. Pawlicki et al (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 31 (1992), 129-139) were infected to obtain transformed carrot plants, and they were further put into a hypocotyl or cotyledon of a germ-free seedling of Lotus corniculatus with one in Nagasawa et al. (Ikushugaku Zasshi 45 Supplement 1 (1995), 143) infected with transformed Lotus cornic to preserve ulatus plants. Likewise, they were introduced into a germ-free, cultured Lucerne additive embryo by a method described in R. Desgagnes et al. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 42 (1995). 129-140) infected to obtain transformed alfalfa plants. Likewise, they were transformed into an epycotyl or a cotyledon of a germ-free pea seedling by an in J. Pounti-Kaerlas et al. (Theoretical and Applied Genetics 80 (1990), 246-252) infected method to obtain transformed pea plants.
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 1,358
Sequence type: amino acid
Topology: linear
Molecule type: protein
Original source of the sequence
Organism: Maize (Zea mais L.)
Tribe: Cultivar: Golden Cross Bantam 70 SEQUENCE DESCRIPTION

SEQ ID NO: 2
Sequence length: 4,412
Sequence type: nucleic acid
Strand description: Single strand
Topology: linear
Molecule type: cDNA to mRNA
Original source of the sequence
Organism: Maize (Zea mais L.)
Tribe: Cult variety: Golden Cross Bantam 70
Features of the sequence:
Key: CDS
Location: 46..4120 (termination codon included)
Identification method: E SEQUENCE DESCRIPTION

SEQ ID NO: 3
Sequence length: 1,349
Sequence type: amino acid
Topology: linear
Molecule type: protein
Original source of the sequence
Organism: Maize (Zea mais L.)
Tribe: Cultivar: Golden Cross Bantam 70 SEQUENCE DESCRIPTION

SEQ ID NO: 4
Sequence length: 4,359
Sequence type: nucleic acid
Strand description: Single strand
Topology: linear
Molecule type: cDNA to mRNa
Original source of the sequence,
Organism: Maize (Zea mais L.)
Tribe: Cult variety: Golden Cross Bantam 70
Features of the sequence:
Key: CDS
Location: 91..4138 (termination codon included)
Identification method: E

SEQUENZBESCHREIBUNG

SEQUENCE DESCRIPTION

Claims (11)

Pflanzen-Aldehydoxidase-Gen, das eine 4.4 kbp-DNA ist und das eine Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das eine Aldehydverbindung zu einer Carboxylsäure oxidieren kann, wobei das Aldehydoxidase-Gen ist: (a) eine Nucleotidsequenz, die eine in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz codiert; (b) eine Nucleotidsequenz, die eine in SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäureseugenz codiert; (c) eine Nucleotidsequenz, die eine in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, mit einem oder mehreren hinzugefügten, deletierten oder ersetzten Nucleotid(en), wobei die Nucleotidsequenz darin Nucleotide aufweist, die mittels des RACE-Verfahrens mit einem der folgenden Primer-Sätze amplifizierbar ist: SATZ 1: ein Sense-Primer ausgewählt aus:

ein Antisense-Primer ausgewählt aus:

SATZ 2: ein Sense-Primer ausgewählt aus:

ein Antisense-Primer ausgewählt aus:

(d) eine Nucleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 2 gezeigt; oder (e) eine Nucloetidsequenz wie in SEQ ID NO: 4 gezeigt.Plant aldehyde oxidase gene which is a 4.4 kbp DNA and which encodes an amino acid sequence of an enzyme which can oxidize an aldehyde compound to a carboxylic acid, the aldehyde oxidase gene being: (a) a nucleotide sequence which is one in SEQ ID NO: 1 encoded amino acid sequence shown; (b) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3; (c) a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 with one or more nucleotide (s) added, deleted or replaced, the nucleotide sequence therein having nucleotides which can be The method can be amplified with one of the following primer sets: SET 1: a sense primer selected from:

an antisense primer selected from:

SET 2: a sense primer selected from:

an antisense primer selected from:

(d) a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 2; or (e) a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 4. Gen nach Anspruch 1, wobei die Aldehydverbindung Indolacetaldehyd ist.The gene of claim 1, wherein the aldehyde compound Is indole acetaldehyde. Gen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Carboxylsäure Indolessigsäure ist. The gene of claim 1 or 2, wherein the carboxylic acid is indole acetic acid. Aldehydoxidase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das von einer Maispflanze stammt.Aldehyde oxidase gene according to one of claims 1 to 3, which comes from a corn plant. Plasmid, umfassend ein Aldehydoxidase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4.A plasmid comprising an aldehyde oxidase gene according to a of claims 1 to 4. Wirtszelle, transformiert mit dem Plasmid nach Anspruch 5.Host cell transformed with the plasmid according to claim 5th Zelle nach Anspruch 6, wobei die Wirtszelle ein Mikroorganismus oder eine Pflanze ist.The cell of claim 6, wherein the host cell is a microorganism or is a plant. Verfahren zum Konstruieren eines Expressionsplasmids, welches Ligieren (a) eines Promotors, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann; (b) eines Aldehydoxidase-Gens nach einem der Ansprüche 1 bis 4; und (c) eines Terminators, der in einer Pflanze funktionieren kann, in funktioneller Weise und in der beschriebenen Reihenfolge umfasst.Method of constructing an expression plasmid, what ligating (a) a promoter located in a plant cell can work; (b) an aldehyde oxidase gene after one of claims 1 to 4; and (c) a terminator that works in a plant can, in a functional manner and in the order described includes. Expressionsplasmid, umfassend: (a) einen Promotor, der in einer Pflanzenzelle funktionieren kann; (b) ein Aldehydoxidase-Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 4; und (c) einen Terminator, der in einer Pflanze funktionieren kann; die in einer funktionellen Weise und in der beschriebenen Reihenfolge ligiert werden.Expression plasmid comprising: (a) a promoter, that can function in a plant cell; (b) an aldehyde oxidase gene according to one of the claims 1 to 4; and (c) a terminator that will work in a plant can; which in a functional manner and in that described Order to be ligated. In vitro-Verfahren zum Herstellen einer Aldehydoxidase in einer Wirtszelle, welches das Einbringen des Expressionsplasmids nach Anspruch 9 in die Wirtszelle umfasst.In vitro method for producing an aldehyde oxidase in a host cell, which introduces the expression plasmid according to claim 9 in the host cell. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Aldehydoxidase-Gen von einer Pflanze stammt und die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.The method of claim 10, wherein the aldehyde oxidase gene comes from a plant and the host cell is a plant cell.